JP2017522011A - 細胞の増殖非依存的検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は2014年6月13日に出願された米国仮出願第62/011,660の利益を主張するものであり、当該出願は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。2015年6月10に作成された前記ASCIIのコピーは、29449PCT_CRF_sequencelisting.txtと命名され、25キロバイトのサイズである。
前記試料を複数の非複製性形質導入粒子(non-replicative transduction particles)(NRTPs)と接触させるステップ、その結果前記複数のNRTPsが試料中の1又は2以上の対象の微生物を形質導入し、ここで前記複数のNRTPsは、レポーター核酸配列を含み、そして前記1又は2以上の対象の微生物の増殖速度は対数増殖期(logarithmic phase)よりも低い;前記リポーター核酸配列の活性化のための条件を提供するステップ;及び、前記リポーター核酸配列によって産生されるシグナルを検出するステップ、ここで前記シグナルの存在は前記1又は2以上の対象の微生物の存在を示し、前記シグナルの不在は前記1又は2以上の対象の微生物の不在を示す、を含む。
ウィルスは、宿主細胞において溶原性及び溶菌性サイクルを受ける。溶原性サイクルが採用される場合、ファージ染色体が細菌染色体中に組み込まれるか、又はそれは、宿主において安定したプラスミドとしてそれ自体確立することができ、ここでそれは残存することができる。溶原菌の溶菌サイクルが誘発される場合、ファージゲノムが、細菌染色体から切除され、そして溶菌サイクルが開始し、細胞の溶解及びファージ粒子の放出で絶頂に達する。溶菌サイクルは、宿主の溶解により放される新規ファージ粒子の生成を導く。
「形質導入粒子(transduction porticle)」とは、細胞中に非ウィルス核酸分子を送達できるウィルスのことである。前記ウィルスは、バクテリオファージ、アデノウィルスなどであり得る。
本明細書に開示される細胞は、原核生物及び真核生物を包含することができる。いくつかの側面によれば、細胞は微生物であり得る。用語「微生物(microorganism)」とは、古細菌、細菌及び真核生物ドメインからの原核及び真核微生物種を意味し、後者は、酵母及び糸状菌、原生動物、藻類又は高等原生生物を包含する。用語「微生物細胞(microbial cells)」及び「微生物(microbes)」は、用語「微生物(microorganism)」と交換可能的に使用される。微生物は、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)細胞、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus spp.)、腸内細菌科菌(Enterobacteriaceae)、エンテロコッカス属菌(Enterococcus spp.)、ストレプトコッカス属菌(Streptococcus spp.)、アシネトバクター属菌(Acinetobacter spp.)、シュードモナス属菌(Pseudomonas spp.)、ステノトロフォモナス属菌(Stenotrophomonas spp.)又はマイコバクテリウム属菌(Mycobacterium spp.)を含むことができる。
「抗微生物剤(antimicrobial agent)」とは、1又は2以上の微生物を殺害し、その増殖を阻害し、又は他方では、その微生物の生存能力を損なう化合物を意味する。抗微生物剤は、抗生物質、抗真菌剤、抗原虫薬、抗ウィルス薬、及び他の化合物を包含する。
本明細書に開示される方法、システム及び組成物は典型的には、対象由来の試料における1又は2以上の細胞の検出のための増殖非依存的方法、システム及び組成物である。例えば、本明細書に記載される方法は、目的の対象から試料を単離するか、又は入手し、そして増殖にもかかわらず、試料中に存在するか又は存在しない目的の細胞又は細胞組を検出するために、試料(又は試料を含む培養物)と、本明細書に記載されるNRTPとを直接的に接触することを包含することができる。
以下は、非複製形質導入粒子を生成するための欠失/補完ベースのパッケージングシステムの設計及び構成の例である。
RN4220は、NCTC8325の非溶原性誘導体であり、そしてE.コリ(E.Coli)DNAのための効果的受容体である制限欠損S.アウレウス株である。それは、最初に、Kreiswirth, B.N. et al., The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature, 1983. 305(5936): p. 709-712に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態によれば、カセットのためのプラスミド源として使用され得るプラスミドの例は、Charpentier, E., et al., Novel Cassette-Based Shuttle Vector System for Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 2004. 70(10): p. 6076-6085に記載されている。
・配列番号1(S.アウレウスpT181プラスミド起源又は複製コピー数変異体pT181cop−623repC)
・M21136 (tetA(M))
・配列番号2 (PcipBプロモーター配列)
・配列番号3(ψ11小ターミナーゼ(terS) 遺伝子配列)
・L09137 (amp Co1E1 ori)
・X06758 (luxAB)
・M62650 (転写終結)
上記非複製形質導入粒子を、レポーター分子(例えば、luxAB)の発現を介して、生存細菌の存在を検出するためにレポーターシステムに使用することができる。この形質導入粒子が形質導入粒子の宿主範囲内の細胞中にレポーターベクター(例えば、pGW80A0001)を導入する場合、プロモーター(例えば、PclpB)が細胞転写機械により認識される細胞は、この細胞内のレポーター分子の発現を駆動することができる。
例として、標的細胞を検出する能力に対する細胞複製の影響を評価するための試験を実施した。
例として、試験を実施し、直接的に臨床試料からの標的細胞を検出する能力に対する細胞の影響性を評価した。
配列番号1
S.アウレウスpT181プラスミド由来又は複製コピー数バリアントpT181cop−623repC
S.アウレウスPclpBプロモーター配列
天然terS遺伝子を含む配列
φ30αterS欠失及び補完を示す、RN10616ゲノム配列座。tertS=カッコで括られたテキスト、欠失=下線、補完=太字
pGW80A0001完全配列
Claims (48)
- 試料中の対象の微生物を検出するための増殖非依存的な方法であって:
前記試料を複数の非複製性形質導入粒子(NRTPs)と接触させ、その結果前記複数のNRTPsが試料中の1又は2以上の対象の微生物を形質導入するステップ、ここで前記複数のNRTPsは、レポーター核酸配列を含み、そして前記1又は2以上の対象の微生物の増殖速度は対数増殖期よりも低い;
前記リポーター核酸配列の活性化のための条件を提供するステップ;及び、
前記リポーター核酸配列によって産生されるシグナルを検出するステップ、ここで前記シグナルの存在は前記1又は2以上の対象の微生物の存在を示し、前記シグナルの不在は前記1又は2以上の対象の微生物の不在を示す、
を含む、前記方法。 - 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度は1時間当たり0.1分裂未満であり、前記1又は2以上の目的の微生物は、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)である、請求項1に記載の方法。
- 抗微生物剤を前記試料に提供し、そして
前記リポーター核酸配列によって産生されるシグナルを検出して、前記1又は2以上の目的の微生物が前記抗微生物剤に感受性か又は非感受性かを決定すること
をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記1又は2以上の目的の微生物が定常期にあるか、あるいは
前記1又は2以上の目的の微生物が増殖をしていない、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度が、1時間当たり、0.1〜5分裂以下、0.1〜3分裂以下、0.1〜1分裂以下、0.5〜1分裂以下、0.1分裂以下、0.2分裂以下、0.3分裂以下、0.4分裂以下、0.5分裂以下、1分裂以下、2分裂以下、又は3分裂以下である、請求項1、3又は4に記載の方法。
- 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度が、4時間当たり、0〜10細胞分裂以下、1〜9細胞分裂以下、2〜8細胞分裂以下、3〜7細胞分裂以下、4〜6細胞分裂以下、1細胞分裂以下、2細胞分裂以下、3細胞分裂以下、4細胞分裂以下、5細胞分裂以下、6細胞分裂以下、7細胞分裂以下、8細胞分裂以下、9細胞分裂以下、又は10細胞分裂以下である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度が、陰性であるか又は恒常性である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)細胞、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus spp.)、腸内細菌科菌(Enterobacteriaceae)、エンテロコッカス属菌(Enterococcus spp.)、ストレプトコッカス属菌(Streptococcus spp.)、アシネトバクター属菌(Acinetobacter spp.)、シュードモナス属菌(Pseudomonas spp.)、ステノトロフォモナス属菌(Stenotrophomonas spp.)又はマイコバクテリウム属菌(Mycobacterium spp.)を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が臨床試料である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料は、鼻腔用スワブの試料、直腸スワブの試料、血液試料、陽性血液培養試料、皮膚/軟組織試料、気管支肺胞洗浄の試料、痰試料、便試料、尿試料、及び/又は単離された微生物の試料である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが発光シグナルであるか、又は
前記検出ステップが、前記シグナルによって放出される相対発光量(RLU)を測定することを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記提供ステップが、前記試料を脂肪族アルデヒド細菌ルシフェラーゼ基質試薬(fatty aldehyde bacterial luciferase substrate reagent)と接触させることを含み、ここで場合により、前記試薬はトリデカナールである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルがバックグラウンド閾値よりも大きく、ここで前記バックグラウンド閾値は、平均バックグラウンドシグナル・プラス・0〜3x、0x、lx、2x、又は3x平均バックグラウンドシグナルの標準偏差、から計算される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗微生物剤が、セフォキシチン(cefoxitin)、β-ラクタム、広域スペクトルβ−ラクタム(extended-spectrum β-lactam)、アミオノグリコシド(Aminoglycoside)、アンサマイシン(Ansamycin)、カルバセフェム(Carbacephem)、カルバペネム(Carbapenems)、任意の世代のセファロスポリン(Cephalosporin)、グリコペプチド(Glycopeptide)、リンコサミド(Lincosamide)、リポペプチド(Lipopeptide)、マクロライド(Macrolide)、モノバクタム(Monobactam)、ニトロフラン(Nitrofuran)、オキサゾリドノン(Oxazolidonone)、ペニシリン(Penicillin)、ポリペプチド(Polypeptide)、キノリン(Quinolone)、フルオロキノリン(Fluoroquinolone)、ストレプトグラミン(Streptogramin)、スルフォンアミド(Sulfonamide)、テトラサイクリン(Tetracycline)、リファンピシン(Rifampicin)、マイコバクテリアの抗生剤、クロラムフェニコール(Chloramphenicol)、及び/又はムピロシン(Mupirocin)である、請求項3に記載の方法。
- 前記レポーター核酸配列がルシフェラーゼ遺伝子であり、場合により、前記ルシフェラーゼ遺伝子がluxAB、luc、ruc、又はnlucである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸配列が構成的プロモーターに操作可能に連結され、場合により前記構成的プロモーターはS.アウレウス (aureus)clpBプロモーターである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、標準的細胞培養系アッセイに関して、少なくとも80〜100、80〜90、80〜95、90〜95、80、85、90、95、96、97、98、99%の検出特異性を生ずる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、標準的細胞培養系アッセイに関して、少なくとも80〜100、80〜90、80〜95、90〜95、80、85、90、95、96、97、98、99%の検出感度を達成する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、標準的細胞培養系アッセイに関して、少なくとも95%の検出特異性、及び少なくとも90%の検出感度を達成する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標準的細胞培養系アッセイの細胞は対数増殖期にある、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)細胞である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス(MSSA)細胞である、請求項1及び3〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸配列は、検出可能なマーカー又は選択可能なマーカーをコードする、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸配列は、発光反応を媒介する酵素(luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc)をコードする遺伝子、発色反応(colorimetric reactions)を媒介する酵素(lacZ、HRP)をコードする遺伝子、蛍光タンパク質(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近赤外蛍光タンパク質)をコードする遺伝子、アフィニティーペプチド(His−tag、3X−FLAG)をコードする核酸分子、及び、選択可能なマーカー(ampC、tet(M)、CAT、erm)をコードする遺伝子から成る群から選択される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター核酸配列は、構成的プロモーターに操作可能に連結される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルは、1〜1000コロニー形成単位(CFU)以下、10〜100CFU以下、100〜1000CFU以下、10CFU以下、100CFU以下、1,000CFU以下の検出限界(LoD)で検出され得る、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが、1〜5CFU以下、2〜4CFU以下、3〜5CFU以下、又は5CFU以下のLoDで検出され得るか、あるいは前記シグナルが3CFU以下のLoDで検出され得るか、あるいは前記シグナルが2CFU以下のLoDで検出され得るか、あるいは前記シグナルが1CFU以下のLoDで検出され得る、請求項26に記載の方法。
- あらかじめ決められた濃度の抗生剤を前記試料に提供し、そしてシグナルの存在又は不在を検出して、前記1又は2以上の目的の微生物が、前記抗生剤に対して抵抗性であるか、又は感受性であるかを決定することをさらに含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 種々のあらかじめ決められた濃度の抗生剤を前記試料に提供し、そしてシグナル量を検出して、前記抗生剤における前記1又は2以上の目的の微生物の最小阻害濃度を決定することをさらに含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の非複製性形質導入粒子(NRTPs)と、1又は2以上の目的の微生物とを含む、試料又は細胞培養物であって、場合により、前記複数のNRTPsは、レポーター核酸配列を含み、そして前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度は対数増殖期よりも低い、前記試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度は1時間当たり0.1分裂未満であり、前記1又は2以上の目的の微生物は、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)である、請求項30に記載の試料又は細胞培養物。
- 抗微生物剤をさらに含む、請求項30又は31に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が定常期にあるか、あるいは
前記1又は2以上の目的の微生物が増殖をしていない、請求項30〜32のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。 - 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度が、1時間当たり、0.1〜5分裂以下、0.1〜3分裂以下、0.1〜1分裂以下、0.5〜1分裂以下、0.1分裂以下、0.2分裂以下、0.3分裂以下、0.4分裂以下、0.5分裂以下、1分裂以下、2分裂以下、又は3分裂以下である、請求項30〜33のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度が、4時間当たり、0〜10細胞分裂以下、1〜9細胞分裂以下、2〜8細胞分裂以下、3〜7細胞分裂以下、4〜6細胞分裂以下、1細胞分裂以下、2細胞分裂以下、3細胞分裂以下、4細胞分裂以下、5細胞分裂以下、6細胞分裂以下、7細胞分裂以下、8細胞分裂以下、9細胞分裂以下、又は10細胞分裂以下である、請求項30〜34のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物の増殖速度が、陰性であるか又は恒常性である、請求項30〜35のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)細胞、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス属菌、腸内細菌科菌、エンテロコッカス属菌、ストレプトコッカス属菌、アシネトバクター属菌、シュードモナス属菌、ステノトロフォモナス属菌又はマイコバクテリウム属菌を含む、請求項30〜36のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記試料が臨床試料である、請求項30〜37のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記試料は、鼻腔用スワブの試料、直腸スワブの試料、血液試料、陽性血液培養試料、皮膚/軟組織試料、気管支肺胞洗浄の試料、痰試料、便試料、尿試料、及び/又は単離された微生物の試料である、請求項30〜38のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 脂肪族アルデヒド細菌ルシフェラーゼ基質試薬をさらに含み、ここで場合により、前記試薬はトリデカナールである、請求項30〜39のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記抗微生物剤が、セフォキシチン、β-ラクタム、広域スペクトルβ−ラクタム、アミオノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノリン、フルオロキノリン、ストレプトグラミン、スルフォンアミド、テトラサイクリン、リファンピシン、マイコバクテリアの抗生剤、クロラムフェニコール、及び/又はムピロシンである、請求項32に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記レポーター核酸配列がルシフェラーゼ遺伝子であり、場合により、前記ルシフェラーゼ遺伝子がluxAB、luc、ruc、又はnlucである、請求項30〜41のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記レポーター核酸配列が構成的プロモーターに操作可能に連結され、場合により前記構成的プロモーターはS.アウレウスclpBプロモーターである、請求項30〜42のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が、メチシリン抵抗性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)細胞である、請求項30〜43のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記1又は2以上の目的の微生物が、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス(MSSA)細胞である、請求項30〜44のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記レポーター核酸配列は、検出可能な又は選択可能なマーカーをコードする、請求項30〜45のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記レポーター核酸配列は、発光反応を媒介する酵素(luxA、luxB、luxAB、luc、ruc、nluc)をコードする遺伝子、発色反応を媒介する酵素(lacZ、HRP)をコードする遺伝子、蛍光タンパク質(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近赤外蛍光タンパク質)をコードする遺伝子、アフィニティーペプチド(His−tag、3X−FLAG)をコードする核酸分子、及び、選択可能なマーカー(ampC、tet(M)、CAT、erm)をコードする遺伝子から成る群から選択される、請求項30〜46のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
- 前記レポーター核酸配列は、構成的プロモーターに操作可能に連結される、請求項30〜47のいずれか1項に記載の試料又は細胞培養物。
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