ES2872526T3 - Detección de células independiente del crecimiento - Google Patents

Abstract

Un procedimiento independiente del crecimiento para detectar un microorganismo de interés en una muestra, que comprende: - poner en contacto la muestra con una pluralidad de partículas de transducción no replicativas (NRTP) de modo que la pluralidad de NRTP transduzca uno o más microorganismos de interés en la muestra, en el que la pluralidad de NRTP se producen usando un procedimiento de alteración/complementación, en el que dichos procedimientos no producen NRTP que contengan un genoma vírico, y en el que la pluralidad de NRTP son bacteriófagos que pueden insertar una molécula de ácido nucleico no vírico en el uno o más microorganismos de interés sin empaquetar su propio genoma vírico replicado en la partícula de transducción, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico no vírico una secuencia de ácido nucleico indicadora que incluye un gen indicador enlazada de forma funcional a un promotor, y en el que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es la fase estacionaria, menor que la fase estacionaria o mayor que la fase estacionaria, pero menor que la fase exponencial; - proporcionar condiciones para la activación de la secuencia de ácido nucleico indicadora y la expresión de una molécula indicadora de dicho gen indicador; y - detectar una señal producida por la molécula indicadora, en la que la presencia de la señal indica la presencia del uno o más microorganismos de interés, y en la que la ausencia de la señal indica la ausencia del uno o más microorganismos de interés.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de células independiente del crecimiento

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/011.660, presentada el 13 de junio de 2014.

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 10 de junio de 2015, se llama 29449PCT_CRF_sequencelisting.txt y tiene un tamaño de 25 kilobytes.

Antecedentes

En el laboratorio de investigación, se llevan a cabo muchos estudios que emplean células usando células cultivadas que, a menudo, presentan un crecimiento exponencial. En la naturaleza, sin embargo, las células casi nunca están en una tasa de crecimiento exponencial y, a menudo, están en un estado estacionario. Este fenómeno es una consideración importante en el desarrollo de diagnósticos clínicos para la detección de células, puesto que las muestras clínicas pueden contener células que no estén en un estado metabólico que soporte un crecimiento óptimo. En algunos casos, se pueden obtener células que no crecen en las condiciones de ensayo previstas para detectar las células. Como tal, cuando se somete a prueba la presencia de células directamente a partir de una muestra clínica o ambiental, a menudo, puede ser importante emplear un ensayo que funcione independientemente del crecimiento celular.

Incluso cuando las células se aíslan y cultivan en el laboratorio, todavía pueden existir situaciones en las que las cepas individuales de células aisladas puedan presentar características de crecimiento variables. Cuando dichas células presentan un crecimiento subóptimo, esto puede dar lugar a que una célula no se detecte por un ensayo que, en general, requiere crecimiento. El ejemplo 9 del documento WO 2014/145899 ejemplifica esta situación (véase la página 80, línea 2, página 82, línea 33, y la figura 26B). En ese ensayo, se supervisaron células de S. aureus para determinar el crecimiento en presencia de clindamicina. El ensayo estaba previsto para distinguir un fenotipo susceptible frente a resistente a clindamicina, realizando la determinación en base a la tasa de crecimiento de las bacterias en presencia de clindamicina. En el ensayo, una cepa aislada de bacterias resistente a clindamicina se malinterpretó como sensible a clindamicina porque la cepa aislada presentó una tasa de crecimiento subóptimo.

Como tales, los ensayos que, en general, requieren una cantidad mínima de crecimiento o una tasa de crecimiento mínima pueden no detectar células diana que no presentan las características de crecimiento requeridas durante el ensayo. Se divulgan otros ensayos en Dusthackeer et al. (Journal of Microbiological Methods vol. 73(1), 19 de enero de 2008, páginas 18-25) y el documento WO2008/131230A1.

Las solicitudes de patente relacionadas incluyen: el documento PCT/US2014/026536, presentado el 13 de marzo de 2014.

Sumario

En el presente documento se divulga un procedimiento de detección celular que funciona independientemente del crecimiento celular. Mientras que las metodologías de detección celular existentes se benefician del crecimiento celular, los procedimientos divulgados en el presente documento demuestran modos de realización que son independientes del crecimiento celular.

Los procedimientos divulgados en el presente documento, en general, son independientes del crecimiento, lo que puede ser un rasgo característico importante para detectar células en un estado metabólico que no soporta el crecimiento adecuado (por ejemplo, células encontradas en muestras clínicas) y para cepas de células con tasas de crecimiento menores a las esperadas.

En el presente documento se divulgan diversos procedimientos, sistemas y composiciones para la detección de células independiente del crecimiento.

Por ejemplo, un procedimiento divulgado en el presente documento puede incluir un procedimiento independiente del crecimiento para detectar un microorganismo de interés en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con una pluralidad de partículas de transducción no replicativas (NRTP) de modo que la pluralidad de NRTP transduzca uno o más microorganismos de interés en la muestra, en la que la pluralidad de NRTP comprende una secuencia de ácido nucleico indicadora, y en la que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es menor que la fase exponencial; proporcionar condiciones para la activación de la secuencia de ácido nucleico indicadora; y detectar una señal producida por la secuencia de ácido nucleico indicadora, en la que la presencia de la señal indica la presencia del uno o más microorganismos de interés, y en la que la ausencia de la señal indica la ausencia del uno o más microorganismos de interés.

Como otro ejemplo, una composición divulgada en el presente documento puede incluir una muestra o un cultivo celular que comprende una pluralidad de partículas de transducción no replicativas (NRTP) y uno o más microorganismos de interés, opcionalmente en la que la pluralidad de NRTP comprende una secuencia de ácido nucleico indicadora, y en la que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es menor que la fase exponencial.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Estos y otros rasgos característicos, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción y dibujos adjuntos, donde:

Figura 1: la figura 1A resume la proporción de recuentos por unidades formadoras de colonias (UFC) de SARM al final del ensayo y al comienzo del ensayo, donde la mayoría de muestras presentaron un crecimiento mínimo durante el ensayo de 4 horas (por ejemplo, 1-2 divisiones), mostrando dos muestras una disminución del crecimiento (48 y 60), mostrando una muestra ningún crecimiento (51) y presentando 3 muestras menos de 0,4 divisiones por hora (40, 51 y 81). La figura 1B muestra que todas las muestras sometidas a prueba produjeron una señal positiva (unidades relativas de luz; URL) sobre el fondo.

Figura 2: la figura 2A resume la proporción de recuentos por UFC de SARM al final del ensayo y al comienzo del ensayo, donde la mayoría de las muestras presentaron un crecimiento mínimo durante el ensayo de 4 horas (por ejemplo, 1-2 divisiones) y una muestra (3037) mostró una disminución del crecimiento. La figura 2B muestra que todas las muestras produjeron una señal positiva (URL) durante el ensayo sobre el fondo.

Descripción detallada

Los términos usados en las reivindicaciones y memoria descriptiva se definen como se expone a continuación, a menos que se especifique de otro modo.

Como se usa en el presente documento, "molécula de ácido nucleico indicadora" o "secuencia de ácido nucleico indicadora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende una molécula de ADN o ARN que puede producir una señal. La molécula de ácido nucleico indicadora puede ser natural o una molécula artificial o sintética. En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora es exógena a una célula huésped y se puede introducir en una célula huésped como parte de una molécula de ácido nucleico exógena, tal como un plásmido o vector. En determinados modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora puede ser complementaria a un gen diana en una célula. En otros modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un gen indicador que codifica una molécula indicadora (por ejemplo, enzima indicadora, proteína). En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora se denomina "construcción indicadora" o "construcción indicadora de ácido nucleico".

Una "molécula indicadora" o "indicador" se refiere a una molécula (por ejemplo, ácido nucleico o proteína) que confiere a un organismo un fenotipo detectable o seleccionable. El fenotipo detectable puede ser colorimétrico, fluorescente o luminiscente, por ejemplo. Se pueden expresar moléculas indicadoras a partir de genes indicadores que codifican enzimas que median en reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), genes que codifican enzimas que median en reacciones colorimétricas (lacZ, HRP), genes que codifican proteínas fluorescentes (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano), moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos de afinidad (marca His, 3X-FLAG) y genes que codifican marcadores seleccionables (ampC, tet(M), c At , erm). La molécula indicadora se puede usar como marcador para la captación con éxito de una molécula de ácido nucleico o secuencia exógena (plásmido) en una célula. La molécula indicadora también se puede usar para indicar la presencia de un gen diana, molécula de ácido nucleico diana, molécula intracelular diana o una célula, como se describe en el presente documento. De forma alternativa, la molécula indicadora puede ser un ácido nucleico, tal como un aptámero o una ribozima.

En algunos aspectos de la invención, la molécula de ácido nucleico indicadora se enlaza de forma funcional a un promotor. En otros aspectos de la invención, el promotor se puede elegir o diseñar para contribuir a la reactividad y reactividad cruzada del sistema indicador en base a la actividad del promotor en células específicas (por ejemplo, especies específicas) y no en otras. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico indicadora comprende un origen de replicación. En otros aspectos, la elección del origen de replicación puede contribuir de forma similar a la reactividad y reactividad cruzada del sistema indicador, cuando la replicación de la molécula de ácido nucleico indicadora dentro de la célula diana contribuye a o se requiere para la producción de señales indicadoras en base a la actividad del origen de replicación en células específicas (por ejemplo, especies específicas) y no en otras. En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico indicadora forma un replicón que se puede empaquetar como ADN concatamérico en un virus descendiente durante la replicación del virus.

Una "indicación detectable de la viabilidad" se refiere a un indicador asociado con una célula que se puede observar y que demuestra si la célula es más o menos viable o si su viabilidad se ve afectada, por ejemplo, en relación con una célula de control, donde la célula de control puede ser la misma célula en un punto de tiempo diferente o una célula separada. Los ejemplos incluyen una o más señales, uno o más indicadores, uno o más marcadores, crecimiento o falta del mismo, luz (por ejemplo, luz emitida por una luciferasa) o falta de la misma, etc.

Como se usa en el presente documento, un "transcrito diana" se refiere a una porción de una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN o una molécula de ARNm que se forma naturalmente por una célula diana incluyendo la formada durante la transcripción de un gen diana y ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primaria. El transcrito diana también se puede denominar transcrito celular o transcrito natural.

Como se usa en el presente documento, el término "transcrito" se refiere a una longitud de secuencia de nucleótidos (ADN o a Rn ) transcrita a partir de una secuencia de molde de ADN o ARN o gen. El transcrito puede ser una secuencia de ADNc transcrita a partir de un molde de ARN o una secuencia de ARNm transcrita a partir de un molde de ADN. El transcrito puede ser codificante o no codificante de proteínas. El transcrito también se puede transcribir a partir de una construcción de ácido nucleico genomanipulado.

Un transcrito derivado de una molécula de ácido nucleico indicadora se puede denominar un "transcrito indicador". El transcrito indicador puede incluir una secuencia indicadora y una secuencia de represión cis. El transcrito indicador puede tener secuencias que formen regiones de complementariedad, de modo que el transcrito incluya dos regiones que formen una estructura de dúplex (por ejemplo, una región dúplex intermolecular). Una región se puede denominar una "secuencia de represión cis" y tiene complementariedad con una porción o todo un transcrito diana y/o una secuencia indicadora. Una segunda región del transcrito se llama "secuencia indicadora" y puede tener complementariedad con la secuencia de represión cis. La complementariedad puede ser complementariedad completa o complementariedad sustancial. La presencia y/o unión de la secuencia de represión cis con la secuencia indicadora puede formar una conformación en el transcrito indicador, que puede bloquear la expresión adicional de la molécula indicadora. El transcrito indicador puede formar estructuras secundarias, tales como una estructura de horquilla, de modo que las regiones dentro del transcrito indicador que son complementarias entre sí se puedan hibridar entre sí.

"Introducir en una célula", cuando se hace referencia a una molécula de ácido nucleico o una secuencia exógena (por ejemplo, plásmido, vector, construcción), significa facilitar la captación o absorción en la célula, como se entiende por los expertos en la técnica. La absorción o captación de construcciones o transcritos de ácido nucleico se puede producir a través de procesos celulares activos o difusivos sin ayuda, o por agentes o dispositivos auxiliares incluyendo por medio del uso de bacteriófago, virus y partículas de transducción. El significado de este término no se limita a células in vitro; una molécula de ácido nucleico también se puede "introducir en una célula", en la que la célula es parte de un organismo vivo. En dicho caso, la introducción en la célula incluirá la inserción en el organismo. Por ejemplo, para la inserción in vivo, las moléculas, construcciones o vectores de ácido nucleico de la invención se pueden inyectar en un sitio de tejido o administrar sistémicamente. La introducción in vitro en una célula incluye procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación y lipofección. En el presente documento se describen otros enfoques o son conocidos en la técnica.

Un "plásmido" es una pequeña molécula de ADN que está físicamente separada de, y se puede replicar independientemente de, el ADN cromosómico dentro de una célula. Los plásmidos, encontrados lo más comúnmente como pequeñas moléculas circulares de ADN bicatenario en bacterias, a veces están presentes en arqueas y organismos eucariotas. Los plásmidos se consideran replicones, que se pueden replicar de forma autónoma dentro de un huésped adecuado.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico usada como vehículo para llevar artificialmente material genético exógeno a otra célula, donde se puede replicar y/o expresar.

Un "virus" es un pequeño agente infeccioso que se replica solo en el interior de las células vivas de otros organismos. Las partículas de virus (conocidas como viriones) incluyen dos o tres partes: i) el material genético hecho de moléculas de ADN o bien ARN que lleva información genética; ii) una cubierta proteica que protege a estos genes; y, en algunos casos, iii) una envoltura de lípidos que rodea a la cubierta proteica.

"SARM" se refiere a Staphylococcus aureus resistente a meticilina.

"SASM" se refiere a Staphylococcus aureus sensible a meticilina.

El término "mejorar" se refiere a cualquier resultado terapéuticamente beneficioso en el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad, que incluye profilaxis, disminución de la gravedad o progresión, remisión o cura de la misma.

El término "in situ" se refiere a procesos que se producen en una célula viva que crece separada de un organismo vivo, por ejemplo, que crece en histocultivo.

El término "in vivo" se refiere a procesos que se producen en un organismo vivo.

El término "mamífero" como se usa en el presente documento incluye tanto humanos como no humanos e incluye, pero no se limita a, seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos.

"G", "C", "A" y "U", en general, representan cada uno un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. "T" y "dT" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un desoxirribonucleótido en el que la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxirribotimina. Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" o "desoxirribonucleótido" también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla además a continuación, o a un resto de reemplazo sustituto. El experto en la técnica sabe muy bien que se pueden reemplazar guanina, citosina, adenina y uracilo por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de emparejamiento de bases de un oligonucleótido que comprenda un nucleótido que porte dicho resto de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprenda inosina como su base se puede someter a emparejamiento de bases con nucleótidos que contengan adenina, citosina o uracilo. De ahí que los nucleótidos que contengan uracilo, guanina o adenina se puedan reemplazar en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contenga, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden dichos restos de reemplazo son modos de realización de la invención.

Como se usa en el presente documento, el término "complementario", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos de hibridarse y formar una estructura de dúplex en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como se entenderá por el experto en la técnica. Las secuencias complementarias también se describen como unidas entre sí y caracterizadas por afinidades de unión.

Por ejemplo, se puede describir una primera secuencia de nucleótidos como complementaria a una segunda secuencia de nucleótidos cuando las dos secuencias se hibridan (por ejemplo, hibridación) en condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de hibridación incluyen temperatura, fuerza iónica, pH y concentración de disolvente orgánico para las etapas de hibridación y/o lavado. El término condiciones de hibridación rigurosas se refiere a condiciones en las que una primera secuencia de nucleótidos se hibridará preferentemente a su secuencia diana, por ejemplo, una segunda secuencia de nucleótidos y, en menor medida a, o en absoluto a, otras secuencias. Las condiciones de hibridación rigurosas son dependientes de secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. En general, se seleccionan las condiciones de hibridación rigurosas para que sean aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia de nucleótidos a una fuerza iónica y pH definidos. La Tf es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que un 50 % de las primeras secuencias de nucleótidos se hibridan a una secuencia diana perfectamente emparejada. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra, por ejemplo, en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, cap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. ("Tijssen"). Se pueden aplicar otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente pertinentes como se puede encontrar en el interior de un organismo. El experto en la técnica podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.

Esto incluye el emparejamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos con el oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos en toda la longitud de la primera y segunda secuencia de nucleótidos. Dichas secuencias se pueden denominar "completamente complementarias" entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero, en general, no más de 4, 3 o 2 pares de bases con emparejamiento erróneo tras su hibridación, mientras que retienen la capacidad de hibridarse en las condiciones más pertinentes para su aplicación final. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos se diseñan para formar, tras su hibridación, una o más protuberancias monocatenarias, dichas protuberancias no se considerarán emparejamientos erróneos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, aún se puede denominar "completamente complementario" para los propósitos descritos en el presente documento.

Secuencias "complementarias", como se usa en el presente documento, también pueden incluir, o estar totalmente formadas de pares de bases distintas de Watson-Crick y/o pares de bases formadas de nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que los requisitos anteriores con respecto a su capacidad de hibridación se cumplan. Dichos pares de bases distintas de Watson-Crick incluyen, pero sin limitarse a, el emparejamiento de bases de Wobble o Hoogstein G:U.

Los términos "complementario", "completamente complementario" y "sustancialmente complementario" en el presente documento se pueden usar con respecto al emparejamiento de bases entre dos hebras de un ARNbc, o entre la hebra antisentido de un ARNbc y una secuencia diana, entre hebras complementarias de una secuencia de ARN monocatenario o una secuencia de ADN monocatenario, como se entenderá a partir del contexto de su uso.

Como se usa en el presente documento, una "estructura de dúplex" comprende dos secuencias de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias. Las secuencias complementarias en una construcción de ácido nucleico, entre dos transcritos, entre dos regiones dentro de un transcrito o entre un transcrito y una secuencia diana pueden formar una "estructura de dúplex". En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero, como se describe en detalle en el presente documento, cada una o ambas hebras también pueden incluir al menos un nucleótido distinto de ribonucleótido, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Las dos hebras que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos hebras son parte de una molécula más grande y, por lo tanto, se conectan por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva formando la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina "bucle en horquilla". Cuando las dos hebras se conectan de forma covalente por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva formando la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina "conector". Las hebras de ARN pueden tener el mismo número o uno diferente de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del dúplex menos cualquier protuberancia que esté presente en el dúplex. En general, la estructura de dúplex tiene entre 15 y 30 o entre 25 y 30, o entre 18 y 25, o entre 19 y 24, o entre 19 y 21, o 19, 20 o 21 pares de bases de longitud. En un modo de realización, el dúplex tiene 19 pares de bases de longitud. En otro modo de realización, el dúplex tiene 21 pares de bases de longitud. Cuando se usan dos ARNip diferentes en combinación, las longitudes del dúplex pueden ser idénticas o pueden diferir.

Como se usa en el presente documento, el término "región de complementariedad" se refiere a la región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, como se define en el presente documento. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los emparejamientos erróneos son los más tolerados en las regiones terminales y, si están presentes, en general, están en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.

El término porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoacídicos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para los expertos) o por inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de "identidad" puede existir en una región de la secuencia que se compara, por ejemplo, en un dominio funcional, o, de forma alternativa, existir en la longitud completa de las dos secuencias que se van a comparar.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados.

Se puede llevar a cabo la alineación óptima de secuencias para su comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (Ga p , BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección visual (véase, en general, Ausubel et al., más abajo).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud entre secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa informático para realizar los análisis por BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/).

El término "cantidad suficiente" significa una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad suficiente para producir una señal detectable a partir de una célula.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que es eficaz para mejorar un síntoma de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una "cantidad profilácticamente eficaz", ya que la profilaxis se puede considerar un tratamiento.

Se debe tener en cuenta que, como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

Ciclo lisógeno y lítico de los virus

Los virus experimentan ciclos lisógenos y líticos en una célula huésped. Si se adopta el ciclo lisógeno, el cromosoma del fago se puede integrar en el cromosoma bacteriano, o se puede establecer por sí mismo como plásmido estable en el huésped, donde puede permanecer. Si se induce el ciclo lítico de un lisógeno, el genoma del fago se escinde del cromosoma bacteriano e inicia el ciclo lítico, que culmina en la lisis de la célula y la liberación de partículas de fago. El ciclo lítico da lugar a la producción de nuevas partículas de fago, que se liberan por lisis del huésped.

Determinados fagos moderados pueden presentar actividad lítica, y la propensión a esto puede variar con bacterias huésped variables. Para ilustrar este fenómeno, se examinó la actividad lítica de dos fagos de S. aureus moderados en diez cepas aisladas clínicas de SARM por medio de ensayo en placa (tabla 1). El fago 9 I 1 presentó actividad lítica en 10 de 10 cepas aisladas clínicas de SARM y 980a presentó actividad lítica en seis de las 10 cepas aisladas clínicas de SARM. Por tanto, se puede esperar que los ensayos con indicadores que se basan en el ciclo lisógeno natural de los fagos presenten actividad lítica de forma esporádica.

Tabla 1: actividad lítica (indicada por la letra "x") de los fagos moderados de S. aureus ⁹ I I y ^{9 8 0} a en diez cepas aisladas clínicas de SARM

Además, los ensayos con indicadores basados en virus, tales como indicadores basados en fago, pueden adolecer de reactividad limitada (es decir, inclusividad analítica) debido a los límites en la gama de huéspedes del fago provocada por mecanismos de resistencia a fagos basados en huésped y derivados de profago. Estos mecanismos de resistencia seleccionan el ácido nucleico del fago natural que puede dar como resultado la degradación o de otro modo inhibición del ADN y funciones del fago. Dichos mecanismos de resistencia incluyen sistemas de restricción que escinden el ADN del fago y sistemas CRISPR que seleccionan las secuencias derivadas del fago.

Tanto la actividad lítica como la resistencia a fagos pueden ser inhibidoras con respecto a los ensayos basados en fagos indicadores. La actividad lítica puede inhibir la señal al destruir o de otro modo inhibir la célula en su capacidad de generar una señal detectable y, por tanto, afectar a los límites de detección reduciendo la cantidad de señal detectable o evitando la generación de una señal detectable. Los mecanismos de resistencia a fagos pueden limitar la gama de huéspedes del fago y limitar la inclusividad del indicador basado en fago, lo que afecta, de forma similar, a los límites de detección al reducir la cantidad de señal detectable o evitar la generación de una señal detectable. Tanto la actividad lítica como la resistencia a fagos provocadas por la incorporación del ADN del fago en un fago indicador pueden dar lugar a resultados negativos falsos en los ensayos que incorporan estos indicadores de fagos.

Partículas de transducción no replicativas (NRTP), procedimientos para producir partículas de transducción no replicativas (NRTP) y ensayos relacionados

Una "partícula de transducción" se refiere a un virus que puede insertar una molécula de ácido nucleico no vírico en una célula. El virus puede ser un bacteriófago, adenovirus, etc.

Una "partícula de transducción no replicativa" se refiere a un virus que puede insertar una molécula de ácido nucleico no vírico en una célula, pero no empaqueta su propio genoma vírico replicado en la partícula de transducción. El virus puede ser un bacteriófago, adenovirus, etc.

Las diversas NRTP, procedimientos de preparación de las diversas NRTP y procedimientos de uso de las NRTP se describen en: el documento PCT/US2014/026536, presentado el 13 de marzo de 2014, que se incorpora por la presente por referencia en su totalidad, para todos los propósitos. Los ejemplos de dichos procedimientos de producción de NRTP incluyen sistemas de alteración/complementación que emplean virus lisogenizados en los que se altera una secuencia de ADN que se reconoce por la maquinaria de empaquetamiento vírico (por ejemplo, por medio de mutación, deleción, inserción, etc.) y se complementa la alteración por un plásmido indicador. En estos sistemas, cuando se induce el ciclo lítico del virus lisogenizado, el sistema produce partículas víricas, pero las partículas llevan ADN plasmídico en lugar de ADN vírico.

En algunos aspectos, los procedimientos para el uso de NRTP como moléculas indicadoras para su uso con inductores endógenos o naturales que seleccionan promotores de genes dentro de células viables. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende emplear una NRTP como indicador, en el que la NRTP comprende un gen indicador que se enlaza de forma funcional a un promotor que controla la expresión de un gen diana dentro de una célula diana. Cuando la NRTP que incluye el gen indicador se introduce en la célula diana, la expresión del gen indicador es posible, por ejemplo, por medio de la inducción del promotor de genes diana en la molécula de ácido nucleico indicadora. En determinados aspectos, una secuencia de ácido nucleico indicadora se enlaza de forma funcional a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el promotor constitutivo es un promotor clpB de S. aureus.

En algunos modos de realización, las construcciones (incluyendo las NRTP) comprenden una secuencia de ácido nucleico indicadora que puede incluir un gen indicador. El gen indicador puede codificar una molécula indicadora, y la molécula indicadora puede ser un marcador detectable o seleccionable. En determinados modos de realización, el gen indicador codifica una molécula indicadora que produce una señal detectable cuando se expresa en una célula.

En determinados modos de realización, una secuencia de ácido nucleico indicadora codifica un marcador, tal como un marcador detectable o seleccionable. Los términos "marcador" o "marcadores" engloban, sin limitación, lípidos, lipoproteínas, proteínas, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, péptidos, ácidos nucleicos, genes y oligonucleótidos, conjuntamente con sus complejos relacionados, metabolitos, mutaciones, variantes, polimorfismos, modificaciones, fragmentos, subunidades, productos de degradación, elementos y otros analitos o medidas derivadas de muestras. Un marcador también puede incluir proteínas mutadas, ácidos nucleicos mutados, variaciones de los números de copias y/o variantes de transcritos.

En determinados modos de realización, la molécula indicadora puede ser una molécula indicadora fluorescente, tal como, pero sin limitarse a, una proteína fluorescente verde (GFP), GFP potenciada, proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente azul verdoso (CFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente roja (RFP) o mCherry, así como proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano.

En otros modos de realización, la molécula indicadora puede ser una enzima que media en reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc, etc.). Las moléculas indicadoras pueden incluir una luciferasa bacteriana, una luciferasa eucariota, una enzima adecuada para la detección colorimétrica (lacZ, HRP), una proteína adecuada para la inmunodetección, tal como péptidos de afinidad (marca His, 3X-FLAG), un ácido nucleico que funciona como un aptámero o que presenta actividad enzimática (ribozima) o un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibióticos (ampC, tet(M), CAT, erm). Se pueden usar otras moléculas indicadoras conocidas en la técnica para producir señales para detectar ácidos nucleicos o células diana.

En otros aspectos, la molécula indicadora comprende una molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, la molécula indicadora es un aptámero con actividad de unión específica o que presenta actividad enzimática (por ejemplo, aptazima, ADNzima, ribozima).

La inserción de secuencias de ácido nucleico indicadoras celulares se puede lograr por diversos medios incluyendo transformación por electroporación, química, biolística y por microesferas de vidrio, transducción, transfección, conjugación, incluyendo, pero sin limitarse a, inserción por medio de vehículos de inserción de ácido nucleico, incluyendo bacteriófago, virus, esferoplasto, liposomas, partículas similares a virus, complejos lípido-ADN, lipoplexos, complejos polímero-ADN, poliplexos, etc.

En algunos aspectos, los procedimientos, sistemas y composiciones divulgados en el presente documento comprenden una muestra en contacto con un reactivo para el sustrato de luciferasa bacteriana aldehído graso, por ejemplo, para producir una señal. Los ejemplos de reactivos para el sustrato de luciferasa bacteriana aldehído graso pueden incluir tridecanal, así como otros reactivos para el sustrato de luciferasa bacteriana aldehído graso similares conocidos en la técnica. Son adecuados los aldehidos grasos de diversas longitudes de cadena de carbonos, incluyendo hexanal, heptanal, octanal, nonanal, decanal, undecanal, dodecanal y/o tetradecanal.

En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico indicadora puede producir una señal. En determinados aspectos, una señal es una señal de luminiscencia. En algunos aspectos, una señal se puede medir en unidades relativas de luz (URL) emitidas por la señal. En la técnica son conocidos diversos dispositivos que detectan una señal de una secuencia de ácido nucleico indicadora. Los dispositivos para detectar la emisión de luz incluyen tubos fotomultiplicadores, fotodiodos y/o fotodiodos de avalancha. Se pueden lograr la detección simplemente recogiendo la señal luminosa de un área o volumen y/o por formación de imágenes de un área o volumen.

En algunos aspectos, una señal es mayor que un umbral de fondo, por ejemplo, cuando el umbral de fondo se calcula a partir de una señal de fondo promedio más 0x, 1x, 2x o 3x la desviación estándar de la señal de fondo promedio.

En algunos aspectos, se puede detectar una señal a un límite de detección (LD) de menos de o igual a 10000-1, 1000-10, 1000-100, 100-1, 10.000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 unidades formadoras de colonias (UFC). En algunos aspectos, se puede detectar una señal a un LD de menos de o igual a cinco UFC, o se puede detectar una señal a un Ld de menos de o igual a tres UFC, o se puede detectar una señal a un LD de menos de o igual a dos UFC, o se puede detectar una señal a un LD de menos de o igual a una UFC.

En determinados aspectos, se puede determinar la sensibilidad o especificidad de un procedimiento de uso de una NRTP dada para detectar una célula, por ejemplo, como se describe en el documento PCT/US2014/026536, presentado el 13 de marzo de 2014.

En algunos aspectos, un procedimiento produce al menos un 80-100, 80-90, 90-100, 85-95, 90-95, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de especificidad de detección con referencia a un ensayo basado en cultivo celular estándar.

En algunos aspectos, un procedimiento produce al menos un 80-100, 80-90, 90-100, 85-95, 90-95, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de sensibilidad de detección con referencia a un ensayo basado en cultivo celular estándar.

En algunos aspectos, un procedimiento logra al menos un 80-100, 80-90, 90-100, 85-95, 90-95, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de especificidad de detección y al menos un 80-100, 80-90, 90-100, 85-95, 90-95, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de sensibilidad de detección con referencia a un ensayo basado en cultivo celular estándar.

Células y muestras

Las células divulgadas en el presente documento pueden incluir procariotas y eucariotas. En algunos aspectos, una célula puede ser un microorganismo. El término "microorganismo" significa especies microbianas procariotas y eucariotas de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo este último levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas o protistas superiores. Los términos "células microbianas" y "microbios" se usan de manera intercambiable con el término microorganismo. Un microorganismo puede incluir una célula de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterobacteriaceae, Enterococcus spp. Streptococcus spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas spp. o Mycobacterium spp.

El término "muestra" puede incluir una única célula o múltiples células o una alícuota de líquido corporal, tomadas de un entorno o sujeto, por medios que incluyen venopunción, excreción, eyaculación, masaje, biopsia, aspirado con aguja, muestra de lavado, raspado, incisión quirúrgica, hisopado o intervención u otros medios conocidos en la técnica. En algunos aspectos, una muestra puede incluir una muestra clínica, tal como una muestra obtenida de un sujeto en un entorno clínico, tal como un hospital. En algunos aspectos, una muestra es una muestra de hisopado nasal, una muestra de hisopado rectal, una muestra de sangre, una muestra de hemocultivo positivo, una muestra de piel/partes blandas, una muestra de lavado broncoalveolar, una muestra de esputo, una muestra de heces, una muestra de orina y/o una muestra de un microorganismo aislado.

El término "sujeto" engloba una célula, tejido u organismo, humano o no humano, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro, de sexo masculino o femenino.

Agentes antimicrobianos

Un "agente antimicrobiano" se refiere a un compuesto que puede destruir, inhibir el crecimiento o de otro modo alterar la viabilidad de uno o más microorganismos. Los agentes antimicrobianos incluyen antibióticos, antifúngicos, antiprotozoicos, antivíricos y otros compuestos.

Un agente antimicrobiano puede incluir cefoxitina, una p-lactama, una p-lactama de espectro extendido, un aminoglucósido, una ansamicina, un carbacefem, carbapenémicos, cualquier generación de cefalosporina, un glucopéptido, una lincosamida, un lipopéptido, un macrólido, un monobactámico, un nitrofurano, una oxazolidonona, una penicilina, un polipéptido, una quinolona, una fluoroquinolona, una estreptogramina, una sulfonamida, una tetraciclina, una rifampicina, un antibiótico micobacteriano, cloranfenicol y mupirocina.

En algunos aspectos, los procedimientos, sistemas y composiciones divulgados en el presente documento pueden incluir un agente antimicrobiano en contacto con una muestra y la detección de una señal producida por una secuencia de ácido nucleico indicadora de un NRTP para determinar si uno o más microorganismos de interés es susceptible o no susceptible al agente antimicrobiano. En determinados aspectos, el agente antimicrobiano es un antibiótico.

En algunos aspectos, los procedimientos, sistemas y composiciones divulgados en el presente documento pueden incluir concentraciones predeterminadas variables de agente antimicrobiano en contacto con una muestra y detectar la cantidad de una señal para determinar la concentración inhibidora mínima del uno o más microorganismos de interés con respecto al agente antimicrobiano. En determinados aspectos, el agente antimicrobiano es un antibiótico.

Crecimiento celular

Los procedimientos, sistemas y composiciones divulgados en el presente documento típicamente son procedimientos, sistemas y composiciones independientes del crecimiento, por ejemplo, para la detección de una o más células en una muestra derivada de un sujeto. Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir aislar u obtener una muestra de un sujeto de interés y poner en contacto directamente una NRTP descrita en el presente documento con la muestra (o un cultivo que comprenda la muestra) para detectar una célula o conjunto de células de interés que pueden o pueden no estar presentes en la muestra, independientemente del crecimiento.

En la técnica son conocidos diversos procedimientos para determinar el crecimiento, por ejemplo, procedimientos que detectan el crecimiento masivo de células, por ejemplo, midiendo un incremento de la densidad óptica de una muestra y/o procedimientos que miden el crecimiento de células discretas en una muestra, tal como microscopia, microscopia automatizada y/o cultivo tradicional de organismos en medios sólidos para detectar la presencia de una colonia de bacterias en los medios sólidos.

Se pueden usar diversas condiciones de cultivo para detectar una célula de una manera independiente del crecimiento, por ejemplo, una o más formulaciones de nutrientes que soportan la capacidad de una célula de transcribir y traducir independientemente de la tasa de replicación celular. En algunos aspectos, las condiciones de cultivo incluyen condiciones de nutrientes limitados, por ejemplo, tales como las proporcionadas por los medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Fisher Scientific Company, LLC). En algunos aspectos, las condiciones de cultivo se seleccionan de modo que imiten el estado metabólico de las células en un entorno natural. En algunos aspectos, las condiciones de cultivo se limitan a o incluyen el uso de una muestra que está en un estado similar a o idéntico a su estado en su entorno natural.

En algunos aspectos, la tasa de crecimiento de un microorganismo o población de microorganismos es menor que la fase exponencial. En algunos aspectos, la tasa de crecimiento de un microorganismo o población de microorganismos puede ser menor que o igual a 0,05, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,2 o 3 divisiones por hora. En algunos aspectos, la tasa de crecimiento de un microorganismo o población de microorganismos puede ser menor que o igual a 1 división celular por período de 4 horas, menor que o igual a 2 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 3 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 4 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 5 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 6 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 7 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 8 divisiones celulares por período de 4 horas, menor que o igual a 9 divisiones celulares por período de 4 horas o menor que o igual a 10 divisiones celulares por período de 4 horas. En algunos aspectos, la tasa de crecimiento de un microorganismo o población de microorganismos puede ser menor que o igual a 0,1 divisiones por hora, en particular, cuando el microorganismo o población de microorganismos es o incluye Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM).

En algunos aspectos, el crecimiento de un microorganismo o población de microorganismos se puede caracterizar como fase estacionaria, menor que la fase estacionaria o mayor que la fase estacionaria, pero menor que la fase exponencial. En algunos aspectos, un microorganismo o población de microorganismos puede no experimentar ningún crecimiento o ningún crecimiento detectable. En algunos aspectos, el crecimiento de un microorganismo o población de microorganismos puede ser negativo (por ejemplo, se produce mayor muerte celular que división celular) u homeostático (por ejemplo, la muerte y división celulares son relativamente iguales).

Ejemplos

A continuación hay ejemplos de modos de realización específicos para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solo para propósitos ilustrativos y no están previstos para limitar el alcance de la presente invención de ningún modo. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se debe considerar algún error y desviación experimentales.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, procedimientos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman y Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey y Sundberg Advanced Organic Chemistry 3.a ed. (Plenum Press), vols. A y B(1992).

Ejemplo 1: sistema de empaquetamiento por deleción/complementación.

Lo siguiente es un ejemplo del diseño y construcción de un sistema de empaquetamiento basado en deleción/complementación para producir partículas de transducción no replicativas.

Los materiales usados para desarrollar el sistema de empaquetamiento se enumeran a continuación:

Cepas bacterianas:

RN4220 es una cepa de S. aureus desprovista de restricción que es un derivado no lisógeno de NCTC 8325 y es un receptor eficaz para el ADN de E. coli. Se describió por primera vez en Kreiswirth, B.N. et al., The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature, 1983. 305(5936): p.

709-712.

RN10616 se deriva lisogenizando RN4220 con el bacteriófago 980a. Ubeda, C. et al., Specificity of staphylococcal phage and SaPI DNA packaging as revealed by integrase and terminase mutations. Molecular Microbiology, 2009.

72(1): p. 98-108.

ST24 se deriva de la deleción del gen de la terminasa pequeña terS del bacteriófago lisogenizado 980a en RN10616. Ubeda, C. et al., Specificity of staphylococcal phage and SaPI DNA packaging as revealed by integrase and terminase mutations. Molecular Microbiology, 2009. 72(1): p. 98-108.

Vectores:

Los ejemplos de plásmidos que se pueden usar como plásmidos fuente para casetes, en algunos modos de realización de la invención, se describen en Charpentier, E., et al., Novel Cassette-Based Shuttle Vector System for Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 2004. 70(10): p. 6076-6085.

Se pueden usar los siguientes números de acceso de GenBank para las secuencias de casete:

SEQ ID NO:1 (origen de replicación del plásmido pT181 de S. aureus, variante en número de copias pT181cop-623 repC)

M21136 (tetA(M))

SEQ ID NO:2 (secuencia del promotor PclpB)

SEQ ID NO:3 (secuencia del gen de la terminasa pequeña (terS) de 011)

L09137 (amp ColEl ori)

X06758 (luxAB)

M62650 (terminación de la transcripción)

Deleción de terS: la construcción de la cepa con terS inactivado ST24 se puede lograr por medio de una estrategia basada en intercambio alélico que da como resultado una deleción sin cambio de pauta de lectura que retira la mayor parte de la secuencia codificante del gen de la terminasa pequeña de 980a. Los detalles de esta estrategia se describen en Ubeda, C. et al., Specificity of staphylococcal phage and SaPI DNA packaging as revealed by integrase and terminase mutations. Molecular Microbiology, 2009. 72(1): p. 98-108.

Una secuencia ejemplar de una cepa con terS inactivado se muestra en SEQ ID NO:4 (mostrada en el listado de secuencias a continuación). La SEQ ID NO:4 son locus de secuencia genómica de RN10616 que muestran la deleción de terS de 980a y complementación.

Construcción de vectores: el vector GW80A0001 es un vector transportador de E. coli/S. aureus. El vector contiene orígenes de replicación de S. aureus (pT 181cop-623 repC) y E. coli (ColElori), los marcadores seleccionables para la resistencia a ampicilina (amp) y tetraciclina (tet(M)) para la selección en E. coli y S. aureus, respectivamente, la secuencia del gen de la terminasa pequeña (terS) de 9 I I que incluye su propio promotor, los genes luxA y luxB son de Vibrio harveyi enlazados de forma funcional al promotor PclpB de S. aureus constitutivo, y una secuencia de terminación de la transcripción (TT).

El vector resultante (pGW80A0001, SEQ ID NO:5) se puede construir de una variedad de maneras que son conocidas por un experto en la técnica. En un ejemplo, el casete para tet(M) y los genes luxAB se pueden obtener por medio de amplificación por PCR de los vectores pCN36 y pCN58 disponibles públicamente (Charpentier, E., et al.). Se puede obtener PclpB de la amplificación por PCR de RN4220 de S. aureus y se puede obtener terS por medio de amplificación por PCR de RN10616. Se puede obtener una cadena principal del vector retirando el gen ermC del vector pCN48 disponible públicamente (Charpentier, E., et al.), y los diversos componentes del vector final pGW80A0001 se pueden ensamblar en esta cadena principal del vector por medio de clonación basada en enzima de restricción diseñada apropiadamente.

Sistema de empaquetamiento por deleción/complementación: el sistema de empaquetamiento puede incluir la cepa con terS inactivado ST24 complementada con el vector pGW80A0001 para generar la cepa GW24. Como es conocido para un experto en la técnica, la manera de construir este sistema se puede lograr por transformación de ST24 con el vector pGW80A0001. El vector pGW80A0001 se puede mantener en cultivos de la ST24 transformada haciendo que el transformante crezca en presencia de 5 ug/ml de tetraciclina.

Producción de partículas de transducción que llevan ADN plasmídico: se pueden producir partículas de transducción no replicativas que lleven el vector pGW80A0001 a partir de GW24 por medio de un procedimiento de inducción por mitomicina C que se demostró por primera vez en E. coli y ahora es una técnica estándar para obtener profagos de bacterias lisogenizadas. Otsuji, N. et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coli K-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080. Este procedimiento de inducción de profago da como resultado la inducción del ciclo lítico de 980a en el que el profago se escinde del genoma de GW24, produce elementos estructurales de fago y empaqueta ADN concatamérico de pGW80A0001 en partículas de fago descendientes. A continuación, se recoge el lisado celular resultante y contiene partículas de transducción no replicativas, consistiendo cada una en partículas de bacteriófago 980a que llevan un concatámero lineal de ADN de pGW80A0001.

Ejemplo 2: sistema indicador basado en partículas de transducción no replicativas.

Las partículas de transducción no replicativas descritas anteriormente se pueden usar en un sistema indicador para detectar la presencia de bacterias viables por medio de la expresión de una molécula indicadora (por ejemplo, luxAB). Cuando esta partícula de transducción introduce un vector indicador (por ejemplo, PGW80A0001) en una célula dentro de la gama de huéspedes de la partícula de transducción, las células en las que el promotor (por ejemplo, PclpB) se reconoce por la maquinaria de transcripción de las células pueden accionar la expresión de la molécula indicadora dentro de esa célula.

Para someter a prueba la funcionalidad de las partículas de transducción no replicativas como indicadores para detectar la presencia de células de S. aureus, se desarrollaron diversos ensayos con indicadores para SASM/SARM. En un modo de realización, se desarrolló una partícula de transducción no replicativa a partir de un bacteriófago específico de S. aureus y se incorporaron los genes de la luciferasa bacteriana luxAB bajo el control de un promotor constitutivo. Cuando la partícula de transducción no replicativa insertó el ácido nucleico indicador en S. aureus, el promotor constitutivo expresó luxAB adecuados para indicar la presencia de un S. aureus viable.

Además, el antibiótico cefoxitina se añadió antes de, simultáneamente con, o después de la adición de las partículas de transducción en una muestra que contenía células de S. aureus. Si las células no eran fenotípicamente resistentes a cefoxitina (es decir, no eran SARM), la luminiscencia disminuyó o se eliminó, lo que indicaba que las células eran SASM. Sin embargo, si las células eran fenotípicamente resistentes a cefoxitina (es decir, eran SARM), se observó una luminiscencia incrementada o detectable, lo que indicaba que las células eran SARM.

Ejemplo 3: detección de células independiente del crecimiento.

Como ejemplo, se llevó a cabo una prueba para evaluar el impacto de la replicación celular sobre la capacidad de detectar una célula diana.

Se empleó una partícula de transducción para S. aureus y ensayo como se describe en el ejemplo 1 (véase también el documento PCT/US2014/026536, ejemplo 2) en un ensayo para detectar SARM. La partícula de transducción provoca que las células de S. aureus viables produzcan luciferasa bacteriana que pueda mediar en una reacción de luminiscencia que se supervisa usando un tubo fotomultiplicador que mide las unidades relativas de luz (URL) emitidas por la reacción de luminiscencia. Cuando se somete a prueba la SARM, el ensayo emplea cefoxitina, de modo que la SASM no produce ninguna señal de luminiscencia, mientras que la SARM sí produce una señal de luminiscencia en el ensayo. En resumen, se prepararon cultivos de cepas aisladas clínicas de SARM obtenidas de la Network for Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) en condiciones de nutrientes limitados de cultivo en medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Fisher Scientific Company, LLC) para producir cultivos celulares con células que presentan actividad metabólica limitada, es decir, que imitan el estado metabólico de las células en un entorno natural. Los cultivos celulares se normalizaron a una DO600 = 0,1 y se usaron para inocular muestras. Las muestras se mezclaron con el reactivo de partículas de transducción descrito en el ejemplo 2 (véase también el documento PCT/US2014/026536, ejemplo 7) y cefoxitina y se incubaron durante 4 h a 37 °C, a continuación, se sometieron a prueba para determinar la producción de luminiscencia después de la adición de un reactivo para el sustrato de luciferasa bacteriana aldehído graso (tridecanal). Además de ejecutar el ensayo de luminiscencia, la cantidad de bacterias en cada muestra se cuantificó antes de la adición de partículas de transducción/incubación y después de la incubación/antes de la adición de sustrato sembrando en placa una alícuota de cada muestra de agar-TSB y enumerando el número de colonias resultantes después de 18-24 horas de incubación con cada muestra enumerado como UFC totales en la muestra en cada punto de tiempo.

La FIG. 1 resume los datos obtenidos de la prueba. La FIG. 1a resume la proporción de UFC después (t=4 h) y antes (t=0 h) del ensayo. La FIG. 1b resume la señal producida a partir de las muestras resumidas en la FIG. 1a, donde la línea de puntos en ~200 URL es el umbral de fondo calculado a partir de la señal de fondo promedio más 3 veces su desviación estándar.

Los resultados indican que el ensayo no requirió crecimiento bacteriano para detectar las células diana. El análisis del crecimiento bacteriano durante el ensayo reveló de poco a ningún crecimiento durante el ensayo a pesar de un incremento continuo del producto señal en SARM. Como se muestra, la FIG. 1a resume la proporción de recuentos por UFC de SARM al final del ensayo y al comienzo del ensayo, donde la mayoría de muestras presentaron un crecimiento mínimo durante el ensayo de 4 horas (por ejemplo, 1-2 divisiones), mostrando dos muestras una disminución del crecimiento (48 y 60), mostrando una muestra ningún crecimiento (51) y presentando 3 muestras menos de 0,4 divisiones por hora (40, 51 y 81). Como se ilustra en la FIG. 1b, todas las muestras produjeron una señal positiva durante el ensayo. A pesar de presentar de poco a ningún crecimiento, todas las muestras sometidas a prueba produjeron una señal positiva (URL) sobre el fondo.

Ejemplo 4: detección de células independiente del crecimiento a partir de muestras clínicas.

Como ejemplo, se llevó a cabo una prueba para evaluar el impacto de la replicación celular sobre la capacidad de detectar una célula diana directamente a partir de muestras clínicas.

Se empleó una partícula de transducción para S. aureus y ensayo como se describe en el ejemplo 1 (véase también el documento PCT/US2014/026536, ejemplo 2) en un ensayo para detectar SARM. La partícula de transducción provoca que las células de S. aureus viables produzcan luciferasa bacteriana que pueda mediar en una reacción de luminiscencia que se supervisa usando un tubo fotomultiplicador que mide las unidades relativas de luz (URL) emitidas por la reacción de luminiscencia. Cuando se somete a prueba la SARM, el ensayo emplea cefoxitina, de modo que la SASM no produce ninguna señal de luminiscencia, mientras que la SARM sí produce una señal de luminiscencia en el ensayo. En resumen, se sometieron a prueba muestras de hisopados nasales remanentes recogidas de pacientes por un centro hospitalario para el propósito de vigilancia de SARM para determinar la presencia de SARM usando el ensayo con partículas de transducción. Las muestras se mezclaron con el reactivo de partículas de transducción como se describe en el ejemplo 2 (véase también el documento PCT/US2014/026536, ejemplo 7) y cefoxitina y se incubaron durante 4 h a 37 °C, a continuación, se sometieron a prueba para determinar la producción de luminiscencia después de la adición de un reactivo para el sustrato de luciferasa bacteriana aldehído graso (tridecanal). Además de ejecutar el ensayo de luminiscencia, la cantidad de bacterias en cada muestra se cuantificó antes de la adición de partículas de transducción/incubación y después de la incubación/antes de la adición de sustrato sembrando en placa una alícuota de cada muestra de agar-TSB y enumerando el número de colonias resultantes después de 18-24 horas de incubación con cada muestra enumerado como UFC totales en la muestra en cada punto de tiempo.

La FIG. 2 resume los datos obtenidos de cuatro muestras clínicas que eran positivas para SARM. La FIG. 2a resume la proporción de UFC después (t=4 h) y antes (t=0 h) del ensayo. La FIG. 2b resume la señal producida a partir de las cuatro muestras clínicas resumidas en la FIG. 2a, donde la línea de puntos en ~200 URL es el umbral de fondo calculado a partir de la señal de fondo promedio más 3 veces su desviación estándar.

Los resultados indican que el ensayo no requirió crecimiento bacteriano para detectar las células diana. El análisis del crecimiento bacteriano durante el ensayo reveló de poco a ningún crecimiento durante el ensayo a pesar de un incremento continuo del producto señal en SARM. Como se muestra, la FIG. 2a resume la proporción de recuentos por UFC de SARM al final del ensayo y al comienzo del ensayo, donde la mayoría de las muestras presentaron un crecimiento mínimo durante el ensayo de 4 horas (por ejemplo, 1-2 divisiones) y una muestra (3037) mostró una disminución del crecimiento. Como se ilustra en la FIG. 2b, todas las muestras produjeron una señal positiva durante el ensayo. A pesar de presentar de poco a ningún crecimiento, todas las muestras sometidas a prueba produjeron una señal positiva (URL) sobre el fondo.

SECUENCIAS

SEQ ID NO:1

Origen de replicación del plásmido pT181 de S. aureus, variante en número de copias pT181cop-623 repC

TTTGCGGAAAGAGTTAGTAAGTTAACAGAAGACGAG CCAAACCTAAATGGTTTAG CAGGAAACTTAGATAAAAAA ATGAATCCAGAATTATATTCAGAACAGGAACAGCAACAAGAGCAACAAAAGAATCAAAAACGAGATAGAGGTATG CACTTATAGAACATGCATTTATGCCGAGAAAACTTATTGGTTGGAATGGGCTATGTGTTAGCTAACTTGTTAGCG AGTTGGTTGGACTTGAATTGGGATTAATCCCAAGAAAGTACCGGCTCAACAACCCATAAAGCCCTGTAGGTTCCG NCCAATAAGGAAATTGGAATAAAG CAATAAAAGGAGTTGAAGAAATGAAATTCAGAGAAG CCTTTGAGAATTTTA TAACAAGTAAGTATGTACTTGGTGTTTTAGTAGTCTTAACTGTTTACCAGATAATACAAATGCTTAAATAAAAAA AGACTTGATCTGATTAGACCAAATCTTTTGATAGTGTTATATTAATAACAAAATAAAAAGGAGTCGCTCACGCCC TAC CAAAGTTTGTGAACGACAT CAT T CAAAGAAAAAAACAC TGAGTTGTTTT TATAAT CTTGTATATTTAGATAT TAAAC GATAT T TAAATATACAT CAAGATATATAT TTGGGTGAGCGATTACT TAAA C GAAAT T GAGAT TAAG GAG T CGATTTTTTATGTATAAAAACAATCATGCAAATCATTCAAATCATTTGGAAAATCACGATTTAGACAATTTTTCT AAAACCGGCTACTCTAATAGCCGGTTGGACGCACATACTGTGTGCATATCTGATCCAAAATTAAGTTTTGATGCA ATGACGATCGTTGGAAATCTCAACCGAGACAACGCTCAGGCCCTTTCTAAATTTATGAGTGTAGAGCCCCAAATA AGACTTTGGGATATTCTT C AAA C AAAG T T TAAAG C TAAAG CAC T T CAAGAAAAAG TTTATATT GAATAT GAOAAA GTGAAAGCAGATAGTTGGGATAGACGTAATATGCGTATTGAATTTAATCCAAACAAACTTACACGAGATGAAATG ATTTGGTTAAAACAAAATATAATAAGCTACATGGAAGATGACGGTTTTACAAGATTAGATTTAGCCTTTGATTTT GAAGATGATTTGAGTGACTACTATGCAATGTCTGATAAAGCAGTTAAGAAAACTATTTTTTATGGTCGTAATGGT AAG C CAGAAACAAAATAT TTTGGCGTGAGAGATAG TAATAGAT T TAT TAGAAT T TATAATAAAAAGCAAGAACGT AAAGATAATGCAGATGCTGAAGTTATGTCTGAACATTTATGGCGTGTAGAAATCGAACTTAAAAGAGATATGGTG GATTACTGGAATGATTGCTTTAGTGATTTACATATCTTGCAACCAGATTGGAAAACTATCCAACGCACTGCGGAT AGAG CAATAG TTTTTATGTTATTGAGTGAT GAAGAAGAAT G G G GAAAG C T T CA CAGAAAT T C TAGAACAAAATAT AAGAATTTGATAAAAGAAATTTCGCCAGTCGATTTAACGGACTTAATGAAATCGACTTTAAAAGCGAACGAAAAA CAATTGCAAAAACAAATCGATTTTTGGCAACATGAATTTAAATTTTGGAAATAGTGTACATATTAATATTACTGA ACAAAAATGATATATTTAAACTATTCTAATTTAGGAGGATTTTTTTATGAAGTGTCTATTTAAAAATTTGGGGAA TTTATATGAGGTGAAAGAATAATTTACCCCTATAAACTTTAGCCACCTCAAGTAAAGAGGTAAAATTGTTTAGTT TATATAAAAAATTTAAAGGTTTGTTTTATAGCGTTTTATTTTGGCTTTGTATTCTTTCATTTTTTAGTGTATTAA ATGAAATGGTTTTAAATGTTTCTTTACCTGATATTGCAAATCATTTTAATACTACTCCTGGAATTACAAACTGGG TAAACACTGCATATATGTTAACTTTTTCGATAGGAACAGCAGTATATGGAAAATTATCTGATTATATAAATATAA AAAAATTGTTAATTATTGGTATTAGTTTGAGCTGTCTTGGTTCATTGATTGCTTTTATTGGGCCCACCTAGGCAA ATATGCTCTTACGTGCTATTATTTAAGTGACTATTTAAAAGGAGTTAATAAATATGCGGCAAGGTATTCTTAAAT AAACTGTCAATTTGATAGCGGGAACAAATAATTAGATGTCCTTTTTTAGGAGGGCTTAGTTTTTTGTACCCAGTT TAAGAATAC C T T TATCATGTGATT CTAAAGTATC CAGAGAATATCTGTATG CTTTGTATACCTATGGTTATG CAT AAAAATCCCAGTGATAAAAGTATTTATCACTGGGATTTTTATGCCCTTTTGGGTTTTTGAATGGAGGAAAATCAC ATGAAAATTATTAATATTGGAGTTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAAACTACCTTAACAGAAAGCTTATTATAT AACAG TGGAGCGAT TACAGAAT TAG GAAG C G T G GACAAAG G TA CAAC GAG GAC G GATAATAC G C T T T TAGAA C G T CAGAGAGGAATTACAATT CAGACAGGAATAAC CT CTTTT CAGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACG CCAGGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATGGGGCAATTCTACTGATTTCT GCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTTAGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTT TTTATCAATAAGATTGAC CAAAATGGAATTGATTTATCAACGGTTTATCAGGATATTAAAGAGAAACTTTCTGCC GAAATTGTAATCAAACAGAAGGTAGAACTGTATCCTAATATGTGTGTGACGAACTTTACCGAATCTGAACAATGG GATACGGTAATAGAGGGAAACGATAACCTTTTAGAGAAATATATGTCCGGTAAATCATTAGAAGCATTGGAACTC GAACAAGAGGAAAGCATAAGATTTCAGAATTGTTCTCTGTTCCCTCTTTATCATGGAAGTGCAAAAAGTAATATA GGGATTGATAACCTTATAGAAGTTATTACTAATAAATTTTATTCATCAACACATCGAGGTCCGTCTGAACTTTGC G GAAAT G T T T T CAAAAT T GAATATACAAAAAAAAGA CAA CGTCTTGCATATATACGCCTTTATAGTGGAGTACTA CATTTACGAGATTCGGTTAGAGTATCAGAAAAAGAAAAAATAAAAGTTACAGAAATGTATACTTCAATAAATGGT GAAT TAT G TAAGAT TGATAGAGCTTATTCTG GAGAAAT TGTTATTTTG 0 AAAAT GAGTTTTT GAAG T TAAATAG T GTTCTTGGAGATACAAAACTATTGCCACAGAGAAAAAAGATTGAAAATCCGCACCCTCTACTACAAACAACTGTT GAACCGAGTAAACCTGAACAGAGAGAAATGTTGCTTGATGCCCTTTTGGAAATCTCAGATAGTGATCCGCTTCTA CGATATTACGTGGATTCTACGACACATGAAATTATACTTTCTTTCTTAGGGAAAGTACAAATGGAAGTGATTAGT G CACTGTTG CAAGAAAAG TATCATGTG GAGATAGAA C TAAAAGAG CCTACAGTCATTTATATGGAGAGACCGTTA AAAAATGCAGAATATACCATTCACATCGAAGTGCCGCCAAATCCTTTCTGGGCTTCCATTGGTTTATCTGTATCA CCGCTTCCGTTGGGAAGTGGAATGCAGTATGAGAGCTCGGTTTCTCTTGGATACTTAAATCAATCATTTCAAAAT GCAGTTATGGAAGGGGTACGCTATGGTTGCGAACAAGGATTATATGGTTGGAATGTGACGGATTGTAAAATCTGT TTTAAGTACGGTTTATACTATAGCCCTGTTAGTACTCCAGCAGATTTTCGGATGCTTACTCCTATTGTACTGGAG CAAGC CTTTAGAAAAGCTGGAACAGAATTGTTAGAG CCATATCTTAGTTTTAAAGTTTATGCACCACAGGAATAT CTTTCNCGGGCATATAACGATGCTCCCAAATATTGTGCAAATATCGTAAATACTCAACTGAAAAATAATGAGGTC ATTATTATTGGAGAAATTCCTGCTCGATGTATTCAAGATTATCGCAATGATTTAACTTTTTTTACAAATGGGCTT AGTGTTTGTTTAGCAGAGCTAAAAGGATATCAGGTTACCACTGGCGAACCTGTTTGCCAGACCCGTCGTCTAAAT AG T C G GATAGATAAAG TAAGATATAT G T T CAATAAAATAAC TTAGTGCGTTTTATGTTGT TATATAAATAT G G T T TCTTATTAAATAAGATGAAATATTCTTTAATATAGATTTGAATTAAAGTGGAAAGGAGGAGATTGTTATTATAAA CTACAAGTGGATATTGTGTCCTATTTGTGGAAATAAAACAAGACTACGAATACGAGTGGATACTATACTTAAAAA TTT CC CTTTATACAG CC C CAAAT G TAAGAA C GAAAC T T TAAT TAAT G T T CAAAAAAT GAATATAATAA CAATCAA AGAGCCAGACGCCAAGACGCAGAGCCGATAATTTGAGAAATGAAACTCTCATCTTATCGGCTCTTTTTGTTTATC TGAATTTTACTGACTAGCCTTCAATATTTCC

SEQ ID NO:2

Secuencia del promotor PcipB de S. aureus

G T C TAGT TAAT GT GTAAC GTAACATTAG CTAGATTTTTTTATT CAAAAAAATATT TACAAATAT TAGGAAAT TTA AGT GTAAAAGAGT TGATAAATGAT TATATTGG GACTATAATATAATTAAGG T C

SEQ ID NO:3

Secuencia que contiene el gen terS natural

AATT GG CAGTAAAG TGGCAGTTTTTGATACC T AAAAT GAGATATTATGATAGTGTAGGATATTGACTATCTTACT GCGTTTCCCTTATCG CAAT TAGGAATAAAGGAT CTATGTGGGTTGGCTGATTATAGC CAAT C C TT TT TTAATT TT AAAAAG CGTATAGCGCGAGAGTTGGTG GTAAAT GAAAT GAA C GAAAAACAAAAGAGATT CG CAGATG AATATATA AT GAAT GGAT GTAATGGTAAAAAAG CAG CAATT TCAGCAGGT TATAGTAAGAAAA CAGCAGAGTCTTTAG CAAGT CGAT TG TTAAGAAATGTTAAT GT TT CG GAATATAT TAAAGAACGAT TAGAA CAGATA CAAGAAGAG C GT TTAATG AG CATTA CAGAAG CTTTAGCGTTATCTGCTTCTATTGC TAGAGGAGAAC C T CAAGAGG C TTA CAG TAAGAAATAT GAC CAT TTAAA C GATGAAG TG GAAAAAGAGG TTA C TTACACAAT CACAC CAACT TT TGAAGAG CGTCAGAGATCT AT TGA C CACATACTAAAAG TTCATGGTGCGTATAT CGACAAAAAAGAAAT TACT CAGAAGAATAT TGAGAT TAAT ATTGGTGAGTACGATGA CGAAAG TTAAAT TAAACT TTAA CAAA C CAT C TAAT GT TT T CAA CAG

SEQ ID NO:4

Locus de secuencia genómica de RN10616 que muestran la deleción de terS de 980a y complementación. terS=texto entre corchetes, deleción=subrayado, complemento=negrita

ATTAGACAACAAACAAGT CATTGAAAATTC CGACTTATTATTCAAAAAGAAATTTGATAG CG CAGATATACAAG C TAGGTTAAAAGTAGG CGATAAGGTAGAAGTTAAAACAAT CGGTTATAGAATACACTTTTTAAATTTATAT CCGGT CTTATACGAAGTAAAGAAGGTAGATAAACAATGATTAAACAAATACTAAGACTATTATTCTTACTAGCAATGTAT GAGTTAGGTAAGTATGTAACTGAGCAAGTATATATTATGATGACGGCTAATGATGATGTAGAGGTGCCGAGTGAC

TTCGCGAAGTTGAGCGATCAGT CAGATTTGATGAGGGCGGAGGTGACGGAGTAGATGATGTGGTTAGT CATAGCA ATTATATTACTAGTCATCTTATTGTTTGGTGTGATGTTGCAAGCTGAACAGTTAAAAGGCGATGTGAAAGTTAAA GAGCGGGA GA TA GA GA TAT TAAGAA GTAGATTGAGACATTTT GAAGAT T AAAAAT ATTTGTATGGAGGGTATTCA T GA C T AAAAAGAAATAT G GAT TAAAAT TAT CAACAG T T C GAAAG T TAGAAGAT GAGTTGTGTGATTATCC TAAT T AT CA T AAG CAA C T C GAAGAT T TAAGAAG T GAAATAAT GACACCATGGATTC CAAGAGATA CAAATATAG G C GG GG AGTTTGTACCGTCTAATACATCGAAAACAGAAATGGCAGTAACTAATTATCTTTGTAGTATACGAAGAGGTAAAA TCCTTGAGTT TAAGAG C G C TA T T GAA C GTATAA T CAA CA CAT C AAG T AGGAAAGAAC G C GAAT T CAT T CAAGAGT AT TA T T T TAA TAAAAAG GAAT TAG T GAAAG TTTGTGATGACATACACATTTCT GATAGAA CTGCTCAT AGAAT C A AAAG GAAAAT CATATCTAGATTGGCG GAAGAG T TAG G G GAAGAG T GAAAT TG GCAG TAAAG TG GC AG TT TT TG AT AC CTAAAATGAGATAT TAT GATAGT GTAG GATATT GAC TATC TTACTGCGTTTCCC TTATC GCAATTAG GAATAA AG GATC TATG TGGGTTGGCTGAT TATAGC CAAT CC TT T TT TAAT TT TAAAAAGC GTATAGC GC GAGAGT TG GT GG TAAATGAA

[ [ ATGAACGAAAAACAAAAGAGATTCGCAGATGAATATATAATGAATGGATGTAATGGT AAAAAAGCAGCAATTT CAGCAG GT TATAGTAAGAAAACAGCAGAG TC TT TAGCAAG TC GATT GT TAAGAAAT GTTAATG TT TC GGAATATA TTAAAGAACGAT TAGAACAGATACAAGAAGAGC GT TTAAT GAGCAT TACAGAAG CT TTAGC GT TATC TG CT TC TA TT GC TAGAGGAGAACC TCAAGAG GCTTACAG TAAGAAATATGAC CATT TAAACGAT GAAGT GGAAAAAGAG GT TA CT TACACAAT CACACCAAC TT TT GAAGAG CGTCAGAGATC TATT GACCACATAC TAAAAGT TCATGGTGCG TATA TC GACAAAAAAGAAAT TAC TCAGAAGAATAT TGAGAT TAATATT GG TGAG TACGAT GAC GAAAGT TAA] ] AT TAAACT TTAACAAACCATC TAAT GT TT TCAACAGAAA CATAT T C GAAATAC TAAC CAAT TAC GATAAC T T CA C TGAAGTACATTACGGTGGAGGTTCGAGTGGTAAGTCTCACGGCGTTATACAAAAAGTTGTACTTAAAGCATTGCA AGACTGGAAATATCCTAGGCGTATACTATGGCTTAGAAAAGTCCAATCAACAATTAAAGATAGTTTATTCGAAGA TGTCAAAGATTGTTTGATAAACTTCGGTATTTGGGACATGTGCCTTTGGAATAAGACTGATAACAAAGTTGAATT G C CAAA CGGCGCAGTTTTTTTGTT TAAAG GAT TAGATAA C C CAGAGAAAATAAAGT C GATAAAAG GCATATCAGA CATAGTCATGGAAGAAGCGTCTGAATTCACACTAAATGATTACACGCAATTAACGTTGCGTTTGAGGGAGCGTAA ACACGTGAATAAGCAAATATTTTTGATGTTTAACCCAGTATCTAAACTGAATTGGGTTTATAAGTATTTCTTTGA A CAT G G T GAAC CAAT G GAAAAT GTCATGATTAGA CAAT CTAGTTATC GAGATAATAAGT TTCTTGAT GAAAT GAC ACGACAAAACTTAGAGTTGTTAGCAAATGGTAATCCAGCATATTACAAAATTTATGCGTTAGGTGAATTTTCTAC ACTAGACAAATTGGTTTTCCCTAAGTATGAAAAACGTTTAATAAATAAAGATGAGTTAAGACATTTACCTTCTTA TTTTGGATTGGACTTTGGCTACGTTAATGATCCTAGTGCTTTTATACATTCTAAAATAGATGTAAAGAAAAAGAA GTTATACATCATTGAAGAGTATGTTAAAGAAGGTATGCTGAATGATGAAATAG CTAATGT CATAAAGCAACTTGG TTATGCTAAAGAAGAAATTACAGCAGATAGTGCAGAACAAAAAAGTATAGCTGAATTAAGGAATCTAGGGCTTAA AAGGATTTTACCAACCAAAAAAGGGAAGGGCTCGGTTGTACAAGGGTTACAATTCTTAATGCAATTTGAAATCAT T G T T GAT GAAC G T T G T T T CAAGAC TATT GAAGAG T T T GA CAAC TACACATGG CAAAAG GA CAAAGATA CAG GT GA ATATACCAATGAACCAGTAGATACATACAATCATTGTATCGATTCGTTGCGTTATTCAGTGGAACGATTC

SEQ ID NO:5

Secuencia completa de pGW80A0001

GGCGCCATGG TTAAGG GCCCTTTGC GGAAAGAG TTAG TAAGT TAA CAGAAGACGAAC CAAAA C TAAATG GT TTAG CAGGAAA C TTAGATAAAAAAATGAAT C CAGAAT TATAT T CAGAACAGGAACAG CAACAAGAA CAACAAAAGAAT C AAAAA CGAGATAGAGGTATGCAC TTATAGAACATG CATTTATGC CGAGAAAACT TATTGGTTG GAAT GGGCTATG TG TTAG CTAACT TGTTAGCGAGTTGGTTGGACT TGAAT TG GGAT TAAT C C CAAGAAAGTA C CAA C T CAACAA CA C ATAAAG CCCTGTAGGTTCCGAC CAATAAG GAAATT GGAATAAAG CAATAAAAGGAG TTGAAGAAATGAAAT T CAG AGAAG C CT TT GAGAAT TTTATAACAAG TAAG TATGTACTTGGTGTTTTAGTAGTCT T AACT GT TTA C CAGATAAT A CAAAT G C TTAAATAAAAAAAGACT TGATCTGATTAGAC CAAAT CTTTTGATAGTG TTATATTAATAA CAAAATA AAAAGGAG TCGCTCACGCCCTAC CAAAGT TT GT GAA CGACATCATT CAAAGAAAAAAA CACTGAGTTGTTTTTAT AAT CTTGTATAT TTAGATATTAAA C GATATT TAAATATA CAT CAAGATATATAT TTGGGTGAGCGATTACT TAAA CGAAATTGAGATTAAGGAGTCGATTTTTTATGTATAAAAACAATCATGCAAATCATTCAAATCATTTGGAAAATC ACGATTTAGACAATTTTTCTAAAACCGGCTACTCTAATAGCCGGTTGGACGCAGATACTGTGTGCATATCTGATC CAAAATTAAGTTTTGATGCAATGAGGATCGTTGGAAATCTCAACCGAGACAAGGCTCAGGCCCTTTCTAAATTTA TGAGTGTAGAGCCCCAAATAAGACTTTGGGATATTCTTCAAACAAAGTTTAAAGCTAAAGCACTTCAAGAAAAAG TTTATATTGAATATGACAAAGTGAAAGCAGATAGTTGGGATAGACGTAATATGGGTATTGAATTTAATCCAAACA AAG T TAGA C GAGAT GAAAT GAT T T G G T TAAAA CAAAATATAATAAG C TACAT G GAAGAT GA C G G T T T TACAAGAT TAGATTTAGCCTTTGATTTT GAAGAT GAT T T GAGT GAC TA C TAT G CAAT G T G T GATAAAG CAG T TAAGAAAA C TA TCTTTTATGGTCGT AA T GGTAAG C CAGAAA C AAAA TATTTTGGCGT GAGAGATAGTAAT AGATTTAT TAGAAT T T ATAATAAAAAG C AAGAA C GTAAAGATAAT GCAGATGCT GAAGTTA T G C C T GAA CATTTATGGCGTG TAGAAAT C G AACTTAAAAGAGATATGGTGGATTACTGGAATGATTGCTTTAGTGATTTACATATCTTGCAACCAGATTGGAAAA CTATCCAACGCACTGCGGATAGAGCAATAGTTTTTATGTTATTGAGTGATGAAGAAGAATGGGGAAAGCTTCACA G AAAT T G T AG AA C AAAAT AT AAC-AAT T T GAT AAAAG AAAT T TCGCCAGTCGATT T AA C GGA C T T AAT G AAAT C G A C T T TAAAAG C GAA C GAAAAACAAT T G CAAAAA CAAAT CGATTTTTGG CAAGAT GAAT T T AAA T T T T G GAAATAG T GTACATAT TAATAT TA C T GAACAAAAAT GAT ATAT T TAAA C TAT T C TAAT T TAGGAGGAT TTTTTTA T GAAGT GT C TAT T TAAAAAT T T GG G GAAT T TATAT GAGGT GAAAGAATAATT TAC C C C TATAAA CTTTAGCCACCT CAAG TAA AGAGGTAAAATTGTTTAGTTTATATAAAAAATTTAAAGGTTTGTTTTATAGCGTTTTATTTTGGCTTTGTATTCT TTCATTTTTTAGTGTATTAAATGAAATGGTTTTAAATGTTTCTTTACCTGATATTGCAAATCATTTTAATACTAC TCCTGGAATTACAAACTGGCTAAAGACTGCATATATGTTAACTTTTTCGATAGGAACAGCAGTATATGGAAAATT AT C T GAT TATATAAATA TAAAAAAAT T GT TAATTA T TGGTATTAGTTTGAGCTGTCTTGGTTCATTGATTGCTTT TATTGGGCCCACCTAGGCAAATATGCTCTTACGTGCTATTATTTAAGTGACTATTTAAAAGGAGTTAATAAATAT GCGGCAAGGTATTCTTAAATAAACTGTCAATTTGATAGCGGGAACAAATAATTAGATGTCCTTTTTTAGGAGGGC TTAGTTTTTTGTACCCAGTTTAAGAATACCTTTATCATGTGATTCTAAAGTATCCAGAGAATATCTGTATGCTTT CTATACCTATGGTTATCCATAAAAATCCCAGTGATAAAACTATTTATCACTGGGATTTTTATGCCCTTTTGGGTT TTT GAAT GGAGGAAAA T CA CAT GAAAAT T A.T T AATA TTGGAGTTTTAGCTCATGTT GAT G CA G GAAAAAC TA C C T T AAC AG AAAG C T T A TT AT AT AAC AG T GGAG C GATTACAGAATTA G G AAG C G T G GA C AAAGGT AC AAC GAGGACGG ATAATACGCTTTTAGAACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAGGAATAACCTCTTTTCAGTGGGAAAATACGA AGGTGAACATCATAGACACGCCA.GGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATG GGGCAATTCTACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTTAGGAAAA TGGGGATTCCCAC AAT CTTTTTTAT CAATAAGATT GA C C AAAAT G GAAT TGATTTATC AA CGGTTTATCAGGATA TTAAAGAGAAACTTTCTGCCGAAATTGTAATCAAACAGAAGGTAGAACTGTATCCTAATATGTGTGTGACGAACT TTACCGAATCTGAACAATGGGATACGGTAATAGAGGGAAACGATAACCTTTTAGAGAAATATATGTCCGGTAAAT CAT TAGAAG CAT T GGAAC T C GAACAAGAG GAAAG CATAAGATTT CAGAAT TGTTCTCTGTTCCCTCTTTATGATG GAAGTGGAAAAAGT AATATAGGC-ATTGATAAC CTTATAGAAGTTATTAGTAATAAATTTT ATTCATCAACAGAT C GAGGTCCGTCTGAACTTTGCGGAAATGTTTTCAAAATTGAATATACAAAAAAAAGACAACGTCTTGCATATATAC GCCTTTATAGTGGAGTACTACATTTACGAGATTCGGTTAGAGTATCA GAAAAAGAAAAAATAAAA G T TACAGAAA TGTATACTT CAATAAAT GGT GAAT TAT G TAAGATT GATAGAG CTTATTCTG GAGAAAT TGTTATTTTG CAAAAT G AG T T T T T GAAG T TAAATAG TGTTCTTGGAGATA C AAAA C TATTG C CACAGAGAAAAAAGATT GAAAAT C C G CA C C CCCTACTACAAACAACTGTTGAACCGAGTAAACCTGAACAGAGAGAAATGTTGGTTGATGCCCTTCTGGAAATCT CAGATAGT GAT C C G CT T C TAC GATAT TA C GT GGAT T C TA C GA CA CAT GAAAT TATACTTTCTTTCGTAGG GAAAG TA CAAAT G GAAGT GATTAGTGCACTGTTGC AAGAAAA GTATCATGTG GAGATAGAA C T AAAA GAGCCTACAGTCA TTTATATGGAGAGACCGTTAAAAAATGCAGAATATACCATTCACATCGAAGTGCCGCCAAATCCTTTCTGGGCTT CCATTGGTTTATCTGTATCGCCC-CTTCCGTTGGGAAGTGGAATGCAGTATGAGAGCTCGGTTTCTCTTGGATACT TAAATCAATCATTTCAAAATCCAGTTATGGAACGGCTACGCTATCCTTCCGAACAAGGATTATATCCTTGGAATG TGACGGATTGTAAAATCTGTTTTAAGTACGGTTTATACTATAGCCCTGTTAGTACTCCAGCAGATTTTCGGATGC TTACTCCTATTGTACTGGAGCAAGCCTTTAGAAAAGCTGGAACAGAATTGTTAGAGCCATATCTTAGTTTTAAAG

T7TATGCACCACAGGAATATCTTTCACGGGCATATAACGATGCTCCCAAATATTGTGCAAATATCGTAAATACTC AACTGAAAAATAATGAGGTCATTATTATTGGAGAAATTCCTGCTCGATGTATTCAAGATTATCGCAATGATTGAA CTTTTTTTACAAATGGGCTTAGTGTTTGTTTAGCAGAGCTAAAAGGATATCAGGTTACCACTGGCGAACCTGTTT GCCAGACCCGTCGTCTAAATAGTCGGATAGATAAAGTAAGATATATGTTCAATAAAATAACTTAGTGCGTTTTAT GTTGTTATATAAATATGGTTTCTTATTAAATAAGATGAAATATTCTTTAATATAGATTTGAATTAAAGTGGAAAG GAG GAGAT T GT TA T TATAAAC TA C AAGTG GATATTGTGTCCTAGTTGT GGAAA TAAAACAAGA C TA C GAA TAC GA GTGGATACTATACTTAAAAATTTCCCTTTATACAGCCCCAAATGTAAGAACGAAACGTTAATTAATGTTCAAAAA ATGAATATAATAACAATCAAAGAGCCAGACGCCAAGACGCAGAGCCGATAATTTGAGAAATGAAACTCTCATCTT ATCGGGTCTTTTTGTTTATCTGAATTTTACTGACTAGCCTTCAATATTTCCGCGGCCAGCTTACTATGCCATTAT TAAGCTTGTAATATCGGAGGGTTTATTAATTGGCAGTAAAGTGGCAGTTTTTGATACCTTAAATGAGATATTATG ATAGTGTAGGATATTGACTATCGTACTGCGTTTCCCTACCGCAAATTAGGAATAAAGGATCTATGTGGGTTGGCT GATTATAGC CAAT C C T T T T T TAAT T T TAAAAAG CGTATAGCGCGAGAGTTGGTGG TAAAT GAAAT GAA C GAAAAA CAAAAGAGATTCGCAGATGAATATATAATGAATGGATGTAATGGTAAAAAAGCAGCAATTACAGTAGGTTATAGT AAGAAAACAGCAGAGTCTTTAGCAAGTCGATTGTTAAGAAATGTTAATGTTTCGGAATATATTAAAGAACGATTA GAACAGGTACAAGAAGAGCGTTTAATGAGTATTACAGAAGCTTTAGCGTTATCTGCTTCTATTGCTAGAGGAGAA CCTCAAGAGGCTTACAGTAAGAAATATGACCATTTAAACGATGAAGTGGAAAAAGAGGTTACTTACACAATCACA C CAAC T T T T GAAGAG C G T CAGAGAT C TAT T GAC CACATAC TAAAAG TACATGGTGCGTATATC GATAAAAAAGAA AT TAC T CAGAAGAATAT T GAGAT TAATAT T G G T GAG TAC GAT GAC GAAAGT TAAAT T GAAG T T TAA CAAAC C G T C TAATGTTTTCAATAGCCGCGGGGGCCCAACACACCAACTTTTGAAGAGCGTCAGAGATCTATTGACCACATACTA AAAG TACATGGTGCGTATATC GATAAAAAA GAAAT TAC T CAGAAGAATAT T GA GA T TAATAT TGGTGAGTACGAT G AC G AAAGT T AAA T T AAA C T"l' T1 AA C AAA C C G T C T AAT G T T T T C AA'l1 AG CCGCGGGGGCC CAA C GAG CGGCCGCAT AGTTAAGCGAGCCCCGACACCCGCGAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGGATCCGCTT ACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGAC GAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCA CTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGA GACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCC TTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTG AAC-ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCC CCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCG GGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCGGTCACAGAAAAGC ATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACT TACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCC TTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGG CAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGG AGC-CGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAG CCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCT ACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGC ATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGA TCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAG ACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCGGCTGCTTGCAAACAAAAA AACCACCGCTAOCAGCGGTGGTTTTTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTCCA GCAGAGCG CAGATAC CAAATAG TGTTCTTCTAGTC-TAGCCGTAGTTAGGCCACCACTT CAAGAA CTCTGTAGCAC CGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGGCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGT

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento independiente del crecimiento para detectar un microorganismo de interés en una muestra, que comprende:

- poner en contacto la muestra con una pluralidad de partículas de transducción no replicativas (NRTP) de modo que la pluralidad de NRTP transduzca uno o más microorganismos de interés en la muestra, en el que la pluralidad de NRTP se producen usando un procedimiento de alteración/complementación, en el que dichos procedimientos no producen NRTP que contengan un genoma vírico, y en el que la pluralidad de NRTP son bacteriófagos que pueden insertar una molécula de ácido nucleico no vírico en el uno o más microorganismos de interés sin empaquetar su propio genoma vírico replicado en la partícula de transducción, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico no vírico una secuencia de ácido nucleico indicadora que incluye un gen indicador enlazada de forma funcional a un promotor, y en el que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es la fase estacionaria, menor que la fase estacionaria o mayor que la fase estacionaria, pero menor que la fase exponencial;

- proporcionar condiciones para la activación de la secuencia de ácido nucleico indicadora y la expresión de una molécula indicadora de dicho gen indicador; y

- detectar una señal producida por la molécula indicadora, en la que la presencia de la señal indica la presencia del uno o más microorganismos de interés, y en la que la ausencia de la señal indica la ausencia del uno o más microorganismos de interés.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además proporcionar un agente antimicrobiano a la muestra y detectar la señal producida por la molécula indicadora para determinar si el uno o más microorganismos de interés es susceptible o no susceptible al agente antimicrobiano.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el uno o más microorganismos de interés está en fase estacionaria; o en el que el uno o más microorganismos de interés no experimenta ningún crecimiento.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uno o más microorganismos de interés comprende una célula de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., Streptococcus spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas spp. o Mycobacterium spp.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el uno o más microorganismos de interés comprende una célula de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) o una célula de Staphylococcus aureus sensible a meticilina (sAs M).

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es menor que o igual a 0,1-5, 0,1-3, 0,1-1, 0,5-1, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2 o 3 divisiones por hora.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es menor que o igual a 0-10, 1-9, 2-8, 3-7, 4-6, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 divisiones celulares por período de 4 horas.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la tasa de crecimiento del uno o más microorganismos de interés es menor que 0,1 divisiones por hora y en el que el uno o más microorganismos de interés es Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM).

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de provisión comprende poner en contacto la muestra con un reactivo para el sustrato de luciferasa bacteriana aldehído graso, opcionalmente en el que el reactivo es tridecanal.

10. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el agente antimicrobiano es cefoxitina, una p-lactama, una p-lactama de espectro extendido, un aminoglucósido, una ansamicina, un carbacefem, carbapenémicos, cualquier generación de cefalosporina, un glucopéptido, una lincosamida, un lipopéptido, un macrólido, un monobactámico, un nitrofurano, una oxazolidonona, una penicilina, un polipéptido, una quinolona, una fluoroquinolona, una estreptogramina, una sulfonamida, una tetraciclina, una rifampicina, un antibiótico micobacteriano, cloranfenicol y/o mupirocina.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de ácido nucleico indicadora se selecciona del grupo que consiste en genes que codifican enzimas que median en reacciones de luminiscencia (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), genes que codifican enzimas que median en reacciones colorimétricas (lacZ, HRP), genes que codifican proteínas fluorescentes (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, proteínas fluorescentes en el infrarrojo cercano), moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos de afinidad (marca His, 3X-FLAG) y genes que codifican marcadores seleccionables (ampC, tet(M), CAT, erm).

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la secuencia de ácido nucleico indicadora se enlaza de forma funcional a un promotor constitutivo.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además proporcionar un antibiótico a la muestra a una concentración predeterminada y detectar una presencia o ausencia de la señal para determinar si el uno o más microorganismos de interés es resistente o sensible al antibiótico.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además proporcionar concentraciones predeterminadas variables de antibiótico a la muestra y detectar la cantidad de la señal para determinar la concentración inhibidora mínima del uno o más microorganismos de interés con respecto al antibiótico.