JP2017520255A - ポリペプチド発現系 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリペプチド発現系及びその使用方法に関する。【選択図】図１

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式にて電子的に提出し、かつそれを全体として参照により本明細書に組み込む配列表を含有する。２０１５年６月２５日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーの名称は、Ｐ０５８３３−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，４２１バイトである。

本発明は、ポリペプチドのモジュール式発現及び生成のためのポリペプチド発現系に関する。

組換えポリペプチドは、ときには機能目的または精製目的のために個々のドメインまたはタグの融合物として発現される。組換えＤＮＡ法は伝統的に、各モジュールをコードする配列を結合するために使用され、各組み合わせについて異なる構築物を必要とする。このことは、構築物の数が、使用されるモジュール数の関数として幾何学的に増大するにつれて、様々な組み合わせで結合される繰り返しモジュールからなる多くのタンパク質コレクションの発現に関する技術に課題を提起する。

サブクローニングのための高スループットシステムは、並行して多数の挿入物を取り扱うことができるが、それらは通常、供給源集中的であり、初期の特徴付けステップ後、最終的に必要でない多数の構築物を生成する。したがって、組換えポリペプチドのモジュール式発現及び生成を可能にするポリペプチド発現系の開発分野で未だ対処されていない必要性が存在している。

本発明は、ポリペプチドのモジュール式発現及び生成のためのポリペプチド発現系に関する。

一態様では、本発明は、第１の核酸分子及び第２の核酸分子を含むポリペプチド発現系を特徴とし、ここで、（ａ）第１の核酸分子は、以下の構成要素：（ｉ）第１の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ１）、（ｉｉ）第１のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_１）、（ｉｉｉ）第１の５’スプライス部位（５’ｓｓ１_１）、及び（ｉｖ）ハイブリダイズ配列（ＨＳ１）を含む第１の発現カセットを含み、これらの構成要素は、Ｐ１_Ｅｕｋ１−ＰＥＳ１_１−５’ｓｓ１_１−ＨＳ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、（ｂ）第２の核酸分子は、以下の構成要素：（ｉ）真核生物プロモーター（Ｐ２_Ｅｕｋ）、（ｉｉ）ＨＳ１にハイブリダイズすることができるハイブリダイズ配列（ＨＳ２）、（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ２）、（ｉｖ）ポリペプチドコード配列（ＰＥＳ２）、及び（ｖ）ポリアデニル化部位（ｐＡ２）を含み、これらの構成要素は、Ｐ２_Ｅｕｋ−ＨＳ２−３’ｓｓ２−ＰＥＳ２−ｐＡ２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、Ｐ１_Ｅｕｋ１は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐ２_Ｅｕｋは、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含み、ＥＳＳ１_１は、Ｐ１_Ｅｕｋ１とＰＥＳ１_１との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ＥＳＳ１_１は、可変重鎖（ＶＨ）遺伝子に由来する。

いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_２）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}）、及び（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_１）を含む、切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_１）を更に含み、ここで、これらの構成要素は、５’ｓｓ１_２−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}−３’ｓｓ１_１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、ｅＰＰＭ_１は、Ｐ１_Ｅｕｋ１とＰＥＳ１_１との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}は、ＰｈｏＡプロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｌａｃ、及びＴｐｈａｃプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｅＰＰＭ_１は、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＳ１_１は、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現系は、ＰＳＳ１_１と３’ｓｓ１_１との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ１_１）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＴ１_１は、ＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣの核酸配列（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ１_１は、潜在性５’スプライス部位を含まない。いくつかの実施形態では、ＨＳ１は、コートタンパク質またはアダプタータンパク質の全てまたは一部をコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、コートタンパク質は、バクテリオファージＭ１３、ｆ１、またはｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及びｐＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、コートタンパク質は、バクテリオファージＭ１３のｐＩＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、ｐＩＩＩ断片は、ｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基２６７〜４２１またはｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基２６２〜４１８を含む。いくつかの実施形態では、アダプタータンパク質は、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、ロイシンジッパーは、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、第２の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ２）、（ｉｉ）第２のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_２）、及び（ｉｉｉ）ポリアデニル化部位（ｐＡ１）を含む第２の発現カセットを更に含み、ここで、これらの構成要素は、Ｐ１_Ｅｕｋ２−ＰＥＳ１_２−ｐＡ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、Ｐ１_Ｅｕｋ２は、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターである。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_２）をコードする第２の核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ＥＳＳ１_２は、マウス結合免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ＥＳＳ１_２は、ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮの核酸配列（配列番号６）を含み、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧである。

いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_３）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}）、及び（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_２）を含む、切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_２）を更に含み、ここで、これらの構成要素は、５’ｓｓ１_３−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}−３’ｓｓ１_２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、ｅＰＰＭ_２は、Ｐ１_Ｅｕｋ２とＰＥＳ１_２との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}は、ＰｈｏＡプロモーター、Ｔａｃプロモーター、及びＬａｃプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｅＰＰＭ_２は、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_２）をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＳ１_２は、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現系は、ＰＳＳ１_２と３’ｓｓ１_２との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ１_２）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＴ１_２は、ＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣの核酸配列（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、第１の発現カセットに対して５’に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現系は、５’ｓｓ１_１とＨＳ１との間に位置付けられるイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）（ＩＳＥ１）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＥ１は、３つまたはそれ以上の連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＥ１は、９つの連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現系は、ＨＳ２と３’ｓｓ２との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ２）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＴ２は、ＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣの核酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現系は、ＨＳ２と３’ｓｓ２との間に位置付けられるＩＳＥ（ＩＳＥ２）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＥ２は、３つまたはそれ以上の連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＥ２は、９つの連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む。いくつかの実施形態では、５’ｓｓ１_１は、ＧＴＡＡＧＡの核酸配列（配列番号８）を含む。

いくつかの実施形態では、真核生物プロモーターによる発現が、哺乳動物細胞において起こる。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、またはＮＳＯ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞である。いくつかの実施形態では、原核生物プロモーターによる発現が、細菌細胞で起こる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ１_１は、抗体の全てまたは一部をコードする。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ１_１は、ＶＨドメインを含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ２は、抗体の全てまたは一部をコードする。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ２は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ１_２は、抗体の全てまたは一部をコードする。いくつかの実施形態では、ＰＥＳ１_２は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする。

別の態様では、本発明は、以下の構成要素：（ａ）第１の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ１）；（ｂ）以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_２）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}）、及び（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_１）を含む第１の切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_１）であって、ｅＰＰＭ_１の構成要素が、５’ｓｓ１_２−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}−３’ｓｓ１_１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される、第１の切除可能原核生物プロモーターモジュール；（ｃ）第１のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_１）；（ｄ）第１の５’スプライス部位（５’ｓｓ１_１）；及び（ｅ）有用ペプチドコード配列（ＵＰＥＳ）を含む、第１の発現カセットを含む核酸分子を特徴とし、第１の発現カセットの構成要素は、Ｐ１_Ｅｕｋ１−ｅＰＰＭ_１−ＰＥＳ１_１−５’ｓｓ１_１−ＵＰＥＳとして５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含み、ここで、ＥＳＳ１_１は、Ｐ１_Ｅｕｋ１とｅＰＰＭ_１との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ｅＰＰＭ_１は、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含み、ここで、ＰＳＳ１_１は、Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}と３’ｓｓ１_１との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ２）、（ｉｉ）第２のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_２）、及び（ｉｉｉ）ポリアデニル化部位（ｐＡ１）を含む第２の発現カセットを更に含み、ここで、これらの構成要素は、Ｐ１_Ｅｕｋ２−ＰＥＳ１_２−ｐＡ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_２）をコードする第２の核酸配列を更に含み、ここで、ＥＳＳ１_２は、Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}と３’ｓｓ１_２との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_３）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}）、（ｉｉｉ）原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_２）をコードする核酸配列、及び（ｉｖ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_２）を含む、切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_２）を更に含み、ここで、これらの構成要素は、５’ｓｓ１_３−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}−ＰＳＳ１_２−３’ｓｓ１_２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、ｅＰＰＭ_２は、Ｐ１_Ｅｕｋ２とＰＥＳ１_２との間に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ＵＰＥＳは、タグ、ラベル、コートタンパク質、及びアダプタータンパク質からなる群から選択される有用ペプチドの全てまたは一部をコードする。いくつかの実施形態では、コートタンパク質は、バクテリオファージＭ１３、ｆ１、またはｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及びｐＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、コートタンパク質は、バクテリオファージＭ１３のｐＩＩＩである。

別の態様では、本発明は、前述の核酸分子のいずれか１つを含むベクターを特徴とする。別の態様では、本発明は、第１のベクター及び第２のベクターを含むベクターセットを特徴とし、ここで、第１及び第２のベクターは、本明細書で開示されるポリペプチド発現系のいずれかの、それぞれ、第１及び第２の核酸分子を含む。

別の態様では、本発明は、前述の核酸、ベクター、及び／またはベクターセットを含む宿主細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、大腸菌細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、またはＮＳＯ細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞である。

さらなる態様では、本発明は、培養培地中で前述の核酸、ベクター、及び／またはベクターセットの１つもしくは２つ以上を含む宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの生成方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主細胞または培養培地からポリペプチドを回復することを更に含む。

モジュール式タンパク質発現のためのポリペプチド発現系のｐＤＶ２及びｐＲＫ−Ｆｃ核酸分子の相対的構成を示す模式図である。図はまた、真核細胞中の核酸分子の転写後の一般的なプレｍＲＮＡ産物、生成された２つのプレｍＲＮＡ産物間の予想されるトランススプライシング事象、及びスプライシングされたｍＲＮＡ分子の翻訳後に得られる産物を示す。 図２Ａ及び２Ｂを包含し、ｐＤＶ２ベクターの部分的配列図である。５’ｓｓ、３’ｓｓ、及びポリピリミジン領域（ＰＰＴ）は、太字及び下線付きである。図２Ｂ中で、ｐＲＫ−Ｆｃ及びｐＲＫ−Ｆｃ２由来転写産物にハイブリダイズする１５０−ｎｔ遺伝子ＩＩＩ配列をコードする領域は、斜体及び下線付きである。野生型ＰＰＴからの変異は、太字、斜体、及び下線付きである。ｐＤＶ２ベクターの遺伝子ＩＩＩのＡＡＴＡＡＡ潜在的ポリアデニル化部位は、変異体ｐＤＶ２ベクターｐＤＶ２ｃ及びｐＤＣ２ｄに導入されたサイレント突然変異の配列の上に示される（太字、斜体、下線付き）。図２Ａ及び２Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２、３、９、１０、及び１９〜２２を開示する。 図２Ａ及び２Ｂを包含し、ｐＤＶ２ベクターの部分的配列図である。５’ｓｓ、３’ｓｓ、及びポリピリミジン領域（ＰＰＴ）は、太字及び下線付きである。図２Ｂ中で、ｐＲＫ−Ｆｃ及びｐＲＫ−Ｆｃ２由来転写産物にハイブリダイズする１５０−ｎｔ遺伝子ＩＩＩ配列をコードする領域は、斜体及び下線付きである。野生型ＰＰＴからの変異は、太字、斜体、及び下線付きである。ｐＤＶ２ベクターの遺伝子ＩＩＩのＡＡＴＡＡＡ潜在的ポリアデニル化部位は、変異体ｐＤＶ２ベクターｐＤＶ２ｃ及びｐＤＣ２ｄに導入されたサイレント突然変異の配列の上に示される（太字、斜体、下線付き）。図２Ａ及び２Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２、３、９、１０、及び１９〜２２を開示する。 ｐＲＫ−Ｆｃベクターの部分的配列図である。分岐点コンセンサス配列（ＢＰ）、ポリピリミジン領域、及び３’ｓｓは、太字または太字及び下線付きであり、図３に示される。１５０ｂｐのアンチセンス遺伝子ＩＩＩ配列は、斜体及び下線付きである。ＣＭＶプロモーターの後の最初のインフレームＡＴＧコドンは、太字、斜体、及び下線付きである。図３は、出現順に、それぞれ、配列番号２３及び２４を開示する。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＩｇＧの発現レベル（μｇ／ｍｌ単位）に対する、ｐＤＶ２におけるＩＳＥ配列の追加または遺伝子ＩＩＩの潜在的ポリアデニル化モチーフの除去、並びに補完ｐＲＫ−Ｆｃ及びｐＲＫ−Ｆｃ２ベクターの効果を示すグラフである。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＩｇＧの発現レベル（μｇ／ｍｌ単位）に対する、ｐＤＶ２ｃ及びｐＲＫ−Ｆｃ２のプラスミド比の効果を示すグラフである。示される値は、三重で行われた２つの独立した実験の代表的な実験の平均値の、平均及び標準誤差である。 図５Ａ及び５Ｂを包含し、ｐＤＶ２ｂベクターの部分的配列図である。５’ｓｓ及び３’ｓｓが示され、これらの配列は太字である。ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）及び９−ｎｔ Ｇ−ｒｕｎ ＩＳＥが、それぞれ示され、太字及び強調表示されている。図５Ｂで、ｐＲＫ−Ｆｃ及びｐＲＫ−Ｆｃ２由来の転写産物にハイブリダイズする１５０−ｎｔ遺伝子ＩＩＩ配列をコードする領域は、斜体である。野生型ｓｔＩＩシグナル配列及びＭ１３遺伝子ＩＩＩからの突然変異は、太字及び斜体であり、野生型ヌクレオチド残基を配列の上に示す。潜在的ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化部位モチーフは、配列の上に示される。括弧内のアミノ酸は、大腸菌、及びまた哺乳動物細胞におけるスプライシングにより創出されるコドンの両方によりコードされる。可変領域配列クローニングに使用されるシグナル配列の３’末端のＢｓｉＷＩ及びＲｓｒＩＩ制限酵素部位を、配列の上に示す。図５Ａ及び５Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２、２５、９、１０、１９、２０、２６、及び２７を開示する。 図５Ａ及び５Ｂを包含し、ｐＤＶ２ｂベクターの部分的配列図である。５’ｓｓ及び３’ｓｓが示され、これらの配列は太字である。ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）及び９−ｎｔ Ｇ−ｒｕｎ ＩＳＥが、それぞれ示され、太字及び強調表示されている。図５Ｂで、ｐＲＫ−Ｆｃ及びｐＲＫ−Ｆｃ２由来の転写産物にハイブリダイズする１５０−ｎｔ遺伝子ＩＩＩ配列をコードする領域は、斜体である。野生型ｓｔＩＩシグナル配列及びＭ１３遺伝子ＩＩＩからの突然変異は、太字及び斜体であり、野生型ヌクレオチド残基を配列の上に示す。潜在的ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化部位モチーフは、配列の上に示される。括弧内のアミノ酸は、大腸菌、及びまた哺乳動物細胞におけるスプライシングにより創出されるコドンの両方によりコードされる。可変領域配列クローニングに使用されるシグナル配列の３’末端のＢｓｉＷＩ及びＲｓｒＩＩ制限酵素部位を、配列の上に示す。図５Ａ及び５Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２、２５、９、１０、１９、２０、２６、及び２７を開示する。 ｐＲＫ−Ｆｃ２ベクターの部分的配列図である。分岐点コンセンサス配列（ＢＰ）、ポリピリミジン領域、及び３’ｓｓは、太字である。９−ｎｔ Ｇ−ｒｕｎ ＩＳＥを、強調表示する。１５０ｂｐのアンチセンス遺伝子ＩＩＩ配列は、斜体である。最初のＡＴＧトリプレット及びインフレーム終止コドンは、下線付きである。ＣＭＶプロモーターの後の最初のインフレームＡＴＧコドンは、太字及び斜体である。ＣＭＶプロモーターＴＡＴＡボックス及び転写開始部位を、配列の上に示す。括弧内のグルタミン酸残基は、哺乳動物細胞におけるトランススプライシングにより創出されるコドンによりコードされる。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号２８及び２９を開示する。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現し、精製したＩｇＧの重鎖（左パネル）及び軽鎖（右パネル）の質量分析からの畳み込みを解いた質量を示す一連のグラフである。 図７Ａの重鎖及び軽鎖の両方について予想された質量及び観察された質量を示す表である。 ｐＤＶ２ｄ（ＩＳＥを含有し、遺伝子ＩＩＩのＡＡＴＡＡＡモチーフを含まない）及びｐＲＫ−Ｆｃ２ベクターを同時トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養物の上清（３０ｍｌ）から精製した、５つの異なる特異性のＩｇＧ分子の収率（ｍｇ単位）を示すグラフである。ｎ＝３。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ｐＤＶ２ｄ（ＩＳＥを含有し、遺伝子ＩＩＩのＡＡＴＡＡＡモチーフを含まない）及びｐＲＫ−Ｆｃ２ベクターを同時トランスフェクトした２９３Ｔ及びＣＨＯ細胞培養物の上清（３０ｍｌ）から精製した、５つの異なる特異性のＩｇＧ分子の収率（ｍｇ単位）を示すグラフである。ｎ＝４。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 Ｆｌａｇタグ配列に融合したＣＭＶプロモーターＴＡＴＡボックスとヒトＩｇＧ１上部ヒンジ領域との間の領域を示すｐＲＫ−Ｆａｂ−Ｆｌａｇベクターの部分的配列図である。ヒンジ及びＦｌａｇタグ配列に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（図示せず）が続く。ポリピリミジン領域及びコンセンサス分岐点（ＢＰ）を含む３’ｓｓが示され、太字または太字及び下線付きである。ＩＳＥ配列が示され、太字、下線付き、及び斜体である。ドナー転写産物とのハイブリダイゼーションを仲介するアンチセンス遺伝子ＩＩＩ配列は、斜体及び下線付きである。図９は、出現順に、それぞれ、配列番号３０及び３１を開示する。 一般的なポリペプチド産物のモジュール式発現に可能な第１及び第２の核酸分子の相対的構成を示す模式図である。図はまた、真核細胞中の核酸分子の転写後の一般的なプレｍＲＮＡ産物、生成された２つのプレｍＲＮＡ産物間の予想されるトランススプライシング事象、及びスプライシングされたｍＲＮＡ分子の翻訳後に得られる産物を示す。 一般的な２つ以上のポリペプチド産物のモジュール式発現に可能な第１及び第２の核酸分子の相対的構成を示す模式図である。図はまた、真核細胞中の核酸分子の転写後の一般的なプレｍＲＮＡ産物、生成された２つのプレｍＲＮＡ産物間の予想されるトランススプライシング事象、及びスプライシングされたｍＲＮＡ分子の翻訳後に得られる産物を示す。 ｐＤＶ２変異体及びｐＲＫ−Ｆｃ２を同時トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＭａｂ１重鎖及びＦｄ−ｃＰ３融合タンパク質の発現を示す１組のウェスタンブロットである。トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ溶解物をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、抗ＩｇＧ１ Ｆｃ（上部パネル）または抗Ｍ１３ ｐ３（下部パネル）抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。ＧＦＰ及びＨＣ対照ベクターは、それぞれ、緑色蛍光タンパク質及びヒトＩｇＧ１重鎖を発現する。ＨＣは、全長ヒトＩｇＧ１重鎖を示す。遺伝子ＩＩＩ ＡＡＴＡＡＡは、遺伝子ＩＩＩの潜在的ポリアデニル化部位の存在を示す。ＦＣ^＊は、推定される細胞質Ｎ末端切断型Ｆｃ断片発現産物を示す。ＮＡ、適用外。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現し、精製したＩｇＧ及びＦａｂ断片の分析を示す、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルである。ｐＤＶ２ｄ及びｐＲＫ−Ｆｃ２（ＩｇＧ）またはｐＲＫ−ＦＡＢ−Ｆ（Ｆａｂ断片）を同時トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清からの、発現し、精製したＩｇＧ及びＦａｂを、精製し、還元または非還元条件下で４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。バンドの同一性を、右側に示す。ＨＣ、重鎖。ＬＣ、軽鎖。Ｆｄ、重鎖Ｆｄ断片（ＶＨ＋ＣＨ１＋上部ヒンジ）。ＨＣ及びＬＣ（非還元）バンドは、鎖間ジスルフィド結合を形成していない重鎖及び軽鎖であるが、ＩｇＧ試料中で鎖内ジスルフィド結合を有し得る。非還元Ｆａｂ試料中の約２５ｋＤａのバンドは、鎖間ジスルフィド結合を形成しなかったが、鎖内ジスルフィド結合を有し得る、共移行重鎖及び軽鎖を有する。 ファージ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により検出された、ファージミドｐＤＶ２を伴うファージ上でのＦａｂ断片のディスプレイを示すグラフである。Ｆａｂ−ジップ−ファージは、ｐＦａｂ−ジップファージミドを保有する大腸菌細胞をＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに感染させることにより生成した。ｐＤＶ２ファージは、ｐＤＶ２ｄベクターを保有する大腸菌細胞をＡｍｂｅｒ−２６１４ ＫＯ７ファージに感染させることにより生成した。

Ｉ．定義
本明細書中の「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。

Ｋａｂａｔ番号付け方式は、可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）内の残基に言及する場合、一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付け方式」または「ＥＵ指数」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する場合、一般的に使用される（例えば、上記Ｋａｂａｔらにおいて報告されるＥＵ指数）。「ＫａｂａｔのＥＵ指数」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書に別段の記載がない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、Ｋａｂａｔ番号付け方式による残基番号付けを意味する。本明細書に別段の記載がない限り、抗体の重鎖定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付け方式による残基番号付けを意味する。

天然の基本的４鎖抗体単位は、２つの同一の軽鎖（ＬＣ）と２つの同一の重鎖（ＨＣ）からなるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドを伴う基本的ヘテロ四量体単位の５つからなり、それゆえ１０個の抗原結合部位を含有し、一方で、分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖を伴う基本的４鎖単位の２〜５を含む多価集合を形成することができる）。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般的に、約１５０，０００ダルトンである。２つのＨＣがＨＣアイソタイプに応じて１つまたは２つ以上のジスルフィド結合により互いに連結されている一方で、各ＬＣは１つの共有ジスルフィド結合によりＨＣに連結されている。また、各ＨＣ及びＬＣは、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各ＨＣは、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これに、α及びγ鎖の各々について３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、並びにμ及びεアイソタイプについて４つのＣｊドメインが続く。各ＬＣは、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）が続く。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。ＣＨ１は、ヒンジ領域により、重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）に接続することができる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインとの間の接合点を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬは、対を形成して、共に単一の抗原結合部位を形成する。様々なクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ６を参照のこと。

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、ＩｇＧの残基およそ２３１〜およそ３４０に延在する。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていないという点で、独特である。むしろ、２つのＮ連結分岐炭水化物鎖が、無傷のネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。炭水化物はドメイン−ドメイン対形成の代替としてはたらき、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立ち得ると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基およそ３４１〜アミノ酸残基およそ４４７）中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端であるひと続きの残基を含む。

任意の脊椎動物種からの軽鎖（ＬＣ）は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明らかに別個のタイプのうちの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは、様々なクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、それぞれ、α、δ、γ、ε、及びμという名称の重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的小さな差異に基づいて更にサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分は、抗体間で配列が広範囲に異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸の全長にわたって均一に分散されていない。その代わりに、Ｖ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる１５〜３０アミノ酸の比較的不変のひと続き、及びこれを分離する「超可変領域」と呼ばれる、各々９〜１２アミノ酸長の極端な可変性のより短い領域からなる。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々は、主としてベータシート構造をとる４つのＦＲを含み、これらは、このβシート構造を接続し、いくつかの場合にはベータシート構造の部分を形成するループを形成する３つの超可変領域により接続されている。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって共に近接して保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与等の様々なエフェクタ機能を示す。

「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原を結合する、無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；二重特異性抗体；線形抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

「Ｆａｂ」断片は、抗体のパパイン消化によって生成された抗原結合断片であり、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）を伴うＬ鎖全体と、１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。抗体のパパイン消化は、２つの同一のＦａｂ断片を生成する。抗体のペプシン処理により単一の大型Ｆ（ａｂ’）２断片が生成され、これは概ね、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片に対応し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端で、抗体ヒンジ領域からの１つまたは２つ以上のシステインを含む追加のいくつかの残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書中における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、Ｆａｂ’断片の対で、それらの間にヒンジシステインを有する対として生成された。抗体断片の他の化学結合も知られている。

本明細書で使用する場合、「アダプタータンパク質」は、溶液中で別のアダプタータンパク質配列と特異的に相互作用するタンパク質配列を指す。一実施形態では、「アダプタータンパク質」は、ヘテロ多量体化ドメインを含む。かかるアダプタータンパク質は、ロイシンジッパータンパク質、または配列番号４（ｃＪＵＮ（Ｒ）：ＡＳＩＡＲＬ［Ｅ］Ｅ［Ｋ］Ｖ ＫＴＬ［Ｋ］Ａ［Ｑ］ＮＹＥＬ ［Ａ］Ｓ［Ｔ］ＡＮＭＬＲＥ［Ｑ］ ＶＡＱＬＧＧＣ）もしくは配列番号５（ＦｏｓＷ（Ｅ）：ＡＳ［Ｉ］ＤＥＬ［Ｑ］ＡＥ［Ｖ］ ＥＱＬＥＥ［Ｒ］ＮＹＡＬ ［Ｒ］ＫＥ［Ｖ］ＥＤＬ［Ｑ］Ｋ［Ｑ］ ［Ａ］ＥＫＬＧＧＣ）のアミノ酸配列もしくはこれらの変形（非限定的に、下線付き及び太字のものを含むように改変され得る配列番号４及び配列番号５のアミノ酸）であって、この変形が、アダプタータンパク質の、別のアダプタータンパク質へのアフィニティを維持または増大させるアミノ酸改変を有する、変形を含むポリペプチド、または配列番号１１（ＡＳＩＡＲＬＲＥＲＶＫＴＬＲＡＲＮＹＥＬＲＳＲＡＮＭＬＲＥＲＶＡＱＬＧＧＣ）もしくは配列番号１２（ＡＳＬＤＥＬＥＡＥＩＥＱＬＥＥＥＮＹＡＬＥＫＥＩＥＤＬＥＫＥＬＥＫＬＧＧＣ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１３（ＧＡＢＡ−Ｒ１：ＥＥＫＳＲＬＬＥＫＥ ＮＲＥＬＥＫＩＩＡＥ ＫＥＥＲＶＳＥＬＲＨ ＱＬＱＳＶＧＧＣ）もしくは配列番号１４（ＧＡＢＡ−Ｒ２：ＴＳＲＬＥＧＬＱＳＥ ＮＨＲＬＲＭＫＩＴＥ ＬＤＫＤＬＥＥＶＴＭ ＱＬＱＤＶＧＧＣ）もしくは配列番号１５（Ｃｙｓ：ＡＧＳＣ）もしくは配列番号１６（Ｈｉｎｇｅ：ＣＰＰＣＰＧ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。コートタンパク質またはアダプタータンパク質をコードする核酸分子は、合成イントロン内に含まれる。

本明細書で使用される場合、「ヘテロ多量体化ドメイン」は、ヘテロ多量体形成を促進し、ホモ多量体形成を妨害するための、生物学的分子への変更または追加を指す。ホモダイマーよりヘテロダイマーを形成する強い優先性を有する任意のヘテロ二量体化ドメインは、本発明の範囲内である。例示的な例として、例えば米国特許出願第２００３００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎら、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ホールへのノブを説明する）、国際特許公開第ＷＯ２００７１４７９０１号（Ｋｊaｒｇａａｒｄら、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、イオン性相互作用を説明する）、国際特許公開第ＷＯ２００９０８９００４号（Ｋａｎｎａｎら、Ａｍｇｅｎ、静電ステアリング効果を説明する）、国際特許公開第ＷＯ２０１１／０３４６０５号（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、多重コイルを説明する）が挙げられるが、これらに限定されない。また、例えば、ロイシンジッパーを説明するＰａｃｋ，Ｐ．＆ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１５７９−１５８４（１９９２）、またはヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを説明するＰａｃｋらＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１２７１−１２７７（１９９３）を参照のこと。「ヘテロ多量体化ドメイン」及び「ヘテロ二量体化ドメイン」という句は、本明細書中で相互変換可能に使用される。

本明細書で使用する場合、「クローニング部位」という用語は、互換性のある付着末端または平滑末端を含有する核酸配列のライゲーションによる制限エンドヌクレアーゼ仲介クローニングのための制限酵素部位、ホモロジー及び「オーバーラップＰＣＲスティッチング」という延長によるインサートＤＮＡのＰＣＲ仲介クローニングのためのプライミング部位として働く核酸配列の領域、または組換え−交換反応による標的核酸配列のリコンビナーゼ仲介挿入のための組換え部位、または標的核酸配列のトランスポゾン仲介挿入のためのモザイク末端、及び本分野で一般的な他の技術を含有する核酸配列を指す。

本明細書で使用される場合、「コートタンパク質」は、ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、及びｐＩＸを含むファージ粒子の構成要素である５つのカプシドタンパク質のいずれかを指す。一実施形態では、「コートタンパク質」は、タンパク質またはペプチドをディスプレイするために使用され得る（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，２００４，ｐ．１−２６を参照のこと）。一実施形態では、コートタンパク質は、ｐＩＩＩタンパク質またはそのいくつかの変形、部分、及び／もしくは誘導体であってよい。例えば、Ｍ１３バクテリオファージｐＩＩＩコートタンパク質（ｃＰ３）のＣ末端部分、例えばＭ１３ファージのタンパク質ＩＩＩのＣ末端残基２６７〜４２１をコードする配列を使用してよい。一実施形態では、ｐＩＩＩ配列は、配列番号１７のアミノ酸配列（ＡＥＤＩＥＦＡＳＧＧＧＳＧＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦＨＳＧＦＮＥＤＰＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＳＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ）を含む。一実施形態では、ｐＩＩＩ断片は、配列番号１８のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＱＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＧＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ）を含む。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、特定の生物学的及び／または生化学的活性を有する特異的核酸配列を含む核酸断片（例えばＤＮＡ断片）を意味する。「カセット」、「遺伝子カセット」、または「ＤＮＡカセット」という表現は、相互変換可能に使用することができ、同じ意味を有することができる。

「宿主細胞」、「宿主細胞系」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、相互変換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞（かかる細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、初代形質転換細胞及び継代数にかかわらず、それに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、突然変異を含有してもよい。元の形質転換された細胞においてスクリーニングされ、または選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、本明細書に含まれる。

本明細書中で使用される場合、「連結した」または「リンク（複数）」もしくは「リンク（単数）」は、ペプチドまたはホスホジエステル結合を介する、それぞれ、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の共有結合を指すこと意味し、かかる結合は、結合される２つのアミノ酸配列または核酸配列の間に任意の数の追加のアミノ酸または核酸配列を含んでよい。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で相互変換可能に使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／もしくはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりもしくは合成反応によりポリマーに組み込まれ得る任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含んでよい。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、ポリマーの組織化の前または後に修飾してよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素により中断されてよい。ポリヌクレオチドは、標識との接合による修飾等、合成後に更に修飾されてもよい。他の種類の修飾は、例えば天然ヌクレオチドの１つまたは２つ以上の、アナログでの「キャップ」置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非電荷連結を有するもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）及び電荷連結を有するもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジン等）、インターカレータを有するもの（例えばアクリジン、プソラレン等）、キレート剤を含有するもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結を有するもの（例えばアルファ芳香性核酸等）、並びにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態を含む。更に、糖内に元々存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えばホスホン酸基、リン酸基により置換され、標準の保護基により保護され、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の連結を調製するために活性化されてもよく、または固体もしくは半固体支持に接合されてもよい。５’及び３’末端のＯＨは、リン酸化され、またはアミンもしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されてもよい。また、他のヒドロキシルは、標準の保護基に誘導体化してよい。また、ポリヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボースを含む、本分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態；炭素環式糖アナログ；アルファ−アノマー糖；アラビノース、キシロース、またはリキソース等のエピマー糖；ピラノース糖；フラノース糖；セドヘプツロース；非環式アナログ；及びメチルリボシド等の塩基性ヌクレオシドアナログを含有してよい。１つまたは２つ以上のホスホジエステル結合は、代替の連結基により置換してよい。これらの代替の連結基として、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）により置換される実施形態を含むが、これらに限定されず、ここで、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈ、または任意にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド内の全ての連結が同一である必要はない。上記説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む本明細書中で言及される全てのポリヌクレオチドに適用する。

核酸が別の核酸配列との構造的または機能的関係に置かれる場合、核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、ＤＮＡの１つのセグメント及びＤＮＡの別のセグメントが同じ連続ＤＮＡ分子上で互いに位置付けられ、かつコード配列の転写を促進するようにコード配列に対して位置付けられる、プロモーターもしくはエンハンサー；翻訳を促進するようにコード配列に対して位置付けられる、リボソーム結合部位；またはプレタンパク質（例えばコードされたポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質）の発現を促進するようにコード配列に対して位置付けられる、プレ配列もしくは分泌リーダー等の構造的または機能的関係を有する場合、ＤＮＡの１つのセグメントはＤＮＡの別のセグメントに作動可能に連結することができる。他の例では、作動可能に連結された核酸配列は連続していないが、それらは核酸として、またはそれらにより発現されるタンパク質として互いに機能的な関係を有するように位置付けられる。例えば、エンハンサーは、連続していなくてもよい。連結は、便利な制限酵素部位でのライゲーションにより、または合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーを使用することにより達成することができる。

「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化部位」という用語は、細胞内で発現されたＲＮＡ分子へのポリアデノシンリボ核酸の付加を指示するのに十分な配列を意味するために本明細書で使用される。

「プロモーター」は、メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子配列の転写開始を可能にする核酸配列であり、かかる転写は、プロモーター上またはプロモーター近くのＲＮＡポリメラーゼの結合で開始される。

「３’スプライス部位」という用語は、スプライシング機構により認識及び結合され得る３’イントロン／エクソン境界の、核酸配列、例えばプレｍＲＮＡ配列を意味すると意図される。

「５’スプライス部位」という用語は、スプライシング機構により認識及び結合され得る５’エクソン／イントロン境界の、核酸配列、例えばプレｍＲＮＡ配列を意味すると意図される。

「潜在性スプライス部位」という用語は、突然変異により、または別の方法で活性化され、スプライシングエレメントとして働くことができる、通常休止状態の５’または３’スプライス部位を意味することが意図される。例えば、突然変異は、ネイティブまたはドミナント５’スプライス部位の下流の５’スプライス部位を活性化し得る。この「潜在性」スプライス部位の使用は、ネイティブまたはドミナントスプライス部位の使用により生成されない別個のｍＲＮＡスプライシング産物の生成をもたらす。

本明細書で使用する場合、「トランススプライシング」という用語は、別々の非連続的ＲＮＡ分子上に含有されるエクソンの結合を意味する。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般的に、同様の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔら Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと。）単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨまたはＶＬドメインを用いて、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするための抗原に結合する抗体から単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結される別の核酸を増幅することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される核酸の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。

ＩＩ．モジュール式ポリペプチド発現系
本発明は、少なくとも部分的に、モジュール式組換えタンパク質発現を可能にするために、プレｍＲＮＡトランススプライシングを哺乳動物細胞内で利用することができるという発見に基づいている。モジュール式の、柔軟なタンパク質発現の概念により、他のタンパク質−タンパク質スプライシング方法の要件及び制約のいずれも伴わずに、２つの異なる構築物によりコードされる任意の２つのタンパク質コード配列を正確に結合して、ポリペプチド鎖をコードする単一のｍＲＮＡにすることが可能になる。この概念は、繰り返しモジュールの様々な組み合わせを有するタンパク質の多くのコレクションを哺乳動物細胞で発現することを必要とする他の技術を簡素化し、拡張するために適合させることができる。

ここでは、ファージディスプレイ発現系との関連で様々な抗体フォーマットのモジュール式発現を可能にする、多数のポリペプチド発現系の生成を説明する。必要な核酸構成要素、ベクター、宿主細胞、及び本発明のポリペプチド発現系を使用する方法は、本明細書で説明する。

Ａ．発明の実施様式
本発明の実施は、別途指示されない限り、当該分野の技術範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，版，１９８４）、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，版，１９８７）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，編，１９８７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９８７）、「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら，編，１９９４）、及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，編，１９９１）等の文献で完全に説明されている。

Ｂ．モジュール式タンパク質発現系
本発明のポリペプチド発現系は、同じまたは異なる（例えば再フォーマットされた）形態のポリペプチド（例えば融合タンパク質）の発現を支持することができる。本発明は、トランススプライシングのプロセスを用いることにより、宿主細胞依存的様式での目的のタンパク質の様々な形態（例えば様々なフォーマットまたは様々な融合形態）のモジュール式発現及び生成のための、かかるポリペプチド発現系を生成するための手段を提供する。

１．モジュール式タンパク質発現系の核酸構成要素
ａ．モジュール式タンパク質発現系の核酸構成要素の構造
タンパク質発現系は、方向付けられたプレｍＲＮＡトランススプライシングのプロセスを介して任意の所望のポリペプチドの柔軟なモジュール式発現を一緒になって可能にする、少なくとも２つの核酸分子を使用する。第１の核酸分子は、真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ１）（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスＵ３領域、ヤギ関節炎脳炎ウイルスＵ３領域、ビスナウイルスＵ３領域、またはレトロウイルスＵ３領域配列）を含む第１の発現カセットを含み、これは、ポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_１）に作動可能に連結されている。いくつかの場合、ポリペプチドコード配列は所望のポリペプチドの一部のみをコードし、残りの部分は第２の核酸分子上に含有されるポリペプチドコード配列（ＰＥＳ２）により供給される。第１の核酸分子は、ＰＥＳ１_１の下流（３’）であるが、ハイブリダイズ配列（ＨＳ１）の上流（５’）に位置する５’ｓｓ（５’ｓｓ１_１）（例えば、ＧＴＡＡＧＡ（配列番号８））を含んでもよい。

ＨＳ１配列は、ＰＥＳ１_１とインフレームに位置付けられ得るポリペプチドタグ、ラベル、コートタンパク質、及び／またはアダプタータンパク質の全てまたは一部をコードする遺伝子を含有してよく、このため、その発現は、ＨＳ１にコードされるタンパク質に融合されたＰＥＳ１_１にコードされるタンパク質をもたらす。ある場合、ＨＳ１は、バクテリオファージＭ１３、ｆ１、またはｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及びｐＸからなる群から選択されるコートタンパク質の全てまたは一部をコードする遺伝子である。例えば、ＰＥＳ１_１は、抗体またはそのＦａｂ断片の全てまたは一部をコードすることができ、ＨＳ１配列は、コートタンパク質をコードすることができ（例えば、バクテリオファージＭ１３のｐＩＩＩタンパク質の全てまたは一部、例えばｐＩＩＩ断片は、ｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基２６７〜４２１またはｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基２６２〜４１８を含み）、抗体−またはＦａｂ断片−ｐＩＩＩタンパク質融合産物をもたらす。別の場合、ＨＳ１は、ロイシンジッパー等のアダプタータンパク質の全てまたは一部をコードする遺伝子であり、ロイシンジッパーは、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む。

加えて、第１の核酸分子は、Ｐ１_Ｅｕｋ１に対して３’及びＰＥＳ１_１に対して５’に位置する真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_１）をコードすることができる。したがって、第１の核酸分子は、Ｐ１_Ｅｕｋ１−ＥＳＳ１_１−ＰＥＳ１_１−５’ｓｓ１_１−ＨＳ１として５’〜３’方向に互いに連結される（例えば作動可能に連結される）上記構成要素を含んでよい。

タンパク質発現系の第２の核酸分子は、ポリペプチドコード配列（ＰＥＳ２）に作動可能に連結された、真核生物プロモーター（Ｐ２_Ｅｕｋ）（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター）を含んでよい。いくつかの場合、ポリペプチドコード配列は所望のポリペプチドの一部のみをコードし、残りの部分は第１の核酸分子上に含有されるポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_１）により供給される。第２の核酸分子は、ＰＥＳ２に対して５’に位置する３’スプライス部位（３’ｓｓ２）を含んでよい。第２の核酸分子は、Ｐ２_Ｅｕｋと３’ｓｓ２との間に位置するＨＳ１にハイブリダイズすることができるハイブリダイズ配列（ＨＳ２）を含んでよい。更に、第２の核酸分子は、ポリアデニル化部位（ｐＡ２）を含んでもよく、ここで、第２の核酸分子の構成要素は、Ｐ２_Ｅｕｋ−ＨＳ２−３’ｓｓ２−ＰＥＳ２−ｐＡ２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される。

それゆえ、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）内の第１及び第２の核酸プレｍＲＮＡ産物間のトランススプライシングは、別々のｍＲＮＡ分子上に位置する相補的配列（すなわち、ＨＳ１及びＨＳ２）のハイブリダイゼーションにより誘発され、このため、第１の分子の孤立した５’スプライス部位（５’ｓｓ１_１）と第２の分子の孤立した３’スプライス部位（３’ｓｓ２）とは、近接するようになり、トランススプライシングが起こり、所望のトランススプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の形成を支持する。加えて、トランススプライシングを促進するために、第１の核酸分子は、５’ｓｓ１_１とＨＳ１との間に位置付けられるイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）（ＩＳＥ１）を含んでもよい。ＩＳＥ１は、例えば、９つの連続グアニン残基を有するＧ−ｒｕｎ等の、３つまたはそれ以上の連続グアニン残基を有するＧ−ｒｕｎを含む。更に、第１及び第２の核酸プレｍＲＮＡ産物間のトランススプライシングは、第１の核酸分子がＰＥＳ１_１及び／またはＨＳ１構成要素の下流の標準のポリアデニル化部位を欠くように遺伝子操作することにより、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、２９３Ｔ、またはＣＨＯ細胞）内のそれらの転写の際に誘導され得る。これは、第２の核酸分子のｍＲＮＡ転写産物とのトランススプライシングが起こり得る前に細胞質に輸送され得る成熟ｍＲＮＡ転写産物の形成を最小限にするであろう。

いくつかの場合、別々のポリペプチド産物を同時に発現することが望ましい場合がある。例えば、第１及び第２の核酸分子の両方によりコードされる第１のポリペプチド産物と自己組織化することができる第２のポリペプチド産物を発現して、所望のヘテロ多量体タンパク質産物（例えば、重鎖及び軽鎖の両方からなる抗体）を形成することが望ましい場合がある。この目的のために、第１及び／または第２の核酸分子は、第２の発現カセットを更に含んでもよい。例えば、第１の核酸分子が第２の発現カセットを含む場合において、第２の発現カセットは、第２の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ２）、（ｉｉ）真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_２）をコードする第２の核酸配列、（ｉｉｉ）第２のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_２）、及び（ｉｖ）ポリアデニル化部位（ｐＡ１）を含んでよく、これらの構成要素は、Ｐ１_Ｅｕｋ２−ＥＳＳ１_２−ＰＥＳ１_２−ｐＡ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される。いくつかの場合、第２の発現カセットは、ＥＳＳ１_２構成要素を含まなくてもよい（例えば、発現されたポリペプチドの分泌が必要とされないか、または望ましくない場合）。したがって、第１の核酸分子は、別々のプロモーター下で２つのポリペプチド産物をコードし、これにより第１の核酸分子のポリペプチド産物の１つをコードするｍＲＮＡ転写産物の１つは、第２の核酸分子によりコードされるｍＲＮＡ転写産物との方向付けられたトランススプライシングを介して形成された。いくつかの場合、第２の発現カセットは、第１の発現カセットに対して５’に位置付けられる。他の場合、第２の発現カセットは、第１の発現カセットに対して３’に位置付けられる。

ｂ．原核細胞及び真核細胞の両方におけるポリペプチド発現
いくつかの場合、ポリペプチド発現系は、原核細胞及び真核細胞の両方に関するポリペプチド発現のために遺伝子操作で作製することができる。したがって、第１の核酸分子は、ＰＥＳ１_１またはいくつかの場合ＰＥＳ１_１及びＨＳ１によりコードされるポリペプチド産物の発現が所望される場合、Ｐ１_Ｅｕｋ１とＰＥＳ１_１との間に位置付けられる切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_１）を含んでよい。ｅＰＰＭ_１は、５’スプライス部位（５’ｓｓ１_２）、原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}）、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_１）をコードする核酸配列、及び３’スプライス部位（３’ｓｓ１_１）を含んでよく、これらは、５’ｓｓ１_２−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}−ＰＳＳ１_１−３’ｓｓ１_１として５’〜３’方向に互いに対して位置し、ＰＥＳ１_１、またはＰＥＳ１_１及びＨＳ１によりコードされるポリペプチドの転写を駆動するように作動可能に連結される。いくつかの場合、ｅＰＰＭ_１は、ＰＳＳ１_１構成要素を含まなくてもよい（例えば、発現されたポリペプチドの分泌が必要とされないか、または望ましくない場合）。したがって、ｅＰＰＭ_１は、原核細胞内で第１の核酸分子のＰＥＳ１_１にコードされるポリペプチドの転写を駆動し得る。一方、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）において、Ｐ１_Ｅｕｋ１は、第１の核酸分子のＰＥＳ１_１にコードされるポリペプチドの転写の発現を駆動し、ｅＰＰＭ_１は、５’ｓｓ１_２及び３’ｓｓ１_１構成要素に隣接する衝突のために、シススプライシングによりプレｍＲＮＡ転写産物から除去され得る。

いくつかの場合、また、ｅＰＰＭ_１は、ＰＳＳ１_１と３’ｓｓ１_１との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ１_１）を含む。ＰＰＴ１_１は、例えば、ＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣの配列（配列番号１）を含んでよい。また、第２の核酸分子は、例えば、ＨＳ２と３’ｓｓ２との間に位置付けられ得るポリピリミジン領域（ＰＰＴ２）を含んでよい。ＰＰＴ２は、例えば、ＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣの配列（配列番号７）を含んでよい。加えて、第２の核酸分子は、ＨＳ２と３’ｓｓ２との間に位置付けられるＩＳＥ（ＩＳＥ２）を更に含んでよい。ＩＳＥ２は、例えば、９つの連続グアニン残基を有するＧ−ｒｕｎ等の、３つまたはそれ以上の連続グアニン残基を有するＧ−ｒｕｎを含んでよい。

ポリペプチド発現系の第１の核酸分子が第２の発現カセットを含む、いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、Ｐ１_Ｅｕｋ２とＰＥＳ１_２との間に位置付けられる切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_２）を更に含んでよく、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_３）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}）、（ｉｉｉ）原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_２）をコードする核酸配列、及び（ｉｖ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_２）を含み、これによりこれらの構成要素は、５’ｓｓ１_３−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}−ＰＳＳ１_２−３’ｓｓ１_２として５’〜３’方向に互いに対して位置し、ＰＥＳ１_２によりコードされるポリペプチドの転写を駆動するように作動可能に連結される。いくつかの場合、ｅＰＰＭ_２は、ＰＳＳ１_２構成要素を含まなくてもよい（例えば、発現されたポリペプチドの分泌が必要とされないか、または望ましくない場合）。第２の切除可能原核生物プロモーターモジュールは、上述した第１の切除可能原核生物プロモーターモジュールの様式と同様の様式で機能するであろう。

切除可能原核生物プロモーターモジュール（複数可）の原核生物プロモーター（複数可）は、ｐｈｏＡ、Ｔａｃ、Ｌａｃ、もしくはＴｐｈａｃプロモーター（例えば、ＫｉｍらＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７（４）：ｅ３５８４４を参照のこと）、または本分野で既知の別の原核生物プロモーターであってよい。

原核細胞（例えば、大腸菌細胞）及び真核細胞（哺乳動物細胞、例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞）細胞の両方において、目的のタンパク質を発現することができるベクターの構築における追加の課題は、これらの細胞型で発見されるシグナル配列の違いから生じる。シグナル配列のある特定の特徴は一般的に、原核細胞及び真核細胞の両方で保存されるが（例えば、配列の中央に位置する疎水性残基、及び成熟ポリペプチドのＮ末端で開裂部位に隣接する極性／荷電残基のパッチ）、他のものは、もう一方のものより一方の細胞型でより特徴的である。さらに、たとえ、配列が全て哺乳動物の起源のものであったとしても、異なるシグナル配列が、哺乳動物細胞における発現レベルへ著しい影響を有し得ることは当技術分野で既知である（Ｈａｌｌら，Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：１９９９６−１９９９９（１９９０）、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０：２５２−２６４（２０００））。例えば、細菌シグナル配列は典型的に、開始メチオニンの直後に正荷電残基（最も一般的にリジン）を有するが、一方でこれらは、哺乳動物シグナル配列中に常に存在するわけではない。

発現されたタンパク質の分泌が必要または所望される場合、原核生物中のペリプラズム及び真核生物中の小胞体に対して目的のポリペプチドの標的とする任意のシグナル配列（コンセンサスシグナル配列を含む）が、使用され得る。例えば、真核生物シグナル配列（例えば、ＥＳＳ１_１またはＥＳＳ１_２）は、マウス結合免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）シグナル配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：受託番号Ｐ２００２９）または抗体重鎖もしくは軽鎖シグナル配列（例えば、マウスＶＨ遺伝子シグナル配列）の全てもしくは一部に由来し得るか、または全てもしくは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、原核生物シグナル配列（例えば、ＰＳＳ１_１またはＰＳＳ１_２）は、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）遺伝子の全てもしくは一部に由来し得るか、または全てもしくは一部を含み得る。利用され得る他のシグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：受託番号ＢＩＡ４Ｇ６）、ガウシアプリンセプスルシフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：受託番号Ｑ９ＢＬＺ２）、及び酵母エンド−１，３−グルカナーゼ（ｙＢＧＬ２）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：受託番号Ｐ１５７０３）からのシグナル配列を含む。シグナル配列は、天然または合成シグナル配列であり得る。いくつかの実施形態では、合成シグナル配列は、その非最適化天然シグナル配列と比較して、最適化されたレベルのディスプレイレベルを駆動する最適化シグナル分泌配列である。

２．ベクター、宿主細胞、及び生成方法
本発明は、上述した核酸分子のうちの１つ以上を含むベクターまたはベクターセットを特徴とする。したがって、本発明は、第１のベクター及び第２のベクターを含むベクターセットも特徴とし、ここで、第１及び第２のベクターは、上述したポリペプチド発現系の第１及び第２の核酸分子をそれぞれ含む。

上記で詳細に説明される核酸分子の構成要素に加えて、ベクターまたはベクターセットは、細菌の複製起点、哺乳動物の複製起点、及び／または対照として有用な（例えば、ｇＤタンパク質）もしくは活性（例えば、タンパク質の精製、タンパク質のタグ付け、またはタンパク質の標識化）にとって有用なポリペプチドをコードする核酸を含み得る。

培養培地中で上記のベクター（複数可）またはベクターセット（複数可）のうちの１つ以上を含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞（または宿主細胞の培養培地）から抗体を任意に回復することを含む、ポリペプチドを生成するための方法も、提供される。

Ｃ．モジュール式抗体発現及び再フォーマットのためのファージディスプレイベクター系
いくつかの実施形態では、抗体（例えば、全長抗体、例えば、全長ＩｇＧ抗体、またはそれらの断片、例えば、Ｆａｂ断片）は、本発明のポリペプチド発現系を使用して生成されることができる。同じクローンからのヒト細胞内で異なる抗体フォーマットの発現を可能にするファージディスプレイベクター系を設計することによるモジュール式タンパク質発現系の適用が示される。重鎖抗原結合領域及びファージディスプレイベクターによりコードされる定常領域の一部は、細胞内で発現の間、プレｍＲＮＡトランススプライシングによりポリペプチドの異なる一部をコードする配列を結合することにより、第２の補完構築物中でコードされる配列に直接的及び正確に融合された。

ファージＦａｂ配列のサブクローニングを必要とせずに、哺乳動物細胞におけるＩｇＧの直接発現を可能にすることを目的としたポリペプチド発現系の使用が、以下の実施例１及び２に説明される。いくつかの場合、ポリペプチド発現系の第１の核酸分子は、Ｆａｂ断片構成要素の全体をコードするために設計され得る。したがって、第１の核酸分子は、ＦａｂのＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するポリペプチドをコードするＰＥＳ１_１構成要素を含み得る。第１の核酸分子は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインをコードするＰＥＳ１_２構成要素も含み得る。第１の核酸分子の転写は、２つの非連続プレｍＲＮＡ産物をもたらし、これらは、ファージディスプレイの目的のために適切にタグ付け（例えば、Ｍ１３のｐＩＩＩに融合される）され得るＦａｂ断片を共に形成する。

Ｆａｂ断片を全長ＩｇＧ抗体に再フォーマットするプロセスは続いて、抗体の残りの部分（すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を提供する第２の核酸分子を伴って、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞）における第１の核酸分子の発現により達成されることができる。例えば、第２の核酸分子は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有するポリペプチドをコードするＰＥＳ２構成要素を含み得る。真核細胞における第１及び第２の分子の転写は、３つのプレｍＲＮＡ転写産物の生成をもたらし、プレｍＲＮＡ転写産物をコードする重鎖が、互いにトランススプライシングを受けるために誘発され、所望のＩｇＧ抗体の再フォーマットされた全長重鎖を生成するであろう。次いで、処理されたｍＲＮＡは、翻訳され、ＩｇＧ分子の軽鎖及び重鎖の両方の生成をもたらし、かかる生成は、労働集約的サブクローニングの必要性を必要としないであろう。

野生型ＩｇＧ、Ｆａｂ断片、または二重特異性フォーマットのためのＦｃ修飾を有するＩｇＧ等の異なる抗体フォーマットを、異なるスクリーニング検定法のために必要とするとき、同じクローンから異なる抗体フォーマットを発現する能力は、抗体発見において有用である。本発明のポリペプチドの発現系は、原理的に、補完プラスミド中のＣＨ１領域の後に追加される好適な配列を単にクローニングすることにより、これらのまたは追加のフォーマットのいずれかを可能にする。さらに、本系のモジュール式組織は、新規の補完プラスミドの構築のみを必要とするため、ファージディスプレイライブラリーのストックの再創出を必要とせず、新たな抗体フォーマットの発現を可能にする。核酸は、ＣＨ１コード領域下流からＶＨまたはＪ−ＣＨ１接合点のＪ領域（ＦＲ４）に５′ｓｓを移し替えることにより任意のＣＨ１領域の使用を可能にするように適合されることも可能であり、よって、２つの異なる核酸においてＶＨ及び重鎖の全体の定常領域を分離する。核酸分子は、上部ヒンジをコードする配列後に終止コドンを単に追加することにより、大腸菌におけるＦａｂ断片の発現のための従来の方法と適合可能である。しかし、Ｆａｂファージディスプレイライブラリー中の重鎖及び遺伝子ＩＩＩ配列の接合点におけるアンバー終止コドンは通常、著しくより低いレベルのディスプレイをもたらし、よって、少なくとも未経験のレパートリーライブラリーの場合、選択後にクローンの再フォーマットを必要とする（ＬｅｅらＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．２８４：１１９−１３２，２００４）。ＩｇＧ発現のために使用されたのと同じ方法を使用する哺乳動物細胞におけるＦａｂ断片の発現は、大腸菌で通常得られるものと比較可能な収率を以って、再フォーマットに対するこの必要性を回避する。

このポリペプチド発現系により生成された抗体は、組換え生成されたキメラ、ヒト化、及び／またはヒト抗体を含むことができる。いくつかの場合、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ′、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、またはＦ（ａｂ′）_２断片である。他の場合、抗体は、全長抗体、例えば本明細書で定義されるような無傷のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４抗体、または別のクラスもしくはアイソタイプの他の抗体である。

発現された抗体は、以下の項１〜７で説明されるように、単独でまたは組み合わせて、いずれかの特徴を組み込み得る。

１．抗体親和性
本明細書で説明されるポリペプチド発現系により生成された抗体（例えば、Ｆａｂまたは全長ＩｇＧ抗体）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有し得る。

一実施形態では、Ｋｄは、以下の検定法により説明されるように、目的の抗体及びその抗原のＦａｂバージョンで行われる放射標識された抗原結合検定法（ＲＩＡ）により測定される。抗原に関するＦａｂの溶液結合親和性は、標識化されていない抗原の滴定シリーズの存在下で、（^１２５Ｉ）標識化された抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化することにより測定され、次いで、抗Ｆａｂ抗体コートした板と結合した抗原を捕捉する（例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと）。検定法のための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）多坑井型板（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングされ、続いて、室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで遮断される。非吸着性の板（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［^１２５Ｉ］抗原は、目的のＦａｂの段階希釈と混合される（例えば、Ｐｒｅｓｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）中の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と矛盾しない）。次いで、目的のＦａｂは、一晩培養されるが、培養は、平衡状態に到達したことを確実にするために、より長時間にわたって（例えば、約６５時間）継続し得る。その後、混合物を、室温で（例えば、１時間）培養するために捕捉板に移される。次いで、溶液は、除去され、板は、８回、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で洗浄される。板が乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）が追加され、板は、１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で数えられる。２０％以下の最大結合を供する各Ｆａｂの濃度が、競合結合検定法での使用のために選ばれる。

別の実施形態に従って、Ｋｄは、２５℃で、約１０の応答単位（ＲＵ）で不動化抗原ＣＭ５チップを用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴検定法を使用して測定される。要するに、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）は、供給者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、ｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈し、約１０の結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）を達成するように５μｌ／分の流量で注入される。抗原の注入後、反応していない群を遮断するために１Ｍのエタノールアミンが注入される。動態測定のために、２倍に段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が、２５℃で約２５μｌ／分の流量で０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳに注入される。会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、会合及び解離のセンサーグラムを同時に適合させることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、算出される。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出した。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴検定法による結合速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、結合速度は、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、増加濃度の抗原の存在下で、ｐＨ７．２のＰＢＳ中、２５℃における、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎＭ、発光＝３４０ｎＭ、１６ｎＭの帯域通過）における増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することにより、決定されることができる。

２．抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書で説明されるポリペプチド発現系により生成された抗体は、抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに以下に説明される他の断片を含むが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、ＨｕｄｓｏｎらＮａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ 編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、国際特許公開第ＷＯ９３／１６１８５号、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期を増加させるＦａｂ及びＦ（ａｂ′）_２断片の考察のために、例えば、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。

二特異性抗体は、二価または二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際特許公開第ＷＯ１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。三特異性抗体及び四特異性抗体も、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）で説明される。

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照のこと）。

３．キメラの及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で説明されるポリペプチド発現系により生成された抗体（例えば、Ｆａｂまたは全長ＩｇＧ抗体）は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））で説明される。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えばサル由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変化した「クラスが転換された」抗体である。キメラ抗体は、それらの抗原結合断片を含む。

ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体は、ヒト化されて、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を維持しながらヒトに対する免疫原性を低減する。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（またはそれらの部分）が、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）が、ヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来となる抗体）からの対応する残基で置換されて、例えば抗体の特異性または親和性を復元または改善する。

ヒト化抗体及びそれらの作製方法が、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ， Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）で確認され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化を説明する）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再生」を説明する）、Ｄａｌｌ′Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を説明する）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を説明する）で更に説明される。

ヒト化のために使用され得るヒト枠組み領域は、「最良適合」方法を使用して選択される枠組み領域（例えば、ＳｉｍｓらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照のこと）、軽鎖または重鎖可変領域の特別な下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来する枠組み領域（例えば、ＣａｒｔｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照のこと）、ヒト成熟（体細胞的に突然変異した）枠組み領域またはヒト生殖系枠組み領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照のこと）、ならびにスクリーニングＦＲライブラリーに由来する枠組み領域（例えば、Ｂａｃａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。

４．ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で説明されるポリペプチド発現系により生成された抗体（例えば、Ｆａｂまたは全長ＩｇＧ抗体）は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で既知の様々な技術を使用して独自に調製され、次いで、その配列が同定された、組換えヒト抗体であり得る。ヒト抗体は概して、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）で説明される。

５．ライブラリー由来抗体
ファージディスプレイ系において有用である本明細書で説明されるポリペプチド発現系の利用により、本発明のポリペプチドの発現系により生成された抗体（例えば、Ｆａｂまたは全長ＩｇＧ抗体）は、コンビナトリアルライブラリーを、所望の活性（複数可）を有する抗体に関してスクリーニングにより単離され得る。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍらｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、ならびに例えば ｉｎ ｔｈｅ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）； Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照のこと。

６．多重特異性抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で説明されるポリペプチド発現系により生成された抗体（例えば、Ｆａｂまたは全長ＩｇＧ抗体）は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの１つは、第１の抗原に関し、他は、任意の他の抗原に関する。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、細胞毒を、第１の抗原を発現する細胞に局限するためにも使用され得る。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製されることができる。

「オクトパス抗体」を含めて、３つ以上の機能抗原結合部位を有する工学的に作製された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、米国第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照のこと）。

本明細書の抗体または断片は、第１の抗原、ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。

７．抗体変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の全てまたは一部をコードする核酸分子列のうちの１つ以上に適切な修飾を導入することにより調製され得る。かかる修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／またはアミノ酸配列中への残基の挿入、及び／またはアミノ酸配列中の残基の置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構築を達成するように作製され得るが、但し、最終構築物は所望の特徴、例えば抗原結合性を保有することを条件とする。

ある特定の実施形態では、互いに対して１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体の収集が、本発明の発現系及び方法により生成されることができる。置換変異誘発のための目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換を表１の見出し「保存的置換」の下に示す。より実質的な変更は表１の見出し「典型的な置換」の下に提供され、アミノ酸側鎖クラスに関連して、以下で更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体及び所望の活性、例えば、維持／改善された抗原結合、減少された免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣに関してスクリーニングされた産物中に導入され得る。

アミノ酸は共通の側鎖特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。

置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる研究のために選択された得られた変異体（複数可）は、親抗体に対してある特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）を有し（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）、及び／または親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に維持するであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、それは、例えば本明細書で説明されるもの等のファージディスプレイに基づく親和性成熟法を使用して簡便に生成され得る。要するに、１つ以上のＨＶＲ残基は、突然変異され、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。

変更（例えば、置換）は、例えば抗体親和性を改善するためにＨＶＲにおいて行われ得る。かかる変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセスの間、高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われ得、得られた変異体ＶＨまたはＶＬは結合親和性に関して試験される。二次ライブラリーを構築し、それらから再選択することによる親和性成熟法は、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８ １−３７（２００１）（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，版，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに説明されている。親和性成熟法のいくつかの実施形態では、多様性は、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟させるために選ばれる可変部遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが創出される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法はＨＶＲ指向手法を伴い、その方法では、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化される。抗原結合で伴われるＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に同定され得る。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的とされる。

ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる変更が抗原を結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）は、ＨＶＲにおいて行われ得る。かかる変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲ以外の箇所であり得る。上記で提供された変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは変更していないか、または１、２、もしくは３つを超えるアミノ酸置換を含有しないかのどちらかである。

変異誘発の標的となり得る抗体の残基または領域の同定にとって有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基のグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）は、同定され、かつ中性または負に荷電されたアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により交換されて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けたかどうかを決定する。さらなる置換が、初期置換に対して機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異体は、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。

アミノ酸配列の挿入は、長さにおいて１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含む。

ファージ抗体ディスプレイベクター系との関連でプレｍＲＮＡトランススプライシングによるモジュール式タンパク質発現の概念が本明細書で詳細に説明されるが、本明細書で説明される核酸分子、ベクター、ベクターセット、宿主細胞、及び方法の使用により例示される概念の適用は、例えば繰り返しモジュールの異なる組み合わせを有するタンパク質の多くのコレクションを哺乳動物細胞で発現することを必要とする他の技術に適合及び拡張することができる。

ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の実施例である。様々な他の実施形態が、上記で提供された一般的な記述に基づいて実践され得ることを理解されたい。

実施例１．ファージディスプレイベクターと関連する抗体再フォーマットのためのモジュール式タンパク質発現系の生成
ポリペプチドのモジュール式発現及び生成のためのポリペプチド発現系の生成が説明される。本発明は、少なくとも部分的に、モジュール式組換えタンパク質発現を可能にするために、プレｍＲＮＡトランススプライシングを哺乳動物細胞において活用することができることを示す実験の発見に基づいている。モジュール式タンパク質発現の概念により、他のタンパク質−タンパク質スプライシング方法の要件及び制約のいずれも伴わずに、２つの異なる構築物によりコードされる任意の２つのタンパク質コード配列を正確に結合して、ポリペプチド鎖をコードする単一のｍＲＮＡにすることが可能になる。プレｍＲＮＡトランススプライシングによるモジュール式タンパク質発現の概念は、繰り返しモジュールの異なる組み合わせを有するタンパク質の多くのコレクションを哺乳動物細胞で発現することを必要とする他の技術を簡素化し、拡張するために適合させることができる。例えば、この概念は、単一のポリペプチド中の融合タンパク質パートナーまたは突然変異の組み合わせの発現を必要とする他の設定で用途を見出すであろう。この技術は、単純及び有効的の両方であり、どのような規模においても適用を可能にし、現代の多くの生物工学の基礎である哺乳動物細胞における組換えタンパク質発現の分野にとって広範な重要性を有する。

ここでは、ファージディスプレイ発現系との関連で異なる抗体フォーマットのモジュール式発現を可能にする、かかるポリペプチド発現系の生成が説明される。ファージディスプレイは、治療及び試薬抗体の開発に関して、抗体断片の発見及び工学的作製において幅広く使用される（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＮａｔｕｒｅ．３４８：５５２−５５４，１９９０、Ｓｉｄｈｕ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１１：６１０−６１６，２０００、Ｓｍｉｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２８：１３１５−１３１７，１９８５）。ファージディスプレイは従来、抗原特異性結合剤の迅速な選択を可能にするが、選択された抗体断片のスクリーニングを限定した。抗体断片の詳細な特徴付けはしばしば、哺乳動物細胞において通常発現される全長免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の発現を必要とする。しかし、このプロセスの１つの限定ステップは、ＩｇＧ発現のためにファージクローンを哺乳動物発現ベクターに再フォーマットすることである。高スループットサブクローニング方法は、多数のクローンを再フォーマットするために使用されることができるが、これらの方法は通常、相対的に労働集約的であり、スクリーニング段階を超えて使用されないであろう多くのクローンを産生する。

サブクローニングに対する必要性を回避し、モジュール式タンパク質発現を可能にするために、第１の核酸分子：二重宿主ベクター、ｐＤＶ２が生成された（図１）。細菌または哺乳動物細胞のどちらか一方における重鎖の発現のために工学的に作製されたシグナル配列を有するＩｇＧ発現カセットを含有し、完全ＩｇＧ発現のための軽鎖を発現する哺乳動物発現ベクターを有する哺乳動物細胞の同時トランスフェクションを必要とする前述の二重ベクターｐＤＶと違い（ＴｅｓａｒらＰｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ．２６：６５５−６６２，２０１３）、ｐＤＶ２は、細菌プロモーター及び哺乳動物細胞におけるスプライシングにより除去されるイントロン中に埋め込まれたｓｔＩＩシグナル配列の殆どを含有する。

ｐＤＶ２中のｓｔＩＩシグナル配列を、３′スプライス部位（３′ｓｓ）及び３′ｓｓの前に最適化されたポリピリミジン領域（ＰＰＴ）の両方を含むように修飾した。これは、ｓｔＩＩシグナル配列中に３つの相対的に保存的なアミノ酸置換を導入することを必要とし、これは、ファージ上のＦａｂ断片の表示に影響を与えなかった（図２）。同じクローンからの抗体フォーマットのモジュール式で柔軟な発現を可能にするために、ＣＨ１ドメインをコードする領域から下流に定常領域をコードする、完全なイントロン及びエクソンを追加しなかった。代わりに、第２の核酸分子からトランスでこれらの重鎖配列を追加しようとした。これを達成するために、２つの異なるプレｍＲＮＡを結合して単一の成熟ｍＲＮＡを形成する、プレｍＲＮＡトランススプライシングのプロセスを活用した。５′ｓｓから下流及び３′ｓｓから上流への相補的配列のハイブリダイゼーションにより単独５′ｓｓ及び３′ｓｓを有するプレｍＲＮＡをもたらすことにより哺乳動物細胞におけるトランススプライシングを誘発して、単一の非共有結合的プレｍＲＮＡを形成することができ、次いで、それを正規のプレｍＲＮＡとしてスプライスする（ＫｏｎａｒｓｋａらＣｅｌｌ．４２：１６５−１７１，１９８５、ＰｕｔｔａｒａｊｕらＮａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：２４６−２５２，１９９９、Ｓｏｌｎｉｃｋ．Ｃｅｌｌ．４２：１５７−１６４，１９８５）。この特別なポリペプチド発現系では、ハイブリダイズ配列としてＭ１３遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）の１５０−ｂｐの断片を使用した（図１）。この遺伝子ＩＩＩ配列は、ＣＨ１をコードする配列の３′境界で前述の最適化されたＧＴＡＡＧＡ ５′ｓｓに続く（ＴｅｓａｒらＰｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ．２６：６５５−６６２，２０１３）。

ポリペプチド発現系を完了するために、リンカー配列、コンセンサス分岐点、及びＰＰＴが続く１５０−ｎｔアンチセンス遺伝子ＩＩＩ配列、ならびにヒンジ、１つのエクソン中のＣＨ２とＣＨ３領域、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続く３′ｓｓを含有するプレｍＲＮＡを発現する補完プラスミドである、第２の核酸分子ｐＲＫ−Ｆｃを生成した（図１及び３）。この転写産物は、シグナル配列をコードせず、第１の２つの潜在的な開始コドンは、フレーム外の、アンチセンス遺伝子ＩＩＩ配列中及びヒンジ領域中に位置される。よって、５′ｓｓを除いて、スプライシングのために必要とした他の全ての配列を、ｐＤＶ２よりむしろｐＲＫ−Ｆｃによりコードする。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（インビトロゲン）とｐＤＶ２及びｐＲＫ−Ｆｃとの同時トランスフェクションは、基線であるが検出可能な発現レベルのＩｇＧをもたらした（図４Ａ）。

実施例２．ファージディスプレイベクターと関連する抗体再フォーマットのための最適化されたモジュール式タンパク質発現系の生成
ｐＤＶ２及びｐＲＫ−Ｆｃにより達成された基線ＩｇＧ収率は、効率的なトランススプライシングのために必要とされる配列、またはトランススプライシングを阻害するベクター中の配列の欠如に起因した可能性がある。エクソン及びイントロンの両方におけるヌクレオチドモチーフは、それらの位置に応じて、スプライシングエンハンサーまたはサプレッサーまたはそれらの両方として作用することができる。ベクター設計の目的に関して、イントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）が、哺乳動物細胞発現においてコード配列に影響を与える可能性が低いため、簡単に追加することができる。１つのよく説明されたＩＳＥは、イントロン境界に近接して位置される、３つ以上の連続グアニン残基の配列またはＧ−ｒｕｎから構成されており、それらは、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質ＨまたはＦにより結合されて、スプライシングを増進する（Ｗａｎｇら Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．１９：１０４４−１０５２，２０１２、Ｘｉａｏら Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．１６：１０９４−１１００，２００９）。加えて、Ｇ−ｒｕｎに限定されず５′ｓｓに近接するプリンに富むイントロン配列も、スプライシングを増進することが示されている（Ｈａｓｔｉｎｇｓら ＲＮＡ．７：８５９−８７４，２００１）。

よって、Ｍ１３バクテリオファージｐＩＩＩコートタンパク質（ｃＰ３）の上部ヒンジとＣ末端部との間でリンカーをコードする領域において９−ｎｔのＧ−ｒｕｎ、ならびに下流に第２の４−ｎｔのＧ−ｒｕｎ１０ｎｔを有する、５′ｓｓから下流に２３−塩基対（ｂｐ）のプリンに富む領域２６−ｂｐを含む、ｐＤＶ２、ｐＤＶ２ｂの変異体を創出した（図５）。この変異体は、上部ヒンジとｃＰ３との間でＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏリンカーを３つのＧｌｙ残基に変化させる。ベクターは、重鎖カセットのための標準ポリアデニル化部位を含まなかった。この理由は、ベクターからの成熟重鎖ｍＲＮＡの形成を最小限に抑えようと試みたためであり、次いで、これは細胞質に輸送され、トランススプライシングが起こり、Ｆａｂ−ｃＰ３融合タンパク質の発現を潜在的に引き起こす可能性がある。ｐＲＫ−Ｆｃ分子も、最適化した。３′ｓｓ付近のイントロンＧ−ｒｕｎは、インビトロにおけるスプライシングを刺激することが示されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ．ＰＬｏＳ ｂｉｏｌｏｇｙ．４：ｅ２１，２００６）。それゆえ、９−ｎｔのＩＳＥを、分岐部位から上流に追加して、最適化された補完プラスミドｐＲＫ−Ｆｃ２を生成した（図６）。ヒトＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞とｐＤＶ２、及びｐＲＫ−Ｆｃ（ＩＳＥ−）またはｐＲＫ−Ｆｃ２（ＩＳＥ＋）との同時トランスフェクションは、基線レベルのＩｇＧ発現をもたらした（図４Ａ）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞とＩＳＥ＋ｐＤＶ２ｂプラスミド、及びｐＲＫ−ＦｃまたはｐＲＫ−Ｆｃ２との同時トランスフェクションは、より高いレベルのＩｇＧ発現をもたらし、ＩＳＥ＋プラスミドｐＤＶ２ｂ及びｐＲＫ−Ｆｃ２を同時トランスフェクすることにより産生された最大２５μｇ／ｍｌの最も高い発現レベルは、両方の転写産物中のＩＳＥ配列が、トランススプライシングの効率を増進することを示す。

トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内の基線ＩｇＧ発現レベルは、トランスフェクションの７日後の見掛けの細胞溶解に関連し、ｐＲＫ−ＦｃまたはｐＲＫ−Ｆｃ２ではなくｐＤＶ２またはｐＤＶ２ｂが、単独でトランスフェクトされたときに観察された。抗Ｍ１３ｐ３抗体を用いたウェスタンブロッティングによりトランスフェクトした細胞溶解質の分析は、Ｍ１３ｃＰ３ペプチドに融合したＩｇＧ１Ｆｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１−上部ヒンジ）の発現と一致する、約４１ｋＤａの見掛けの分子量を有するポリペプチドを明らかにした（図１２、下部パネル、列３〜６）。このポリペプチドの発現は、補完プラスミド無しでｐＤＶ２またはｐＤＶ２ｂでトランスフェクトした細胞においてより高かった。結果は、ｐＤＶ２及びｐＤＶ２ｂプラスミドが両方とも、重鎖カセットからベクター下流で哺乳動物ポリアデニル化部位を欠如しているという事実にもかかわらず、潜在的に毒性である産物をコードする成熟ｍＲＮＡを発現できることを示した。

ｃＰ３をコードする遺伝子ＩＩＩ配列の目視検査は、ポリアデニル化部位として作用することが可能であるＡＡＴＡＡＡモチーフを明らかにした（図２）。この部位に２つのサイレント突然変異を導入して、これが哺乳動物細胞における毒性を低減し、タンパク質発現を改善するかどうかを試験するためにプラスミドｐＤＶ２ｃ（ＩＳＥ−）及びｐＤＶ２ｄ（ＩＳＥ＋）を生成した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞とｐＲＫ−Ｆｃ、及びｐＤＶ２ｃまたはｐＤＶ２ｄとの同時トランスフェクションは、遺伝子ＩＩＩ中の潜在的ポリアデニル化部位により、ｐＤＶ２及びｐＤＶ２ｂベクターに対して約６倍高いレベルのＩｇＧ発現をもたらした（図４Ａ）。このＩｇＧ発現レベルの増加は、トランスフェクトした細胞の高い生存能力及びトランスフェクトした細胞内のＦｄ−ｃＰ３融合タンパク質の著しく低減されたかまたは検出不可能な発現に関連した（図１２、下方パネル、列７〜１０）。これは、遺伝子ＩＩＩ内のドナーベクター中の潜在的ポリアデニル化部位の存在は、タンパク質発現に著しい負の影響を有する、ドナープラスミド単独からの不要なタンパク質発現を引き起こすことを示す。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞とｐＤＶ２ｃまたはｐＤＶ２ｄ、及びＩＳＥ＋ｐＲＫ−Ｆｃ２補完ベクターとの同時トランスフェクションは、ＩＳＥ−ｐＲＫ−Ｆｃベクターとの同時トランスフェクトと比較してさらに２倍のＩｇＧ発現の増加をもたらした（図４Ａ）。これらの結果は、ｐＤＶ２ベクター中の基線タンパク質発現を決定する主要な要因は、遺伝子ＩＩＩ中の潜在的ポリアデニル化部位の存在であるが、一方で潜在的遺伝子ＩＩＩポリアデニル化モチーフが存在しないとき、ＩＳＥの追加は、タンパク質発現に軽微な効果を有することを示す。対照的に、補完ｐＲＫ−Ｆｃ２プラスミド中のＩＳＥの追加は、遺伝子ＩＩＩ中の潜在的ポリアデニル化部位無しにｐＤＶ２変異体を同時トランスフェクトするとき、約２倍高いＩｇＧ収率をもたらす（図４Ａ）。

タンパク質発現のさらなる最適化を、トランスフェクションのための最適ＤＮＡ比を決定することにより達成した。ｐＤＶ２ｄに対して２：１過剰の補完プラスミドｐＲＫ−Ｆｃ２を使用することは、この系において最も高いＩｇＧ発現収率をもたらした（図４Ｂ）。最適化されたＤＮＡ比を有するｐＤＶ２ｄ及びｐＲＫ−Ｆｃ２を使用すると、トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の３０ｍｌの上清から精製されたＩｇＧの収率は、３．２±１．２ｍｇ（ｎ＝３）であった。これらのプラスミドを同時トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から精製されたＩｇＧは、質量分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、従来の発現ベクターにより発現された同じＩｇＧと区別がつかなかった（図７Ａ〜７Ｂ及び図１３）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞と異なる特異性の可変領域をコードするｐＤＶ２ｄ及び最適化されたＤＮＡ比を有するｐＲＫ−Ｆｃ２との同時トランスフェクションは、トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の３０ｍｌの上清から精製された２．５〜５．５ｍｇのＩｇＧの高いＩｇＧ発現をもたらした（図８Ａ）。ポリペプチド発現系は、高い発現レベルを達成するためのＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の使用に限定されない。２９３Ｔ及びＣＨＯ細胞等の、ＩｇＧ発現のために幅広く使用される他の哺乳動物細胞株も、効果的であった。２９３ＴまたはＣＨＯ細胞と異なる特異性の可変領域を発現するｐＤＶ２ｄ及びｐＲＫ−Ｆｃ２との同時トランスフェクションは、高いＩｇＧ発現をもたらした（図８Ｂ）。

ｐＲＫ−Ｆｃ２ベクターを、ｐＤＶ２プラスミドと同時トランスフェクトしたとき、Ｆａｂ断片の発現のために修飾した。ｐＲＫ−Ｆｃ２においてより低いヒンジ及びＦｃ領域をコードする配列を除去し、ｐＲＫ−Ｆａｂ−Ｆｌａｇベクターを産生するためにＦｌａｇタグと交換した（図９）。ｐＤＶ２ｄ及びｐＲＫ−Ｆａｂ−Ｆｌａｇを同時トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の３０ｍｌの上清から精製された精製Ｆａｂ断片の収率は、０．８±０．０６ｍｇ（平均±標準偏差、ｎ＝３）であった。精製されたＦｌａｇタグ付きＦａｂ断片の構造的精度を、質量分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１３）。観察された重鎖質量は、クリップＣ末端リジンを除くと、予想された質量２５，１７２Ｄａに近い２５，１６９Ｄａであった。

補完転写産物からのＮ末端切断型タンパク質の発現は、遺伝子治療のためのトランススプライシング系で観察されている（Ｍｏｎｊａｒｅｔら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１７６−１１８７，２０１４）。これは、成熟ｍＲＮＡの形成のために必要である全ての要素を有する３′エクソンをコードする補完転写産物に因り、内部開始コドンからの翻訳を引き起こす可能性がある。ｐＲＫ−Ｆｃ２をトランスフェクトした細胞の溶解質のウェスタンブロッティングにより、第１のインフレームＡＴＧコドンから翻訳されたＦｃ断片と一致するポリペプチドの発現を観察した（図１２、上部パネル、列１１）。このポリペプチドはおそらく、分泌シグナル配列を欠如しており、細胞質のみで発現されるはずである。この産物は、細胞溶解により培養培地中に放出される可能性があるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３、列２）及び質量分析により、精製されたＩｇＧ試料中でそれを観察しなかった。ｐＤＶ２ｃまたはｐＤＶ２ｄが細胞中に同時トランスフェクトされたとき、この切断型産物の発現は低減されたが、排除はされなかった（図１２、上部パネル、列８及び１０）。潜在的Ｆｃ開始コドンからのイントロン領域上流への最適翻訳開始部位を有するアウトオブフレームオープンリーディングフレームの挿入は、切断型Ｆｃ産物の発現を著しく低減しなかった。

選択効率を決定するファージディスプレイベクターの重要な特性は、達成されるファージ粒子上の抗体断片ディスプレイのレベルである。大腸菌ＳｕｐＥサプレッサー菌株において低減されたｐ３発現と共に、前述のＡｍｂｅｒ−２６１４ＫＯ７ヘルパーファージを使用して、ｐＤＶ２ｄベクターで達成したＦａｂ断片ディスプレイのレベルは、特殊化Ｆａｂディスプレイベクター、Ｆａｂ−ジップ−ファージで、標準Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを使用して達成されたＦａｂディスプレイレベルと比較可能であった（図１４）。

野生型ＩｇＧ、Ｆａｂ断片、または二重特異性フォーマットのためのＦｃ修飾を有するＩｇＧ等の異なる抗体フォーマットを、異なるスクリーニング検定法のために必要とするとき、同じクローンから異なる抗体フォーマットを発現するための能力は、抗体発見において有用である。ベクターセットは、原理的に、補完プラスミド中のＣＨ１領域の後に追加される好適な配列を単にクローニングすることにより、これらのまたは追加のフォーマットのいずれかを可能にする。さらに、本系のモジュール式組織は、新規の補完プラスミドの構築のみを必要とするため、ファージディスプレイライブラリーのストックの再創出を必要とせず、新たな抗体フォーマットの発現を可能にする。二重ベクターは、ＣＨ１コード領域下流からＶＨまたはＪ−ＣＨ１接合点のＪ領域（ＦＲ４）に５′ｓｓを移し替えることにより任意のＣＨ１領域の使用を可能にするように適合されることも可能であり、よって、２つの異なるプラスミドにおいてＶＨ及び重鎖の全体定常領域を分離する。Ｆａｂファージディスプレイライブラリー中の重鎖及び遺伝子ＩＩＩ配列の接合点におけるアンバー終止コドンは通常、著しくより低いレベルのディスプレイをもたらし、よって、少なくとも未経験のレパートリーライブラリーの場合、選択後にクローンの再フォーマットを必要とするという知識を以って、ｐＤＶ２ベクターは、上部ヒンジをコードする配列後に終止コドンを単に追加することにより、大腸菌におけるＦａｂ断片の発現のための従来の方法と適合可能である（Ｌｅｅら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．２８４：１１９−１３２，２００４）。ＩｇＧ発現のために使用されたのと同じ方法を使用する哺乳動物細胞におけるＦａｂ断片の発現は、大腸菌で通常得られるものと比較可能な収率を以って、再フォーマットに対するこの必要性を回避する。

実施例３．モジュール式タンパク質発現系
実施例１及び２で生成及び特徴付けられたポリペプチド発現系は、任意の所望のタンパク質のモジュール式で柔軟なポリペプチド発現が、ファージディスプレイとの関連でタンパク質の再フォーマットに関して上述した最適化された発現系等のポリペプチド発現系の使用により直接的に達成されることができることを示す。したがって、本発現系は、単一の所望のポリペプチド産物の一部を各々コードする２つの核酸分子構成要素（ポリペプチドコード配列ＰＥＳ１_１及びＰＥＳ２）を含み、ここで、これらのタンパク質の分裂コード領域は、タンパク質コード核酸のサブクローニングを必要とせずに、プレｍＲＮＡトランススプライシングによりインビボで正確に一つに結合する。図１０で示されるように、第１の核酸分子は、ＰＥＳ１_１を有する発現カセットを含み、ＰＥＳ１_１構成要素の上流に真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ１）及び真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_１）、ならびにＰＥＳ１_１の下流に位置する５′スプライス部位（５′ｓｓ１_１）及びハイブリダイズ配列（ＨＳ１）も含む。補完的な第２の核酸分子は、真核生物プロモーター（Ｐ２_Ｅｕｋ）、ならびにＨＳ１（ＨＳ２）にハイブリダイズすることができるハイブリダイズ配列、及びＰＥＳ２構成要素の上流に３′スプライス部位（３′ｓｓ２）を含むであろう。加えて、第２の核酸分子は、ＰＥＳ２構成要素の下流にポリアデニル化部位（ｐＡ２）を含むであろう。よって、哺乳動物細胞において複写されるとき、１つが単独５′を有し、他方が単独３′を有する２つの生成されたプレｍＲＮＡ分子は、それらの相補的ハイブリダイズ配列（ＨＳ１及びＨＳ２）により共に方向付けられ、トランススプライシングを受けて、所望のタンパク質産物を後の翻訳及びコードすることができる単一の連続ｍＲＮＡを形成するであろう。

原核細胞中、ＰＥＳ１_１及び任意にＨＳ１領域によりコードされるポリペプチド産物の発現も望ましい場合、第１の核酸分子は、Ｐ１_Ｅｕｋ１とＰＥＳ１_１との間に位置付けられる切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_１）を更に含み得る。ｅＰＰＭ_１は、５′スプライス部位（５′ｓｓ１_２）、原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}）、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列、及び３′スプライス部位（３′ｓｓ１_１）を含み得、５′ｓｓ１_２−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}−ＰＳＳ１_１−３′ｓｓ１_１として、５′〜３′方向に互いに動作可能に連結される。ｅＰＰＭ_１は、原核細胞内で第１の核酸分子のコードされるポリペプチドの転写を駆動するであろう。一方、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）において、Ｐ１_Ｅｕｋ１は、第１の核酸分子のコードされるポリペプチドの転写の発現を駆動し、ｅＰＰＭ_１は、５′ｓｓ１_２及び３′ｓｓ１_１構成要素に隣接する衝突のために、シススプライシングによりプレｍＲＮＡ転写産物から除去されるであろう。

いくつかの場合、第２のポリペプチドを発現することが望ましい場合もある。したがって、モジュール式タンパク質発現系の第１の核酸分子は、第２の発現カセットを含むように設計され得る。図１１で示されるように、第２のタンパク質産物（ＰＥＳ１_２）をコードする第２の発現カセットは、第１の発現カセットと類似の方法で設計されるが、ＰＥＳ１_２配列の下流にポリアデニル化部位（ｐＡ１）を含有して、転写後の別個のプレｍＲＮＡ分子の生成を確実にするであろう。他の場合、第２の発現カセットは、ポリペプチド発現系の第２の核酸分子中に設計されることが可能である。

他の実施形態
前述の発明は、明確な理解を目的として例示及び実施例の方法で詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書で説明される全ての特許及び科学文献の開示は、参照することによりそれらの全体が明白に組み込まれる。

Claims (73)

1. 第１の核酸分子及び第２の核酸分子を含むポリペプチド発現系であって、
   （ａ）前記第１の核酸分子が、以下の構成要素：（ｉ）第１の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ１）、（ｉｉ）第１のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_１）、（ｉｉｉ）第１の５’スプライス部位（５’ｓｓ１_１）、及び（ｉｖ）ハイブリダイズ配列（ＨＳ１）を含む、第１の発現カセットを含み、前記構成要素が、Ｐ１_Ｅｕｋ１−ＰＥＳ１_１−５’ｓｓ１_１−ＨＳ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、
   （ｂ）前記第２の核酸分子が、以下の構成要素：（ｉ）真核生物プロモーター（Ｐ２_Ｅｕｋ）、（ｉｉ）ＨＳ１にハイブリダイズすることができるハイブリダイズ配列（ＨＳ２）、（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ２）、（ｉｖ）ポリペプチドコード配列（ＰＥＳ２）、及び（ｖ）ポリアデニル化部位（ｐＡ２）を含み、前記構成要素が、Ｐ２_Ｅｕｋ−ＨＳ２−３’ｓｓ２−ＰＥＳ２−ｐＡ２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される、前記ポリペプチド発現系。
2. 前記Ｐ１_Ｅｕｋ１が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項１に記載のポリペプチド発現系。
3. 前記Ｐ２_Ｅｕｋが、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターである、請求項１または２に記載のポリペプチド発現系。
4. 前記第１の発現カセットが、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含み、前記ＥＳＳ１_１が、前記Ｐ１_Ｅｕｋ１と前記ＰＥＳ１_１との間に位置付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
5. 前記ＥＳＳ１_１が、可変重鎖（ＶＨ）遺伝子に由来する、請求項４に記載のポリペプチド発現系。
6. 前記第１の発現カセットが、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_２）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}）、及び（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_１）を含む、切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_１）を更に含み、前記構成要素が、５’ｓｓ１_２−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}−３’ｓｓ１_１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、前記ｅＰＰＭ_１が、前記Ｐ１_Ｅｕｋ１と前記ＰＥＳ１_１との間に位置付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
7. 前記Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}が、ＰｈｏＡプロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｌａｃ、及びＴｐｈａｃプロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載のポリペプチド発現系。
8. 前記ｅＰＰＭ_１が、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含む、請求項６または７に記載のポリペプチド発現系。
9. 前記ＰＳＳ１_１が、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）遺伝子に由来する、請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
10. 前記ＰＳＳ１_１と前記３’ｓｓ１_１との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ１_１）を更に含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
11. 前記ＰＰＴ１_１が、ＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣの核酸配列（配列番号１）を含む、請求項１０に記載のポリペプチド発現系。
12. 前記ＰＥＳ１_１が、潜在性５’スプライス部位を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
13. 前記ＨＳ１が、コートタンパク質またはアダプタータンパク質の全てまたは一部をコードする遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
14. 前記コートタンパク質が、バクテリオファージＭ１３、ｆ１、またはｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及びｐＸからなる群から選択される、請求項１３に記載のポリペプチド発現系。
15. 前記コートタンパク質が、バクテリオファージＭ１３の前記ｐＩＩＩタンパク質である、請求項１４に記載のポリペプチド発現系。
16. 前記ｐＩＩＩ断片が、前記ｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基２６７〜４２１または前記ｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基２６２〜４１８を含む、請求項１５に記載のポリペプチド発現系。
17. 前記アダプタータンパク質が、ロイシンジッパーである、請求項１３に記載のポリペプチド発現系。
18. 前記ロイシンジッパーが、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のポリペプチド発現系。
19. 前記第１の核酸分子が、第２の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ２）、（ｉｉ）第２のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_２）、及び（ｉｉｉ）ポリアデニル化部位（ｐＡ１）を含む第２の発現カセットを更に含み、前記構成要素が、Ｐ１_Ｅｕｋ２−ＰＥＳ１_２−ｐＡ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
20. 前記Ｐ１_Ｅｕｋ２が、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターである、請求項１９に記載のポリペプチド発現系。
21. 前記第２の発現カセットが、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_２）をコードする核酸配列を更に含む、請求項１９または２０に記載のポリペプチド発現系。
22. 前記ＥＳＳ１_２が、マウス結合免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）遺伝子に由来する、請求項２１に記載のポリペプチド発現系。
23. 前記ＥＳＳ１_２が、ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮの核酸配列（配列番号６）を含み、配列中、Ｎが、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
24. 前記第２の発現カセットが、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_３）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}）、及び（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_２）を含む、切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_２）を更に含み、前記構成要素が、５’ｓｓ１_３−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}−３’ｓｓ１_２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、前記ｅＰＰＭ_２が、前記Ｐ１_Ｅｕｋ２と前記ＰＥＳ１_２との間に位置付けられる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
25. 前記Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}が、ＰｈｏＡプロモーター、Ｔａｃプロモーター、及びＬａｃプロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載のポリペプチド発現系。
26. 前記ｅＰＰＭ_２が、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_２）をコードする核酸配列を更に含む、請求項２４または２５に記載のポリペプチド発現系。
27. 前記ＰＳＳ１_２が、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）遺伝子に由来する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
28. 前記ＰＳＳ１_２と前記３’ｓｓ１_２との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ１_２）を更に含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
29. 前記ＰＰＴ１_２が、ＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣの核酸配列（配列番号１）を含む、請求項２８に記載のポリペプチド発現系。
30. 前記第２の発現カセットが、前記第１の発現カセットに対して５’に位置付けられる、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
31. 前記５’ｓｓ１_１と前記ＨＳ１との間に位置付けられるイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）（ＩＳＥ１）を更に含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
32. 前記ＩＳＥ１が、３つまたはそれ以上の連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む、請求項３１に記載のポリペプチド発現系。
33. 前記ＩＳＥ１が、９つの連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む、請求項３２に記載のポリペプチド発現系。
34. 前記ＨＳ２と前記３’ｓｓ２との間に位置付けられるポリピリミジン領域（ＰＰＴ２）を更に含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
35. 前記ＰＰＴ２が、ＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣの核酸配列（配列番号７）を含む、請求項３４に記載のポリペプチド発現系。
36. 前記ＨＳ２と前記３’ｓｓ２との間に位置付けられるＩＳＥ（ＩＳＥ２）を更に含む、請求項３５に記載のポリペプチド発現系。
37. 前記ＩＳＥ２が、３つまたはそれ以上の連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む、請求項３６に記載のポリペプチド発現系。
38. 前記ＩＳＥ２が、９つの連続グアニン残基を含むＧ−ｒｕｎを含む、請求項３７に記載のポリペプチド発現系。
39. 前記５’ｓｓ１_１が、ＧＴＡＡＧＡの核酸配列（配列番号８）を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
40. 真核生物プロモーターによる発現が、哺乳動物細胞内で起こる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
41. 前記哺乳動物細胞が、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、またはＮＳＯ細胞である、請求項４０に記載のポリペプチド発現系。
42. 前記哺乳動物細胞が、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞である、請求項４１に記載のポリペプチド発現系。
43. 原核生物プロモーターによる発現が、細菌細胞内で起こる、請求項６〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
44. 前記細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項４３に記載のポリペプチド発現系。
45. 前記ＰＥＳ１_１が、抗体の全てまたは一部をコードする、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
46. 前記ＰＥＳ１_１が、ＶＨドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項４５に記載のポリペプチド発現系。
47. 前記ポリペプチドが、ＣＨ１ドメインを更に含む、請求項４６に記載のポリペプチド発現系。
48. 前記ＰＥＳ２が、抗体の全てまたは一部をコードする、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
49. 前記ＰＥＳ２が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項４８に記載のポリペプチド発現系。
50. 前記ＰＥＳ１_２が、抗体の全てまたは一部をコードする、請求項１９〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド発現系。
51. 前記ＰＥＳ１_２が、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項５０に記載のポリペプチド発現系。
52. 以下の構成要素：
    （ａ）第１の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ１）と、
    （ｂ）以下の構成要素：
    （ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_２）、
    （ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}）、及び
    （ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_１）
    を含む第１の切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_１）であって、前記ｅＰＰＭ_１の前記構成要素が５’ｓｓ１_２−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}−３’ｓｓ１_１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される、第１の切除可能原核生物プロモーターモジュールと、
    （ｃ）第１のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_１）と、
    （ｄ）第１の５’スプライス部位（５’ｓｓ１_１）と、
    （ｅ）有用ペプチドコード配列（ＵＰＥＳ）と、
    を含む、第１の発現カセットを含み、前記第１の発現カセットの前記構成要素が、Ｐ１_Ｅｕｋ１−ｅＰＰＭ_１−ＰＥＳ１_１−５’ｓｓ１_１−ＵＰＥＳとして５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される、前記核酸分子。
53. 前記第１の発現カセットが、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含み、前記ＥＳＳ１_１が、前記Ｐ１_Ｅｕｋ１と前記ｅＰＰＭ_１との間に位置付けられる、請求項５２に記載の核酸分子。
54. 前記ｅＰＰＭ_１が、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_１）をコードする第１の核酸配列を更に含み、前記ＰＳＳ１_１が、前記Ｐ１_{Ｐｒｏｋ１}と前記３’ｓｓ１_１との間に位置付けられる、請求項５２または５３に記載の核酸分子。
55. 第２の真核生物プロモーター（Ｐ１_Ｅｕｋ２）、（ｉｉ）第２のポリペプチドコード配列（ＰＥＳ１_２）、及び（ｉｉｉ）ポリアデニル化部位（ｐＡ１）を含む、第２の発現カセットを更に含み、前記構成要素が、Ｐ１_Ｅｕｋ２−ＰＥＳ１_２−ｐＡ１として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結される、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の核酸分子。
56. 前記第２の発現カセットが、真核生物シグナル配列（ＥＳＳ１_２）をコードする第２の核酸配列を更に含み、前記ＥＳＳ１_２が、前記Ｐ１_Ｅｕｋ２と前記ＰＥＳ１_２との間に位置付けられる、請求項５５に記載の核酸分子。
57. 前記第２の発現カセットが、以下の構成要素：（ｉ）５’スプライス部位（５’ｓｓ１_３）、（ｉｉ）原核生物プロモーター（Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}）、及び（ｉｉｉ）３’スプライス部位（３’ｓｓ１_２）を含む、切除可能原核生物プロモーターモジュール（ｅＰＰＭ_２）を更に含み、前記構成要素が、５’ｓｓ１_３−Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}−３’ｓｓ１_２として５’〜３’方向に互いに作動可能に連結され、前記ｅＰＰＭ_２が、前記Ｐ１_Ｅｕｋ２と前記ＰＥＳ１_２との間に位置付けられる、請求項５５または５６に記載の核酸分子。
58. 前記ｅＰＰＭ_２が、原核生物シグナル配列（ＰＳＳ１_２）をコードする核酸配列を更に含み、前記ＰＳＳ１_２が、前記Ｐ１_{Ｐｒｏｋ２}と前記３’ｓｓ１_２との間に位置付けられる、請求項５７に記載の核酸分子。
59. 前記ＵＰＥＳが、タグ、ラベル、コートタンパク質、及びアダプタータンパク質からなる群から選択される有用ペプチドの全てまたは一部をコードする、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の核酸分子。
60. 前記コートタンパク質が、バクテリオファージＭ１３、ｆ１、またはｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及びｐＸからなる群から選択される、請求項５９に記載の核酸分子。
61. 前記コートタンパク質が、バクテリオファージＭ１３の前記ｐＩＩＩである、請求項６０に記載の核酸分子。
62. 請求項５２〜６１のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含むベクター。
63. 第１のベクター及び第２のベクターを含むベクターセットであって、前記第１及び第２のベクターが、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド発現系の、それぞれ、前記第１及び第２の核酸分子を含む、ベクターセット。
64. 請求項６２に記載の前記ベクターまたは請求項６３に記載の前記ベクターセットを含む、宿主細胞。
65. 前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項６４に記載の宿主細胞。
66. 前記原核細胞が、細菌細胞である、請求項６５に記載の宿主細胞。
67. 前記細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項６６に記載の宿主細胞。
68. 前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項６４に記載の宿主細胞。
69. 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６８に記載の宿主細胞。
70. 前記哺乳動物細胞が、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、またはＮＳＯ細胞である、請求項６９に記載の宿主細胞。
71. 前記哺乳動物細胞が、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞である、請求項７０に記載の宿主細胞。
72. 培養培地中で、請求項６２に記載の前記ベクターまたは請求項６３に記載の前記ベクターセットを含む宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの生成方法。
73. 前記方法が、前記宿主細胞または前記培養培地から前記ポリペプチドを回復することを更に含む、請求項７２に記載の方法。

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