JP2017515893A - Hdl治療マーカー - Google Patents
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Abstract
本出願は、HDLを模倣する、またはHDL発現レベルを上昇させる治療剤に関するコンパニオン診断アッセイに関する。本出願はまた、家族性低アルファリポタンパク血症の処置方法にも関する。
Description
1.関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下で、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2014年5月2日に提出された米国特許仮出願第61/988,095号明細書に対する優先権を主張する。
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下で、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2014年5月2日に提出された米国特許仮出願第61/988,095号明細書に対する優先権を主張する。
2.配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、配列表を含む。2015年4月22日に作成された前記ASCIIのコピーは、名称がCRN−016WO_SL.txtであり、サイズは57,065バイトである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、配列表を含む。2015年4月22日に作成された前記ASCIIのコピーは、名称がCRN−016WO_SL.txtであり、サイズは57,065バイトである。
3.背景
3.1.概要
循環中のコレステロールは、血液中の脂質を輸送する、脂質とタンパク質を組成とする血漿中リポタンパク質複合体粒子によって運ばれる。4つの主要なクラスのリポタンパク質粒子、すなわちカイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)が、血漿中を循環し、脂質輸送系に関係している。カイロミクロンは、腸管脂質吸収能を有する短命の産物を構成する。VLDLおよび、特にLDLは、肝臓からのコレステロール(肝臓で合成されるか、または食事源から得られる)を、動脈壁を含む肝臓外組織に送達することを司る。これに対し、HDLは、コレステロール逆輸送(RCT)、特に、肝臓外組織から、コレステロールが貯蔵され、異化され、排泄またはリサイクルされる肝臓へのコレステロール脂質の除去を媒介する。HDLはまた、炎症においても有益な役割を果たし、酸化した脂質およびインターロイキンを輸送し、これにより血管壁の炎症を低減させ得る。
3.1.概要
循環中のコレステロールは、血液中の脂質を輸送する、脂質とタンパク質を組成とする血漿中リポタンパク質複合体粒子によって運ばれる。4つの主要なクラスのリポタンパク質粒子、すなわちカイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)が、血漿中を循環し、脂質輸送系に関係している。カイロミクロンは、腸管脂質吸収能を有する短命の産物を構成する。VLDLおよび、特にLDLは、肝臓からのコレステロール(肝臓で合成されるか、または食事源から得られる)を、動脈壁を含む肝臓外組織に送達することを司る。これに対し、HDLは、コレステロール逆輸送(RCT)、特に、肝臓外組織から、コレステロールが貯蔵され、異化され、排泄またはリサイクルされる肝臓へのコレステロール脂質の除去を媒介する。HDLはまた、炎症においても有益な役割を果たし、酸化した脂質およびインターロイキンを輸送し、これにより血管壁の炎症を低減させ得る。
リポタンパク質粒子は、コレステロール(通常、コレステリルエステルの形態)とトリグリセリドとで構成される疎水性のコアを有する。コアは、リン脂質、非エステル化コレステロール、およびアポリポタンパク質を含む表面外皮によって取り囲まれている。アポリポタンパク質は、脂質輸送を媒介し、一部は、脂質代謝に関係する酵素と相互作用し得る。ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoA−V、ApoB、ApoC−I、ApoC−II、ApoC−III、ApoD、ApoE、ApoJ、およびApoHを含む、少なくとも10種のアポリポタンパク質が同定されている。リポタンパク質に会合した、LCAT(レシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ)、CETP(コレステリルエステル転送タンパク質)、PLTP(リン脂質転送タンパク質)およびPON(パラオキソナーゼ)などの他のタンパク質も見出されている。
冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、およびアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患は、血清中コレステロールレベルの上昇に強く関係している。例えば、アテローム性動脈硬化症は、動脈壁内のコレステロール(およびコレステロールエステル)の蓄積によって特徴付けられる進行の遅い疾患である。マクロファージにおけるコレステロールおよびコレステロールエステルの蓄積により、アテローム動脈硬化性プラークの顕著な特徴である泡沫細胞が形成される。アテローム動脈硬化性病変に沈着した脂質は血漿中のLDLに主に由来する、という理論を支持する説得力のある証拠があり、これによりLDLは、「悪玉」コレステロールとして一般的に知られるようになった。これに対し、血清中HDLレベルは、冠動脈性心疾患と反比例する。実際に、高い血清中HDLレベルは、負の危険因子であると考えられる。高い血漿中HDLレベルは、冠動脈疾患に対して保護的であるのみならず、実際にアテローム動脈硬化性プラークの退縮を誘導し得るという仮説が立てられている(例えば、Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94;Dansky and Fisher, 1999, Circulation 100:1762-63;Tangirala et al., 1999, Circulation 100(17):1816-22;Fan et al., 1999, Atherosclerosis 147(1):139-45;Deckert et al., 1999, Circulation 100(11):1230-35;Boisvert et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19(3):525-30;Benoit et al., 1999, Circulation 99(1):105-10;Holvoet et al., 1998, J. Clin. Invest. 102(2):379-85;Duverger et al., 1996, Circulation 94(4):713-17;Miyazaki et al., 1995, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 15(11):1882-88;Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113(2):237-46;Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35(12):2263-67;Plump et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91(20):9607-11;Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94(2):899-903;She et al, 1992, Chin. Med. J. (Engl). 105(5):369-73;Rubin et al., 1991, Nature 353(6341):265-67;She et al., 1990, Ann. NY Acad. Sci. 598:339-51;Ran, 1989, Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih (also translated as: Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi) 18(4):257-61;Quezado et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther. 272(2):604-11;Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(12):1424-29;Kopfler et al., 1994, Circulation; 90(3):1319-27;Miller et al., 1985, Nature 314(6006):109-11;Ha et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta 1125(2):223-29;Beitz et al., 1992, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 47(2): 149-52を参照されたい)。その結果、HDLは、「善玉」コレステロールとして一般的に知られるようになった(例えば、Zhang, et al., 2003 Circulation 108:661-663を参照されたい)。
HDLの「保護的な」役割は、多数の研究において確認されている(例えば、Miller et al., 1977, Lancet 1(8019):965-68;Whayne et al., 1981, Atherosclerosis 39:411-19)。これらの研究において、LDLレベルの上昇は、心血管リスクの増加に関連するように思われるが、高いHDLレベルは、心血管の保護を与えるように思われる。In vivoでの試験により、HDLの保護的な役割はさらに証明されており、HDLをウサギに注入すると、コレステロール誘発性の動脈病変の発生を妨害し得ること(Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60:455-61)、および/またはその退縮を誘導し得ること(Badimon et al, 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-41)が示されている。新規標的治療(Treating to New Target)(TNT)研究の事後分析において、HDL−コレステロールは、スタチンで処置した患者において、そのLDL−コレステロールが70mg/dl未満である患者でさえも主要心血管事象の予測因子であった。
最近の臨床試験において、ナイアシンおよび2つのCETP阻害剤(トルセトラピブ(Pfizer)およびダルセトラピブ(Roche))は、これらの試験の一部が何らかの交絡因子を有し得るものの、長期間の処置で冠動脈事象の発生率を低減することができなかった(Boden et al, 2011, N Engl J Med 365:2255-2267;HPS2-THRIVE Collaborative Group, 2013, Eur. Heart J. 34:1279-1291;Barter et al, 2007, N Engl J Med 357:2109-2122;Schwartz et al, 2012, N. Engl. J. Med. 367:2089-2099)。2つのメンデル遺伝学的研究は、HDL−コレステロールと心血管疾患のリスクとの関連に疑問を呈した(Voight et al, Lancet DOI:10.1016/S0140-6736(12)60312-2, published online May 17, 2012;Holmes et al, Eur Heart J doi:10.1093/eurheartj/eht571, published online January 27, 2014)。これらの研究は、HDLコレステロール(HDL−c)の上昇よりむしろ、機能的なHDL粒子の数と脂質逆輸送の増強が、心血管事象を予防するための重要な要因であるという考え方をさらに強調している(Barter et al, 2007, N Engl J Med 357:2109-22;Group et al, 2010, N Engl J Med 362:1563-74;Nissen et al, 2007, The New England journal of medicine 356:1304-16)。実際に、患者数が5,000人を超えるMESA臨床試験において、CHDの発生および心血管事象に相関する最善の因子は、HDL分画のコレステロール含有量(すなわち、HDL−c)よりむしろHDL粒子数であった(Mackey et al, 2012, Journal of the American College of Cardiology 60:508-16;van der Steeg et al, 2008, Journal of the American College of Cardiology 51:634-42)。強力なスタチン治療の状況において、HDL粒子数は、化学的に測定されたHDL−コレステロールまたはApoA−Iより残留リスクのより良好なマーカーであり得る(Mora et al. 2013, Circulation DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.113.002671)。
3.2.脂質逆輸送、HDL、およびアポリポタンパク質A−I
HDL粒子の保護機能は、コレステロール逆輸送(RCT)経路としても知られる脂質逆輸送(RLT)経路におけるその役割によって説明することができる。RLT(Tall, 1998, Eur Heart J 19:A31-5)経路は、主に4つの基本的なステップで動脈からのコレステロールの除去および体から排泄するために肝臓へのその輸送の要因である。
HDL粒子の保護機能は、コレステロール逆輸送(RCT)経路としても知られる脂質逆輸送(RLT)経路におけるその役割によって説明することができる。RLT(Tall, 1998, Eur Heart J 19:A31-5)経路は、主に4つの基本的なステップで動脈からのコレステロールの除去および体から排泄するために肝臓へのその輸送の要因である。
第1のステップは、「コレステロール除去」と呼ばれるプロセスにおける新生HDL粒子による動脈からのコレステロールの除去である。コレステロールは、小胞体輸送およびシグナル伝達の調節において重要である構造ドメインを維持する膜構成成分である。ほとんどの細胞において、コレステロールは異化されない。このため、細胞のステロール流出の調節は、細胞のステロール恒常性において極めて重要な役割を果たす。細胞ステロールは、非調節性の受動的な拡散機構、ならびにABCA1およびABCG1トランスポーターなどの受容体によって媒介される能動的な調節性のエネルギー依存的プロセスの両方によって、細胞外ステロールアクセプターへと流出することができる。
RCTにおける重要な酵素であるLCATは、腸管および肝臓によって産生され、主にHDL分画と会合して血漿中を循環する。LCATは、細胞由来のコレステロールをコレステリルエステルに変換し、これは、除去の運命にあるHDLにおいて隔離されている(Jonas 2000, Biochim. Biophys. Acta 1529(1-3):245-56を参照されたい)。コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)およびリン脂質輸送タンパク質(PLTP)は、循環中のHDL集団のさらなるリモデリングに寄与する。CETPは、LCATによって作製されたコレステリルエステルを他のリポタンパク質、特にVLDLおよびLDLなどのApoBを含むリポタンパク質に移動させる。PLTPは、HDLにレシチンを供給する。HDLトリグリセリドは、細胞外肝トリグリセリドリパーゼによって異化され、リポタンパク質コレステロールは、いくつかの機構によって肝臓から除去される。
HDL粒子の機能的特徴は、ApoA−I、およびApoA−IIなどのその主要なアポリポタンパク質成分によって主に決定される。微量のApoC−I、ApoC−II、ApoC−III、ApoD、ApoA−IV、ApoE、およびApoJもまた、HDLに会合して観察されている。HDLは、代謝RCTカスケードまたは経路の際のリモデリングの状況に応じて、広く多様な異なるサイズおよび上記構成成分の異なる混合物で存在する。
各HDL粒子は通常、ApoA−Iの少なくとも1つの分子、通常2〜4個の分子を含む。HDL粒子はまた、Gerd Assmann教授(例えば、von Eckardstein et al., 1994, Curr Opin Lipidol. 5(6):404-16を参照されたい)によって記述されているように、コレステロール流出の要因であることが知られているApoE(ガンマ−LpE粒子)のみを含み得る。ApoA−Iは、肝臓および小腸によってプレプロアポリポタンパク質A−Iとして合成され、プロアポリポタンパク質A−I(プロApoA−I)として分泌され、迅速に切断されて、アミノ酸243個の1つのポリペプチド鎖であるApoA−Iの血漿型を生成する(Brewer et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:623-30)。実験的に血流に直接注射されたプレプロApoA−Iもまた、ApoA−Iの血漿型へと切断される(Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85;Segrest et al., 2000, Curr. Opin. Lipidol. 11(2) :105-15;Segrest et al., 1999, J. Biol. Chem. 274(45):31755-58)。
ApoA−Iは、しばしばプロリンであるリンカー部分によって隔てられた、6〜8個の異なるアミノ酸22個のアルファ−ヘリックスまたは機能的反復を含む。反復単位は、両親媒性のヘリックス状の立体配座で存在し(Segrest et al., 1974, FEBS Lett. 38:247-53)、ApoA−Iの主要な生物活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)活性化を与える。
ApoA−Iは、脂質と3つのタイプの安定な複合体、すなわちプレ−ベータ−1HDLと呼ばれる脂質の少ない小さい複合体、プレ−ベータ−2HDLと呼ばれる極性の脂質(リン脂質およびコレステロール)を含む平坦なディスク状の粒子、および球状または成熟HDL(HDL3およびHDL2)とも呼ばれる極性と無極性の脂質の両方を含む球状の粒子を形成する。循環中の集団におけるほとんどのHDLは、ApoA−IとApoA−IIの両方を含む(「AI/AII−HDL分画」)。しかし、ApoA−Iのみを含むHDLの分画(「AI−HDL分画」)は、RCTにおいてより有効であるように思われる。ある疫学的研究は、ApoA−I−HDL分画が抗アテローム形成性であるという仮説を支持する(Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-07;Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307)。
HDL粒子は、異なる大きさ、脂質組成およびアポリポタンパク質組成を有する粒子のいくつかの集団で形成される。HDL粒子は、その水和密度、アポリポタンパク質組成および電荷特徴を含む、その特性に従って分離することができる。例えば、プレ−ベータ−HDL分画は、成熟アルファ−HDLより低い表面電荷によって特徴付けられる。この電荷の差のために、プレ−ベータ−HDLおよび成熟アルファ−HDLは、アガロースゲルにおいて異なる電気泳動移動度を有する(David et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12):8959-8965)。
プレ−ベータ−HDLと成熟アルファ−HDLの代謝もまた異なる。プレ−ベータ−HDLは、2つの代謝運命を有し、血漿から除去されて腎臓で異化されるか、または中等度の大きさのHDLにリモデリングされて、肝臓によって選択的に分解される(Lee et al., 2004, J. Lipid Res. 45(4)716-728)。
細胞表面からのコレステロール移動(すなわち、コレステロール流出)の機構は不明であるが、脂質の少ない複合体であるプレ−ベータ−1HDLが、末梢組織から転送されたコレステロールのRCTに関係する好ましいアクセプターであると考えられている(Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-82;Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1709;Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-97;およびKawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-28;Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-25を参照されたい)。細胞表面からのコレステロール動員のこのプロセスの際に、プレ−ベータ−1HDLは、プレ−ベータ−2HDLへと急速に変換される。PLTPは、プレ−ベータ−2HDLディスク形成率を増加させ得るが、データは、RCTにおけるPLTPの役割が欠如していることを示している。LCATは、ディスク状、小さい(プレ−ベータ)および球状の(すなわち成熟)HDLに選択的に反応して、レシチンまたは他のリン脂質の2−アシル基を、コレステロールの遊離のヒドロキシル残基に転移させ、コレステリルエステル(HDLにおいて保持される)およびリゾレシチンを生成する。LCAT反応は、活性化因子としてApoA−Iを必要とし、すなわち、ApoA−Iは、LCATの天然の補因子である。HDLにおいて隔離されたコレステロールがそのエステルに変換されることにより、細胞へのコレステロールの再流入が防止され、最終結果は、コレステロールが細胞の勾配により細胞から除去され、HDLが維持されることである。
ApoA−I HDL分画(すなわち、ApoA−Iを含みApoA−IIを含まない)の成熟HDL粒子におけるコレステリルエステルは、肝臓によって除去されて、ApoA−IとApoA−IIの両方を含むHDL(AI/AII−HDL分画)に由来するコレステリルエステルよりも有効に胆汁へと処理される。これは部分的に、肝細胞膜にApoA−I−HDLがより有効に結合することによるものであり得る。HDL受容体の存在は仮説が立てられており、スキャベンジャー受容体、クラスB、I型(SR−BI)がHDL受容体として同定されている(Acton et al., 1996, Science 271:518-20;Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-98)。SR−BIは、ステロイド産生組織(例えば、副腎)および肝臓において最も豊富に発現されている(Landschulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-95;Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-49)。HDL受容体の総説に関しては、Broutin et al., 1988, Anal. Biol. Chem. 46:16-23を参照されたい。
ATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)による最初の脂質化は、血漿中のHDL形成およびプレ−ベータ−HDL粒子がコレステロール流出をもたらす能力にとって極めて重要であるように思われる(Lee and Parks, 2005, Curr. Opin. Lipidol. 16(1):19-25)。これらの著者らによれば、この最初の脂質化によって、プレ−ベータ−HDLは、コレステロールアクセプターとしてより効率的に機能することができ、ApoA−Iが既存の血漿中HDL粒子に急速に会合するのを防止して、それによってコレステロール流出のためにプレ−ベータ−HDL粒子をより一層利用することができる。
ABCA1欠損症は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症の基礎となる原因の1つである。家族性原発性低アルファリポタンパク血症は、ABCA1などのHDL合成/成熟の要因である遺伝子の1つの遺伝的欠損によって引き起こされ、高密度リポタンパク質(HDL)粒子の非常に少ない数に関連し、同様にアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)の非常に低い血漿中濃度にも反映される。疾患はまた一般的に、低いHDL−コレステロール(HDL−C)または若年性心血管疾患の家族歴陽性にも関連している。
ホモ接合型ABCA1欠損は、タンジール病とも呼ばれ、重度の血漿中HDL、アポリポタンパク質A−I(ApoA−I)の欠損または非存在、および全身の組織におけるコレステリルエステルの蓄積によって特徴付けられる(Puntoni et al, 2012)。タンジール病を有する対象は、大きい黄色−オレンジ色の扁桃および/または神経障害を呈する。他の臨床特徴には、肝腫大、脾腫大、若年性心筋梗塞または卒中、血小板減少症、貧血、および角膜混濁が挙げられる。
最近、第2のATP結合カセットトランスポーターG1(ABCG1)が、細胞内コレステロール恒常性を媒介しているとして記述された。ABCG1の発現は、主に球状でコレステロールを含有する中等度から非常に大きいHDL粒子、ならびに大きいディスク状HDL粒子との相互作用を通してコレステロール流出を増強する。より大きい粒子は、ABCG1からのアクセプターとしてより小さいHDL粒子と同様に有効である。
ATP結合カセットトランスポーターABCA1およびABCG1は、肝臓X受容体転写因子によって増加し(Costet et al., 2000, J Biol Chem 275:28240-5;Kennedy et al., 2001, J Biol Chem 276:39438-47)、この転写因子はABCA1およびABCG1トランスポーターの両方によるコレステロール流出の調節において肝要な役割を果たす。In vivoで、肝臓X受容体は、コレステロール含有細胞における特異的オキシステロールによって活性化され、ABCA1およびABCG1は、マクロファージにおける肝臓X受容体の重要な標的遺伝子である(Janowski et al., 1996, Nature 383:728-31)。ABCA1は、コレステロール欠損およびリン脂質枯渇ApoA−IおよびapoE複合体へのコレステロールの流出を促進するが、ABCG1は、HDL粒子への流出を促進する(Duong et al., 2006, Journal of lipid research 47:832-43;Mulya et al., 2007, Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 27:1828-36;Wang et al., 2004, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101:9774-9)。ABCA1およびABCG1トランスポーターの発現の増加は、細胞質膜の内葉から外葉へのコレステロールの再分布に関連しており、コレステロール含有泡沫細胞からHDL粒子へのコレステロール流出を促進する(Pagler et al., 2011, Circulation research 108:194-200)。マクロファージのコレステロール流出の媒介にABCA1およびABCG1が協調して関与することは、動物試験から証明されている。マウスにおけるABCA1単独の欠損によって、アテローム性動脈硬化症の中等度の増加が起こり、ABCG1の欠損は効果を有しない。しかし、共に欠損すると、病変の発生が顕著に加速された(Yvan-Charvet et al., 2007, The Journal of clinical investigation 117:3900-8)。二重ノックアウトマクロファージは、HDLおよびApoA−Iへのコレステロール流出の顕著な欠如を示し、リポ多糖類で処置した場合の炎症応答を増加させた(Yvan-Charvet et al., 2008, Circulation 118:1837-47)。
コレステロール恒常性はまた、最近、生理的プロセスに関係する遺伝子の転写後調節剤である小さい内因性の非タンパク質コードRNAであるマイクロRNA(miRNA)によっても調べられている(Rayner et al., 2010, Science (New York, N.Y.) 328:1570-3;Najafi-Shoushtari et al., 2010, Science (New York, N.Y.) 328:1566-9;Marquart et al., 2010, PNAS)。MiR−33は、ステロール調節エレメント結合因子−2をコードする遺伝子内に存在するイントロンmiRNAであり、ABCA1およびABCG1の両方の肝臓での発現を阻害し、HDL−C濃度(Yvan-Charvet et al., 2008, Circulation 118:1837-47;Marquart et al., 2010, PNAS)ならびにマクロファージにおけるABCA1発現を低減させ、このようにして、コレステロール流出を減少させる(Yvan-Charvet et al., 2008, Circulation 118:1837-47)。オリゴヌクレオチドによるMiR−33の拮抗により、マウスモデルにおいてHDL−Cが上昇し、アテローム性動脈硬化症が低減した(Rayner et al., 2011, The Journal of Clinical Investigation 121:2921-31)。
ABCA1ならびにABCG1は、細胞のコレステロール含有量によって高度に調節される。細胞の脂質過剰負荷によって、オキシステロールが形成され、これが核の肝臓X受容体(LXR)を活性化して、ABCA1およびABCG1の転写を誘導し、したがってコレステロール流出を誘導する(Jakobsson et al., 2012, Trends in pharmacological sciences 33:394-404)。このように、コレステロール流出は、HDL粒子の細胞外濃度および組成、ならびにABCトランスポーターの活性の両方によって決定される。
興味深いことに、ABCA1の発現は、予めロードされたHDL粒子が細胞培地に存在することによってダウンレギュレートされたように思われる(Langmann et al., 1999, Biochemical and biophysical research communications 257:29-33)。
細胞コレステロール恒常性の重要な調節因子としてのコレステロール流出は、造血幹細胞の増殖および動員などの多くの細胞機能に対して重要な調節ステップを発揮する(Tall et al., 2012, Arterioscler Thromb Vase Biol 32:2547-52)。
ATP結合カセットトランスポーターG4(ABCG4)は、HDLへのコレステロール流出を媒介し、それによって巨核球の増殖が起こる(Murphy et al., 2013, Nature medicine 19:586-94)。
コレステロール流出は、単球およびマクロファージに対する炎症応答(Westerterp et al., 2013, Circulation research 112:1456-65)、リンパ球の増殖(Sorci-Thomas et al., 2012, Arterioscler Thromb Vase Biol 32:2561-5)、内皮酸化窒素シンターゼ(eNOS)による酸化窒素(NO)の産生(Terasaka et al, 2010, Arterioscler Thromb Vase Biol 30:2219-25)、および膵臓のβ細胞からのインスリン産生(Kruit et al, 2012, Diabetes 61:659-64)を調節する。
CETPもまた、RCTにおいて役割を果たし得る。CETP活性またはそのアクセプターであるVLDLおよびLDLの変化は、HDL集団の「リモデリング」において役割を果たす。例えば、CETPの非存在下では、HDLは、除去されない肥大した粒子となる(RCTおよびHDLの総説に関しては、Fielding and Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-28;Barrans et al, 1996, Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85;Hirano et al, 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(6):1053-59を参照されたい)。
HDLはまた、他の脂質および無極性分子の逆輸送、ならびに解毒において、すなわち細胞、臓器、および組織から異化および排泄のための肝臓への脂質の輸送において役割を果たす。そのような脂質には、スフィンゴミエリン(SM)、酸化脂質、およびリゾホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、Robins and Fasulo(1997, J. Clin. Invest. 99:380-84)は、HDLが、肝臓による植物ステロールの胆汁分泌への輸送を刺激することを示している。
HDLの主成分であるApoA−Iは、in vitroでSMと会合することができる。ApoA−Iをin vitroでウシ脳SM(BBSM)によって再構成すると、最大再構成速度は、BBSMの相転移温度に近似する温度である28℃で起こる(Swaney, 1983, J. Biol. Chem. 258(2), 1254-59)。BBSM:ApoA−Iの重量比7.5:1またはそれ未満では、粒子1個あたり3分子のApoA−Iを含み、BBSM:ApoA−Iのモル比360:1を有する1つの再構成された均一なHDL粒子が形成される。電子顕微鏡では、リン脂質/タンパク質の比率が上昇したホスファチジルコリンとApoA−Iとの組み換えによって得られたものと類似のディスク状の複合体のように見える。しかし、BBSM:ApoA−Iの重量比15:1では、より高いリン脂質:タンパク質モル比(535:1)を有するより大きい直径のディスク状複合体が形成する。これらの複合体は、ホスファチジルコリンによって形成されたApoA−I複合体より、有意に大きく、より安定で、変性に対してより抵抗性である。
スフィンゴミエリン(SM)は、初期コレステロールアクセプター(プレ−ベータ−HDLおよびガンマ−遊走ApoEを含むリポタンパク質)において上昇し、これらの粒子のコレステロール流出促進能をSMが増強し得ることを示唆している(Dass and Jessup, 2000, J. Pharm. Pharmacol. 52:731-61;Huang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-38;Fielding and Fielding 1995, J. Lipid Res. 36:211-28)。
3.3.HDLおよびApoA−Iの保護機構
HDLの保護機構に関する研究は、HDLの主成分であるアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)に集中している。高い血漿中ApoA−Iレベルは、冠動脈病変の非存在または低減に関連する(Maciejko et al., 1983, N. Engl. J. Med. 309:385-89;Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84)。
HDLの保護機構に関する研究は、HDLの主成分であるアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)に集中している。高い血漿中ApoA−Iレベルは、冠動脈病変の非存在または低減に関連する(Maciejko et al., 1983, N. Engl. J. Med. 309:385-89;Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84)。
実験動物にApoA−IまたはHDLを注入すると、有意な生化学変化を発揮すると共に、アテローム動脈硬化性病変の程度および重症度を低減させる。Maciejko and Mao(1982, Arteriosclerosis 2:407a)による最初の報告後、Badimonら(1989, Lab. Invest. 60:455-61;1989, J. Clin. Invest. 85:1234-41)は、HDL(d=1.063〜1.325g/ml)を注入することによってコレステロールを与えたウサギにおいて、アテローム動脈硬化性病変の程度(45%の低減)、およびそのコレステロールエステル含有量(58.5%の低減)を有意に低減させることができることを見出した。彼らはまた、HDLの注入によって、確立された病変の50%に近い退縮が起こることも見出した。(Esper et al. 1987, Arteriosclerosis 7:523a)は、HDLの注入が、初期動脈病変を発症する遺伝性の高コレステロール血症を有するWatanabeウサギの血漿中リポタンパク質組成を顕著に変化させることができることを示している。これらのウサギにおいて、HDL注入は、保護的HDLとアテローム形成性LDLとの間の比率を倍より大きくすることができる。最近、組換え型ヒトアポリポタンパク質A−I改変プレ−βHDLであるCER−001を数回注入すると、家族性高コレステロール血症の前臨床モデルであるLDL受容体ノックアウトマウスにおいて、血管の炎症を低減して、食事誘発性のアテローム性動脈硬化症の退縮を促進することができた(HDL Tardy et al., Atherosclerosis 232 (2014) 110-118)。
HDLが動物モデルにおいて動脈疾患を予防する可能性は、ApoA−Iがin vitroで線維素溶解活性を発揮することができるという知見によってさらに強調されている(Saku et al., 1985, Thromb. Res. 39:1-8)。Ronneberger(1987, Xth Int. Congr. Pharmacol., Sydney, 990)は、ApoA−Iがビーグル犬およびカニクイザル(Cynomologous)において線維素溶解を増加させることができることを証明している。類似の活性は、in vitroでヒト血漿に関して認めることができる。Ronnebergerは、ApoA−I処置動物において脂質沈着および動脈プラーク形成の低減を確認することができた。
In vitro試験は、ApoA−Iとレシチンの複合体が、培養動脈平滑筋からの遊離のコレステロールの流出を促進できることを示している(Stein et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta, 380:106-18)。この機構によって、HDLは、これらの細胞の増殖もまた低減させることができる(Yoshida et al., 1984, Exp. Mol Pathol. 41:258-66)。
ApoA−IまたはApoA−I模倣ペプチドを含むHDLの注入治療はまた、ABCA1トランスポーターにより血漿中HDLレベルを調節し、心血管疾患の処置において効能が得られることが示されている(例えば、Brewer et al., 2004, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:1755-1760を参照されたい)。
アルギニン残基がシステインに置換されている、ApoA−Iの天然に存在する2つのヒト多型が単離されている。アポリポタンパク質A−IMilano(ApoA−IM)において、この置換は、173位の残基で起こるが、アポリポタンパク質A−IParis(ApoA−IP)では、この置換は、151位の残基で起こる(Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900;Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13;Bruckert et al, 1997, Atherosclerosis 128:121-28;Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22;Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85)。ロイシンが144位でアルギニンに置換されている、ApoA−Iのなおさらなる天然に存在するヒト多型が単離されている。この多型は、アポリポタンパク質A−I Zaragoza(ApoA−IZ)と呼ばれ、重度の低アルファリポタンパク血症に関連し、高密度リポタンパク質(HDL)のコレステロール逆輸送に及ぼす効果の増強に関連する(Recalde et al, 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623;Fiddyment et al, 2011, Protein Expr. Purif. 80(1):110-116)。
ApoA−IMまたはApoA−IPのいずれかのジスルフィド結合ホモ二量体を含む再構成されたHDL粒子は、そのジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)乳剤の除去能およびコレステロール流出の促進能に関して、野生型ApoA−Iを含む再構成されたHDL粒子と類似である(Calabresi et al, 1997b, Biochemistry 36:12428-33;Franceschini et al, 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19:1257-62;Daum et al, 1999, J. Mol. Med. 77:614-22)。いずれの変異においても、ヘテロ接合個体は、減少したHDLレベルを有するが、逆説的に言うと、アテローム性動脈硬化症のリスクは低減している(Franceschini et al, 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900;Weisgraber et al, 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13;Bruckert et al, 1997, Atherosclerosis 128:121-28)。いずれかの変種を含む再構成されたHDL粒子は、野生型ApoA−Iを含む再構成されたHDL粒子と比較した場合に効率は減少しているが、LCAT活性化を行うことができる(Calabresi et al, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:345-49;Daum et al, 1999, J. Mol. Med. 77:614-22)。
ApoA−IM変異は、常染色体優性形質として伝搬され、家族内の8世代の保因者が同定されている(Gualandri et al., 1984, Am. J. Hum. Genet. 37:1083-97)。ApoA−IM保因個体の状態は、HDL−コレステロールレベルの顕著な低減によって特徴付けられる。これにもかかわらず、保因個体は、動脈疾患のいかなるリスクの増加も明白に示していない。実際に、家系図の記録を調べることによって、これらの対象は、アテローム性動脈硬化症から「保護され」得るように思われる(Sirtori et al., 2001, Circulation, 103: 1949-1954;Roma et al., 1993, J. Clin. Invest. 91(4):1445-520)。
変異の保因者におけるApoA−IMの可能性がある保護効果の機構は、1つのアルファ−ヘリックスが失われて疎水性残基の露出が増加した変異体ApoA−IMの構造の修飾に関連するように思われる(Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35)。多数のアルファ−ヘリックスの堅固な構造が失われることによって分子の可撓性が増加し、正常なApoA−Iと比較して、脂質とより容易に会合する。その上、リポタンパク質複合体は、変性に対してより感受性が高く、このように、変異体では、脂質の輸送もまた改善されることを示唆している。
Bielickiら(1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(9):1637-43)は、ApoA−IMが野生型ApoA−Iと比較して、限定的な膜コレステロールの動員能を有することを証明している。加えて、ApoA−IMと膜脂質との会合によって形成された新生HDLは、野生型ApoA−Iによって形成されたより大きい9および11nmの複合体ではなくて主に7.4nmの粒子であった。これらの知見は、ApoA−I一次配列におけるArg173→Cys173置換が、細胞のコレステロール動員および新生HDLアセンブリの正常なプロセスを妨害したことを示している。変異は、細胞からのコレステロールの除去効率の減少に明らかに関連する。それゆえ、その抗アテローム形成特性は、RCTとは無関係であり得る。同様に、その抗アテローム形成特性は、HDLの成熟を小さい粒子に限定するその能力に起因し得る。
Arg173→Cys173置換による最も顕著な構造の変化は、ApoA−IMの二量体形成である(Bielicki et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(9):1637-43)。ApoA−IMは、自身とホモ二量体を、およびApoA−IIとヘテロ二量体を形成することができる。アポリポタンパク質の混合物を含む血液分画の研究は、循環中の二量体および複合体の存在が、アポリポタンパク質の消失半減期の増加の要因であり得ることを示している。そのような消失半減期の増加は、変異の保因者の臨床試験において観察されている(Gregg et al., 1988, NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone S G)。他の研究は、ApoA−IM二量体(ApoA−IM/ApoA−IM)がin vitroでHDL粒子の相互変換の阻害因子として作用することを示している(Franceschini et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:12224-31)。
3.4.脂質異常症および関連障害の現行の処置
脂質異常障害は、血清中コレステロールおよびトリグリセリドレベルの上昇、ならびに血清HDL:LDL比の低下に関連する疾患であり、高脂血症、特に高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患が含まれる。動脈の不全によって引き起こされる、一過性の虚血発作または間欠性爬行などのアテローム性動脈硬化症に関連する症候群もまた含まれる。脂質異常障害に関連する上昇した血清中コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるために、多数の処置が現在利用可能である。しかし、それぞれの処置は、効能、副作用、および適任である患者集団に関してそれぞれが欠点および制限を有する。いくつかの脂質異常障害は、タンジール病、ABCA1欠損、ApoA−I欠損、LCAT欠損、または魚眼病などの、しかしこれらに限定されるわけではないHDL合成、成熟、または消失の要因である遺伝子の変異によるHDL欠損に関連している。これらの障害は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症(FPHA)の項に再度分類することができる。
脂質異常障害は、血清中コレステロールおよびトリグリセリドレベルの上昇、ならびに血清HDL:LDL比の低下に関連する疾患であり、高脂血症、特に高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患が含まれる。動脈の不全によって引き起こされる、一過性の虚血発作または間欠性爬行などのアテローム性動脈硬化症に関連する症候群もまた含まれる。脂質異常障害に関連する上昇した血清中コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるために、多数の処置が現在利用可能である。しかし、それぞれの処置は、効能、副作用、および適任である患者集団に関してそれぞれが欠点および制限を有する。いくつかの脂質異常障害は、タンジール病、ABCA1欠損、ApoA−I欠損、LCAT欠損、または魚眼病などの、しかしこれらに限定されるわけではないHDL合成、成熟、または消失の要因である遺伝子の変異によるHDL欠損に関連している。これらの障害は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症(FPHA)の項に再度分類することができる。
胆汁酸結合レジンは、小腸から肝臓への胆汁酸のリサイクルを中断するクラスの薬剤であり、例えばコレスチラミン(Questran Light(登録商標)、Bristol-Myers Squibb)、コレスチポール塩酸塩(Colestid(登録商標)、The Upjohn Company)、およびコレセベラム塩酸塩(Welchol(登録商標)、Daiichi-Sankyo Company)である。経口で服用すると、これらの正荷電レジンは、腸管で負荷電胆汁酸に結合する。レジンは、腸管から吸収されることができないことから、レジンは自身が運ぶ胆汁酸と共に排泄される。しかし、そのようなレジンを使用しても、せいぜい血清中コレステロールレベルを約20%低下させるに過ぎず、便秘および特定のビタミン欠乏を含む消化管副作用に関連する。その上、レジンは、他の薬物に結合することから、他の経口薬は、レジンの摂取前少なくとも1時間か、または摂取後4〜6時間に服用しなければならず、このため、心疾患の患者の薬物レジメンを複雑にする。
スタチンは、コレステロール生合成経路に関係する重要な酵素であるHMGCoAレダクターゼを阻害することによってコレステロール合成を遮断するコレステロール低下剤である。スタチン、例えばロバスタチン(Mevacor(登録商標))、シンバスタチン(Zocor(登録商標))、プラバスタチン(Pravachol(登録商標))、フルバスタチン(Lescol(登録商標))、ピタバスタチン(Livalo(登録商標))、およびアトルバスタチン(Lipitor(登録商標))は、時に、胆汁酸結合レジンと併用して使用される。スタチンは、血清中コレステロールおよび血清中LDLレベルを有意に低減させ、冠動脈アテローム性動脈硬化症の進行を遅らせる。しかし、血清中HDLコレステロールレベルの増加は中等度に過ぎない。LDL低下効果の機構は、VLDL濃度の低減およびLDL受容体の細胞発現の誘導の両方を必要とし、それによってLDLの産生の低減および/または異化の増加が起こり得る。肝臓および腎臓の機能障害を含む副作用は、これらの薬剤の使用に関連する(The Physicians Desk Reference, 56th Ed., 2002, Medical Economics)。
ナイアシン(ニコチン酸)は、栄養補助食品および抗高脂血症剤として使用される水溶性ビタミンB−複合体である。ナイアシンは、VLDLの産生を減少させ、LDLを低下させるために有効である。いくつかの場合において、ナイアシンは、胆汁酸結合レジンと併用して使用される。ナイアシンは、適切な用量で使用すると、HDLを増加させることができるが、その有用性は、そのような高用量で使用する場合の重篤な副作用によって制限されている。Niaspan(登録商標)は、純粋なナイアシンより副作用が少ない徐放性ナイアシンの剤形である。ナイアシン/ロバスタチン(Nicostatin(登録商標))は、ナイアシンとロバスタチンの両方を含有する製剤であり、各薬剤の有益性を組み合わせている。ARBITER6−HALTS(Arterial Biology for the Investigation of the Treatment Effects of Reducing Cholesterol 6 - HDL and LDL Treatment Strategies in Atherosclerosis)試験は、ナイアシンが脂質プロファイルを都合よく改変するのみならず、頸動脈および冠動脈におけるプラーク形成を低減させることも示した(Villines et al., 2010, J Am Coll Cardiol 55:2721-6)。残念なことに、米国国立衛生研究所の支援を受けた大規模アウトカム試験であるAIM−HIGH(Atherothrombosis Intervention in Metabolic Syndrome with Low HDL/High Triglycerides)は、3000人を超える患者の募集後まもなく、無益であるとして中止された(Investigators et al., 2011, N Engl J Med 365:2255-67)。HPS−THRIVE(Heart Protection Study 2 - Treatment of HDL to Reduce the Incidence of Vascular Events)試験は、心血管リスクの高い患者25673人においてシンバスタチンに加えてラロピプラント(顔面紅潮の発生率を低減させるためのプロスタグランジンD2受容体拮抗剤)と併用した徐放性ナイアシンの効果を調べたが、主要血管事象に及ぼすナイアシン−ラロピプラント併用の有意な有益性は示されなかった(Group, 2013, Eur Heart J 34:1279-91)。
新規クラスのHDL−コレステロール増加薬は、CETP阻害剤である。HDLからVLDLまたはLDLへのコレステロールエステルの転送を低減させることによって、CETP阻害剤は、血漿中HDL−コレステロールレベルの30〜140%(参照値の)の顕著で一貫した増加を生じる。スタチンに関連して、LDL−コレステロールは、不変のままであるか(ダルセトラピブ)または約40%(トルセトラピブ、アナセトラピブ、またはエバセトラピブ)さらに減少させる。ILLUMINATE(Investigation of Lipid Level Management to Understand its Impact in Atherosclerotic Events)試験において、患者15067人に、トルセトラピブをアトルバスタチン80mgに追加すると、アトルバスタチン単独(Barter et al., 2007, N Engl J Med 357:2109-22)と比較して、HDL−コレステロールが80%増加して、LDL−コレステロールが25%減少したにもかかわらず、死亡率および有病率の増加に関連した(Barter et al., 2007, N Engl J Med 357:2109-22)。他の2つの試験、Bモード頸動脈超音波を使用したRADIANCE2(Rating Atherosclerotic Disease Change by Imaging with a New Cholesteryl-Ester-Transfer Protein Inhibitor)試験(Bots et al., 2007, Lancet 370:153-60)、ならびに冠動脈血管内超音波を使用したILLUSTRATE(Investigation of Lipid Level Management Using Coronary Ultrasound to Assess Reduction of Atherosclerosis by CETP Inhibition and HDL Elevation)試験(Nissen et al., 2007, N Engl J Med 356:1304-16)では、トルセトラピブは、脂質プロファイルを有利に変化させたにもかかわらず、頸動脈内膜中膜複合体厚を低減させず、冠動脈プラーク体積を減少させなかった。これらの好ましくない転帰は、副腎からのアルドステロン分泌の増加におそらく関連する血圧の上昇などのオフターゲット作用のためである可能性がある(Hu et al., 2009, Endocrinology 150:2211-9;Forrest et al., 2008, British journal of pharmacology 154:1465-73)。トルセトラピブのオフターゲット作用を欠如するように思われる、アナセトラピブ、ダルセトラピブ、およびエバセトラピブなどの他のCETP阻害剤が開発されている。これらの化合物は、アルドステロン分泌に影響を及ぼさない。DEFINE(Determining the Efficacy and Tolerability of CETP Inhibition with Anacetrapib)試験において、アナセトラピブは、アトルバスタチンと比較して、HDL−コレステロールを約140%増加させ、LDL−コレステロールを40%低下させた(Cannon et al., 2010, The New England journal of medicine 363:2406-15)。dal−OUTCOMES試験の中間分析において、ACS患者では、プラセボと比較してダルセトラピブの有益性は示されなかったが、HDL−コレステロールは約30%増加して、ApoA−Iは18%増加して、LDL−コレステロールは変化しなかった(Schwartz et al., 2012, The New England journal of medicine 121105113014000)。効能の欠如は、スタチンによるABCA1のダウンレギュレーションに関連すると仮定された(Niesor et al. poster 167 presented at the American College of Cardiology, 62nd annual scientific sessions March 9-11, 2013, San Francisco, CA, USA)。
フィブレートは、高コレステロール血症にも関連し得る様々な型の高脂血症(すなわち、上昇した血清中トリグリセリド)を処置するために使用される脂質低下薬のクラスである。フィブレートは、VLDL分画を低減させるように思われ、HDLを控えめに増加させるように思われるが、血清中コレステロールに及ぼすこれらの薬物の効果は多様である。米国において、クロフィブレート(Atromid-S(登録商標))、フェノフィブレート(Tricor(登録商標))、およびベザフィブレート(Bezalip(登録商標))などのフィブレートは、抗脂質異常薬としての使用が承認されているが、高コレステロール血症剤としての承認は受けていない。例えば、クロフィブレートは、VLDL分画を低減させることによって血清中トリグリセリドを低下させるように作用する(未知の機構によって)抗脂質異常剤である。血清中コレステロールは、ある患者亜集団において低減され得るものの、薬物に対する生化学応答は多様であり、患者が都合の良い結果を得ると必ずしも予測することはできない。Atromid-S(登録商標)は、冠動脈性心疾患の予防に関して有効であることが示されていない。化学的および薬理学的に近縁の薬剤であるゲムフィブロジル(Lopid(登録商標))は、血清中トリグリセリドおよびVLDLコレステロールを中等度に減少させ、HDLコレステロール、すなわちHDL2およびHDL3小分画、ならびにApoA−IおよびA−IIの両方(すなわち、AI/AMT−HDL分画)を中等度に増加させる脂質調節剤である。しかし、特に、異なる患者集団では、脂質の応答は様々である。その上、冠動脈性心疾患の予防は、既存の冠動脈性心疾患の既往または症状を有しない40〜55歳の男性患者において観察されたが、これらの知見を他の患者集団(例えば、女性、高齢者、およびより若い男性)にどの程度外挿できるかは不明である。実際に、確立された冠動脈性心疾患を有する患者において効能は観察されなかった。悪性腫瘍(特に消化管がん)、胆嚢疾患、および非冠動脈死亡率の発生率の増加などの毒性を含む重篤な副作用が、フィブレートの使用に関連する。
閉経後の女性における中等度の高コレステロール血症では、経口エストロゲン補充療法が検討され得る。しかし、HDLの増加は、トリグリセリドの増加を伴い得る。エストロゲン処置は、当然、特異的患者集団(閉経後女性)に限定され、悪性新生物の誘導、胆嚢疾患、血栓塞栓症、肝細胞線腫、血圧上昇、耐糖能障害、および高カルシウム血症を含む重篤な副作用に関連する。
高脂血症の処置にとって有用な他の薬剤には、エゼチミブ(Zetia(登録商標)、Merck)が挙げられ、これはコレステロール吸収を遮断または阻害する。しかし、エゼチミブの阻害剤は、一定の毒性を示すことが示されている。
HDLならびにリン脂質と複合体を形成したApoA−Iの組換え型は、無極性または両親媒性分子、例えばコレステロールおよび誘導体(オキシステロール、酸化ステロール、植物ステロール等)、コレステロールエステル、リン脂質および誘導体(酸化したリン脂質)、トリグリセリド、酸化産物、およびリポ多糖類(LPS)のシンク/スキャベンジャーとして作用することができる(例えば、Casas et al., 1995, J. Surg. Res. Nov 59(5):544-52を参照されたい)。HDLはまた、TNF−アルファおよび他のリンフォカインのスキャベンジャーとしても作用することができる。HDLはまた、ヒト血清パラオキソナーゼ、例えばPON−1、−2、−3の担体としても作用することができる。HDLに会合するエステラーゼであるパラオキソナーゼは、酸化に対して細胞成分を保護するために重要である。酸化ストレスの際に起こるLDLの酸化は、アテローム性動脈硬化症の発症に直接関連するように思われる(Aviram, 2000, Free Radic. Res. 33 Suppl:S85-97)。パラオキソナーゼは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患に対する感受性において役割を果たすように思われる(Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86)。ヒト血清パラオキソナーゼ(PON−1)は、高密度リポタンパク質(HDL)に結合する。その活性は、アテローム性動脈硬化症と反比例する。PON−1は、有機リン酸エステルを加水分解して、HDLおよび低密度リポタンパク質(LDL)の酸化を阻害することによってアテローム性動脈硬化症に対して保護し得る(Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86)。実験的研究は、この保護が、酸化されたリポタンパク質中の特異的脂質過酸化物をPON−1が加水分解する能力に関連することを示唆している。PON−1活性を保存または増強する介入は、アテローム性動脈硬化症および冠動脈性心疾患の発症を遅らせるために役立ち得る。
HDLは、抗血栓剤およびフィブリノーゲン低下剤として、および出血性ショックにおける薬剤としての役割をさらに有する(Cockerill et al.、国際公開第01/13939号パンフレット、2001年3月1日公表)。HDLおよびApoA−Iは、特に敗血症によって産生されたリポ多糖類のApoA−Iを含む脂質粒子への交換を促進して、リポ多糖類を機能的に中和させることが示されている(Wright et al.、国際公開第9534289号パンフレット、1995年12月21日に公表;Wright et al.、米国特許第5,928,624号明細書、1999年7月27日に公表;Wright et al.、米国特許第5,932,536号明細書、1999年8月3日に発行)。
最近、フィブレート、ナイアシン、またはCETP阻害剤などのHDL−コレステロールを増加させる薬剤によって、スタチン治療単独によって達成される効果を超えて冠動脈リスクを低減する難しさを異なる試験が記述している(上記を参照されたい)。ヒトHDL代謝のいくつかの先天性異常ならびにHDL代謝が変化した遺伝的マウスモデルにおいて、HDL−Cの変化はそれぞれ、心血管リスクまたはアテローム動脈硬化性プラークの大きさの変化に関連しなかった(Besler et al., 2012, EMBO molecular medicine 4:251-68;Voight et al., 2012, Lancet 6736:1-9;Frikke-Schmidt et al., JAMA, June 4, 2008- Vol 299, No. 21;Holmes et al., Eur Heart J first published online January 27, 2014 doi:10.1093/eurheartj/eht571)。このため、HDLの発病に及ぼす役割および治療標的としての適切性は疑問である。これによって、今後の臨床試験では、単純なHDL−コレステロールレベル(バイオマーカーとして)よりむしろHDLの機能性が、心血管疾患におけるHDLの有益性を評価するために肝要であり得るという結論に至った。HDLの機能性を調べると、HDLの代謝は高度に調節されているように思われ、それゆえHDLレベルの強い増加(例としてCETP阻害剤治療で達成される増加)などの極端な変化によりダウンレギュレーションが起こり得て、それによって心血管疾患に対する影響が控えめとなるという仮説を立てることができる。この仮説は、再構成された異なるHDLを使用したが用量反応関係が観察されなかった2つの臨床試験の結果によって強調される。その上、いずれの臨床試験においても、最大用量では低用量よりプラークの退縮に対してより弱い効果を示す傾向があることが記述された(Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-300;Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-82)。最近の臨床試験においてCETP阻害剤であるダルセトラピブの有益な効果がなかったことをさらに分析すると、いくつかのスタチンが、マクロファージのABCA1発現に対して特異的ダウンレギュレーション効果を有し、このことがACS患者のアテローム動脈硬化性プラークの退縮におけるHDLの有益性を損ない得るという結論に達した。要するに、それらの知見により、HDLレベルの直接の増加またはHDLの性質(プレ−ベータHDL対球状のHDL)またはHDLの粒子数が、心血管疾患の治療が成功するために鍵となり得るという結論が得られる。
健康な対象のHDLは、血管系、特に内皮細胞に対して何らかの保護的効果を発揮することができる(Besler et al., 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708;Yuhanna et al., 2001, Nature medicine 7:853-7;Kuvin et al., 2002, American heart journal 144:165-72)。健康な対象のHDLは、培養ヒト大動脈内皮細胞からのNO放出を刺激して、eNOSの発現を増加させる(Besler et al, 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708;Yuhanna et al., 2001, Nature medicine 7:853-7;Kuvin et al., 2002, American heart journal 144:165-72)。HDLは、血管細胞接着分子(VCAM1)などの接着分子の発現を抑制して、このように、単球の接着を阻害する(Nicholls et al, 2005, Circulation 111 :1543-50;Ansell et al., 2003, Circulation 108:2751-6)。HDLはまた、上記のように抗血栓効果も発揮する。マウス頸動脈モデルにおいて、HDLは、血管損傷後の内皮の修復を増強する(Besler et al, 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708)。健康な対象から得られたHDLは、in vitroで、およびin vivoのapo−E欠損マウスにおいて内皮細胞のアポトーシスを低減させた(Riwanto et al., 2013, Circulation 127:891-904)。そのような効果は、ABCA1に変異を有する患者においても観察される(Attie et al., 2001, J Lipid Res 42:1717-26)。再構成されたHDL粒子(モル比1:150のApoA−I/ホスファチジルコリン)の注入は、アセチルコリンを動脈内に注入して、上腕動脈のプレチスモグラフィーまたは高解像度超音波による前腕の血流の測定および血流依存性血管拡張の測定によりそれぞれ観察されるように、内皮機能の障害を改善する(Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-402)。二重盲検無作為化プラセボ対照臨床試験(dal−VESSEL)において冠動脈性心疾患(CHD)を有するまたはそのリスクのある患者において、CETP阻害剤(ダルセトラピブ)は、NO依存的内皮機能、血圧、または炎症および酸化ストレスのマーカーに影響を及ぼすことなく、CETP活性を低減させて、HDL−Cレベルを増加させた(Luscher et al., 2012, European heart journal 33:857-65)。1つの仮説は、健康な対象のHDLとは異なり、糖尿病、CAD、ACS、または慢性腎機能障害を有する患者のHDLは、それらがもはや培養内皮細胞からのNO放出を刺激しないことから、血管作用において機能障害性であるということである(Besler et al., 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708;Sorrentino et al., 2010, Circulation 121:110-22;Speer et al., 2013, Immunity 1-15)。
ApoA−I、ApoA−IM、ApoA−IPおよび他の変種、ならびに再構成されたHDLの治療的使用は、組み換えによって発現されたタンパク質の総産生収量が低いことおよび培養時にタンパク質分解が起こることを考慮すると、治療的投与に必要なアポリポタンパク質が大量であることおよびタンパク質産生に費用がかかることによって現在制限されている(例えば、Mallory et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(9):4241-4247;Schmidt et al., 1997, Protein Expression & Purification 10:226-236を参照されたい)。初期の臨床試験から、用量範囲は、心血管疾患の処置に関して1回の注入あたりタンパク質1.5〜4gの間であることが示唆されている。完全な処置に必要な注入回数は不明である(例えば、Eriksson et al., 1999, Circulation 100(6):594-98;Carlson, 1995, Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 5:85-91;Nanjee et al, 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20(9):2148-55;Nanjee et al, 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19(4):979-89;Nanjee et al, 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(9):1203-14を参照されたい)。
組換え型ヒトApoA−Iは、異種宿主において発現されているが、成熟タンパク質の収量は、特に精製法と組み合わせると、さらに収量を低減させて不純な産物が得られることから、大規模治療応用にとって不十分である。
Weinberg et al., 1988, J. Lipid Research 29:819-824は、アポリポタンパク質A−I、A−II、およびA−IVの分離、ならびに逆相高速液体クロマトグラフィーによってヒト血漿から精製されたそのアイソフォームを記述している。
国際公開第2009/025754号パンフレットは、ヒト血漿からのアルファ−1−アンチトリプシンおよびApoA−Iのタンパク質の分離および精製を記述している。
Hunter et al., 2009, Biotechnol. Prog. 25(2):446-453は、大腸菌(E. coli)において組換え発現されるApoA−IMilano変種の大規模精製を記述している。
Caparon et al., 2009, Biotechnol. And Bioeng. 105(2):239-249は、精製アポリポタンパク質産物における2つの宿主細胞タンパク質のレベルを低減させるために、これらのタンパク質を欠失させるように遺伝子改変された大腸菌(E. coli)宿主からのApoA−IMilanoの発現および精製を記述している。
米国特許第6,090,921号明細書は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用したApoA−IおよびApoEを含有するヒト血漿分画からのApoA−Iまたはアポリポタンパク質E(ApoE)の精製を記述している。
Brewer et al., 1986, Meth. Enzymol. 128:223-246は、クロマトグラフィー技術を使用して、ヒト血液からのアポリポタンパク質の単離および特徴付けを記述している。
Weisweiler et al, 1987, Clinica Chimica Acta 169:249-254は、タンパク質の高速液体クロマトグラフィーを使用したヒトHDLからのApoA−IおよびApoA−IIの単離を記述している。
deSilva et al., 1990, J. Biol. Chem. 265(24):14292-14297は、イムノアフィニティクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーによるアポリポタンパク質Jの精製を記述している。
リポタンパク質およびリポタンパク質複合体は、臨床での使用のために現在開発中であり、異なるリポタンパク質に基づく薬剤を使用する臨床試験がリポタンパク質治療の実現可能性を確立している(Tardif, 2010, Journal of Clinical Lipidology 4:399-404)。1つの試験は、自己脱脂HDLを評価した(Waksman et al., 2010, J Am. Coll. Cardiol. 55:2727-2735)。別の試験は、組換え型ApoA−IMとパルミトイル−オレオイル−PC(POPC)の複合体であるETC−216を評価した(Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300)。CSL−111は、ダイズのホスファチジルコリン(SBPC)と複合体を形成した、血漿から精製した再構成されたヒトApoA−Iである(Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-1682)。現在の探索中の薬物は、アテローム動脈硬化性プラークの低減において効能を示しているが、その効果は、トランスアミナーゼの増加またはApoA−I抗体の形成などの二次効果を伴った(Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Vase. Throm. Biol. 19:979-89;Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300;Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-1402;Nieuwdorp et al., 2004, Diabetologia 51:1081-4;Drew et al., 2009, Circulation 119, 2103-11;Shaw et al., 2008, Circ. Res. 103:1084-91;Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682;Waksman, 2008, Circulation 118:S 371;Cho、米国特許第7,273,849号明細書B2、2007年9月25日発行)。例えば、ERASE臨床試験(Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682)は、CSL−111の2つの用量、すなわち40mg/kgと80mg/kgのApoA−Iを利用した。80mg/kg用量群は、肝毒性(重篤なトランスアミナーゼ上昇によって示される)のために中止しなければならなかった。40mg/kg用量群においても、数人の患者はトランスアミナーゼの上昇を経験している。毒性はおそらく、再構成されたHDLの製造のために使用される洗浄剤である残留コール酸塩の存在のためである(Wright et al.、米国特許出願公開第2013/0190226号明細書によって強調される)。
それゆえ、肝毒性およびトリグリセリド、LDL−トリグリセリド、もしくはVLDLトリグリセリドの増加などの副作用を最小限にしながら、血清中コレステロールを低下させるために、血清中HDLレベルを増加させるために、脂質異常症ならびに/または脂質異常に関連する疾患、状態、および/もしくは障害を予防および/または処置するためにより有効であるコレステロール低下薬の投与レジメンが必要であり、ならびにそのような投与レジメンを同定して、そのような処置を受ける対象をモニターする方法が必要である。
4.概要
オーダーメイド医療のこの時代に、薬物の科学とゲノミクスとを組み合わせる薬理ゲノミクスにより、処置の選択、開始、用量の最適化、または回避の情報をよりよく知らせるために、治療産物と共に使用することが意図される診断産物である、いわゆる「コンパニオン診断」の使用および問い合わせが促進されている。本開示は、部分的に、ABCA1およびABCG1トランスポーターならびに脂肪酸生合成を調節する転写因子であるSREBP1などの、コレステロール流出および脂質逆輸送の成分をダウンレギュレートする作用機序による、HDL治療剤(以下の6.1章に定義される)、特にHDL模倣剤、脱脂もしくは脂質の少ないHDL、または投与後にHDLレベルを増加させる他の化合物での対象の処置に応答した逆U字型の用量反応曲線の発見に関連している。この作用機序の発見により、HDL治療剤での処置をモニターするためにおよび/または特定の対象または対象の亜群もしくは他の群に関するHDL治療剤の有効量を同定するために有用なコンパニオン診断アッセイの設計が可能となる。このように、本開示は、とりわけ、HDL治療剤での処置を受けている対象と共に使用することができるHDLマーカーコンパニオン診断アッセイに関する。いくつかの実施形態において、本開示は、HDL治療剤での処置を受けている対象が治療的有効量または最適な用量を受けているか否かを決定する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、HDL治療剤での処置を受けている対象が、安全性を最適にしながら治療的有効量または最適な用量を受けているか否かを決定する方法に関する。
オーダーメイド医療のこの時代に、薬物の科学とゲノミクスとを組み合わせる薬理ゲノミクスにより、処置の選択、開始、用量の最適化、または回避の情報をよりよく知らせるために、治療産物と共に使用することが意図される診断産物である、いわゆる「コンパニオン診断」の使用および問い合わせが促進されている。本開示は、部分的に、ABCA1およびABCG1トランスポーターならびに脂肪酸生合成を調節する転写因子であるSREBP1などの、コレステロール流出および脂質逆輸送の成分をダウンレギュレートする作用機序による、HDL治療剤(以下の6.1章に定義される)、特にHDL模倣剤、脱脂もしくは脂質の少ないHDL、または投与後にHDLレベルを増加させる他の化合物での対象の処置に応答した逆U字型の用量反応曲線の発見に関連している。この作用機序の発見により、HDL治療剤での処置をモニターするためにおよび/または特定の対象または対象の亜群もしくは他の群に関するHDL治療剤の有効量を同定するために有用なコンパニオン診断アッセイの設計が可能となる。このように、本開示は、とりわけ、HDL治療剤での処置を受けている対象と共に使用することができるHDLマーカーコンパニオン診断アッセイに関する。いくつかの実施形態において、本開示は、HDL治療剤での処置を受けている対象が治療的有効量または最適な用量を受けているか否かを決定する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、HDL治療剤での処置を受けている対象が、安全性を最適にしながら治療的有効量または最適な用量を受けているか否かを決定する方法に関する。
対象が、ある状態(以下の6.1章に定義される)に関してHDL治療剤で処置される、またはある状態を有する対象を処置するためにHDL治療剤の投与スケジュールを同定もしくは最適化する、本明細書において記述される方法を使用することができる。
同様に、HDL治療剤での処置に対象が応答する可能性を予測する方法も、本明細書において提供される。
ある態様において、本開示は、ある状態を有する対象をHDL治療剤で処置する、ある状態を処置するためにHDL治療剤の好適な用量を同定する、ある状態を有する対象におけるコレステロールを動員する、または対象におけるHDL治療剤の効能をモニターする方法に関する。方法は典型的に、対象にHDL治療剤を投与する(例えば、投与レジメンに従って1回または複数回)ことと、個体の試験試料における少なくとも1つ、いくつかの実施形態において、2つまたは3つまたはそれよりも多くのHDLマーカーの遺伝子発現の変化をモニターすることとを含む。対象自身のベースライン、対象の前回の測定、および/または個体集団における1つもしくは複数のHDLマーカーの測定から得られた対照と比較して試験試料におけるHDLマーカーのいかなる変化もあり得る。個体集団は、任意の適切な集団、例えば健康な個体、ある状態を有する個体、遺伝的にマッチさせた個体等であり得る。測定後、HDL治療剤が、治療効能が減弱される程度までコレステロール流出経路の成分をダウンレギュレートすれば、用量、投与回数、またはその両方を調節することができる。いくつかの実施形態において、対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを変化させないまたは増加させない用量が同定される。
いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象または対象の集団から第1の試験試料を得るステップと、(b)試験試料における1つまたは複数のHDLマーカー(以下の6.1章に定義される)の発現レベルを測定するステップと、(c)対象または対象の集団にHDL治療剤のある用量(または一連の用量)を投与するステップと、(d)対象または対象の集団から第2の試験試料を得るステップと、(e)第2の試験試料における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、第1の試料は、HDL治療剤での処置の前に得られる。他の実施形態において、第1の試料は、対象または対象の集団をステップ(c)の用量とは異なるHDL治療剤の用量で処置した後に得られる。
他の実施形態において、方法は、(a)対象または対象の集団にHDL治療剤のある用量を投与するステップと、(b)対象または対象の集団から試験試料を得るステップ、と(c)試験試料における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、発現レベルがカットオフ量より上または下であるかを決定するステップとを含む。任意選択で、好適な用量が同定されるまで、HDL治療剤の1つまたは複数の追加の用量でステップ(a)〜(c)を繰り返す。追加の用量は、HDL治療剤のより高い/より低い用量、より多い/より少ない投与回数、またはより速い/より遅い注入時間を含み得る。
試験試料は、好ましくは、末梢血単核細胞、または循環中の単球もしくはマクロファージの試料である。同様に、リンパ単核細胞または循環中の単球もしくはマクロファージの試料でもあり得る。試料は、例えば、無処置の対象もしくは対象の集団から、またはHDL治療剤の投与後の、例えば、投与の2、4、6、8、10、12、16、20、もしくは24時間後の対象もしくは対象の集団から得ることができる。様々な実施形態において、試料は、投与の2〜10、2〜12、4〜6、4〜8、4〜24、4〜16、6〜8、または6〜10時間後に得られる。対象は、単剤治療として、または例えばアトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、およびプラバスタチンなどの1つまたは複数の脂質調節薬との併用治療レジメンの一部としてHDL治療剤で処置することができる。いくつかの実施形態において、好適な用量の同定は、健康な個体において行われ、他の実施形態において、ある状態を有する個体の集団において行われる。様々な実施形態において、好適な用量は、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを、対象のベースライン量および/または集団の平均値と比較して20〜80%、30%〜70%、40%〜60%、または50%低減させる用量である。他の実施形態において、好適な用量は、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルをわずか50%低減させる用量であり、いくつかの実施形態において、対象のベースライン量または集団の平均値と比較してわずか40%、わずか30%、わずか20%、またはわずか10%低減させる用量である。なお他の実施形態において、用量は、対象のベースライン量または集団の平均値と比較して1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを全く低減させない用量である。
なおもう一つの実施形態において、本明細書において、本開示のコンパニオン診断アッセイにおける使用のためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、(a)少なくとも1つのHDL治療剤と、(b)HDLマーカーの発現を定量するために有用な少なくとも1つの診断試薬(例えば、核酸アッセイの場合にはHDLマーカーの検出のためのプライマーおよび/またはプローブ、ならびにタンパク質アッセイの場合には少なくとも1つの抗HDLマーカー抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル))とを含む。別の実施形態において、HDLマーカーは、生物試料(例として、血液またはリンパ)から細胞を分離するために使用されるセルソーターまたはFACS機器の助けを借りて決定される。
同様に、家族性低アルファリポタンパク血症、例えばABCA1欠損症を有する対象をHDL治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。好ましくは、治療は、2つの相で、すなわち初回のより強い「誘導」相とその後のより弱い「維持」相で行われる。任意選択で、治療は、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールに従って行われる。
同様に、任意選択で、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールを使用して、LCAT欠損症(ホモ接合またはヘテロ接合体)を有する対象をHDL治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。
同様に、任意選択で、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールを使用してApoA−I欠損症(ホモ接合またはヘテロ接合体)を有する対象をHDL治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。
同様に、任意選択で、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールを使用して、低HDLレベル(男性においてHDL−コレステロールが40mg/dl未満、または女性においてHDL−コレステロールが50mg/dl未満)を有する対象をHDL治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。
ある実施形態において、本開示は、対象におけるコレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)(i)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減する場合、第1の用量より低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップ、または(ii)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減されない場合、対象を前記HDL治療剤の第1の用量で処置するステップとを含む。
ある実施形態において、本開示は、対象におけるHDL治療剤の効能をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象を第1の投与スケジュールに従ってHDL治療剤で処置するステップと、(b)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の投与スケジュールの効果を評価するステップと、(c)(i)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、対象を第2の投与スケジュールに従ってHDL治療剤で処置するステップであって、第2の投与スケジュールが、HDL治療剤のより低い用量を投与すること、HDL治療剤を対象により長い期間にわたって注入すること、およびHDL治療剤を対象により少ない回数で投与することのうちの1つまたは複数を含む、ステップ、(ii)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、対象を第2の投与スケジュールに従ってHDL治療剤で処置するステップであって、第2の投与スケジュールが、HDL治療剤のより高い用量を投与すること、HDL治療剤を対象により短い期間にわたって注入すること、およびHDL治療剤を対象により多い回数で投与することのうちの1つまたは複数を含むステップ;または(iii)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、対象を第1の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む。
カットオフ量は、前記投与前の対象自身のベースラインに関連し得るか、またはカットオフ量は、例えば健康な対象もしくは対象と同じ疾患状態を有する集団、または1つもしくは複数の疾患リスク遺伝子を対象と共有する集団からの集団の平均値などの対照量(control amount)に関連し得る。
ある実施形態において、本開示は、コレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象の集団にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)前記第1の用量より高いまたは低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップと、(d)前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(e)任意選択で、前記HDL治療剤の1つまたは複数の追加の用量によってステップ(c)および(d)を繰り返すステップと、(f)1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最大用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記HDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
ある実施形態において、前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第2の用量の効果を評価する。対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、第2の用量より低い、前記HDL治療剤の第3の用量が投与され得る。
ある実施形態において、本開示は、HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、(a)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、対象のベースライン量と比較して20%より大きくまたは10%より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む。
ある実施形態において、本開示は、HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、(a)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、対照量と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低減治療との組み合わせを投与するステップを含む。
対照量(control amount)は、集団の平均値、例えば健康な対象の集団の平均値、または対象と同じ疾患状態を有する集団の平均値、または1つもしくは複数の疾患リスク遺伝子を対象と共有する集団の平均値であり得る。対象はヒトであり得るか、または対象の集団はヒト対象の集団である。対象は、非ヒト動物、例えばマウスであり得るか、または対象の集団は、非ヒト動物の集団であり得る。
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも1つのHDLマーカーはABCA1である。例えば、ABCA1mRNA発現レベルまたはABCA1タンパク質発現レベルが測定される。様々な実施形態において、ABCA1カットオフ量は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%であるか、または前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択される。ABCA1発現レベルは、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定され得る。
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも1つのHDLマーカーは、ABCG1である。例えば、ABCG1mRNA発現レベルまたはABCG1タンパク質発現レベルが測定される。様々な実施形態において、ABCG1カットオフ量は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%であるか、または前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択される。ABCG1発現レベルは、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定され得る。
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも1つのHDLマーカーは、SREBP−1である。例えば、SREBP−1mRNA発現レベルまたはSREBP−1タンパク質発現レベルが測定される。様々な実施形態において、SREBP−1カットオフ量は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%であるか、または前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択される。SREBP−1発現レベルは、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定され得る。
ある実施形態において、HDL治療剤は、リポタンパク質複合体である。リポタンパク質複合体は、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoE、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質を含み得る。リポタンパク質複合体は、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、もしくはApoEペプチド模倣体、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質ペプチド模倣体を含み得る。リポタンパク質複合体は、CER−001、CSL−111、CSL−112、CER−522、またはETC−216であり得る。
ある実施形態において、HDL治療剤は、CETP阻害剤またはパントテン酸誘導体などの低分子である。
ある実施形態において、本明細書において記述される方法は、カットオフ量を決定するステップをさらに含む。例えば、カットオフ量は、HDL治療剤の用量反応曲線を作成することによって決定され得る。カットオフ量は、用量反応曲線における変曲点でのHDLマーカーの発現レベルの25%、40%、50%、60%、または75%であり得る。特定の実施形態において、カットオフは、前述のカットオフ値の任意の2つを境界とする範囲、例えば用量反応曲線における変曲点でのHDLマーカーの発現レベルの30%〜70%、40%〜60%、25%〜50%、25%〜75%から選択される。
ある実施形態において、対象または対象の集団は、ABCA1欠損症を有する。対象または対象の手段は、ABCA1変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ABCA1変異に関してヘテロ接合であり得る。
他の実施形態において、対象または対象の集団は、HDL欠損、低アルファリポタンパク血症、または原発性家族性低アルファリポタンパク血症を有する。
他の実施形態において、対象または対象の集団は、LCAT欠損症、または魚眼病を有する。対象または対象の集団は、LCAT変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、LCAT変異に関してヘテロ接合であり得る。
他の実施形態において、対象または対象の集団は、ABCG1欠損症を有する。対象または対象の集団は、ABCG1変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ABCG1変異に関してヘテロ接合であり得る。
他の実施形態において、対象または対象の集団は、ApoA−I欠損症を有する。対象または対象の集団は、ApoA−I変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ApoA−I変異に関してヘテロ接合であり得る。
なお他の実施形態において、対象または対象の集団は、ABCG8欠損症を有する。対象または対象の集団は、ABCG8変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ABCG8変異に関してヘテロ接合であり得る。
なお他の実施形態において、対象または対象の集団は、PLTP欠損症を有する。対象または対象の集団は、PLTP変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、PLTP変異に関してヘテロ接合であり得る。
患者は、前述の遺伝子の1つまたは複数に遺伝子欠損を有し得る、すなわち複合遺伝子欠損を有する。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
他の実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーのベースライン発現レベルを維持する、または発現レベルを上昇させる用量を同定し、それによって、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。レベルは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または前述の値の任意の2つを境界とする範囲増加させることができ、例えば、レベルは、10%まで、20%まで、50%まで、10%〜50%、20%〜60%等増加させることができる。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)前記対象における1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく増加させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーのベースライン発現レベルを維持する、または発現レベルを上昇させる用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。レベルは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または前述の値の任意の2つを境界とする範囲増加させることができ、例えば、レベルは、10%まで、20%まで、50%まで、10%〜50%、20%〜60%等増加させることができる。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させないHDL治療剤の最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法は、(a)対象または対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含み得る。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させないHDL治療剤の最も頻回投与レジメンの最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法は、(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を50%〜100%より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
ある実施形態において、1回または複数回の投与回数は、(a)2日ごとに1〜4時間の注入としての投与、(b)3日ごとに1〜4時間の注入としての投与、(c)1週間ごとに24時間の注入としての投与、および(d)2週間ごとに24時間の注入としての投与、から選択される1回または複数回の投与回数を含む。
コレステロール流出は、前記対象または対象の集団からの単球、マクロファージ、または単核細胞において測定され得る。
ある実施形態において、本開示は、ABCA1欠損症を有する対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、CER−001などのHDL治療剤の治療的有効量を投与することを含む。対象は、ABCA1変異に関してヘテロ接合またはホモ接合であり得る。
ある実施形態において、本開示は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法を含む。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象に導入レジメンに従ってHDL治療剤を投与するステップ、および次に(b)対象に、維持レジメンに従って対HDL治療剤を投与するステップを含む。維持レジメンは、HDL治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴い得る。対象は、ABCA1変異に関してヘテロ接合またはホモ接合であり得る。対象は、LCAT変異に関してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。対象は、ApoA−I変異に関してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。対象は、ABCG1変異に関してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。対象はまた、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせなどの脂質調節薬でも処置され得る。
HDL治療剤は、CER−001であり得、および/または導入レジメンは、4週間の期間であり得る。導入レジメンは、HDL治療剤を1週間に2回、3回、または4回投与することを含み得る。HDL治療剤がCER−001などのリポタンパク質複合体である場合、導入レジメンにおいて投与される用量は、8〜15mg/kg(タンパク質の重量に基づく)から選択することができる。特定の実施形態において、導入用量は、8mg/kg、12mg/kg、または15mg/kgである。維持レジメンは、HDL治療剤を少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも1年間、少なくとも18か月間、少なくとも2年間、または無限に投与するステップを含み得る。維持レジメンは、HDL治療剤を1週間に1回または2回投与するステップを含み得る。HDL治療剤がCER−001などのリポタンパク質複合体である場合、維持レジメンにおいて投与される用量は、1〜6mg/kg(タンパク質の重量に基づく)から選択することができる。特定の実施形態において、維持用量は、1mg/kg、3mg/kg、または6mg/kgである。
ある実施形態において、(a)導入レジメンは、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを、対象のベースライン量および/または集団の平均値と比較して20%〜80%、または40%〜60%低減させる用量を利用する、および/または(b)維持レジメンは、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを、対象のベースライン量および/または集団の平均値と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量を利用する。
不定詞「1つの(a)」および「1つの(an)」および定冠詞「その」は、特許出願において一般的であるように、本出願において、本文がそれ以外であることを明らかに述べている場合を除き、1つまたは複数を意味するために使用されると留意すべきである。さらに、用語「または」は、特許出願において一般的であるように、本出願において、離接語「または」または接続語「および」を意味するために使用される。
本開示の特徴および利点は、以下の本発明の実施形態の詳細な説明からさらに明らかとなるであろう。
6.1.定義
本明細書において使用されるように、以下の用語は、以下の意味を有すると意図される。
本明細書において使用されるように、以下の用語は、以下の意味を有すると意図される。
状態または複数の状態は、脂質異常障害(高脂血症、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲疾患、およびアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患)、および脂質異常障害に関連する疾患(冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、急性冠血管症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、卒中、一過性虚血発作(TIA)、内皮機能障害、アテローム血栓性血管疾患などの血栓症、血管内皮炎症などの炎症疾患、心血管疾患、高血圧症、低酸素症誘導血管新生、内皮細胞のアポトーシス、黄斑変性、I型糖尿病、II型糖尿病、虚血、再狭窄、血管または血管周囲疾患、異リポタンパク血症、低密度リポタンパクコレステロールの高レベル、超低密度リポタンパクコレステロールの高レベル、高密度リポタンパク質の低レベル、リポタンパク質Lp(a)コレステロールの高レベル、アポリポタンパク質Bの高レベル、動脈不全によって引き起こされる間欠性跛行などのアテローム性動脈硬化症、急速進行型アテローム性動脈硬化症、グラフトアテローム性動脈硬化症、家族性高コレステロール血症(FH)、家族性複合高脂血症(FCH)、高トリグリセリド血症などのリポタンパクリパーゼ欠損症、低アルファリポタンパク血症、および高コレステロール血症リポタンパク質)のうちの1つ、または複数、または全てを意味する。いくつかの実施形態において、脂質異常障害は、タンジール病、ABCA1欠損症、ApoA−I欠損症、LCAT欠損症、または魚眼病などの家族性原発性低アルファリポタンパク血症(FPHA)に関連する。
「IUSDEC」は、「逆U字型用量反応曲線」を意味する。IUSDECは、治療剤の用量と患者の応答との間の非線形の関係である。所定の治療剤の用量を増加させる効果は、最大(正の勾配を有する用量反応曲線の部分)まで増加して、その後(変曲点)効果は減少する(負の勾配を有する用量反応曲線の部分)ように思われる。
「HDL治療剤」は、高コレステロール血症または脂質異常症および関連疾患状態を処置するために有用な治療剤を意味する。HDL治療剤の例には、HDL模倣リポタンパク質複合体(例えば、CER−001、CSL−111、CSL−112、CER−522、ETC−216)および低分子(例えば、スタチン)が挙げられる。
「HDLマーカー」は、その発現がHDL模倣体での処置に応答してIUSDECと相関する分子マーカーを意味する。例示的なHDLマーカーは、ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8、およびSREBP1である。HDLマーカーは、例えば、6.2章に記述されるmRNAまたはタンパク質レベルでアッセイすることができる。
6.2.コンパニオン診断法
コレステロール逆輸送(RCT)は、蓄積されたコレステロールが、排泄のために血管壁から肝臓へと輸送される経路であり、このようにしてアテローム性動脈硬化症を予防する。RCTの主要な構成成分は、高密度リポタンパク質(HDL)およびアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)などのアクセプター、ならびにレシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)、リン脂質輸送タンパク質(PLTP)、肝リパーゼ(HL)、およびコレステロールエステル転送タンパク質(CETP)などの酵素を含む。RCTの肝要な部分はコレステロール流出であり、蓄積されたコレステロールが、例えば血管壁の内膜下のマクロファージからATP結合膜カセットトランスポーターA1(ABCA1)およびG1(ABCG1)によって除去されるか、または受動拡散、スキャベンジャー受容体B1(SR−B1)、カベオリン、およびステロール27−ヒドロキシラーゼを含む他の機構によって除去されて、HDLおよびApoA−Iによって回収される。HDLにおけるエステル化コレステロールは、排泄のために肝臓に送達される。ステロール調節エレメント結合因子1遺伝子(SREBP1)は、脂肪酸およびコレステロールの生合成を調節することによって、RCTに影響を及ぼす。
コレステロール逆輸送(RCT)は、蓄積されたコレステロールが、排泄のために血管壁から肝臓へと輸送される経路であり、このようにしてアテローム性動脈硬化症を予防する。RCTの主要な構成成分は、高密度リポタンパク質(HDL)およびアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)などのアクセプター、ならびにレシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)、リン脂質輸送タンパク質(PLTP)、肝リパーゼ(HL)、およびコレステロールエステル転送タンパク質(CETP)などの酵素を含む。RCTの肝要な部分はコレステロール流出であり、蓄積されたコレステロールが、例えば血管壁の内膜下のマクロファージからATP結合膜カセットトランスポーターA1(ABCA1)およびG1(ABCG1)によって除去されるか、または受動拡散、スキャベンジャー受容体B1(SR−B1)、カベオリン、およびステロール27−ヒドロキシラーゼを含む他の機構によって除去されて、HDLおよびApoA−Iによって回収される。HDLにおけるエステル化コレステロールは、排泄のために肝臓に送達される。ステロール調節エレメント結合因子1遺伝子(SREBP1)は、脂肪酸およびコレステロールの生合成を調節することによって、RCTに影響を及ぼす。
本開示は、HDL治療剤での処置に対するIUSDEC型応答の発見に部分的に基づいている。本開示はさらに、HDL治療剤のIUSDECの基礎となる作用機序、すなわちコレステロール流出に関係するタンパク質(本明細書においてHDLマーカーと呼ばれる)(例えば、ABCA1、ABCG1)発現のダウンレギュレーション、またはHDL治療剤での処置に応答したRCT経路の調節(例えば、SREBP1)の発見に部分的に基づいている。そのようなタンパク質のダウンレギュレーションは、HDL治療剤での処置に応答してIUSDECと相関することが発見されている。
本開示は部分的に、用量反応曲線における変曲点付近の用量、すなわち用量反応関係が最大となる用量を利用するために、診断、予後判定、およびHDL治療剤の用量を最適化するためにこの現象を使用することに関する。
本開示は部分的に、用量反応曲線における変曲点付近の用量、すなわち過剰量のHDL治療剤を使用することなく、用量反応関係が最大となる用量を利用するために、診断、予後判定、およびHDL治療剤の用量を最適化するためにこの現象を使用することに関する。
他の態様において、本開示は、例えば単球、マクロファージ、または単核細胞からのコレステロール流出の媒介におけるHDLマーカーの発現および/または機能に及ぼす影響を最小限にする治療用量および投与スケジュールの同定に関する。いくつかの態様において、1つまたは複数のHDLマーカーの発現を既定のカットオフ点より、例えばHDLマーカーの参照量の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%より大きく低減させない用量が選択される。ある実施形態において、カットオフは、前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする参照値の任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択され、参照値の20%〜80%の範囲であり得る。参照値は、対象自身のベースラインまたはいくつかの集団の平均値であり得る。集団は、年齢、性別、および/または疾患の危険因子(例えば、遺伝的危険因子またはライフスタイルの危険因子)をマッチさせた集団であり得る。集団の平均値は、正常な集団、または対象と同じもしくは類似の疾患を有する集団の平均値であり得る。特定のHDLマーカーおよびカットオフ点は、特定のHDL治療剤、対象の状態、および対象が受けている他の治療に依存する。
いくつかの態様において、特に併用治療を伴う場合、1つまたは複数のHDLマーカーの発現を20%より大きく低減させない用量が選択され、いくつかの実施形態において、わずか10%、およびなお他の実施形態において、1つまたは複数のHDLマーカーの発現を全く低減させない用量が選択される。
本明細書において記述されるHDLマーカーの使用は、6.6章の処置方法のいずれかを最適にするために使用することができる。ある実施形態において、本開示は、対象におけるコレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)(i)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルがカットオフ量より大きく低減される場合、第1の用量より低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップ、または(ii)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルがカットオフ量より大きく低減されない場合、対象を前記HDL治療剤の第1の用量で処置するステップとを含む。
ある実施形態において、本開示は、対象におけるHDL治療剤の効能をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象を第1の投与スケジュールに従ってHDL治療剤で処置するステップと、(b)対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の投与スケジュールの効果を評価するステップと、(c)(i)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、対象を第2の投与スケジュールに従ってHDL治療剤で処置するステップであって、第2の投与スケジュールが、HDL治療剤のより低い用量を投与すること、HDL治療剤を対象により長い期間にわたって注入すること、およびHDL治療剤を対象により少ない回数で投与することのうちの1つまたは複数を含むステップ、(ii)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、対象を第2の投与スケジュールに従ってHDL治療剤で処置するステップであって、第2の投与スケジュールが、HDL治療剤のより高い用量を投与すること、対象にHDL治療剤をより短い期間にわたって注入すること、および対象にHDL治療剤をより多い回数で投与することのうちの1つまたは複数を含むステップ;または(iii)対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、対象を第1の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む。
カットオフ量は、前記投与前の対象自身のベースラインに関連するか、またはカットオフ量は、例えば健康な対象もしくは対象と同じ疾患状態を有する集団からの集団の平均値などの対照量に関連し得る。
ある実施形態において、本開示は、コレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象の集団にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)第1の用量より高いまたは低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップと、(d)前記第2の用量の投与後、対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1および/または第2の用量の効果を評価するステップと、(e)前記HDL治療剤の1つまたは複数の追加の用量でステップ(c)および(d)を任意選択で繰り返すステップと、(f)1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最大用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記HDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
ある実施形態において、前記第2の用量の投与後、前記試験試料(例えば、循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞)における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第2の用量の効果を評価する。対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルがカットオフ量より大きく低減される場合、第2の用量より低い、前記HDL治療剤の第3の用量が投与され得る。
ある実施形態において、本開示は、HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、(a)前記対象の試験試料(例えば、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞)における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、対象のベースライン量と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低減治療、の組み合わせを投与することを含む。
ある実施形態において、本開示は、HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、(a)前記対象の試験試料(例えば、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞)における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、対照量と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低減治療、の組み合わせを投与することを含む。
対照量は、集団の平均値、例えば健康な対象の集団の平均値、または対象と同じ疾患状態を有する集団の平均値であり得る。対象はヒトであり得るか、または対象の集団はヒト対象の集団である。対象は、非ヒト動物、例えばマウスであり得るか、または対象の集団は、非ヒト動物の集団であり得る。
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも1つのHDLマーカーはABCA1である。例えば、ABCA1mRNA発現レベルまたはABCA1タンパク質発現レベルが測定される。ABCA1カットオフ量は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%であるか、または前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択される。ABCA1発現レベルは、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定され得る。
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも1つのHDLマーカーはABCG1である。例えば、ABCG1mRNA発現レベルまたはABCG1タンパク質発現レベルが測定される。ABCG1カットオフ量は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%であるか、または前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択される。ABCA1発現レベルは、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定され得る。
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも1つのHDLマーカーはSREBP−1である。例えば、SREBP−1mRNA発現レベルまたはSREBP−1タンパク質発現レベルが測定される。SREBP−1カットオフ量は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、もしくは80%であるか、または前述のカットオフ量の任意の2つを境界とする任意の範囲、例えば20%〜80%、30%〜70%、40%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%等から選択される。SREBP−1発現レベルは、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定され得る。
いくつかの実施形態において、対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを変化させない、または増加させる用量が同定される。レベルは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または前述の値の任意の2つを境界とする範囲増加させることができ、例えば、レベルは、10%まで、20%まで、50%まで、10%〜50%、20%〜60%等増加させることができる。
ある実施形態において、HDL治療剤は、リポタンパク質複合体である。リポタンパク質複合体は、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoE、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質を含み得る。リポタンパク質複合体は、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、またはApoEペプチド模倣体、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質ペプチド模倣体を含み得る。リポタンパク質複合体は、CER−001、CSL−111、CSL−112、CER−522、またはETC−216であり得る。他の実施形態において、HDL治療剤は、脱脂または脂質の少ないリポタンパク質である。
ある実施形態において、HDL治療剤は、CETP阻害剤またはパントテン酸誘導体などの低分子である。
ある実施形態において、本明細書において記述される方法は、カットオフ量を決定することをさらに含む。例えば、カットオフ量は、HDL治療剤の用量反応曲線を作成することによって決定され得る。カットオフ量は、用量反応曲線における変曲点でのHDLマーカーの発現レベルの25%、40%、50%、60%、または75%であり得る。特定の実施形態において、カットオフは、前述のカットオフ値の任意の2つを境界とする範囲、例えば用量反応曲線における変曲点でのHDLマーカーの発現レベルの30%〜70%、40%〜60%、25%〜50%、25%〜75%から選択される。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各投与後の前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、(a)対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各投与後の前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)前記対象における1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させないHDL治療剤の最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法は、(a)対象または対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含み得る。
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させないHDL治療剤の最も頻回の投与レジメンの最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法は、(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を50%〜100%より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含み得る。
6.3.HDL治療剤
本開示のHDL治療剤は、リポタンパク質複合体、脱脂または脂質の少ないリポタンパク質、ペプチド、融合タンパク質、およびHDL模倣体を含む。「リポタンパク質」および「アポリポタンパク質」は本明細書において互換的に使用されることに留意されたい。
本開示のHDL治療剤は、リポタンパク質複合体、脱脂または脂質の少ないリポタンパク質、ペプチド、融合タンパク質、およびHDL模倣体を含む。「リポタンパク質」および「アポリポタンパク質」は本明細書において互換的に使用されることに留意されたい。
リポタンパク質複合体は、タンパク質分画(例えば、アポリポタンパク質分画)および脂質分画(例えば、リン脂質分画)を含み得る。タンパク質分画は、リポタンパク質複合体に存在するコレステロールを動員することができる、アポリポタンパク質、ペプチド、またはアポリポタンパク質ペプチド類似体もしくは模倣体などの1つまたは複数の脂質結合タンパク質を含む。そのようなアポリポタンパク質およびアポリポタンパク質ペプチドの非制限的な例には、好ましくは成熟型のApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoA−V、およびApoEが挙げられる。脂質結合タンパク質にはまた、活性多形型、アイソフォーム、変種、および変異体、ならびに前述のアポリポタンパク質の切断型が挙げられ、その最も一般的なものは、アポリポタンパク質A−IMilano(ApoA−IM)、アポリポタンパク質A−IParis(ApoA−IP)およびアポリポタンパク質A−IZaragoza(ApoA−IZ)である。システイン残基を含有するアポリポタンパク質変異体も同様に公知であり、同様に使用することができる(例えば、米国特許出願公開第2003/0181372号明細書を参照されたい)。アポリポタンパク質は、単量体、またはホモ二量体もしくはヘテロ二量体であり得る二量体の形態であり得る。例えば、ApoA−I(Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(12):1424-29)、ApoA−IM (Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35)、ApoA−IP(Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22)、ApoA−II(Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46;Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35)、ApoA−IV(Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83)、ApoE(McLean et al, 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000)、ApoJおよびApoHのホモおよびヘテロ二量体(可能であれば)が使用され得る。
アポリポタンパク質は、複合体に含まれるアポリポタンパク質がいくつかの生物活性を保持する限り、Hisタグなどのその単離を容易にするエレメント、または他の目的のために設計された他のエレメントに対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、アポリポタンパク質分画は本質的にApoA−Iからなり、最も好ましくは1つのアイソフォームからなる。リポタンパク質複合体におけるApoA−Iは、図64のApoA−Iリポタンパク質(SEQ ID NO:1)の25〜267位のアミノ酸に対応するタンパク質と少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有し得る。任意選択で、ApoA−Iは、さらに、SEQ ID NO:1の完全長のApoA−Iの25位のアミノ酸に対応する位置(および成熟タンパク質の1位)でアスパラギン酸を含む。好ましくは、ApoA−Iの少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が正確にプロセシングされ、成熟タンパク質(すなわち、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠如する)は、酸化されず、脱アミノ化されず、および/または切断されない。
アポリポタンパク質に対応するペプチドおよびペプチド類似体、ならびにApoA−I、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、およびApoEの活性を模倣するアゴニストを使用することができる。ペプチドおよびペプチド類似体の非制限的な例は、その開示の全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,004,925号明細書、第6,037,323号明細書、および第6,046,166号明細書(Dasseux et al.に発行)、米国特許第5,840,688号明細書(Tsoに発行)、米国特許出願公開第2004/0266671号明細書、第2004/0254120号明細書、第2003/0171277号明細書、および第2003/0045460号明細書(Fogelmanに発行)、米国特許出願公開第2003/0087819号明細書(Bielickiに発行)、およびPCT出願国際公開第2010/093918号パンフレット(Dasseux et al.に発行)に開示されている。これらのペプチドおよびペプチド類似体は、L−アミノ酸もしくはD−アミノ酸、またはL−アミノ酸とD−アミノ酸の混合物で構成され得る。それらはまた、1つまたは複数の周知のペプチド/アミド同配体などの1つまたは複数の非ペプチド結合またはアミド結合を含み得る。そのような「ペプチドおよび/またはペプチド模倣体」アポリポタンパク質は、例えば米国特許第6,004,925号明細書、第6,037,323号明細書、および第6,046,166号明細書に記述される技術を含む、当技術分野において公知の任意のペプチド合成技術を使用して合成または製造することができる。
リポタンパク質は、脱脂型でまたはタンパク質分画に加えて脂質分画を含有するリポタンパク質複合体で、HDL治療剤として使用することができる。脂質分画は典型的に、中性、負荷電、正荷電、またはその組み合わせであり得る1つまたは複数のリン脂質を含む。リン脂質上の脂肪酸鎖は、好ましくは長さが炭素12〜26個、または炭素16〜26個であり、飽和から一不飽和まで飽和の程度が異なり得る。例示的なリン脂質には、低分子アルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、1−ミリストイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−ミリストイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−ステアロイルホスファチジルコリン、1−ステアロイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロールなど、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、ミルクスフィンゴミエリン、パルミトイルスフィンゴミエリン、フィトスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、(1,3)−D−マンノシル−(1,3)ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、3−コレステリル−6’−(グリコシルチオ)ヘキシルエーテルグリコリピッド、ならびにコレステロールおよびその誘導体が挙げられる。SMおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含むリン脂質分画は、任意選択で、リゾリン脂質、パルミトイルスフィンゴミエリン以外のスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、ならびにコレステロールおよびその誘導体を含むがこれらに限定されるわけではない、少量の任意のタイプの脂質を含み得る。
ある実施形態において、脂質分画は、少なくとも1つの中性リン脂質、任意選択で1つまたは複数の負荷電リン脂質を含有する。中性および負荷電リン脂質の両方を含むリポタンパク質複合体において、中性および負荷電リン脂質は、同じまたは異なる数の炭素および同じまたは異なる飽和度を有する脂肪酸鎖を有し得る。いくつかの例において、中性および負荷電リン脂質は、同じアシルテール、例えばC16:0またはパルミトイルアシル鎖を有する。特異的実施形態において、特に、卵SMを中性脂質として使用する実施形態において、アポリポタンパク質分画:脂質分画の重量比は、約1:2.7〜約1:3(例えば、1:2.7)の範囲である。
生理的pHで少なくとも部分的に負電荷を有する任意のリン脂質を、負荷電リン脂質として使用することができる。非制限的な例には、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジン酸の負荷電型、例えば塩が挙げられる。特異的実施形態において、負荷電リン脂質は、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)]、またはDPPG、ホスファチジルグリセロールである。好ましい塩には、カリウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。
いくつかの実施形態において、HDL治療剤は、その全内容物のそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,206,750号明細書または国際公開第2012/109162号パンフレット(およびその米国対応特許、米国特許出願公開第2012/0232005号明細書)に記述されているリポタンパク質複合体である。特定の実施形態において、リポタンパク質複合体のタンパク質成分は、6.1章に記述され、好ましくは国際公開第2012/109162号パンフレット(および米国特許出願公開第2012/0232005号明細書)の6.1.1章に記述されているとおりであり、脂質成分は、国際公開第2012/109162号パンフレット(および米国特許出願公開第2012/0232005号明細書)の6.2章に記述されているとおりであり、これは任意選択で、国際公開第2012/109162号パンフレット(および米国特許出願公開第2012/0232005号明細書)の6.3章に記述される量で共に複合体を形成することができる。これらの章のそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。ある態様において、リポタンパク質複合体は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2012/109162号パンフレット(および米国特許出願公開第2012/0232005号明細書)の6.4章に記述されるように、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%均一である複合体の集団に存在する。
特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に2〜4当量のApoA−I、2分子の荷電リン脂質、50〜80分子のレシチン、および20〜50分子のSMからなる。
別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に2〜4当量のApoA−I、2分子の荷電リン脂質、50分子のレシチン、および50分子のSMからなる。
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に2〜4当量のApoA−I、2分子の荷電リン脂質、80分子のレシチン、および20分子のSMからなる。
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に2〜4当量のApoA−I、2分子の荷電リン脂質、70分子のレシチン、および30分子のSMからなる。
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に2〜4当量のApoA−I、2分子の荷電リン脂質、60分子のレシチン、および40分子のSMからなる。
特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、脂質成分が本質的に、約90〜99.8重量%のSM、および約0.2〜10重量%の負荷電リン脂質、例えば約0.2〜1重量%、0.2〜2重量%、0.2〜3重量%、0.2〜4重量%、0.2〜5重量%、0.2〜6重量%、0.2〜7重量%、0.2〜8重量%、0.2〜9重量%、または0.2〜10重量%の総負荷電リン脂質からなる3成分複合体である。別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、脂質分画が、本質的に約90〜99.8重量%のレシチン、および約0.2〜10重量%の負荷電リン脂質、例えば約0.2〜1重量%、約0.2〜2重量%、0.2〜3重量%、0.2〜4重量%、0.2〜5重量%、0.2〜6重量%、0.2〜7重量%、0.2〜8重量%、0.2〜9重量%、または0.2〜10重量%の総負荷電リン脂質からなる3成分複合体である。
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、約9.8〜90重量%のSM、約9.8〜90重量%のレシチン、および約0.2〜10重量%の負荷電リン脂質、例えば、約0.2〜1重量%、0.2〜2重量%、0.2〜3重量%、0.2〜4重量%、0.2〜5重量%、0.2〜6重量%、0.2〜7重量%、0.2〜8重量%、0.2〜9重量%、または0.2〜10重量%の総負荷電リン脂質からなる4成分複合体である。
別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、33重量%プロApoA−I、65重量%スフィンゴミエリン、および2重量%ホスファチジルグリセロールからなる。
別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、ApoA−Iアポリポタンパク質と脂質分画とを含み、脂質分画は本質的にスフィンゴミエリンと約3重量%の負荷電リン脂質とからなり、脂質分画対ApoA−Iアポリポタンパク質とのモル比は約2:1〜200:1であり、前記リポタンパク質複合体は、2〜4当量のApoA−Iを含有する小さいまたは大きいディスク状粒子である。
複合体は、1つのタイプの脂質結合タンパク質、または同じもしくは異なる種に由来し得る2つ以上の異なる脂質結合タンパク質の混合物を含み得る。必要ではないが、リポタンパク質複合体は、好ましくは、治療に対する免疫応答の誘導を回避するために、処置される動物種に由来する、またはアミノ酸配列が対応する脂質結合タンパク質を含む。このため、ヒト患者の処置に関して、好ましくは本開示の複合体において、ヒト起源の脂質結合タンパク質が使用される。ペプチド模倣アポリポタンパク質の使用もまた、免疫応答を低減または回避し得る。
好ましい実施形態において、脂質成分は、2つのタイプのリン脂質、すなわちスフィンゴミエリン(SM)と、負荷電リン脂質とを含む。SMは、それが生理的pHで約ゼロの正味の電荷を有するという点において、「中性」のリン脂質である。このため、本明細書において使用されるように、「SM」という表現は、天然起源に由来するまたは天然起源から得られたスフィンゴミエリン、ならびに天然に存在するSMと同様にLCATによる加水分解に対して抵抗性である天然に存在するSMの類似体および誘導体が含まれる。
SMは、実質的に任意の起源から得られ得る。例えば、SMは、ミルク、卵、または脳から得られ得る。SMの類似体または誘導体も同様に使用され得る。有用なSMの類似体および誘導体の非制限的な例には、パルミトイルスフィンゴミエリン、N−パルミトイル−4−ヒドロキシスフィンガニン−1−ホスホコリン(フィトスフィンゴミエリンの1つの形態)、パルミトイルスフィンゴミエリン、ステアロイルスフィンゴミエリン、D−エリスロ−N−16:0−スフィンゴミエリンおよびそのジヒドロ異性体であるD−エリスロ−N−16:0−ジヒドロ−スフィンゴミエリンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。合成パルミトイルスフィンゴミエリンまたはN−パルミトイル−4−ヒドロキシスフィンガニン−1−ホスホコリン(フィトスフィンゴミエリン)などの合成SMは、動物起源のスフィンゴ脂質より均一で、混入物および/または酸化物の少ない複合体を産生するために使用することができる。
天然起源から単離されたスフィンゴミエリンを、1つの特定の飽和または不飽和アシル鎖に関して人工的に濃縮することができる。例えば、ミルクスフィンゴミエリン(Avanti Phospholipid, Alabaster, Ala.)は、長い飽和アシル鎖(すなわち、炭素原子20個以上を有するアシル鎖)によって特徴付けられる。これに対し、卵スフィンゴミエリンは、短い飽和アシル鎖(すなわち、炭素原子が20個より少ないアシル鎖)によって特徴付けられる。例えば、ミルクスフィンゴミエリンのわずか約20%がC16:0(炭素16個、飽和)アシル鎖を含むのに対し、卵スフィンゴミエリンの約80%が、C16:0アシル鎖を含む。溶媒抽出を使用して、ミルクスフィンゴミエリンの組成を、卵スフィンゴミエリンと同等であるアシル鎖組成を有するように濃縮することができ、またはその逆も可能である。
SMは、特定のアシル鎖を有するように、半合成であり得る。例えば、ミルクスフィンゴミエリンを、最初にミルクから精製した後、1つの特定のアシル鎖、例えばC16:0アシル鎖を切断して、別のアシル鎖に交換することができる。SMはまた、例えば大規模合成によって全合成することができる。例えば、Dongらの米国特許第5,220,043号明細書、表題Synthesis of D-erythro-sphingomyelins, issued Jun. 15, 1993;Weis, 1999, Chem. Phys. Lipids 102 (1-2):3-12を参照されたい。
半合成または合成SMを含むアシル鎖の長さおよび飽和レベルを、選択的に変化させることができる。アシル鎖は、飽和または不飽和であり得、炭素原子約6個〜約24個を含有し得る。それぞれの鎖は同数の炭素原子を含有し得るか、あるいはそれぞれの鎖は異なる数の炭素原子を含有し得る。いくつかの実施形態において、半合成または合成SMは、1つの鎖が飽和で1つの鎖が不飽和である混合アシル鎖を含む。そのような混合アシル鎖SMにおいて、鎖長は、同じであるかまたは異なり得る。他の実施形態において、半合成または合成SMのアシル鎖は、両方とも飽和または両方とも不飽和のいずれかである。この場合も、鎖は、同じまたは異なる数の炭素原子を含有し得る。いくつかの実施形態において、半合成または合成SMを含む両方のアシル鎖は同一である。特異的実施形態において、鎖は、例えばミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、またはアラキドン酸などの天然に存在する脂肪酸のアシル鎖に対応する。別の実施形態において、飽和または不飽和の官能化された鎖を有するSMが使用される。別の特異的実施形態において、アシル鎖は両方とも飽和され、炭素原子6〜24個を含有する。
好ましい実施形態において、SMは、C16:0アシル鎖を有する合成パルミトイルSMなどのパルミトイルSMであるか、または主成分としてパルミトイルSMを含む卵SMである。
特異的実施形態において、フィトスフィンゴミエリンなどの官能化SMが使用される。
脂質成分は、好ましくは、負荷電リン脂質、すなわち、生理的pHで正味の負電荷を有するリン脂質を含む。負荷電リン脂質は、1つのタイプの負荷電リン脂質または2つ以上の異なる負荷電リン脂質の混合物を含み得る。いくつかの実施形態において、荷電リン脂質は、負荷電グリセロリン脂質である。好適な負荷電リン脂質の特異的な例には、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)]、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、負荷電リン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、および/またはホスファチジン酸のうちの1つまたは複数を含む。特異的実施形態において、負荷電リン脂質は、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)]、またはDPPGからなる。
SMと同様に、負荷電リン脂質は、天然起源から得ることができ、または化学合成によって調製することができる。合成負荷電リン脂質を使用する実施形態において、SMに関連して上記で考察したように、アシル鎖の同一性を選択的に変化させることができる。本明細書において記述される負荷電リポタンパク質複合体のいくつかの実施形態において、負荷電リン脂質上の両方のアシル鎖は同一である。いくつかの実施形態において、SM上のアシル鎖と、負荷電リン脂質上のアシル鎖は全く同一である。特異的実施形態において、負荷電リン脂質(複数)および/またはSMは全て、C16:0またはC16:1アシル鎖を有する。特異的実施形態において、SMの脂肪酸部分は、主にC16:1パルミトイルである。1つの特異的実施形態において、荷電リン脂質(複数)および/またはSMのアシル鎖は、パルミチン酸のアシル鎖に対応する。
使用されるリン脂質は、好ましくは少なくとも95%純粋であり、および/または低減されたレベルの酸化剤を有する。天然起源から得られた脂質は、好ましくは、より少ない多価不飽和脂肪酸部分および/または酸化に対して感受性でない脂肪酸部分を有する。試料における酸化レベルは、ヨウ素滴定法を使用して決定することができ、この方法は、試料1kgあたりの単離されたヨウ素のミリ当量数で表記され、meqO/kgと省略される過酸化物の値を提供する。例えば、Gray, J. I., Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal of the American Oil Chemists Society, Vol. 55, p. 539-545 (1978);Heaton, F.W. and Uri N., Improved Iodometric Methods for the Determination of Lipid Peroxides, Journal of the Science of food and Agriculture, vol 9. P, 781-786 (1958)を参照されたい。好ましくは、酸化のレベル、または過酸化物のレベルは低く、例えば5meqO/kg未満、4meqO/kg未満、3meqO/kg未満、または2meqO/kg未満である。
SMおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含む脂質成分は、任意選択で少量の追加の脂質を含み得る。リゾリン脂質、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、ならびにコレステロールおよびその誘導体を含むがこれらに限定されるわけではない、実質的に任意のタイプの脂質が使用され得る。
そのような任意選択の脂質が含まれる場合、任意選択の脂質は、典型的に脂質分画の約15重量%未満を占めるが、いくつかの例において、より多くの任意選択の脂質を含めることができる。いくつかの実施形態において、任意選択の脂質は、約10重量%未満、約5重量%未満、または約2重量%未満を占める。いくつかの実施形態において、脂質分画は、任意選択の脂質を含まない。
特異的実施形態において、リン脂質分画は、卵SMまたはパルミトイルSM、またはフィトスフィンゴミエリンおよびDPPGを、90:10〜99:1の範囲の重量比(SM:負荷電リン脂質)で、より好ましくは95:5〜98:2の範囲の重量比で含有する。1つの実施形態において、重量比は97:3である。
リポタンパク質複合体はまた、多様な治療応用または診断応用のために疎水性、親油性、または無極性活性剤を送達するための担体として使用することができる。そのような応用に関して、脂質成分はさらに、脂肪酸、薬物、核酸、ビタミン、および/または栄養素を含むがこれらに限定されるわけではない、1つまたは複数の疎水性、親油性、または無極性活性剤を含むことができる。好適な疎水性、親油性、または無極性活性剤は、治療の範疇に限定されず、例えば、鎮痛剤、抗炎症剤、抗蟯虫剤、抗不整脈剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗凝固剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗てんかん剤、抗真菌剤、抗痛風剤、抗高血圧剤、抗マラリア剤、抗片頭痛剤、抗ムスカリン作動剤、抗新生物剤、勃起機能障害改善剤、免疫抑制剤、抗原虫剤、抗甲状腺剤、抗不安剤、鎮静剤、睡眠剤、神経遮断剤、β−遮断剤、強心剤、コルチコステロイド、利尿剤、抗パーキンソン病剤、胃腸薬、ヒスタミン受容体拮抗剤、角質溶解剤、脂質調節剤、抗狭心症剤、cox−2阻害剤、ロイコトリエン阻害剤、マクロライド、筋弛緩剤、栄養剤、核酸(例えば、低分子干渉RNA)、オピオイド鎮痛剤、プロテアーゼ阻害剤、性ホルモン、刺激剤、筋弛緩剤、抗骨粗鬆症剤、抗肥満剤、認知増強剤、抗尿失禁剤、栄養オイル、抗良性前立腺肥大剤、必須脂肪酸、非必須脂肪酸、およびそれらの混合物であり得る。
リポタンパク質複合体の脂質成分対タンパク質成分のモル比は、変化し得るが、中でもタンパク質成分を含むアポリポタンパク質の同一性(複数)、脂質成分を含む脂質の同一性および量、ならびにリポタンパク質複合体の所望のサイズに依存するであろう。ApoA−Iなどのアポリポタンパク質の生物活性は、アポリポタンパク質を含む両親媒性ヘリックスによって媒介されると考えられることから、脂質:アポリポタンパク質のアポリポタンパク質分画のモル比はApoA−Iタンパク質当量を使用して簡便に表記される。一般的に、ヘリックスを計算するために使用される方法に応じて、ApoA−Iが6〜10個の両親媒性ヘリックスを含有することは受け入れられている。他のアポリポタンパク質は、それらが含有する両親媒性ヘリックスの数に基づいてApoA−I当量に関して表記することができる。例えば、典型的にジスルフィド架橋された二量体として存在するApoA−IMは、ApoA−IMのそれぞれの分子が、1分子のApoA−Iの2倍多くの両親媒性ヘリックスを含有することから、2当量のApoA−Iとして表記することができる。逆に、1つの両親媒性ヘリックスを含有するペプチドアポリポタンパク質は、各分子が、1分子のApoA−Iの1/10〜1/6の両親媒性ヘリックスを含有することから、1/10〜1/6当量のApoA−Iとして表記することができる。一般的に、リポタンパク質複合体(本明細書において「Ri」と定義する)の脂質:ApoA−I当量のモル比は、約105:1〜110:1の範囲である。いくつかの実施形態において、Riは、約108:1である。リン脂質に関しておよそ650〜800のMWを使用して、重量比を得ることができる。
いくつかの実施形態において、脂質:ApoA−I当量のモル比(「RSM」)は、約80:1〜約110:1の範囲、例えば、約80:1〜約100:1である。特異的実施例において、リポタンパク質複合体のRSMは、約82:1であり得る。
好ましい実施形態において、リポタンパク質複合体は、好ましくは成熟した完全長のApoA−Iであるタンパク質分画と、中性リン脂質、スフィンゴミエリン(SM)、および負荷電リン脂質を含む脂質分画とを含む負荷電リポタンパク質複合体である。
特異的実施形態において、脂質成分は、卵SM、またはパルミトイルSM、またはフィトSMおよびDPPGを、90:10〜99:1の範囲、より好ましくは95:5〜98:2、例えば97:3の重量比(SM:負荷電リン脂質)で含有する。
特異的実施形態において、タンパク質成分対脂質成分の比率は、典型的に、約1:2.7〜約1:3の範囲であり、1:2.7が好ましい。これは、約1:90〜1:140の範囲のApoA−Iタンパク質対脂質のモル比に対応する。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体のタンパク質対脂質のモル比は、約1:90〜約1:120、約1:100〜約1:140、または約1:95〜約1:125である。
特定の実施形態において、複合体は、CER−001、CSL−111、CSL−112、CER−522、またはETC−216である。
CER−001は、ApoA−I、スフィンゴミエリン(SM)、およびDPPGを、リポタンパク質重量:総リン脂質重量比1:2.7で、SM:DPPGの重量比97:3で含む。好ましくは、SMは、卵SMであるが、合成SMまたは植物SMを置換することができる。いくつかの実施形態において、複合体は、国際公開第2012/109162号パンフレットの実施例4に記述される方法に従って作製される。
CSL−111は、ダイズホスファチジルコリン(SBPC)と複合体を形成した血漿から精製した再構成されたヒトApoA−Iである(Tardif et al, 2007, JAMA 297:1675-1682)。
CSL−112は、血漿から精製され、静脈内注入に好適なHDLを形成するように再構成されたApoA−Iの製剤である(Diditchenko et al., 2013, DOI 10.1161/ATVBAHA.113.301981)。
ETC−216(MDCO−216としても知られる)は、組換え型ApoA−IMilanoを含有するHDLの脱脂型である。Nicholls et al., 2011, Expert Opin Biol Ther. 11(3):387-94. doi: 10.1517/14712598.2011.557061を参照されたい。
別の実施形態において、複合体は、3個のリン脂質とアミノ酸22個のペプチド、CT80522の組み合わせを含むリポタンパク質複合体であるCER−522である。
CER−522のリン脂質成分は、卵スフィンゴミエリン、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(ジパルミトイルホスファチジルコリン、DPPC)、および1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)](ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、DPPG)の48.5:48.5:3の重量比からなる。CER−522複合体におけるペプチド対総リン脂質の重量比は、1:2.5である。
HDL治療剤の追加の例には、その全ての全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,617,615号明細書、同第8,206,750号明細書、同第8,378,068号明細書、同第7,994,120号明細書、同第7,566,695号明細書、同第7,312,190号明細書、同第7,307,058号明細書、同第7,273,848号明細書、同第7,250,407号明細書、同第7,211,565号明細書、同第7,189,689号明細書、同第7,189,411号明細書、同第7,157,425号明細書、同第6,900,177号明細書、同第6,844,327号明細書、同第6,753,313号明細書、同第6,734,169号明細書、同第6,716,816号明細書、同第6,630,450号明細書、同第6,602,854号明細書、同第6,573,239号明細書、同第6,455,088号明細書、同第6,376,464号明細書、同第6,329,341号明細書、同第6,287,590号明細書、同第6,265,377号明細書、同第6,046,166号明細書、同第6,037,323号明細書、同第6,004,925号明細書、同第6,743,778 8,383,592号明細書、同第8,101,565号明細書、同第8,044,021号明細書、同第7,985,728号明細書、同第7,985,727号明細書、同第8,568,766号明細書、同第8,557,767号明細書、同第8,404,635号明細書、同第8,148,328号明細書、同第8,048,851号明細書、同第7,994,132号明細書、同第7,820,784号明細書、同第7,807,640号明細書、同第7,723,303号明細書、同第7,638,494号明細書、同第7,531,514号明細書、同第7,199,102号明細書、同第7,166,578号明細書、同第7,148,197号明細書、同第7,144,862号明細書、同第6,933,279号明細書、同第6,930,085号明細書、同第8,541,236号明細書、同第8,148,323号明細書、同第8,071,746号明細書、同第7,572,771号明細書、同第7,223,726号明細書、同第8,163,699号明細書、同第8,415,293号明細書、同第7,691,965号明細書、同第7,601,802号明細書、同第7,439,323号明細書、同第7,217,785号明細書、同第8,158,601号明細書、同第8,653,245号明細書、同第8,557,962号明細書、同第7,491,693号明細書、同第7,749,315号明細書、同第5,059,528号明細書、再発行特許第38,556号明細書、米国特許第6,258,596号明細書、同第5,866,551号明細書、同第6,953,840号明細書、同第8,119,590号明細書、同第7,193,056号明細書、同第6,767,994号明細書、同第6,617,134号明細書、同第6,559,284号明細書、同第6,454,950号明細書、同第6,306,433号明細書、同第6,107,467号明細書、同第5,990,081号明細書、同第5,876,968号明細書、同第5,721,114号明細書、同第8,343,932号明細書、同第7,786,352号明細書、同第8,536,117号明細書、同第8,143,224号明細書、同第7,781,219号明細書、同第7,776,563号明細書、同第7,390,504号明細書、同第7,378,396号明細書、同第6,897,039号明細書、同第7,273,849号明細書、同第8,637,460号明細書、同第8,268,787号明細書、同第8,048,851号明細書、同第8,048,015号明細書、同第8,030,281号明細書、同第7,402,246号明細書、同第7,393,826号明細書、同第7,375,191号明細書、同第7,361,739号明細書、同第7,364,658号明細書、同第7,361,739号明細書、同第7,364,658号明細書、同第7,361,739号明細書、同第7,297,262号明細書、同第7,297,261号明細書、同第7,195,710号明細書、同第7,166,223号明細書、同第7,033,500号明細書、同第6,897,039号明細書、同第8,252,739号明細書、同第7,847,079号明細書、同第7,592,010号明細書、同第7,550,432号明細書、同第7,521,424号明細書、同第7,507,414号明細書、同第7,507,413号明細書、同第7,482,013号明細書、同第7,238,667号明細書、同第7,094,577号明細書、同第7,081,354号明細書、同第7,056,701号明細書、同第7,045,318号明細書、同第7,041,478号明細書、同第6,994,857号明細書、同第6,989,365号明細書、同第6,987,006号明細書、同第6,972,322号明細書、同第6,946,134号明細書、同第6,926,898号明細書、同第6,909,014号明細書、同第6,905,688号明細書、および米国特許出願公開第20040266662号明細書に記述される、リポタンパク質複合体、脱脂アポリポタンパク質、ペプチド、融合タンパク質、およびHDL模倣体が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
本開示のHDL治療剤は、その投与によってHDLレベルの増加が起こる低分子を含む。例示的な低分子には、CETP阻害剤、例えば、トルセトラピブ、アナセトラピブ、エバセトラピブ、DEZ−001(以前のTA−8995)、およびダルセトラピブ、ならびにその全ての全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,053,440号明細書、同第5,783,600号明細書、同第5,756,544号明細書、同第5,750,569号明細書、同第5,648,387号明細書、同第8,642,653号明細書、同第8,623,915号明細書、同第8,497,301号明細書、同第8,309,604号明細書、同第8,153,690号明細書、同第8,084,498号明細書、同第8,067,466号明細書、同第7,838,554号明細書、同第7,812,199号明細書、同第7,709,515号明細書、同第7,705,177号明細書、同第7,576,130号明細書、同第7,335,799号明細書、同第7,335,689号明細書、同第7,304,093号明細書、同第7,192,940号明細書、同第7,119,221号明細書、同第6,909,014号明細書、同第6,831,105号明細書、同第6,790,953号明細書、同第6,713,507号明細書、同第6,703,422号明細書、同第6,699,910号明細書、同第6,673,780号明細書、同第6,646,170号明細書、同第6,506,799号明細書、同第6,459,003号明細書、および同第6,410,802号明細書に開示されるそれらの低分子が挙げられる。
本開示の低分子HDL治療剤には、またCER−002およびCER−209が挙げられる。
HDL治療剤は、薬学的組成物として処方され得る。本開示によって企図される薬学的組成物は、対象に投与および送達するために好適な薬学的に許容される担体中に活性成分としてHDL治療剤を含む。
注射可能組成物には、滅菌懸濁剤、液剤、または水性もしくは油性ビヒクル中の活性成分の乳剤が挙げられる。組成物はまた、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤などの賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態において、HDL治療剤がHDL模倣体である場合、模倣体はリン酸緩衝生理食塩水(10mMリン酸ナトリウム、80mg/mlスクロース、pH8.2)中でHDL治療剤を含む注射可能組成物として製剤化される。注射用組成物は、単位投与剤形で、例えばアンプル、または多用量容器で提示することができ、添加された保存剤を含み得る。注入のためには、組成物を、エチレン酢酸ビニルまたは当技術分野で公知である他の任意の適合性の材料などの、HDL治療剤と適合性である材料で作製された注入バッグで供給することができる。
リポタンパク質複合体または脱脂リポタンパク質であるHDL治療剤の適した投与剤形は、HDL治療剤を、約1mg/mL〜約50mg/mLリポタンパク質で、好ましくは約5mg/mL〜約15mg/mLリポタンパク質の最終濃度で含む。特異的実施形態において、投与剤形は、HDL治療剤を、約8mg/mL〜約10mg/mLアポリポタンパク質A−Iで、好ましくは約8mg/mLの最終濃度で含む。
6.4.HDLマーカー
本開示は部分的に、HDL治療剤の投与を増加させる(回数を増加、用量を増加、または両方)ことによってダウンレギュレートされるHDLマーカーの利用に関する。HDLマーカーは、単球、マクロファージ、および単核細胞からの、蓄積したコレステロールまたはコレステリルエステルの除去に直接または間接的に関係しており、HDLマーカーには、脂肪酸およびコレステロールの生合成ならびに脂質代謝において重要な役割を果たす、ATP結合膜カセットトランスポーターA1(ABCA1)およびG1(ABCG1)ならびにステロール調節エレメント結合因子1遺伝子(SREBP1)が挙げられる。様々な実施形態において、本開示の方法は、単一のHDLマーカーに関してアッセイする。様々な実施形態において、本開示の方法は、複数の(例えば、2つまたは3つの)HDLマーカーに関してアッセイする。本開示の方法においてアッセイすることができるHDLマーカーの例示的な組み合わせには、ABCA1+ABCG1、ABCA1+SREBP1、ABCG1+SREBP1、およびABCA1+ABCG1+SREBP1が、単独で、または追加のマーカーとの組み合わせで挙げられる。HDLマーカーをアッセイする方法は、当技術分野において公知であり、以下に例示する。
本開示は部分的に、HDL治療剤の投与を増加させる(回数を増加、用量を増加、または両方)ことによってダウンレギュレートされるHDLマーカーの利用に関する。HDLマーカーは、単球、マクロファージ、および単核細胞からの、蓄積したコレステロールまたはコレステリルエステルの除去に直接または間接的に関係しており、HDLマーカーには、脂肪酸およびコレステロールの生合成ならびに脂質代謝において重要な役割を果たす、ATP結合膜カセットトランスポーターA1(ABCA1)およびG1(ABCG1)ならびにステロール調節エレメント結合因子1遺伝子(SREBP1)が挙げられる。様々な実施形態において、本開示の方法は、単一のHDLマーカーに関してアッセイする。様々な実施形態において、本開示の方法は、複数の(例えば、2つまたは3つの)HDLマーカーに関してアッセイする。本開示の方法においてアッセイすることができるHDLマーカーの例示的な組み合わせには、ABCA1+ABCG1、ABCA1+SREBP1、ABCG1+SREBP1、およびABCA1+ABCG1+SREBP1が、単独で、または追加のマーカーとの組み合わせで挙げられる。HDLマーカーをアッセイする方法は、当技術分野において公知であり、以下に例示する。
6.4.1.ABCA1
様々な実施形態において、本開示の方法は、ABCA1発現レベルおよび発現レベルの変化(例えば、HDL治療剤による処置に応答した変化)をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるABCA1mRNA配列には、受託番号AB055982.1が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるABCA1タンパク質には、受託番号AAF86276が割付けされている。これらの配列を図65A1〜65A3および65Bにそれぞれ示す。
様々な実施形態において、本開示の方法は、ABCA1発現レベルおよび発現レベルの変化(例えば、HDL治療剤による処置に応答した変化)をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるABCA1mRNA配列には、受託番号AB055982.1が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるABCA1タンパク質には、受託番号AAF86276が割付けされている。これらの配列を図65A1〜65A3および65Bにそれぞれ示す。
例えば、Vinals et al., 2005, Cardiovascular Research 66:141-149;Sporstol et al., 2007, BMC Mol Biol. 8:5;Genvigir et al., 2010, Pharmacogenomics 11(9):1235-46;Wang et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun. 353(3):650-4;Holven et al, 2013, PLOS ONE 8(11):e78241;およびRubic & Lorenz, 2006, Cardiovascular Research 69:527-35に記述されるように、本発明の方法に従ってABCA1発現に関してアッセイするために使用することができるいくつかのRT−PCRおよび抗体検出システムが開発されている。
6.4.2.ABCG1
様々な実施形態において、本開示の方法は、ABCG1発現レベルおよび発現レベルの変化(例えば、HDL治療剤による処置に応答した変化)をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるABCG1mRNA配列には、受託番号NM_207629.1が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるABCG1タンパク質には、受託番号P45844が割付けされている。これらの配列を図66A1〜66A2および66Bにそれぞれ示す。
様々な実施形態において、本開示の方法は、ABCG1発現レベルおよび発現レベルの変化(例えば、HDL治療剤による処置に応答した変化)をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるABCG1mRNA配列には、受託番号NM_207629.1が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるABCG1タンパク質には、受託番号P45844が割付けされている。これらの配列を図66A1〜66A2および66Bにそれぞれ示す。
例えば、Sporstol et al., 2007, BMC Mol Biol. 8:5;Genvigir et al., 2010, Pharmacogenomics 11(9):1235-46;Wang et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun. 353(3):650-4;Holven et al., 2013, PLOS ONE 8(11):e78241;およびRubic & Lorenz, 2006, Cardiovascular Research 69:527-35に記述されるように、本発明の方法に従って、ABCA1発現に関してアッセイするために使用することができるいくつかのRT−PCRおよび抗体検出システムが開発されている。
6.4.3.SREBP1
様々な実施形態において、本開示の方法は、SREBP1発現レベルおよび発現レベルの変化(例えば、HDL治療剤による処置に応答した変化)をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるSREBP1mRNA配列には、受託番号BC063281.1が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるSREBP1タンパク質には、受託番号P36956が割付けされている。これらの配列を図67A1〜67A2および67Bにそれぞれ示す。
様々な実施形態において、本開示の方法は、SREBP1発現レベルおよび発現レベルの変化(例えば、HDL治療剤による処置に応答した変化)をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるSREBP1mRNA配列には、受託番号BC063281.1が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるSREBP1タンパク質には、受託番号P36956が割付けされている。これらの配列を図67A1〜67A2および67Bにそれぞれ示す。
6.5.単球
単球は、骨髄で生成されて、血流に放出され、同様に脳脊髄液、またはリンパなどの他の生体液にも存在して、循環中を離れると、異なるタイプの組織マクロファージまたは樹状細胞を生じ得る。単球、その子孫および骨髄における直前の前駆細胞もまた、「単核食細胞系」(MPS)と呼ばれている。それらは、骨髄において単球および顆粒球を生じる顆粒球/マクロファージコロニー形成単位(CFU−GM)前駆細胞に由来する。
単球は、骨髄で生成されて、血流に放出され、同様に脳脊髄液、またはリンパなどの他の生体液にも存在して、循環中を離れると、異なるタイプの組織マクロファージまたは樹状細胞を生じ得る。単球、その子孫および骨髄における直前の前駆細胞もまた、「単核食細胞系」(MPS)と呼ばれている。それらは、骨髄において単球および顆粒球を生じる顆粒球/マクロファージコロニー形成単位(CFU−GM)前駆細胞に由来する。
新たに形成された単球は骨髄を離れ、末梢血へと遊走する。循環中の単球は、毛細血管の内皮細胞に接着することができ、様々な組織へと遊走することができ(van Furth et al., 1992, Production and Migration of Monocytes and Kinetics of Macrophages. In: van Furth R ed. Mononuclear Phagocytes. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers)、そこで、それらはマクロファージまたは樹状細胞へと分化することができる。単球、マクロファージ、および樹状細胞は、アテローム性動脈硬化症の開始および進行における鍵となる細胞である。通常の環境下では、流れている血液に接する内皮単層は、単球の堅固な接着に抵抗する。しかし、炎症促進因子に曝露されると、内皮細胞における様々な白血球接着分子の発現が次第に増加して、それによって単球は、内皮細胞膜に接着することができる(Libby, 2002, Nature 420:868-874)。単球が遊走すると、単球は組織常在マクロファージとなり、次に改変リポタンパク質に曝露されると、脂質含有泡沫細胞となる(Osterud and Bjorklid, 2003, Physiol. Rev. 83:1069-1112)。
本開示の診断および用量最適化法は、典型的に、患者レベル、集団レベル、動物モデル、またはin vitro細胞培養での最適な投与を同定するために、HDL治療剤での処置の前、間、および/または後にHDLマーカーの発現に関して単球およびマクロファージをアッセイすることを伴う。
末梢血単球を単離する方法は、当技術分野でルーチンである。そのような方法には、密度勾配遠心分離(細胞の比重の差を単離に利用する)、アフェレーシス、ポリスチレンフラスコなどのプラスチック表面器具への単球の接着、および分子マーカーを利用する細胞ソーティング法が挙げられる。
単核細胞は、密度勾配遠心分離法によって単離することができる。
単球は、末梢血において見出される他の細胞、例えばリンパ球およびナチュラルキラー(NK)細胞より強くプラスチック(ポリスチレン)基質に固着する傾向が大きいことから、プラスチック基質へのその接着を通して単離することができる。混入している細胞は、基質の十分な洗浄によって除去することができる。
単球はまた、勾配を有するチャンバーの中で、遠心分離とは反対方向に緩衝液を流すことによって特定の細胞層を形成する、細胞浮遊液を遠心分離する方法であるエルトリエーションを使用して単離することもできる。
単球およびマクロファージは、好ましくは、CD14およびCD16などの細胞表面マーカーを利用する細胞ソーティング法(例えば、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)、磁気活性化細胞ソーティング(MACS)、またはフローサイトメトリ)を使用して単離される。例示的な細胞ソーティング法およびマーカーは、Mittar et al., August 2011 BD Biosciences publication entitled "Flow Cytometry and High-Content Imaging to Identify Markers of Monocyte-Macrophase Differentiation."に開示されている。
6.6.治療法
本開示は、ある状態を処置または予防する方法を開示する。いくつかの実施形態において、方法は、それを必要とする対象におけるHDL治療剤の有効量を投与することを含む。対象は好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。処置方法は、本明細書において記述される方法によって同定されたHDL治療剤の用量(量および/または投与スケジュールおよび/または注入時間)を利用することができ、および/または処置の効能をモニターするために本明細書において記述されるHDLマーカーを利用するコンパニオン診断アッセイを伴うことができる。
本開示は、ある状態を処置または予防する方法を開示する。いくつかの実施形態において、方法は、それを必要とする対象におけるHDL治療剤の有効量を投与することを含む。対象は好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。処置方法は、本明細書において記述される方法によって同定されたHDL治療剤の用量(量および/または投与スケジュールおよび/または注入時間)を利用することができ、および/または処置の効能をモニターするために本明細書において記述されるHDLマーカーを利用するコンパニオン診断アッセイを伴うことができる。
ABCA1の欠損によって、対立遺伝子障害である家族性低アルファリポタンパク血症(FHA)、または血漿中HDL−Cコレステロールレベルの大きい低減、コレステロール流出障害、および細胞内コレステロールエステルの蓄積傾向によって特徴付けられる、より重度の障害であるタンジール病(TD)が起こる。本開示は、そのような障害を処置する方法を提供する。
本明細書において記述されるHDL治療剤および組成物は、実質的にあらゆる目的のために使用することができ、HDL模倣体は、ABCA1関連疾患または欠損の処置または予防、ABCG1関連疾患または欠損の処置または予防、およびHDL欠損、ApoA−I欠損、またはLCAT欠損の処置または予防などのために有用であることが示されている。HDL治療剤は、黄斑変性、卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、内皮機能障害、急速進行型アテローム性動脈硬化症、グラフトアテローム性動脈硬化症、虚血、および一過性虚血発作などの疾患を処置または予防するために使用され得る。
本開示のHDL治療剤および組成物は、心血管疾患、障害、および/または関連障害を処置または予防するために特に有用である。対象における心血管疾患、障害、および/または関連障害を処置または予防する方法は、一般的に、対象に、特定の適応を処置または予防するために有効なレジメンに従って、本明細書において記述されるHDL治療剤または薬学的組成物の低用量(<15mg/kg)または量を投与することを含む。
HDL治療剤は、治療上の有益性を提供するために十分または有効な量で投与される。心血管疾患、障害、および/または関連状態を処置するという文脈において、治療上の有益性は、以下のうちの1つまたは複数が起こる場合に推論することができる:ベースラインと比較してコレステロール動員の増加、アテローム動脈硬化性プラーク体積の低減、アテローム体積率の増加(IVUSによって得られた測定値)(Nicholls et al., 2010, J Am Coll Cardiol 55:2399-407)、超音波撮像技術またはMRI(Duivenvoorden et al., 2009, Circ Cardiovasc Imaging. 2:235-242.)によって測定した血管壁厚(内膜中膜厚)の減少、平均血漿中トリグリセリド濃度の増加を伴わない、または肝トランスアミナーゼ(またはアラニンアミノトランスフェラーゼ)レベルの正常範囲を超える増加を伴わない、ベースラインレベルと比較した遊離のコレステロールの高密度リポタンパク質(HDL)分画の増加。完全な治癒は、望ましいが、治療上の有益性が存在するために必要ではない。
いくつかの実施形態において、HDL治療剤は、注射あたり約1mg/kgのApoA−I当量〜約15mg/kgのApoA−I当量の用量で投与されるリポタンパク質複合体である。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体は、約1mg/kg、2mg/kg、または3mg/kgのApoA−I当量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体は、約6mg/kgのApoA−I当量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体は、約8mg/kg、12mg/kg、または15mg/kgのApoA−I当量の用量で投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書において記述されるある状態を処置または予防する方法は、例えば本明細書において記述されるHDL治療剤の効能をモニターする方法に従って、HDL治療剤の処置効能をモニターするステップを含む。HDL治療剤の用量および/または投与スケジュールの効能は、2回以上の時点で、例えばHDL治療剤の用量の投与前と、HDL治療剤の用量の投与後で1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを比較することによって、モニターすることができる。いくつかの実施形態において、発現レベルは、HDL治療剤の用量の投与の、2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定される。別の実施形態において、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルは、投与スケジュール、例えば、HDL治療剤が2日ごと、3日ごと、1週間ごと、または2週間ごとに投与される投与スケジュールに従って、HDL治療剤の投与前と投与後に測定される。
発現レベルは、タンパク質発現レベルまたはmRNA発現レベルであり得る。1つの実施形態において、発現レベルは、例えば6.4章に記述されるように、抗体検出系を使用して決定されるタンパク質発現レベルである。別の実施形態において、発現レベルは、RT−PCRを使用して決定されるmRNA発現レベルである。1つの実施形態において、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルは、6.5章に記述される方法のいずれかに従って単離された循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される。HDL治療剤の用量および/または投与スケジュールは、発現レベルが、6.2章に記述される1つまたは複数のHDLマーカーのカットオフ量より大きく低減されるか否かに応じて維持または変更することができる。
処置される対象は、心血管疾患、障害、および/または関連状態を有する個体である。本明細書において記述されるHDL治療剤および組成物で処置または予防することができるそのような心血管疾患、障害、および/または関連状態の非制限的な例には、末梢血管疾患、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、および例えば卒中、虚血性卒中、一過性虚血発作、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、間欠性跛行、重度の脚虚血、弁狭窄、および大動脈弁硬化などのアテローム性動脈硬化症の無数の臨床症状発現が挙げられる。対象は、心筋梗塞(ST上昇を伴うまたは伴わない)または不安定狭心症などの急性冠症候群が以前に起こったことがある個体であり得る。処置される対象は、任意の動物、例えば哺乳動物、特にヒトであり得る。
1つの実施形態において、方法は、心臓移植(例えば、移植心冠動脈病変(CAV))、腎移植、または肝移植(Garcia-Garcia et al., 201 0, European Heart Journal 3:2456-2469 at 2465, under "Cardiac Allograph Disease")などの臓器移植を受けた対象における心血管疾患、急速進行型アテローム性動脈硬化症を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、本明細書において記述されるHDL治療剤または組成物を投与することを含む。
ある態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、(a)投与後に患者のベースラインApoA−Iを変化させない量、および/または(b)投与前のベースライン(最初の)レベルより、投与後約2時間で約5mg/dl〜100mg/dl高い、および/または投与後約24時間で約5mg/dl〜20mg/dl高い、遊離または複合体形成アポリポタンパク質の血清中レベルを達成するために有効である量で、本明細書において記述されるHDL治療剤または組成物を投与することを含む。
別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、投与前の最初のHDL−コレステロール分画より少なくとも約10%高いHDL−コレステロール分画の循環中の血漿中濃度を投与後少なくとも1日間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるHDL治療剤または組成物を投与することを含む。
別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、30〜300mg/dlであるHDL−コレステロール分画の循環中の血漿中濃度を投与後5分〜1日の間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるHDL治療剤または組成物を投与することを含む。
別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、30〜300mg/dlの間であるコレステリルエステルの循環中の血漿中濃度を投与後5分から1日の間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるHDL治療剤または組成物を投与することを含む。
なお別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、投与前のベースライン(最初の)レベルより少なくとも約10%高い便中コレステロール排泄の増加を投与後少なくとも1日間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるHDL治療剤または組成物を対象に投与することを含む。
本明細書において記述されるHDL治療剤または組成物は、単独で、または前述の状態を処置もしくは予防するために使用される他の薬剤との併用治療において使用することができる。そのような治療には、関係する薬物の同時または連続的投与が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例えば、脂質異常症、家族性高コレステロール血症(ホモ接合またはヘテロ接合)などの高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化症の処置において、HDL治療剤は、現在使用されているコレステロール低下治療剤、例えば胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、コレステロール吸収阻害剤、および/またはフィブレートの任意の1つまたは複数と共に投与することができる。そのような併用レジメンは、それぞれの薬物がコレステロール合成および輸送における異なる標的に作用を及ぼすことから、すなわち胆汁酸レジンは、コレステロールのリサイクル、カイロミクロンおよびLDL集団に影響を及ぼし、ナイアシンは、VLDLおよびLDL集団に主に影響を及ぼし、スタチンはコレステロール合成を阻害し、LDL集団を減少させる(およびおそらくLDL受容体発現を増加させる)が、本明細書において記述されるHDL治療剤は、RCTに影響を及ぼし、HDLを増加させ、コレステロール流出を促進することから、特に有益な治療効果を生じ得る。
別の実施形態において、本明細書において記述されるHDL治療剤または組成物は、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、心血管疾患、再狭窄、血管または血管周囲疾患、アテローム性動脈硬化症(アテローム性動脈硬化症の処置および予防を含む)を処置または予防するためにフィブレートと共に使用され得る。
本明細書において記述されるHDL治療剤または組成物は、小さいHDL分画、例えばプレ−ベータ、プレ−ガンマ、およびプレ−ベータ様HDL分画、アルファHDL分画、HDL3および/またはHDL2分画を増加させる投与量で投与することができる。いくつかの実施形態において、投与量は、例えば磁気共鳴イメージング(MRI)または血管内超音波(IVUS)などの撮像技術によって測定されるように、アテローム動脈硬化性プラークの低減を達成するために有効である。IVUSが追跡するパラメータには、ベースラインからのアテローム体積率の変化、および総アテローム体積の変化が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。MRIが追跡するパラメータには、IVUSのパラメータ、ならびにプラークの脂質組成および石灰化が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
プラークの退縮は、患者自身の対照として患者を使用して測定することができる(ゼロ時間対最後の注入後t時間、または最後の注入後数週間以内、または3か月以内、6か月以内、または治療開始後1年以内)。
投与は、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内、皮下(SC)、および腹腔内(IP)注射を含む、非経口投与経路によって最善に達成され得る。ある実施形態において、投与は、点滴装置、インフィルトレーター、またはカテーテルによる投与である。いくつかの実施形態において、HDL治療剤は、注射、皮下植え込み可能ポンプ、またはデポー調製物によって、非経口投与を通して得られたものと等しい循環血清中濃度を達成する量で投与される。HDL治療剤はまた、例えばステントまたは他の装置に吸収させることもできる。
投与は、多様な異なる処置レジメンを通して達成することができる。例えば、累積の総注射容積が1日の毒性用量に達しないように、1日の間に数回の静脈内注射を定期的に投与することができる。方法は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12日の間隔でHDL治療剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、HDL治療剤は、1週間に1回、1週間に2回、1週間に3回またはそれより多い間隔で投与される。
方法はさらに、HDL治療剤を、上記の投与間隔のいずれかで4、5、6、7、8、9、10、11、または12回またはそれより多く投与することを含み得る。家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象において、HDL治療剤は、数か月、数年、または無限に投与することができる。
例えば、1つの実施形態において、HDL治療剤は、各投与の間が1週間間隔で6回投与される。いくつかの実施形態において、投与は、一連の注射として行われ、その後6か月から1年間中止して、その後別のシリーズを開始することができる。その後、維持シリーズの注射を、毎年、または3〜5年ごとに投与することができる。一連の注射は1日かけて(複合体の明記された血漿中レベルを維持するための潅流)、数日かけて(例えば、8日間の間に4回注射)、または数週間かけて(例えば、4週間の間に4回注射)行うことができ、その後6か月から1年後に再開することができる。慢性的な状態では、投与は、継続的に行うことができる。任意選択で、方法は、HDL治療剤をより頻回投与する誘導相の後で行われ得る。
別の実施形態において、HDL治療剤による処置は、誘導投与レジメンに従って開始した後、用量および/または投与回数を低減する維持レジメンを行うことができる。例えば、誘導レジメンは、HDL治療剤を週に2回、3回、または4回投与することを伴い得る。HDL治療剤が、CER−001などのリポタンパク質複合体である場合、誘導相の用量は、タンパク質に基づいて4〜15mg/kg(例えば、4、5、6、7、8、9、10、12、または15mg/kg)の範囲であり得る。維持レジメンは、HDL治療剤を1週間に1回、2回、または3回投与することを伴い得る。HDL治療剤が、CER−001などのリポタンパク質複合体である場合、維持用量は、タンパク質に基づいて0.5〜8mg/kg(例えば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、または8mg/kg)の範囲であり得る。誘導相の投与スケジュールは、家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象にとって特に好適である。例示的な投与スケジュールを実施例4に記述する。
なお別の代替において、投与あたり1mg/kg〜8mg/kgの用量で約1〜12回の投与から開始して、その後に投与あたり4mg/kg〜15mg/kgの反復投与を行う漸増用量を投与することができる。患者の必要に応じて、投与は、1時間より長い期間での遅い注入、1時間以内での急速注入、または1回ボーラス注射によって行うことができる。用量は、1週間に1回、2回、3回またはそれより多く投与することができる。
様々なHDL治療剤の毒性および治療効能は、LD50(集団の50%に対して致死である用量)およびED50(集団の50%において治療的に有効である用量)を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法を使用して決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、比LD50/ED50として表記することができる。大きい治療指数を示すHDL治療剤が好ましい。追跡することができるパラメータの非制限的な例には、肝機能トランスアミナーゼ(正常なベースラインレベルのわずか2倍)が挙げられる。これはあまりにも多くのコレステロールが肝臓に運ばれて、そのような量を同化できないことの指標である。赤血球からのコレステロールの動員により赤血球が脆弱となり、その形態に影響を及ぼすことから、赤血球に及ぼす効果もまたモニターすることができる。ABCA1、ABCG1、または本明細書において記述されるHDLマーカーのダウンレギュレーションもまた、モニターすることができる。
患者は、医療行為(例えば、予防的処置)の前、医療行為の間、または後に数日から数週間処置することができる。投与は、血管形成術、頸動脈アブレーション、ロータブレーター、または臓器移植(例えば、心臓、腎臓、肝臓等)などの別の侵襲性の治療と同時または同時期であり得る。
ある実施形態において、そのコレステロール合成が、スタチンまたはコレステロール合成阻害剤(PCSK9阻害剤などの、しかしこれらに限定されない)によって制御される患者にHDL治療剤が投与される。他の実施形態において、HDAL治療剤は、胆汁塩およびコレステロールを捕捉するために、胆汁酸の排泄を増加させるために、ならびに血中コレステロール濃度を低下させるために、結合レジン、例えばコレスチラミンなどの半合成レジンでの処置、または繊維、例えば植物の繊維での処置を受けている患者に投与される。
7.実施例1:CER−001の用量応答性解析
7.1.カイ二乗臨床試験
CER−001は、負電荷を有する遺伝子工学的に改変された組換えヒトアポリポタンパク質A−I高密度リポタンパク質(HDL)であり、静脈内注射された際に、天然のHDLの生物特性を模倣する。CER−001は、参照により本明細書にその全体を組み入れられている国際公開第2012/109162号パンフレットの実施例3および4では「Formula H」として記載され、組換えヒトアポリポタンパク質A−lと、スフィンゴミエリン(Sph)およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)を含有するリン脂質とから構成される。タンパク質とリン脂質との比率は、1:2.7であり、97%のSphおよび3%のDPPGを含有する。
7.1.カイ二乗臨床試験
CER−001は、負電荷を有する遺伝子工学的に改変された組換えヒトアポリポタンパク質A−I高密度リポタンパク質(HDL)であり、静脈内注射された際に、天然のHDLの生物特性を模倣する。CER−001は、参照により本明細書にその全体を組み入れられている国際公開第2012/109162号パンフレットの実施例3および4では「Formula H」として記載され、組換えヒトアポリポタンパク質A−lと、スフィンゴミエリン(Sph)およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)を含有するリン脂質とから構成される。タンパク質とリン脂質との比率は、1:2.7であり、97%のSphおよび3%のDPPGを含有する。
国際公開第2012/109162号パンフレットの実施例8に記載されるように、健康なボランティアで0.25、0.75、2、5、10、30および45mg/kgの単回静脈内投与が行われたCER−001の第I相試験では、この複合体が、良好な耐容性を有し、用量の増加に伴ってコレステロールの動員を増加させたこと、および15mg/kgを超えるレベルでは、トリグリセリドの一過的な増加が観察されたことが示された。
第I相試験に基づき、「HDL注入がアテローム性動脈硬化の退縮を有意に早めることができるか」(「カイ二乗」)と題された第II相試験が開始された。急性の胸痛または他の狭心症と同等の症状を呈し、かつSTセグメント上昇型心筋梗塞、非ST上昇型心筋梗塞または不安定な狭心症の診断を示した504人の対象を登録した。適格性を持たせるために、対象は、冠動脈疾患の血管造影によるエビデンスを有さねばならず、そのエビデンスは、血管造影の目測または経皮的冠動脈形成術(「PCI」)の受療歴によって、3つの主要な生来の冠動脈のうち管腔径の>20%が縮小したいずれかにある少なくとも1つの病変により定義した。PCIの標的血管は、研究IVUSの標的冠動脈とはならなかったため、以前にPCIを行ったいずれの血管も、標的冠動脈として使用することができなかった。
試験のデザインを図1に図示する。主要評価項目は、3次元IVUS(血管内超音波検査)によって評価される標的冠動脈の30mmのセグメント中の総プラーク体積の名目変化とした。重要な副次評価項目は、標的の30mmセグメント中のプラーク体積の%変化およびアテローム体積の%の変化、標的の30mmセグメント中の総血管体積の変化、ならびに病状の最も軽いまたは重い5mmのセグメントにおけるベースラインからのプラーク体積、管腔体積、および総血管体積の変化とした。罹患率および死亡率は、探索的評価項目とした。
7.2.結果
静脈内へのCER−001投与に続いて、アポリポタンパク質A−lが、用量依存的な様式(注入1)で、かつ第I相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入6で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図2Aを参照されたい。
静脈内へのCER−001投与に続いて、アポリポタンパク質A−lが、用量依存的な様式(注入1)で、かつ第I相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入6で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図2Aを参照されたい。
リン脂質もまた、用量依存的な様式(注入1)で、かつ第I相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入6で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図2Bを参照されたい。リン脂質およびApoA−Iの用量反応曲線の傾斜比は、2.8であり、これは、CER−001におけるリン脂質対タンパク質の比率に一致する。
血漿中総コレステロールは、用量依存的な様式(注入1)で、かつ第I相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入6で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図2Cを参照されたい。これらのデータは、CER−001の3mg/kgでの力価が、ETC−216の15mg/kgに匹敵することを示す。
CER−001は、3、6、および12mg/kgの用量で、用量に関連した明瞭な毒性を検査パラメータで示すことなく、全般的に良好な耐容性を示した。
7.2.1.IVUS−最初のアプローチ
ベースラインでの総アテローム体積の平均は、155.24±67.99mm3であった。総アテローム体積の変化の調整平均は、−2.71、−3.13、−1.50および−3.05mm3であり、それぞれプラセボ群、CER−001の3mg/kg群、CER−001の6mg/kg群、およびCER−001の12mg/kg群であった(事前に定めた12mg/kg対プラセボの一次解析についてはp=0.81)。また、CER−001の6mg/kg群(名目p=0.45)および3mg/kg群(名目p=0.77)については、プラセボと比較して差がなかった。アテローム体積率の変化は、全ての試験群の間で同様であった(プラセボ群、CER−001の3mg/kg群(p=0.86)、CER−001の6mg/kg群(p=0.95)およびCER−001の12mg/kg群(p=0.53)で0.02、−0.02、0.01および0.19%(名目p値対プラセボ)。
ベースラインでの総アテローム体積の平均は、155.24±67.99mm3であった。総アテローム体積の変化の調整平均は、−2.71、−3.13、−1.50および−3.05mm3であり、それぞれプラセボ群、CER−001の3mg/kg群、CER−001の6mg/kg群、およびCER−001の12mg/kg群であった(事前に定めた12mg/kg対プラセボの一次解析についてはp=0.81)。また、CER−001の6mg/kg群(名目p=0.45)および3mg/kg群(名目p=0.77)については、プラセボと比較して差がなかった。アテローム体積率の変化は、全ての試験群の間で同様であった(プラセボ群、CER−001の3mg/kg群(p=0.86)、CER−001の6mg/kg群(p=0.95)およびCER−001の12mg/kg群(p=0.53)で0.02、−0.02、0.01および0.19%(名目p値対プラセボ)。
後述に議論する「沿って歩く」アプローチとは対照的に、最適な可読性を得るためにフレーム対を別個に選択した。フレームは、エコー輝度(カルシウム)および側枝がないことに基づき選択した。最大の31フレームを30mmのセグメントにわたって選択し、30mmよりも長い障害物の寄与を除いた。>31フレームが利用可能であった場合に解析セットに含めるための31フレームを選択するためには、予め定義された判定基準は使用しなかった。
約60%の対画像セットが、31フレームにクラスタリングされ、約16%の対画像セットが、16フレームにクラスタリングされた。
16フレームの画像セットで「クラスタリングされたこと」は、解析用の画像セットを適格とするために、フレームが1mm未満の間隔で(すなわち0.3mmまで下げて)選択されたことを示唆する。
31フレームの画像セットで「クラスタリングされたこと」は、画像対の数を31に最大化するために、<1mm間隔も使用された可能性があることを示唆する。
解析のさらに別の詳細は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれているTardif et al., 2014, Eur. Heart Journal, first published online April 29, 2014 doi:10.1093/eurheartj/ehu171)に記載されている。
このアプローチの下では、126人の患者/治療群で、カイ二乗は、心臓血管の事象についての有意性を示すには及ばなかった(およそ5000人の患者/群が必要であったと思われる)。
7.2.2.IVUS解析−第2のアプローチ
IVUSデータの事後解析は、南オーストラリア健康医療研究所(SAHMRI)によって実施された。
IVUSデータの事後解析は、南オーストラリア健康医療研究所(SAHMRI)によって実施された。
この場合では、ベースラインとフォローアップ調査との間では同様のフレーム数であった。選択したフレーム数は、正規分散していた(図3)。
解析は、HDL模倣体以前と比較して、統計学的に有意かつ匹敵する程度のベースラインに対するPAVおよびTAVの減少を示した(図4)。本試験は、mITT集団では主要評価項目に達しなかったものの、修正パープロトコール(mPP)集団では、3mg/kg用量が、TAVおよびPAVの両方で、プラセボに対し名目上の統計学的有意性を達成した(図5)。
図6A〜6Bに見られるように、SAHMRI解析の結果は、ヒトにおけるCER−001の逆U型用量−効果曲線に一致する。
表1に示すように、ベースラインPAVが30以上であった患者では、全ての患者(mITT)について、最低用量の3mg/kgで、総アテローム体積(TAV)の変化およびPAVでの変化においてプラセボに対し統計学的な有意性を得た。
ベースラインでPAV≧30の患者の部分集団における用量応答は、総集団と同じパターンを辿ったが、3mg/kg用量では、TAVおよびPAVに、さらに大きな強調すべき変化があった。
8.実施例2:CER−001またはHDL3を用いた処置後の、逆脂質輸送に関与する遺伝子の調節
8.1.序論
試験A〜Pの目的は、CER−001、HDL3およびApoA−Iを用いてマウスマクロファージ(J774)を処置した後の、逆脂質輸送(RLT)に関与する遺伝子の調節を決定することであった。逆コレステロール輸送(RCT)とは、末梢細胞が、蓄積されたコレステロールを、高密度リポタンパク質(HDL)などの細胞外アクセプターに向けて遊離するための経路であり、次いでHDLは、排出のために肝臓へのコレステロールの送達を媒介し、それゆえアテローム性動脈硬化を予防する。コレステロール流出を試験するための1つのアプローチは、[3H]−コレステロール−酸化LDLを用いてマクロファージを標識し、アクセプター分子の存在下でこれらの細胞からのコレステロールの遊離を測定することである。ABCA1、ABCG1およびSR−BIは、コレステロール流出に関与する膜タンパク質である。
8.1.序論
試験A〜Pの目的は、CER−001、HDL3およびApoA−Iを用いてマウスマクロファージ(J774)を処置した後の、逆脂質輸送(RLT)に関与する遺伝子の調節を決定することであった。逆コレステロール輸送(RCT)とは、末梢細胞が、蓄積されたコレステロールを、高密度リポタンパク質(HDL)などの細胞外アクセプターに向けて遊離するための経路であり、次いでHDLは、排出のために肝臓へのコレステロールの送達を媒介し、それゆえアテローム性動脈硬化を予防する。コレステロール流出を試験するための1つのアプローチは、[3H]−コレステロール−酸化LDLを用いてマクロファージを標識し、アクセプター分子の存在下でこれらの細胞からのコレステロールの遊離を測定することである。ABCA1、ABCG1およびSR−BIは、コレステロール流出に関与する膜タンパク質である。
8.2.材料
これらの試験に使用した材料は、CER−001(タンパク質と総脂質との比率が1:2.7の荷電リポタンパク質複合体、97%卵スフィンゴミエリン/3%DPPG)濃度13.5mg/mLのApoA−I)、精製ヒトHDL3、および精製ApoA−Iを含む。材料は約−20℃で保存した。
これらの試験に使用した材料は、CER−001(タンパク質と総脂質との比率が1:2.7の荷電リポタンパク質複合体、97%卵スフィンゴミエリン/3%DPPG)濃度13.5mg/mLのApoA−I)、精製ヒトHDL3、および精製ApoA−Iを含む。材料は約−20℃で保存した。
8.3.1節に記載されたプロセスに従って、ヒト血漿からHDL3リポタンパク質画分を調製した。簡単に述べれば、まずKBr勾配(d<1.055)および連続的な超遠心分離(100,000×g、24時間を3回)によって、VLDL、IDLおよびLDL画分を除去した。LDL画分は、コレステロール流出実験でのちに使用するために取り置いた。次いで、40時間のKBr勾配(d=1.19)−100,000×gから、HDL3画分を単離した。リポタンパク質画分を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対し広範囲で透析した後、実験で利用した。
8.3.プロトコール
8.3.1.血漿リポタンパク質の分離
血漿の受け取り。新鮮な血漿(凍結されていない)の体積を測定する。以下の終濃度で添加剤を添加する:EDTA:0.1%(w/v)、NaN3:0.01%(w/v)。血漿を20000rpm、4℃で20分間、遠心分離する。細胞の細片およびカイロミクロンである可能性のあるものを除去して、清浄な血漿を提供する。
8.3.1.血漿リポタンパク質の分離
血漿の受け取り。新鮮な血漿(凍結されていない)の体積を測定する。以下の終濃度で添加剤を添加する:EDTA:0.1%(w/v)、NaN3:0.01%(w/v)。血漿を20000rpm、4℃で20分間、遠心分離する。細胞の細片およびカイロミクロンである可能性のあるものを除去して、清浄な血漿を提供する。
リポタンパク質の単離。KBr溶液中で逐次浮揚超遠心分離を行うことによって(VLDL、d=1.006g/mL;LDL、1.006<d<1.063g/mL)、リポタンパク質を得る。まず、HDL2をd=1.125g/mLで単離し(110,000×gを40時間)、続いて、HDL3をd=1.19g/mLで単離した(110,000×gを40時間)。使用前に、リポタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水に対し広範囲で透析する。生理食塩水溶液の体積は、血清の体積−7%であり、これは水和タンパク質の体積に相当する。
8.3.2.RNA抽出
ステップ1−ホモジナイゼーション:組織試料(50mg)または培養細胞(6ウェルプレートのうち1ウェル)を、1mLのTRI試薬(登録商標)中でホモジナイズする。RNase不含の1.5mLチューブ内で、ホモジネートを室温で5分間、インキュベートする。組織試料については、4℃、12,000×gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。注記:培養細胞試料については不要である。
ステップ1−ホモジナイゼーション:組織試料(50mg)または培養細胞(6ウェルプレートのうち1ウェル)を、1mLのTRI試薬(登録商標)中でホモジナイズする。RNase不含の1.5mLチューブ内で、ホモジネートを室温で5分間、インキュベートする。組織試料については、4℃、12,000×gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。注記:培養細胞試料については不要である。
ステップ2−RNA抽出:100μLのブロモクロロプロパン(BCP)を1mLのホモジネートに添加し、よく混合する(ボルテックス15秒間)。室温で5分間インキュベートする。4℃、12,000×gで10分間遠心分離する。新しいRNase不含の1.5mLチューブに、400μLの上部の水相を移す。
ステップ3−最後のRNA精製:200μLの100%エタノールを添加し、直ちに混合する(ボルテックスで5秒間)。試料を、12,000×gでの30秒間の遠心分離によって、フィルターカートリッジに通す。500μLの洗浄溶液を用いて、フィルターを2回洗浄する(12,000×gで30秒間)。30秒超、遠心分離して、残渣の洗浄溶液を除去する。フィルターカートリッジを新しい採集チューブに移す。50〜100μLの溶出緩衝液をフィルターカラムに添加して、室温で2分間インキュベートし、12,000×gで30秒間遠心分離して、フィルターからRNAを溶出する。回収したRNAを−80℃で保存する。
ステップ4−RNA濃度を決定する:RNA溶液の濃度は、1.5μLの試料について、Nanodrop分光器にて260nmで吸光度を測定することによって決定する。RNAの質を評価するために、8.3.3節に記載されるようにAgilent2100バイオアナライザーを用いた分析を行うことができる。
8.3.3.Agilentバイオアナライザーを用いたRNAの質の決定
使用前に、全ての試薬を室温に30分間平衡化させる。室温に至らせるまでの間、色素濃縮液を光から保護する。
使用前に、全ての試薬を室温に30分間平衡化させる。室温に至らせるまでの間、色素濃縮液を光から保護する。
ステップ1−ゲルを調製する:550μLのAgilent RNA6000ナノゲルマトリックスをスピンフィルター内におく。1500×gで10分間、遠心分離する。キットに含まれるRNase不含の0.5mLマイクロチューブ内に、65μLの濾過ゲルを分取する。1か月以内に濾過ゲルを使用する。
ステップ2−ゲル−染色液混合物を調製する:RNA6000ナノ色素濃縮液を10秒間ボルテックスして、スピンダウンする。1μLのRNA6000ナノ色素濃縮物を、65μLアリコートの濾過ゲルに添加する。チューブの蓋を閉め、ボルテックスを徹底的に行い、ゲルと色素とが適正に混合されたことを目視で検査する。チューブを室温、13,000×gで10分間スピンする。調製したゲル−色素混合物を1日以内に使用する。ゲル−色素混合物は、使用前の都度、常に13,000×gで10分間、再スピンする。
ステップ3−ゲル−色素混合物をロードする:ゲル−色素混合物をロードする前に、チッププライミングステーションの底板が位置(C)にあり、かつ調整チップが最上部の位置にセットされていることを確認する。チッププライミングステーションの上に、新しいRNA6000ナノチップをおく。白抜きGウェルの底に、9μLのゲル−色素混合物をピペットで量り入れる。タイマーを30秒にセットし、プランジャーが1mLに位置していることを確認し、次いで、チッププライミングステーションを閉める。プライミングステーションが正しく閉まった時に、ラッチのロックをクリックすることになる。クリップで固定されるまで、シリンジのプランジャーを押し下げる。正確に30秒待ち、次いで、クリップ解放機構を用いてプランジャーを解放する。5秒間待ち、次いで、プランジャーをゆっくりと1mLの位置に引き戻す。チッププライミングステーションをゆっくりと開く。2つのGウェルのそれぞれに9μLのゲル−色素混合物をピペットで量り入れる。
ステップ4−Agilent RNA 6000ナノマーカーをロードする:5μLのRNA6000ナノマーカーを、ラダー記号で標示されたウェルおよび12個の各試料ウェルにピペットで量り入れる。
ステップ5−ラダーおよび試料をロードする:使用前に、ラダーのアリコートおよびRNA試料を解凍し、氷上に保つ。二次構造を最小限にするために、チップ上にロードする前に試料を熱変性する(70℃、2分)。ラダー記号で標示されたウェル内に、1μLの調製ラダーをピペットで量り入れる。12個の各試料ウェルの中に、1μLの各試料をピペットで量り入れる。非使用の各試料ウェルに、1μLのRNA600Nanoマーカーをピペットで量り入れる。IKAボルテックスミキサーのアダプターに、チップを水平に設置し、2400rpmで1分間ボルテックスする。5分以内に、チップをAgilent2100バイオアナライザーにてランする。
ステップ6−チップの解析を開始する:Instrumentコンテキストでは、Assayメニューから適切なアッセイを選択し(例えば、Assay RNA eulkaryote)、COM Port 1を選択する。現段階のFile Prefixを承認するか、または修正する。この接頭辞を使用した名称を有するファイルに、データが自動的にセーブされることになる。この時に、ファイルの保存場所および解析予定の試料数をカスタマイズすることができる。ウィンドウの上部右のStartボタンをクリックして、チップのランを開始する。試料名やコメントなどの試料情報を入れるために、青で強調表示されたData Fileリンクを選択するか、またはAssayコンテキストへ進んでChip Summaryタブを選択する。試料名の表を記入する。チップのランが終了した後、直ちにチップをレセプタクルから除く。
8.3.4.逆転写
反応チューブを調製する前に、high capacity RNA to cDNA kit(Applied Biosystems、カタログ番号4387406)を使用して、RT反応混合物を調製する。RT反応混合物を氷上で調製するために(20μLの反応物当たり):(1)キットの構成物を氷上で解凍し、(2)表2に示すように、必要な数の反応物を調製するのに要する構成物の体積を計算する。
反応チューブを調製する前に、high capacity RNA to cDNA kit(Applied Biosystems、カタログ番号4387406)を使用して、RT反応混合物を調製する。RT反応混合物を氷上で調製するために(20μLの反応物当たり):(1)キットの構成物を氷上で解凍し、(2)表2に示すように、必要な数の反応物を調製するのに要する構成物の体積を計算する。
20μLのRT反応混合物をチューブ内に分注する。チューブを密閉して、230×gで1分間、遠心分離する。RT反応を実施するために、サーマルサイクラーを以下のようにプログラムする:37℃→60分;95℃→5分;12℃→∞。
8.3.5.定量的遺伝子発現アッセイ(リアルタイムPCR)
ステップ1−cDNA試料を調製する:Ribopure Ambion(登録商標)RNA isolation kit(Applied Biosystems、AM1924)を使用して、総RNAを単離し、1.5μLの試料を用いて、Nanodrop分光器によってRNA濃度を決定する(8.3.2節を参照のこと)。High Capacity RNA to cDNA Kit(AppliedBiosystems、PN4387406)を使用して、逆転写(RT)を実施する(8.3.4節を参照のこと)。直ちにPCRに進めない場合には、cDNA試料を−20℃で保存する。
ステップ1−cDNA試料を調製する:Ribopure Ambion(登録商標)RNA isolation kit(Applied Biosystems、AM1924)を使用して、総RNAを単離し、1.5μLの試料を用いて、Nanodrop分光器によってRNA濃度を決定する(8.3.2節を参照のこと)。High Capacity RNA to cDNA Kit(AppliedBiosystems、PN4387406)を使用して、逆転写(RT)を実施する(8.3.4節を参照のこと)。直ちにPCRに進めない場合には、cDNA試料を−20℃で保存する。
ステップ2−PCR反応混合物を調製する:全ての試料について同量のcDNAを使用する(0.5または1μgのRNAにつき20μLのRT反応物のうち4μL)。各試料(3連でランすることになる)につき、以下をヌクレアーゼ不含の1.5−mLマイクロチューブ内にサンプリングする(さらに2試料分の体積を添加して、PCR反応混合物の終体積を算出する):2×TaqMan(登録商標)Gene Expression Master Mix:10μL;20×TaqMan(登録商標)Gene Expression Assay:1μL;ヌクレアーゼ不含H2O:5μL。チューブの蓋を閉め、何回か転倒して反応構成物を混合する。チューブを少しの間遠心分離する。
ステップ3−プレートを装填する:4μLのcDNAを96ウェル反応プレートの各ウェル内に入れ、ウェル当たり16μLのPCR反応混合液を移すが、この2つの堆積物についてプレートの方向を変えることによってそれらを行う(4μLのH2Oを含む1ウェルを各遺伝子に用いるブランクとすることを見越す)。プレートを適切なカバーで密閉する。プレートを少しの間遠心分離する(230×gを1分)。プレートをStepOnePlus Real Time PCRシステム内に装填する。
ステップ4−プレートをランする:ランに用いる実験/プレートドキュメントを作成する。プレートをランする。プログラム:(a)95℃→10分、(b)95℃→15秒、(c)60℃→1分で、(b)および(c)を40サイクル。
8.3.6.放射活性コレステロール流出試験
1日目−細胞培養:ATCC(N°TIB−67)から入手したJ774マクロファージを、10%FBS(ウシ胎児血清、Invitrogen)、100ユニット/mL ペニシリンG(Invitrogen)、および100ユニット/mL ストレプトマイシン(Invitrogen)を補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、37℃、5%CO2で増殖させた。細胞を24ウェルプレート(Falcon)に40,000個/ウェルで播種し、2mLのDMEM10%FBS中で32時間増殖させた。LDL酸化:Slide−A−Lyzer(商標)Mini Dialysis Units 7000MWCO(Pierce)中で、1mLのLDLを、4LのPBSに対して透析した(2回、各回12時間)。
1日目−細胞培養:ATCC(N°TIB−67)から入手したJ774マクロファージを、10%FBS(ウシ胎児血清、Invitrogen)、100ユニット/mL ペニシリンG(Invitrogen)、および100ユニット/mL ストレプトマイシン(Invitrogen)を補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、37℃、5%CO2で増殖させた。細胞を24ウェルプレート(Falcon)に40,000個/ウェルで播種し、2mLのDMEM10%FBS中で32時間増殖させた。LDL酸化:Slide−A−Lyzer(商標)Mini Dialysis Units 7000MWCO(Pierce)中で、1mLのLDLを、4LのPBSに対して透析した(2回、各回12時間)。
2日目−LDL酸化:[1]透析後、アルブミン(#23209、ThermoScientific)を標品として使用し、Coomassieプロテインアッセイ(#1856209、ThermoScientific)を用いて、タンパク質−LDLを定量する。吸光度は、Glomaxマルチディテクションシステム(Promega)を用いて、600nmで読み取る。PBS−透析したLDL(2mg/mL)を、CuSO4(終濃度5μΜ)(C8027、Sigma Aldrich)を使用して37℃で4時間、酸化した。反応は、EDTA(終濃度100μΜ)(#20302.236、Prolablo)を添加することによって停止した。酸化LDLを1LのPBSに対し0.5時間で2回、透析した。透析後、[1]と同じ方法によって、タンパク質−LDLを定量する。細胞培養:酸化LDL(50μL、12.5μg)を、DMEM2.5%FBS中で[3H]コレステロール(1μCi、Perkin Elmer)と15分間混合する。放射標識LDLを、450μLのDMEM2.5%FBS中で24時間、J744細胞に添加する。
3日目−細胞培養:放射活性培地を除去し、細胞を1mLのDMEM(FBS不含)で3回洗浄し、アゴニストLXR(1μΜ)の共存下または不在下で、一晩インキュベートする。
4日目−コレステロール流出アッセイ:流出は、250μLのFBS不含のDMEM中で種々のアクセプターを6時間(または1から24時間の間の種々の時間)添加することによって誘導する。放射活性は、培地(0.25mL)をSuperMix(0.75mL)(1200−439、Perkin−Elmer)に添加して、24ウェルフレキシブルマイクロプレート(1450−402、Perkin−Elmer)内で混合することによって測定し、放射活性は、MicroBeta(登録商標)Triluxを用いて測定した(2分の計測時間)。細胞内[3H]コレステロールは、0.2mLのヘキサン−イソプロパノール(3:2)(0.5時間のインキュベーション)によって抽出し、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。
8.3.7.膜/サイトゾル分離
超遠心分離を用いない膜/サイトゾル分離:細胞ペレット(6ウェルプレートのうち2ウェル)は、200μLの溶解緩衝液に再懸濁し、また、組織試料(50〜100mg)は、1mLの溶解緩衝液に再懸濁する。組織試料は、Turrax(登録商標)を用いてホモジナイズし、細胞ペレットは、Digital Sonifier(登録商標)BRANSONを使用して、30%の振幅かつ10秒を2回、超音波処理することによってホモジナイズする。4℃、800×gで5分間、遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、4℃、13,000×gで30分、遠心分離し、上清(サイトゾル画分)を取っておく。ペレットを100〜200μLの溶解緩衝液(1.2%TritonX100を補ったもの)に再懸濁する。強い振盪下に15分間おく。14,000×gで5分間遠心分離し、上清(可溶化膜タンパク質画分)を取っておく。
超遠心分離を用いない膜/サイトゾル分離:細胞ペレット(6ウェルプレートのうち2ウェル)は、200μLの溶解緩衝液に再懸濁し、また、組織試料(50〜100mg)は、1mLの溶解緩衝液に再懸濁する。組織試料は、Turrax(登録商標)を用いてホモジナイズし、細胞ペレットは、Digital Sonifier(登録商標)BRANSONを使用して、30%の振幅かつ10秒を2回、超音波処理することによってホモジナイズする。4℃、800×gで5分間、遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、4℃、13,000×gで30分、遠心分離し、上清(サイトゾル画分)を取っておく。ペレットを100〜200μLの溶解緩衝液(1.2%TritonX100を補ったもの)に再懸濁する。強い振盪下に15分間おく。14,000×gで5分間遠心分離し、上清(可溶化膜タンパク質画分)を取っておく。
超遠心分離を用いた膜/サイトゾル分離:細胞ペレット(6ウェルプレートのうち2ウェル)または組織試料(50〜100mg)は、1mLの溶解緩衝液に再懸濁する。組織試料は、Turrax(登録商標)を用いてホモジナイズし、細胞ペレットは、Digital Sonifier(登録商標)BRANSONを使用して、30%の振幅かつ10秒で2回、超音波処理することによってホモジナイズする。4℃、800×gで5分間、遠心分離する。上清を超遠心分離用チューブに移し、8℃、100,000×g(38,500rpm)(ローターTi70)で1時間、遠心分離し、上清(サイトゾル画分)を取っておく。ペレットを100〜200μLの溶解緩衝液(表3)(1.2%TritonX100を補ったもの)に再懸濁する。強い振盪下に15分間おく。14,000×gで5分間遠心分離し、上清(可溶化膜タンパク質画分)を取っておく。
8.4.遺伝子調節試験A〜Pの結果
8.4.1.試験A:CER−001、HDL3およびApoA−IによるJ774のABCA1遺伝子の調節−用量応答性(25、250および1000μg/mL)
この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるABCA1遺伝子の発現を調べた。J774を、6×ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3(凍結ストック溶液由来)およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1遺伝子の発現は、TaqmanプローブMm00442646.m1を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
8.4.1.試験A:CER−001、HDL3およびApoA−IによるJ774のABCA1遺伝子の調節−用量応答性(25、250および1000μg/mL)
この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるABCA1遺伝子の発現を調べた。J774を、6×ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3(凍結ストック溶液由来)およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1遺伝子の発現は、TaqmanプローブMm00442646.m1を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
6時間のインキュベーションの後、ApoA−Iは、実験で使用された用量について、ABCA1の発現を変化させなかった。CER−001は、全ての用量でABCA1のmRNAを低下させた。そして、HDL3は、25μg/mLの用量で、ABCA1のmRNA濃度に影響を及ぼさなかった(図7)。
8.4.2.試験B:CER−001、HDL3およびApoA−IによるJ774のABCG1遺伝子の調節−用量応答性(25、250および1000μg/mL)
この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるABCG1遺伝子の発現を調べた。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3(凍結ストック溶液由来)およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)を、マクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1遺伝子の発現は、TaqmanプローブMm00437390.m1を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるABCG1遺伝子の発現を調べた。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3(凍結ストック溶液由来)およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)を、マクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1遺伝子の発現は、TaqmanプローブMm00437390.m1を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
ApoA−Iは、実験で使用された用量について、ABCG1の発現を変化させなかった。CER−001は、全ての用量でABCG1のmRNAを低下させた。そして、HDL3は、25μg/mLの用量で、ABCG1のmRNA濃度に影響を及ぼさなかった(図8)。
8.4.3.試験C:CER−001、HDL3およびApoA−IによるJ774のSR−BI遺伝子の調節−用量応答性(25、250および1000μg/mL)
この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるSR−BI遺伝子の発現を調べた。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3(凍結ストック溶液由来)およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)を、マクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SR−BI遺伝子の発現は、TaqmanプローブMm00450234.m1を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるSR−BI遺伝子の発現を調べた。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3(凍結ストック溶液由来)およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)を、マクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SR−BI遺伝子の発現は、TaqmanプローブMm00450234.m1を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
全ての用量で種々の処置について、SR−BI遺伝子の発現には有意な変化は観察されなかった(図9)。
8.4.4.試験D:CER−001、HDL3およびApoA−IによるJ774の他の遺伝子の調節−用量応答性(25、250および1000μg/mL)
ABCA1、ABCG1およびSR−BIを発現する遺伝子のmRNAの調節は、LXR、SREBP1およびSREBP2のような核タンパク質と連鎖する。この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるLXR、SREBP1およびSREBP2遺伝子のmRNAレベルを調べる。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SREBP−1、SREBP−2およびLXR遺伝子の発現レベルは、Taqmanプローブ(それぞれMm01138344.m1、Mm01306292.m1、Mm00443451.m1)を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
ABCA1、ABCG1およびSR−BIを発現する遺伝子のmRNAの調節は、LXR、SREBP1およびSREBP2のような核タンパク質と連鎖する。この試験では、種々の濃度のCER−001、HDL3およびApoA−Iについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ(J774)におけるLXR、SREBP1およびSREBP2遺伝子のmRNAレベルを調べる。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロールを使用せずに酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3およびApoA−I(25、250および1000μg/mL)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した(条件当たり1ウェル)。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SREBP−1、SREBP−2およびLXR遺伝子の発現レベルは、Taqmanプローブ(それぞれMm01138344.m1、Mm01306292.m1、Mm00443451.m1)を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
ApoA−Iを用いた種々の処置について、SREBP−1、SREBP−2およびLXR遺伝子の発現には有意な変化が観察されなかった。CER−001およびHDL3は、種々の用量について、SREBP−1のmRNAレベルにのみ影響を及ぼし(図10)、一方で、SREBP−2およびLXRは変化しなかった(それぞれ図11および図12)。
8.4.5.試験E:マウスJ774マクロファージにおけるABCA1、ABCG1およびSR−BIの発現を調節するためのCER−001およびHDL3のEC50の決定
この試験では、ABCA1、ABCG1およびSR−BIの遺伝子発現の調節に必要なApoA−I、CER−001またはHDL3の最小有効濃度を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3およびApoA−I(0.25、2.5、7.5、25および250μg/mL)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SR−BI遺伝子(TaqmanプローブMm00450234.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、SREBP1(TaqmanプローブMm01138344.m1)およびABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)であった。
この試験では、ABCA1、ABCG1およびSR−BIの遺伝子発現の調節に必要なApoA−I、CER−001またはHDL3の最小有効濃度を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3およびApoA−I(0.25、2.5、7.5、25および250μg/mL)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SR−BI遺伝子(TaqmanプローブMm00450234.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、SREBP1(TaqmanプローブMm01138344.m1)およびABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)であった。
ApoA−Iは、供試した遺伝子のmRNAレベルを変化させなかった(図13)。ABCA1レベルの半分を減じるためのCER−001の用量は、おおよそ7.5μg/mLであり、HDL3については25μg/mLである(図13)。ABCG1については、mRNAレベルを半分に低下させるためにCER−001およびHDL3で75g/mLを超える用量が必要である(図14)。SREBP1については、CER−001では2.5μg/mLを超える濃度で、HDL3では25μg/mLで、低下およびプラトーが観察された(図15)。SR−BIレベルは、種々の処置によって影響を及ぼされなかった(図16)。
8.4.6.試験F:CER−001およびHDL3による、マウスJ774マクロファージにおけるABCA1 mRNAの調節に関する反応速度論
この試験では、J774マクロファージにおけるABCA1のmRNAレベルの低下に関する反応速度論を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3およびApoA−I(25および250μg/mL)を種々の時点でマクロファージ上に添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)であった。
この試験では、J774マクロファージにおけるABCA1のmRNAレベルの低下に関する反応速度論を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。CER−001、HDL3およびApoA−I(25および250μg/mL)を種々の時点でマクロファージ上に添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)であった。
CER−001(25または250μg/mL)は、4時間で、ABCA1のmRNAレベルの半分を低下させることができた。HDL3(250μg/mL)(何度か解凍/凍結された)の挙動は、ダウンレギュレーションが25μg/mLのHDL3で観察されなかったことを除いて、CER−001と同様である。先に報告したように、ApoA−Iは、25μg/mLと250μg/mLとのどちらの濃度でもmRNAのABCA1レベルを低下させなかった。ABCA1のmRNAの増加は、ApoA−I処置を用いて2時間および4時間に観察された(図17)。
8.4.7.試験G:CER−001、HDL3およびApoA−Iの存在下でABCA1およびABCG1のmRNAレベルの調節に及ぼすcAMPの効果
この試験では、cAMPを用いた処置後のJ774マクロファージにおける、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルに及ぼすCER−001、HDL3またはApoA−Iの効果を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。翌日、培地をDMEM+/−cAMP(300μΜ)で置換した。cAMPの存在/不在下で一晩インキュベーションした後、培地を除去し、CER−001またはHDL3またはApoA−I(250μg/mL)と混合したDMEMを用いて6時間置換し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)およびABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、cAMPを用いた処置後のJ774マクロファージにおける、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルに及ぼすCER−001、HDL3またはApoA−Iの効果を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。翌日、培地をDMEM+/−cAMP(300μΜ)で置換した。cAMPの存在/不在下で一晩インキュベーションした後、培地を除去し、CER−001またはHDL3またはApoA−I(250μg/mL)と混合したDMEMを用いて6時間置換し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)およびABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
cAMPの存在下で、ABCA1のmRNAレベルの増加が観察された(図18)。CER−001またはHDL3(250μg/mL)の存在下では、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルが低下し、一方で、ApoA−Iは変わらなかった。cAMPの存在下では、ABCA1およびABCG1の濃度は、細胞をCER−001またはHDL3とインキュベートした時にRQ=1に戻ったが、ABCA1の刺激(RQ=5〜6)には届かなかった(図18および図19)。ApoA−IおよびcAMPの存在下では、ABCA1のmRNAレベル(RQ≒3)は、ApoA−I単独と比較して増加したが、DMEM+cAMP(RQ≒6)と同じレベルではなかった。
8.4.8.試験H:CER−001およびHDL3の存在下でのJ774マクロファージにおけるABCA1タンパク質レベルの調節に及ぼす効果
この試験では、J774マクロファージにおけるABCA1のタンパク質レベルに及ぼすCER−001およびHDL3の効果を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。翌日、培地をDMEMで置換した。一晩平衡化した後、培地を除去し、CER−001またはHDL3(250μg/mL)と混合したDMEMを用いて6時間置換し、細胞を溶解し、8.3.7節の方法に従って膜を分離した。サイトゾルおよび膜のタンパク質を10%SDS PAGE上で分解し、ABCA1(ab7360−希釈率1/1000)に対しプローブ化した。imageJ(登録商標)ソフトウェアを使用して、タンパク質レベルを定量した。
この試験では、J774マクロファージにおけるABCA1のタンパク質レベルに及ぼすCER−001およびHDL3の効果を調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。翌日、培地をDMEMで置換した。一晩平衡化した後、培地を除去し、CER−001またはHDL3(250μg/mL)と混合したDMEMを用いて6時間置換し、細胞を溶解し、8.3.7節の方法に従って膜を分離した。サイトゾルおよび膜のタンパク質を10%SDS PAGE上で分解し、ABCA1(ab7360−希釈率1/1000)に対しプローブ化した。imageJ(登録商標)ソフトウェアを使用して、タンパク質レベルを定量した。
CER−001およびHDL3を用いて処置されたマクロファージについて、ABCA1タンパク質レベルの有意な低下が観察された(図20および図21)。ApoA−Iは、ABCA1のレベルに影響を及ぼさず、cAMPの添加は、このレベルを大きく増加させた。CER−001およびHDL3を250μg/mLで6時間、J774マクロファージに添加することによって、ABCA1のmRNAおよびタンパク質レベルが減少した。
8.4.9.試験I:CER−001の濃度の増加の存在下でABCA1およびABCG1のmRNAレベルの調節に及ぼすcAMPの効果
この試験では、cAMPを用いた処置後のABCA1およびABCG1のmRNAレベルに及ぼすCER−001の濃度の増加の効果を調べる。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。翌日、培地をDMEM+/−cAMP(300μΜ)で置換した。cAMPの存在/不在下で一晩インキュベーションした後、培地を除去し、種々の濃度(0、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、15および30μg/mL)でCER−001と混合したDMEMを用いて6時間置換し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)およびABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、cAMPを用いた処置後のABCA1およびABCG1のmRNAレベルに及ぼすCER−001の濃度の増加の効果を調べる。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。翌日、培地をDMEM+/−cAMP(300μΜ)で置換した。cAMPの存在/不在下で一晩インキュベーションした後、培地を除去し、種々の濃度(0、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、15および30μg/mL)でCER−001と混合したDMEMを用いて6時間置換し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)およびABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
cAMPの存在下では、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルについて増加が観察された(図22、図23、図24、図25および図26)。ABCA1およびABCG1のmRNAレベルの低下は、4〜6μg/mLの用量で観察され、最大でおおよそ15μg/mLであった。cAMPの存在下でも不在下でもプロファイルが同様であったことから、cAMPの活性化によって、ABCA1のレベルを低下させるのに充分なCER−001の用量は変化しなかった(図26)。
8.4.10.試験J:CER−001およびHDL3を用いた処置後のABCA1およびABCG1のmRNAの正常量への戻り
この試験では、CER−001およびHDL3を用いた処置後に、ABCA1およびABCGIのmRNAの正常量に戻るために必要な時間を調べた。J774を、6ウェルプレート(600,000個/ウェル)でDMEM10%FCSに播種した。翌日、培地を血清不含のDMEMで置換し、CER−001、HDL3またはApoA−I(250μg/mL)を用いて24時間処置した。培地を除去し、マクロファージをDMEMで洗浄した。CER−001、HDL3またはApoA−Iを除去した後の種々の時点(0、1、2、4、8および24時間)で、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って細胞RNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)およびSR−BI(TaqmanプローブMm00450234.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、CER−001およびHDL3を用いた処置後に、ABCA1およびABCGIのmRNAの正常量に戻るために必要な時間を調べた。J774を、6ウェルプレート(600,000個/ウェル)でDMEM10%FCSに播種した。翌日、培地を血清不含のDMEMで置換し、CER−001、HDL3またはApoA−I(250μg/mL)を用いて24時間処置した。培地を除去し、マクロファージをDMEMで洗浄した。CER−001、HDL3またはApoA−Iを除去した後の種々の時点(0、1、2、4、8および24時間)で、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って細胞RNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)およびSR−BI(TaqmanプローブMm00450234.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
CER−001およびHDL3の処置後に、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルの低下が観察された。ApoA−Iは、これらのmRNAのレベルに影響を及ぼさず、CER−001およびHDL3は、SR−BIのmRNAレベルを変化させなかった(図27、図28および図29)。CER−001処置後、ABCA1のmRNAレベルは、8時間超でベースラインに戻り、ABCG1では、ベースラインに8時間で届いたために戻りがさらに早かった。HDL3処置後では、ABCA1のmRNAレベルは、およそ8時間でベースラインに戻り、ABCG1では、2時間から4時間が必要であった。CER−001処置とHDL3処置との間に観察された違いは、恐らくCER−001の存在下ではmRNAがさらに低いレベルであることに起因する。ApoA−Iの除去によって、種々の時点(ABCA1については1時間、およびABCG1については4時間)で、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルの増加が誘導された。CTは、対照、すなわちCER−001、HDL3またはApoA−Iを添加されることなく増殖したJ774マクロファージを表す。
8.4.11.試験K:CER−001およびHDL3によるABCA1およびSR−BIのmRNAの調節についてのマクロファージの特異性−肝細胞(マウスおよびヒト)への効果
この試験では、マウスおよびヒト肝細胞におけるABCA1およびSR−BIのmRNAレベルに及ぼすCER−001およびHDL3(25g/mLでの)の効果を調べた。HepG2(ヒト肝細胞)およびHepa1−6(マウス肝細胞)を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)にDMEM10%FCS中で播種した。3日後、CER−001、HDL3およびApoA−I(DMEM中0.25、25および250μg/mL)を肝細胞に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(それぞれHepG2およびHepa1−6に用いるためのTaqmanプローブHs01059118.m1およびMm00442646.m1)ならびにSR−BI(それぞれHepG2およびHepa1−6に用いるためのTaqmanプローブHs00969821.m1およびMm00450234.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、Hepa1−6にはHPRT1(TaqmanプローブMm00446968.m1)であり、HepG2細胞にはGAPDH(Taqmanプローブ:Hs03929097.g1)である。
この試験では、マウスおよびヒト肝細胞におけるABCA1およびSR−BIのmRNAレベルに及ぼすCER−001およびHDL3(25g/mLでの)の効果を調べた。HepG2(ヒト肝細胞)およびHepa1−6(マウス肝細胞)を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)にDMEM10%FCS中で播種した。3日後、CER−001、HDL3およびApoA−I(DMEM中0.25、25および250μg/mL)を肝細胞に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(それぞれHepG2およびHepa1−6に用いるためのTaqmanプローブHs01059118.m1およびMm00442646.m1)ならびにSR−BI(それぞれHepG2およびHepa1−6に用いるためのTaqmanプローブHs00969821.m1およびMm00450234.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、Hepa1−6にはHPRT1(TaqmanプローブMm00446968.m1)であり、HepG2細胞にはGAPDH(Taqmanプローブ:Hs03929097.g1)である。
ヒト肝細胞では、CER−001、HDL3およびApoA−Iの処置について、ABCA1およびSR−BIのmRNAレベルの有意な低下は観察されなかった(図30および図31)。マウス肝細胞では、250μg/mLでのCER−001およびHDL3の処置について、ABCA1のmRNAレベルに2分の1への低下が観察された(図32および図33)。ApoA−Iを用いた250μg/mLでの処置によって、マウス肝細胞で、ABCA1のmRNAレベルが25%低下した。
8.4.12.試験L:CER−001およびHDL3によるABCA1のダウンレギュレーション後のApoA−I添加の結果
この試験では、CER−001およびHDL3によるABCA1およびABCG1のダウンレギュレーション後の遺伝子発現に及ぼすApoA−I添加の効果を調べた。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)にMEM2.5%FCS中で播種した。平衡化した後(DMEM)、CER−001、HDL3およびApoA−Iを250μg/mLで一晩添加する。翌日、培地を、ApoA−I(25または250μg/mL)を補うか補わない新鮮なDMEMに置換して、ApoA−Iコレステロール流出を2時間開始させた。実験を種々の時点で停止させた:1)J774をApoA−Iの添加前に停止、2)J774+DMEM(2時間の受動流出)、3)J774+ApoA−I(25μg/mL)を2時間、および4)J774+ApoA−I(250μg/mL)を2時間。RNAは、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、およびSR−Bl(TaqmanプローブMm00450234.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、CER−001およびHDL3によるABCA1およびABCG1のダウンレギュレーション後の遺伝子発現に及ぼすApoA−I添加の効果を調べた。J774を、6ウェルプレート(300,000個/ウェル)にMEM2.5%FCS中で播種した。平衡化した後(DMEM)、CER−001、HDL3およびApoA−Iを250μg/mLで一晩添加する。翌日、培地を、ApoA−I(25または250μg/mL)を補うか補わない新鮮なDMEMに置換して、ApoA−Iコレステロール流出を2時間開始させた。実験を種々の時点で停止させた:1)J774をApoA−Iの添加前に停止、2)J774+DMEM(2時間の受動流出)、3)J774+ApoA−I(25μg/mL)を2時間、および4)J774+ApoA−I(250μg/mL)を2時間。RNAは、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、およびSR−Bl(TaqmanプローブMm00450234.m1)の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
250μg/mLでApoA−Iを添加することによって、2時間後にABCA1のmRNAレベルが増加した(DMEM条件−4番目のバー)(図34)。6時間でレベルがベースラインに戻ったことから、この増加は一過的であった(実験Fを参照)。CER−001またはHDL3の添加によって、ABCA1のmRNAレベルは大きく低下した(黒いバー)。リポタンパク質の除去から2時間後、ABCA1のmRNAレベルは、以前の結果通りに増加しており(実験1を参照)、この増加は、ApoA−Iを250μg/mLで添加することによって促進された。250μg/mLのApoA−Iとのマクロファージのプレインキュベーションによって、ABCA1のmRNAレベルは変化しなかった。また、DMEM+250μg/mL ApoA−Iによる顕著な刺激が、250μg/mL ApoA−Iとのプレインキュベーションを伴う条件でも観察された。種々の条件で、ABCG1のmRNAの調節について、同様のプロファイルが観察された(図35)。SR−BIのmRNAは、HDL3の存在下で増加したが、他の条件では増加しなかった(図36)。供試した種々の条件で、ApoA−Iの添加により、SR−BIのmRNAレベルは変化しなかった。
8.4.13.試験M:HDL2によるJ774マクロファージにおけるABCA1、ABCG1およびSR−BIのmRNAの細胞レベルの調節
この試験では、マウスマクロファージにおけるABCA1、ABCG1およびSR−BIのmRNAレベルに及ぼすHDL2の効果を調べた。HDL2は、HDL3と比較してさらに大きく、かつさらに成熟したリポタンパク質であり、HDL2は、ABCG1と相互作用し、HDL3は、ABCA1と相互作用する。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。HDL2(2.5から1000μg/mLまで)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、およびSR−Bl(TaqmanプローブMm00450234.m1)の遺伝子発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。実験に使用したHDL2は、新たにPBS溶液に対し透析したものである。
この試験では、マウスマクロファージにおけるABCA1、ABCG1およびSR−BIのmRNAレベルに及ぼすHDL2の効果を調べた。HDL2は、HDL3と比較してさらに大きく、かつさらに成熟したリポタンパク質であり、HDL2は、ABCG1と相互作用し、HDL3は、ABCA1と相互作用する。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、酸化LDLをロードした。HDL2(2.5から1000μg/mLまで)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、およびSR−Bl(TaqmanプローブMm00450234.m1)の遺伝子発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。実験に使用したHDL2は、新たにPBS溶液に対し透析したものである。
75μg/mLを超えるHDL2処置について、マウスマクロファージにおけるABCA1およびABCG1のmRNAレベルの有意な低下が観察された(図37および図38)。SR−BIのmRNAレベルは、75μg/mLを超えるHDL2濃度について増加し始めた。(図39)。
8.4.14.試験N:シクロデキストリンによるJ774マクロファージにおけるABCA1、ABCG1およびSR−BIのmRNAの細胞レベルの調節−シクロデキストリン存在下におけるコレステロール流出の決定
この試験は、細胞内コレステロール濃度が、CER−001およびHDL3を用いて観察されるマウスJ774マクロファージにおけるABCA1およびABCG1のダウンレギュレーションに関与しうるか否かを、β−シクロデキストリンを使用して調べた。β−シクロデキストリンは、環状のオリゴ糖であり、ステロールに高特異的に水に溶解することができるため、細胞からコレステロールを流出させることが可能である。J774を24ウェルプレート(60,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロール酸化LDLをDMEM2.5%FCSにロードした。24時間の平衡化の後(DMEM)、β−シクロデキストリン(0.03、0.1、0.3、1、3、10および30mM)を6時間添加した。流出率は、8.3.6節のプロトコールを使用してアッセイし、以下のように決定した:培地DPM/(培地DPM+細胞DPM)*100。30mMの用量は、毒性を有し、細胞集団の半分を死滅させたため、最終的なグラフには表示されていない。
この試験は、細胞内コレステロール濃度が、CER−001およびHDL3を用いて観察されるマウスJ774マクロファージにおけるABCA1およびABCG1のダウンレギュレーションに関与しうるか否かを、β−シクロデキストリンを使用して調べた。β−シクロデキストリンは、環状のオリゴ糖であり、ステロールに高特異的に水に溶解することができるため、細胞からコレステロールを流出させることが可能である。J774を24ウェルプレート(60,000個/ウェル)に播種し、3H−コレステロール酸化LDLをDMEM2.5%FCSにロードした。24時間の平衡化の後(DMEM)、β−シクロデキストリン(0.03、0.1、0.3、1、3、10および30mM)を6時間添加した。流出率は、8.3.6節のプロトコールを使用してアッセイし、以下のように決定した:培地DPM/(培地DPM+細胞DPM)*100。30mMの用量は、毒性を有し、細胞集団の半分を死滅させたため、最終的なグラフには表示されていない。
β−シクロデキストリンによるコレステロール流出について用量依存的な増加が観察された(図40)。
8.4.15.試験O:シクロデキストリンによるJ774マクロファージにおけるABCA1、ABCG1およびSR−BIのmRNAの細胞レベルの調節−遺伝子発現の決定
この試験では、細胞内コレステロール濃度が、CER−001およびHDL3を用いて観察されるマウスJ774マクロファージにおけるABCA1およびABCG1のダウンレギュレーションに関与しうるか否かを、β−シクロデキストリンを使用して調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、β−シクロデキストリン(0.03、0.1、0.3、1、3、10および30mM)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)、および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、およびSR−BI(TaqmanプローブMm00450234.m1)の遺伝子発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、細胞内コレステロール濃度が、CER−001およびHDL3を用いて観察されるマウスJ774マクロファージにおけるABCA1およびABCG1のダウンレギュレーションに関与しうるか否かを、β−シクロデキストリンを使用して調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、β−シクロデキストリン(0.03、0.1、0.3、1、3、10および30mM)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)、および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ABCA1(TaqmanプローブMm00442646.m1)、ABCG1(TaqmanプローブMm00437390.m1)、およびSR−BI(TaqmanプローブMm00450234.m1)の遺伝子発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
β−シクロデキストリンの存在下において、ABCA1およびABCG1のmRNAレベルについてのJ774における用量依存的な低下が観察された(図41および図42)。対照的に、SR−BIは、β−シクロデキストリンにより用量依存的な増加を示した(図44)。
8.4.16.試験P:シクロデキストリンによるJ774マクロファージにおけるSREBP1、SREBP2およびLXRのmRNAの細胞レベルの調節−遺伝子発現の決定
この試験では、J774マクロファージでのLXR、SREBP1およびSREBP2のmRNA発現に及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を、β−シクロデキストリンを使用して調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、β−シクロデキストリン(0.03、0.1、0.3、1、3、10および30mM)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)、および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SREBP−1、SREBP−2およびLXRの遺伝子発現は、Taqmanプローブ(それぞれMm01138344.m1、Mm01306292.m1、Mm00443451.m1)を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
この試験では、J774マクロファージでのLXR、SREBP1およびSREBP2のmRNA発現に及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を、β−シクロデキストリンを使用して調べた。J774を6ウェルプレート(300,000個/ウェル)に播種し、β−シクロデキストリン(0.03、0.1、0.3、1、3、10および30mM)をマクロファージ上に6時間添加し、RiboPure(商標)キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってRNAを抽出した。遺伝子発現は、8.3.2節(RNA抽出)、8.3.4節(逆転写)、および8.3.5節(qPCR)に記載のプロトコールを使用してアッセイした。SREBP−1、SREBP−2およびLXRの遺伝子発現は、Taqmanプローブ(それぞれMm01138344.m1、Mm01306292.m1、Mm00443451.m1)を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、HPRT1(Taqmanプローブ:Mm00446968.m1)である。
LXRのmRNAについて、β−シクロデキストリンの濃度の増加に伴う有意な変化は観察されなかった(図44)。SREBP−2のmRNAは、最も低い用量のβ−シクロデキストリンで増加し、プラトーに達した(図46)。SREBP−1のmRNAについて(図45)、CER−001およびHDL3処置を用いて観察されたものと同様に、用量依存的な低下が観察された。
9.実施例3:CER−001を用いて処置されたApo−/−マウス流動停止モデルにおけるプラーク退縮の測定
9.1.序論
試験A〜Fの目的は、高脂肪食を摂食させたアポE−/−マウスの結紮された左頸動脈において種々のCER−001濃度がプラーク退縮に及ぼす効能を測定することであった。
9.1.序論
試験A〜Fの目的は、高脂肪食を摂食させたアポE−/−マウスの結紮された左頸動脈において種々のCER−001濃度がプラーク退縮に及ぼす効能を測定することであった。
9.2.材料および方法
9.2.1.概論
これらの試験に使用した材料は、CER−001(Vivaflow 30KDaカセット膜によって濃縮した1109HDL03−2X240913バッチ)および精製ヒトHDL3を含んでいた。実験前に、CER−001およびHDL3の製剤を、少なくとも8アリコート/リポタンパク質濃度(群の注射当たり使用する1アリコート)に分けた。注射前に、1アリコートの製剤を、約37℃の水浴中で5分インキュベートすることによって解凍し、穏やかに旋回させて混合した。製剤は、起泡を防ぐため、攪拌したり勢いよく振盪させたりするべきではない。溶液が濁るか、または目視で粒子が観察された場合には、溶液を約37℃でさらに30分間、水浴中でインキュベートした。
9.2.1.概論
これらの試験に使用した材料は、CER−001(Vivaflow 30KDaカセット膜によって濃縮した1109HDL03−2X240913バッチ)および精製ヒトHDL3を含んでいた。実験前に、CER−001およびHDL3の製剤を、少なくとも8アリコート/リポタンパク質濃度(群の注射当たり使用する1アリコート)に分けた。注射前に、1アリコートの製剤を、約37℃の水浴中で5分インキュベートすることによって解凍し、穏やかに旋回させて混合した。製剤は、起泡を防ぐため、攪拌したり勢いよく振盪させたりするべきではない。溶液が濁るか、または目視で粒子が観察された場合には、溶液を約37℃でさらに30分間、水浴中でインキュベートした。
リン酸緩衝スクロース希釈液(10mMリン酸、4%スクロース、および2%マンニトール、pH=7.4)を調製し、分注し、約−20℃で保存した。プラセボ溶液を種々の濃度のCER−001およびHDL3調製のために使用した。
9.2.2.動物
これらの試験に使用した動物は、C57Bl/6−B6.129P2−Apoetm1Unc/J系統のマウスであった。この系統は、Jackson研究所に由来し、Charles Riverによって分与されている。この種および系統は、コレステロール代謝の研究に用いられる特徴がよく調べられたモデルである。選定基準は以下を含む:体重:21グラム(8週齢)、23グラム(9週齢)および25グラム(12週齢);年齢:食餌および生殖の開始時に8、9および12週;および数:雄、n=125(群当たり12頭のマウス)。
これらの試験に使用した動物は、C57Bl/6−B6.129P2−Apoetm1Unc/J系統のマウスであった。この系統は、Jackson研究所に由来し、Charles Riverによって分与されている。この種および系統は、コレステロール代謝の研究に用いられる特徴がよく調べられたモデルである。選定基準は以下を含む:体重:21グラム(8週齢)、23グラム(9週齢)および25グラム(12週齢);年齢:食餌および生殖の開始時に8、9および12週;および数:雄、n=125(群当たり12頭のマウス)。
動物を、Prolog Biotechの動物施設で、最大12頭/ケージの群ずつ収容した。Prolog Biotechは、フランス獣医局から認証番号A−31−254−01を取得済みである。各ケージでは、動物の幸福に2つのイグルーを追加した。試験を始める前に、動物を5日間順応させた(09/18から09/23まで)。動物は、水および高コレステロール食にアクセスさせた(0.2%コレステロール、39.9%脂肪、14.4%タンパク質、45.7%糖)。全ての動物を、同様に管理し、Prolog Biotechの動物施設で広く運用されていた実践に従って、動物の幸福に充分に配慮した。試験計画は、Prologue Biotech倫理委員会によって受理された(N℃EF−2011−CER−09)。
動物室の条件を以下の通りとした:温度:21±1℃、相対湿度:50±10%、および明期/暗期サイクル:12時間/12時間(07H/19H)。各月に、動物室の条件の報告を編集した。各動物を毎週秤量した。動物は、実験の始めに挿入した耳環によって同定した。
9.2.3.処置
動物を、群当たり12頭ずつ10群に分け、表4に示されるように処置した。
動物を、群当たり12頭ずつ10群に分け、表4に示されるように処置した。
イソフルランで麻酔したマウスの眼窩後方の静脈に、2日に1回で8回、製剤を注射した(50μL/マウス)。投与した用量は、各ケージにおけるマウスの体重の平均に基づいた。化合物は、毎日午前10時に注射した。血液をサンプリングするため、一晩絶食させたマウスから、以下に指示した用量で1回サンプリングした:(1)投与前(午前9時)に眼窩後方からの引き抜きによる:最初の注射の24時間前/外科的処置の日;(2)投与後(午前9時)に眼窩後方からの引き抜きによる:最後の注射から24時間後;および(3)t=0(午前9時)かつ5回目の注射後の指示された時点で尾からの引き抜きによる。血液試料の変化を避けるために、採集後直ちに、血液試料を約+4℃に保った。血液検体を遠心分離し(800×g、10分間、+4℃)、将来的な分析のために血漿を取り置いた。
9.2.4.外科的処置
器官を採集するため、最後の注射の24時間後に、ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物を腹腔内に注射してマウスを麻酔し、動物は2〜3分後に眠りに落ちた。血液を毛管作用によって引き抜き(眼窩後方静脈−およそ200μLの血液)、EDTAを入れたチューブに移した。次いで、腹と胸郭の切開を行った。心臓を右室にてPBSで灌流して、最初の洗浄を行い、必要に応じて、左室でも行った。液体は、胸大動脈によって流すべきものとした。
器官を採集するため、最後の注射の24時間後に、ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物を腹腔内に注射してマウスを麻酔し、動物は2〜3分後に眠りに落ちた。血液を毛管作用によって引き抜き(眼窩後方静脈−およそ200μLの血液)、EDTAを入れたチューブに移した。次いで、腹と胸郭の切開を行った。心臓を右室にてPBSで灌流して、最初の洗浄を行い、必要に応じて、左室でも行った。液体は、胸大動脈によって流すべきものとした。
左右の頸動脈、肝臓、脾臓、および心臓につながる大動脈を取り出し、−80℃で保存した。肝臓を、4つの異なるアリコートに採集した。器官を採集した後、残りの生物学的検体を廃棄した。糞便を採集するため、各群について最後に注射した日に、ケージを新しい敷き藁に交換し、糞便を24時間採集した(屠殺日)。
9.2.5.総血漿コレステロールの決定
実験手順:各チューブにコレステロール標品(2g/L):0/0.625/1.25/1.875/2.5/3.75/5μLを添加する。血漿試料を12,000×gで1分間遠心分離する。種に応じて、表5に示すように、各チューブ内に試料を添加する。0.5mlの再構成緩衝液を各チューブ(標品および試料)に添加し、ボルテックスし、37℃で5分間インキュベートする。各チューブから150μLを、96ウェルプレートのうち2つの異なるウェルに移す。500nMでの吸光度を読み取る。
実験手順:各チューブにコレステロール標品(2g/L):0/0.625/1.25/1.875/2.5/3.75/5μLを添加する。血漿試料を12,000×gで1分間遠心分離する。種に応じて、表5に示すように、各チューブ内に試料を添加する。0.5mlの再構成緩衝液を各チューブ(標品および試料)に添加し、ボルテックスし、37℃で5分間インキュベートする。各チューブから150μLを、96ウェルプレートのうち2つの異なるウェルに移す。500nMでの吸光度を読み取る。
9.2.6.血漿中の非エステル化コレステロールの決定
実験手順:各チューブにコレステロール標品(2g/L):0/0.625/1.25/1.875/2.5/3.75/5μLを添加する。血漿試料を12,000×gで1分間遠心分離する。種に応じて、表6に示すように、各チューブ内に試料を添加する。0.5mlの再構成緩衝液を各チューブ(標品および試料)に添加し、ボルテックスし、37℃で5分インキュベートする。各チューブから150μLを、96ウェルプレートのうち2つの異なるウェルに移す。500nMにおける吸光度を読み取る。
実験手順:各チューブにコレステロール標品(2g/L):0/0.625/1.25/1.875/2.5/3.75/5μLを添加する。血漿試料を12,000×gで1分間遠心分離する。種に応じて、表6に示すように、各チューブ内に試料を添加する。0.5mlの再構成緩衝液を各チューブ(標品および試料)に添加し、ボルテックスし、37℃で5分インキュベートする。各チューブから150μLを、96ウェルプレートのうち2つの異なるウェルに移す。500nMにおける吸光度を読み取る。
9.2.7.RP C18 HPLCによるコレステロールの決定
装置:HPLC(WatersバイナリHPLCポンプ1525、WatersUV/可視検出器2489、Watersサンプルマネージャ2767、Masslynxソフトウェア(4.1)、カラム:RP C18 Zorbax 4.6mm×25cm、粒径10μm(または同等)、アセトニトリルHPLCグレード、無水エタノール、水(milliQ)、無水エタノール中標品コレステロール0.1g/L。
装置:HPLC(WatersバイナリHPLCポンプ1525、WatersUV/可視検出器2489、Watersサンプルマネージャ2767、Masslynxソフトウェア(4.1)、カラム:RP C18 Zorbax 4.6mm×25cm、粒径10μm(または同等)、アセトニトリルHPLCグレード、無水エタノール、水(milliQ)、無水エタノール中標品コレステロール0.1g/L。
クロマトグラフィーのパラメータ:溶離液A:86%アセトニトリル、10%エタノール、4%水;溶離液B:86%アセトニトリル、14%エタノール。使用前に溶離液をソニケーター浴中で5分間超音波処理する。流速:1.5mL/分;圧力:1400PSI;検出:UV214nm;ラン時間:20分;注射:25から100μL;表7に示す勾配プログラム。
試料:9.2.8節の方法に従って、試料を調製する。マイクロバイアル内に50μLのエタノール抽出物を添加し、40μLをHPLC内に注入する。214nmでのピーク面積を決定し、抽出物中の濃度を算出する:[コレステロール試料](μg/μL)=ピーク面積/傾き/注入体積
9.2.8.肝臓からのコレステロールの抽出
ステップ1:約50mgの肝臓を秤量し、ガラスチューブに組織を入れる。3mLのMeOH中で組織をホモジナイズする(Turrax(登録商標))。
ステップ1:約50mgの肝臓を秤量し、ガラスチューブに組織を入れる。3mLのMeOH中で組織をホモジナイズする(Turrax(登録商標))。
EDTA 5mM(2:1)。3mLのクロロホルムおよび3mLのH2Oを添加し、5分間ボルテックスする。1,500×gで10分間遠心分離し、下方の相を採集する。溶液を2つのガラスチューブ(小)に等体積(2x1.3mL)で分割する。
ステップ2:以下のように溶液を処置する。
非エステル化コレステロール:溶液を乾燥する。400μLのEtOHを添加し、試料を可溶化する。
総コレステロール:溶液を乾燥する。1mLの0.5M KOHメタノール溶液を添加する。60℃で少なくとも1時間インキュベートする。1mLのクロロホルムおよび1mLのH2Oを試料に添加し、ボルテックスし、1,500×gで10分間遠心分離し、下方の相を採集することによって、BlighおよびDyerの脂質抽出を実施する。有機相を乾燥する。400μLのEtOHを添加して、試料を可溶化する。
非エステル化コレステロール:溶液を乾燥する。400μLのEtOHを添加し、試料を可溶化する。
総コレステロール:溶液を乾燥する。1mLの0.5M KOHメタノール溶液を添加する。60℃で少なくとも1時間インキュベートする。1mLのクロロホルムおよび1mLのH2Oを試料に添加し、ボルテックスし、1,500×gで10分間遠心分離し、下方の相を採集することによって、BlighおよびDyerの脂質抽出を実施する。有機相を乾燥する。400μLのEtOHを添加して、試料を可溶化する。
9.2.9.頸動脈または大動脈からのコレステロールの抽出
ステップ1:外科用ストラップを取り外して(頸動脈用のみ)、ガラスチューブに組織を入れる。1.8mLのCHCl3/MeOH(2:1)を頸動脈用に、3mLを大動脈用に添加する。4℃で一晩混合する。
ステップ1:外科用ストラップを取り外して(頸動脈用のみ)、ガラスチューブに組織を入れる。1.8mLのCHCl3/MeOH(2:1)を頸動脈用に、3mLを大動脈用に添加する。4℃で一晩混合する。
ステップ2:頸動脈または大動脈を取り出し、乾燥し、秤量する。有機溶液(CHCl3/MeOH)を2つのガラスチューブ(小)に等体積に分ける。溶液を以下のように処置する。
非エステル化コレステロール:溶液を乾燥する。200μLのEtOHを添加し、試料を可溶化する。
総コレステロール:溶液を乾燥する。1mLの0.1M KOHエタノール溶液を添加する。60℃で少なくとも1時間インキュベートする。1mLのクロロホルムおよび1mLのH2Oを試料に添加し、ボルテックスし、1,500×gで10分間遠心分離し、下方の相を採集することによって、BlighおよびDyerの脂質抽出を実施する。有機相を乾燥する。200μLのEtOHを添加して、試料を可溶化する。
非エステル化コレステロール:溶液を乾燥する。200μLのEtOHを添加し、試料を可溶化する。
総コレステロール:溶液を乾燥する。1mLの0.1M KOHエタノール溶液を添加する。60℃で少なくとも1時間インキュベートする。1mLのクロロホルムおよび1mLのH2Oを試料に添加し、ボルテックスし、1,500×gで10分間遠心分離し、下方の相を採集することによって、BlighおよびDyerの脂質抽出を実施する。有機相を乾燥する。200μLのEtOHを添加して、試料を可溶化する。
9.3.In vivoプラーク進行試験A〜Fの結果
9.3.1.試験A:結紮された左頸動脈におけるアテローム動脈硬化性プラークの決定
この試験では、高脂肪食を摂食させたapoE−/−マウス由来の結紮された頸動脈における、プラークの進行に及ぼすCER−001投与の効果を調べた。マウスの各群について、脂質抽出およびHPLC分析の後に、頸動脈のコレステロール含有量を試験した。屠殺した日に、結紮された頸動脈を採集し、−80℃で保存した。有機溶液を用いて脂質を抽出し、HPLCでコレステロール濃度を決定した。
9.3.1.試験A:結紮された左頸動脈におけるアテローム動脈硬化性プラークの決定
この試験では、高脂肪食を摂食させたapoE−/−マウス由来の結紮された頸動脈における、プラークの進行に及ぼすCER−001投与の効果を調べた。マウスの各群について、脂質抽出およびHPLC分析の後に、頸動脈のコレステロール含有量を試験した。屠殺した日に、結紮された頸動脈を採集し、−80℃で保存した。有機溶液を用いて脂質を抽出し、HPLCでコレステロール濃度を決定した。
9.2.9節の方法に従って、結紮された頸動脈を脂質抽出に供した。頸動脈(新鮮重)から外科用ストラップを取り外して、組織をガラスチューブに入れた。これに、1.8mLのCHCl3/MeOH(2:1)を添加し、4℃で一晩混合した。次いで、頸動脈を取り出し、乾燥し、秤量し、有機溶液(CHCl3/MeOH)を2つのガラスチューブに等体積で分けた。非エステル化コレステロール(UC)については、100μLのβ−シトステロール(内部標準)を添加し、溶液を乾燥した。これに、200μLのEtOHを添加して試料を可溶化し、試料をHPLCでUCについて分析した。総コレステロール(TC)については、100μLのβ−シトステロール(内部標準)を添加し、溶液を乾燥した。これに、1mLの0.1M KOHメタノール溶液を添加し、溶液を60℃で少なくとも30分間、インキュベートした。BlighおよびDyer手順を実施してコレステロールを抽出し、この手順では、1mLのクロロホルムを添加した後、1mLのH2Oを添加し、ボルテックスで混合した。相が分離した際に、下方の相を採集して乾燥した。これに、200μLのEtOHを添加して試料を可溶化し、HPLCによってTCを分析した。コレステロール濃度は、9.2.7節の方法に従ってHPLCで決定した。簡単に述べれば、50μLをC18 Zorbax:SB−C18 4.6×250mm(Agilent参照番号880975−902)カラムに注入した。流速は、60%の溶離液A(ACN/ETOH/H2O 85/10/5)および40%の溶離液B(ACN/ETOH 86/14)で1.5mL/分とした。ラン時間は55分とし、そのうちコレステロールの保持時間は22.85分であり、β−シトステロールの保持時間は32.2分であった。システム:バイナリポンプWaters1525−214nmに設定されたUV検出器−ソフトウェア:Massslynx4.1。
CER−001またはHDL3で処置したマウスの結紮された頸動脈におけるコレステロール含有量について、同様のプロファイルが観察された(図47および図48)。2、5および10mg/kgの濃度について、非エステル化コレステロールに25%の低下が観察され、結紮された頸動脈における総コレステロール含有量に50%の低下が観察された。CER−001およびHDL3を用いた処置について、20および50mg/kgの用量に対するプラーク進行の阻害は、おおよそ10%である。
9.3.2.試験B:CER−001注入後の血漿コレステロールの動員の決定
この試験では、高脂肪食を摂食させたapoE−/−マウスにおけるリポタンパク質プロファイルに及ぼすCER−001投与の結果を調べた。5回目の注入後の種々の時点で血液を採集して解析した。投与前の血漿(最初の注射の前)および投与後の血漿(最後の注射の24時間後)を比較した。総コレステロールおよび非エステル化コレステロールならびにヒトApoA−Iの含有量について血漿を分析した。
この試験では、高脂肪食を摂食させたapoE−/−マウスにおけるリポタンパク質プロファイルに及ぼすCER−001投与の結果を調べた。5回目の注入後の種々の時点で血液を採集して解析した。投与前の血漿(最初の注射の前)および投与後の血漿(最後の注射の24時間後)を比較した。総コレステロールおよび非エステル化コレステロールならびにヒトApoA−Iの含有量について血漿を分析した。
総コレステロールおよび非エステル化コレステロール濃度を、それぞれ9.2.5節および9.2.6節のプロトコールに従って決定した。総コレステロールから非エステル化コレステロールを差し引いた後、コレステロールエステル濃度を決定した。5回目の投与の後、群当たり12頭のマウスに関して、コレステロールの動員を決定した(注射1時間前;注射から1時間後、2時間後、4時間後、および24時間後)。動物を一晩、絶食させた。
CER−001およびHDL3を注入した後、総血漿コレステロールの動員に有意な変化は観察されなかった(図49および図50)。CER−001またはHDL3を注入した後、非エステル化コレステロールの動員に有意な変化は観察されなかった(図51および図52)。50mg/kgでのCER−001によって、注入の2時間後および4時間後に血漿中非エステル化コレステロール濃度が増加したようであった。
総コレステロール濃度および非エステル化コレステロール濃度が、CER−001処置された動物では、HDL3処置されたマウスと比較して2倍高かったことを除けば、CER−001およびHDL3についての投与後のプロファイルは同様であった(図53および図54)。CER−001では、10mg/kgを超える用量によって、8回の注射後に、マウス血漿中のコレステロール濃度がプラセボと比較して増加した。HDL3の注入によって、コレステロール濃度はプラセボより大きく増加しなかった。
9.3.3.試験C:血漿ヒトApoA−Iの決定
この試験では、CER−001を注入した後の血漿中のヒトApoA−Iの濃度を決定することによって、CER−001注入の反応速度論を調べた。血漿中のApoA−I濃度を、製造業者の取扱説明書に従い、ELISA(アッセイProEA5201−1)によって決定した。ApoA−Iを決定する前に、マウスに注射されたCER−001およびHDL3の濃度に応じて、血漿を1/100、1/50または1/10に希釈した。
この試験では、CER−001を注入した後の血漿中のヒトApoA−Iの濃度を決定することによって、CER−001注入の反応速度論を調べた。血漿中のApoA−I濃度を、製造業者の取扱説明書に従い、ELISA(アッセイProEA5201−1)によって決定した。ApoA−Iを決定する前に、マウスに注射されたCER−001およびHDL3の濃度に応じて、血漿を1/100、1/50または1/10に希釈した。
CER−001によって、ヒトApoA−I血漿濃度の用量依存的な増加が観察された。供試した全ての濃度について、血漿中のApoA−Iの予想される用量が回復した(図55)。HDL3について、ヒトApoA−I血漿濃度に用量依存的な増加が観察された(図56)。しかし、ヒト血漿ApoA−Iは、予想された用量よりも3分の1少ない濃度である。
9.3.4.試験D:結紮された頸動脈におけるABCA1発現のウェスタンブロットの決定
この試験では、マウスの結紮された頸動脈におけるコレステロール含有量に、低下(5mg/kg CER−001)および効果のないこと(50mg/kg CER−001)が観察された時に、ABCA1の発現が、コレステロール含有量の差に関連しうるか否かを調べた。クロロホルム:メタノールを用いて既に抽出した、結紮された頸動脈を、0.1N NAOH(100μL/頸動脈)に可溶化した。溶液を少しの間超音波処理し、15,000×gで10分間遠心分離した。Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を決定し、40μgの試料をSDS−PAGEにロードした。imageJ(登録商標)ソフトウェアを使用して、ABCA1発現(ab7360−希釈率1/1000)を定量した。
この試験では、マウスの結紮された頸動脈におけるコレステロール含有量に、低下(5mg/kg CER−001)および効果のないこと(50mg/kg CER−001)が観察された時に、ABCA1の発現が、コレステロール含有量の差に関連しうるか否かを調べた。クロロホルム:メタノールを用いて既に抽出した、結紮された頸動脈を、0.1N NAOH(100μL/頸動脈)に可溶化した。溶液を少しの間超音波処理し、15,000×gで10分間遠心分離した。Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を決定し、40μgの試料をSDS−PAGEにロードした。imageJ(登録商標)ソフトウェアを使用して、ABCA1発現(ab7360−希釈率1/1000)を定量した。
50mg/kg用量でのCER−001およびHDL3について、頸動脈のABCA1含有量に低下が観察された(図57)。CER−001およびHDL3の両方について、5mg/kg用量は、ABCA1の発現に影響を及ぼさなかった。結紮された頸動脈におけるABCA1の発現は、50mg/kgのCER−001およびHDL3用量についてダウンレギュレーションされた。それらのマクロファージのコレステロール流出は、弱まっていた可能性があり、このことは、50mg/kgの濃度にはプラークコレステロール含有量への効果がないことを説明しうるものであった。
9.3.5.試験E:マウス肝臓におけるSR−BIおよびABCA1の決定
この試験では、CER−001の最後の注射から24時間後の肝臓におけるSR−BIおよびABCA1タンパク質の含有量を調べた。少しの間超音波処理することによって、肝臓片(50mg)をPBS(500μL)に溶解した。この試料を遠心分離し(800×gを10分間)、ペレットを廃棄した。上清を4℃、16,000×gで30分間遠心分離し、PBS 1%Triton×100(200μL)を用いて、ペレットを可溶化した。10μgの可溶化ペレットを10%SDS PAGEにロードし、imageJ(登録商標)ソフトウェアを使用して、ABCA1発現(ab7360−希釈率1/1000)またはSR−BI発現(ab24603−希釈率1/1000)を定量した。
この試験では、CER−001の最後の注射から24時間後の肝臓におけるSR−BIおよびABCA1タンパク質の含有量を調べた。少しの間超音波処理することによって、肝臓片(50mg)をPBS(500μL)に溶解した。この試料を遠心分離し(800×gを10分間)、ペレットを廃棄した。上清を4℃、16,000×gで30分間遠心分離し、PBS 1%Triton×100(200μL)を用いて、ペレットを可溶化した。10μgの可溶化ペレットを10%SDS PAGEにロードし、imageJ(登録商標)ソフトウェアを使用して、ABCA1発現(ab7360−希釈率1/1000)またはSR−BI発現(ab24603−希釈率1/1000)を定量した。
ABCA1頸動脈の含有量とは対照的に、マウス肝臓では、CER−001の濃度の増加に伴って、ABCA1タンパク質レベルの増加が観察された(図58)。この解離は、以下によって説明される:i)細胞集団が異なっていたこと、すなわち、頸動脈では、細胞集団がマクロファージおよび内皮細胞から構成され、肝臓では、細胞集団は大部分が肝細胞であること、ii)CER−001の形態およびその機能が、両方の場合で異なっていること、すなわち、頸動脈では、CER−001がコレステロール中であまり荷電しておらず、その機能は細胞からコレステロールを流出させるものであり、肝臓では、CER−001はロードされたコレステロールであって、その機能は肝臓によって排除されることになること。ABCA1発現は、コレステロール含有量によって強固に調節されることから、コレステロールが乏しい環境(例えばコレステロール流出が高い)では、ABCA1発現は低下し、コレステロールが豊富な環境(コレステロール取り込み)では、ABCA1発現は増加するものと仮定された。SR−BIについては、CER−001の濃度の増加に伴ってタンパク質レベルに有意な変化は観察されなかった(図59)。
9.3.6.試験F:マウス糞便におけるコレステロール含有量の決定
この試験では、種々の濃度のCER−001およびHDL3について、マウス糞便におけるコレステロール含有量を分析した。糞便を脂質抽出に供し、そのコレステロール含有量をHPLCで分析した。糞便(200mg)をメタノール:水(50:50)溶液に可溶化し、Turrax(登録商標)を用いて1分間混合した。溶液を凍結して、一晩凍結乾燥した。翌日、4mLのクロロホルム/メタノール(2:1)を添加し、溶液を4℃で24時間混合した。これに、水(1.33mL)を添加し、次いで、溶液を混合して、3700×gで3分間遠心分離した。有機相を取り置いて乾燥した。ペレットを無水エタノール(2mL)に可溶化して、カートリッジAC 0.2μmにて濾過した。9.2.7節の方法に従って、試料中のコレステロール濃度を分析した。
この試験では、種々の濃度のCER−001およびHDL3について、マウス糞便におけるコレステロール含有量を分析した。糞便を脂質抽出に供し、そのコレステロール含有量をHPLCで分析した。糞便(200mg)をメタノール:水(50:50)溶液に可溶化し、Turrax(登録商標)を用いて1分間混合した。溶液を凍結して、一晩凍結乾燥した。翌日、4mLのクロロホルム/メタノール(2:1)を添加し、溶液を4℃で24時間混合した。これに、水(1.33mL)を添加し、次いで、溶液を混合して、3700×gで3分間遠心分離した。有機相を取り置いて乾燥した。ペレットを無水エタノール(2mL)に可溶化して、カートリッジAC 0.2μmにて濾過した。9.2.7節の方法に従って、試料中のコレステロール濃度を分析した。
CER−001およびHDL3を注射されたマウスについて、糞便のコレステロール含有量に用量依存的な増加が観察された(図60)。10mg/kgの濃度で、最大のコレステロール排出が観察された。
10.実施例4:低アルファリポタンパク血症に罹った患者におけるCER−001の臨床試験
10.1.背景
Cerenisは、遺伝子欠損(タンジール病患者および2つのABCA1のヘテロ接合が挙げられる)に起因して低アルファリポタンパク血症に罹った対象で、初期の臨床試験の業務を複数完了している。
10.1.背景
Cerenisは、遺伝子欠損(タンジール病患者および2つのABCA1のヘテロ接合が挙げられる)に起因して低アルファリポタンパク血症に罹った対象で、初期の臨床試験の業務を複数完了している。
RLT経路が一生を通して欠損しているために全身を通じて血管壁に捕捉されたコレステロールの負担は、「導入相」の間は各反復投与に伴い徐々に低減されるはずであり、LDLレベルが適正に制御されている患者では、アテローム動脈硬化性プラークが退縮するはずである。適切なコレステロールのホメオスタシス、すなわち、内在性LDL−Cによる組織への送達と、注入されたCER−001前駆体β様HDL粒子による除去との平衡を維持するために、治療は、投与間隔を減らして(「維持相」)長期にわたって続けることになる。遺伝子作因によるHDL生成およびRLTの遺伝性欠損は、不変であることから、CER−001治療は、一生にわたるものとなりうる。
下記の表8は、治験(SAMBA試験と呼ぶ)に含めた患者のプロファイルを示す。
患者を、初めに集中的な「導入相」で処置し、この相では、8mg/kgの用量で4週間超、9回のCER−001の投与を与えた。この導入相の後、リポタンパク質のプロファイルおよびMRIスキャンを用いて、試験対象を再び評価した。その後、試験対象を、「維持相」で2週間に1回処置し続けて、総治療を6か月間とした。その時点で、リポタンパク質のプロファイルおよびMRIスキャンを繰り返した。
10.2.結果
コレステロールの動員およびLCATによるコレステロールのエステル化に及ぼす、CER−001の効果を、図68A〜68Gおよび図69A〜69Gに対象毎ベースで示す。
コレステロールの動員およびLCATによるコレステロールのエステル化に及ぼす、CER−001の効果を、図68A〜68Gおよび図69A〜69Gに対象毎ベースで示す。
対象1は、ApoA−I遺伝子を欠失しており(ホモ接合、ApoA−I−/−)、CER−001を8mg/kgで1回投与した後に、コレステロールの動員、LCATの活性化、および糞便コレステロールの排除を示した。
対象7は、ABCA1遺伝子を持たず(ホモ接合のABCA1−/−)、タンジール病に罹患しており、CER−001を8mg/kgで1回投与した後に、コレステロールの動員およびLCATの活性化を示した。この患者では、糞便コレステロールの排除を試験しなかった。
図70および図71は、患者毎ベースで、処置の1か月後の頸動脈および大動脈の血管壁厚の平均をそれぞれ示す。頸動脈の平均血管壁厚は、導入治療の1か月後に、平均で−6.4%低下し、大動脈の平均血管壁厚は、導入治療の1か月後に、平均で−4.6%低下した。ホモ接合性のApoA−I欠乏患者は、頸動脈の平均血管壁厚が−17%の退縮となった。図72は、6か月後の平均血管壁厚を示す。平均血管壁厚は、3TeslaMRIによって決定した。
この治験は、これらの対象におけるメカニズムの実証(proof of mechanism)(すなわち、CER−001が、RLT経路の全ての段階を実行すること)ならびに正の治療効果のエビデンスを示しており、具体的には、集中的な処置の1か月後に頸動脈の血管内膜−内側部壁厚が減少するが、最も重度の欠損(ホモ接合性のABCA1欠乏)を有する対象において、この減少は、スタチン未処置の高コレステロール血症の対象において処置の2年後に認められる減少に相当するものであった。重要なことに、この観察された減少は、ケアの標準(個人に合わせた集中的な脂質の管理)を凌いで認められた。重要なことに、さらに5か月の維持治療の後には、永続的かつ累積的な恩恵が認められ、このことは、家族性低アルファリポタンパク血症に罹った患者が、一生にわたり絶えずApoA−I置換治療を必要とするという治療原理を支援するものである。ABCA1欠乏において、ABCA1がないかまたはABCA1機能がない際に、コレステロールは依然としてCER−001に流出するが、おそらくは、以下に限定されないがABCG1など、他の受容体による流出経路の重複性があるためである。
11.具体的な実施形態
本願の開示の様々な態様が、以下の付番された段落に規定された実施形態に記載される。
本願の開示の様々な態様が、以下の付番された段落に規定された実施形態に記載される。
1.対象においてコレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法であって、(a)対象に前記HDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)(i)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第1の用量より低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップ、または(ii)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、前記カットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を前記HDL治療剤の前記第1の用量で処置するステップとを含む方法。
2.対象においてHDL治療剤の効能をモニターする方法であって、(a)対象を第1の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップと、(b)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の投与スケジュールの効果を評価するステップと、(c)(i)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減する場合、前記対象を第2の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップであって、前記第2の投与スケジュールが、前記HDL治療剤のより低い用量を投与すること、前記HDL治療剤を前記対象により長い期間にわたって注入すること、および前記HDL治療剤を前記対象により少ない回数で投与することのうちの1つまたは複数を含む、ステップ、(ii)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を第2の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップであって、前記第2の投与スケジュールが、前記HDL治療剤のより高い用量を投与すること、前記HDL治療剤を前記対象により短い期間にわたって注入すること、および前記HDL治療剤を前記対象により多い回数で投与することのうちの1つまたは複数を含む、ステップ、または(iii)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、前記対象を前記第1の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む方法。
3.前記カットオフ量が、前記投与前の前記対象自身のベースラインに関連する、実施形態1または実施形態2の方法。
4.前記カットオフ量が、対照量に関連する、実施形態1または実施形態2の方法。
5.前記対照量が、集団の平均値である、実施形態4の方法。
6.前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態5の方法。
7.前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態5の方法。
8.対象においてコレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法であって、(a)対象の集団にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)前記第1の用量より高いまたは低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップと、(d)前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1および/または第2の用量の効果を評価するステップと、(e)任意選択で、前記HDL治療剤の1つまたは複数の追加の用量によってステップ(c)および(d)を繰り返すステップと、(f)1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最高用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記HDL治療剤の用量を同定するステップとを含む方法。
9.ステップ(d)が、前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップを含む、実施形態8の方法。
10.前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第2の用量の効果を評価するステップをさらに含む、実施形態1から9のいずれか1つの方法。
11.前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第2の用量より低い、前記HDL治療剤の第3の用量を投与する、実施形態10の方法。
12.HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法であって、対象に、(a)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、前記対象のベースライン量と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量の、任意選択でリポタンパク質複合体であるHDL治療剤と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む方法。
13.前記HDL治療剤が、リポタンパク質複合体である、実施形態12の方法。
14.HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法であって、対象に、(a)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、対照量と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量の、任意選択でリポタンパク質複合体であるHDL治療剤と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む方法。
15.前記HDL治療剤が、リポタンパク質複合体である、実施形態14の方法。
16.前記対照量が、集団の平均値である、実施形態14または15の方法。
17.前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態16の方法。
18.前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態16の方法。
19.前記対象がヒトであるか、または前記対象の集団がヒト対象の集団である、実施形態1から18のいずれか1つの方法。
20.前記対象が非ヒト動物である、または前記対象の集団が非ヒト動物の集団である、実施形態1から18のいずれか1つの方法。
21.前記非ヒト動物がマウスである、実施形態20の方法。
22.少なくとも1つのHDLマーカーがABCA1である、実施形態1から21のいずれか1つの方法。
23.ABCA1 mRNA発現レベルが測定される、実施形態22の方法。
24.ABCA1タンパク質発現レベルが測定される、実施形態22の方法。
25.前記ABCA1カットオフ量が20%〜80%である、実施形態22から24のいずれか1つの方法。
26.前記ABCA1カットオフ量が30%〜70%である、実施形態25の方法。
27.前記ABCA1カットオフ量が40%〜60%である、実施形態26の方法。
28.前記ABCA1カットオフ量が50%である、実施形態27に記載の方法。
29.ABCA1発現レベルが、前記第1の用量または前記第2の用量の投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間または4〜8時間後に測定される、実施形態22から28のいずれか1つの方法。
30.少なくとも1つのHDLマーカーがABCG1である、実施形態1から29のいずれか1つの方法。
31.ABCG1 mRNA発現レベルが測定される、実施形態30の方法。
32.ABCG1タンパク質発現レベルが測定される、実施形態30の方法。
33.前記ABCG1カットオフ量が20%〜80%である、実施形態30から32のいずれか1つの方法。
34.前記ABCG1カットオフ量が30%〜70%である、実施形態33の方法。
35.前記ABCG1カットオフ量が40%〜60%である、実施形態34の方法。
36.前記ABCA1カットオフ量が50%である、実施形態35の方法。
37.ABCG1発現レベルが、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間または4〜8時間後に測定される、実施形態30から36のいずれか1つの方法。
38.少なくとも1つのHDLマーカーがSREBP−1である、実施形態1から37のいずれか1つの方法。
39.SREBP−1 mRNA発現レベルが測定される、実施形態38の方法。
40.SREBP−1タンパク質発現レベルが測定される、実施形態38の方法。
41.前記SREBP−1カットオフ量が20%〜80%である、実施形態38から40のいずれか1つの方法。
42.前記SREBP−1カットオフ量が30%〜70%である、実施形態41の方法。
43.前記SREBP−1カットオフ量が40%〜60%である、実施形態42の方法。
44.前記SREBP−1カットオフ量が50%である、実施形態43の方法。
45.SREBP−1の発現レベルが、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間または4〜8時間後に測定される、実施形態38から44のいずれか1つの方法。
46.前記HDL治療剤がリポタンパク質複合体である、実施形態1から45のいずれか1つの方法。
47.前記リポタンパク質複合体がアポリポタンパク質を含む、実施形態46の方法。
48.前記アポリポタンパク質が、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoE、またはその組み合わせである、実施形態47の方法。
49.前記リポタンパク質複合体が、アポリポタンパク質ペプチド模倣体を含む、実施形態46の方法。
50.前記ペプチド模倣体が、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、もしくはApoEのペプチド模倣体、またはその組み合わせである、実施形態49の方法。
51.前記リポタンパク質複合体が、CER−001、CSL−111、CSL−112、またはETC−216である、実施形態46の方法。
52.前記HDL治療剤が低分子である、実施形態1から45のいずれか1つの方法。
53.前記低分子がCETP阻害剤である、実施形態52の方法。
54.前記低分子がパントテン酸誘導体である、実施形態52の方法。
55.カットオフ量を決定することをさらに含む、実施形態1から46のいずれか1つの方法。
56.前記カットオフ量が、前記HDL治療剤の用量反応曲線を生成することによって決定される、実施形態55の方法。
57.前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の25%〜75%である、実施形態56の方法。
58.前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の40%〜60%である、実施形態57の方法。
59.前記対象または前記対象の集団が、ABCA1欠損を有する、実施形態1から58のいずれか1つの方法。
60.前記対象または前記対象の集団が、ABCA1変異に関してホモ接合である、実施形態59の方法。
61.前記対象または前記対象の集団が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、実施形態59の方法。
62.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法であって、(a)対象に前記HDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを、0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む方法。
63.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法であって、(a)対象の集団に前記HDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む方法。
64.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法であって、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない、前記HDL治療剤の最高用量を同定するステップを含む方法。
65.(a)対象または対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態64の方法。
66.治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法であって、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない、前記HDL治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む方法。
67.(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態66の方法。
68.前記1回または複数回の投与回数が、(a)2日ごとに1〜4時間の注入としての投与、(b)3日ごとに1〜4時間の注入としての投与、(c)1週間ごとに24時間の注入としての投与、および(d)2週間ごとに24時間の注入としての投与から選択される1回または複数回の投与回数を含む、実施形態67の方法。
69.コレステロール流出が、前記対象または対象の集団の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される、実施形態65から68のいずれか1つの方法。
70.対象にHDL治療剤の治療有効量を投与することを含む、ABCA1欠損を有する対象を処置する方法。
71.前記HDL治療剤がCER−001である、実施形態70の方法。
72.前記対象が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、実施形態70または71の方法。
73.前記対象が、ABCA1変異に関してホモ接合である、実施形態70または71の方法。
74.家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法であって、(a)前記対象に導入レジメンに従って前記HDL治療剤を投与するステップ、および次に(b)前記対象に維持レジメンに従って前記HDL治療剤を投与するステップを含む方法。
75.前記維持レジメンが、前記HDL治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴う、実施形態74の方法。
76.前記対象が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、実施形態74または実施形態75の方法。
77.前記対象が、ABCA1変異に関してホモ接合である、実施形態74または実施形態75の方法。
78.前記対象が、LCAT変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態74から77のいずれか1つの方法。
79.前記対象が、ApoA−I変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態74から78のいずれか1つの方法。
80.前記対象が、ABCG1変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態74から79のいずれか1つの方法。
81.前記対象が、脂質調節薬でも処置される、実施形態74から80のいずれか1つの方法。
82.前記脂質調節薬が、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせである、実施形態81の方法。
83.前記HDL治療剤がCER−001である、実施形態74から82のいずれか1つの方法。
84.前記導入レジメンが4週間の期間である、実施形態83の方法。
85.前記導入レジメンが、CER−001を週に3回投与することを含む、実施形態83または実施形態84の方法。
86.前記導入レジメンで投与される前記用量が、8〜15mg/kg(タンパク質重量に基づく)である、実施形態83から85のいずれか1つの方法。
87.前記導入レジメンで投与される前記用量が、8mg/kg、12mg/kg、または15mg/kgである、実施形態から86の方法。
88.前記維持レジメンが、CER−001を少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3カ月間、少なくとも6カ月間、少なくとも1年間、少なくとも18か月間、少なくとも2年間、または無限に投与するステップを含む、実施形態83から87のいずれか1つの方法。
89.前記維持レジメンが、CER−001を週に2回投与することを含む、実施形態83から88のいずれか1つの方法。
90.前記維持レジメンで投与される前記用量が、1〜6mg/kg(タンパク質の重量に基づいて)である、実施形態83から89のいずれか1つの方法。
91.前記維持レジメンで投与される前記用量が、1mg/kg、3mg/kg、または6mg/kgである、実施形態90の方法。
92.(a)前記導入レジメンが、1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および/もしくは集団の平均値と比較して20%〜80%、または40%〜60%低減させる用量を利用する、ならびに/または(b)前記維持レジメンが、1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および/もしくは集団の平均値と比較して20%より大きく、もしくは10%より大きく低減させない用量を利用する、実施形態74から91のいずれか1つの方法。
93.前記維持レジメンが、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを低減させない用量を利用する、実施形態92の方法。
94.対象においてコレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)対象に前記HDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)(i)前記対象の1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第1の用量より低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップ、または(ii)前記対象の1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルが、前記カットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を前記HDL治療剤の前記第1の用量で処置するステップとを含む、HDL治療剤。
95.対象におけるHDL治療剤の効能をモニターする方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)対象を第1の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップと、(b)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の投与スケジュールの効果を評価するステップと、(c)(i)前記対象の1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、前記対象を第2の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップであって、前記第2の投与スケジュールが、前記HDL治療剤のより低い用量を投与すること、前記HDL治療剤を前記対象により長い期間にわたって注入すること、および前記HDL治療剤を前記対象により少ない回数で投与することのうちの1つもしくは複数を含む、ステップ、(ii)前記対象の1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を第2の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップであって、前記第2の投与スケジュールが、前記HDL治療剤のより高い用量を投与すること、前記HDL治療剤を前記対象により短い期間にわたって注入すること、および前記HDL治療剤を前記対象により多い回数で投与することのうちの1つもしくは複数を含む、ステップ、または(iii)前記対象の1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、前記対象を前記第1の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む、HDL治療剤。
96.前記カットオフ量が、前記投与前の前記対象の自身のベースラインに関連する、実施形態94または実施形態95の使用のためのHDL治療剤。
97.前記カットオフ量が、対照量に関連する、実施形態94または実施形態95の使用のためのHDL治療剤。
98.前記対照量が、集団の平均値である、実施形態97の使用のためのHDL治療剤。
99.前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態98の使用のためのHDL治療剤。
100.前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態98の使用のためのHDL治療剤。
101.コレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)対象の集団にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、(c)前記第1の用量より高いかまたは低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップと、(d)前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1および/または第2の用量の効果を評価するステップと、(e)任意選択で、前記HDL治療剤の1つまたは複数の追加の用量によってステップ(c)および(d)を繰り返すステップと、(f)1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最高用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記HDL治療剤の量を同定するステップとを含む、HDL治療剤。
102.ステップ(d)が、前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップを含む、実施形態101の方法。
103.前記方法が、前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第2の用量の効果を評価するステップをさらに含む、実施形態94から101のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
104.前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第2の用量よりも低い、前記HDL治療剤の第3の用量を投与する、実施形態102の使用のためのHDL治療剤。
105.HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法に使用するための、任意選択でリポタンパク質複合体であるHDL治療剤であって、前記方法が、前記対象に、(a)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、前記対象のベースライン量または対照量と比較して20%より大きくまたは10%より大きく低減させない用量の前記HDL治療剤と、(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む、HDL治療剤。
106.リポタンパク質複合体である、実施形態105の使用のためのHDL治療剤。
107.前記比較される量が、前記対象のベースライン量である、実施形態105または106の使用のためのHDL治療剤。
108.前記比較される量が、対照量であり、集団の平均値である、実施形態105または106の使用のためのHDL治療剤。
109.前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態108の使用のためのHDL治療剤。
110.前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態108の使用のためのHDL治療剤。
111.前記対象がヒトである、または、前記対象の集団がヒト対象の集団である、実施形態94から110のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
112.前記対象が非ヒト動物である、または前記対象の集団が非ヒト動物の集団である、実施形態94から110のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
113.前記非ヒト動物がマウスである、実施形態112の使用のためのHDL治療剤。
114.少なくとも1つのHDLマーカーがABCA1である、実施形態94から113のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
115.ABCA1 mRNA発現レベルが測定される、実施形態114の使用のためのHDL治療剤。
116.ABCA1タンパク質発現レベルが測定される、実施形態114の使用のためのHDL治療剤。
117.前記ABCA1カットオフ量が20%〜80%である、実施形態114から116のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
118.前記ABCA1カットオフ量が30%〜70%である、実施形態117の使用のためのHDL治療剤。
119.前記ABCA1カットオフ量が40%〜60%である、実施形態118の使用のためのHDL治療剤。
120.前記ABCA1カットオフ量が50%である、実施形態119の使用のためのHDL治療剤。
121.ABCA1発現レベルが、前記第1の用量または前記第2の用量の投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間または4〜8時間後に測定される、実施形態114から120のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
122.少なくとも1つのHDLマーカーがABCG1である、実施形態94から121のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
123.ABCG1 mRNA発現レベルが測定される、実施形態122の使用のためのHDL治療剤。
124.ABCG1タンパク質発現レベルが測定される、実施形態122の使用のためのHDL治療剤。
125.前記ABCG1カットオフ量が20%〜80%である、実施形態122から124のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
126.前記ABCG1カットオフ量が30%〜70%である、実施形態125の使用のためのHDL治療剤。
127.前記ABCG1カットオフ量が40%〜60%である、実施形態126の使用のためのHDL治療剤。
128.前記ABCA1カットオフ量が50%である、実施形態127の使用のためのHDL治療剤。
129.ABCG1発現レベルが、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間または4〜8時間後に測定される、実施形態122から128のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
130.少なくとも1つのHDLマーカーがSREBP−1である、実施形態94から129のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
131.SREBP−1 mRNA発現レベルが測定される、実施形態130の使用のためのHDL治療剤。
132.SREBP−1タンパク質発現レベルが測定される、実施形態130の使用のためのHDL治療剤。
133.前記SREBP−1カットオフ量が20%〜80%である、実施形態130から132のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
134.前記SREBP−1カットオフ量が30%〜70%である、実施形態133の使用のためのHDL治療剤。
135.前記SREBP−1カットオフ量が40%〜60%である、実施形態134の使用のためのHDL治療剤。
136.前記SREBP−1カットオフ量が50%である、実施形態135 使用のためのHDL治療剤。
137.SREBP−1発現レベルが、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間または4〜8時間後に測定される、実施形態130から136のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
138.リポタンパク質複合体である、実施形態94から137のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
139.前記リポタンパク質複合体が、アポリポタンパク質を含む、実施形態138の使用のためのHDL治療剤。
140.前記アポリポタンパク質が、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoE、またはその組み合わせである、実施形態139の使用のためのHDL治療剤。
141.前記リポタンパク質複合体が、アポリポタンパク質ペプチド模倣体を含む、実施形態138の使用のためのHDL治療剤。
142.前記ペプチド模倣体が、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、もしくはApoEのペプチド模倣体、またはその組み合わせである、実施形態141の使用のためのHDL治療剤。
143.前記リポタンパク質複合体が、CER−001、CSL−111、CSL−112、またはETC−216である、実施形態138の使用のためのHDL治療剤。
144.低分子である、実施形態94から137のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
145.前記低分子がCETP阻害剤である、実施形態144の使用のためのHDL治療剤。
146.前記低分子がパントテン酸誘導体である、実施形態144の使用のためのHDL治療剤。
147.カットオフ量を決定することをさらに含む、実施形態94から138のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
148.前記カットオフ量が、前記HDL治療剤の用量反応曲線を生成することによって決定される、実施形態147の使用のためのHDL治療剤。
149.前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の25%〜75%である、実施形態148の使用のためのHDL治療剤。
150.前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の40%〜60%である、実施形態149の使用のためのHDL治療剤。
151.前記対象または対象の集団が、ABCA1欠損を有する、実施形態94から150のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
152.前記対象または対象の集団が、ABCA1変異に関してホモ接合である、実施形態151の使用のためのHDL治療剤。
153.前記対象または対象の集団が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、実施形態151の使用のためのHDL治療剤。
154.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)対象に前記HDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、HDL治療剤。
155.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)対象の集団に前記HDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、(c)前記対象において、前記1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、HDL治療剤。
156.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない、前記HDL治療剤の最高用量を同定するステップを含む、HDL治療剤。
157.(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を50%超から100%低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態156の使用のためのHDL治療剤。
158.治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、細胞のコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない、前記HDL治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む、方法。
159.(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を50%超から100%低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態158の使用のためのHDL治療剤。
160.治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)対象または対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとを含む、HDL治療剤。
161.治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと、(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップとによって、前記HDL治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む、HDL治療剤。
162.前記1回または複数回の投与回数が、(a)2日ごとに1〜4時間の注入としての投与、(b)3日ごとに1〜4時間の注入としての投与、(c)1週間ごとに24時間の注入としての投与、および(d)2週間ごとに24時間の注入としての投与から選択される1回または複数回の投与回数を含む、実施形態67の方法。
163.コレステロール流出が、前記対象または対象の集団の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される、実施形態156から162のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
164.対象にHDL治療剤の治療有効量を投与することを含む、ABCA1欠陥を有する対象を処置する方法に使用するためのHDL治療剤。
165.CER−001である、実施形態164の使用のためのHDL治療剤。
166.前記対象が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、実施形態164または165の使用のためのHDL治療剤。
167.前記対象が、ABCA1変異に関してホモ接合である、実施形態164または165の使用のためのHDL治療剤。
168.家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、(a)前記対象に導入レジメンに従って前記HDL治療剤を投与するステップ、および次に(b)前記対象に維持レジメンに従って前記HDL治療剤を投与するステップを含む、HDL治療剤。
169.前記維持レジメンが、前記HDL治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴う、実施形態168の使用のためのHDL治療剤。
170.前記対象が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、実施形態168または実施形態169の使用のためのHDL治療剤。
171.前記対象が、ABCA1変異に関してホモ接合である、実施形態168または実施形態169の使用のためのHDL治療剤。
172.前記対象が、LCAT変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態168から171のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
173.前記対象が、ApoA−I変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態168から172のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
174.前記対象が、ABCG1変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態168から173のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
175.前記対象が、脂質調節薬でも処置される、実施形態168から174のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
176.前記脂質調節薬が、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせである、実施形態175の使用のためのHDL治療剤。
177.CER−001である、実施形態168から176のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
178.前記導入レジメンが、4週間の期間である、実施形態177の使用のためのHDL治療剤。
179.前記導入レジメンが、CER−001を週に3回投与するステップを含む、実施形態177または実施形態178の使用のためのHDL治療剤。
180.前記導入レジメンで投与される前記用量が、8〜15mg/kg(タンパク質重量に基づく)である、実施形態177から179のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
181.前記導入レジメンで投与される前記用量が、8mg/kg、12mg/kg、または15mg/kgである、実施形態から180の使用のためのHDL治療剤。
182.前記維持レジメンが、CER−001を少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3カ月間、少なくとも6カ月間、少なくとも1年間、少なくとも18か月間、少なくとも2年間、または無限に投与することを含む、実施形態177から181のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
183.前記維持レジメンが、CER−001を週に2回投与することを含む、実施形態177から182のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
184.前記維持レジメンで投与される前記用量が、1〜6mg/kg(タンパク質の重量に基づいて)である、実施形態177から183のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
185.前記維持レジメンで投与される前記用量が、1mg/kg、3mg/kg、または6mg/kgである、実施形態184の使用のためのHDL治療剤。
186.(a)前記導入レジメンが、1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および/もしくは集団の平均値と比較して20%〜80%、もしくは40%〜60%低減させる用量を利用する、ならびに/または(b)前記維持レジメンが、1つもしくは複数のHDLマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および/もしくは集団の平均値と比較して20%より大きく、もしくは10%より大きく低減させる用量を利用する、実施形態168から185のいずれか1つの使用のためのHDL治療剤。
187.前記維持レジメンが、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを低減させない用量を利用する、実施形態186の使用のためのHDL治療剤。
様々な具体的な実施形態が例示され記載されている一方で、本開示(複数可)の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更が行われうることが理解されよう。
12.参照による組込み
本出願に引用されたあらゆる刊行物、特許、特許出願および他の文書は、ここに、あらゆる目的のために参照によりその全体を組み入れられ、それは、それぞれの別個の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み入れられることを別個に示すのと同程度である。
本出願に引用されたあらゆる刊行物、特許、特許出願および他の文書は、ここに、あらゆる目的のために参照によりその全体を組み入れられ、それは、それぞれの別個の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み入れられることを別個に示すのと同程度である。
本明細書が含む文書、行為、材料、デバイス、物品などに関するいかなる議論も、本願の開示の文脈を提供することを目的とするにすぎない。これらのいかなるまたはあらゆる事項が、先行技術の基盤の一部を形成すること、または、本出願の優先日前にどこかに存在していたかのように、本願の開示に関連する技術分野の一般常識であることを、自認するものと解されるものではない。
Claims (87)
- 対象においてコレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)対象に前記HDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、
(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、
(c)(i)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第1の用量より低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップ;または
(ii)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、前記カットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を前記HDL治療剤の前記第1の用量で処置するステップと
を含む、HDL治療剤。 - 対象においてHDL治療剤の効能をモニターする方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)対象を第1の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップと、
(b)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の投与スケジュールの効果を評価するステップと、
(c)(i)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、前記対象を第2の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップであって、前記第2の投与スケジュールが、前記HDL治療剤のより低い用量を投与すること、前記HDL治療剤を前記対象により長い期間にわたって注入すること、および前記HDL治療剤を前記対象により少ない回数で投与することのうちの1つまたは複数を含む、ステップ、
(ii)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を第2の投与スケジュールに従って前記HDL治療剤で処置するステップであって、前記第2の投与スケジュールが、前記HDL治療剤のより高い用量を投与すること、前記HDL治療剤を前記対象により短い期間にわたって注入すること、および前記HDL治療剤を前記対象により多い回数で投与することのうちの1つまたは複数を含む、ステップ;または
(iii)前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、前記対象を前記第1の投与スケジュールに従って処置し続けるステップと
を含む、HDL治療剤。 - 前記カットオフ量が、前記投与前の前記対象自身のベースラインに関連する、請求項1または請求項2に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記カットオフ量が、対照量に関連する、請求項1または請求項2に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対照量が、集団の平均値である、請求項4に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、請求項5に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、請求項5に記載の使用のためのHDL治療剤。
- コレステロールを動員するために有効なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)対象の集団にHDL治療剤の第1の用量を投与するステップと、
(b)前記第1の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1の用量の効果を評価するステップと、
(c)前記第1の用量より高いまたは低い、前記HDL治療剤の第2の用量を投与するステップと、
(d)前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第1および/または第2の用量の効果を評価するステップと、
(e)任意選択で、前記HDL治療剤の1つまたは複数の追加の用量によってステップ(c)および(d)を繰り返すステップと、
(f)1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最高用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記HDL治療剤の用量を同定するステップと
を含む、HDL治療剤。 - 前記方法が、前記第2の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージまたは単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第2の用量の効果を評価するステップをさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象の1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第2の用量より低い、前記HDL治療剤の第3の用量を投与する、請求項9に記載の使用のためのHDL治療剤。
- HDL治療剤を必要とする対象を処置する方法に使用するための、任意選択でリポタンパク質複合体であるHDL治療剤であって、前記方法が、前記対象に、
(a)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現を、前記対象のベースライン量または対照量と比較して20%より大きくまたは10%より大きく低減させない用量の前記HDL治療剤と、
(b)任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、PCSK9阻害剤、エゼチミブ、およびCETP阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤と
の組み合わせを投与するステップを含む、HDL治療剤。 - 前記比較される量が、対照量であり、集団の平均値である、請求項11に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、請求項12に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、請求項12に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象がヒトである、または対象の集団がヒト対象の集団である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が非ヒト動物である、または対象の集団が非ヒト動物の集団である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記非ヒト動物がマウスである、請求項16に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 少なくとも1つのHDLマーカーがABCA1である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- ABCA1 mRNA発現レベルが測定される、請求項18に記載の使用のためのHDL治療剤。
- ABCA1タンパク質発現レベルが測定される、請求項18に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCA1カットオフ量が20%〜80%である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCA1カットオフ量が30%〜70%である、請求項21に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCA1カットオフ量が40%〜60%である、請求項22に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCA1カットオフ量が50%である、請求項23に記載の使用のためのHDL治療剤。
- ABCA1発現レベルが、前記第1の用量または前記第2の用量の投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定される、請求項18〜24のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 少なくとも1つのHDLマーカーがABCG1である、請求項1〜25のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- ABCG1 mRNA発現レベルが測定される、請求項26に記載の使用のためのHDL治療剤。
- ABCG1タンパク質発現レベルが測定される、請求項26に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCG1カットオフ量が20%〜80%である、請求項26〜28のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCG1カットオフ量が30%〜70%である、請求項29に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCG1カットオフ量が40%〜60%である、請求項30に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ABCA1カットオフ量が50%である、請求項31に記載の使用のためのHDL治療剤。
- ABCG1発現レベルが、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定される、請求項26〜32のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 少なくとも1つのHDLマーカーがSREBP−1である、請求項1〜33のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- SREBP−1 mRNA発現レベルが測定される、請求項34に記載の使用のためのHDL治療剤。
- SREBP−1タンパク質発現レベルが測定される、請求項34に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記SREBP−1カットオフ量が20%〜80%である、請求項34〜36のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記SREBP−1カットオフ量が30%〜70%である、請求項37に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記SREBP−1カットオフ量が40%〜60%である、請求項38に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記SREBP−1カットオフ量が50%である、請求項39に記載の使用のためのHDL治療剤。
- SREBP−1発現レベルが、投与の2〜12時間、4〜10時間、2〜8時間、2〜6時間、4〜6時間、または4〜8時間後に測定される、請求項34〜40のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- リポタンパク質複合体である、請求項1〜41のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記リポタンパク質複合体がアポリポタンパク質を含む、請求項42に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記アポリポタンパク質が、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoE、またはその組み合わせである、請求項43に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記リポタンパク質複合体がアポリポタンパク質ペプチド模倣体を含む、請求項42に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記ペプチド模倣体が、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、もしくはApoEペプチド模倣体、またはその組み合わせである、請求項45に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記リポタンパク質複合体が、CER−001、CSL−111、CSL−112、またはETC−216である、請求項42に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 低分子である、請求項1〜41のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記低分子がCETP阻害剤である、請求項48に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記低分子がパントテン酸誘導体である、請求項48に記載の使用のためのHDL治療剤。
- カットオフ量を決定することをさらに含む、請求項1〜42のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記カットオフ量が、前記HDL治療剤の用量反応曲線を作成することによって決定される、請求項51に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記カットオフ量が、前記用量反応曲線の変曲点となる用量の25%〜75%である、請求項52に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記カットオフ量が、前記用量反応曲線の変曲点となる用量の40%〜60%である、請求項53に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象または対象の集団が、ABCA1欠損を有する、請求項1〜54のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象または対象の集団が、ABCA1変異に関してホモ接合である、請求項55に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象または対象の集団が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、請求項55に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)対象または対象の集団に前記HDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、
(b)各用量の投与後、前記対象のまたは集団の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、
(c)1つまたは複数の前記HDLマーカーの発現レベルを0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップと
を含む、HDL治療剤。 - 治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)対象または対象の集団に前記HDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、
(b)各用量の投与後、前記対象のまたは集団の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを測定するステップと、
(c)前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における1つまたは複数のHDLマーカーのベースライン発現レベルを維持する、または発現レベルを上昇させる用量を同定し、それによって、治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップと
を含む、HDL治療剤。 - 治療に好適なHDL治療剤の用量を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)対象または対象の集団にHDL治療剤の1つまたは複数の用量を投与するステップと、
(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、
(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップと、
を含む、HDL治療剤。 - 治療に好適なHDL治療剤の投与間隔を同定する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)1回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にHDL治療剤を投与するステップと
(b)前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、
(c)前記対象におけるコレステロール流出を0%より大きく、10%より大きく、または20%より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なHDL治療剤の用量を同定するステップと
によって前記HDL治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む、HDL治療剤。 - 前記1回または複数回の投与回数が、
(a)2日ごとに1〜4時間の注入としての投与、
(b)3日ごとに1〜4時間の注入としての投与、
(c)1週間ごとに24時間の注入としての投与、および
(d)2週間ごとに24時間の注入としての投与
から選択される1回または複数回の投与回数を含む、請求項61に記載の使用のためのHDL治療剤。 - コレステロール流出が、前記対象または対象の集団の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される、請求項59〜62のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 対象にHDL治療剤の治療的有効量を投与することを含む、ABCA1欠損を有する対象を処置する方法に使用するためのHDL治療剤。
- CER−001である、請求項64に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、請求項64または65に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、ABCA1変異に関してホモ接合である、請求項64または65に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法に使用するためのHDL治療剤であって、前記方法が、
(a)前記対象に導入レジメンに従って前記HDL治療剤を投与するステップ、および次に
(b)前記対象に維持レジメンに従って前記HDL治療剤を投与するステップ
を含む、HDL治療剤。 - 前記維持レジメンが、前記HDL治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴う、請求項68に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、ABCA1変異に関してヘテロ接合である、請求項68または請求項69に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、ABCA1変異に関してホモ接合である、請求項68または請求項69に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、LCAT変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項68〜71のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、ApoA−I変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項68〜72のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、ABCG1変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項68〜73のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記対象が、脂質調節薬でも処置される、請求項68〜74のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記脂質調節薬が、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせである、請求項75に記載の使用のためのHDL治療剤。
- CER−001である、請求項68〜76のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記導入レジメンが4週間の期間である、請求項77に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記導入レジメンが、CER−001を週に3回投与することを含む、請求項77または請求項78に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記導入レジメンで投与される用量が、8〜15mg/kg(タンパク質重量に基づく)である、請求項77〜79のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記導入レジメンで投与される用量が、8mg/kg、12mg/kg、または15mg/kgである、請求項80に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記維持レジメンが、CER−001を少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも1年間、少なくとも18か月間、少なくとも2年間、または無限に投与することを含む、請求項77〜81のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記維持レジメンが、CER−001を週に2回投与することを含む、請求項77〜82のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記維持レジメンで投与される前記用量が、1〜6mg/kg(タンパク質の重量に基づいて)である、請求項77〜83のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。
- 前記維持レジメンで投与される前記用量が、1mg/kg、3mg/kg、または6mg/kgである、請求項84に記載の使用のためのHDL治療剤。
- (a)前記導入レジメンが、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および/または集団の平均値と比較して20%〜80%、または40%〜60%低減させる用量を利用する、および/または
(b)前記維持レジメンが、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および/または集団の平均値と比較して20%より大きく、または10%より大きく低減させない用量を利用する、
請求項68〜85のいずれか1項に記載の使用のためのHDL治療剤。 - 前記維持レジメンが、1つまたは複数のHDLマーカーの発現レベルを低減させない用量を利用する、請求項86に記載の使用のためのHDL治療剤。
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