JP2017521074A - 骨形成タンパク質の治療上の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10 (BMP10)、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9(BMP9)のバリアントから選択されるポリペプチドに関する。また、本発明はBMP9の新規バリアント及び前記ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
血管疾患は大型及び中型筋性動脈の病理的状態であり、内皮細胞の機能不全により引き起こされる。病原体、酸化LDL粒子及び他の炎症性刺激のような因子を原因として、内皮細胞は活性化状態になる。このことは、内皮細胞の特性の変化をもたらす:内皮細胞は、サイトカイン及びケモカインを分泌し、その表面に接着分子を発現し始める。このことは、今度は白血球(単球及びリンパ球)の動員をもたらし、該白血球は血管壁に浸潤し得る。内皮細胞及び動員された白血球によって生産されたサイトカインによって平滑筋細胞層が刺激されると、平滑筋細胞は増殖し、血管内腔へと遊走する。このプロセスにより、管壁が肥厚し、増殖する平滑筋細胞、マクロファージ、及び様々な種類のリンパ球からなる斑が形成される。この斑は血流を遮ることとなり、標的器官に到達する酸素及び栄養素の量の減少をもたらす。また末期において、該斑は破裂して、血餅の形成、その結果として卒中を引き起こし得る。
本発明の第一の態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10(BMP10)、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9(BMP9)のバリアントから選択されるポリペプチドが提供される。
本発明の第一の態様に従って、血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10(BMP10)、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9(BMP9)のバリアントから選択されるポリペプチドが提供される。
(略語)
ActR-IIA(B): アクチビン受容体-II型A(B);
ALK1、2、3、6: アクチビン受容体様キナーゼ1、2、3、6;
ALP: アルカリホスファターゼ;
BMP: 骨形成タンパク質;
BMPR-II: 骨形成タンパク質受容体II型;
ECD: 細胞外ドメイン;
FBS: ウシ胎仔血清;
HMEC-1: ヒト微小血管内皮細胞;
hPAEC: ヒト肺動脈内皮細胞;
MSC: 間葉性幹細胞;
PAH: 肺動脈性肺高血圧症;
プロBMP9: プロドメインと結合したBMP9;
プロBMP10: プロドメインと結合したBMP10; 及び
qPCR: 定量PCR。
(組換えヒトプロBMP9及びプロBMP10の生成)
ヒトプレプロBMP9のオープンリーディングフレームを含む全長cDNAを、発現ベクターpCEP4のHindIII部位及びXhoI部位の間にクローニングした(図1を参照されたい)。同様に、ヒトプレプロBMP10の全長cDNAを、発現ベクターpCEP4のXhoI部位及びBamHI部位の間にクローニングした(図1を参照されたい)。インサートは、DNA配列決定法により確認した。プロBMP9のバリアントは、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene社)を用いて生成し、全ての変異をDNA配列決定法により確認した。
シグナル伝達のアッセイについて、プロBMP9の濃度をR&D社BMP9を標準として用いるELISAにより決定した;プロBMP10の濃度をR&D社BMP10を標準として用いるウェスタンブロット及びImageJにより定量化した。
C2C12細胞を24ウェルプレートの10%FBSを含むDMEM中に、20,000細胞/ウェルで播種した。48時間後、細胞を0.25% FBSを含むDMEMで16時間にわたって休止させ、示された濃度のBMPリガンドで64時間にわたり処理した。細胞を1% Triton X-100/PBS中で溶解し、細胞溶解物中の全タンパク質濃度をDC(商標)タンパク質アッセイ(Bio-Rad社)を用いて決定した。細胞溶解物中のALP活性を、発色性ホスファターゼ基質4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩(Sigma社, S0942)を用いて測定し、可溶性産物をプレートリーダー上405 nmで測定した。全てのアッセイにおいて、対照BMP9及びBMP10はR&D Systems社から購入した。
(BMP9シグナル伝達及びそのPAHにおける治療的可能性を支持するデータ)
BMP9及びBMP10はオーファン受容体ALK1のリガンドとして同定された(Davidらの文献、(2007) Blood 109(5):1953-1961)。内皮細胞において、BMP9及びBMP10はID1、ID2、及びBMPRIIを含む類似した一群の遺伝子を誘導する。BMP9は肝臓で合成され(Millerらの文献、(2000) J. Biol. Chem. 275(24):17937-17945; Bidartらの文献、(2012) Cell. Mol. Life Sci. 69(2):313-324)、2〜10 ng/mlで循環し、活性濃度で循環することが確認される唯一のBMPである(Herrera及びInmanの文献、(2009) BMC Cell Biol. 10:20; Davidらの文献、(2008) Circ. Res. 102(8):914-922)。BMP9は血管の休止要因であり、インビトロでの内皮細胞の遊走、増殖、及び血管新生を阻害し、従って血管の安定化を促す(Davidらの文献(2008)、前掲)。
内皮の受容体を選択的に活性化することにより、心血管疾患を治療する可能性をもつにもかかわらず、BMP9は間葉性幹細胞(MSC)及びC2C12筋芽細胞におけるシグナルも伝達することができる。試験した14個のBMPのうち、BMP9は最も高いインビトロでの骨形成シグナル伝達及びインビボでの骨形成活性を有することが見出された(Kangらの文献、(2004) Gene Ther. 11(17):1312-1320; Lutherらの文献、(2011) Curr. Gene Ther. 11(3):229-240)。ALK1及びALK2の両方がBMP9の骨形成活性に要求される(Luoらの文献、(2010) J. Biol. Chem. 285(38):29588-29598)が、骨形成活性の状況におけるALK1及びALK2とBMP9との相互作用の性質は知られていない。また、ALK2も血管内皮細胞により発現される(Uptonらの文献、(2008) Mol. Pharmacol. 73(2):539-552)ものの、ALK1がこれらの細胞においてBMP9反応を仲介する主要なI型受容体である(Uptonらの文献、(2009) J. Biol. Chem. 284(23):15794-15804; Scharpfeneckerらの文献、(2007) J. Cell Sci. 120(Pt 6):964-972)。BMP9の骨形成活性に対するII型受容体の要求性は、MSCにおいて研究されている。3つのII型BMP受容体BMPR-II、ActR-IIA、及びActR-IIBの全てのドミナントネガティブ変異体の発現により、BMP9に誘導される骨形成活性を阻害することができ、ドミナントネガティブのActR-IIAが最も効力が高いことが示されている(Wuらの文献、(2010) Acta biochimica et biophysica Sinica 42(10):699-708)。
24個のBMP9アラニンバリアント(H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A、及びY418A)を生成し、ID1遺伝子誘導についてはHMEC-1細胞、アルカリホスファターゼ活性についてはC2C12細胞の、両方の細胞で試験した。本研究の結果は図5に要約されており、この図から、13個のBMP9のバリアント(H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A)が、内皮特異的シグナル伝達の有益な効果を維持し、大きく低下した骨形成シグナル伝達を有する(野生型BMP9と比較した場合、少なくとも0.75倍のID1誘導及び0.5倍未満のALP活性により証拠づけられた)ものとして特定されたことを読み取ることができる。さらに、図5に示される結果は8個のBMP9のバリアント(F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A)が、内皮特異的シグナル伝達を維持するが、骨形成シグナル伝達を欠いている(野生型BMP9と比較した場合、少なくとも0.75倍のID1誘導及びごくわずかな(すなわち、0.1倍未満)ALP活性により証拠づけられた)ものとして特定されたことを示している。さらに、図5に示されている結果は2つのBMP9のバリアント(D366A又はD408A)が、内皮特異的シグナル伝達を増加させたが、骨形成シグナル伝達を欠いている(野生型BMP9と比較した場合、1倍より高いID1誘導及びごくわずかな(すなわち、0.1倍未満)ALP活性により証拠づけられた)ことを示している。
先に内皮特異的シグナル伝達を維持するが、骨形成シグナル伝達を欠いているものとして特定された8個のBMP9のバリアント(F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A)を、初代内皮細胞でさらに検証した。これらの変異体は全て、ヒト肺動脈内皮細胞(hPAEC)におけるBMPR2遺伝子の発現を誘導することが見出された(図6)。少なくとも1つのバリアント、D408Aは、PAECの腫瘍壊死因子α(TNFα)及びシクロヘキシミド(CHX)によって誘導される早期アポトーシスをレスキューすることができることが示された(図7)。
BMP10は心臓の発達に不可欠である(Neuhausらの文献、(1999) Mech. Dev. 80(2):181-184)。BMP10を欠失したマウスは重度に損なわれた心臓の発達のために胚性致死となる(Chen Hらの文献、(2004) Development 131(9):2219-2231)。BMP10は転写調節因子Tbx20を通じて心臓の心室壁の発達を調節し(Zhangらの文献、(2011) J. Biol. Chem. 286(42):36820-36829)、心筋におけるBMP10の過剰発現は心臓の生後の肥大性成長を中断させる(Chenらの文献、(2006) J. Biol. Chem. 281(37):27481-27491)。成体では、BMP10は右心房のみに発現する(Chenらの文献、(2004)、前掲)。循環するBMP10はフロー依存的な動脈静止を仲介することが示されている(Lauxらの文献、(2013) Development 140(16):3403-3412)。
ヒト微小血管内皮細胞(HMEC-1)における濃度-反応シグナル伝達アッセイより、BMP10がID1、ID2、及びBMPR-II遺伝子の発現誘導においてBMP9と同程度の効力をもつことが示された(図3A〜3C)。重要なことに、BMP10はTNFα-CHXにより誘導されるアポトーシスに対するhPAECの保護において、BMP9と同じ抗アポトーシス活性を示す(図3D)。BMP9は内皮細胞の増殖を抑制することにより、脈管構造の安定性を維持すると報告されている(Davidらの文献、(2008) 前掲)。BMP9及びBMP10は両方とも、hPAECにおいて3H-チミジンの取り込みとして測定されるDNA合成を同程度抑制する(図3E)。アルカリホスファターゼ(ALP)は骨形成経路の重要な酵素であり、BMP9により誘導されたALP活性は、C2C12細胞において5 ng/mlのBMP9で検出することができる。しかしながら、同一の条件下、BMP10は試験した最高濃度(20ng/ml)においても、ALP活性を一切誘導せず(図3F)、C2C12細胞においてアデノウイルスで発現させたBMPを用いた過去の研究(Kangらの文献、(2004)前掲)と矛盾しなかった。
BMPをプレプロタンパク質として合成すると、プロドメインは分泌の際に切断される(図4A)。過去の報告では、BMP10のプロドメインがBMP10の活性を阻害することができ、BMP10が不活性形態で循環すると見込まれることが示された。本発明者らは大量の、プロドメインと結合したBMP10(プロBMP10)を生成させた。過去の報告と対照的に、プロドメインはBMP10が哺乳動物細胞から生産される場合、依然としてBMP10と結合していること、プロBMP複合体が非常に安定であることが見出された(図4B及び4C)。このことは、プロBMP10が循環時の形態であると見込まれることを示唆している。さらに本発明者らは、HMEC-1細胞(図4D及び4E)及びhPAECにおいて、プロBMP10が商業的供給源(R&D Systems社)から購入したBMP9及びBMP10と同等の活性を有することを示した。プロドメインはBMP10の疎水性表面を保護し、従ってBMP10の循環時の形態を安定化する。そのため、プロBMP10はPAH及び他の心血管疾患を治療するためのインビボ投与に好ましい形態であることが見込まれる。
血液派生内皮細胞はほとんどの個体の末梢血液から単離することができ、ヒト内皮細胞を大いに代表する高度に増殖性の細胞種を表す。内皮細胞同様、BOECは3次元コラーゲン:フィブロネクチンマトリックス中で液胞化された毛管様構造を形成することが示されている。この分析の結果は図8に示されており、BMP9及びBMP10の血管形成に対抗する役割を示すだけでなく、BMP9並びに内皮細胞に対し抗増殖性であることが、内皮細胞をアポトーシスから保護し、増加した透過性から内皮細胞を保護することも示している。BMP9による阻害は低濃度でさえも明らかである。
Claims (26)
- 血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、骨形成タンパク質10(BMP10)、又は骨形成活性を欠いている骨形成タンパク質9(BMP9)のバリアントから選択されるポリペプチド。
- 前記血管疾患が:肺高血圧症; 肺動脈性肺高血圧症; 遺伝性出血性毛細血管拡張症; アテローム性動脈硬化症; 及び肝肺症候群から選択される、請求項1記載の使用のためのポリペプチド。
- 肺動脈性肺高血圧症から選択される血管疾患の治療を含む、請求項1又は2記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記呼吸器疾患が、閉塞性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性気管支炎及び肺気腫; 肺血管疾患、例えば肺水腫及び肺出血; 呼吸不全及び呼吸促迫症候群、例えば急性肺傷害及び急性呼吸促迫症候群; 並びに間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症から選択される、請求項1記載の使用のためのポリペプチド。
- BMP10である、請求項1〜4のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列を含むBMP10である、請求項5記載の使用のためのポリペプチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列によりコードされるBMP10である、請求項5又は6記載の使用のためのポリペプチド。
- プロドメインと結合した形態のBMP10(プロBMP10)である、請求項5〜7のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記プロBMP10が、配列番号:2の残基317-424のアミノ酸配列を含む成熟BMP10配列と非共有結合的に結合した、配列番号:2の残基22-316のアミノ酸配列を含むプロペプチド配列を含む、請求項8記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記プロBMP10が、2つの前記プロペプチド配列及び2つの前記成熟BMP10配列を含む四量体を含む、請求項9記載の使用のためのポリペプチド。
- 骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントである、請求項1〜4のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
- プロドメインと結合した形態のBMP9(プロBMP9)のバリアントである、請求項11記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記プロBMP9のバリアントが、配列番号:4の残基320-429のアミノ酸配列を有する成熟BMP9配列と非共有結合的に結合した、配列番号:4の残基23-319のアミノ酸配列を有するプロペプチド配列のバリアントを含む、請求項12記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記プロBMP9のバリアントが、2つの前記プロペプチド配列及び2つの前記成熟BMP9配列を含む四量体を含む、請求項13記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントが、配列番号:4のアミノ酸配列の置換、欠失、又は挿入変異体を含む、請求項11〜14のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントが、配列番号:4のアミノ酸配列の置換変異体を含む、請求項15記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記配列番号:4のアミノ酸配列の置換変異体が、以下の置換:H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A、及びY418A、例えばH326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A、特にF362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A、及びY418A、とりわけD366A、及びD408Aの1以上、例えば1つを含む、請求項16記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記配列番号:4のアミノ酸配列の置換変異体が:D366A又はD408A、例えばD408Aから選択される、請求項17記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記配列番号:4のアミノ酸配列の置換変異体が、配列番号:5のアミノ酸配列を含むD366A BMP9のバリアント、又は配列番号:6のアミノ酸配列を含むD408A BMP9のバリアントから選択される、請求項16〜18のいずれか1項記載の使用のためのポリペプチド。
- 血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10又は骨形成活性を欠いているBMP9のバリアントを含む医薬組成物。
- 配列番号:5のアミノ酸配列を含む、BMP9のバリアント。
- 配列番号:6のアミノ酸配列を含む、BMP9のバリアント。
- 請求項21又は22記載のBMP9のバリアントを含む、医薬組成物。
- 血管疾患又は呼吸器疾患の治療における使用のための、BMP10又はBMP9のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列を含む、請求項24記載の使用のためのベクター。
- ウイルスベクター、例えば:レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペス、ワクシニア、及びアデノ随伴ウイルス、特にアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスのベクターである、請求項24又は25記載の使用のためのベクター。
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