JP2017511806A

JP2017511806A - 選択的ｂａｃｅ１阻害剤

Info

Publication number: JP2017511806A
Application number: JP2016558188A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズヘンブレ，エリック; エデュアルドロペス，ホセ; アンマクマホン，ジェニファー; ジェイムズリチャーズ，サイモン; ラリー，ジュニアウィナロスキー，レオナルド; アンドリューウッズ，ティモシー
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2015-02-23
Filing date: 2016-02-17
Publication date: 2017-04-27
Anticipated expiration: 2036-02-17
Also published as: PE20171337A1; CA2972098A1; US9522923B2; GT201700185A; MX367940B; TWI627177B; CR20170315A; EP3262051A1; CO2017008382A2; BR112017013936A2; KR20170103971A; PH12017501523A1; EA201791684A1; ZA201704293B; KR101945139B1; TW201643170A; EA031546B1; MX2017010861A; CL2017002090A1; WO2016137788A1

Abstract

本発明は、式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。【化１】【選択図】なし

Description

本発明は、ある特定の新規な選択的ＢＡＣＥ１阻害剤、前記化合物を含む医薬組成物、前記化合物を用いて生理障害を治療する方法、並びに前記化合物の合成において有用な中間体および方法に関する。

本発明は、アルツハイマー病、並びに、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のペプチド断片である、神経毒性があり高度に凝集したアミロイドβ（Ａｂｅｔａ）ペプチドが関連する他の疾患および障害、の治療分野に属する。アルツハイマー病は、世界中で数百万人の患者を害している重篤な神経変性障害である。前記疾患の進行停止、遅延、または反転ではなく、一過性の対症的な恩恵しか患者にもたらさない、現在承認されている市場の作用剤を考慮すると、アルツハイマー病の治療における重要な要求は未だ満たされていない。

アルツハイマー病は、脳におけるＡｂｅｔａの発生、凝集、および堆積に特徴付けられる。β−セクレターゼ（アミロイド前駆体タンパク質βサイト切断酵素；ＢＡＣＥ）の完全または部分的な阻害は、マウスモデルにおけるプラーク関連性およびプラーク依存性の病態に重大な影響を与えることが示されており、このことは、Ａｂｅｔａペプチドレベルの小さな減少でさえ、プラーク面積率（plaque burden）およびシナプス欠損の長期に亘る有意な減少をもたらし、それにより、特にアルツハイマー病の治療において有意な治療効果を提供し得ることを示唆している。さらに、ＢＡＣＥ１およびＢＡＣＥ２と称されるＢＡＣＥの２つの相同体が特定されており、ＢＡＣＥ１はアルツハイマー病の発症において臨床的に最も重要であると考えられている。ＢＡＣＥ１は主にニューロンにおいて発現され、一方、ＢＡＣＥ２は主に末梢において発現されることが示されている（D. Oehlrich, Bioorg. Med. Chem. Lett., 24, 2033-2045 (2014)を参照）。さらにＢＡＣＥ２は、色素細胞に特異的なメラニン形成細胞タンパク質のプロセシングに関与していることが確認されていることから、色素沈着において重要であり得る（L. Rochin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110(26), 10658-10663 (2013)を参照）。中枢神経系（ＣＮＳ）への浸透性を有するＢＡＣＥ阻害剤、特にＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対して選択的な阻害剤によって、アルツハイマー病等のＡｂｅｔａペプチド介在性障害に対する治療が提供されることが望まれている。

米国特許第８，１５８，６２０号では、融合アミノジヒドロチアジン誘導体が開示されており、これは、ＢＡＣＥ１阻害活性を有し、さらに、アルツハイマー型認知症等の、Ａβペプチドによって引き起こされる神経変性疾患に対する有用な治療薬であることが開示されている。さらに、米国特許第８，３３８，４０７号では、アルツハイマー型認知症等のある特定の神経変性疾患の治療に有用な、ＢＡＣＥ１阻害効果を有する、ある特定の融合アミノジヒドロチアジン誘導体が開示されている。

本発明は、ＢＡＣＥの阻害剤である、ある特定の新規化合物を提供する。さらに本発明は、ＢＡＣＥ２を超えて、ＢＡＣＥ１の選択的阻害剤である、ある特定の新規化合物を提供する。さらに本発明は、ＣＮＳに浸透する、ある特定の新規化合物を提供する。また本発明は、例えばＢＡＣＥ２を超えたＢＡＣＥ１の選択的阻害を通じて、副作用プロファイルを改善し得る、ある特定の新規化合物も提供する。

よって、本発明は、式Ｉの化合物

またはその薬学的に許容できる塩を提供する。

さらに本発明は、式Ｉａの化合物

またはその薬学的に許容できる塩を提供する。

本発明はさらに、Ｒがメチル、エチル、またはシクロプロピルである、式ＩＩの化合物

またはその薬学的に許容できる塩を提供する。

さらに本発明は、式ＩＩａの化合物

またはその薬学的に許容できる塩を提供する。

本発明はまた、患者におけるアルツハイマー病を治療する方法も提供し、前記方法は、このような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む。

本発明はさらに、患者における軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行を治療する方法も提供し、前記方法は、このような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む。本発明はまた、患者におけるＢＡＣＥを阻害する方法も提供し、前記方法は、このような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む。本発明はまた、ＢＡＣＥによるアミロイド前駆体タンパク質の切断を阻害する方法も提供し、前記方法は、このような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む。本発明はさらに、Ａｂｅｔａペプチドの産生を阻害するための方法も提供し、前記方法は、このような治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む。

さらに本発明は、治療で用いるための、具体的には、アルツハイマー病の治療のための、または軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行の治療のための、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を提供する。またさらに、本発明は、アルツハイマー病の治療のための薬剤の製造のための、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用を提供する。

本発明はさらに、１つ以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤と共に、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を含む、医薬組成物を提供する。本発明はさらに、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩を、１つ以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法を提供する。本発明はまた、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、およびＩＩａの化合物を合成するための新規の中間体および方法も包含する。

軽度認知機能障害は、臨床症状、および軽度認知機能障害を示す患者のアルツハイマー型認知症への経時的な進行に基づく、アルツハイマー病と関連する、認知症の潜在的な前駆期と定義されている（Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)）。用語「軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行の治療」には、患者における軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行の、抑制、遅延、停止、または反転が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「治療（treating）」または「治療（to treat）」には、既存の症状または障害の進行または重症度の抑制、遅延、停止、または反転が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「患者」とはヒトを指す。

用語「Ａｂｅｔａペプチドの産生の阻害」は、患者におけるＡｂｅｔａペプチドのインビボレベルの減少を意味していると見なされる。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、患者への単回投与または複数回投与時に診断または治療中の患者において所望の効果を与える、本発明の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の量または用量を指す。

有効量は、当業者としての、主治医を務める診断医により、公知の技術の使用によって、および、類似の環境下で得られた結果の観察によって、容易に決定することができる。患者に対する有効量を決定する際、いくつかの要素が主治医を務める診断医によって考慮され、例えば、限定はされないが、患者の種；そのサイズ、年齢、および全体的な健康；関連する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度または併発（involvement）または重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与様式；投与される調製物のバイオアベイラビリティ特性；選択される用法；併用薬の使用；並びに他の関連する環境が挙げられる。

本発明の化合物は、概して、広い用量域にわたって有効である。例えば、１日当たりの投与量は通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲に含まれる。いくつかの場合では、前記範囲の下限を下回る投与量レベルで充分過ぎる場合があり、一方、他の場合では、より大きな用量が許容できる副作用を伴って使用される場合があり、従って、上記の用量域は、決して、本発明の範囲を限定することを意図していない。

本発明の化合物は、経口経路および経皮経路を含む、化合物を生物学的に利用可能なものにするあらゆる経路によって投与される医薬組成物として、製剤化されることが好ましい。このような組成物は経口投与用であることが最も好ましい。このような医薬組成物およびその調製法は、当該技術分野において周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006を参照）。

式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、もしくはＩＩａの化合物、またはその薬学的に許容できる塩は、本発明の治療法において特に有用であるが、ある特定の基、置換基、および立体配置が好ましい。以下のパラグラフには、そのような好ましい基、置換基、および立体配置が記載される。これらの好ましさが、本発明の治療法および本発明の新規化合物の両方に適用可能であることは理解されよう。

従って、縮合二環式環がＣＩＳ立体配置である式Ｉおよび式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容できる塩、が好ましい。例えば、式Ｉａの化合物が、下記のスキームＡに示される、１および２と標識された中心において、ＣＩＳ相対配置であることは、当業者によって理解される。さらに、式Ｉａの化合物は、１、２、および３と標識された炭素原子において３つのキラル中心を含有するコアを含む。スキームＡで使用される付番方式が、本明細書における化合物の命名に使用される付番方式に一致していなくてもよいこと、および、従って、スキームＡで使用される付番方式が例示を目的としていることは、当業者によって理解される。式Ｉａの３つのキラル中心の好ましい相対配置がスキームＡに示される。

スキームＡ

さらに、本発明の化合物は、

Ｎ−［３−［（４ａＳ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド；
Ｎ−［３−［（４ａＳＲ，５ＳＲ，７ａＳＲ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、およびその薬学的に許容できる塩である。

本発明は、各々全ての鏡像異性体およびジアステレオマー、並びに、ラセミ化合物を含む、前記化合物の鏡像異性体の混合物を意図しているが、下記の絶対配置を有する化合物が特に好ましい：
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、およびその薬学的に許容できる塩；並びに
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物。
さらに、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドが特に好ましい。
さらに、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネート；および
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホネートも特に好ましい。

本発明の化合物が、下記のスキームＢに示されるように互変異性型で存在し得ることは、当業者に理解される。本願における、本発明の化合物の特定の互変異性体の１つに対しいかなる言及がなされた場合も、両方の互変異性型およびその全ての混合物が包含されるものと理解される。

スキームＢ

さらに、以下の調製に記載されるある特定の中間体は、１つ以上の窒素保護基または酸素保護基を含有していてもよい。保護基が、特定の反応条件および実行される特定の形質転換に応じて、当業者によって理解されるように変化し得ることは、理解される。保護および脱保護の条件は当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007を参照）。

個々の異性体、鏡像異性体、およびジアステレオマーは、当業者によって、本発明の化合物の合成のあらゆる好都合なポイントで、選択的結晶化法またはキラルクロマトグラフィー等の方法によって、分離または分割され得る（例えば、J. Jacques, et al., “Enantiomers, Racemates, and Resolutions”, John Wiley and Sons, Inc., 1981、およびE.L. Eliel and S.H. Wilen,” Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994を参照）。

塩酸塩等の本発明の化合物の薬学的に許容できる塩は、例えば、当該技術分野において周知の標準条件下での、ジエチルエーテル等の適切な溶媒中の、本発明の化合物の適切な遊離塩基と、塩酸等の適切な薬学的に許容できる酸との反応によって、形成させることができる。さらに、このような塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に起こり得る。このような塩の形成は当該技術分野において充分に周知・認知されている。例えば、Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000);およびBerge, S.M., et al., “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)を参照されたい。

ある特定の略語は以下の通りに定義される：「ＡＰＰ」はアミロイド前駆体タンパク質を指し；「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し；「ＣＤＩ」は１，１’−カルボニルジイミダゾールを指し；「ｃＤＮＡ」は相補的デオキシリボ核酸を指し；「ＤＣＣ」は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを指し；「Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）」はビス（２−メトキシエチル）アミノサルファートリフルオリドを指し；「ＤＩＣ」は１，３−ジイソプロピルカルボジイミドを指し；「ＤＭＡＰ」は４−ジメチルアミノピリジンを指し；「ＤＭＥＭ」はダルベッコー変法イーグル培地を指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「ＥＢＳＳ」はアール平衡塩類溶液を指し；「ＥＤＣＩ」は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を指し；「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着測定法を指し；「Ｆ１２」はハムＦ１２培地を指し；「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し；「Ｆｃ」は結晶形成フラグメント（fragment crystallizable）を指し；「ＦＬＵＯＬＥＡＤ（商標）」は４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６−ジメチルフェニルサルファートリフルオリドを指し；「ＦＲＥＴ」は蛍光共鳴エネルギー転移を指し；「ＨＡＴＵ」は（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）メタンイミニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し；「ＨＢＴＵ」は（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタンイミニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し；「ＨＥＫ」はヒト胚腎臓を指し；「ＨＦ−ピリジン」はフッ化水素・ピリジンまたはオラー試薬またはポリ（ピリジンフルオライド）を指し；「ＨＯＡｔ」は１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを指し；「ＨＯＢＴ」は１−ヒドロキシルベンゾトリアゾール水和物を指し；「ＩＣ_５０」はその作用剤が可能な最大阻害反応の５０％をもたらす作用剤の濃度を指し；「ＩｇＧ_１」は免疫グロブリン様ドメインＦｃ−γ受容体を指し；「ＭＥＭ」は最小必須培地を指し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝食塩水を指し；「ＰＤＡＰＰ」は血小板由来アミロイド前駆体タンパク質を指し；「Ｐｈ」はフェニル基を指し；「ＰｙＢＯＰ」は（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）を指し；「ＰｙＢｒＯＰ」はブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し；「ＲＦＵ」は相対蛍光単位を指し；「ＲＴ−ＰＣＲ」は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指し；「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を指し；「ＳＣＸ」は強陽イオン交換を指し；「ＳＦＣ」は超臨界クロマトグラフィーを指し；「Ｔ３Ｐ（登録商標）」はプロピルホスホン酸無水物を指し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し；「ＴＥＭＰＯ」は（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−イル）オキシルを指し；「ＴＭＥＭ」は膜貫通型タンパク質を指し；「トリチル」は式「（Ｐｈ）_３Ｃ− の基を指し；「ＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｅ（登録商標）またはＤＡＳＴジフルオロスルフィニウム塩（DAST difluorosulfinium salt）」は（ジエチルアミノ）ジフルオロスルホニウムテトラフルオロボレートまたはＮ，Ｎ−ジエチル−Ｓ，Ｓ−ジフルオロスルフィルイミニウムテトラフルオロボレート（N,N-diethyl-S,S-difluorosulfiliminium tetrafluoroborate）を指し；「ＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｍ（登録商標）またはモルフォ−ＤＡＳＴジフルオロスルフィニウム塩（morpho-DAST difluorosulfinium salt）」はジフルオロ（モルホリノ）スルホニウムテトラフルオロボレートまたはジフルオロ−４−モルホリニルスルホニウムテトラフルオロボレートを指す。

用語「トシル酸塩」、「トルエンスルホン酸」、「ｐ−トルエンスルホン酸」、および「４−メチルベンゼンスルホン酸」が以下の構造の化合物を指すことは当業者によって理解される。

本発明の化合物、またはその塩は、当業者に公知の種々の手順によって調製され得、そのいくつかが下記のスキーム、調製、および実施例に示される。本発明の化合物またはその塩を調製するために、記載される各経路の特定の合成ステップを、異なる様式で組み合わせてもよいこと、または異なるスキーム由来のステップと併せてもよいことは、当業者によって理解される。下記のスキームにおける各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈降、クロマトグラフィー、濾過、研和、および結晶化を含む、当該技術分野において周知の常法によって回収することができる。下記のスキームでは、全ての置換基は、特に記載がない限り、先に定義された通りである。試薬および出発物質は、当業者が容易に入手可能である。以下のスキーム、調製、および実施例によって、本発明はさらに説明される。

スキーム１

スキーム１のステップＡでは、ヨウ化トリメチルスルホニウムを、ＴＨＦ等の溶媒中、約−５０℃の温度で、ｎ−ブチルリチウム等の有機塩基で処理する。次に、トリチル基等の適切な保護基で保護された保護オキシメチルオキシランを、−１０℃の塩基性溶液に添加し、約２時間撹拌することで、スキーム１、ステップＡの保護生成物が得られる。「ＰＧ」は、カルバメート、アミド、またはエーテル等のアミノ基または酸素基のために開発された保護基である。このような保護基は当該技術分野において充分に周知・認知されている。ステップＡの保護生成物を、およそ室温の、トルエンおよび水酸化ナトリウム等の無機塩基水溶液等の溶媒中で、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムスルフェートまたは他の四級アンモニウム塩相間移動触媒を用いて、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等のα−ハロエステルと反応させることで、スキーム１、ステップＢの化合物が得られる。このようなアルキル化は当該技術分野において周知である。あるいは、油中の６０％水素化ナトリウム等の塩基、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはＴＨＦ等の溶媒、および０〜１００℃の温度範囲を用いることで、ステップＢの保護生成物を得ることができる。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアセテートを、２段階の手順にわたってオキシムに変換する。ヘキサン中のイソブチルアルミニウム水素化物等の還元剤を約−７０℃の温度で滴加し、続いて、塩酸等の酸水溶液を約−６０℃の温度で滴加する。有機的抽出によりワークアップを完了させることで、中間体物質が得られる。この物質をジクロロメタン等の有機溶剤に溶解させ、酢酸ナトリウム、次いで塩酸ヒドロキシルアミンで処理することで、ステップＣのオキシム生成物が得られる。スキーム１、ステップＣののオキシム生成物は、約１０〜１５℃の温度で、または加熱しながら、次亜塩素酸ナトリウムまたはＮ−クロロスクシンイミド等の別のオキシダントの水溶液を用いて、および、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、トルエン、ジクロロメタン、またはキシレン等の溶媒中で、等のいくつかの方法による３＋２環化において、ステップＤの二環式４，５−ジヒドロイソキサゾール生成物に変換することができる。有機金属試薬を生成することによって、２−フルオロ，５−ブロモフェニル基をジヒドロイソキサゾールに付加することができる。有機金属試薬は、ｎ−ブチルリチウムまたはイソプロピルマグネシウムクロリド−塩化リチウム錯体等の試薬、および、ＴＨＦ等の溶媒中での約−７８℃〜１５℃の温度範囲における滴加、によるハロゲン／金属交換を用いることで、４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨード−ベンゼンから生成することができる。次に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル等のルイス酸を添加することで、スキーム１、ステップＥの生成物が得られる。得られた二環式テトラヒドロイソキサゾールを酢酸中の亜鉛で処理することで、スキーム１、ステップＦの開環生成物を形成することができる。イソキサゾール環を開環するための別の方法では、水素化条件下、圧力下で、エタノール等の極性溶媒中のラネーニッケルが使用される。次に、ステップＦの生成物を、約５℃〜室温の温度のジクロロメタンまたはＴＨＦ等の溶媒中のイソチオシアン酸ベンゾイルと反応させることで、ステップＧのチオ尿素化合物を得ることができる。チアジン環を、約−２０℃の温度のジクロロメタン等の溶媒中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物およびピリジン等の有機塩基を用いて形成させることで、ステップＨの生成物を得ることができる。トリチル基等のヒドロキシメチル保護基を、、室温のギ酸等の当該技術分野において周知の方法を用いて、または、ジクロロメタンおよびメタノール等の溶媒中のｐ−トルエンスルホン酸一水和物を用いて、スキーム１、ステップＩで除去することで、ステップＩの化合物を得ることができる。ＤＭＳＯ等の溶媒中、０〜２２℃の温度で２−ヨードキシ安息香酸（ＩＢＸ）等の酸化剤を用いて、または、約５−２５℃の温度で撹拌しながら、アセトニトリルまたはアセトニトリルおよび水等の溶媒で、（ジアセトキシヨード）ベンゼンを少しずつまたは一度に全て添加することで、ヒドロキシメチルをカルボン酸に酸化することにより、スキーム１、ステップＪの化合物を得ることができる。酸化における触媒としてＴＥＭＰＯも用いることができる。ワインレブアミドが、スキーム１、ステップＫにおいて、ステップＪの酸生成物から、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩、有機塩基（例えば、トリエチルアミン）、およびカップリング試薬（例えば、ＨＡＴＵ）の添加により調製される。この混合物を室温で混合することで、ステップＫの生成物が得られる。使用され得る他のカップリング剤としては、ＣＤＩ、カルボジイミド（例えば、ＤＣＣ、ＤＩＣ、もしくはＥＤＣＩ）、または他の、非求核性陰イオンのウロニウム塩もしくはホスホニウム塩（例えば、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、およびＰｙＢｒＯＰ）が挙げられる。次に、ＴＨＦ等の溶媒中、ステップＬで、グリニャール試薬または有機リチウム試薬等の有機金属試薬を用いて、ワインレブアミドがケトンに変換される。適切なグリニャール試薬を、エーテルまたは２−メチルテトラヒドロフラン等の溶媒中の溶液として、約−７８℃〜０℃の温度でワインレブアミドに添加することで、ステップＬのケトンを得ることができる。スキーム１、ステップＭにおいて、約−７８℃〜室温のジクロロメタン等の溶媒中のＤｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）を用いて、ステップＬの化合物のＲ基およびケトン基をジフルオロ−Ｒ基に変換することができる。別の手順には、Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等のフッ素化試薬と三フッ化ホウ素ジエチルエーテルの予混合、その後の、スキーム１、ステップＬの生成物およびトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の添加により、スキーム１、ステップＭの生成物を得ることが含まれる。あるいは、当該技術分野において周知の、使用され得る他のフッ素化剤は、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩等の添加剤を用いるジエチルアミノ硫黄トリフルオリド（「ＤＡＳＴ」とも称される）、ＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｅ（登録商標）もしくはＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｍ（登録商標）、または、ＨＦ−ピリジン等の添加剤を用いるＦＬＵＯＬＥＡＤ（商標）である。エタノール等の溶媒中の（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミンまたはトランス−Ｎ，Ｎ’ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミンを用い、アジ化ナトリウム、次いでＬ−アスコルビン酸ナトリウムおよび硫酸銅を添加することで、前記フェニルの５−ブロモがアミンに変換される。前記反応物は、約８０〜１００℃で数時間加熱され、その後、酢酸エチル等の溶媒を用いる抽出によりワークアップがなされる。次に、前記中間体を、約４０〜５０ｐｓｉの水素圧下、メタノールまたはエタノールおよびＴＨＦ等の溶媒中で、５〜１０％パラジウム等のパラジウム炭素を用いて、水素化条件下で還元することで、スキーム１、ステップＮのアニリン生成物が得られる。

スキーム２

あるいは、スキーム２において、スキーム１、ステップＡの保護生成物を、約５℃の温度のトルエン等の溶媒中、４−（２−クロロアセチル）モルホリノ、およびテトラブチルアンモニウム硫酸水素塩等の塩基で処理することで、スキーム２、ステップＡの生成物を得ることができる。モルホリノ基はその後、スキーム２、ステップＢにおいて脱離基として機能し得る。例えば、スキーム２、ステップＡの生成物を、イソプロピルマグネシウムクロリド−塩化リチウム錯体および４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨードベンゼンからインサイツで調製できる適切なグリニャール試薬で処理することで、または、前記適切なグリニャール試薬が利用可能な場合、前記試薬を約５℃の温度でスキーム２、ステップＡの生成物に直接添加することで、スキーム２、ステップＢの生成物を得ることができる。前記カルボニルアセテートを、約５０℃に加熱しながら、塩酸ヒドロキシルアミンおよび酢酸ナトリウムを用いて、オキシムに変換することで、スキーム２、ステップＣの生成物を得ることができる。次に、トルエン等の溶媒中のヒドロキノンを用い、加熱還流することで、スキーム２、ステップＣのオキシム生成物をスキーム２、ステップＤの生成物（スキーム１、ステップＥと同一の生成物）に変換することができる。スキーム２、ステップＤのアミン生成物を、約０〜５℃の温度のジクロロメタン等の溶媒中のＤＭＡＰおよびピリジン等の有機塩基を用いて、塩化アセチルでアシル化することで、スキーム２、ステップＥの生成物を得ることができる。スキーム２、ステップＥの生成物はその後、下記の通りに、スキーム３、ステップＡの生成物に変換することができる。

スキーム３

スキーム３に記載されるような別の経路では、スキーム１、ステップＥの化合物のイソキサゾール窒素をアセチル基によって保護し、ヒドロキシメチルの保護基を二段階の手順で除去する。例えば、テトラヒドロイソキサゾールをジクロロメタン等の溶媒中のＤＭＡＰおよびピリジン等の有機塩基で処理し、塩化アセチルを添加する。温度を約１０℃以下に維持し、およそ室温で撹拌する。反応物を水で希釈し、ジクロロメタン等の溶媒で抽出する。有機抽出液を１Ｎ塩酸等の酸水溶液で洗浄し、この水溶液をジクロロメタン等の溶媒で再度抽出し、その後水で洗浄する。有機溶媒を部分的に除去し、ジクロロメタンおよびメタノール等の溶媒中のギ酸またはｐ−トルエンスルホン酸一水和物等の酸を添加することで、ヒドロキシメチルを脱保護することができる。この混合物を、前記ヒドロキシの脱保護が完了するまで、室温で撹拌する、または約４０℃の温度に加熱することで、スキーム３、ステップＡの化合物を得ることができる。スキーム３、ステップＡのヒドロキシメチル生成物は、スキーム１、ステップＪに記載される手順と同様に、スキーム３、ステップＢのカルボン酸生成物に酸化することができ、さらに、スキーム１、ステップＫに記載される手順と同様に、ジクロロメタン等の溶媒と共に、少しずつ添加する、または一度に添加するＣＤＩ等のカップリング剤を用い、−２０℃に冷却し、約１時間撹拌し、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩を少しずつまたは一度に添加することで、ワインレブアミドを調製することができる。トリエチルアミン等の有機塩基を用いることで反応を促進することもできる。完全な反応が観察されるまで、ＣＤＩおよびＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンのさらなる添加を加えることで、スキーム３、ステップＣのワインレブアミド生成物を得ることができる。スキーム３、ステップＤのケトンは、スキーム１、ステップＬに記載される手順と同様に、ワインレブアミドから形成することができる。ステップＤのケトンをスキーム１、ステップＭに記載される手順と同様にジフルオロ−Ｒ基に変換することで、スキーム３、ステップＥの生成物を得ることができる。アセチルテトラヒドロイソキサゾールを、塩酸の使用および約１００℃への加熱等の当該技術分野において周知の酸性条件下で脱保護することで、スキーム３、ステップＦの生成物を得ることができる。スキーム１、ステップＦに記載される手順と同様に、二環式テトラヒドロイソキサゾールを酢酸中の亜鉛で処理することで、スキーム３、ステップＧの開環生成物を形成させることができる。スキーム３、ステップＨのチアジン生成物は、スキーム１、ステップＧに記載される手順と同様に、イソチオシアン酸ベンゾイルを用いるワンポットの２段階反応で調製することができる。この混合物を残渣になるまで蒸発させ、シクロヘキサンを添加する。この混合物を約６０℃に加熱し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加して残渣を溶解させる。この溶液を濾過し、濃縮乾固する。その後、スキーム１、ステップＨに記載される手順と同様にチアジン環を形成させることで、スキーム３、ステップＨの生成物を得ることができる。

スキーム４

スキーム４、ステップＡにおいて、当該技術分野において周知のカップリング条件を用いて、スキーム１、ステップＮのアニリン生成物をヘテロ芳香族カルボン酸とカップリングすることができる。カルボン酸およびアミンの反応がもたらすアミド形成のための方法および試薬がいくつか存在することは、当業者によって認められる。例えば、カップリング試薬、およびジイソプロピルエチルアミンまたはトリエチルアミン等のアミン塩基の存在下での適切なアニリンと適切な酸との反応によって、スキーム４、ステップＡの化合物が得られる。カップリング試薬としては、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣＩ等のカルボジイミド、並びにＨＯＢｔおよびＨＯＡｔ等の芳香族オキシムが挙げられる。さらに、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、およびＰｙＢｒＯＰ等の非求核性陰イオンのウロニウム塩もしくはホスホニウム塩、またはＴ３Ｐ（登録商標）等の環式無水リン酸を、より伝統的な前記カップリング試薬の代わりに用いることができる。ＤＭＡＰ等の添加剤を用いて、反応を強化してもよい。あるいは、前記アニリンアミンは、トリエチルアミンまたはピリジン等の塩基の存在下で置換塩化ベンゾイルを用いることで、アシル化することができる。次いで、スキーム４、ステップＢにおいて、前記保護チアジンアミンを、ＴＨＦおよびエタノール等の溶媒中のピリジンおよびＯ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩等の有機塩基、並びにピリジン等の有機塩基で脱保護することで、式ＩＩの化合物を得ることができる。あるいは、メタノール中の水酸化リチウム等の無機塩基を用いてチアジンを脱保護し、式ＩＩの化合物を得てもよい。

スキーム５

あるいは、スキーム５では、約１００〜１３０℃に加熱しながら、トリフルオロアセトアミド、ヨウ化銅、ジアミン、例えば、トランス、ラセミ−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン、無機塩基例えば、炭酸カリウム、およびヨウ化ナトリウムを用いて、スキーム１、ステップＭのブロマイド生成物を保護アニリンに変換することで、スキーム５、ステップＡの保護アニリン生成物が得られる。保護アニリンおよびチアジンアミンはその後、段階的に脱保護され得る。トリフルオロアセトアミドをメタノール中の７Ｎアンモニア等の塩基を用いて加水分解することで、スキーム１、ステップＮの同一生成物である、アニリンおよび保護チアジンを得ることができる。次に、チアジンを、当該技術分野において周知であり、スキーム４、ステップＢに記載される条件下で、ピリジン等の有機塩基と共にエタノールおよびＴＨＦ等の溶媒中のＯ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩を用いて脱保護し、次いで、約５５℃に加熱または室温で撹拌し、その後濃縮および精製することで、スキーム５、ステップＢの生成物を得ることができる。あるいは、脱保護の順番を逆転して、チアジンを最初に脱保護し、アニリンを最後に脱保護してもよい。次に、スキーム５、ステップＣにおいて、スキーム４、ステップＡに記載のように、ステップＢのアニリン生成物を適切なカルボン酸または酸塩化物と反応させることで、式ＩＩの生成物を得ることができる。

塩酸塩等の本発明の化合物の薬学的に許容できる塩は、例えば、当該技術分野において周知の標準条件下でのジエチルエーテル等の適切な溶媒中の、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、またはＩＩａの適切な遊離塩基と、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸、またはマロン酸等の適切な薬学的に許容できる酸との反応によって、形成させることができる。さらに、このような塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に起こり得る。このような塩の形成は当該技術分野において充分に周知・認知されている。例えば、Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities”を参照されたい。

以下の調製法および実施例によって本発明はさらに説明される。

調製法１
（２Ｓ）−１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール

スキーム１、ステップＡ：周囲温度のＴＨＦ（１２６４ｍＬ）中でヨウ化トリメチルスルホニウム（１９３．５ｇ、９４８．２ｍｍｏｌ）を７５分間撹拌する。混合物を−５０℃に冷却し、カニューレを介し３０分間かけてｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５ｍｏｌ／Ｌ、３７９ｍＬ、９４８．２ｍｍｏｌ）を加える。反応物を−３０℃に徐々に温め、６０分間撹拌する。（２Ｓ）−２−トリチルオキシメチルオキシラン（１００ｇ、３１６．１ｍｍｏｌ）を少量ずつ加え、温度を−１０℃以下に維持する。添加が完了した後、反応混合物を室温に温め、２時間撹拌する。反応物を飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。メチルｔ−ブチルエーテル：ヘキサン（１０〜１５％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（５６．２２ｇ、５４％）を得る。ES/MS m/z 353 (M+Na).

調製法１の別法
（２Ｓ）−１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール
スキーム２、ステップＡ出発物質：トリフェニル塩化メチル（２８７ｇ、９４７．１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７．７１ｇ、６３．１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１４０ｇ、１３８３．５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（８５０ｍＬ）中の（２Ｓ）−ブタ−２−エン−１，２−ジオール（JACS, 1999, 121, 8649でのように調製）（６４．５ｇ、６３１ｍｍｏｌ）の溶液に加える。２４℃で２４時間撹拌する。１Ｎクエン酸水溶液（４２５ｍＬ）を加える。層を分離し、有機抽出液を減圧下で濃縮乾固する。メタノール（９００ｍＬ）を加え、１時間かけて５℃に冷却する。固体を濾過で収集し、５℃メタノール（５０ｍＬ）で洗浄する。固体を捨て、母液を減圧下で濃縮乾固する。トルエン（８００ｍＬ）を加え、２６８ｇの塊まで濃縮して、４８ｗｔ％トルエン溶液中の表題化合物（１２９ｇ、６７％）を得る。

調製法２
１−モルホリノ−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン

スキーム２、ステップＡ：テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（８３．２ｇ、２４５．０ｍｍｏｌ）および４−（２−クロロアセチル）モルホリン（６３８．５０ｇ、３９０２．７ｍｍｏｌ）を、０〜５℃のトルエン（５８００ｍＬ）中の１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール（８３２．４、２５１９ｍｍｏｌ）の溶液に加える。水（１０４１ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（１００８．０ｇ、２５２０２ｍｍｏｌ）を加える。０〜５℃で１９時間撹拌する。水（２５００ｍＬ）およびトルエン（２５００ｍＬ）を加える。層を分離し、水（２×３５００ｍＬ）で有機抽出液を洗浄する。有機抽出液を減圧下で濃縮乾固する。トルエン（２５００ｍＬ）を残渣に加えた後、ｎ−ヘプタン（７５００ｍＬ）をゆっくり加える。１６時間撹拌する。得られる固体を濾過で収集し、ｎ−ヘプタン（１２００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物（１０７５．７ｇ、９８％）を得る。

調製法３
１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン

スキーム２、ステップＢ：ＴＨＦ中の１．３Ｍイソプロピルマグネシウムクロリド−塩化リチウム錯体溶液（３０７９ｍＬ、２０００ｍｍｏｌ）を、５℃以下の反応温度を維持する速度でトルエン（２５００ｍＬ）中の４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨードベンズ（６７３．２ｇ、２２３７．５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１時間撹拌する。得られたグリニャール溶液（５１５０ｍＬ）を、トルエン（５０００ｍＬ）中の１−モルホリノ−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン（５００ｇ、１０９３ｍｍｏｌ）の溶液に、５℃以下の反応温度を維持する速度で加える。温度を５℃以下に維持しながら３時間撹拌する。調製したグリニャール溶液（４２９ｍＬ）さらにを加え、１時間撹拌する。１Ｎクエン酸水溶液（５０００ｍＬ）を、温度を５℃以下に維持する速度で加える。層を分離し、水（５０００ｍＬ）で有機抽出液を洗浄する。溶液を減圧下で濃縮乾固する。メタノール（２０００ｍＬ）を残渣に加え、濃縮して、表題化合物を残渣として得る（７９３ｇ、７３．４％効力、８３％）。

調製法４
１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノンオキシム

スキーム２、ステップＣ：塩酸ヒドロキシルアミン（９８．３ｇ）を、メタノール（３８００ｍＬ）中の１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン（４５０ｇ、７０７ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１７４ｇ）に加える。溶液を２時間かけて５０℃に加熱する。２４℃に冷却し、濃縮する。水（１０００ｍＬ）およびトルエン（１５００ｍＬ）を残渣に加える。層を分離し、トルエン（５００ｍＬ）で水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、水（２×４００ｍＬ）で洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して、表題化合物を残渣として得る（５６７ｇ、６１．４％効力、８８％）。

調製法５
ｔｅｒｔ−ブチル２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセテート

スキーム１、ステップＢ：（２Ｓ）−１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール（７４．６７ｇ、２２６．０ｍｍｏｌ）を、トルエン（３７６ｍＬ）中のテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムスルフェート（１３．２６ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）の溶液に加える。水（１１９ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（５０％質量）、次いで、ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブロモアセテート（１１０．２０ｇ、５６５．０ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。水に注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。混合物濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（７７．８６ｇ、７７％）を得る。ES/MS m/z 467 (M+Na).

調製法６
（１Ｅ）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセトアルデヒドオキシム

スキーム１、ステップＣ：ジクロロメタン（５８２．２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセテート（７７．６６ｇ、１７４．７ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。ヘキサン中の水素化ジイソブチルアルミニウム（１ｍｏｌ／Ｌ、１７４．７ｍＬ）を３５分間かけて滴加し、−７０℃以下の温度を維持する。−７８℃で５時間撹拌する。水中の塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ、１９２．１ｍＬ）を反応混合物に滴加し、−６０℃以下の温度を維持する。反応物を周囲温度に徐々に温め、６０分間撹拌する。有機抽出液を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄する。硫酸マグネシウムで溶液を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。残渣をジクロロメタンに溶解させる。酢酸ナトリウム（２８．６６ｇ、３４９．３ｍｍｏｌ）、次いで塩酸ヒドロキシルアミン（１８．２１ｇ、２６２．０ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で１８時間撹拌する。水に注ぎ、相を分離し、ジクロロメタンで水相を抽出する。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。混合物濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（６８．３８ｇ、１０１％）を得る。ES/MS m/z 386 (M-H).

調製法７
（３ａＲ，４Ｓ）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール

スキーム１、ステップＤ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（７１７ｍＬ）中の（１Ｅ）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセトアルデヒドオキシム（５５．５７ｇ、１４３．４ｍｍｏｌ）の溶液を５℃に冷却する。次亜塩素酸ナトリウム（水中５％、５９１ｍＬ、４３０．２ｍｍｏｌ）を滴加し、１０℃以下の温度を維持する。１０℃で３０分間撹拌する。反応物を１５℃に温める。１５℃で１８時間撹拌する。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄する。相を分離し、５％亜硫酸水素ナトリウム溶液およびブラインで有機相を洗浄する。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。５０％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ジクロロメタン：ヘキサン（２０〜２７％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（３５．８４ｇ、６５％）を得る。ES/MS m/z 408 (M+Na).

調製法８
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール

スキーム１、ステップＥ：ＴＨＦ（１４４．５ｍＬ）およびトルエン（１４４５ｍＬ）中の４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨード−ベンゼン（８６．９４ｇ、２８８．９ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。−７０℃以下の温度を維持しながら、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、１２０ｍＬ、２８８．９ｍｍｏｌ）を滴加する。−７８℃で３０分間撹拌する。−７０℃以下の温度を維持しながら、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（３６．５ｍＬ、２８８．９ｍｍｏｌ）を滴加する。溶液を−７８℃で３０分間撹拌する。−６５℃以下の温度を維持しながら、ＴＨＦ（４８２ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（５５．６９ｇ、１４４．５ｍｍｏｌ）の溶液を反応物に３０分間かけて滴加する。−７８℃で９０分間撹拌する。−６０℃以下の温度を維持しながら、飽和塩化アンモニウムを迅速に加える。ブラインに注ぎ、酢酸エチルで水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。１０〜１５％ジエチルエーテル：ヘキサン（０〜７０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（３６．５２ｇ、４５％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 560/562 [M+H].

調製法８の別法
スキーム２、ステップＤ：トルエン（４０００ｍＬ）中の１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノンオキシム（４５８ｇ、５０２ｍｍｏｌ）およびヒドロキノン（５６．３ｇ５１１ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で２７時間加熱還流する。溶液を２４℃に冷却し、炭酸ナトリウム水溶液（８００ｍＬ）を加える。層を分離し、トルエン（３００ｍＬ）で水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、水（２×５００ｍＬ）で洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して、残渣を得る。イソプロピルアルコール（１５００ｍＬ）を加え、加熱還流する。２４℃に冷却し、固体を濾取する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物（２１２ｇ、７５％）を得る。

調製法９
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン

スキーム２、ステップＥ：塩化アセチル（３５．５６ｇ、５０３．９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（７２０ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（２３５．３ｇ、４２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５．１３ｇ、４２．０ｍｍｏｌ）、およびピリジン（６６．４５ｇ、８４０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で５℃以下の内部温度を維持しながら加える。１時間撹拌した後、水（３００ｍＬ）および１Ｍ硫酸（３００ｍＬ）を加える。混合物を１０分間撹拌し、層を分離する。有機抽出液を集め、飽和炭酸ナトリウム（５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）で洗浄する。硫酸マグネシウムで溶液を乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（２３５ｇ、９３％）を灰色固体として得る。

調製法１０
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−１−イル］エタノン

スキーム３、ステップＡ：２０Ｌジャケット付き反応器内で、塩化アセチル（２９０ｍＬ、４０７５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（１９９６ｇ、３３８４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５６．０ｇ、４５８ｍｍｏｌ）、ピリジン（５００ｍＬ、６１８０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で１０℃以下の内部温度を維持しながら加える。添加完了後（１時間）、２０℃に温め、一晩撹拌する。反応が不完全である場合、塩化アセチル、ＤＭＡＰ、ピリジン、およびジクロロメタンを、完全な反応が観察されるまで加える。反応混合物を０℃に冷却し、水（５Ｌ）をゆっくりと加え、反応混合物を１０℃で３０分間撹拌し、層を分離する。有機抽出液を集め、この水溶液をジクロロメタン（１Ｌ）で洗浄する。合わせた有機抽出液を１Ｎ塩酸水溶液（２×４Ｌ）で洗浄し、この水溶液をジクロロメタン（２×１Ｌ）で抽出する。合わせた有機抽出液を水（４Ｌ）で洗浄し、溶媒を減圧除去して、およそ５Ｌの総体積を得る。９０％ギ酸（１８００ｍＬ）を加え、周囲温度で３日間放置する。４０℃に２時間かけて温めた後、溶媒を減圧除去する。残渣をメタノール（４Ｌ）で希釈し、炭酸ナトリウム飽和水溶液（３Ｌ）をゆっくりと加える。固体の炭酸ナトリウム（３７５ｇ）を加えてｐＨを８〜９に調整する。４５℃で１時間撹拌した後、周囲温度に冷却する。固体を濾去し、メタノール（４×５００ｍＬ）で洗浄した後、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で処理し、周囲温度で１時間放置する。固体を濾去し、メタノール（２×１００ｍＬ）で洗浄する。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル（５Ｌ）と水（２Ｌ）に分割する。この溶液を酢酸エチル（２Ｌ）で抽出し、合わせた有機抽出液をブライン（２×１Ｌ）で洗浄する。溶媒を減圧除去し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２．５Ｌ）を加え、蒸発乾固する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４Ｌ）を加え、６５℃で１時間撹拌し、周囲温度に冷却し、固体を濾取し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×５００ｍＬ）で洗浄する。真空下で乾燥させてベージュ色固体を得る。この固体をトルエン（７．５Ｌ）中で完全に溶解するまで１１０℃まで加熱し、１時間かけて１８℃に冷却し、この温度で１時間撹拌する。４０℃に温め、沈殿が形成した場合、もう一度１８℃に冷却する。４５分間撹拌した後、固体を濾取し、トルエン（２×５００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物（４４３．１ｇ、３６％、ＬＣＭＳによる純度９５％）を得る。濾液を真空蒸発させて、残渣を得る。イソヘキサン中２０％〜１００％酢酸エチルで溶出させるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）中の画分を含有する生成物を６０℃で３０分間スラリー化させ、周囲温度に冷却し、固体を濾取し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物をベージュ色の結晶性固体として得る（３０４ｇ、２４％、ＬＣＭＳによる純度８８％）。濾液を真空蒸発させて残渣を得る。イソヘキサン中２０％〜１００％酢酸エチルで溶出させるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（５７．８ｇ、５％、ＬＣＭＳによる純度８８％）を得る。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 360.0/362.0 [M+H].

調製法１０の別法
スキーム３、ステップＡ：１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（６９ｇ、１１４．５ｍｍｏｌ）を、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２．２ｇ、１１．４５ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２８０ｍＬ）およびメタノール（７００ｍＬ）の１５℃溶液に加える。１８時間撹拌した後、溶媒を減圧除去する。残渣をジクロロメタン（３５０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（１４０ｍＬ）および水（１４０ｍＬ）を加える。層を分離し、有機層を減圧下で蒸発させる。トルエン（３５０ｍＬ）を残渣に加え、１時間加熱還流する。１０℃／時の速度で１０〜１５℃に冷却する。固体を濾取し、トルエン（７０ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物（３０ｇ、６５％）を灰色固体として得る。

調製法１１
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−カルボン酸

スキーム３、ステップＢ：水（２Ｌ）を、２０Ｌジャケット付き反応器内のアセトニトリル（４．５Ｌ）中の１−［（４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（８０４．９ｇ、２１７７ｍｍｏｌ）、ＴＥＭＰＯ（４０．０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、５℃の内部温度に冷却する。（ジアセトキシヨード）ベンゼン（１６９３ｇ、４９９３．４３ｍｍｏｌ）を３０分間かけて少しずつ加える。反応器冷却を用いて発熱を制御し、その後、ＬＣＭＳが完全な反応を示すまで２０℃に維持する。内部温度を２５℃に維持しながら、周囲温度の水（３００ｍＬ）中の亜硫酸水素ナトリウム（７０ｇ、６７２．６８ｍｍｏｌ）の懸濁液をゆっくりと加える。３０分間撹拌した後、５℃に冷却する。水（２Ｌ）を加えた後、内部温度を１０℃に維持しながら４７ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液（７８０ｍＬ）を１時間かけてゆっくりと加える。酢酸エチル（２Ｌ）およびイソヘキサン（５Ｌ）を加え、激しく撹拌し、層を分離する。二相性の有機層を水（１Ｌ）で抽出し、合わせた水層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２．５Ｌ）で洗浄する。水層抽出物を５℃に冷却し、内部温度を約５℃に維持ながら３７％塩酸（１．４Ｌ）を３０分間かけてゆっくりと加える。酢酸エチル（５Ｌ）を加え、層を分離し、有機層をブライン（３×１Ｌ）で洗浄する。合わせた水層抽出物を酢酸エチル（２．５Ｌ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（１Ｌ）で洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過する。有機層をヘプタン（２．５Ｌ）で希釈し、減圧下で蒸発乾固する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１．５Ｌ）およびヘプタン（１．５Ｌ）を加え、蒸発乾固する。ヘプタン（２．５Ｌ）を加え、２回蒸発乾固する。ヘプタン（５００ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５００ｍＬ）を加え、４０℃で３０分間撹拌した後、沈殿物を濾取し、ヘプタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１：１、１Ｌ）、次いでメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×３００ｍＬ）で洗浄し、風乾して、表題化合物をベージュ色の結晶性固体として得る（７７９ｇ、９１％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 374.0/376.0 [M+H].[α]_D ²⁰=-19.0°(C=1.004、クロロホルム).

調製法１１の別法
スキーム３、ステップＢ：水（１５０ｍＬ）およびアセトニトリル（１５０ｍＬ）を、１−［（４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（３０ｇ、７３．３ｍｍｏｌ）、ＴＥＭＰＯ（１．１４ｇ、７．３０ｍｍｏｌ）および（ジアセトキシヨード）ベンゼン（５１．９ｇ、１６１ｍｍｏｌ）に加える。１５℃に冷却し、２時間撹拌する。周囲温度の水（１５０ｍＬ）中のチオ硫酸ナトリウム（２１ｇ）および炭酸カリウム（２２ｇ）をゆっくりと加える。１時間撹拌した後、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１５０ｍＬ）を加える。層を分離し、濃硫酸で水層のｐＨを２〜３に調整する。酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、層を分離する。有機層を減圧下で蒸発乾固する。ｎ−ヘプタン（９０ｍＬ）を加え、１時間加熱還流する。１５℃に冷却した後、沈殿物を濾取し、ｎ−ヘプタン（９０ｍＬ）で洗浄する。真空下で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得る（２７ｇ、９８％）。

調製法１２
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルテトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−４−カルボキサミド

スキーム３、ステップＣ：１０Ｌジャケット付き反応器内で、ジクロロメタン（７．０Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−カルボン酸（７７１ｇ、２０１９ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で０℃に冷却し、ＣＤＩ（４００ｇ、２４２１ｍｍｏｌ）を４０分間かけて少しずつ加える。反応器ジャケットを−２０℃に冷却し、１時間撹拌した後、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２６０．０ｇ、２６１２ｍｍｏｌ）を約３０分間かけて少しずつ加える。−２０℃で１時間、０℃で２時間、１０℃で７時間撹拌する。ＣＤＩ（１７５ｇ、１０５８ｍｍｏｌ）を加え、１０℃で一晩撹拌する。ＣＤＩ（１８０ｇ、１０８８ｍｍｏｌ）を１０℃でさらに加え、１時間撹拌した後、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１４０ｇ、１４０７ｍｍｏｌ）を加え、１０℃で撹拌し続ける。反応が不完全であった場合、完全な反応が観察されるまで、ＣＤＩ、次いでＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩をさらに添加してもよい。反応混合物を５℃に冷却し、１Ｎ塩酸水溶液（５Ｌ）、次いで２Ｎ塩酸水溶液（５Ｌ）で洗浄する。合わせた水溶液をジクロロメタン（１Ｌ）で抽出し、有機抽出液を合わせ、水（２．５Ｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２．５Ｌ）、および水（２．５Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、残渣を得る。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３Ｌ）を加え、減圧下で蒸発させる。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）をさらに加え、５０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却し、３０分間撹拌する。得られた固体を濾取し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×５００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、表題化合物（７６０ｇ、８８％）を白色固体として得る。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 417.0/419.0 [M+H].

調製法１２の別法
スキーム３、ステップＣ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３５ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−カルボン酸（２７ｇ、７０．７ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で０℃に冷却し、ＣＤＩ（１４．９ｇ、９１．９ｍｍｏｌ）を加える。１時間撹拌した後、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（９．０ｇ、９２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１４．３ｇ、１４１ｍｍｏｌ）を加える。１５℃で１６時間撹拌する。反応混合物を０℃に冷却し、０．５Ｍ硫酸水溶液（６７５ｍＬ）を加える。１時間撹拌する。得られた固体を濾取する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（９０ｍＬ）中で固体を１時間スラリー化する。固体を濾取し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄する。真空下で乾燥させて、表題化合物（２３ｇ、７８％）を固体として得る。

調製法１３
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−イル］エタノン

スキーム３、ステップＤ：２０Ｌジャケット付き反応器内で、ＴＨＦ（１０Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルテトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−４−カルボキサミド（６５４．０ｇ、１５３６ｍｍｏｌ）の溶液を−６０℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン中３．２Ｍの臭化メチルマグネシウム溶液（６６０ｍＬ、２１１０ｍｍｏｌ）を、−４０℃以下の内部温度を維持しながら滴加する。反応混合物を−４０℃で３０分間撹拌した後、−５０℃に冷却し、−３８℃以下の内部温度を維持しながらＴＨＦ（２Ｌ）中の１Ｎ塩酸水溶液（２Ｌ）の溶液を加える。温度を１０℃に上昇させ、酢酸エチル（５Ｌ）および水（１Ｌ）を加え、撹拌し、内部温度を５℃に到達させ、層を分離する。水層を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出し、有機抽出液を合わせる。有機抽出液を水（２Ｌ）で洗浄し、水層を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出する。有機抽出液を合わせ、ブライン（３×２Ｌ）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、残渣を得る。シクロヘキサン（２．５Ｌ）を加え、６０℃で１時間、次いで２０℃で３０分間撹拌し、固体を濾取し、シクロヘキサン（５００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得る（５６５ｇ、９９％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 372.0/374.0 [M+H], [α]_D ²⁰= -58.0 ° (C=1.000、クロロホルム).

調製法１３の別法
スキーム３、ステップＤ：ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルテトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−４−カルボキサミド（４．０ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）の溶液を−５℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン中３．０Ｍの臭化メチルマグネシウム溶液（５．０ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を、−５〜０℃の内部温度を維持しながら滴加する。反応混合物を−５〜０℃で６０分間撹拌した後、塩化アンモニウム飽和溶液（２０ｍＬ）を加える。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４０ｍＬ）を加え、内部温度を５℃に到達させ、層を分離する。有機層を減圧下で蒸発させて、残渣を得る。ｎ−ヘプタン（５０ｍＬ）を加え、撹拌し、固体を濾取する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物を固体として得る（３．０ｇ、７７％）。

調製法１４
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−１−イル］エタノン

スキーム３、ステップＥ：１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−イル］エタノン（５．０８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）を、０〜５℃の無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｍ（登録商標）（１０．０２ｇ、３９．１８ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に一度に加える。混合物を１０分間撹拌し、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（４．５ｍＬ、２７ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴加する。反応混合物を氷浴中で８時間撹拌した後、周囲温度に温め、一晩撹拌する。炭酸ナトリウム飽和水溶液（１００ｍＬ）を加え、１時間撹拌する。層を分離し、水層をジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出する。有機抽出液を合わせ、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１００ｍＬ）、２Ｎ塩酸水溶液（２×１００ｍＬ）、およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄する。蒸発乾固して淡褐色の固体を得て、６０℃のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３００ｍＬ）に溶解させる。この熱溶液を濾過し、濾液を蒸発させ、褐色の固体（５．３ｇ、８１％、ＬＣＭＳによる純度８２％）を得て、これをさらなる精製無しで使用する。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 393.8/395.8 [M+H].

調製法１４の別法
スキーム３、ステップＥ：ＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｍ（登録商標）（１．２１ｋｇ、４．７３ｍｏｌ）を、−１４℃の無水ジクロロメタン（５Ｌ）中の１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−イル］エタノン（５６５ｇ、１．５１ｍｏｌ）の撹拌溶液に少量ずつ加える。混合物を１０分間撹拌し、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（５５０ｇ、３．３４ｍｏｌ）を２０分間かけて滴加する。反応混合物を−１０℃でおよそ１０時間撹拌した後、周囲温度に温め、一晩撹拌する。内部温度を１０℃に維持しながら、５０％水酸化ナトリウム水溶液（７５０ｍＬ）をゆっくりと加え、その後、水（１．５Ｌ）および炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１Ｌ）を加え、３０分間撹拌する。層を分離し、水層をジクロロメタン（１Ｌ）で抽出する。有機抽出液を合わせ、ブライン（３Ｌ）、２Ｎ塩酸水溶液（５Ｌ）、およびブライン（３Ｌ）で洗浄する。蒸発させて残渣を得て、イソ−ヘキサン中５０〜１００％ジクロロメタン、次いでジクロロメタン中１０％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を白色の粉末として得る（４６７ｇ、７３％、ＬＣＭＳによる純度９４％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 393.8/395.8 [M+H].

調製法１５
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−フロ［３，４−ｃ］イソキサゾール

スキーム３、ステップＦ：３７ｗｔ％塩酸水溶液（１．３Ｌ、１６ｍｏｌ）を、１０Ｌジャケット付き反応器内の１，４−ジオキサン（５Ｌ）中の１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−１−イル］エタノン（５７０ｇ、１．４５ｍｏｌ）の溶液に加え、１００℃でおよそ３時間、またはＬＣＭＳが完全な反応を示すまで、撹拌する。反応混合物を１０℃に冷却し、水（１Ｌ）で希釈し、内部温度を２０℃に維持しながら、５０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液（８００ｍＬ）および水（１Ｌ）の混合物をゆっくりと加える。酢酸エチル（２．５Ｌ）を加え、激しく撹拌し、その後、層を分離し、有機相をブライン（２Ｌ）、さらにブライン（１Ｌ）、および水（１Ｌ）で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固して、残渣を得る。シクロヘキサン（２．５Ｌ）を加え、蒸発乾固した後、これを繰り返して、表題化合物を褐色の油として得る（５２７ｇ、８９％、ＬＣＭＳによる純度８６％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 351.8/353.8 [M+H].

調製法１６
［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール

スキーム３、ステップＧ：亜鉛粉末（６．０ｇ、９２ｍｍｏｌ）を、周囲温度の酢酸（１００ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−フロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（５．０６ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、一晩撹拌する。混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）および水（３００ｍＬ）で希釈し、炭酸ナトリウム（９７ｇ、９１５ｍｍｏｌ）を加えながら激しく撹拌する。層を分離し、有機層をブライン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。イソヘキサン中０％〜１００％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物を蝋様の固体として得る（４．６７ｇ、８９％、ＬＣＭＳによる純度９０％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 354.0/356.0 [M+H].

調製法１６の別法
スキーム３、ステップＧ：亜鉛粉末（２００ｇ、３．０６ｍｏｌ）を、２０℃の酢酸（２Ｌ）および水（２Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−フロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（３０４ｇ、純度７５％、６４７ｍｍｏｌ）の溶液に少しずつ加え、その後４０℃に温め、一晩撹拌する。混合物を水（２Ｌ）で希釈し、炭酸ナトリウム（４ｋｇ、４３．４ｍｏｌ）を加えながら激しく撹拌した後、さらなる炭酸ナトリウムでｐＨ８〜９に調整する。酢酸エチル（５Ｌ）および水（２．５Ｌ）を加え、３０分間撹拌し、珪藻土に通して濾過し、アセトニトリル／水（２：１）で洗浄する。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×２．５Ｌ）で抽出し、合わせた有機抽出液をブライン（２×２．５Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。ＳＦＣ、カラム：ＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤ−Ｈ（５）、５０×２５０ｍｍ；溶出：１２％エタノール（ＣＯ_２中０．２％ジエチルメチルアミン；流速：ＵＶ２２０ｎｍで３４０ｇ／分によって残渣を精製して、表題化合物を白色固体として得る（１９７．７ｇ、８４％）。[α]_D ²⁰ = -6.93 ° (C=0.678、クロロホルム).ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 354.0/356.0 [M+H].

調製法１７
［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール

スキーム１、ステップＦ：（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（３１．３０ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）を酢酸（１８６ｍＬ）に加えて、懸濁液を得る。亜鉛（２５．６ｇ、３９１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１８時間激しく撹拌する。混合物をトルエンで希釈し、珪藻土に通して濾過する。濾液を減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルで可溶化し、ブライン、および飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄する。相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（３１．３５ｇ、９９％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 562/564 [M+H].

調製法１８
Ｎ−［［（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］カルバモチオイル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＧ：［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール（３１．３５ｇ、５５．７３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５５７ｍＬ）中に溶解させ、５℃に冷却する。イソチオシアン酸ベンゾイル（９．７４ｍＬ、７２．４５ｍｍｏｌ）を加える。添加が完了した後、反応混合物を室温に温め、２時間撹拌する。飽和炭酸水素ナトリウムに注ぎ、相を分離し、ジクロロメタンで水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（４２．９５ｇ、１０６％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 747/749 [M+Na].

調製法１９
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム３、ステップＨ：イソチオシアン酸ベンゾイル（１．８０ｍＬ、１３．３ｍｍｏｌ，）を、周囲温度のジクロロメタン（２０ｍＬ）中の［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール（４．６７ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、反応が完了したことをＬＣＭＳが示すまで１時間かけて加える。反応混合物を真空下で蒸発させて残渣を得る。シクロヘキサン（５０ｍＬ）を加え、６０℃に温め、沈殿物が完全に溶解するまでメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加える（１００ｍＬ）。この熱溶液を濾過し、室温に冷却し、白色の沈殿物が形成するまで減圧下でゆっくりと蒸発させる。溶媒を減圧除去し、残渣を無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（２．４ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加え、溶液を−２５℃に冷却する。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２．２ｍＬ１３ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴加し、１時間かけて０℃に温める。反応混合物を水（２５ｍＬ）、２Ｎ塩酸水溶液（２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２５ｍＬ）、および水（２５ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮乾固する。ジクロロメタン中５％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物を淡黄色の気泡として得る（５．０ｇ、７６％、ＬＣＭＳによる純度９０％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 499.0/501.0 [M+H].

調製法１９の別法
スキーム３、ステップＨ：イソチオシアン酸ベンゾイル（９８ｍＬ、７２４．９ｍｍｏｌ，）を、３０℃のジクロロメタン（１．２Ｌ）中の［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール（１９７．６ｇ、５４６．７ｍｍｏｌ）の溶液に１時間かけて加える。ＣＤＩ（１０１ｇ、６１０．４ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で３時間撹拌する。ＣＤＩをさらに添加して、チオ尿素中間体の消費を確実にしてもよい。４２時間かけて９０℃に加熱し、溶液を周囲温度に冷却する。反応混合物を酢酸エチル（２Ｌ）で希釈し、２Ｎ塩酸水溶液（２Ｌ）を加え、撹拌し、ブライン（１Ｌ）を加え、層を分離する。有機層を２Ｎ塩酸水溶液（０．５Ｌ）、ブライン（２×１Ｌ）および炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１Ｌ）で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣を得る。イソ−ヘキサン中０〜１００％酢酸エチルで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物を淡黄色の固体として得る（２３４ｇ、８３％）。ES/MS: m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 499.0/501.0 [M+H].

調製法２０
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（トリチルオキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＨ：Ｎ−［［（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］カルバモチオイル］ベンズアミド（４２．９５ｇ、５９．１８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５９１ｍＬ）に溶解させ、−２０℃に冷却する。ピリジン（１２．０ｍＬ、１４８．０ｍｍｏｌ）、次いでトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１０．９７ｍＬ、６５．１０ｍｍｏｌ）を加える。−２０℃以下の温度を維持しながら添加をモニターする。反応混合物を−２０℃で３０分間撹拌する。反応混合物を室温に温める。飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、ジクロロメタンで水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（４５．２４ｇ、１０８％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 707/709 [M+H].

調製法２１
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（ヒドロキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＩ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（トリチルオキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（４５．２４、６３．９３ｍｍｏｌ）をギ酸（１６０ｍＬ）に溶解させ、周囲温度で１時間撹拌する。水（２９ｍＬ）を５分間かけて加える。５０分間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して残渣を得る。残渣をメタノール（６３９ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（２６．７ｍＬ、１９１．８ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で一晩撹拌する。ブラインに注ぎ、相を分離し、クロロホルムで水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。アセトン：ヘキサン（２５〜３８％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（１６．０４ｇ、５４％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 465/467 [M+H].

調製法２２
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボン酸

スキーム１、ステップＪ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（ヒドロキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１６．０４ｇ、３４．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１７２ｍＬ）に加える。２−ヨードキシ安息香酸（３５．５６ｇ、１２０．７０ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で３時間撹拌する。反応混合物をクロロホルム（３００ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム（４００ｍＬ）に注ぐ。有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。残渣を酢酸エチル（４００ｍＬ）に溶解させ、飽和塩化アンモニウム（２×２５０ｍＬ）で洗浄する。有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。残渣をジクロロメタン：メタノール混合物に溶解させ、固体が沈殿するまでジエチルエーテルを加える。固体を濾取し、減圧下で乾燥させて、表題化合物（５．７８ｇ、３５％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 479/481 [M+H].

調製法２３
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボキサミド

スキーム１、ステップＫ：（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボン酸（５．７８ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０１ｍＬ）およびＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．７６ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）に溶解させる。トリエチルアミン（５．２９ｍＬ、３６．２ｍｍｏｌ）、次いでＨＡＴＵ（７．０２ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で３日間撹拌する。飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ジクロロメタン（０〜５０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（４．１５ｇ、６６％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 522/524 [M+H].

調製法２４
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−５−アセチル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＬ：ＴＨＦ（５７．８ｍＬ）中の（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボキサミド（１．５１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液に、臭化メチルマグネシウム（ジエチルエーテル中３．０ｍｏｌ／Ｌ、４．８ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）を滴加する。反応物を−７８℃で５分間撹拌し、周囲温度に徐々に温める。３０分間撹拌する。反応をメタノール（４ｍＬ）でクエンチし、飽和塩化アンモニウムで希釈し、酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ヘキサン（０〜１００％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（１．２８ｇ、９３％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 477/479 [M+Na].

調製法２４ｂ
Ｎ−［（５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−プロパノイル−４ａ，５，７，７Ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＬ：（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボキサミド（３．００ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１１５ｍＬ）に窒素下で加え、−７８℃に冷却する。−７８℃に温度を維持しながら、ＴＨＦ（２８．７ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）中のエチルマグネシウムブロミド（１．０ｍｏｌ／Ｌ）の溶液を反応物に滴加しする。１時間後、メタノール（１０ｍＬ）を一度に加え、その後塩化アンモニウム飽和溶液に注ぐ。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、残渣を得る。ヘキサン／酢酸エチル（１００〜４０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（２．８４４ｇ、５．７８８ｍｍｏｌ、１００％）を得る。ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 491/493/513/515 (M+H/Na).

調製法２４ｃ
Ｎ−［（５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（シクロプロピルカルボニル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＬ：ＴＨＦ（５１．２ｍＬ）中の（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボキサミド（１．５１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液に、シクロプロピルマグネシウムブロミド（２−メチルテトラヒドロフラン中１．０ｍｏｌ／Ｌ、１４ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ）を滴加する。反応物を−７８℃で５分間撹拌し、周囲温度に徐々に温める。３０分間撹拌する。反応をメタノール（４ｍＬ）でクエンチし、飽和塩化アンモニウムで希釈し、酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ヘキサン（０〜１００％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（１．２９９ｇ、８９％）を得る。ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 503/505 [M+H].

調製法２５
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＭ：ジクロロメタン（３４ｍＬ）、Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（１．５２ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）、および三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（０．８９ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）を混合する。周囲温度で２時間撹拌する。Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−５−アセチル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．８２１ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いでトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１．１３ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で１８時間撹拌する。飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。ジクロロメタン：ヘキサン（８０〜１００％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（０．５５２ｇ、６４％）を得る。ES/MS m/e (⁷⁹Br/⁸¹Br) 499/501 [M+H].

調製法２５ｂ
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロプロピル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＭ：Ｎ−［（５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−プロパノイル−４ａ，５，７，７Ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．４８６ｇ、０．９８９ｍｍｏｌ）を、−７８℃の窒素下、ジクロロメタン（１９．８ｍＬ）に加え、その後、Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（１．７５ｇ、１．７５ｍＬ、３．９６ｍｍｏｌ）を加える。−７８℃で３０分間撹拌した後、一晩かけて室温に温める。反応物を炭酸水素ナトリウム飽和溶液に注ぎ、ジクロロメタンで抽出する。疎水性のフリットを用いて有機層を分離し、真空中で濃縮して残渣を得る。ヘキサン／酢酸エチル（１００〜５０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、不純物を含有する未精製の表題化合物（０．２３０ｇ、０．４４８ｍｍｏｌ、４５％）を得て、これをさらなる精製無しで使用する。ES/MS m/z 513/515 (M+H).

調製法２５ｃ
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＭ：Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（１．９ｍＬ、６．６８ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２４ｍＬ）中のＮ−［（５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（シクロプロピルカルボニル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．８１２ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）の周囲溶液（ambient solution）に加える。周囲温度で１８時間撹拌する。飽和炭酸水素ナトリウムに注ぎ、酢酸エチル（３×）で水相を抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ヘキサン（５〜１００％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（４１ｍｇ、５％）を得る。ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 525/527 [M+H].

調製法２６
Ｎ−［（５Ｓ，７ａＳ）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−７ａ−｛２−フルオロ−５−［（トリフルオロアセチル）アミノ］フェニル｝−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム４、ステップＡ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２３４ｇ、４５４．６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２Ｌ）に溶解させ、４Åモレキュラーシーブ（３７ｇ）、２，２，２−トリフルオロアセトアミド（９１ｇ、７８０．９ｍｍｏｌ）、微粉砕した炭酸カリウム（１１４ｇ、８２４．９ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（１１７ｇ、７８０．６ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（１７．５ｇ、９１．９ｍｍｏｌ）およびラセミトランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（２０ｇ、１４０．６ｍｍｏｌ）を窒素流下で加える。容器を３回の真空／窒素交換でパージし、１８時間かけて１２３℃に加熱する。周囲温度に冷却し、溶液を珪藻土に通して濾過し、酢酸エチルで洗浄する。塩化アンモニウム飽和溶液（２Ｌ）を加え、４５分間激しく撹拌する。層を分離し、有機層を塩化アンモニウム飽和水溶液（３×１Ｌ）、ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、残渣を得る。イソ−ヘキサン中０〜１００％酢酸エチルで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物を淡黄色の固体として得る（２９７．９ｇ、９５％、純度８１％）。ES/MS: m/z 532.0 [M+H].

調製法２７
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＮ：エタノール（３０ｍｌ）中でＮ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．３７２ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）および（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（０．０３７ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を混合する。アジ化ナトリウム（０．１９４ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）、次いでＬ−アスコルビン酸ナトリウム（０．６６Ｍ溶液、０．５０ｍｌ、０．３３ｍｍｏｌ）を加える。フラスコの上部を窒素でパージし、硫酸銅（０．３３Ｍ溶液、０．６８ｍｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を８０℃に加熱し、５時間撹拌する。反応物を冷却し、冷水を加える。混合物を酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。エタノール（５０ｍｌ）およびＴＨＦ（１０ｍｌ）中で、残渣をパラジウム（炭素に対し１０質量％、０．３５ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）と混合する。混合物を窒素でパージし、水素でパージする。５０ｐｓｉの水素下、周囲温度で１時間撹拌する。触媒を濾去し、酢酸エチルで洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ジクロロメタン（０〜２０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（０．２１８４ｇ、６７％）を得る。ES/MS m/z 436 (M+H).

調製法２７の別法
スキーム４、ステップＢ：
メタノール中７Ｎアンモニア（６００ｍＬ、４．２ｍｏｌ）を、室温のメタノール（２００ｍＬ）中のＮ−［（５Ｓ，７ａＳ）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−７ａ−｛２−フルオロ−５−［（トリフルオロアセチル）アミノ］フェニル｝−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２５０ｇ、純度８０％、３７６．３ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に加え、周囲温度で１８時間撹拌する。蒸発乾固して、表題化合物を褐色のゴム質（１９０ｇ、３７５．２ｍｍｏｌ、純度８６％）を得る。ES/MS: m/z 436.0 [M+H].

調製法２７ｂ
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロプロピル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

スキーム１、ステップＮ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロプロピル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．５６７ｇ、１．１０４ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（４．８０２ｍＬ）およびエタノール（１１．０４ｍＬ）を混合し、アジ化ナトリウム（０．２１５４ｇ、３．３１３ｍｍｏｌ）、トランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミン（０．０４７６０ｇ、０．０５２８ｍＬ、０．３３１３ｍｍｏｌ）、０．６６ＭのＬ−アスコルビン酸ナトリウム（０．７４ｇ、０．７４ｍＬ、０．４８５９ｍｍｏｌ）および水（０．１６９９ｍＬ）を加える。最後に、０．３３Ｍの硫酸銅（０．７４ｇ、０．７４ｍＬ、０．２４３０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃に加熱する。９０℃で一晩撹拌する。０．３３Ｍの硫酸銅（０．７４ｇ、０．７４ｍＬ、０．２４３０ｍｍｏｌ）、０．６６ＭのＬ−アスコルビン酸ナトリウム（０．７４ｇ、０．７４ｍＬ、０．４８５９ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（０．２１５４ｇ、３．３１３ｍｍｏｌ）およびトランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミン（０．０４７６０ｇ、０．０５２８ｍＬ、０．３３１３ｍｍｏｌ）をさらに加える。反応物を１００℃で１時間加熱した後、室温に冷却する。反応物をブラインに注ぎ、生成物をクロロホルムで抽出する。混合物を珪藻土に通して濾過し、有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。この物質を、リンドラー触媒（０．１１３ｇ、０．０５３３ｍｍｏｌ）中のパラジウム（５質量％）を含むパールフラスコ（Parr flask）に移し、窒素下でメタノール（５５．２２ｍＬ）を加える。３時間激しく振盪しながら２７６ｋＰａ水素圧下で水素付加する。リンドラー触媒（０．１１３ｇ、０．０５３３ｍｍｏｌ）中のパラジウム（５質量％）をさらに加え、３４５ｋＰａ水素圧下でさらに４時間水素付加する。反応物を珪藻土に通して濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を真空中で濃縮した後、メタノール（５５．２２ｍＬ）、次いで水酸化リチウム水和物（０．４６３４ｇ、０．１８２ｍＬ、１１．０４ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を３時間かけて７０℃に加熱し、その後室温に冷却する。反応物をブラインに注ぎ、クロロホルムで抽出する。有機層をメタノールで希釈し、ＳＣＸ−２カートリッジに注ぐ。カートリッジを１カラム体積のメタノールで洗い流し、廃棄する。次に、ＳＣＸ−２カートリッジを１カラム体積の７Ｍメタノール性アンモニアで洗い流し、真空中で濃縮して、表題化合物（０．２９０ｇ、０．８４０ｍｍｏｌ、７６％）を得る。ES/MS m/z 346 (M+H).

調製法２７ｃ
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

スキーム１、ステップＮ：エタノール（３ｍｌ）中で、Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（３１ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）および（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（０．００４９ｍＬ、０．０３０ｍｍｏｌ）を混合する。アジ化ナトリウム（３１ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、次いでＬ−アスコルビン酸ナトリウム（０．６６Ｍ溶液、０．０８９ｍｌ、０．０５９ｍｍｏｌ）を加える。フラスコの上部を窒素でパージし、硫酸銅（０．３３Ｍ溶液、０．１８ｍｌ、０．０５９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を８０℃に加熱し、３時間撹拌する。反応物を冷却し、冷水を加える。混合物を酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。エタノール（２０ｍｌ）およびＴＨＦ（５ｍｌ）中で、残渣をパラジウム（炭素に対し１０質量％、３０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）と混合する。混合物を窒素でパージし、水素でパージする。４０ｐｓｉの水素下、周囲温度で４時間撹拌する。触媒を濾去し、酢酸エチルで洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ヘキサン（０〜１００％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（２１ｍｇ、７７％）を得る。ES/MS m/z 462 (M+H).

調製法２８
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

スキーム４、ステップＢ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２１６．４ｇ、純度８８％、４３５．９ｍｍｏｌ）をピリジン（４００ｍＬ）、エタノール（１００ｍＬ）およびＴＨＦ（３００ｍＬ）に溶解させる。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１９０ｇ、２２７５．０ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で１８時間撹拌する。２−メチルテトラヒドロフラン（１Ｌ）で希釈し、水（２×３００ｍＬ）で洗浄する。有機層を単離し、３５％水酸化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）を水層に加える。２−メチルテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）で抽出した後、塩化ナトリウムで飽和させ、２−メチルテトラヒドロフラン（２×３００ｍＬ）で抽出する。有機抽出液を合わせ、ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、蒸発させて残渣を得る。メタノール（２００ｍＬ）に溶解させ、メタノール中７Ｎアンモニア（１００ｍＬ、７００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌する。トリフルオロアセタミド（trifluoracetamide）不純物が残っている場合はさらなるアンモニアを加えてもよい。溶媒を減圧除去し、残渣を２Ｎ塩酸水溶液（１．５Ｌ）に溶解させる。ジクロロメタン（６×５００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、約１Ｌの総体積まで溶媒を減圧除去する。２Ｎ塩酸水溶液（３００ｍＬ）で洗浄し、全ての水性洗液を合わせる。２−メチルテトラヒドロフラン（１Ｌ）を加え、ガス発生が観察されなくなるまで、炭酸水素ナトリウムでｐＨを塩基性に調整しながら、激しく撹拌する。層を分離し、水層を２−メチルテトラヒドロフラン（２×５００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、褐色の固体を得る。ＴＨＦ中０〜１００％ジクロロメタンで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製する。酢酸エチル／ヘプタンによる画分を含有する生成物を蒸発させて、表題化合物をベージュ色の細粉として得る（１０６ｇ、７０％、純度９５％）。ES/MS: m/z 332.0 [M+H], [α]_D ²⁰= +42.11 ° (C= 0.532、クロロホルム).

調製法２９
５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）中のメチル５−クロロピラジン−２−カルボキシレート（１２４ｇ、７１８．５５ｍｍｏｌ）、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（１９８．５ｇ、２８７４．２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２９７．９２ｇ、２１５５．６ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で１５時間撹拌する。周囲温度に冷却し、水（２Ｌ）に注ぐ。濃塩酸水溶液（約５００ｍＬ）を用いて溶液のｐＨを２〜３に調整し、３０分間撹拌する。得られた固体を濾取し、水で洗浄する。水（５００ｍＬ）およびエタノール（５００ｍＬ）を加え、４時間かけて５０〜６０℃に加熱し、周囲温度に冷却する。固体を濾取し、４０℃の真空下で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得る。ES/MS: m/z 190.0 (M-H).

調製法３０
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド

スキーム３、ステップＡ：Ｎ−［（４ａｓ，５ｓ，７ａｓ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．１３９ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（０．０８５２ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（０．０５７５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍｌ）：ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中で混合する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、次いでＥＤＣＩ（０．０７９ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を一度に加える。反応混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。溶液を酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、相を分離する。酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ジクロロメタン（０〜３０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（０．１１４０ｇ、５９％）を得る。ES/MS m/z 609 (M+H).

調製法３０ａ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド

スキーム３、ステップＡ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２１ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（１０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢＴ（１０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２．５ｍｌ）：ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で混合する。この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１６ｍＬ、０．０９１ｍｍｏｌ）を加え、次いでＥＤＣＩ（１１ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を一度に加える。反応混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。溶液を酢酸エチル、水、および１ＮＮａＯＨ（０．５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出する。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。酢酸エチル：ジクロロメタン（０〜１００％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（２０ｍｇ、６９％）を得る。ES/MS m/z 635 (M+H).

実施例１
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド

スキーム３、ステップＢ：ＴＨＦ（２ｍＬ）およびエタノール（２ｍＬ）中のＮ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（０．１１４８ｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．１５７５ｇ、１．８８６ｍｍｏｌ）、およびピリジン（０．１５ｍｌ、１．８８６ｍｍｏｌ）の混合物を４５℃で５時間加熱する。反応混合物を周囲温度に冷却し、２日間撹拌する。溶液を減圧下で濃縮して残渣を得る。メタノール中７ＮＮＨ_３：ジクロロメタン（０〜３％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（０．０８６ｇ、９０％）を得る。ES/MS m/z 505 (M+H).

実施例１の別の調製法
スキーム４、ステップＤ：酢酸エチル（１Ｌ）中の（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（９６．５ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、５０℃で撹拌し、この温溶液に５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（８４ｇ、４３９．４５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加える。１０分間撹拌し、Ｔ３Ｐ（登録商標）（酢酸エチル中１．６７Ｍ、３５０ｍＬ、５８５ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１７時間撹拌する。周囲温度に冷却し、ジクロロメタン（１Ｌ）で希釈し、水中の炭酸ナトリウムの溶液（１Ｌ中１２８ｇ、１．２１ｍｏｌ）でクエンチしながら撹拌する。ジクロロメタン（１Ｌ）および水（２Ｌ）で希釈し、１時間激しく撹拌する。珪藻土に通して濾過し、ジクロロメタン（３×５００ｍＬ）、メタノール（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５００ｍＬ）、およびメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６×５００ｍＬ）で洗浄する。層を分離し、水層をジクロロメタン（３×１Ｌ）で抽出する。全ての有機相を合わせ、蒸発させて、残渣を得る。残渣をジクロロメタン（１Ｌ）中で１５分間超音波処理し、固体を濾取し、ジクロロメタン（５×２００ｍＬ）で洗浄する。ｐＨ８が得られるまで炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を加え、ジクロロメタン（１Ｌ）およびメタノール（５００ｍＬ）と共に激しく撹拌する。固体を濾去し、濾液をジクロロメタン（２×５００ｍＬ）で抽出する。固体をジクロロメタン：メタノール（１：１、５００ｍＬ）で溶解させ、この溶液を他の有機相と併せる。ジクロロメタンを加えることで溶液を維持しながら溶媒を減圧除去し、次に、約３００ｍＬの最終体積が得られた後、溶液を５％の０．３Ｍアンモニア／ジクロロメタン中メタノールで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、淡褐色の固体を得る。固体を熱エタノール（２．５Ｌ）に溶解させ、熱い間に濾過し、１時間かけて周囲温度に冷却する。固体を濾取し、エタノール（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させる。濾液を蒸発乾固し、５０：１のイソ−ヘキサン／メタノール中７Ｎアンモニア中の６５％酢酸エチルで最初に溶出し、次に５０：１の酢酸エチル／メタノール中７Ｎアンモニアで溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製する。必要であれば、ＳＦＣ、カラム：ＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤ−Ｈ（５μ）、５０×２５０ｍｍ；溶出：ＣＯ_２中の３５％イソプロパノール（０．２％ジエチルメチルアミン）；流速：ＵＶ２２０ｎｍで３００ｇ／分によってさらなる精製を完了させてもよい。蒸発および真空乾燥の後、エタノール（１．５Ｌ）中の前記物質をスラリー化し、（３６〜４５℃で）２０分間穏やかに温めながら撹拌する。固体を濾取し、エタノール（１００ｍＬ）で洗浄する。さらなる物質を濾液から回収することができる；蒸発乾固し、エタノール中で還流し、熱濾過によって固体を除去し、次に濾液を周囲温度に冷却する。固体を濾取し、エタノールで洗浄し、上記濾過から得られた物質を合わせる。合わせた固体を４０℃の真空下で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得る（１０３．３ｇ、６８％、２．５ｗｔ％エタノール含有）。ES/MS m/z 505.0 (M+H), [α]_D ²⁰ = +149.4 ° (C= 1、クロロホルム).

実施例１Ａ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホネート

Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（６００ｍｇ、１．１８９ｍｍｏｌ）をアセトン（９ｍＬ）および水（１ｍＬ）に溶解させる。得られた懸濁液を６０℃に加熱する。アセトン（１ｍＬ）に溶解させたｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４２０ｍｇ、２．２０８ｍｍｏｌ）を加える。混合物を６０℃で一晩撹拌する。混合物を室温に冷却し、固体を真空で濾過し、アセトン（１ｍＬ）で洗浄し、一晩風乾して、表題化合物（７４３ｍｇ、７３％）を得る。

粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）
ＣｕＫａ供給源λ＝１．５４０６０Å、並びに３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動するＶａｎｔｅｃ検出器を備えた、ブルカー社製Ｄ４Ｅｎｄｅａｖｏｒ粉末Ｘ線回折計で、結晶性固体のＸＲＤパターンが得られる。この試料を、４〜４０°（２θ）で、０．００９°（２θ）の段階幅、０．５秒／段階の走査速度で、０．６ｍｍの発散スリット、５．２８の固定散乱防止スリット、および９．５ｍｍの検出器スリットで、走査する。乾燥粉末を石英製試料保持器に充填し、スライドガラスを用いて滑面を得る。結晶形の回折図形を周囲温度、相対湿度で収集する。結晶学分野では、あらゆる所与の結晶形において、結晶形態および晶癖等の要因から生じる定向配列のために、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知である。定向配列の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形の特有のピーク位置は変化しない。例えば、米国薬局方＃２３、国民医薬品集＃１８、１８４３〜１８４４頁、１９９５を参照されたい。さらに、あらゆる所与の結晶形において、角度のピーク位置が僅かに変化し得ることも、結晶学分野において周知である。例えばピーク位置は、試料が解析される温度もしくは湿度における変動、試料の変位、または内部標準の有無によって変化する可能性がある。本発明の場合、±０．２（２θ）のピーク位置の変動性によって、指示結晶形の明解な確認を邪魔することなく、これらの潜在的な変動が考慮に入れられる。結晶形の確認は、特色のあるピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの、あらゆる固有な組合せに基づいて、なされ得る。周囲温度および相対湿度で収集した結晶形の回折図形は、８．８５３°２θおよび２６．７７４°２θのＮＩＳＴ６７５基準ピークに基づいて、調整された。

結晶性Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホネートの好ましい試料は、ＣｕＫａ照射を用いたＸＲＤパターンによって、下記の表に記載されるような回折ピーク（２θ値）を有すると特徴付けられる。具体的には、前記パターンは、１４．８、１２．７、および４．９からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と併せて、１７．３°にピークを含有し；回折角の許容誤差は０．２°である。

実施例１Ｂ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネート

９５％エタノール−水（１５ｍＬ）中でＮ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（２０１ｍｇ、０．３９８ｍｍｏｌ）およびマロン酸（１０４ｍｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）を混合する。澄明な溶液が得られるまで、前記混合物を６５℃で撹拌する。濃白色の固体が数分後に沈殿する。懸濁液を５５℃で１時間撹拌した後、撹拌しながら室温に冷却する。真空下で固体を濾過し、２日間風乾して、表題化合物（４７７ｍｇ、８０％）を得る。

結晶性Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネートの好ましい試料は、ＣｕＫａ照射を用いたＸＲＤパターンによって、下記の表２に記載されるような回折ピーク（２θ値）を有すると特徴付けられる。具体的には、前記パターンは、１６．８、１７．２、および２４．０からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と併せて、２２．７にピークを含有し；回折角の許容誤差は０．２°である。

実施例１Ｃ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物

Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（１１６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、７０℃のＴＨＦ：水（１：１）（２ｍＬ）に懸濁する。この溶液を少なくとも２日間撹拌し、固体を濾過し、窒素流下で乾燥させて、表題化合物を得る。

Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物の好ましい試料は、ＣｕＫａ照射を用いたＸＲＤパターンによって、下記の表３に記載されるような回折ピーク（２θ値）を有すると特徴付けられる。具体的には、前記パターンは、７．８、１０．５、１１．０、１４．９、１９．７、２１．３、および２６．９からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と併せて、１３．０にピークを含有し；回折角の許容誤差は０．２°である。

実施例２
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロプロピル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド

スキーム３、ステップＡおよびＢ：５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（０．１１６ｇ、０．６０８ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（４．０５ｍＬ）、ジメチルホルムアミド（０．００３１４ｍＬ）、および、次いで塩化オキサリル（０．１５４ｇ、０．１０５ｍＬ、１．２２ｍｍｏｌ）を窒素下で液滴により混合する。反応物を３０分間撹拌した後、真空中で濃縮する。残渣をアセトニトリル（４．０５ｍＬ）に溶解させ、エタノール（４．０５ｍＬ）および水（１．３５ｍＬ）中の（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロプロピル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（０．１４０ｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）の混合物に撹拌しながら滴加する。添加が完了した後、反応物をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和溶液で洗浄する。有機層をメタノールで希釈し、ＳＣＸ−２カートリッジに添加する。ＳＣＸ−２カートリッジを１カラム体積のメタノールで洗い流し、廃棄し、次に、ＳＣＸ−２カートリッジに１カラム体積の７Ｍメタノール性アンモニアを流す。メタノール性アンモニアの洗液（flush）を真空中で濃縮し、ジクロロメタン／メタノール（１００〜８５％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、残渣を得る。アキラルＳＦＣ（超臨界流体クロマトグラフィー）（カラム：ベンゼンスルホンアミド（ＢｚＳ）（５μ）、プリンストンクロマトグラフィー社（Princeton Chromatography）、２１．２×２５０ｍｍ；溶出：ＣＯ_２中で２２％メタノール（１％のメタノール中２Ｍアンモニア）；流速：ＵＶ２５０ｎｍで７０ｍＬ／分；背圧：１００ｂａｒ；温度：４０℃）でさらに精製する。残渣をクロロホルム中に可溶化し、ブラインで洗浄する。有機層を疎水性のフリットに通し、真空中で濃縮して、表題化合物（０．０６５８ｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、３１％）を得る。ES/MS m/z 519 (M+H).

実施例３
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド

スキーム３、ステップＢ：エタノール（３ｍＬ）中のＮ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−５−［シクロプロピル（ジフルオロ）メチル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３１５ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２６ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）、およびピリジン（０．０２６ｍｌ、０．３１５ｍｍｏｌ）の混合物を５５℃で１８時間加熱する。反応混合物を周囲温度に冷却し、溶液を減圧下で濃縮して残渣を得る。メタノール中７ＮＮＨ_３：ジクロロメタン（０．５〜１０％勾配）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物（１５ｍｇ、９０％）を得る。ES/MS m/z 531 (M+H).

インビトロアッセイの手順：
ＢＡＣＥ２を超えるＢＡＣＥ１の選択性を評価するために、試験化合物を、下記のような、ＢＡＣＥ１およびＢＡＣＥ２に対する特異的基質を用いるＦＲＥＴに基づく酵素試験で評価する。インビトロでの酵素アッセイおよび細胞アッセイについて、試験化合物をＤＭＳＯ中で調製して１０ｍＭ原液を作製する。この原液をＤＭＳＯ中で連続希釈して、９６ウェル丸底プレート中で１０μＭ〜０．０５ｎＭの範囲の最終化合物濃度を有する１０点希釈曲線を得た後、インビトロにおける酵素アッセイおよびホールセルアッセイ（whole cell assay）を行う。

インビトロにおけるプロテアーゼ阻害アッセイ：
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの発現
ヒトＢＡＣＥ１（受入番号：ＡＦ１９０７２５）およびヒトＢＡＣＥ２（受入番号：ＡＦ２０４９４４）を、ＲＴ−ＰＣＲによって全脳ｃＤＮＡからクローニングする。アミノ酸配列番号１〜４６０に対応するヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ_１（Ｆｃ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに挿入する（Vassar et al., Science, 286, 735-742 (1999)）。ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃとそれぞれ称される、この、ＢＡＣＥ１（１〜４６０）またはＢＡＣＥ２（１〜４６０）とヒトＦｃとの融合タンパク質を、ｐＪＢ０２ベクター中に構築する。ヒトＢＡＣＥ１（１〜４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ）およびヒトＢＡＣＥ２（１〜４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃ）は、ＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現される。２５０μｇの各コンストラクトのｃＤＮＡをＦｕｇｅｎｅ６と混合し、１リットルのＨＥＫ２９３細胞に添加する。トランスフェクションの４日後、精製のために培地上清を回収する。ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃを、下記のようなプロテインＡクロマトグラフィーによって精製する。酵素は−８０℃で小分けして保存する。(Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)を参照)。

ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの精製
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：ＦｃのｃＤＮＡを一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培地上清を回収する。培地上清を０．２２μｍ無菌フィルターに通して濾過することで、細胞片を除去する。５ｍｌのプロテインＡ−アガロース（総容積）を４リットルの培地上清に添加する。この混合物を４℃で一晩穏やかに撹拌する。プロテインＡ−アガロース樹脂を回収し、低圧クロマトグラフィーカラムに充填する。このカラムを２０×総容積のＰＢＳで、流速２０ｍｌ／時で洗浄する。結合したｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃタンパク質は、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．６）で、流速２０ｍｌ／時で溶出させる。１ｍｌの溶出画分を、０．５ｍｌの２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）で即座に中和する。最終産物の純度を、４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動によって評価する。酵素は−８０℃で小分けして保存する。

ＢＡＣＥ１ＦＲＥＴアッセイ
試験化合物の連続希釈物を上記のように調製する。この化合物をＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液で２０倍にさらに希釈する。１０μＬの各希釈物を、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ４．６）、１ｍＭＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、およびＡＰＰの配列に基づく１５μＭのＦＲＥＴ基質）を含有する、対応する低タンパク質結合黒色プレートのＡ列〜Ｈ列の各ウェルに添加する（Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)を参照）。内容物をプレート振盪機上で１０分間充分に混合する。１５μＬのＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中２００ｐＭのヒトＢＡＣＥ１（１〜４６０）：Ｆｃ（Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)を参照）を、基質および試験化合物を含有するプレートに添加して、反応を開始させる。プレート振盪機上で短時間混合した後、励起波長３５５ｎｍおよび蛍光波長４６０ｎｍでの時点０の混合物のＲＦＵを記録する。反応プレートをアルミ箔で覆い、室温の暗い加湿乾燥器内で１６〜２４時間保持する。インキュベーション終了後のＲＦＵを、時点０で使用された同じ励起および蛍光の設定で記録する。時点０のＲＦＵとインキュベーション終了後のＲＦＵの差異が、化合物処理下でのＢＡＣＥ１の活性を表す。ＲＦＵの差異を阻害剤濃度に対してプロットし、曲線を４パラメータ・ロジスティック方程式に当てはめ、ＩＣ_５０値を得る。（May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)）。

本明細書の実施例１の化合物を、基本的には上記と同様に試験すると、１．１９ｎＭ＋０．４８（ｎ＝４）（平均値±ＳＥＭ；ＳＥＭ＝平均値の標準誤差）のＢＡＣＥ１に対するＩＣ_５０が示される。このデータは、実施例１の化合物が、精製された組換えＢＡＣＥ１の酵素活性をインビトロで阻害することを示している。

ＢＡＣＥ２ＴＭＥＭ２７ＦＲＥＴアッセイ
コレクトリン（Collectrin）としても知られている膜貫通型タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）（受入番号ＮＭ＿０２０６６５）は、最近報告されたＢＡＣＥ２の基質であり、ＢＡＣＥ１の基質ではない（Esterhazy, et al, Cell Metabolism, 14, 365-377 (2011)）。ＢＡＣＥ２酵素活性の阻害について試験化合物を評価するために、ヒトＴＭＥＭ２７のアミノ酸配列に基づくＦＲＥＴペプチド（ダブシル−ＱＴＬＥＦＬＫＩＰＳ−ＬｕｃＹ）を、基質として使用する（Esterhazy, et al, Cell Metabolism, 14, 365-377 (2011)）。試験化合物の連続希釈物を上記のように調製する。この化合物をＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液で２０倍にさらに希釈する。１０μＬの各希釈物を、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ４．６）、１ｍＭＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、および１５μＭのＦＲＥＴ基質）を含有する、対応する低タンパク質結合黒色プレートのＡ列〜Ｈ列の各ウェルに添加する。次に、１５μＬのＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中２０μＭのヒトＢＡＣＥ２（１〜４６０）：Ｆｃ（Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999）を参照）を、基質および試験化合物を含有するプレートに添加して、反応を開始させる。内容物をプレート振盪機上で１０分間充分に混合する。時点０の混合物のＲＦＵを、励起波長４３０ｎｍおよび蛍光波長５３５ｎｍで記録する。反応プレートをアルミ箔で覆い、室温の暗い加湿乾燥器内で１６〜２４時間保持する。インキュベーション終了後のＲＦＵを、時点０で使用された同じ励起および蛍光の設定で記録する。時点０のＲＦＵとインキュベーション終了後のＲＦＵの差異が、化合物処理下でのＢＡＣＥ２の活性を表す。ＲＦＵの差異を阻害剤濃度に対してプロットし、曲線を４パラメータ・ロジスティック方程式に当てはめ、ＩＣ_５０値を得る。（May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)）。

本明細書の実施例１の化合物を、基本的には上記と同様に試験すると、４７９ｎＭ±２０２（ｎ＝４）（平均値±ＳＥＭ；ＳＥＭ＝平均値の標準誤差）のＢＡＣＥ２ＩＣ_５０が示される。ＢＡＣＥ２（ＴＭＥＭ２７ＦＲＥＴＩＣ_５０アッセイ）に対するＢＡＣＥ１（ＦＲＥＴＩＣ_５０酵素アッセイ）の比は約４００倍であり、これは、ＢＡＣＥ１酵素を阻害するための機能的な選択性を示している。上記のデータは、実施例１の化合物がＢＡＣＥ２を超えてＢＡＣＥ１に対して選択的であることを示している。

ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔのホールセルアッセイ
ＢＡＣＥ１活性の阻害を測定するための通例のホールセルアッセイでは、ヒトＡＰＰ６９５ＷｔｃＤＮＡを安定に発現するヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ２２６６）が利用される。細胞は常に継代数６まで使用した後に廃棄する。

ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ細胞を、２００μＬ培地（５０％ＭＥＭ／ＥＢＳＳおよびハムＦ１２、１×各ピルビン酸ナトリウム、可欠アミノ酸および炭酸水素ナトリウムを含有する１０％ＦＢＳ）中５．０×１０^４細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレート内に播種する。次の日、培地を細胞から取り除き、新鮮な培地を加えた後、所望の濃度範囲の試験化合物の存在下／不在化で３７℃で２４時間インキュベートする。

インキュベーションの終わりに、βセクレターゼ活性の証明のために、特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによるＡｂｅｔａペプチド１−４０および１−４２の解析によって、培地上清を解析する。これらの特異的なＡｂｅｔａアイソフォームを測定するため、モノクローナル２Ｇ３をＡｂｅｔａ１−４０に対する捕捉抗体として使用し、モノクローナル２１Ｆ１２をＡｂｅｔａ１−４２に対する捕捉抗体として使用する。Ａｂｅｔａ１−４０およびＡｂｅｔａ１−４２のＥＬＩＳＡは共に、ビオチン化された３Ｄ６をレポート抗体として使用する（抗体の説明については、Johnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)を参照されたい）。化合物処理後に培地上清中に放出されたＡｂｅｔａの濃度は、このような条件下でのＢＡＣＥ１の活性に対応する。１０点の阻害曲線をプロットし、４パラメータ・ロジスティック方程式に当てはめて、Ａｂｅｔａ低減効果に対するＩＣ_５０値を得る。実施例１の化合物を基本的には上記のように試験すると、表４に示されるような、以下のＡｂｅｔａ低減活性を示す。

βセクレターゼのインビボ阻害
マウス、モルモット、イヌ、およびサルを含むいくつかの動物モデルを用いて、化合物処置後のインビボにおけるβセクレターゼ活性の阻害を検査してもよい。本発明で使用される動物は、野生型動物、遺伝子導入動物、または遺伝子ノックアウト動物であり得る。例えば、Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)に記載される通りに作製されたＰＤＡＰＰマウスモデル、および他の非遺伝子導入動物または遺伝子ノックアウト動物は、阻害性化合物の存在下でのＡｂｅｔａおよびｓＡＰＰｂｅｔａ産生のインビボ阻害の解析に有用である。一般的には、２月齢のＰＤＡＰＰマウス、遺伝子ノックアウトマウスまたは非遺伝子導入動物に、経口的経路、皮下経路、静脈内経路、摂食経路、または他の投与経路を介して、トウモロコシ油、βシクロデキストラン、リン酸緩衝液、ＰＨＡＲＭＡＳＯＬＶＥ（登録商標）、または他の適切なビヒクル等のビヒクル中で製剤化された化合物を投与する。化合物投与の１〜２４時間後、動物を屠殺し、Ａｂｅｔａ１−ｘの解析のために脳を摘出する。「Ａｂｅｔａ１−ｘ」とは、本明細書で使用される場合、残基１から始まり残基２８より大きいＣ末端で終わるＡｂｅｔａ種の合計を指す。これにより、Ａｂｅｔａ種の大部分が検出され、しばしば「総Ａｂｅｔａ」と称される。総Ａｂｅｔａペプチド（Ａｂｅｔａ１−ｘ）レベルを、モノクローナル２６６を捕捉抗体として使用し、ビオチン化された３Ｄ６をレポート抗体として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。（May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011）を参照）。

急性試験では、化合物または適切なビヒクルを投与し、投与の約３時間後に動物を屠殺する。脳組織を選択動物から得て、Ａｂｅｔａ１−ｘの存在について解析する。また、長期投与の後、化合物処置後のβアミロイドプラークの量について、より老齢のＡＰＰ遺伝子導入動物の脳組織を解析してもよい。

阻害性化合物を投与された動物（ＰＤＡＰＰマウスもしくは他のＡＰＰ遺伝子導入マウスまたは非遺伝子導入マウス）は、ビヒクル処置対照またはゼロ時点対照と比較して、脳組織におけるＡｂｅｔａの減少を示し得る。例えば、若齢雌ＰＤＡＰＰマウスへの、実施例１の３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ経口投与量は、脳海馬におけるＡｂｅｔａ１−ｘペプチドレベルを、それぞれ２３％（有意でない）、４３％（ｐ＜０．０５）、および５８％（ｐ＜０．０１）減少させた。脳皮質組織では、実施例１の３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇの投与量は、投与の３時間後のビヒクル処置マウスと比較して、Ａｂｅｔａ１−ｘレベルをそれぞれ４３％、５９％、および７３％（全ての値はｐ＜０．０１）減少させた。

インビトロにおけるＢＡＣＥ１酵素に対する実施例１の活性を考慮すると、これらのＡｂｅｔａ低減効果は、インビボにおけるＢＡＣＥ阻害と一貫しており、さらに、実施例１のＣＮＳ浸透を示している。

これらの試験は、本発明の化合物がＢＡＣＥ１を阻害し、そのため、Ａｂｅｔａレベルの低減に有用であることを示している。

これらの試験は、本発明の化合物がＢＡＣＥ１を阻害し、そのため、Ａｂｅｔａレベルの低減に有用であることを示している。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］次式の化合物またはその薬学的に許容できる塩：

（式中、Ｒは、メチル、エチル、またはシクロプロピルである）。
［２］Ｒがメチルである、［１］に記載の化合物またはその塩。
［３］前記化合物が

である、［１］または［２］に記載の化合物またはその塩。
［４］前記化合物が

である、［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物またはその塩。
［５］

である、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
［６］

である、［１］〜［４］のいずれかに記載の塩。
［７］

である、［１］〜［４］のいずれかに記載の塩。
［８］

である、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
［９］前記化合物がＮ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物またはその塩。
［１０］Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである、［５］に記載の化合物。
［１１］Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物である、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
［１２］Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホネートである、［１］〜［４］のいずれかに記載の塩。
［１３］Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネートである、［１］〜［４］のいずれかに記載の塩。
［１４］患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む、方法。
［１５］患者における軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む、方法。
［１６］治療において使用するための、［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
［１７］アルツハイマー病の治療において使用するための、［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
［１８］軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行の治療において使用するための、［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
［１９］［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩と、１つ以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［２０］［１］〜［１３］のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩と、１つ以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤とを混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法。

Claims

次式の化合物またはその薬学的に許容できる塩：

（式中、Ｒは、メチル、エチル、またはシクロプロピルである）。
Ｒがメチルである、請求項１に記載の化合物またはその塩。
前記化合物が

である、請求項１または請求項２に記載の化合物またはその塩。
前記化合物が

である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の塩。
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の塩。
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
前記化合物がＮ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項５に記載の化合物。
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホネートである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の塩。
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネートである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の塩。
患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む、方法。
患者における軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む、方法。
治療において使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
アルツハイマー病の治療において使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行の治療において使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩と、１つ以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩と、１つ以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤とを混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法。