BR112016026198B1 - Método e sistema de cultura para cultura de um micro-organismo microaerofílico - Google Patents

Abstract

MÉTODO, SISTEMA DE CULTURA PARA CULTURA DE UM MICRO ORGANISMO MICROAEROFÍLICO OU ANAERÓBICO E KIT. Um sistema de cultura para cultura de um microorganismo anaeróbico ou microaerofílico é fornecido. O sistema de cultura pode incluir quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima, um recipiente, e um volume predeterminado de meio aquoso que suporta o crescimento do dito microorganismo anaeróbico ou microaerofílico. A enzima pode ser selecionada a partir de um grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase. As quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predeterminado em uma concentração que facilita o crescimento de um micro-organismo microaerofílico ou micro-organismo obrigatoriamente anaeróbico. Um método de uso do sistema também é fornecido.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade sobre o Pedido Provisório de Patente US n° 61/994.153, depositado em 16 de maio de 2014, cuja revelação está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] A presente invenção refere-se à cultura seletiva e/ou detecção de micro-organismos anaeróbicos e/ou microaerofílicos em uma amostra e, particularmente, diz respeito a um método de enriquecimento de uma população alvo de micro-organismo(s) anaeróbico(s) e/ou microaerofílico(s) em uma amostra empregando um sistema de enzima-substrato. É também revelado um meio para facilitar o mesmo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Micro-organismos são geralmente classificados em grupos diferentes com base em sua necessidade e tolerância ao oxigênio. "Aeróbios" são micro-organismos que requerem oxigênio para o crescimento. "Aeróbios facultativos" são micro-organismos que são capazes de crescer com ou sem oxigênio. Outro grupo de micro-organismos incluem "microaerófilos", que podem crescer apenas na presença de níveis muito baixos de oxigênio. Finalmente, há uma classe de micro-organismos chamada de "anaeróbios", que não podem tolerar oxigênio, uma vez que podem ser inibidos ou mortos pelo mesmo. Bactérias sensíveis ao oxigênio precisam ser cultivadas sob uma atmosfera controlada, e isto requer o desenvolvimento de métodos para seu cultivo que são especificamente direcionados à exclusão total ou limitada de oxigênio.

[0004] Uma cultura de enriquecimento é uma metodologia comumente empregada para cultura e rastreamento da presença de microorganismos alvo na amostra. Os métodos de cultura anaeróbia convencionalmente conhecidos sendo pouco adequados para uso de rotina, onde o processamento rápido e fácil de amostras numerosas e variadas é necessário, há necessidade de um método melhorado para alcançar anaerobiose de uma forma simples, rápida e altamente eficiente. As indústrias de processamento de alimentos, que rotineiramente testam amostras de alimentos e bebidas para a presença de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos, seriam claramente beneficiadas pela determinação da contaminação microbiana através de um método de cultura rápido, simples e conveniente. Outras indústrias também acolheriam a oportunidade de detectar a contaminação por bactérias anaeróbias de uma forma mais rápida e eficaz.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0005] Ao tentar solucionar muitos dos problemas associados à cultura de micro-organismos anaeróbicos e microaerofílicos aqui descritos, tentativas têm sido feitas para desenvolver um método aprimorado para cultivar e/ou rastrear a presença de anaeróbios e/ou microaerófilos em uma amostra alvo pela eliminação ou redução efetiva de oxigênio com a utilização de um sistema removedor de oxigênio que cria um ambiente esgotado de oxigênio que é apropriado ao enriquecimento seletivo e detecção de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos em uma amostra alvo.

[0006] Vantajosamente, a presente invenção fornece um método rápido, simples e conveniente para cultura de anaeróbios e/ou microaerófilos pela adição de um sistema de enzima-substrato a um meio líquido e uma amostra suspeita de conter um anaeróbio ou microaerófilo em um recipiente, sendo que o dito sistema de enzima-substrato, mediante ativação por hidratação, reduz ou elimina o oxigênio dissolvido tornando a detecção e/ou o enriquecimento de organismos anaeróbicos e/ou microaerofílicos na amostra conveniente e substancialmente mais fácil do que os meios convencionais.

[0007] Vantajosamente, a presente revelação fornece um processo para a cultura de anaeróbios e/ou microaerófilos que não requer procedimentos especiais ou caros para a produção e a manutenção de condições anaeróbicas e que, de fato, podem ser convenientemente e economicamente cultivados em incubadoras em uma grande escala comercial comum. Além disso, ao contrário de técnicas convencionais (por exemplo, caixa de luvas anaeróbia, bolsas de contenção GASPAK para geração de gás), para cultivar micro-organismos anaeróbicos, o método da invenção aqui descrito elimina oxigênio diretamente do meio de cultura líquido, em vez de removê-lo da atmosfera na qual o meio de cultura é mantido.

[0008] Além disso, a presente revelação fornece um método para facilitar a detecção de anaeróbicos e/ou microaerófilos, que vantajosamente é executado de uma maneira mais simples, mais econômica, eficiente e conveniente.

[0009] Além disso, a presente revelação fornece vantajosamente um método para detectar micro-organismos anaeróbicos e/ou microaerofílicos por criação de um ambiente substancialmente esgotado de oxigênio usando um sistema removedor de oxigênio compreendendo uma enzima de uma família de oxidorredutase e o substrato da mesma, criando assim condições propícias para o enriquecimento dos ditos micro-organismos.

[0010] Consequentemente, em outro aspecto, a presente revelação fornece um método. O método pode compreender a formação de uma mistura aquosa no recipiente; a mistura compreendendo uma amostra contendo um micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico, um volume pré-definido de um meio que suporta o crescimento dos ditos micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos, e um sistema removedor de oxigênio. O sistema removedor de oxigênio pode compreender quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima. O sistema removedor de oxigênio pode ser ativado mediante hidratação, esgotando, desse modo o oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento de um micro-organismo anaeróbico ou um microorganismo microaerofílico. A enzima pode ser selecionada a partir de um grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase. O método pode compreender adicionalmente a incubação da mistura aquosa sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular do dito micro-organismo anaeróbico ou microorganismo microaerofílico. Em qualquer modalidade, o método pode compreender adicionalmente a detecção de crescimento de micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico. Em qualquer modalidade, a detecção de crescimento do micro-organismo pode compreender a análise do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico para associar o micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico a um gênero, uma espécie ou um grupo de micro-organismos caracterizados por uma característica diferente de sua capacidade de crescer em um ambiente contendo oxigênio.

[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um sistema de cultura para a cultura de um micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico. O sistema pode compreender quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima, um recipiente, e um volume predeterminado de meio aquoso que suporta o crescimento do dito micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico. A enzima pode ser selecionada a partir de um grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase. As quantidades eficazes podem ser eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predeterminado em uma concentração que facilita o crescimento de um micro-organismo microaerofílico ou micro-organismo obrigatoriamente anaeróbico. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0012] Em ainda um outro aspecto, a presente revelação fornece um kit. O kit pode compreender um recipiente passível de vedação e um sistema removedor de oxigênio, compreendendo quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima. A enzima pode ser selecionada a partir de um grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase. Em qualquer modalidade, as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido a cerca 100 μM ou menos, cerca de 10 μM ou menos, cerca de 1 μM ou menos, 0,1 μM ou menos ou 0,01 μM ou menos. Em qualquer modalidade, as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido à concentração que facilita o crescimento em cerca de 60 minutos ou menos.

[0013] Em qualquer das modalidades acima, o sistema removedor de oxigênio da presente invenção após ativação cria um ambiente que é substancialmente esgotado de oxigênio ou contém traços de oxigênio para facilitar a cultura de anaeróbios obrigatórios ou microaerófilos, respectivamente.

[0014] Em qualquer uma das modalidades acima da presente invenção, o sistema removedor de oxigênio após a ativação permite o enriquecimento seletivo de micro-organismos anaeróbicos e/ou microaerofílicos contidos na amostra alvo.

[0015] Em qualquer uma das modalidades acima, o recipiente pode ser um recipiente que seja substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0016] As características e vantagens da presente invenção serão entendidas levando em consideração a descrição detalhada das modalidades preferenciais, bem como as reivindicações em anexo. Essas e outras características e vantagens da invenção podem ser descritas a seguir em conexão com várias modalidades ilustrativas da invenção.

[0017] O sumário supracitado da presente invenção não se destina a descrever cada uma das modalidades apresentadas ou todas as implementações da presente invenção. A descrição detalhada a seguir exemplifica mais particularmente as modalidades ilustrativas. Outras características, objetivos e vantagens se tornarão evidentes a partir da descrição e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0018] A presente invenção será agora descrita mais completamente a seguir. Para os propósitos da seguinte descrição detalhada, deve ser entendido que a invenção pode assumir várias variações alternativas e sequências de etapas, exceto onde expressamente especificado o contrário. Dessa forma, antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não é limitada às modalidades ou sistemas especificamente exemplificados que podem, obviamente, variar. O uso de exemplos em qualquer local neste relatório descritivo, incluindo exemplos de quaisquer termos discutidos aqui, é apenas ilustrativo, e de nenhuma maneira limita o escopo e o significado da invenção ou de qualquer termo exemplificado. Da mesma forma, a invenção não está limitada às diversas modalidades dadas neste relatório descritivo.

[0019] Para uso na presente invenção, as formas singulares "um", "uma", "a" e "o" incluem referência no plural, a não ser que o contexto claramente determine de outro modo. O termo "e/ou" significa um ou todos os elementos mencionados, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos mencionados.

[0020] Os termos "preferencial" e "preferencialmente" referem-se a modalidades da invenção que podem oferecer certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras modalidades podem também ser preferenciais, sob circunstâncias iguais ou diferentes. Ademais, a menção de uma ou mais modalidades preferenciais não acarreta que outras modalidades não sejam úteis e não pretende excluir outras modalidades do escopo da invenção.

[0021] Quando o termo "cerca de" é usado na descrição de um valor ou um ponto final de um intervalo, a descrição deve ser compreendida como incluindo o valor específico ou o ponto final referido.

[0022] Para uso na presente invenção, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "contendo", "caracterizado por", "tendo" ou qualquer outra variação dos mesmos, pretendem cobrir uma inclusão não exclusiva.

[0023] O termo "micro-organismo" ou "micróbio" refere-se a qualquer organismo microscópico, que pode ser um organismo de célula única ou multicelular. O termo é geralmente usado para se referir a qualquer organismo microscópico procariótico ou eucariótico, capaz de crescer e se reproduzir em um meio de cultura adequado, incluindo sem limitação, uma ou mais bactérias. Micro-organismos abrangidos pelo escopo da presente invenção incluem procariotas, ou seja, as bactérias e arqueas; e várias formas de eucariotas, compreendendo os protozoários, fungos, leveduras (por exemplo, levedura anaeróbica), algas, etc. O termo "micro-organismo alvo" refere-se a qualquer micro-organismo que se deseja detectar.

[0024] O termo "micro-organismo anaeróbico" ou "anaeróbio", como usado aqui, refere-se a micro-organismos que são sensíveis ao oxigênio e não crescerão na presença de oxigênio. Um micro-organismo anaeróbico ou anaeróbio é qualquer organismo que não requer oxigênio para o crescimento. Micro-organismos anaeróbicos incluem tanto anaeróbicos facultativos quanto anaeróbicos obrigatórios. Micro-organismos anaeróbicos obrigatórios são aqueles que morrem quando expostos a níveis de oxigênio atmosféricos. Um anaeróbio facultativo é um organismo que pode realizar respiração aeróbica se o oxigênio está presente, mas que é capaz de trocar a fermentação ou respiração anaeróbica se o oxigênio está ausente. Métodos e sistemas da presente invenção poderiam ser usados para o enriquecimento e detecção tanto de anaeróbicos obrigatórios quanto de anaeróbicos facultativos.

[0025] O termo "micro-organismo microaerofílico" ou "microaerófilos" é usado aqui para se referir a qualquer micro-organismo que cresce na presença de micro quantidades de oxigênio. Microaerófilos usam oxigênio, mas apenas em concentrações muito baixas (faixa de baixo micromolar), tipicamente níveis de concentração de oxigênio de 5 a 15% com crescimento inibido por concentrações normais de oxigênio ou concentrações maiores que cerca de 15%.

[0026] O termo "cultura" ou "crescimento" de micro-organismos, como usado aqui, refere-se ao método de multiplicação de organismos microbianos ao deixá-los reproduzir em meios de cultura predeterminados sob condições propícias para seu crescimento. Mais particularmente, é o método de fornecimento de um meio de cultura e condições adequados para facilitar ao menos uma divisão celular do micro-organismo. Os meios de cultura são meios sólidos, semissólidos ou líquidos contendo todos os nutrientes necessários e todos os parâmetros físicos de crescimento necessários para o crescimento microbiano.

[0027] O termo "enriquecimento", como usado aqui, refere-se ao método de cultura de enriquecimento seletivo para o crescimento de um microorganismo específico pelo fornecimento de meio e condições com atributos específicos e conhecidos que favorecem o crescimento daquele microorganismo específico. O ambiente de cultura de enriquecimento suportará o crescimento de um micro-organismo selecionado, enquanto inibe o crescimento de outros.

[0028] "Removedor de oxigênio", "sistema removedor de oxigênio", "sistema de enzima-substrato" serão usados amplamente aqui para referir-se a um sistema que pode consumir, esgotar ou reagir com oxigênio de um dado ambiente. De preferência, o sistema removedor de oxigênio compreende um sistema de enzima-substrato, compreendendo quantidades eficazes de uma enzima de uma família de oxidorredutase e um substrato para a dita enzima e é capaz de remover ativamente o oxigênio de um determinado ambiente mediante a ativação.

[0029] O termo "ativação" ou "ativado" refere-se a um estado no qual o sistema removedor de oxigênio é capaz de remover de oxigênio, conforme descrito na presente invenção. De acordo com a presente invenção, o processo de ativação provoca a função catalítica da enzima tipicamente através de hidratação. Preferencialmente, de acordo com a presente invenção, a hidratação é obtida através do contato com o meio líquido ou amostra.

[0030] Os termos "inativação", ou "inativado" referem-se a um estado no qual o sistema removedor de oxigênio não é capaz de remover o oxigênio. O sistema removedor de oxigênio é tipicamente mantido em um estado "inativo" até um ponto próximo ou coincidente com a adição da amostra contendo micro-organismos no meio, a fim de preservar a atividade enzimática do sistema removedor de oxigênio e evitar a ativação prematura do dito sistema, antes do início da remoção de oxigênio em uma amostra alvo ou meio.

[0031] Os componentes mínimos do sistema removedor de oxigênio compreendem uma enzima capaz de reduzir o oxigênio molecular e um substrato adequado para a dita enzima. De preferência, o dito sistema compreende uma quantidade eficaz de uma enzima de uma família de oxidorredutase e seu substrato adequado. Com mais preferência, o sistema de enzima-substrato que pode ser usado na presente invenção envolve o uso de uma enzima de uma família de oxidorredutase, a enzima selecionada a partir do grupo que consiste em ascorbato oxidase, lacase ou combinações das mesmas.

[0032] Os termos "substrato redutor", "substrato" e "redutor" são aqui usados de forma intercambiável e referem-se a uma substância que é capaz de atuar como uma fonte de elétrons para a enzima incluída no sistema removedor de oxigênio da invenção.

[0033] A presente revelação refere-se, de modo geral, a artigos e métodos para o crescimento de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos. Em particular, a presente revelação fornece um sistema para a cultura de bactérias anaeróbicas ou microaerofílicas. O sistema compreende quantidades eficazes de uma enzima oxidorredutase que reduz o oxigênio molecular e um substrato correspondente que é oxidado em uma reação que consome oxigênio. Vantajosamente, o sistema inventivo é altamente estável (por exemplo, à temperatura ambiente) e o sistema elimina a necessidade por equipamento especializado e/ou gases comprimidos a fim de alcançar e manter um ambiente anaeróbico. Além disso, o sistema é capaz de criar um ambiente líquido que facilita o crescimento de um micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico menos de uma hora após o sistema ser ativado.

[0034] Tem sido amplamente reconhecido que o potencial para contaminação bacteriana existe em produtos que se destinam ao consumo ou uso humano. Os fabricantes e/ou processadores dos produtos destinados ao consumo humano geralmente testam estes produtos para assegurar a qualidade e a segurança dos produtos para consumo humano. Alimentos, produtos farmacêuticos, bebidas, cosméticos e água são rotineiramente testados para contaminação microbiana por micro-organismos patogênicos, incluindo bactérias anaeróbicas e microaerofílicas.

[0035] Classicamente, a cultura e o enriquecimento de anaeróbios foram extremamente difíceis devido à necessidade de se excluir oxigênio, crescimento lento e requisitos complexos de crescimento. Meios de cultura anaeróbicos precisam ser mantidos sob condições completamente isentas de oxigênio e isso exige a adoção de técnicas físicas e químicas complicadas. Para esta finalidade, o rastreamento, cultura e manutenção laboratorial de bactérias anaeróbicas exigem recipientes de cultura especializados, equipamento de incubação, meios que tornam o processo extremamente trabalhoso, caro e demorado. Adicionalmente, a operação desses dispositivos tipicamente requer também procedimentos de configuração elaborados que necessitam de mão-de- obra qualificada. Por estas razões, os testes de rotina de alimentos/água ou outras amostras biológicas quanto à presença ou ausência de micro-organismos anaeróbicos tornaram-se extremamente complicados desencorajando, desse modo, sua utilização de rotina.

[0036] Métodos que têm sido empregados tradicionalmente para alcançar a anaerobiose incluem técnicas físicas e químicas, como o uso da câmara anaeróbica, exclusão de oxigênio ou produção de vácuo, técnica de aspersão envolvendo o deslocamento de oxigênio com outros gases, o uso de agentes redutores, absorção de oxigênio por meios químicos ou biológicos e redução do oxigênio.

[0037] Uma câmara anaeróbica é, por exemplo, uma caixa com luvas de plástico que contém uma atmosfera de H2, CO2 e N2. Os meios de cultura são colocados no interior da câmara por meio de uma trava de ar que pode ser evacuada e recarregada novamente com N2.

[0038] Um outro método convencional de criação de um ambiente anaeróbico é por incubação das culturas em dessecadores a vácuo, mas a adaptação em larga escala desse método tem sido restrita devido à incapacidade de obter anaerobiose completa.

[0039] O frasco de velas tradicional que se baseia no princípio de deslocamento de oxigênio é ainda um outro método popular mas ineficaz. A metodologia empregada inclui colocar as placas inoculadas dentro de um recipiente grande hermético e uma vela acesa é mantida dentro dela antes da tampa ser selada. Embora normalmente seja esperado que a vela use todo o oxigênio disponível antes de se extinguir, na prática, traços de oxigênio sempre são deixados para trás.

[0040] Um outro método para remover o oxigênio do meio líquido é por meio da adição de agentes redutores. Mas a maioria desses agentes são agentes redutores fortes e qualquer agente residual presente no meio tende a inibir o crescimento subsequente de anaeróbios no meio.

[0041] Têm sido tentado obter anaerobiose por outros meios químicos empregando mistura de produtos químicos; isto é, misturas compreendendo ácido pirogálico/hidróxido de sódio, misturas compreendendo cromo/ácido sulfúrico, misturas compreendendo boroidreto de sódio/cloreto de cobalto ou misturas compreendendo ácido cítrico/bicarbonato de sódio (por exemplo, como em um sistema de bolsas de contenção GASPAK para geração de gás), nas quais o gás hidrogênio e o dióxido de carbono são produzidos. O hidrogênio então reage com o gás oxigênio em um catalisador de paládio para produzir mais água, removendo, assim, o gás oxigênio. Algumas das desvantagens frequentemente encontradas que limitam o uso desses métodos químicos incluem a liberação de monóxido de carbono, que pode inibir o crescimento de algumas bactérias sensíveis a este gás. Ainda outra limitação, particularmente, no emprego de um sistema de bolsas de contenção GASPAK para geração de gás é a geração e a gestão de grandes volumes da água formada durante a reação catalítica.

[0042] A aspersão do meio líquido com nitrogênio de alta pureza ou outro gás inerte remove de maneira eficaz o oxigênio do meio líquido. Mas este método frequentemente resulta em formação de espuma do meio líquido e problemas mecânicos associados. Além disso, após a aspersão ser parada, o meio é facilmente recontaminado com oxigênio. Modernos laboratórios anaeróbicos ainda usam adaptações dessa técnica na forma de estações de emissão de gases. Mas estações de emissão de gases não estão disponíveis comercialmente e têm de ser feitas de forma personalizada. Isto representa grande desafio em relação a custo e tempo.

[0043] Fica claro que os métodos convencionais requerem o uso de equipamento relativamente caro, juntamente com o dispêndio de grandes quantidades de tempo, trabalho e habilidade, entretanto, são na maioria ineficazes na obtenção de anaerobiose completa.

[0044] A enzima ácido L-ascórbico oxidase/ascorbato oxidase é uma enzima multi-cobre que pertence à família de oxidorredutases (EC 1.10.3.3) que catalisa a redução de quatro elétrons de oxigênio à água com a oxidação concomitante de um elétron de um substrato (isto é, ascorbato ou ácido ascórbico). Essa enzima catalisa as reações químicas que incluem, mas não se limitam aos reagentes ("substratos") e produtos mostrados na seguinte reação exemplificadora:

[0045] Dessa forma, os dois substratos da enzima ácido L- ascórbico oxidase/ascorbato oxidase na reação exemplificadora são L-ascorbato e O2, enquanto seus dois respectivos produtos são desidroascorbato e H2O.

[0046] Em qualquer modalidade, o substrato para ascorbato oxidase compreende ácido ascórbico e sais do mesmo, particularmente sais de metais alcalinos. Na presente invenção, exemplos de um composto de ácido ascórbico incluem ácido L-ascórbico, L-ascorbato de sódio, L-ascorbato de cálcio e D-iso-ascorbato de sódio, e podem ser usados individualmente ou sob a forma de uma mistura dos mesmos. Ácido ascórbico oxidase é conhecida por catalisar reações que consomem oxigênio com derivados de ácido ascórbico e sais dos mesmos, bem como os substratos não ascorbato. Alguns exemplos não limitadores de derivados de ácido ascórbico incluem D-iso-ascorbato, ácido D- araboascórbico, 6-amino-L-ascorbato, 6-desóxi-L-ascorbato, D-eritroascorbato, 6-O-fenil-L-ascorbato e 6-S-fenil-L-ascorbato. Alguns exemplos não limitadores de substratos não ascorbato podem incluir hidroquinona, pirogalol, catecol e similares. Os termos "ácido ascórbico" e "ascorbato" serão usados de forma intercambiável na presente invenção para referir-se tanto a ácido ascórbico quanto a sais do mesmo.

[0047] A enzima lacase refere-se a uma enzima oxidorredutase multi-cobre (EC 1.10.3.2) que catalisa a redução de quatro elétrons de oxigênio à água com a oxidação concomitante de um elétron de um substrato.

[0048] A lacase é conhecida por oxidar uma ampla gama de moléculas fenólicas, bem como algumas pequenas moléculas não fenólicas. Consequentemente, substratos adequados para uso com a lacase em um sistema removedor de oxigênio da presente revelação incluem, mas não se limitam a, fenois, L-tirosina, o-difenol, p-difenol.

[0049] Em um aspecto, a presente revelação fornece um sistema para a cultura de um micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico. Em qualquer modalidade, o dito sistema pode compreender uma quantidade eficaz de uma enzima de uma família de oxidorredutase e um substrato para a dita enzima e o dito sistema de enzima e substrato torna-se ativado após hidratação por contato com o meio líquido, criando assim um ambiente aquoso substancialmente esgotado de oxigênio; propício ao crescimento de micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico. Em qualquer modalidade, um ambiente aquoso que é "substancialmente esgotado de oxigênio", como usado aqui, refere-se a um ambiente aquoso (por exemplo, um tampão aquoso, ou meio de cultura) que, após a ativação do sistema de enzima e substrato em um ambiente aquoso, compreende menos que 50% do oxigênio dissolvido que estava presente em um ambiente aquoso, antes de ativar o sistema de enzima e substrato.

[0050] Um líquido aquoso bem misturado que é saturado com ar compreende cerca de 470 μM de oxigênio dissolvido a 30°C. R.A. Ludwig ("Mesophilic bacteria transduce energy via oxidative metabolic gearing", Research In Microbiology, vol. 155 (2004), pp. 61-70) revela que a taxa de atividade metabólica de micro-organismos aeróbicos diminui significativamente em concentrações de oxigênio dissolvido abaixo de cerca 10 μM e essencialmente cessa em concentrações de oxigênio dissolvido abaixo de cerca de 0,2 μM. Em contraste, Ludwig revela que micro-organismos microaerofílicos exibem atividade metabólica em ambientes com concentrações de oxigênio dissolvido na faixa de cerca de 0,001 μM a cerca de 200 μM com a maior atividade metabólica em ambientes com concentrações de oxigênio dissolvido na faixa de cerca de 0,05 μM a cerca de 10 μM. Além disso, Ludwig revela que micro-organismos estritamente anaeróbicos exibem a mais alta taxa de atividade metabólica em ambientes com concentrações de oxigênio dissolvido menor ou igual a cerca de 0,005 μM. A atividade metabólica de anaeróbios estritos essencialmente cessa em ambientes com concentrações de oxigênio dissolvido superior a cerca de 0,2 μM.

[0051] Um versado na técnica reconhecerá que o oxigênio dissolvido pode ser medido em um líquido aquoso usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, um medidor de oxigênio dissolvido e uma sonda.

[0052] Em qualquer modalidade de um método usado para enriquecer um micro-organismo anaeróbico e/ou micro-organismo microaerofílico, um ambiente aquoso que é "substancialmente esgotado de oxigênio", como usado aqui, refere-se a um ambiente aquoso (por exemplo, um tampão aquoso ou meio de cultura) que; após a ativação do sistema de enzima e substrato em um ambiente aquoso; tem uma concentração de oxigênio dissolvido menor ou igual a cerca de 100 μM, menor ou igual a cerca de 50 μM, menor ou igual a cerca 10 μM, menor ou igual a cerca de 5 μM, menor ou igual a cerca de 1 μM, menor ou igual a cerca de 0,5 μM, menor ou igual a cerca de 0,1 μM, menor ou igual a cerca de 0,05 μM, menor ou igual a cerca de 0,01 μM, ou menor ou igual a cerca de 0,005 μM.

[0053] O método, sistema ou kit da presente revelação podem ser usados para favorecer o crescimento de um micro-organismo microaerofílico em relação ao crescimento de um micro-organismo aeróbico. Consequentemente, em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 0,01 μM e cerca de 10 μM. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 0,01 μM e cerca de 1 μM. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 0,1 μM e cerca de 1 μM.

[0054] O método, sistema ou kit da presente revelação podem ser usados para favorecer o crescimento de um micro-organismo microaerofílico em relação ao crescimento de um micro-organismo anaeróbico. Consequentemente, em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 0,05 μM e cerca de 100 μM. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 0,01 μM e cerca de 100 μM. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 0,5 μM e cerca de 1 μM. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo microaerofílico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido em uma concentração entre cerca de 1 μM e cerca de 100 μM.

[0055] O método, sistema ou kit da presente revelação podem ser usados para favorecer o crescimento de um micro-organismo anaeróbico estrito em relação ao crescimento do micro-organismo microaerofílico. Consequentemente, em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo anaeróbico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotar o oxigênio dissolvido a uma concentração de cerca de 0,2 μM ou menos. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo anaeróbico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotamento do oxigênio dissolvido a uma concentração de cerca de 0,1 μM ou menos. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo anaeróbico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotamento do oxigênio dissolvido a uma concentração de cerca de 0,05 μM ou menos. Em qualquer modalidade de um método de enriquecimento e/ou detecção de um micro-organismo anaeróbico, de acordo com a presente revelação, esgotar substancialmente o oxigênio em um meio de cultura pode compreender esgotamento do oxigênio dissolvido a uma concentração de cerca de 0,01 μM ou menos.

[0056] Em qualquer modalidade de um método ou sistema da presente revelação, o termo "quantidade eficaz" deve ser compreendido como significando uma quantidade de enzima e/ou substrato de enzima eficaz na obtenção de um efeito de remoção de oxigênio que reduz a concentração do oxigênio dissolvido em um dado volume de meio aquoso em uma proporção que permita o crescimento de um micro-organismo microaerofílico ou um microorganismo anaeróbico por um período de tempo suficiente, opcionalmente para facilitar a detecção do micro-organismo.

[0057] A quantidade de enzima empregada em um sistema removedor de oxigênio pode depender de vários fatores como, por exemplo, o volume da amostra, a concentração inicial de oxigênio, a concentração desejada de oxigênio necessária para um dado ambiente (por exemplo, para facilitar o crescimento de micro-organismo anaeróbio obrigatório versus um microaerofílico), a taxa desejada de remoção (por exemplo, para minimizar a exposição dos anaeróbios obrigatórios a concentrações de oxigênio potencialmente letais), taxa de entrada de oxigênio (por exemplo, se o recipiente não é impermeável ao oxigênio), e a atividade específica da enzima empregada. Em qualquer modalidade, entretanto, após a formação da mistura aquosa usando o método da presente revelação, a enzima pode estar presente na mistura em uma quantidade de ao menos 1K Unidades/L (1000 unidades/L), ou em alguns casos, ao menos de 2K Unidades/L (2000 unidades/L), ou em alguns casos, ao menos de 3K Unidades/L (3000 unidades/L), ou em alguns casos, ao menos de 4K Unidades/L (4000 unidades/L). Para facilitar rápido esgotamento do oxigênio dissolvido em um meio de cultura aquoso, após a formação da mistura aquosa, a enzima pode estar presente na mistura em uma quantidade de ao menos 4K Unidades/L do volume total do meio líquido.

[0058] A quantidade de substrato de enzima empregado no sistema removedor de oxigênio pode também afetar a velocidade, extensão e duração do esgotamento de oxigênio de um dado ambiente em um recipiente da presente revelação. Consequentemente, em qualquer modalidade, após a formação da mistura aquosa usando o método da presente revelação, o substrato presente na mistura pode estar em cerca de 0,1 a 100 mg/ml. Em qualquer modalidade, a concentração do substrato da enzima na mistura aquosa da presente revelação pode ser de cerca de 0,1 a 50 mg/ml. Em qualquer modalidade, a concentração do substrato da enzima na mistura aquosa da presente revelação pode ser de cerca de 0,1 a 10 mg/ml. Em qualquer modalidade, a concentração do substrato da enzima na mistura aquosa da presente revelação pode ser de cerca de 0,1 a 5 mg/ml. Um versado na técnica entenderia que a quantidade do substrato pode variar dependendo da taxa desejada de remoção a ser alcançada, ou a concentração de oxigênio desejada a ser obtida em um dado volume de meio líquido, dependendo da natureza do micro-organismo alvo a ser enriquecido.

[0059] É bem conhecido que a hidratação é necessária para a função catalítica da enzima e que enzimas secas são não funcionais. A hidratação pode facilitar a função catalítica e/ou a difusão de substrato e produto. Consequentemente, o sistema de substrato da enzima, de acordo com a presente invenção, é ativado mediante contato com umidade suficiente; abaixo de um limite do nível de hidratação, o sistema de substrato da enzima é substancialmente inativo. O termo "sistema removedor de oxigênio", como usado aqui, refere-se tanto ao sistema ativado quanto ao desativado. Consequentemente, de acordo com a invenção, o sistema de enzima-substrato pode ser implantado em uma variedade de formatos, como uma forma de comprimido (pílulas, anéis ou pequenas esferas), forma liofilizada, um sachê, um revestimento por aspersão no interior do recipiente, bolsas de contenção ou cápsulas solúveis ou degradáveis (por exemplo, degradáveis em contato com uma solução aquosa), ou em meio de rápida dissolução em pó.

[0060] Em qualquer modalidade, é contemplado que a enzima ou substrato da enzima do sistema da presente revelação podem ser implantados como um pó aglomerado. Opcionalmente, a enzima ou substrato da enzima podem ser aglomerados com um ou mais nutrientes (por exemplo, caldo de nutrientes ou nutrientes em pó) de um meio de cultura (por exemplo, um meio de cultura de caldo de enriquecimento), conforme revelado na publicação de patente PCT n° WO2014/025514; que é aqui incorporado na íntegra, a título de referência.

[0061] De acordo com um aspecto da invenção, a enzima e o substrato podem ser incorporados no meio líquido após a esterilização do meio. De acordo com um outro aspecto, a enzima ou a enzima-substrato podem ser adicionadas concomitantemente com a amostra contendo o micro-organismo no meio. Em uma outra modalidade, a enzima-substrato pode ser adicionada após a adição da amostra. Em qualquer modalidade, o meio e a amostra podem ser adicionados ao sistema de enzima substrato que foi aplicado como revestimento sobre a parede do recipiente.

[0062] A presente revelação é, em geral, direcionada ao método para cultura e/ou detecção de micro-organismos anaeróbicos/microaerofílicos em uma amostra. A amostra pode ser obtida de uma variedade de fontes. Em qualquer modalidade, a fonte pode ser uma fonte de alimento (por exemplo, um ingrediente alimentício, uma amostra de alimento durante o processo, ou uma amostra de alimento do produto acabado). Em algumas modalidades, a fonte pode ser uma fonte não alimentar. Em contraste com os métodos convencionais para a detecção de micro-organismos anaeróbicos/microaerofílicos, que requerem procedimentos trabalhosos, o método da invenção permite facilmente que o usuário combine simplesmente a amostra com um meio pré-definido e um sistema removedor de oxigênio, de acordo com a invenção, para criar condições propícias ao enriquecimento e detecção de micro-organismos anaeróbicos/microaerofílicos.

[0063] De acordo com uma modalidade, uma amostra a ser testada pode compreender o fornecimento de uma amostra que é suspeita de conter um micro-organismo anaeróbico/microaerófilo alvo. Exemplos não limitadores de amostras adequadas incluem amostras de alimentos, ou seja, variedade de alimentos, bebidas ou fontes ambientais de processamento de alimentos ou bebidas. Exemplos não limitadores de tais fontes de alimentos incluem vegetais ou frutas crus ou processados, carne crua ou processada, produtos lácteos fluidos ou não fluidos, xaropes, bebidas fermentadas, água potável, leite e similares. Alimentos ou bebidas pasteurizados podem também formar fontes adequadas. Exemplos também incluem, mas não se limitam a, carnes, aves, ovos, peixe, frutos do mar, vegetais, frutas, alimentos preparados (por exemplo, sopas, molhos, pastas), produtos de grão (por exemplo, farinha, cereais, pães), alimentos enlatados, queijo, leite, outros produtos lácteos(por exemplo, queijo, iogurte, creme azedo), gorduras, óleos, sobremesas, condimentos, especiarias, massas, bebidas, água, rações para animais, outros materiais comestíveis adequados e combinações dos mesmos.

[0064] O termo "alimento" refere-se a uma fonte sólida ou líquida (por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, soluções, dispersões, emulsões, suspensões, etc., e combinações das mesmas) e/ou composição comestível semissólida.

[0065] Amostras adequadas a serem usadas em um método da presente invenção também incluem amostras clínicas derivadas de uma variedade de fontes humanas/animais, como fluido fisiológico, por exemplo, sangue, saliva, fluido sinovial, pus, suor, fluido cerebrospinal, urina, leite de lactação, exsudatos, amostra nasal, bile, medula óssea, aspirado direta do pulmão, biópsia de tecido de um sítio normalmente estéril, fluido de um sítio normalmente estéril (como uma articulação), abcesso dental, abcesso abdominal ou pélvico, um ferimento (por exemplo, uma ferida traumática ou cirúrgica), uma queimadura grave, bem como outros possíveis tecidos infectados e similares. Em qualquer modalidade, a amostra a ser testada pode compreender um tecido biológico e/ou um fluido biológico.

[0066] Amostras adequadas a serem usadas em um método da presente revelação também incluem amostras ambientais (por exemplo, amostras ambientais de água (por exemplo, água de superfície, água de processo), amostras de solo, amostras de resíduo de superfície e similares).

[0067] Várias técnicas de amostragem podem ser empregadas para a coleta da amostra suspeita de conter um micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico alvo. Tais técnicas de amostragem também são adequadas para os métodos da presente invenção. A amostra de teste (por exemplo, líquida) pode ser submetida a tratamento prévio para rastreamento, como, por exemplo, isto pode incluir concentração, precipitação, filtração, centrifugação, diálise, diluição e similares. Em qualquer modalidade, uma ou mais diluições da amostra diferentes podem ser preparadas e cada uma das diluições pode ser usada como inóculo.

[0068] Em um outro aspecto, a presente revelação fornece um método para a redução e/ou remoção de oxigênio compreendendo: a) fornecimento de um recipiente para conter uma amostra alvo suspeita de conter um micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico; b) fornecimento de um sistema removedor de oxigênio compreendendo: a) uma quantidade eficaz de uma enzima de uma família de oxidorredutase; e b) uma quantidade eficaz de um substrato redutor, e c) colocar os conteúdos do recipiente em contato com o sistema removedor de oxigênio de modo que oxigênio seja reduzido ou removido do recipiente vedado promovendo assim o enriquecimento e/ou detecção do micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser um recipiente vedado. Vantajosamente, um recipiente vedado permite menor entrada de oxigênio da atmosfera ambiente após o sistema removedor de oxigênio ser ativado.

[0069] Em qualquer modalidade, a presente invenção fornece um método para o cultivo de micro-organismos anaeróbicos e/ou microaerofílicos, compreendendo a formação de uma mistura aquosa em um recipiente; a mistura compreendendo uma amostra contendo um micro-organismo anaeróbico, volume pré-definido de um meio que suporta o crescimento dos ditos microorganismos anaeróbicos ou microaerofílicos, e um sistema removedor de oxigênio; sendo que o dito sistema removedor de oxigênio compreende quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima, em que o dito sistema removedor de oxigênio sendo ativado mediante hidratação cria, assim, um ambiente aquoso substancialmente esgotado de oxigênio; e incubação da amostra, meio e sistema removedor de oxigênio sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular do dito micro-organismo anaeróbico. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser um recipiente que é substancialmente impermeável ao oxigênio. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser um recipiente vedado. Vantajosamente, um recipiente vedado permite menor entrada de oxigênio da atmosfera ambiente após o sistema removedor de oxigênio ser ativado.

[0070] De acordo com outra modalidade preferencial, a presente revelação fornece um método para detectar um micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico em uma amostra. Consequentemente, a presente revelação fornece um método de detecção de um micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico em uma amostra, o método compreendendo: colocar em contato em um recipiente, um volume pré-definido de líquido aquoso compreendendo: uma amostra suspeita de conter um micro-organismo anaeróbico, um meio que suporte o crescimento do dito micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico, e um sistema removedor de oxigênio; em que o dito sistema removedor de oxigênio compreende uma enzima de uma família de oxidorredutase e um substrato para a dita enzima; em que o dito sistema removedor de oxigênio sendo ativado mediante hidratação cria, assim, um ambiente aquoso substancialmente esgotado de oxigênio; incubação da amostra, meio e sistema removedor de oxigênio sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular do dito micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico; e detectar a presença ou a ausência do dito micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser um recipiente que é substancialmente impermeável ao oxigênio. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser um recipiente vedado. Vantajosamente, um recipiente vedado permite menor entrada de oxigênio da atmosfera ambiente após o sistema removedor de oxigênio ser ativado.

[0071] Consequentemente, a presente revelação fornece um sistema para a cultura de micro-organismo[s] anaeróbico[s] e/ou microaerofílico[s], o dito sistema compreendendo: quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima, a dita enzima e substrato sendo ativados mediante hidratação, criando, assim um ambiente desprovido de oxigênio ou contendo traços de oxigênio; um recipiente, e um volume predeterminado de meio aquoso que suporta o crescimento do dito micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0072] O termo "recipiente" ou "embalagem" refere-se a um objeto que forma um invólucro definindo um espaço interior projetado para reter uma amostra alvo de qualquer tipo e que é dotada de propriedades de barreira ao oxigênio. Os termos "recipiente vedado" e "embalagem vedada" referem-se a um recipiente que define um espaço interior projetado para conter o meio aquoso, a amostra alvo e o sistema removedor de oxigênio, em que o dito recipiente é projetado para evitar, substancialmente, a comunicação desobstruída com a atmosfera ambiente existente no exterior do recipiente. O recipiente pode estar sob a forma de uma bolsa de contenção, um envelope, um envoltório vedado, uma bolsa, uma lata, um recipiente, uma caixa ou uma bolsa de barreira, uma bolsa de armazenamento com zíper (por exemplo, uma bolsa de armazenamento ZIPLOC) ou similares, uma bolsa misturadora de laboratório (por exemplo, uma bolsa STOMACHER), um frasco com uma rolha ou um septo, uma garrafa com uma tampa ou um septo, ou qualquer forma de contenção vedada adequada para contenção e crescimento de uma cultura microbiana em um meio aquoso. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser passível de vedação e, opcionalmente, novamente passível de vedação.

[0073] O recipiente pode ter qualquer formato ou tamanho adequado usado para confinar e conter um volume de meio e/ou amostra suspeito de conter um micro-organismo anaeróbico e/ou microaerofílico. Além disso, o recipiente pode ser desprovido de meio nutritivo adequado ou um meio nutritivo pode ser incluído no recipiente. O recipiente ou a embalagem pode ser do tipo de uso único, descartável, de um recipiente. Alternativamente, o recipiente ou embalagem pode ser reutilizável. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser esterilizado usando processos que são conhecidos na técnica para o material específico do qual o recipiente é feito.

[0074] Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser feito de substâncias que são substancialmente impermeáveis ao oxigênio, de modo que o influxo de oxigênio através da parede do recipiente não reprima substancialmente a capacidade do sistema de remoção de oxigênio de esgotar e/ou manter o oxigênio em um meio aquoso no recipiente em uma concentração que suporte o crescimento de um micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico.

[0075] Em qualquer modalidade, o recipiente pode compreender uma porta passível de vedação (por exemplo, um septo perfurável auto-vedante) para a adição da amostra ou um reagente, por exemplo. Adicional ou alternativamente, a porta passível de vedação pode ser usada para remover material (por exemplo, uma porção ou toda a mistura aquosa da presente revelação, uma parte ou o todo de qualquer gás (por exemplo, ar) que foi introduzido no recipiente e/ou um reagente (por exemplo, a enzima ou o substrato enzimático da presente revelação)).

[0076] Em alguma modalidade, o recipiente pode ser feito de um material polimérico. De preferência, um material polimérico que é substancialmente inerte ao sistema removedor de oxigênio e aos conteúdos do recipiente vedado. Em qualquer modalidade, o material polimérico pode ter uma espessura e composição que o torna substancialmente impermeável ao oxigênio. Alguns exemplos não limitadores de materiais poliméricos adequados incluem cloreto de polivinila, polietileno, policarbonato, poliestireno, cloreto de polivinilideno (PVdC), copolímeros de etileno-acetato de vinila, copolímero de cloreto de polivinilideno, copolímero de álcool etileno vinílico, poliamida (como Náilon 6), poliacrilonitrilas, polimetacrilonitrila, acetato de celulose, butirato de acetato de celulose, diacetato de celulose, Neoprene®, Teflon®, polissiloxano ou misturas ou laminados dos mesmos. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser feito de vidro.

[0077] Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser um laminado de filme polimérico em múltiplas camadas. Em qualquer modalidade, um recipiente compreendendo um filme polimérico pode compreender um filme polimérico orientado (por exemplo, polipropileno orientado (OPP), náilon orientado, tereftalato de polietileno orientado (OPET). Em qualquer modalidade, um recipiente compreendendo um filme polimérico pode compreender um filme metalizado (por exemplo, um filme polimérico tendo um revestimento metálico (por exemplo, alumínio). Em qualquer modalidade, um recipiente compreendendo um filme polimérico pode compreender PVdC, filme revestido com copolímero de PVDC ou álcool polivinílico (PVOH) (por exemplo, OPP revestido com PVOH, OPET revestido com PVdC, OPET revestido com copolímero de PVdC, OPP revestido com PVdC, OPP revestido com copolímero de PVdC).

[0078] A permeabilidade ao oxigênio do recipiente é influenciada pela composição e espessura do recipiente. Em qualquer modalidade, pode ser preferencial o uso de um recipiente altamente flexível (por exemplo, uma bolsa fabricada pela vedação de um ou mais filmes poliméricos ao longo de ao menos uma borda) de modo a minimizar o espaço de armazenamento e/ou ajuste em uma variedade de tamanhos ou formatos diferentes de espaços para incubação. Alternativamente, em qualquer modalidade, pode ser preferencial o uso de um recipiente relativamente rígido (por exemplo, um frasco de vidro ou tubo). A permeabilidade ao oxigênio de qualquer recipiente pode ser medida como uma taxa de entrada e saída de oxigênio através das paredes do recipiente. As unidades são relatadas como nmol/(metros x segundos x Gpa).

[0079] Em qualquer modalidade, a permeabilidade ao oxigênio das paredes do recipiente pode ser menor que cerca de 100 nmol/(m x s x Gpa), por exemplo. Em qualquer modalidade, a permeabilidade ao oxigênio das paredes do recipiente pode ser menor ou igual a 50 nmol/(m x s x Gpa), menor ou igual a 25 nmol/(m x s x Gpa), menor ou igual a 15 nmol/(m x s x Gpa), ou menor ou igual a 10 nmol/(m x s x Gpa). A título de exemplo, em uma modalidade, o recipiente pode ser construído de um filme de tereftalato de polietileno tendo uma espessura de cerca de 0,025 mm, e uma permeabilidade ao oxigênio de cerca de 6 a 8 nmol/(m x s x Gpa).

[0080] Em algumas modalidades, o recipiente pode ser vedado. Embora possa ser preferencial em algumas modalidades, o ar residual no recipiente não precisa ser removido antes ou após a vedação completa do recipiente. Consequentemente, em qualquer modalidade, o recipiente vedado, com o meio aquoso, amostra, e/ou sistema removedor de oxigênio dispostos podem incluir um espaço livre disposto nele. O espaço livre pode compreender um gás (por exemplo, ar ambiente) que é aprisionado no recipiente quando o recipiente é vedado. De preferência, o espaço vazio é relativamente pequeno, de modo a não constituir um reservatório de oxigênio presente no recipiente vedado. Em qualquer modalidade, o volume do espaço livre pode ser de cerca de 0 mililitros a cerca de 50 mililitros. Em qualquer modalidade de um método da presente revelação, o ar no espaço livre pode ser completamente expulso, pelo menos parcialmente expelido, ou pode não ser removido de forma alguma.

[0081] A presente invenção fornece um método para detectar a presença de micro-organismo anaeróbico e/ou micro-organismo microaerofílico em amostras. Além disso, uma amostra pode compreender concentrações maiores (por exemplo, ao menos 2 vezes maior, ao menos 3 vezes maior, ao menos 5 vezes maior, ao menos 10 vezes maior, ao menos 100 vezes maior, ao menos 1000 vezes maior, ao menos 10000 vezes maior, ao menos 100000 vezes maior) de micro-organismos aeróbicos, em relação à concentração de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos. Onde o micro-organismo a ser detectado (isto é, "micro-organismo alvo") é relativamente escasso na amostra, ou, na verdade, está em números muito baixos, um enriquecimento do dito micro-organismo na amostra pode ser necessário a fim de detectá-lo. Vantajosamente, o método da presente revelação promove o enriquecimento de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos em uma população microbiana mista compreendendo um micro-organismo aeróbico e ao menos um de um micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico.

[0082] Exemplos não limitadores de bactérias anaeróbicas típicas que podem ser detectadas por um método ou sistema de acordo com a presente revelação incluem Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Actinomyces, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Lactobacillus, Peptococcus, Peptostreptococcus e Veillonella. Algumas das bactérias anaeróbicas contaminantes de alimentos que ocorrem comumente que podem ser prontamente detectadas pela presente invenção compreendem bactérias de Clostridium sp. viz., Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, C.botulinum, e C. difficile que podem causar intoxicação alimentar.

[0083] O método ou sistema da presente revelação pode ser usado para a detecção e cultura das bactérias microaerofílicas. Alguns exemplos não limitadores de organismos microaerofílicos, de acordo com a invenção, são do gênero Campylobater, Borrelia e Helicobacter. Por exemplo, o método ou sistema da presente revelação poderia ser usado para a detecção de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli, que são as duas principais espécies que causam intoxicação alimentar. Campylobacter spp. ocorrem mais comumente como contaminantes alimentares e são conhecidas por crescerem fracamente em cultura anaeróbica normal. Estes organismos exigem oxigênio tipicamente em uma quantidade de 5 a 15% para o crescimento.

[0084] Em qualquer modalidade, o método ou sistema da presente revelação pode ser usado para a detecção e a cultura das bactérias anaeróbicas facultativas. Exemplos não limitadores de bactérias anaeróbicas facultativas típicas que podem ser detectadas pela presente invenção incluem bactérias selecionadas do gênero Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Listeria e Shewanella.

[0085] O meio de cultura, conforme aqui descrito, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um meio de nutrientes, um meio seletivo, um meio enriquecido e um meio de enriquecimento. De preferência, o meio é particularmente adequado para o crescimento, isolamento e/ou identificação de anaeróbios e/ou microaerófilos. Um meio adequado para a cultura de um organismo anaeróbico e/ou microaerofílico alvo pode conter tipicamente como fonte de carbono, um ou mais de glicose, frutose, galactose, sacarose, lactose, celobiose, maltose, xilose, ribose, manose, trealose, celubiose, arabinose, amido hidrolisado ou fontes de carboidratos adequadas. O meio adequado pode compreender adicionalmente um material proteináceo ou componentes dos mesmos (por exemplo, um ou mais aminoácidos, um ou mais oligopeptídeos). O material proteináceo é desejavelmente introduzido em quantidades entre cerca de 2 e 25%, e pode compreender qualquer fonte adequada, como farinhas de proteína de origem vegetal como, por exemplo, peptonas, farinha de soja, ou proteínas animais como, por exemplo, farinha de peixe, farinha de fígado, farinha de carne, e similares. Sais opcionais a serem incorporados ao meio podem ser selecionados dentre carbonato de sódio, sulfato de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato ferroso, hepta-hidrato de sulfato ferroso, sulfato de magnésio ou como misturas dos mesmos. Água é adicionada à mistura de nutrientes sólidos e substrato, desejavelmente em uma quantidade compreendendo cerca de 25% a 75% em peso. Exemplos não limitadores de meios de cultura de enriquecimento incluem, por exemplo, caldo Bolton, caldo selenito e caldo de carne cozida. O pH do meio pode ser ajustado para a faixa ótima para o crescimento da espécie de bactéria suspeita. O meio pode ser esterilizado antes da adição do sistema removedor de oxigênio e a amostra.

[0086] Em qualquer modalidade da invenção, a incorporação do sistema removedor de oxigênio no meio líquido pode ser de tal modo que o sistema seja ativado simultaneamente com a adição da amostra, em que a presença do anaeróbio ou microaerófilo deve ser detectada. Esta circunstância facilita a eficiente temporização e duração da reação de remoção de oxigênio para alcançar um nível apropriado de anaerobiose no meio líquido.

[0087] De acordo com a presente invenção, a incubação da amostra, meio e sistema removedor de oxigênio pode ser executada em condições ótimas para facilitar ao menos uma divisão celular do organismo anaeróbico e/ou microaerofílico a ser enriquecido e/ou detectado.

[0088] A temperatura da incubação pode ser selecionada, de acordo com o micro-organismo a ser detectado. A incubação pode ser executada a uma temperatura propícia para o crescimento do anaeróbico/microaerófilo que suspeita-se estar presente na amostra. Um versado na técnica selecionaria uma temperatura de incubação apropriada (por exemplo, cerca de 25°C, cerca de 30°C, cerca de 35°C, cerca de 37°C, cerca de 42°C), com base na natureza do micro-organismo suspeito de estar presente na amostra alvo. Consequentemente, a temperatura de incubação pode depender da temperatura de crescimento ótima da bactéria suspeita na amostra, por exemplo, a temperatura de crescimento ótima da espécie Campylobater é entre 37 e 42°C; para Clostridium sp., cerca de 37°C. Para muitos dos micro-organismos patógenos humanos, a temperatura ideal para a incubação pode ser de cerca de 37°C.

[0089] A duração da incubação pode variar dependendo do microorganismo a ser enriquecido. O período de tempo pode ser um período de tempo pré-determinado. Em algumas modalidades, a incubação da mistura aquosa pode compreender a incubação da mistura por ao menos cerca de 1 hora, ao menos cerca de 5 horas, ao menos cerca de 8 horas, ao menos cerca de 12 horas, ao menos cerca de 18 horas, ao menos cerca de 24 horas, ao menos cerca de 48 horas, ou ao menos cerca de 72 horas. Em algumas modalidades, o dispositivo de cultura pode ser incubado por não mais que cerca de 24 horas, não mais que cerca de 48 horas, ou não mais que cerca de 72 horas.

[0090] É contemplado que um sistema de cultura ou um método da presente revelação pode ser usado para enriquecer as bactérias redutoras de sulfato. Nessas modalidades, pode ser desejável incubar a mistura aquosa por até cerca de 28 dias.

[0091] Embora isso não seja requerido no método da presente revelação, a incubação da mistura aquosa opcionalmente pode compreender adicionalmente a mistura aquosa com agitação (por exemplo, o recipiente pode ser agitado durante o período de incubação usando meios de agitação conhecidos na técnica. Alternativamente, a mistura aquosa pode ser incubada sem agitação de acordo com o método descrito nos exemplos mais adiante neste documento.

[0092] Vantajosamente, o método ou sistema da presente revelação fornece a incubação do meio inoculado com a amostra contendo bactérias anaeróbicas/microaerofílicas em uma incubadora regular (isto é, uma incubadora que tem um ambiente contendo ar atmosférico (isto é, contendo oxigênio)). O uso do método, de acordo com a presente revelação, elimina a necessidade de equipamentos especiais como uma câmara anaeróbica.

[0093] Em qualquer modalidade, um método da presente revelação opcionalmente inclui uma etapa de detecção do crescimento de um microorganismo anaeróbico ou microaerofílico no recipiente. Em qualquer modalidade, a detecção de crescimento de um micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico pode compreender observação do crescimento (por exemplo, visualmente ou pelo uso de um instrumento como um nefelômetro ou espectrofotômetro, por exemplo). A observação pode ser realizada durante e/ou após a etapa de incubação. Em qualquer modalidade, a observação do crescimento do anaeróbio e/ou microaerófilo pode compreender a observação de turvação. Tipicamente, suspensões bacterianas tendo contagem de células viáveis de aproximadamente 1 x 107 ou acima apresentarão uma turvação que pode ser observada. Observação de turvação no meio pode indicar que ocorreu o enriquecimento do anaeróbio e/ou microaerófilo. O crescimento microbiano pode ser detectado também através do uso de um reagente indicador e a medição de uma alteração observável no agente indicador como, por exemplo, um reagente indicador de pH ou um substrato de enzima cromogênico ou fluorogênico no meio após a incubação.

[0094] Em qualquer modalidade, um método de acordo com a presente revelação pode compreender adicionalmente a análise do microorganismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico para associar o microorganismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico a um gênero, uma espécie ou um grupo de micro-organismos caracterizados por uma característica diferente de sua capacidade de crescer em um ambiente contendo oxigênio. A análise dos micro-organismos pode ser realizada através do uso de qualquer método de análise de micro-organismos conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando a métodos bioquímicos (por exemplo, detecção de uma atividade enzimática ou biomolécula associada a um micro-organismo em particular ou um grupo de micro-organismos), métodos genéticos (por exemplo, amplificação de ácidos nucleicos, hibridização de ácido nucleico, PCR, sequenciamento de ácidos nucleicos), e/ou métodos imunológicos (por exemplo, western blot, Elisa). Em qualquer modalidade, pode ser desejável detectar um subproduto metabólico ou uma toxina associada a um micro-organismo particular ou um grupo de microorganismos.

[0095] Em qualquer modalidade, o método pode compreender adicionalmente o contato da mistura com um material que indica a presença ou ausência de oxigênio. Em qualquer modalidade, o contato da mistura com o material pode compreender dissolução ou suspensão do material na mistura. Dessa forma, em qualquer modalidade, o material pode ser solúvel em água. Alternativamente, o material pode ser insolúvel em água ou pode ser disposto, por exemplo, em um polímero ou em um revestimento que seja insolúvel em água. Por exemplo, o material pode ser qualquer material adequado que pode ser incorporado no meio e/ou amostra a serem testados e que indica a presença ou ausência de oxigênio no dado ambiente por meio de uma mudança de cor reversível ou irreversível. Dessa forma, o indicador pode ter uma cor na presença de oxigênio e uma cor diferente em uma atmosfera que é substancialmente esgotada e/ou desprovida de oxigênio. Além disso, o indicador pode ser incolor quando nenhum oxigênio está presente e desenvolver uma cor quando o oxigênio está presente, ou o indicador pode ser incolor quando o oxigênio está presente e desenvolver uma cor quando pouco ou nenhum oxigênio está presente na atmosfera circundante. Em qualquer modalidade, o indicador pode incluir um reagente indicador fluorescente. Reagentes indicadores adequados incluem, mas não se limitam a, corantes sensíveis ao oxigênio e que são conhecidos na técnica.

[0096] Um exemplo não limitador de um indicador solúvel em água, de cor reversível, que pode ser empregado em um método ou sistema da presente revelação é azul de metileno. Azul de metileno é incolor na ausência de oxigênio, mas na presença de oxigênio dissolvido suficiente, como líquidos aquosos equilibrados com ar, por exemplo, tem uma cor azul. Em qualquer modalidade, o material indicador de cor pode ser um que sofra uma alteração de cor reversível, de modo que qualquer mudança de uma atmosfera contendo oxigênio para uma atmosfera substancialmente esgotada e/ou desprovida de oxigênio, ou de uma atmosfera desprovida de oxigênio para uma contendo oxigênio, será indicada pela mudança de cor.

[0097] Em qualquer modalidade, após a incubação da mistura sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular, o método pode compreender identificação e/ou enumeração de micro-organismos na mistura. Micro-organismos podem ser identificados através do uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (por exemplo, identificação bioquímica, identificação genética, identificação imunológica). A enumeração de microorganismos na mistura pode compreender, por exemplo, plaqueamento e contagem do organismo em ágar após ter crescido no seu enriquecimento. Em qualquer modalidade, a mistura, ou uma porção da mesma, pode ser purificada (por exemplo, para remover substâncias que podem de outro modo interferir no procedimento de identificação ou enumeração) e/ou diluída antes do procedimento de identificação ou enumeração.

[0098] Em ainda outro aspecto, a presente revelação fornece um kit para o enriquecimento, detecção, ou ambos, de micro-organismos anaeróbicos ou micro-organismos microaerofílicos. O kit inclui um recipiente passível de vedação; um dito sistema removedor de oxigênio compreendendo quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima; o dito sistema removedor de oxigênio sendo ativado mediante hidratação com um volume predeterminado de meio aquoso criando, desse modo, um ambiente substancialmente esgotado ou desprovido de oxigênio. O kit pode incluir ainda componentes adicionais, se desejado, selecionados para permitir o uso do kit para uma ou mais aplicações específicas. Em qualquer modalidade do kit, o recipiente é substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0099] Em qualquer modalidade do kit da presente revelação, o recipiente pode ser selecionado de uma bolsa de contenção, e envelope, um envoltório vedado, uma bolsa, uma lata, um recipiente, um cilindro, uma caixa ou bolsa de barreira, um saco com zíper (por exemplo, um saco de armazenamento ZIPLOC), uma bolsa de laboratório compacta (por exemplo, bolsa misturadora STOMACHER), um frasco com rolha, uma garrafa com rolha, ou qualquer forma de contenção vedada adequada para manter as culturas de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser vedado usando uma rolha, um septo (por exemplo, um septo perfurável auto- vedante), uma tampa de rosca, e/ou uma vedação térmica.

[0100] O recipiente pode ser formado de materiais poliméricos adequados que incluem cloreto de polivinila, polietileno, policarbonato, poliestireno, cloreto de polivinilideno, poliacrilonitrilas, copolímeros de polietileno acetato de vinila, polimetacrilonitrila, acetato de celulose, butirato de acetato de celulose, diacetato de celulose, Neoprene®, Teflon®, polissiloxano, ou misturas e/ou laminados dos mesmos. Em qualquer modalidade, o recipiente pode ser feito de vidro.

[0101] De acordo com a invenção, o kit pode compreender o sistema de enzima-substrato implantado em uma variedade de formatos, como uma forma de comprimido (por exemplo, pílulas, anéis ou pequenas esferas), uma forma liofilizada, um revestimento por aspersão no interior da bolsa, um sachê ou um meio de rápida dissolução em pó.

[0102] Em qualquer modalidade, o kit também pode compreender componentes adicionais como ao menos um indicador selecionado de um indicador de pH, um indicador para indicar a presença ou ausência de oxigênio, instrução de uso, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos mesmos componentes adicionais supracitados.

MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS

[0103] A Modalidade A é um método compreendendo: formação de uma mistura aquosa em um recipiente; a mistura compreendendo uma amostra contendo um micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico, um volume pré-definido de um meio que suporta o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico, e um sistema removedor de oxigênio; em que o dito sistema removedor de oxigênio compreende quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima; em que o sistema removedor de oxigênio é ativado mediante hidratação, esgotando, desse modo o oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico; e incubação da mistura aquosa sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular do dito micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico.

[0104] A Modalidade B é um método compreendendo: formação de uma mistura aquosa em um recipiente; a mistura compreendendo uma amostra contendo um micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico, um volume pré-definido de um meio que suporta o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico, e um sistema removedor de oxigênio; em que o dito sistema removedor de oxigênio compreende quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima; em que o sistema removedor de oxigênio é ativado mediante hidratação, esgotando, desse modo o oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico; em que a enzima é selecionada a partir de um grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase; e incubação da mistura aquosa sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular do dito micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico.

[0105] A Modalidade C é o método de acordo com a Modalidade A ou Modalidade B, em que o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico compreende o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração de cerca 100 μM ou menos.

[0106] A Modalidade D é o método de acordo com a Modalidade A ou Modalidade B, em que o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico compreende o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração de cerca 10 μM ou menos.

[0107] A Modalidade E é o método de acordo com a Modalidade A ou Modalidade B, em que o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico compreende o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração de cerca 1 μM ou menos.

[0108] A Modalidade F é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores compreendendo adicionalmente: detecção de crescimento do micro-organismo anaeróbico ou microorganismo microaerofílico.

[0109] A Modalidade G é o método de acordo com a Modalidade F compreendendo adicionalmente: análise do micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico para associar o micro-organismo anaeróbico ou micro-organismo microaerofílico a um gênero, uma espécie ou um grupo de micro-organismos caracterizados por uma característica diferente de sua capacidade de crescer em um ambiente contendo oxigênio.

[0110] A Modalidade H é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a formação de uma mistura aquosa em um recipiente compreende a formação de uma mistura aquosa em que um recipiente que é substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0111] A Modalidade I é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a enzima compreende ascorbato oxidase, em que o substrato é selecionado a partir do grupo que compreende ácido ascórbico ou um sal do mesmo, um derivado de ácido ascórbico ou um sal do mesmo, hidroquinona, pirogalol, catecol, ou uma mistura de quaisquer dois ou mais dos substratos supracitados.

[0112] A Modalidade J é o método de acordo com a Modalidade I, em que o derivado de ácido ascórbico é selecionado a partir do grupo que consiste em D-iso-ascorbato, ácido D-araboascórbico, 6-amino-L-ascorbato, 6- desóxi-L-ascorbato, D-eritroascorbato, 6-O-fenil-L-ascorbato e 6-S-fenil-L- ascorbato.

[0113] A Modalidade K é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades A a H, em que a enzima compreende lacase, em que o substrato é selecionado a partir do grupo que consiste em um fenol, L-tirosina, o-difenol e p-difenol, 2,6-dimetoxifenol, e misturas de quaisquer dois ou mais dos substratos supracitados.

[0114] A Modalidade L é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o dito método promove o enriquecimento de micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos em uma população microbiana mista compreendendo um micro-organismo aeróbico e ao menos um de um micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico.

[0115] A Modalidade M é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que, após a formação da mistura aquosa, a enzima está presente na mistura em uma concentração de ao menos 1000 unidades/L.

[0116] A Modalidade N é o método de acordo com a Modalidade M, em que, após a formação da mistura aquosa, a enzima está presente na mistura em uma concentração de ao menos 2000 unidades/L.

[0117] A Modalidade O é o método de acordo com a Modalidade M, em que, após a formação da mistura aquosa, a enzima está presente na mistura em uma concentração de ao menos 4000 unidades/L.

[0118] A Modalidade P é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que, após a formação da mistura aquosa, o substrato está presente na mistura em uma concentração de cerca de 0,1 a 100 mg/ml.

[0119] A Modalidade Q é o método de acordo com a Modalidade P, em que, após a formação da mistura aquosa, o substrato está presente na mistura em uma concentração de cerca de 0,1 a 50 mg/ml.

[0120] A Modalidade R é o método de acordo com a Modalidade P, em que, após a formação da mistura aquosa, o substrato está presente na mistura em uma concentração de cerca de 0,1 a 10 mg/ml.

[0121] A Modalidade S é o método de acordo com a Modalidade P, em que, após a formação da mistura aquosa, o substrato está presente na mistura em uma concentração de cerca de 0,1 a 5 mg/ml.

[0122] A Modalidade T é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que: antes da formação da mistura aquosa; ao menos uma porção do sistema removedor de oxigênio é empregada como uma solução, um comprimido, um sachê, um revestimento disposto sobre uma superfície interna de uma parede do recipiente, ou um pó.

[0123] A Modalidade U é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a formação da mistura aquosa compreende colocar em contato uma mistura do sistema removedor de oxigênio e da amostra com o meio.

[0124] A Modalidade V é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a formação da mistura aquosa compreende colocar em contato o sistema removedor de oxigênio com uma mistura líquida aquosa compreendendo a amostra e o meio.

[0125] A Modalidade W é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a amostra compreende o material coletado a partir de uma fonte selecionada do grupo consistindo em ar, água, um alimento, uma bebida, um animal, um tecido biológico, um fluido biológico e uma superfície ambiental.

[0126] A Modalidade X é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o micro-organismo anaeróbico é um anaeróbico obrigatório ou um anaeróbico facultativo.

[0127] A Modalidade Y é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o micro-organismo pertence a um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Actinomyces, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Lactobacillus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Veillonella, Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Listeria e Shewanella.

[0128] A Modalidade Z é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o micro-organismo microaerofílico pertence a um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Campylobater, Helicobacter e Borrelia.

[0129] A Modalidade AA é o método de acordo com a Modalidade Z, em que o micro-organismo microaerofílico do gênero Campylobater pertence a uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em Campylobater jejuni ou Campylobater coli.

[0130] A Modalidade AB é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o recipiente é feito de um material polimérico.

[0131] A Modalidade AC é o método de acordo com a Modalidade AB, em que o material polimérico é selecionado a partir do grupo que consiste em cloreto de polivinila, polietileno, policarbonato, poliestireno, cloreto de polivinilideno, copolímero de polivinilideno, poliacrilonitrilas, polimetacrilonitrila, acetato de celulose, butirato de acetato de celulose, diacetato de celulose, Neoprene®, Teflon®, polissiloxano e misturas e laminados dos mesmos.

[0132] A Modalidade AD é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades F à AC, em que a detecção do crescimento do micro-organismo compreende medição ou detecção de uma alteração observável do meio após a incubação.

[0133] A Modalidade AE é o método de acordo com a Modalidade AD, em que a medição ou a detecção de uma alteração observável do meio compreende a medição ou a observação de turvação.

[0134] A Modalidade AF é o método de acordo com a Modalidade AD, em que o crescimento do micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico é detectado com o uso de um agente indicador.

[0135] A Modalidade AG é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores compreendendo adicionalmente: colocação de um material que indica a presença ou a ausência de oxigênio no recipiente.

[0136] A Modalidade AH é o método de acordo com a Modalidade AG, em que a colocação do material no recipiente compreende a colocação do material em comunicação fluida com o meio.

[0137] A Modalidade AI é o método de acordo com a Modalidade AG ou Modalidade AH, em que o material indica a presença ou a ausência de oxigênio no recipiente por meio de uma mudança de cor.

[0138] A Modalidade AJ é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades AG a AI, em que o dito material é azul de metileno.

[0139] A Modalidade AK é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio a uma concentração que facilita o crescimento compreende esgotamento do oxigênio dissolvido à concentração em cerca de 60 minutos ou menos.

[0140] A Modalidade AL é o método de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio a uma concentração que facilita o crescimento compreende esgotamento do oxigênio dissolvido à concentração em cerca de 30 minutos ou menos.

[0141] A Modalidade AM é um sistema de cultura para cultura de um micro-organismo microaerofílico ou micro-organismo anaeróbico, o dito sistema compreendendo: quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima; um recipiente, e um volume predeterminado de meio aquoso que suporta o crescimento do dito micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico; em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predeterminado em uma concentração que facilita o crescimento de um micro-organismo microaerofílico ou micro-organismo obrigatoriamente anaeróbico.

[0142] A Modalidade AN é um sistema de cultura para cultura de um micro-organismo microaerofílico ou micro-organismo anaeróbico, o dito sistema compreendendo: quantidades eficazes de i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima, sendo que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase; um recipiente, e um volume predeterminado de meio aquoso que suporta o crescimento do dito micro-organismo anaeróbico ou microaerofílico; em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predeterminado em uma concentração que facilita o crescimento de um micro-organismo microaerofílico ou micro-organismo obrigatoriamente anaeróbico.

[0143] A Modalidade AO é o sistema de cultura de acordo com a Modalidade AM ou Modalidade AN, em que o recipiente é substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0144] A Modalidade AP é o sistema de cultura de acordo com qualquer uma das Modalidades AM a AO, em que o recipiente é passível de vedação.

[0145] A Modalidade AQ é o sistema de cultura de acordo com a Modalidade AP, em que o recipiente é resselável.

[0146] A Modalidade AR é o sistema de cultura de acordo com qualquer uma das Modalidades AM à AQ, em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido a cerca 100 μM ou menos.

[0147] A Modalidade AS é o sistema de cultura de acordo com qualquer uma das Modalidades AM à AQ, em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido a cerca 10 μM ou menos.

[0148] A Modalidade AT é o sistema de cultura de acordo com qualquer uma das Modalidades AM à AQ, em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido a cerca 1 μM ou menos.

[0149] A Modalidade AU é o sistema de cultura de acordo com qualquer uma das Modalidades AM à AT, em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido à concentração que facilita o crescimento em cerca de 60 minutos ou menos.

[0150] A Modalidade AV é o sistema de cultura de acordo com qualquer uma das Modalidades AM à Modalidade AT, em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predefinido à concentração que facilita o crescimento em cerca de 30 minutos ou menos.

[0151] A Modalidade AW é um kit, compreendendo: recipiente passível de vedação; e um sistema removedor compreendendo i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima.

[0152] A Modalidade AX é um kit, compreendendo: um recipiente passível de vedação; e um sistema removedor de oxigênio compreendendo i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e ii) um substrato para a dita enzima, sendo que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase.

[0153] A Modalidade AY é o kit de acordo com a Modalidade AW ou Modalidade AX, em que o recipiente é substancialmente impermeável ao oxigênio.

[0154] A Modalidade AZ é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a AY, em que o recipiente passível de vedação é resselável.

[0155] A Modalidade BA é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW à AZ, em que a enzima é alocada em um ou mais recipientes primários, cada recipiente primário tendo uma quantidade de enzima eficaz para reagir com o substrato de enzima para esgotar o oxigênio dissolvido em um volume predeterminado de meio aquoso para uma concentração de oxigênio dissolvido que facilita o crescimento de um micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico.

[0156] A Modalidade BB é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW à BA, em que o substrato é alocado em um ou mais recipientes primários ou um ou mais recipientes secundários, cada recipiente primário ou recipiente secundário tendo uma quantidade de substrato eficaz para reagir com a enzima para esgotar o oxigênio dissolvido em um volume predeterminado de meio aquoso para uma concentração de oxigênio dissolvido que facilita o crescimento de um micro-organismo anaeróbico ou um micro-organismo microaerofílico.

[0157] A Modalidade BC é o kit de acordo com a Modalidade BA ou Modalidade BB, em que o primeiro receptáculo e/ou o segundo receptáculo é o recipiente.

[0158] A Modalidade BD é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BC, em que o recipiente é selecionado a partir do grupo que consiste em um saco de contenção, um envelope, um envoltório vedado, uma bolsa, uma lata, um recipiente, um cilindro, um frasco, e um frasco.

[0159] A Modalidade BE é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BD, em que o recipiente é feito de um material polimérico selecionado a partir de cloreto de polivinila, polietileno, policarbonato, poliestireno, cloreto de polivinilideno, poliacrilonitrilas, polimetacrilonitrila, acetato de celulose, butirato de acetato de celulose, diacetato de celulose, Neoprene®, Teflon®, polissiloxano e misturas dos mesmos.

[0160] A Modalidade BF é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BD, em que o recipiente é feito de vidro.

[0161] A Modalidade BG é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BF, em que a enzima e/ou o substrato é disposto no kit em uma forma selecionada a partir de um grupo que consiste em um comprimido, um sachê, um revestimento disposto sobre uma superfície interna de uma parede do recipiente ou um pó.

[0162] A Modalidade BH é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BG, em que o kit compreende adicionalmente um material que pode ser colocado no recipiente para indicar a presença ou ausência de oxigênio no recipiente.

[0163] A Modalidade BI é o kit de acordo com a Modalidade BH, em que o material indica a presença ou a ausência de oxigênio no recipiente por meio de uma mudança de cor.

[0164] A Modalidade BJ é o kit de acordo com a Modalidade BH ou Modalidade BI, em que o material compreende azul de metileno.

[0165] A Modalidade BK é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BJ, em que o kit compreende adicionalmente um indicador de pH.

[0166] A Modalidade BL é o kit de acordo com qualquer uma das Modalidades AW a BK, em que o kit compreende adicionalmente instruções de uso.

[0167] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar melhor a invenção reivindicada e não devem ser interpretados de qualquer forma como limitadores do escopo da invenção. Todos os materiais e métodos aqui descritos a seguir, no todo ou em parte, recaem dentro do escopo da invenção. Estas composições específicas, materiais e métodos não se destinam a limitar a invenção, mas meramente ilustrar as modalidades específicas dentro do escopo da invenção. O versado na técnica pode desenvolver materiais equivalentes, e métodos sem o exercício de capacidade inventiva e sem se afastar do escopo da invenção. Será entendido que muitas variações podem ser feitas nos procedimentos aqui descritos, embora ainda permanecendo dentro dos limites da invenção. É a intenção dos inventores que tais variações estejam incluídas dentro do escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - PARA DEMONSTRAR O ENRIQUECIMENTO E A DETECÇÃO DE MICRO- ORGANISMOS ANAERÓBICOS E MICROAEROFÍLICOS: ORGANISMOS: CAMPYLOBACTER JEJUNI/CAMPYLOBACTER COLI E CLOSTRIDIUM SPOROGENES

[0168] Meio de cultura usado: Caldo Bolton (meio de enriquecimento) TABELA 1. COMPOSIÇÃO DO CALDO BOLTON.

[0169] Os componentes do caldo foram dissolvidos em água desionizada, e a mistura foi autoclavada. Após a esterilização, aproximadamente 225 mL de caldo foram distribuídos em bolsas de barreira (Associated Bag Company, Milwaukee, WI; número de modelo 185-100) que contém um volume líquido de 500 ml.

[0170] Soluções de estoque de ácido ascórbico oxidase (Modelo # 061A0500; Calzyme Laboratories; San Luis Obispo, CA) e ascorbato de sódio (CAS# 134-03-2; Sigma-Aldrich) foram preparadas em água desionizada.

ENRIQUECIMENTO E DETECÇÃO DE ORGANISMOS MICROAEROFÍLICOS: CAMPYLOBACTER COLI/ CAMPYLOBACTER JEJUNI

[0171] A amostra (uma cultura de um dia para o outro diluída de Campylobacter jejuni / Campylobacter coli em tampão Butterfields) foi adicionada a cada bolsa de meio para se obter uma concentração final de cerca de 50 CFU (cerca de 0,002 CFU/10 μL) no meio de cultura. As bolsas foram vedadas usando vedação tipo zíper na abertura de cada bolsa. Subsequentemente, o meio de cultura na bolsa foi suplementado com volumes adequados das soluções de estoque para conseguir uma concentração final de 4K unidades/L da enzima ascorbato oxidase e 1,31 mg/ml do substrato ascorbato de sódio no meio de cultura. Cada bolsa vedada tinha aproximadamente 30 a 100 mL de ar ambiente vedado na bolsa com o meio. As bolsas vedadas foram incubadas em atmosfera ambiente a 42°C por 48 horas. Uma outra bolsa foi preparada e incubada conforme descrito acima, mas não foi semeada com os micro-organismos da amostra e serviu como um controle de esterilidade para os reagentes e bolsas. O controle não inoculado não estava visivelmente turvo, indicando não ter havido crescimento devido à contaminação dos componentes ou das bolsas. As bolsas foram inoculadas com Campylobacter não estavam turvas também, indicando que os micro-organismos não cresceram a uma concentração celular de mais que cerca de 107/mL. Uma ansa (aproximadamente 10 microlitros) de cada uma das culturas de enriquecimento de Campylobacter e o meio de controle foram, então, estriados sobre ágar carvão não seletivo e as placas foram incubadas de um dia para o outro. Crescimento (isto é, colônias/placa>100) foi observado sobre as placas inoculadas com amostras de cultura de enriquecimento de Campylobacter confirmando que as bactérias microaerofílicas cresceram no ambiente esgotado de oxigênio criado em culturas de enriquecimento. Nenhum crescimento foi observado sobre as placas inoculadas do meio de controle.

ENRIQUECIMENTO E DETECÇÃO DE BACTÉRIAS OBRIGATORIAMENTE ANAERÓBICAS: POR EXEMPLO, CLOSTRIDIUM SPOROGENES.

[0172] A amostra (uma cultura de um dia para o outro diluída de Clostridium sporogenes em tampão Butterfields) foi adicionada a uma bolsa de meio para se obter uma concentração final de cerca de 50 CFU/mL no meio de cultura. Subsequentemente, o meio de cultura na bolsa foi suplementado com volumes adequados das soluções de estoque para conseguir uma concentração final de 4K unidades/L da enzima ascorbato oxidase e 6,55 mg/mL do substrato ascorbato de sódio no meio de cultura. Uma bolsa de controle (sem bactérias) foi preparada conforme descrito acima. As bolsas foram vedadas usando vedação por pressão na abertura de cada bolsa. Cada bolsa vedada tinha aproximadamente 30 a 100 mL de ar ambiente vedado na bolsa com o meio. As bolsas vedadas foram incubadas em atmosfera ambiente a 37°C por 48 horas. O crescimento foi indicado por turvação visível nas bolsas inoculadas com Clostridium sporogenes. O controle não inoculado não estava visivelmente turvo, indicando não ter havido crescimento devido à contaminação dos componentes ou das bolsas.

[0173] A descrição completa de todas as patentes, pedidos de patente, publicações, e material disponível eletronicamente citados no presente documento estão aqui incorporados a título de referência. Caso exista qualquer inconsistência entre a descrição do presente pedido e a(s) descrição(ões) de qualquer documento aqui incorporado, a título de referência, a descrição do presente pedido deve prevalecer. A descrição detalhada e os exemplos anteriormente mencionados foram oferecidos somente por uma questão de clareza de entendimento. Nenhuma limitação desnecessária deve ser inferida a partir dos mesmos. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, visto que variações óbvias aos versados na técnica estarão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

[0174] Todos os cabeçalhos são para a comodidade do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue aos cabeçalhos, a menos que esteja especificado.

[0175] Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Essas e outras modalidades estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (10)

1. MÉTODO, caracterizado por compreender: formação de uma mistura aquosa em um recipiente; a mistura compreendendo uma amostra contendo um micro-organismo microaerofílico, um volume pré-definido de um meio que suporta o crescimento de um microorganismo microaerofílico, e um sistema removedor de oxigênio; em que o dito sistema removedor de oxigênio compreende quantidades eficazes de (i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e (ii) um substrato para a dita enzima; em que o dito sistema removedor de oxigênio é ativado mediante hidratação, esgotando, desse modo o oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo microaerofílico; em que a enzima é selecionada a partir de um grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase; e incubação da mistura aquosa sob condições para facilitar ao menos uma divisão celular do dito micro-organismo microaerofílico, em que o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração que facilita o crescimento do micro-organismo microaerofílico compreende o esgotamento do oxigênio dissolvido no meio para uma concentração de 0,01 μm a 10 μm.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente: detecção de crescimento do micro-organismo microaerofílico.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela enzima ser ascorbato oxidase, em que o substrato é selecionado a partir do grupo que compreende ácido ascórbico ou um sal do mesmo, um derivado de ácido ascórbico ou um sal do mesmo, hidroquinona, pirogalol, catecol, ou uma mistura de quaisquer dois ou mais dos substratos supracitados.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela enzima ser lacase, em que o substrato é selecionado a partir do grupo que consiste em um fenol, L-tirosina, o-difenol e p-difenol, 2,6- dimetoxifenol, e misturas de quaisquer dois ou mais dos substratos supracitados.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por, após a formação da mistura aquosa, a enzima estar presente na mistura em uma concentração de ao menos 1000 unidades/L.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, após a formação da mistura aquosa, o substrato estar presente na mistura em uma concentração de 0,1 a 100 mg/ml.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por, antes da formação da mistura aquosa; ao menos uma porção do sistema removedor de oxigênio ser empregada como uma solução, um comprimido, um sachê, um revestimento disposto sobre uma superfície interna de uma parede do recipiente, ou um pó.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo esgotamento do oxigênio dissolvido no meio a uma concentração que facilita o crescimento, compreender o esgotamento do oxigênio dissolvido à concentração em 60 minutos ou menos.

9. SISTEMA DE CULTURA PARA CULTURA DE UM MICRO ORGANISMO MICROAEROFÍLICO, caracterizado por compreender: quantidades eficazes de (i) uma enzima de uma família de oxidorredutase e (ii) um substrato para a dita enzima, sendo que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em ácido ascórbico oxidase e lacase; um recipiente, e um volume predeterminado de meio aquoso que suporta o crescimento do dito micro-organismo microaerofílico; em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no volume predeterminado em uma concentração que facilita o crescimento de um micro-organismo microaerofílico, em que as quantidades eficazes são eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido no meio para um volume predefinido de 0,01 μM a 10 μM.

10. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelas quantidades eficazes serem eficazes para esgotar o oxigênio dissolvido a uma concentração de 0,01 μM a 10 μM.