JP2018518171A5 - - Google Patents
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Description
また、最後に、
−細胞外核酸の単離および/または精製、
−<250ntの長さを有する短鎖核酸の単離および/または精製、
−ウイルス核酸の単離および/または精製、ならびに
−感染症、および、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかにおける、
本発明に係る上記の核酸の単離および/または精製方法、自動診断方法、水性抽出バッファー、ならびにキットの使用を提供する。
−細胞外核酸の単離および/または精製、
−<250ntの長さを有する短鎖核酸の単離および/または精製、
−ウイルス核酸の単離および/または精製、ならびに
−感染症、および、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかにおける、
本発明に係る上記の核酸の単離および/または精製方法、自動診断方法、水性抽出バッファー、ならびにキットの使用を提供する。
上記の能力は、図1によく示されており、この図は、高量のチオシアン酸グアニジニウム(GuSCN)と混合し、1mlずつ三連に分け、次いで、これを(1)エタノール(「etOH」と表示)、(2)イソプロパノール(「propOH」と表示)および(3)ブタノール(「butOH」と表示)から選択されるそれぞれのアルコールで2倍に希釈した血漿試料を示す。それぞれのアルコールを50%の終濃度まで添加した後、三連のこれらの最終GuSCN濃度を約2Mにした。図1からわかるように、エタノールまたはイソプロパノールのいずれかと混合した血漿−GuSCN溶液は、室温でのほぼ即時で重度のタンパク質の沈殿のため視認可能に濁った。逆に、試料が入ったチューブの目盛が容易に視認可能であることから示されるように、ブタノールでは血漿−GuSCN混合物中に沈殿物は形成されなかった。後者のことは一般的に、上記に明示した濃度範囲内のGuSCN/ブタノールまたはペンタノールミックス、例えば、2.9MのGuSCNと50%のn−ブタノール、2.9MのGuSCNと51%のtert−ブタノール、3.7MのGuSCNと32%の1−ペンタノール、3.2MのGuSCNと38%の1−ペンタノール、2.9MのGuSCNと46%の3−ペンタノールなどで試験した他の場合(水と血漿または全血を用いた)にもあてはまった。これらの溶液中に形成された沈殿物(視認可能な場合)の型は、当然、試験対象の生物学的試料中のタンパク質がどれだけ濃密であるかに依存した(例えば、全血は血漿よりも扱いにくい材料である)。しかしながら、一般には透明であり、場合によっては遠心分離後にのみ視認できた。
Claims (20)
- (a)少なくとも1種類のカオトロピック化合物と少なくとも1種類のアルコールの存在下で、核酸含有出発物質を核酸結合支持体と接触させることによって、核酸を該核酸結合支持材に結合させる工程
を含む、核酸含有出発物質からの核酸の単離および/または精製のための方法であって;
(i)該アルコールが、4個または5個の炭素原子を有するアルコールであり、工程a)において17%(v/v)〜60%(v/v)の濃度で存在すること、および
(ii)該少なくとも1種類のカオトロピック化合物が工程a)において1.5M〜5Mの濃度で存在すること
を特徴とする方法。 - プロテアーゼを工程a)で添加しない、または該核酸含有出発物質を工程a)に供する直前にプロテアーゼ(または他の等価なプロテアーゼ前処理)とのインキュベーションを行なわない、請求項1に記載の方法。
- 4個または5個の炭素原子を有するアルコールが、n−ブタノール、sec−ブタノール、イソブタノール、tert−ブタノール、1−ペンタノール、2−ペンタノール、3−ペンタノール、2−メチル1−ブタノール、3−メチル1−ブタノール、2,2−ジメチル1−プロパノール、2−メチル2−ブタノール、3−メチル2−ブタノールまたはその混合物からなる群より選択されるモノヒドロキシアルコールである、請求項1または2に記載の方法。
- 4個または5個の炭素原子を有するアルコールが工程a)において20%(v/v)〜55%(v/v)の濃度で存在する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該少なくとも1種類のカオトロピック化合物が、チオシアン酸塩、イソシアン酸塩、過塩素酸塩、塩酸塩またはその混合物から選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 該少なくとも1種類のカオトロピック化合物が、チオシアン酸グアニジニウムである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 該少なくとも1種類のカオトロピック化合物は、工程a)において2M〜4.5Mの濃度で存在する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 該核酸含有出発物質が、全血、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)および尿からなる群より選択される液体の生物学的試料である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- (b)結合された該核酸を該核酸結合支持材から溶出バッファーを用いて溶出させる工程、を更に含む請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記方法が、工程a)およびb)が取り外し可能なカートリッジにおいて行なわれる自動化システムで行なわれる、請求項9に記載の方法。
- (a)核酸含有出発物質を自動化システム内に供給する工程;
(b)前記自動化システム内の核酸を、請求項1〜7及び9のいずれかに記載の単離および/または精製方法に従って単離および/または精製する工程;
(c)前記自動化システム内で、工程(b)で単離および/または精製された標的核酸の増幅を行なう工程;ならびに
(d)工程(c)で増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む、標的核酸を検出するための自動診断方法。 - 少なくとも工程(b)と(c)がカートリッジにおいて行なわれる、請求項11に記載の自動診断方法。
- 核酸の単離および/または精製のための水性抽出バッファーであって、
(i)20%(v/v)〜65%(v/v)の濃度である4個または5個の炭素原子を有するアルコール、および
(ii)3.3M〜6.7Mの濃度の少なくとも1種類のカオトロピック化合物
を含む抽出バッファー。 - 前記アルコールが、n−ブタノールである請求項13に記載の抽出バッファー。
- 請求項13または14に記載の抽出バッファーを含み、
核酸含有出発物質から、<250ntの長さを有する細胞外および/または短鎖の核酸の単離および/または精製のためのキット。 - 前記抽出バッファーが、自動システムに取付け可能なカートリッジの内部に供給されている、請求項15に記載のキット。
- 該カートリッジは、さらに、核酸を結合させるのに適した核酸結合支持材を備えている、核酸の単離および/または精製コンパートメントを備えており、前記核酸の単離および/または精製コンパートメントは、該抽出バッファーを収容しているか、または前記抽出バッファーを収容している別のコンパートメントと流体連通している、請求項16に記載のキット。
- −細胞外核酸の単離および/または精製、
−<250nt、最も好ましくは<100ntの長さを有する短鎖核酸の単離および/または精製、
−ウイルス核酸の単離および/または精製、ならびに
−感染症、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかのために用いられる、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - −細胞外核酸の単離および/または精製、
−<250nt、最も好ましくは<100ntの長さを有する短鎖核酸の単離および/または精製、
−ウイルス核酸の単離および/または精製、ならびに
−感染症、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかのための用いられる、請求項13または14に記載の抽出バッファー。 - −細胞外核酸の単離および/または精製、
−<250nt、最も好ましくは<100ntの長さを有する短鎖核酸の単離および/または精製、
−ウイルス核酸の単離および/または精製、ならびに
−感染症、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかのための用いられる、請求項15〜17のいずれかに記載のキット。
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