CN101397546B

CN101397546B - 厌氧微生物培养环境快速生成方法

Info

Publication number: CN101397546B
Application number: CN 200810304988
Authority: CN
Inventors: 姚毓奇
Original assignee: HANGZHOU BASEBIO BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU BASEBIO BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: CN101397546A

Abstract

本发明提供一种方便、快捷、高效且成本低廉的厌氧微生物培养环境快速生成方法，该方法通过向密封箱体内加入除氧剂、二氧化碳发生剂和氢气发生剂，通过三方面的协同交互作用，来达到去除箱体内的氧气、生成合适比例的二氧化碳和氢气，以维持容器内的压力平衡的目的，整个现象通过指示剂颜色变化来观察。本发明还提供一种实现厌氧微生物培养环境快速生成的组合试剂，由上述除氧剂、二氧化碳发生剂和氢气发生剂组成。

Description

厌氧微生物培养环境快速生成方法

技术领域

本发明涉及一种厌氧微生物培养环境快速生成方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

厌氧菌(anaerobic bacteria)是一类只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气(21％氧气)和高于10％二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。按其对氧的耐受程度的不同，可分为专性厌氧菌、微需氧厌氧菌和兼性厌氧菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。

厌氧微生物的危害巨大，它能引起人体不同部位的感染；在食品微生物学上，人们关于厌氧微生物对食品污染危害的认识也逐渐增多，它可以引起啤酒、罐头食品发生腐败，导致食物中毒，严重时甚至可导致人的死亡；对动物的危害主要表现在厌氧菌病是通过新鲜创伤感染的一种急性流行性传染病，其致病菌是厌氧芽胞杆菌，在常温下存活数年，甚至数十年，一旦遇到适宜的生存环境，菌体大量繁殖，就会暴发此病。因此，对厌氧微生物的检测势在必行。在生物医药和食品发酵工业方面，厌氧微生物是生产过程中最重要检测项目，其管控的好坏直接关系到产品安全和产品质量。开展对厌氧微生物的检测，在医学、生物和食品工业领域已变得越来越普及。但由于厌氧微生物生长习性所限制，一般环境下检测厌氧微生物效果并不理想，创造无氧或微氧的环境就成为来有效检测厌氧微生物的必然手段。

在厌氧微生物培养方法中，如何快速、高效的去除体系中的氧气是开发厌氧培养方法及设备最关键的环节。国外对厌氧微生物培养方法作了大量研究，日本三菱公司的厌氧箱、英国OXOID公司的厌氧袋和德国默克公司的厌氧盒已成为厌氧菌培养的成熟产品。我国国内厌氧微生物检测采用的方法主要有厌氧缸、厌氧手套箱、生物耗氧法、焦性末食子酸法、疱肉培养基等，这些方法的特点见表1。

表1几种厌氧微生物培养方法的比较

综上所述，目前国内外厌氧微生物培养设备中成熟、可靠者价格昂贵，成本过高，难于实现普及性应用。而价格低廉、取材方便的设备难以达到厌氧菌培养的要求，因此迫切需求一种即能够满足厌氧菌培养条件，又能够大幅度降低设备投资成本的厌氧微生物培养的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述缺点，提供一种方便、快捷、高效且成本低廉的厌氧微生物培养环境快速生成方法，该方法通过向密封箱体内加入除氧剂、二氧化碳发生剂和氢气发生剂，通过三方面的协同交互作用，来达到去除箱体内的氧气、生成合适比例的二氧化碳和氢气，以维持容器内的压力平衡的目的，整个现象通过指示剂颜色变化来观察。

本发明还提供一种实现厌氧微生物培养环境快速生成的组合试剂，由上述除氧剂、二氧化碳发生剂和氢气发生剂组成。

为实现上述目的，本发明厌氧微生物培养环境快速生成方法包括下列步骤：①在密封的透明箱体内加入氧化还原状态指示剂和接种后的培养皿；②分别向上述箱体内预置的三个容器中加入除氧剂组分、二氧化碳发生剂组分和氢气发生剂组分，迅速密封箱体，整个过程时间控制在2分钟内。

氧化还原状态指示剂是刃天青指示剂或美兰指示剂，氧化还原状态指示剂可以是粉末、试纸或溶液状态。刃天青作为氧化还原状态指示剂时，当箱体内的氧气含量小于0.1％时呈粉红色，氧气含量超过0.5％时呈蓝色。刃天青试纸或质量百分含量为1％的刃天青溶液均可用于本发明。

除氧剂组分为焦性没食子酸溶液、氢氧化钠溶液。除氧剂中可以加入除氧辅剂以提高除氧效果，除氧辅剂包括还原铁粉、氯化钠、活性炭中的一种或几种。当本发明方法应用时，除氧辅剂以粉状料包形式加入除氧剂中。二氧化碳发生剂组分为碳酸氢钠溶液、柠檬酸溶液。氢气发生剂的组分为硼氢化钠和水。

焦性没食子酸作为吸附氧气的载体，在常温常压下与氧气的临界反应常数很高，难以发生反应。但当焦性没食子酸与氢氧化钠发生反应后形成的焦性没食子酸盐与氧气的临界反应常数降低了一百万倍，以至于在常温常压下二者能迅速发生反应。反应过程如下所示：

C₆H₃(OH)₃+3NaOH→C₆H₃(ONa)₃+3H₂O

4C₆H₃(ONa)₃+O₂→2(NaO)₃C₆H₂-C₆H₂(ONa)₃+2H₂O

氢氧化钠作为均相催化剂加入由焦性没食子酸与氧气构成的反应体系，其化学反应变化对比情况见表2。

表2氢氧化钠加入前后的比较

	添加前	添加后
			常温常压	反应能垒高，反应很难发生，性质稳定	反应立即发生，性质极为活波
速率	极慢	极快，在试剂足够的条件下可在10～20分钟之内将其能够吸收的氧气全部还原
			反应程度	几乎不反应	反应完全，反应程度高达99％

均相催化剂氢氧化钠能够在不改变反应本质的前提下，与除氧剂中的主要成分焦性没食子酸发生反应形成势能极低的中间产物，此时中间产物再与空气中的氧气迅速反应，达到去除氧气的目的，这样即能够满足体系除氧的要求，同时保证反应温和，且其反应均在气液两相表面进行，不会对培养的微生物产生不利影响，使厌氧环境得以实现。

由于本发明中所述箱体内氧气的量是一定值，因此焦性没食子酸的加入量为每升箱体体积0.0375～0.05mol，氢氧化钠为每升箱体体积0.1125～0.25mol。还原铁粉、氯化钠、活性炭作为除氧辅剂，可选择性加入其中的一种或几种，每升箱体体积加入的量为还原铁粉0.012～0.013mol、氯化钠0.004～0.005mol、活性炭0.025～0.03mol。

空气中氧气的成分约占总体积的21％左右，因此加入除氧剂后体系内21％左右的氧气被消耗。而由于厌氧微生物的生理特点，本发明方法所产生的二氧化碳的体积含量需控制在5％～10％，为保持体系内外压强一致，并且压力随时间变化波动较小，保证微生物的培养能在标准大气压左右的条件下进行，必须在体系中加入氢气发生剂。二氧化碳发生剂和氢气发生剂所产生的气体体积占箱体体积的19％～23％，用以补偿消耗的氧气。

采用本发明生成厌氧微生物培养环境时，可达到如表3所示的效果。

表3

名称	参数
		耗氧率	＜0.1％
耗氧速度	＜30min
		二氧化碳产生率	10％
二氧化碳产生速度	＜30min
		氢气产生率	11％
氢气产生速度	＜30min
		指示剂变色范围	氧气含量小于0.1％时呈粉红色，氧气含量超过0.5％时呈蓝色。

本发明具有如下优点：

1、选择反应势能较低的反应试剂，使得体系发生反应的能垒大为降低，可以大大加快反应速度。

2、使用氢氧化钠作为均相催化剂，通过两组化学反应组成联合递进催化组系，进一步降低反应体系势能能垒，加快反应进程，将体系内合格浓度的厌氧环境形成时间缩短到30min以内。

3、所用试剂价格低廉，发生的反应过程迅速、安全，方法简便快捷，可实现厌氧微生物培养环境的快速生成，大大降低了厌氧微生物培养和检测的成本。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是实施例1的二氧化碳浓度、氧气残存浓度与时间关系图。

图2是实施例2的二氧化碳浓度、氧气残存浓度与时间关系图。

图3是实施例3的二氧化碳浓度、氧气残存浓度与时间关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

将腐败梭菌CVCC96接种到菌硫乙醇酸盐培养基，褐球固氮菌CICC 20025接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基。把所述接种后的两种培养基放入密封性良好并且透明的箱体内，箱体体积为5.6L，箱体内置有刃天青试纸作为氧化还原状态指示剂。迅速向所述箱体内预置的三个容器中分别加入除氧剂组分、二氧化碳发生剂组分、氢气发生剂组分，密封箱体，整个过程时间控制在2分钟内。

所用除氧剂组分为：2.3mol/L的焦性没食子酸溶液100ml、6.7mol/L的氢氧化钠溶液100ml。二氧化碳发生剂组分为：0.25mol/L的碳酸氢钠溶液100ml、0.091mol/L的柠檬酸溶液100ml。氢气发生剂组分为：0.0275mol硼氢化钠和100ml水。

通过对箱体内氧气浓度、二氧化碳浓度的测定，建立二氧化碳浓度、氧气残存浓度与时间关系图谱见附图1。

经37℃恒温培养24h后，菌体培养结果为：严格厌氧的腐败梭菌CVCC 96长势良好，而严格需氧的褐球固氮菌CICC 20025完全不生长。

实施例2

按所述的相同步骤重复进行实施例1，但是向加入除氧剂组分的容器内同时加入除氧辅剂。所用除氧剂组分为：2.1mol/L的焦性没食子酸溶液100ml、13.5mol/L氢氧化钠溶液100ml，除氧辅剂为：还原铁粉0.0714mol、氯化钠0.025mol、活性炭0.1667mol，二氧化碳发生剂组分为：0.125mol/L碳酸氢钠溶液100ml、0.0455mol/L柠檬酸溶液100ml，氢气发生剂组分为：0.04mol硼氢化钠和100ml水。

通过对箱体内氧气浓度、二氧化碳浓度的测定，建立二氧化碳浓度、氧气残存浓度与时间关系图谱见附图2。

实施例3

按所述的相同步骤重复进行实施例1，但是向加入除氧剂组分的容器内同时加入除氧辅剂。所用除氧剂组分为：2.8mol/L焦性没食子酸溶液100ml、2.1mol/L氢氧化钠溶液100ml，除氧辅剂为：还原铁粉0.0728mol、活性炭0.14mol，二氧化碳发生剂组分为：0.2mol/L碳酸氢钠溶液100ml、0.0728mol/L柠檬酸溶液100ml，氢气发生剂组分为：0.028mol硼氢化钠和100ml水。

通过对箱体内氧气浓度、二氧化碳浓度的测定，建立二氧化碳浓度、氧气残存浓度与时间关系图谱见附图3。

最后，应当指出，以上几个实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种厌氧微生物培养环境快速生成方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

①在密封的透明箱体内加入氧化还原状态指示剂和接种后的培养皿；

②分别向上述箱体内预置的三个容器中加入除氧剂组分、二氧化碳发生剂组分和氢气发生剂组分，迅速密封箱体，整个过程时间控制在2分钟内；

所述的二氧化碳发生剂和氢气发生剂产生的气体体积占箱体体积的19%～23%，其中二氧化碳发生剂产生的气体体积占箱体体积的5%～10%；所述除氧剂组分为焦性没食子酸溶液、氢氧化钠溶液，所述除氧剂加入箱体后，焦性没食子酸物质的量除以箱体体积的值为0.0375～0.05mol/L，氢氧化钠物质的量除以箱体体积的值为0.1125～0.25mol/L；所述二氧化碳发生剂组分为碳酸氢钠溶液、柠檬酸溶液；所述氢气发生剂组分为硼氢化钠和水。

2.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养环境快速生成方法，其特征在于步骤①中所述的氧化还原状态指示剂为刃天青指示剂或美兰指示剂，氧化还原状态指示剂是粉末、试纸或溶液。

3.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养环境快速生成方法，其特征在于步骤②中加入除氧剂的容器内同时加入除氧辅剂。

4.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养环境快速生成方法，其特征在于步骤②中所述的二氧化碳发生剂和氢气发生剂产生的气体体积占箱体体积的21%，其中二氧化碳发生剂产生的气体体积占箱体体积的8%～10%。