JP2017515511A - 嫌気性又は微好気性微生物の液体培養のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月16日出願の米国特許仮出願第61/994,153号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容の全体を本明細書に参照によって援用するものである。
本発明は、選択培養、並びに/又は試料中の嫌気性及び/又は微好気性微生物の検出に関し、詳細には、酵素−基質系を用いて試料中の標的嫌気性及び/又は微好気性微生物の集団を濃縮する方法に関する。上記を促進する手段も開示される。
微生物は、酸素の要求及び酸素の耐性に基づいて異なる群に大別される。「好気性生物」とは、増殖するうえで酸素を必要とする微生物である。「通性好気性生物」とは、酸素があってもなくても増殖できる微生物である。微生物の別の群として、極めて低濃度の酸素の存在下でのみ増殖できる「微好気性菌生物」がある。最後に、酸素によって阻害されるか又は死滅し、酸素に対する耐性を有さない「嫌気性生物」と呼ばれる微生物群がある。酸素感受性細菌は制御された雰囲気下で培養する必要があり、そのため、酸素を完全に又は限定的に排除するように特に指向されたその培養方法の開発が求められている。
嫌気性及び微好気性微生物の培養にともなう、ここに述べた課題の多くの解決を図るため、標的試料中の嫌気性又は微好気性微生物の選択的濃縮及び検出を促す酸素減少環境を作り出す酸素捕捉系を利用して酸素を効果的に除去又は低減することにより、標的試料中の嫌気性生物及び/又は微好気性生物を培養し、かつ/又はその存在についてスクリーニングするための改良された方法を考案する試みがなされてきた。
以下に本開示を本明細書にてより完全に説明する。以下の詳細な説明の目的では、そうでない旨が明らかに断られている場合を除き、本発明は様々な代替的な変形及び工程の順序を取りうる点は理解されなければならない。したがって、本発明を詳細に説明するのに先立ち、本発明は具体的に例示されるシステム又は実施形態に限定されるものではなく、これらは無論のこと多岐にわたりうるものである点は理解されなければならない。本明細書に述べられる任意の用語の例をはじめとする、本明細書の任意の箇所における実施例の使用はあくまで例示的なものであり、いかなる意味でも本発明又は任意の例示される用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に示される様々な実施形態に限定されない。
実施形態Aは、
容器中で、嫌気性微生物又は微好気性微生物を含む試料、嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を支持する所定体積の培地、及び酸素捕捉系を含む水性混合物を形成することであって、
前記酸素捕捉系が有効量のi)酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質を含み、
前記酸素捕捉系が、水和されると活性化され、それにより前記培地中の溶存酸素を、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を促進する濃度まで減少させる、前記水性混合物を形成することと、
前記水性混合物を、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の少なくとも1回の細胞分裂を促進する条件下でインキュベートすることと、を含む方法である。
容器中で、嫌気性微生物又は微好気性微生物を含む試料、嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を支持する所定体積の培地、及び酸素捕捉系を含む水性混合物を形成することであって、
前記酸素捕捉系が有効量のi)酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質を含み、
前記酸素捕捉系が、水和されると活性化され、それによって前記培地中の溶存酸素を、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を促進する濃度にまで減少させ、
前記酵素が、アスコルビン酸オキシダーゼ及びラッカーゼからなる群から選択される、前記水性混合物を形成することと、
前記水性混合物を、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の少なくとも1回の細胞分裂を促進する条件下でインキュベートすることと、を含む方法である。
前記容器内に酸素の存在又は非存在を示す物質を入れることを更に含む、実施形態A〜AFのいずれか1つに記載の方法である。
有効量のi)酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質と、
容器と、
前記嫌気性又は微好気性微生物の増殖を支持する所定体積の水性培地と、を含み、
前記有効量が、前記所定体積中の溶存酸素を微好気性微生物又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進する濃度まで減少させるのに有効である、培養システムである。
有効量のi)アスコルビン酸オキシダーゼ及びラッカーゼからなる群から選択される、酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質と、
容器と、
前記嫌気性又は微好気性微生物の増殖を支持する所定体積の水性培地と、を含み、
前記有効量が、前記所定体積中の溶存酸素を微好気性微生物又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進する濃度まで減少させるのに有効である、培養システムである。
密封可能な容器と、
i)酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質を含む酸素捕捉系と、を含む、キットである。
密封可能な容器と、
i)アスコルビン酸オキシダーゼ及びラッカーゼからなる群から選択される、酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質を含む酸素捕捉系と、を含む、キットである。
生物:カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)/カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)及びクロストリジウム・スポロゲネス(Clostridiumsporogenes)
使用培地:ボルトンブロス(増菌培地)
試料(バターフィールド緩衝溶液中にカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacterjejuni)/カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)を希釈した一晩培養物)を培地のバッグそれぞれに加えて培地中、約50CFU(約0.002CFU/10μL)の最終濃度とした。バッグを各バッグの開口部のジッパー型のシールを使用して密封した。次いで、バッグ内の培地に適当な体積のストック液を添加して培地中、4Kユニット/Lの酵素(アスコルビン酸オキシダーゼ)及び1.31mg/mLの基質(アスコルビン酸ナトリウム)の最終濃度とした。密封したバッグのそれぞれには、およそ30〜100mLの周囲空気が培地とともにバッグ内に密封されていた。密封した各バッグを42℃の周囲雰囲気中で48時間インキュベートした。別のバッグを準備して上記と同様にインキュベートしたが、試料微生物は加えずに試薬及びバッグの滅菌状態のコントロールとした。この接種していないコントロールは目視では濁っておらず、各成分又はバッグからの汚染による増殖はないことを示した。カンピロバクター(Campylobacter)を接種したバッグも濁りは認められず、微生物が約107/mLよりも高い細胞濃度にまで増殖していないことを示した。カンピロバクター(Campylobacter)集積培養物及びコントロール培地のそれぞれからループ1個分(約10μl)を非選択的チャコールアガー上にストリークし、各プレートを一晩インキュベートした。増殖(すなわち100コロニー/プレートよりも多い)が、カンピロバクター集積培養物試料を接種したプレートで認められ、集積培養物中に作り出された酸素減少環境中で微好気性細菌が増殖したことが確認された。コントロール培地から接種したプレートでは増殖は認められなかった。
試料(バターフィールド緩衝溶液中にクロストリジウム・スポロゲネス(Clostridiumsporogenes)を希釈した一晩培養物)を培地のバッグに加えて培地中、約50CFUの最終濃度とした。次いで、バッグ内の培地に適当な体積のストック液を添加して培地中、4Kユニット/Lの酵素(アスコルビン酸オキシダーゼ)及び6.55mg/mLの基質(アスコルビン酸ナトリウム)の最終濃度とした。上記に述べたようにしてコントロールバッグ(細菌を加えないもの)を調製した。バッグを各バッグの開口部の圧力シールを使用して密封した。密封したバッグのそれぞれには、およそ30〜100mLの周囲空気が培地とともにバッグ内に密封されていた。密封した各バッグを37℃の周囲雰囲気中で48時間インキュベートした。クロストリジウム・スポロゲネスを接種したバッグでは目視できる濁度によって増殖が示された。接種していないコントロールは目視では濁っておらず、各成分又はバッグからの汚染による増殖はないことを示した。
Claims (20)
- 容器中で、嫌気性微生物又は微好気性微生物を含有する試料、嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を支持する所定体積の培地、及び酸素捕捉系を含む水性混合物を形成することであって、
前記酸素捕捉系が有効量のi)酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質を含み、
前記酸素捕捉系が、水和されると活性化され、それにより前記培地中の溶存酸素を、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を促進する濃度まで減少させ、
前記酵素が、アスコルビン酸オキシダーゼ及びラッカーゼからなる群から選択される、ことと、
前記水性混合物を、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の少なくとも1回の細胞分裂を促進する条件下でインキュベートすることと、を含む方法。 - 前記培地中の溶存酸素を前記嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を促進する濃度まで減少させることが、前記培地中の溶存酸素を約100μM以下の濃度にまで欠乏させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記嫌気性微生物又は前記微好気性微生物の増殖を検出することを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記嫌気性微生物又は微好気性微生物を分析し、前記嫌気性微生物又は微好気性微生物を、酸素含有環境中で増殖する能力以外の特徴によって特徴付けられる微生物の属、種、又は群と関連付けることを更に含む、請求項3に記載の方法。
- 前記酵素がアスコルビン酸オキシダーゼを含み、前記基質が、アスコルビン酸若しくはその塩、アスコルビン酸の誘導体若しくはその塩、ヒドロキノン、ピロガロール、カテコール、又はこれらの基質のうち任意の2種以上の混合物から構成される群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素がラッカーゼを含み、前記基質が、フェノール、L−チロシン、o−ジフェノール及びp−ジフェノール、2,6−ジメトキシフェノール、並びにこれらの基質のうち任意の2種以上の混合物からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 好気性微生物と、微好気性微生物又は嫌気性微生物のうちの少なくとも一方とを含む混合微生物集団中の嫌気性又は微好気性微生物の濃縮を促進する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性混合物を形成した後、前記酵素が前記混合物中に少なくとも1000ユニット/Lの濃度で存在する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性混合物を形成した後、前記基質が前記混合物中に約0.1〜100mg/mlの濃度で存在する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性混合物を形成する前に、前記酸素捕捉系の少なくとも一部が、溶液、錠剤、サッシェ、前記容器の壁の内側表面に配置されたコーティング、又は粉末として配備される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性混合物を形成することが、前記酸素捕捉系及び前記試料の混合物を、前記培地と接触させることを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性混合物を形成することが、前記酸素捕捉系を、前記試料及び前記培地を含む水性液体混合物と接触させることを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 増殖を促進する濃度にまで、前記培地中の溶存酸素を減少させることが、前記溶存酸素を約60分以内に前記濃度まで減少させることを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 微好気性微生物又は嫌気性微生物を培養するための培養システムであって、
有効量のi)アスコルビン酸オキシダーゼ及びラッカーゼからなる群から選択される、酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質と、
容器と、
前記嫌気性又は微好気性微生物の増殖を支持する所定体積の水性培地と、を含み、
前記有効量が、前記所定体積中の溶存酸素を微好気性微生物又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進する濃度まで減少させるのに有効である、培養システム。 - 前記有効量が、前記所定体積中の溶存酸素を約100μM以下まで減少させるのに有効である、請求項14に記載の培養システム。
- 前記有効量が、前記所定体積中の溶存酸素を、増殖を促進する濃度まで約60分以内に減少させるのに有効である、請求項14又は15に記載の培養システム。
- 密封可能な容器と、
i)アスコルビン酸オキシダーゼ及びラッカーゼからなる群から選択される酸化還元酵素ファミリーの酵素及びii)前記酵素の基質を含む酸素捕捉系と、を含む、キット。 - 前記酵素が1つ以上の第1の容器に配分され、第1の容器のそれぞれが、前記酵素の基質と反応することによって所定体積の水性培地中の溶存酸素を、嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を促進する溶存酸素濃度まで減少させるのに有効な量の酵素を有する、請求項17に記載のキット。
- 前記基質が1つ以上の第1の容器又は1つ以上の第2の容器に配分され、第1の容器又は第2の容器のそれぞれが、前記酵素と反応して、所定体積の水性培地中の溶存酸素を、嫌気性微生物又は微好気性微生物の増殖を促進する溶存酸素濃度まで減少させるのに有効な量の基質を有する、請求項17又は18に記載のキット。
- pH指示薬を更に含む、請求項17〜19のいずれか1項に記載のキット。
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