JP2017510662A - 非結核性抗酸菌に対する活性を有するリポソームシプロフロキサシン製剤 - Google Patents

Abstract

リポソームシプロフロキサシンの製剤を用いてNTM肺感染症を治療する方法を記載している。また、気道感染症および他の医学的状態の治療のための特殊なリポソーム製剤およびそれらの送達、ならびにそれらと関連して使用される装置および製剤を記載している。

Description

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所の国立アレルギー感染症研究所によって与えられた政府の支援である中小企業技術革新制度助成金1R43-AI-106188-01を用いてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、様々な微生物または細胞内病原体、特に非結核性抗酸菌(NTM)によって引き起こされる気道感染症を予防または治療するための、吸入用のリポソームシプロフロキサシンの薬学的組成物に関する。

発明の背景
気道感染症は、様々な微生物によって引き起こされる。医療界には治療の負担および費用の増大を含み、かつ患者には、より侵襲的な治療パラダイムおよび深刻な疾患またはさらには死亡の可能性という点での、無数の結果を、持続性の感染症は招く。微生物に既に感染している患者を根絶する速度または有効性を高めるだけでなく、感染しやすい患者が気道感染症にかかるのを防止することを目的とする予防処置を提供するために、改良された治療パラダイムが利用可能であれば、有益であると考えられる。

非結核性抗酸菌(NTM)による肺感染症は、治療が困難であることで悪名が高い。非結核性抗酸菌は、マクロファージ内部およびバイオフィルム中を含む様々な形態で肺中に存在する。これらの場所は、抗生物質を用いて接近することが特に難しい。さらに、このNTMは休眠期(休止状態(sessile)と呼ばれる)または複製期のいずれかの状態であることができ、有効な抗生物質治療はどちらの時期も標的とすると考えられる。驚くべきことに、本発明者らは、リポソーム中に封入されたシプロフロキサシンを含むいくつかのシプロフロキサシン組成物は、マクロファージ中に棲みついたNTMおよびバイオフィルム中に休眠状態で存在するNTMの両方に対して抗菌活性が有効であることを発見した。

マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)亜種ホミニスイス(hominissuis)(以後、M.アビウムと呼ぶ)およびマイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)(以後、M.アブセサスと呼ばれる)による肺感染症は、重要な医療問題であり、現在の治療法には大きな制限がある。NTMによる肺感染症の発病率は増加しており(Adjemian et al., 2012; Prevots et al, 2010)、特にM.アビウムおよびM.アブセサスによる(Inderlied et al, 1993)。米国におけるNTMの約80％は、M.アビウムに関連している(Adjemian et al., 2012; Prevots et al, 2010)。M.アブセサスは、最も有毒なタイプの1つであり、発生率が2位である(Prevots et al, 2010)。両方のマイコバクテリアによって引き起こされる疾患は、慢性肺疾患、例えば、肺気腫、嚢胞性線維症、および気管支拡張症の患者に好発する(Yeager and Raleigh, 1973)。これらはまた、重度の呼吸器疾患、例えば気管支拡症を起こす場合もある(Fowler et al, 2006)。これらの感染症は、環境由来であり、肺の進行性障害(progressive compromising)を引き起こす。現在使用されている治療法は、多くの場合、有効性が不十分であるか、または重大な副作用を伴う。通常、M.アビウム感染症は、マクロライド(クラリスロマイシン)またはアザライド(アジスロマイシン)をエタンブトールおよびアミカシンと組み合わせて用いる全身療法によって治療される。シプロフロキサシンおよびモキシフロキサシンなどの経口キノロンまたはIVキノロンは、他の化合物と一緒に使用され得る(Yeager and Raleigh, 1973)が、有効性を最大にするためには、高い細胞内薬物レベルを達成する必要がある。経口シプロフロキサシンは、マクロライドまたはアミノグリコシドと組み合わせて投与された場合のみ、M.アビウムに対する臨床的有効性を有する(Shafran et al 1996; de Lalla et al, 1992; Chiu et al, 1990)。インビトロおよびマウスでの研究により、経口シプロフロキサシン単独での活性が限定的であることは、シプロフロキサシンが感染部位で殺菌濃度を達成できないことに関係していることが示唆されている(Inderlied et al, 1989);実験モデルおよびヒトにおいて、最小発育阻止濃度(MIC)が5μg/mlであるのに対し、臨床血清Cmaxが4μg/mlであることから、有効性が限定的であることが明らかである(Inderlied et al, 1989)。M.アブセサスは、しばしば、クラリスロマイシンに耐性である。唯一の利用可能な治療代替手段であることが多いIVアミノグリコシドまたはIVイミペネムを適用する必要があり、これらは、IV投与に伴う外傷および費用だけでなく、重大な副作用の可能性を有する。クロファジミン、リネゾリド、およびセフォキシチンもまた、処方されることがあるが、毒性および/またはIV投与の必要性から、これらの化合物の使用は限定される。したがって、利用可能な治療法が著しく不足しており、より良いアプローチが必要とされている。

また、最近の研究では、M.アビウム感染症およびM.アブセサス感染症のどちらも、顕著なバイオフィルム形成に関連していることが示された(Bermudez et al, 2008; Carter et al, 2003):M.アビウムのバイオフィルム関連遺伝子の欠失は、実験動物モデルにおいてこの細菌がバイオフィルムを形成し、肺感染症を引き起こす能力に強い影響を与えた(Yamazaki et al, 2006)。

シプロフロキサシンは、いくつかの他のタイプのグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対して活性であり、下気道感染症の経口治療およびIV治療に適応されている、広域のフルオロキノロン抗生物質である。これは、細菌の複製、転写、修復、および組換えに必要とされる酵素であるトポイソメラーゼII(DNAギラーゼ)およびトポイソメラーゼIVを阻害することによって作用する。この作用機序は、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、マクロライド、およびテトラサイクリンのものとは異なり、したがって、これらのクラスの薬物に耐性である細菌は、シプロフロキサシンに感受性であり得る。シプロフロキサシンが属する抗微生物剤のクラスである、キノロンと、他のクラスの抗微生物剤の間には、公知の交差耐性はない。

魅力的な抗微生物特性があるものの、シプロフロキサシンは、GI不耐症(嘔吐、下痢、腹部不快感)、ならびにめまい、不眠症、易刺激性、および不安レベルの上昇などの厄介な副作用をもたらす。衰弱を引き起こすこれらの副作用をもたらさずに長期にわたって使用することができる、改良された治療レジメが必要とされていることは明らかである。

吸入エアロゾルとしてのシプロフロキサシンの送達により、一次感染部位である気道中での薬物の送達および作用を区画に分けることによってこれらの懸念のいくつかに対処できる見込みがある。現在、一次感染部分へと直接的に抗生物質送達を導くことができる、ヒト使用向けに規制当局の認可を受けているエアロゾル化形態のシプロフロキサシンはない。この原因は、一つには、この薬物は溶解性が乏しく苦いため、吸入に適した製剤の開発が妨げられていたことにあり;気道疾患に罹患している多くの患者は、リポソーム中に封入されていない抗生物質を吸入すると、咳をするか、または気管支が収縮する場合がある(Barker et al, 2000)。さらに、シプロフロキサシンの組織分布は非常に速いため、肺中の薬物滞留時間が短すぎて、経口経路またはIV経路によって投与された薬物を上回る付加的な治療恩恵を提供できない(Bergogne-Berezin E, 1993)。

多くの薬物の治療特性は、リポソーム中に組み入れることによって改善される。薬物送達系としてのリン脂質ビヒクルは、1965年に「リポソーム」として再発見された(Bangham et al., 1965)。一般用語「リポソーム」は、様々な構造物を包含するが、いずれも、シプロフロキサシンのような親水性薬物を封入できる水性空間を囲い込む1つまたは複数の脂質二重層からなる。リポソーム封入をすると、薬物の薬物動態および体内分布の変化、担体からの持続的薬物放出、疾患部位への送達の促進、および分解からの活性薬物種の保護を含むいくつかのメカニズムを介して、生物薬剤学的特徴が改良される。抗癌剤ドキソルビシン(Myocet(登録商標)/Evacet(登録商標)、Doxyl(登録商標)/Caelyx(登録商標))、ダウノルビシン(DaunoXome(登録商標))、抗真菌剤アムホテリシンB(Abelcet(登録商標)、AmBisome(登録商標)、Amphotec(登録商標))、およびベンゾポルフィリン(Visudyne(登録商標))のリポソーム製剤は、この二十年間に米国、ヨーロッパ、および日本の市場に売り出されて成功している製品の例である。最近、ビンクリスチン(Marqibo(登録商標))のリポソーム製剤が、腫瘍に適応するために認可された。脂質ベースの担体は、安全性および有効性が証明されているため、これらは医薬品の製剤にとって魅力的な候補となっている。

したがって、現在使用されているシプロフロキサシン製剤と比較して、リポソームシプロフロキサシンエアロゾル製剤は、次のいくつかの恩恵を与えるはずである:(1)高い薬物濃度、(2)感染部位での持続放出による、薬物滞留時間の延長、(3)副作用の減少、(4)嗜好性の向上、(5)細菌バイオフィルム中への上手な進入(penetration)、および(6)細菌に感染した細胞中への上手な進入。

本発明の1つの例において、シプロフロキサシンを封入するリポソームは、単層の小胞(平均粒子サイズ75〜120nm)である。シプロフロキサシンは、肺中で約10時間の半減期でこれらのリポソームからゆっくりと放出され(Bruinenberg et al, 2010 b)、これにより、1日に1回の投薬が可能になる。さらに、インビトロおよびマウス感染モデルでの様々なリポソーム組成物を用いた研究によって、リポソームシプロフロキサシンが、M.アビウムを含むいくつかの細胞内病原体に対して有効であることが示された。吸入されたリポソームシプロフロキサシンはまた、患者のシュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)(PA)肺感染症を治療するにあたっても有効である(Bilton et al, 2009 a, b, 2010, 2011; Bruinenberg et al, 2008, 2009, 2010 a, b, c, d, 2011; Serisier et al, 2013)。

認可されている用量の経口シプロフロキサシンおよびIVシプロフロキサシンと比べて、吸入によって気道中に送達されるリポソームシプロフロキサシン製剤の方が、気道粘膜中およびマクロファージ内で高濃度を達成し、その結果、臨床的有効性が向上する:治療用量の本発明者らのリポソームシプロフロキサシンを患者が吸入してから2時間後に、痰中のシプロフロキサシン濃度は200μg/mlを越え、20時間後(次の投与の2時間前)でさえ、濃度は20μg/mlより高く、耐性マイコバクテリアの上記最小発育阻止濃度を十分に上回っていた(ブレイクポイントは約4μg/ml)(Bruinenberg 2010b)。シプロフロキサシンを含むリポソームは、マクロファージによって貪欲に摂取されるため、シプロフロキサシンは細胞内病原体の極めて近くに運ばれ、したがって、抗マイコバクテリア濃度がさらに上昇し、したがって、他の形態のシプロフロキサシンと比べて、吸入リポソーム製剤の有効性は向上するはずである。したがって、本発明者らは、耐性の高いNTMでさえ、本発明者らの吸入リポソームシプロフロキサシンを用いて抑制できると考える。これらの患者では全身投与用の抗生物質を長期にわたって使用することが原因で、抗生物質に対するM.アビウムおよびM.アブセサスの耐性がよく起こるため、このことは意味がある。P.エルギノーサ(PA)を用いた本発明者らの臨床経験からも、吸入リポソームシプロフロキサシン療法の後に明らかな耐性出現はないことが示されている:実際に、最初は耐性株も有していた患者さえ、治療法に良く応答した(Serisier et al., 2013)。これは、持続的に圧倒的濃度のシプロフロキサシンが存在することに起因する可能性が高い。さらに、嚢胞性線維症患者で他の抗シュードモナス薬であるトブラマイシンおよびコリスチメタートを用いた経験は、PAの耐性株を有する患者さえ、吸入形態のこれらの薬物に臨床的に良く応答するというものである(Fiel, 2008)。

いくつかのインビトロ研究により、リポソームシプロフロキサシンが細胞内病原体に対して有効であることが実証されている:(1)ヒト末梢血単球/マクロファージ中で、0.1〜5μg/mlの濃度にわたって試験されたリポソームシプロフロキサシンは、同濃度の遊離薬物と比べて、細胞内のM.アビウム-M.イントラセルラーレ(intracellulare)複合体(MAC)コロニー形成単位(CFU)の濃度依存的(concentration-related)減少を引き起こした(Majumdar et al, 1992);(2)マウスのマクロファージ様細胞株J774において、リポソームシプロフロキサシンは、細胞関連のM.アビウムのレベルを43分の1まで低下させ、これらの低下は、遊離シプロフロキサシンの場合より大幅であった(Oh et al, 1995)。

M.アビウムまたはM.アブセサスが単球/マクロファージに一度感染すると、次に、感染は、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄、および血液に広がることができる。動物モデルでのM.アビウムまたはM.アブセサスに対するリポソームシプロフロキサシンの有効性に関して、公開されている研究はない。

若干のインビボ研究によって、リポソームシプロフロキサシンが細胞内病原体のF.ツラレンシス(tularensis)に対して有効であることが実証されている:吸入性(inhalational)野兎病(F.ツラレンシス生ワクチン株(LVS)およびSchu S4)に対する、吸入または鼻腔内滴下によって肺に送達されたリポソームシプロフロキサシンの有効性がマウスにおいて実証され、その際、リポソームシプロフロキサシンをわずか1回投与しただけで、曝露後の100％の保護を提供し、既にかなりの全身感染が起こっていた動物に対する有効な曝露後治療さえも提供した(Blanchard et al, 2006; Di Ninno et al, 1993; Conley et al, 1997; Hamblin et al, 2011; Hamblin et al, 2014; Wong et al, 2003)。また、これらの研究から、吸入投与されたリポソームシプロフロキサシンが、吸入投与された未封入シプロフロキサシンおよび経口投与された未封入シプロフロキサシンのどちらよりも優れていることも判明した。

一方、(a)遊離シプロフロキサシンは、マイコバクテリア感染症のマクロファージモデルにおいて、リポソームシプロフロキサシンより劣っていた(Majumdar et al, 1992; Oh et al, 1995); (b)肺に送達された単独の遊離シプロフロキサシンは、F.ツラレンシス感染症のマウスモデルで試験した場合、血流中に急速に吸収されるため、遊離シプロフロキサシンより有効性が劣っていた(Conley et al, 1997; Wong et al, 2003)。遊離シプロフロキサシンとリポソームシプロフロキサシンの両方から調合された製剤は、Aradigm社によって非CF気管支拡張症患者において実証されたように、最初に一過性の高濃度遊離シプロフロキサシンによって肺でのCmaxを上昇させること、それに続いて、リポソーム成分からシプロフロキサシンをゆっくりと放出することという潜在的利点を組み合わたものである(Cipolla et al, 2011; Serisier et al, 2013)。遊離シプロフロキサシン成分もまた、望ましい免疫調節効果を有している(米国特許第8,071,127号、同第8,119,156号、同第8,268,347号、および同第8,414,915号)。

さらに、非経口的に注射されたリポソームシプロフロキサシンは、マクロファージを活性化して、その結果、抑制濃度以下でさえ、おそらくは免疫賦活効果によって、食作用、一酸化窒素生成、および細胞内微生物殺菌を増大させた(Wong et al, 2000)。野兎病での経肺送達されたCFIの全身作用によって示唆されているように、シプロフロキサシン充填マクロファージは、肺からリンパ管中に遊走して、肝臓、脾臓、および骨髄中の感染症を治療することができる(Di Ninno et al, 1993; Conley et al, 1997; Hamblin et al, 2011; Hamblin et al, 2014; Wong et al, 2003)。リポソームに封入された抗生物質はまた、肺中でP.エルギノーサによって形成された細菌膜に、より上手に進入することが公知である(Meers et al, 2008)。しかし、一般に、抗生物質を詰めたリポソームまたはリポソームに封入したシプロフロキサシンが、肺中でマイコバクテリア、具体的にはNTMによって形成されたバイオフィルムに進入できるであろうことは、以前には実証されていない。したがって、肺に送達される新しい製剤の抗マイコバクテリア効果および免疫調節効果により、M.アビウムもしくはM.アブセサスに感染した患者にとって、既存の治療より優れた代替案が提供され得るか、または抗生物質調製物が、バイオフィルム中およびマクロファージ内だけでなく、浮遊性であるこれらの生物に対して有効である場合には、少しずつ改善するための補助剤が提供され得る。抗生物質治療は、吸入によって与えられる場合、忍容性が高く安全であることが、さらに必要とされる。現在の抗生物質治療の選択肢は、しばしば、重大な全身性副作用を引き起こすため、新しい治療法は、全身性副作用を回避するために、毒性が低い抗生物質を使用し、血液循環中の濃度を最小限にすることが望ましい。

リポソームシプロフロキサシンの研究により、動物の肺胞マクロファージによる多量の取込みが実証された。おそらくは、このことが、マウスにおける吸入性野兎病の曝露後の予防および治療が著しく有効であることの理由である。シプロフロキサシンの血漿レベルは、本発明者らのリポソームシプロフロキサシンを気道投与した後に低かったものの、肺だけでなく、肝臓、脾臓、気管気管支リンパ節からの野兎病感染の減少が観察されたことから、リポソームシプロフロキサシンを取り込んだ肺胞マクロファージが、リンパ液を介して肺から肝臓、脾臓、およびリンパ節中へ遊走することが示された(骨髄および血液中のF.ツラレンシスCFUレベルは測定されなかった)(Conley et al, 1997)。

現在使用されている臨床パラダイムは、M.アビウムまたはM.アブセサス肺感染症の患者を、経口的にまたはIVによって与えられる併用療法で治療するものである。しかし、現在使用されている治療法には、前述したように多くの問題があり、十分な有効性を有していない。本発明の製剤は、NTM患者に対する有効性を向上させた吸入リポソームシプロフロキサシン製剤であり、1日1回の吸入を可能にし、他の治療法と組み合わせてよい。本発明の吸入リポソームシプロフロキサシンは、他の抗生物質と相乗的に作用し、肺中で高濃度を達成して、M.アビウム播種性感染に対する全身療法を提供する。F.ツラレンシスのマウスモデルで観察されたように、マクロファージに摂取されたリポソームシプロフロキサシンの、リンパ管を介した脾臓および肝臓への輸送が起こり得る。

非結核性抗酸菌感染症を治療する方法は、
1マイクロメートル〜12マイクロメートル、または2マイクロメートル〜10マイクロメートル、または4マイクロメートル〜8マイクロメートルの範囲の空気力学的直径を有するエアロゾル化粒子をもたらすように1回量の製剤をエアロゾル化する段階;および
約7〜56日間、または感染が根絶されるまで、1日に約1回エアロゾル化粒子を患者の肺に吸入させる段階
を含む。

製剤は、シプロフロキサシンであってよい抗感染薬から構成されている。製剤は、液状薬物または水もしくはエタノールなどの不活性液体であってよい液体担体を含んでよい。担体は、その中に薬物が溶解または分散されていてよい。

担体は、その中にリポソームが分散され、かつリポソームは、シプロフロキサシンであってよい抗感染性の薬学的に活性な薬物のナノ結晶を封入している。リポソームは脂質二重層から構成されており、担体および薬物の溶液を初めに封入し、続いて、-20℃〜-80℃に凍結し、続いて解凍し、それによって、薬物のナノ結晶がリポソーム二重層の内部に残る。

リポソームは、凍結保存剤および表面活性剤から構成されてよい。凍結保存剤は、ポリオール、例えば、スクロースまたはトレハロースであってよい。表面活性剤は、ポリソルベート20および/またはBRIJ20であってよい非イオン性界面活性剤である。

本発明はさらに、非結核性抗酸菌を治療するための製剤の使用を含み、この製剤は、シプロフロキサシンのような薬物が、25mg/mLまたはそれ以上、50mg/mLまたはそれ以上、100mg/mLまたはそれ以上、200mg/mLまたはそれ以上の範囲の濃度で水溶液中に溶解され、リポソームの脂質二重層中に封入される、特定の方法によって製造される。次いで、リポソームは、抗感染薬を含んでよい溶液内に含められ、この抗感染薬は、リポソーム内に封入された抗感染化合物と同じでも異なっていてもよく、したがって、シプロフロキサシンであってよい。製剤は凍結され、例えば、-20℃〜-80℃の範囲の極めて低い温度で凍結される。凍結された製剤は、例えば、1週間もしくはそれ以上、1ヶ月もしくはそれ以上、1年もしくはそれ以上保存するために長期間にわたって、凍結して維持されてもよいか、または使用するために直ちに再解凍されてもよい。再解凍すると、リポソーム内部の薬物は、ナノ結晶を形成する。投与すると、リポソームの周囲の溶媒担体中に溶解している薬物が、薬物の即時放出を提供し、続いて、リポソームが肺中で溶解する際に、薬物が放出され、続いて、ナノ結晶が溶解する際に、薬物が追加放出される。製剤は、肺でのシプロフロキサシンのような抗感染薬物の長期間にわたる制御放出を提供し、それによって、バイオフィルムとして発生する感染を効果的に根絶することを可能にする。

シプロフロキサシンのリポソーム封入と肺への製剤の直接送達とを組み合わせることにより、これらの治療は、体内分布、薬物動態、ならびに向上した安全性および有効性の点から、シプロフロキサシンおよび他の抗生物質の経口製品および非経口製品とは根本的に異なるものとなる。リポソームに封入されたシプロフロキサシンは、非常に高い濃度で気道に直接送達され、そこで、長期間にわたって存在し、その間に、シプロフロキサシンがリポソームから肺中の感染部位にゆっくりと放出され、経口シプロフロキサシンまたはIV シプロフロキサシンと比べて全身の曝露が少ない。

リポソームシプロフロキサシン製剤の大きさおよび組成は、肺でのマクロファージによる取込みを促進するように設計されている。最も重要な特徴は、この製剤は、噴霧工程に対して頑丈であるべきであり、その結果、リポソームがその大きさおよび封入特性を保持する、ということである。リポソームがエアロゾル化に対して頑丈ではない場合、封入された薬物の損失、またはリポソームの大きさもしくは表面特性の変化が起こり得る。これらの変化のいずれか、または説明していない他の変化は、マクロファージによるリポソーム取込みの低下を招く場合がある。封入された薬物の一部を噴霧またはエアロゾル化の間に失うリポソームは、損なわれていないリポソームと同じ効率でリポソームによって詰められていても、この時点で、封入された薬物が少なくなっており、したがって、マクロファージ内部およびバイオフィルム中の感染病原体を処理するためのペイロードが少なくなっており、それによって、治療の有効性が低下する。

本発明に包含されるリポソームの1つの具体的な組成物は、噴霧工程による損傷が比較的小さく、米国特許第8,071,127号、同第8,119,156号、同第8,268,347号、および同第8,414,915号で説明されている。これらの特許は、吸入される液滴または粒子のエアロゾル化可能な二相性エアロゾルを説明している。これらの液滴または粒子は、封入されておらず、かつシプロフロキサシンであってよい遊離薬物(例えば、抗感染化合物)を含む。さらに、これらの粒子は、同じくシプロフロキサシンであってよい、抗感染化合物のような薬物を封入するリポソームを含む。遊離薬物およびリポソームに封入された薬物は、エアロゾル化送達用に配合される薬学的に許容される賦形剤の中に含まれる。さらに、これらの粒子は、遊離および/またはリポソーム中であってよく、かつ第1の薬物と異なる任意の薬学的に活性な薬物であってよい、付加的な治療物質を含んでもよい。

他のリポソーム組成物には、噴霧によって改変されて、小胞の大きさもしくは薬物封入または両方が変化したものが含まれる。これらには、米国特許第8,226,975号、同第8,642,075号、同第8,673,348号、同第8,673,349号、および米国特許出願第2007196461号、同第20130028960号、同第20130052260号、同第20130064883号、同第20130071469号、同第20130087480号、同第20130330400号、同第20140072620号で説明されているアミカシンのような薬物を含むリポソームが含まれる。米国特許出願第20130330400号では、噴霧によって損なわれ、その結果、噴霧にさらされた後に58〜73％の薬物しか封入された状態で残らないアミカシンリポソーム製剤を具体的に説明している。この出願、すなわち米国特許出願第20130330400号では、小胞の平均サイズもまた、噴霧工程の影響を受け、平均値は噴霧前の285nmから噴霧後の265nmに減少した(範囲:249〜289nm)。米国特許出願第20140072620号もまた、噴霧後に分解して60％の封入薬物および40％の遊離薬物になる、リポソームアミカシン製剤を説明している。

本発明に関連して使用されるリポソームは、噴霧前に封入された薬物を基準として、80％またはそれ以上、および好ましくは90％またはそれ以上、および最も好ましくは95％またはそれ以上の封入薬物を、噴霧後に保持している。噴霧中に、顕著な量の薬物、例えば、封入された薬物の20％を越える量がリポソームから失われる場合には、リポソームの特徴セットの設計に盛り込まれていたと想定した、マクロファージによるリポソーム取込みの間に、マクロファージ中に放出される封入薬物の量は少なくなり、それによって、インビボの有効性が損なわれる。このことは、リポソーム製剤が細胞内感染に対して活性となる能力の重要な要素である。インビトロまたはインビボの研究を行い、それらのモデルでの有効性を実証できる場合でも、現実の世界という状況では、製剤は最初に噴霧されるか、もしくはそうでなければエアロゾル化され、したがって、製剤がエアロゾルとして適用されたのでなければ(これは典型的ではない)、モデルでの結果の妥当性に関して保証はないか、または他の研究が、エアロゾル化後にリポソームの完全性が維持されているかを検証するために行われた。

肺胞マクロファージは、M.アビウムおよびM.アブセサス(Jordao et al, 2008)および同様に他のマイコバクテリア種の標的とされる。マクロファージは、リポソームシプロフロキサシンおよびマイコバクテリアの両方を貪欲に摂取して、ファゴソーム内部で両者を極めて近くに連れてくる。感染した標的、すなわち肺中の肺胞マクロファージ細胞におけるこの生物学的利用能の増大により、全身に送達されたシプロフロキサシンまたは他の抗マイコバクテリア剤と比べて、向上した有効性が提供される。リポソームからのシプロフロキサシンの持続放出は、特に、肺およびマクロファージ中での曲線下面積とMICの比(AUC/MIC)をさらに大きくし、1日1回の投薬を可能にし得る。これらの製剤の投与により、再発の発生率が低くなり、全身副作用が減少した。

本発明の1つの局面は、吸入される液滴または粒子のエアロゾルである。これらの液滴または粒子は、封入されておらず、かつシプロフロキサシンであってよい遊離薬物(例えば、抗感染化合物)を含む。さらに、これらの粒子は、同じくシプロフロキサシンであってよい、抗感染化合物のような薬物を封入するリポソームを含む。遊離薬物およびリポソームに封入された薬物は、エアロゾル化送達用に配合される薬学的に許容される賦形剤の中に含まれる。さらに、これらの粒子は、遊離および/またはリポソーム中であってよく、かつ第1の薬物と異なる任意の薬学的に活性な薬物であってよい、付加的な治療物質を含んでもよい。

本発明の別の局面は、NTM感染症のヒト患者の肺に、またはNTM感染症を予防するために、エアロゾルによって送達されるリポソームを含む製剤であり、これらのリポソームは、遊離シプロフロキサシンおよび封入シプロフロキサシンを含む。リポソームは、単層または多重層であってよい。エアロゾル化は、ジェット噴霧またはメッシュ噴霧を含む噴霧によって達成することができる。封入されたシプロフロキサシンは、リポソーム中に存在し、リポソームは、噴霧工程に対して頑丈であり、噴霧後に90％超、および好ましくは噴霧後に95％超まで封入状態を維持する。

本発明の第3の局面は、リポソーム中に封入された抗感染薬、例えばシプロフロキサシンを含む製剤を患者に投与する段階を含む、患者の細胞内感染を治療するための方法である。製剤は、好ましくは吸入によって、およびより好ましくは噴霧によって、患者に投与される。細胞内感染症は、M.アブセサス、M.アビウム、M.アビウム複合体(MAC)(M.アビウムおよびM.イントラセルラーレ)、M.ボレチイ(Bolletii)、M.ケロネー(chelonae)、M.ウルセランス(ulcerans)、M.ゼノピ(xenopi)、M.カンサシ(kansasii)、M.フォーチュイタム(fortuitum)複合体(M.フォーチュイタムおよびM.ケロネー)、またはM.マリヌム(marinum)の感染症を含むNTM感染症に相当し得る。

本発明の第4の局面は、エアロゾル化ならびに気道および肺深部への送達後に、マクロファージによって取り込まれ、複製期のマイコバクテリアおよび複製期ではない(休止状態の)マイコバクテリアの両方を死滅させる能力を有する、リポソーム抗感染薬製剤、好ましくはリポソームシプロフロキサシン製剤の能力である。NTMの好結果の治療のためには、複製可能なマイコバクテリアおよび休眠(または休止状態の)マイコバクテリアの両方を治療によって死滅させることが不可欠であり、マイコバクテリア感染症では両方の形態が存在することがその理由である。

本発明の第5の局面は、治療が最大限に有効になるために、抗生物質製剤は、マイコバクテリアによって形成されるバイオフィルムに進入できる必要もあるということである。

本発明の第6の局面は、適切なビヒクル中の抗生物質は、バイオフィルムに進入できるだけでなく、休止状態の(休眠)マイコバクテリアおよび複製期マイコバクテリアの両方に対して有効であるということである。

本発明の別の局面は、抗生物質は、肺でのマイコバクテリアバイオフィルムの形成を促進しないということである。具体的には、M.アビウムはバイオフィルムを形成し、これは、浮遊微粒子(aerosol)を介した肺感染に関連しているマウスの特性である。自然環境に存在する2種の抗生物質であるストレプトマイシンおよびテトラサイクリンと共にM.アビウムをインキュベーションすると、バイオフィルム形成が減少せず、増加する。アンピシリン、モキシフロキサシン、リファンピシン、およびTMP/SMXを含む、他の抗生物質は、バイオフィルムに影響を与えなかった。すなわち、それらはM.アビウムを死滅させることができなかった。モキシフロキサシンは、シプロフロキサシンに似たフルオロキノロンである。したがって、本発明の特定のリポソームシプロフロキサシン製剤が、バイオフィルム中のマイコバクテリアを死滅させるのに有効であることは、意外である。ある抗生物質が、プランクトン様表現型のマイコバクテリアをすべて死滅させることができる場合でも、プランクトン様細菌および休止状態細菌のどちらも、等しく感染を確立することができ、残存する休止状態細菌が宿主に再感染することを確実にすることに留意されたい。多くの慢性肺疾患患者は、多くの病原体によって引き起こされる感染症を、アミノグリコシドまたはテトラサイクリンなどの抗生物質で治療される。したがって、予防または治療法のいずれかの目的で抗生物質を服用している個体にM.アビウムがコロニーを作る状況では、より多い量のバイオフィルムが生成され、かつ感染がさらに確立される結果となる場合がある。

本発明の別の局面によれば、遊離の抗感染薬および封入された抗感染薬の両方を含む製剤は、肺において、最初に高い治療レベルの抗感染薬を提供し、一方で、抗感染薬の持続放出を長期にわたって維持して、バイオフィルムの細菌を処置する際の困難をなくすにあたっての障壁を克服する。したがって、抗感染薬、例えばシプロフロキサシンを即時放出する意図は、バイオフィルムの細菌を根絶するにあたっての困難を避けて、肺中の抗生物質濃度を治療レベルまで急速に上昇させて、バイオフィルムへの、およびバイオフィルム内部での抗生物質の拡散速度が低いという難題に取り組むことである。持続放出される抗感染薬、例えばシプロフロキサシンは、肺中で治療レベルの抗生物質を維持するのに役立ち、それによって、より長い期間にわたって継続される治療法を提供し、有効性を高め、投与頻度を減少させ、かつ耐性コロニーが形成する可能性を低くする。本発明のリポソームからの抗感染薬の持続放出により、抗感染剤が抑制濃度以下を決して下回らないように徹底され、したがって、抗感染薬に対する耐性が生じる可能性が低下する。

シプロフロキサシンが、本発明において特に有用な抗感染薬であるが、本発明をシプロフロキサシンに限定したいという願望はない。他の抗生物質または抗感染薬、例えば、アミノグリコシド、テトラサイクリン、スルホンアミド、p-アミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β-ラクタム、β-ラクタム阻害物質およびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、ペニシリン、セファロスポリン、リノミシン(linomycin)、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン系抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス(butoconazole ciclopirax)、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択されるものが、使用され得る。

休眠(休止状態の)細菌および複製期の細菌の両方に対して有効である抗生物質が好ましい。

本発明の1つの局面は、
1マイクロメートル〜12マイクロメートルの範囲の空気力学的直径を有するエアロゾル化粒子を生成するように1回量の製剤をエアロゾル化する段階;
エアロゾル化粒子を患者の肺に吸入させる段階であって、
エアロゾル化された製剤が、溶液中20mg/mL〜80mg/mLのシプロフロキサシン濃度で遊離シプロフロキサシンを含む液体担体、溶液中のリポソーム非封入シプロフロキサシン、および、リポソーム内部に封入されたナノ結晶としてのシプロフロキサシンから構成されているか、
エアロゾル化粒子が、2マイクロメートル〜8マイクロメートルの空気力学的直径を有し、リポソームが、20ナノメートル〜1マイクロメートルの直径を有し、かつナノ結晶が、10ナノメートルまたはそれ未満の寸法を有するか、
シプロフロキサシンが、30mg/mL〜70mg/mLの濃度で溶液中に存在するか、または
シプロフロキサシンが、40mg/mL〜60mg/mLの濃度で溶液中に存在し、
リポソームが、単層であり、かつエアロゾル化後に90％またはそれ以上のレベルで構造的完全性を維持している、段階;ならびに
少なくとも7日間の期間にわたって毎日1回、エアロゾル化および吸入を繰り返すか、または
繰り返しが7日〜56日の期間にわたって1日1回毎日実施され、かつ感染症がバイオフィルム内に存在する、段階
を含む非結核性抗酸菌感染症の治療のために使用される製剤または該治療の方法である。

本発明の別の局面は、
患者を感染について検査する段階;
患者の試験結果が陽性である場合にエアロゾル繰り返し投与を継続し、かつ、患者の試験結果が陰性である場合に中断する段階
をさらに含む前述の使用または方法であり、
リポソームは、凍結保存剤および表面活性剤から構成されているか、
95％もしくはそれ以上のリポソームは、構造的完全性を維持しており、かつ、製剤をエアロゾル化した後にシプロフロキサシンのナノ結晶を封入し続けているか、または
98％もしくはそれ以上のリポソームは、構造的完全性を維持しており、かつ、製剤をエアロゾル化した後にシプロフロキサシンのナノ結晶を封入し続けている。

本発明のさらに別の局面は、非結核性抗酸菌感染症の治療における製剤の使用であり、製剤はリポソームを含み、リポソームは、
脂質二重層;
凍結保存剤;および
100nmまたはそれ未満の寸法を有する、脂質二重層によって取り囲まれた薬学的に活性な抗感染薬物のナノ結晶
を含み、
凍結保存剤はポリオールであり;
ポリオールはスクロースまたはトレハロースであり;
リポソームは、表面活性剤をさらに含む。

前述の本発明の使用は、
薬学的に許容される担体;または
担体中に溶解された薬学的に活性な抗感染薬物;または
リポソームが液状抗感染薬物中に分散されている、該液状抗感染薬物
をさらに含む。

前述の使用は、
抗感染薬物が、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、β-ラクタム、β-ラクタム阻害物質およびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン系抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、ならびにそれらの組合せを含む群より選択され、かつ
脂質二重層が、脂肪酸;リゾ脂質;スフィンゴ脂質;スフィンゴミエリン;糖脂質;グルコリピド;スフィンゴ糖脂質;パルミチン酸;ステアリン酸;アラキドン酸;オレイン酸;スルホン化単糖、スルホン化二糖、スルホン化オリゴ糖、またはスルホン化多糖を有する脂質;エーテル結合およびエステル結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、ジアセチルホスファート、ステアリルアミン、カルジオリピン、リン脂質、非対称アシル鎖を有する合成リン脂質;ならびに共有結合ポリマーを有する脂質からなる群より選択される脂質から構成されており、かつ
リポソームが、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、およびそれらの混合物からなる群より選択されるリン脂質を含み;該リン脂質が、コレステロール、ステアリルアミン、ステアリン酸、トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群より選択される改質剤との混合物中で提供され;リポソームが単層または多重層であり、かつ
リポソームがHSPCおよびコレステロールから構成されており、かつ
脂質二重層がHSPCおよびコレステロールから構成されており、
凍結保存剤が、スクロースおよびトレハロースからなる群より選択され、
表面活性剤が、ポリソルベート20およびBRIJ20からなる群より選択され、かつ
薬物がシプロフロキサシンである、
使用をさらに含む。

本発明は、
リポソームが、1:10〜10:1(w/w)の間の比で存在するポリオールおよびホスファチジルコリン豊富リン脂質から構成されており;かつ/もしくは
リポソームが、1:1〜5:1(w/w)の間の比で存在するポリオールおよびホスファチジルコリン豊富リン脂質から構成されており;かつ/または
表面活性剤が、0.01％〜1％の間の量で存在し;かつ/もしくは
表面活性剤が、0.05％〜0.4％の間の量で存在し;かつ/または
感染症が患者の肺におけるバイオフィルムでの感染症であり、かつリポソームが、ある期間にわたってかつバイオフィルム感染症を治療するのに有効な速度で、薬物を放出する、
本明細書において説明する任意の使用または製剤をさらに含む。

本発明はまた、
遊離シプロフロキサシンおよびリポソーム中に封入されたシプロフロキサシンを含む製剤をエアロゾル化する段階;ならびに
エアロゾルを患者の肺に吸入させる段階であって、90％またはそれ以上のリポソームが、エアロゾル化後に構造的完全性を維持している、段階
を含む、患者の抗生物質耐性感染症を治療するための任意の使用または方法も含み、
抗生物質耐性感染症は、バイオフィルム中の微生物またはマクロファージに貪食された微生物を含み;
感染症は、バイオフィルム中の微生物の感染症であり;かつ/もしくは
感染症は、浮遊状態の、マクロファージに貪食された微生物の感染症であり;かつ/もしくは
感染症は、マイコバクテリア、P.エルギノーサ、およびF.ツラレンシスからなる群より選択される微生物の感染症であり;かつ/または
リポソームは、凍結保存剤および表面活性剤を含み、約75nm〜約120nmの平均粒径を有し、単層であり;かつ/もしくは
リポソームは、約30対70の割合(±10％)のコレステロールおよび水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)すなわち天然ダイズレシチンの完全に水素添加された半合成誘導体から構成されており;かつ/または
製剤は、酢酸ナトリウムおよび等張緩衝液から構成された、経肺送達に適した賦形剤をさらに含み;かつ/または
90％もしくはそれ以上のリポソームは、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ肺組織に接触後に1時間当たり0.5％〜10％のシプロフロキサシン放出速度をもたらし;かつ/もしくは
95％もしくはそれ以上のリポソームは、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ肺組織に接触後に1時間当たり1％〜8％のシプロフロキサシン放出速度をもたらし;かつ/または
リポソームは、29.4対70.6の割合のコレステロールおよび水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)を含み、かつ単層であり、かつ、98％もしくはそれ以上のリポソームは、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ1時間当たり2％〜6％のシプロフロキサシン放出速度をもたらす。

本発明は、
リポソームが、0.1〜0.3％のポリソルベート20および200〜400mg/mLのスクロースからさらに構成されており;かつ/または
エアロゾル化および吸入が、7日間もしくはそれ以上の期間にわたって毎日1回、繰り返され;かつ/もしくは
エアロゾル化および吸入が、7日〜56日の期間にわたって毎日1回繰り返され;かつ/または
製剤が、50mg〜500mgのシプロフロキサシンを含み;かつ/もしくは
製剤が、75mg〜300mgのシプロフロキサシンを含み;かつ/または
製剤が、噴霧され、かつ150mgのシプロフロキサシンを含む、
本明細書において説明する製剤使用または方法を含む。

本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、下記により完全に説明する製剤および方法論の詳細を読むと、当業者に明らかになると考えられる。

本発明の局面および態様は、以下の詳細な説明を添付図と一緒に読むと、最も良く理解される。慣例に従って、図面の様々な特徴は原寸に比例しないことが強調される。逆に言うと、様々な特徴の寸法は、明確にするために自由裁量で拡大または縮小されている。図面には次の図が含まれる。
吸入用のリポソームシプロフロキサシンの製造フローチャートである(HSPC/Chol 1回の分量10L)。

発明の詳細な説明
シプロフロキサシンを封入したリポソームを製剤化する本発明の方法、ならびにNTM感染症および他の医学的状態の予防および/または治療のためのそのようなものの送達、ならびにそのようなものと関連して使用される装置および製剤を説明する前に、本発明は、説明される特定の方法論、装置、および製剤に限定されず、したがって、方法、装置、および製剤は、当然、変わり得ることを理解すべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図しないことも理解すべきである。

ある範囲の値が提供される場合、文脈において特に規定がない限り、その範囲の上限値と下限値の間にある、その下限値の単位の10分の1までの各介在値もまた、具体的に開示されることが理解される。記載範囲中の任意の記載値または介在値とその記載範囲中の他の任意の記載値または介在値との間の小さな各範囲は、本発明に包含される。これらの小さな範囲の上限値および下限値は、独立に範囲に含まれるか、または除外されてよい。これらの小さな範囲にいずれかの限界値が含まれるか、いずれの限界値も含まれないか、または両方の限界値が含まれる各範囲もまた、記載範囲中の特に除外される任意の限界値に従うことを条件として、本発明に包含される。記載範囲がこれらの限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及される刊行物はすべて、これらの刊行物が関連して引用される方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「製剤(a formulation)」への言及は、複数のそのような製剤を含み、「方法(the method)」への言及は、1つまたは複数の方法および当業者に公知であるその等価物などへの言及を含む。

本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。本明細書における何事も、以前の発明によるそのような刊行物に本発明が先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の出版日と異なる場合があり、別個に確認する必要がある場合がある。

本明細書において使用される場合、抗感染薬とは、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、マイコバクテリア感染症、または原生動物感染症などの感染症に対して作用する薬剤を意味する。

本発明に包含される抗感染薬には、キノロン(ナリジクス酸、シノキサシン、シプロフロキサシン、およびノルフロキサシンなど)、スルホンアミド(例えば、スルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメタオキサゾール(sulfamethaoxazole)、スルフイソキサゾール、スルファセタミドなど)、アミノグリコシド(例えば、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンなど)、テトラサイクリン(クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンなど)、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン(スルファメトキサゾール、ピラジナミドなどと一緒に使用されることが多いトリメトプリムなど)、ペニシリン(ペニシリンG、ペニシリンV、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンなど)、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン(メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリンなど)、第1世代セファロスポリン(セファドロキシル、セファレキシン、セフラジン、セファロチン、セファピリン、セファゾリンなど)、第2世代セファロスポリン(セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォテタン、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフィネタゾール(cefinetazole)、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォラニドなど)、第3世代セファロスポリン(セフェピム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテンなど)、他のβラクタム(イミペネム、メロペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタムなど)、βラクタマーゼ阻害物質(クラブラン酸など)、クロラムフェニコール、マクロライド(エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシンなど)、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、ポリミキシン類(ポリミキシンA、B、C、D、E₁(コリスチンA)、またはE₂、コリスチンBまたはCなど)コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン(ダプソン、スルホキソンナトリウムなど)、クロファジミン、サリドマイド、または脂質に封入され得る他の任意の抗菌剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗感染薬には、ポリエン系抗真物質(アムホテリシンB、ナイスタチン、ナタマイシンなど)、フルシトシン、イミダゾール(ミコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾールなど)、トリアゾール(イトラコナゾール、フルコナゾールなど)、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、または脂質に封入され得るか、もしくは複合され得る他の任意の抗真菌物質、およびそれらの薬学的に許容される塩、ならびにそれらの組合せを含む、抗真菌剤が含まれ得る。考察および例は、主としてシプロフロキサシンを対象とするが、本出願の範囲は、この抗感染薬に限定されるものではない。薬物の組合せが使用され得る。

バイオフィルムとは、表面で細胞が互いに接着する、微生物の任意の集団である。これらの接着細胞は、しばしば、細胞外高分子物質(EPS)からなる自己産生マトリックスの内部に埋もれ込んでいる。スライムとも呼ばれる(ただし、スライムと形容されるものすべてがバイオフィルムではない)バイオフィルム細胞外高分子物質は、細胞外DNA、タンパク質、および多糖類から通常は構成された高分子集塊である。バイオフィルムは、生物表面または非生物表面で形成することができ、自然環境、工業環境、および病院環境下で至るところに広がることができる。バイオフィルム中で増殖する微生物細胞は、同じ生物体の浮遊細胞とは生理学的に異なっており、浮遊細胞は、対照的に、液体媒体中で浮かび得るかまたは浮遊し得る、単一細胞である。

バイオフィルムは、体内での多種多様の微生物感染症に、1つの概算では全感染症の80％に、関与していることが判明している。バイオフィルムが関係するとされている感染プロセスには、尿路感染症、カテーテル感染症、中耳感染症、歯垢の形成、歯肉炎、コンタクトレンズの被覆などのよく起こる問題、ならびに心内膜炎、嚢胞性線維症における感染症、および常時留置している装置、例えば人工関節および心臓弁の感染症など頻度は落ちるが致死性の高いプロセスが含まれる。最近になって、細菌バイオフィルムが、皮膚の創傷治癒を悪化させ、感染した皮膚創傷を治癒させる際または治療する際に局所抗菌薬の効率を低下させる場合があることが注目されている。

本明細書において使用される場合、「製剤」とは、任意の賦形剤または付加的な有効成分を含む、乾燥粉末としての、または液体中に懸濁もしくは溶解された、リポソームに封入された抗感染薬を意味する。

「対象」、「個体」、「患者」、および「宿主」という用語は、本明細書において同義的に使用され、任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳動物を意味し、最も具体的には、ヒト対象、農場動物、および哺乳動物ペットを含む。対象は、医師のような医療従事者の世話を受けていてよいが、必ずしもそうである必要はない。

「安定な」製剤とは、その中のタンパク質または酵素が、比較的高い温度にて保管および曝露された際に、その物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に保持するものである。ペプチド安定性を測定するための様々な解析技術が当技術分野において利用可能であり、Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)およびJones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90に総説がある。安定性は、選択した温度で、選択した期間測定することができる。

治療のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および農場動物、ならびに動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、雌ウシなどを含む、哺乳動物に分類される任意の動物を意味する。

「障害」とは、特許請求される方法および組成物を用いる治療の恩恵を受けると考えられる任意の状態である。

発明全般
シプロフロキサシンは、嚢胞性線維症患者でよく起こる、例えばP.エルギノーサに起因する下気道感染症の治療に適応される、十分に定着しており手広く使用されている広域フルオロキノロン抗生物質である。吸入抗微生物剤の主な利点は、それらが一次感染部分へと抗生物質送達を導き、GIに関連する副作用を回避することであるが;しかし、この薬物は溶解性が乏しく苦いため、吸入に適した製剤の開発が制限されていた。さらに、シプロフロキサシンが急速に組織に分布するということは、肺中での薬物滞留時間が短くなることを意味し、したがって、経口薬物投与またはIV薬物投与を上回る治療恩恵は制限される。本明細書において説明するシプロフロキサシンのリポソーム封入製剤は、改善された生物薬剤学的な特徴およびメカニズム、例えば、小胞の大きさの保持および噴霧後の封入、変更された薬物PKおよび体内分布、担体からの持続的薬物放出、細胞内感染症を含む疾患部位への送達の促進(これらにより、その時点で、薬物の濃度は細胞内空間内で高くなっている)を介して、これらの制限を減らし、NTMに起因する肺感染症の治療技術を改善する。

本発明は、NTM感染症患者の治療に限定されない。実際に、細胞内感染症、ならびに特に肺胞マクロファージにおけるおよび/または気道中のバイオフィルムにおける感染症を含む、この治療法が有益であり得る多くの患者および適応症がある。しかし、本発明は、バイオフィルム中に存在する複製期の細菌および複製期ではない細菌の両方を死滅させるのに有効であるため、マイコバクテリア感染症に対して特に有用である。McNabe et al (2012)によって説明されているように、M.アビウムは、細菌のバイオフィルム関連遺伝子の発現を刺激するストレプトマイシンおよびテトラサイクリンなどの抗生物質の存在下でバイオフィルムを形成して、バイオフィルムの量を漸増させる。一度形成されると、バイオフィルムは、2種の異なる細菌集団、すなわち、休止状態の耐性が高い表現型および浮遊性の感受性が高い表現型でできている。実際、吸入リポソームシプロフロキサシンが、耐性の高い休止状態を含む両方の細菌集団を死滅させるのに有効であることは、意外である。このことは、未封入シプロフロキサシンのはるかに低い有効性と対比されるべきである。未封入シプロフロキサシンは、封入シプロフロキサシンよりもずっと速く、気道および肺から消失するため、リポソームシプロフロキサシンと封入シプロフロキサシンのNTMに対する活性の差は、インビボでさらに大きくなる可能性が高いと考えられる。

本発明の製剤は、使い捨ての容器および持ち運び可能な手持ち型の電池式装置、例えばAERx装置(米国特許第5,823,178号、Aradigm, Hayward, CA)を用いて患者に投与されてよい。あるいは、本発明の製剤は、機械的(電子を用いない)装置を用いて実施されてもよい。従来のジェット噴霧器、超音波噴霧器、ソフトミスト吸入器、ドライパウダー吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)、凝縮エアロゾル発生器、および他の方式を含む他の吸入装置が、製剤を送達するのに使用され得る。遊離シプロフロキサシンと封入シプロフロキサシの比率は、噴霧後、一定のままであることが示された;すなわち、もし起これば、封入された抗生物質の一部分を時期尚早に放出する結果を招くと考えられる損傷が、噴霧中にリポソームに起こらなかった。この知見は、以前の文献の報告に基づくと予想外である(Niven RW and Schreier H, 1990)が、この知見により、エアロゾルを吸入する動物またはヒトでは、再現可能な比率の遊離薬物と封入薬物が肺の全体にわたって沈着することが保証される。

エアロゾルは、細孔が約0.25〜6マイクロメートルの範囲の大きさである膜の細孔に薬物を強制的に通すことによって、作製することができる(米国特許第5,823,178号)。細孔がこの大きさである場合、細孔を通って出てきてエアロゾルを生じさせる粒子は、0.5〜12マイクロメートルの範囲の直径を有すると考えられる。薬物粒子は、このサイズ範囲内に粒子を保つように意図された空気流を用いて放出され得る。小さい粒子の作製は、約800〜約4000キロヘルツの範囲の振動周波数を与える振動装置を用いることによって、容易にすることができる。いくつかの態様の目的が、約0.5〜12マイクロメートルの範囲の直径を有するエアロゾル化粒子を提供することであることを念頭に置いて、薬物が放出される細孔の大きさ、振動周波数、圧力などのパラメーターならびに製剤の密度および粘度に基づく他のパラメーターにいくつかの調整を加えてよいことが、当業者には認識されよう。

リポソーム製剤は、低粘度の液体製剤であってよい。薬物それ自体または担体と組み合わせた薬物の粘度は、強制的に製剤を穴の外へ出してエアロゾルを形成できるように、例えば、20〜200psiを用いて、約0.5〜12マイクロメートルの範囲の粒径を好ましくは有するエアロゾルを形成できるように、十分に低いことが望ましい。

1つの態様において、低沸点の揮発性が高い噴射剤が、本発明のリポソームおよび薬学的に許容される賦形と組み合わされる。リポソームは、噴射剤中の懸濁物もしくは乾燥粉末として提供されてよいか、または、別の態様においてリポソームは、噴射剤内で溶液に溶解される。これらの製剤のどちらも、唯一の開口部としてバルブを有する容器の中に容易に含めることができる。噴射剤は揮発性が高い、すなわち沸点が低いため、容器の内容物は加圧下にある。

別の製剤によれば、シプロフロキサシ含有リポソームは、乾燥粉末として単独で提供され、さらに別の製剤によれば、シプロフロキサシ含有リポソームは、溶液製剤として提供される。乾燥粉末は、各送達について、同じ吸気流速測定値および吸気体積測定値のみでの吸入を可能にすることによって、直接的に吸入されてよい。粉末を水性溶媒中に溶解して溶液を作製してもよく、この溶液に多孔膜を通過させて、吸入用エアロゾルを作製する。患者に吸入させ肺内経路を介して送達できるエアロゾル化型のシプロフロキサシン含有リポソームを製造することを可能にする任意の製剤が、本発明に関連して使用され得る。エアロゾル化送達装置と共に使用できる製剤に関する具体的な情報は、Remington's Pharmaceutical Sciences, A. R. Gennaro editor (latest edition) Mack Publishing Companyの中で説明されている。インスリン製剤に関して、Sciarra et al., (1976)の知見に注目することもまた、有用である。低沸点噴射剤が使用される場合、それらの噴射剤は、装置の加圧された缶の内部に入れられ、液体状態で維持される。弁が動かされると、噴射剤が放出され、有効成分が噴射剤と共に缶から押し出される。噴射剤は、周囲雰囲気に曝露されると「急速に気化する」と考えられ、すなわち、噴射剤は直ちに蒸発する。この急速な気化は、極めて急速に起こるため、患者の肺に実際に送達されるのは、ほぼ純粋な有効成分である。

上記に基づき、複数の異なる治療および投与手段が、ひとりの患者を治療するのに使用され得ることが、当業者に理解されると考えられる。したがって、例えば、静脈内シプロフロキサシンまたは抗生物質などとしてこのような医用薬剤を既に与えられている患者は、本発明の製剤の吸入の恩恵を受ける可能性がある。一部の患者は、吸入によってシプロフロキサシン含有リポソーム製剤のみを与えられる場合がある。このような患者は、NTM 肺感染症に罹患していると診断されている可能性があるか、または患者へのシプロフロキサシンのような抗生物質の投与の恩恵を症状が受ける可能性がある医学的状態の症状を有している可能性がある。また、本発明の製剤は、診断に使用されてもよい。

典型的には、患者は、約0.01〜10mg/kg/日の用量のシプロフロキサシン±20％または±10％を与えられる。典型的には、この用量は、エアロゾル装置からの少なくとも1回、好ましくは数回の「ひと吹き」によって投与される。好ましくは、1日当たりの総用量は、1日当たり少なくとも1回投与されるが、1日当たり2つまたはそれ以上の用量に分割されてもよい。一部の患者は、高用量または数日もしくは数週間の期間にわたる頻度がより高い投与と、それに続く、減量した用量もしくは維持用量を用いて、シプロフロキサシンを患者に「十分な程与える」期間によって、利益を得る場合がある。NTMは治療が困難な病態であるため、患者は長期間にわたってそのような治療法を施されることが予想される。

本発明は、本発明の製剤が、注射、吸入、経鼻投与、経口、およびIV輸注など任意の公知の投与経路によって投与される、非結核性抗酸菌を処置する方法を含む。とはいえ、本発明は肺中のバイオフィルムの形態での感染症の治療に特に適しているため、好ましい投与方法は、吸入によるものである。本発明の製剤は、いくつかの理由から、肺中でバイオフィルムとして形成される感染症の根絶に特に適している。最初に、本発明のリポソームは、90％またはそれ以上、95％またはそれ以上、98％またはそれ以上のリポソームが構造的完全性を維持しており、それによって、噴霧器または多孔膜の細孔を通過させることのいずれかによってエアロゾル化された後、その内部に入れられている薬物製剤を維持するという点で、エアロゾル化の際に特に破裂しにくい。製剤が肺組織に到達した後、比較的低いpH、例えば6.5またはそれ未満、6.0またはそれ未満、5.5またはそれ未満、5.0またはそれ未満の水性担体であってよい溶媒担体中に溶解された薬物は、その担体中では即時放出されかつ細菌と接触する。その後、リポソームが溶解するか、または透過性が高まり、リポソーム内に封入された製剤が放出される。その後、リポソームの内側にナノ結晶が存在する場合、ナノ結晶はゆっくりと溶解する。したがって、本発明の製剤は、1日に1回送達され得、シプロフロキサシンのような薬物の長期間にわたる制御放出のために提供され得る。

バイオフィルムは、いくつかの要因から、抗生物質による根絶に対して耐性である。第1に、それらは通常、クラスとしてアミノグリコシドを含むいくつかの抗生物質がバイオフィルム中に拡散するのを阻害する、密集した菌体外多糖マトリックスに取り囲まれている。第2に、急成長する細菌細胞の外層もまた、バイオフィルムの内側の細胞を抗生物質曝露から「保護する」。第3に、バイオフィルムの内側の細胞は酸素が欠乏しており、それゆえ、ゆっくりと成長するか、または休眠状態であり、したがって、抗生物質曝露に対する感受性が本質的に低い。最後に、殺菌に対して不死身である「存続生物」細胞の存在に関する証拠があり、未知の他の耐性メカニズムもまた、存在する可能性がある。

実験
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために発表され、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を限定することも意図せず、下記の実施例が、実施される唯一の実験であると示すことも意図しない。使用する数値(例えば、量、温度など)に関しては正確性を徹底するよう努力を払ったが、いくつかの実験上の誤差およびずれは考慮されるべきである。別段の定めがない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度の単位は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

実施例1
封入シプロフロキサシンの製造:
水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)(70.6mg/mL)、すなわち天然ダイズレシチン(SPC)の完全に水素添加された半合成誘導体、およびコレステロール(29.4mg/mL)からなる、リポソーム中に、シプロフロキサシン(50mg/mL)を封入する。脂質を、75〜120nmの平均粒径を有する二重層の構造にする。無菌懸濁液を、等張緩衝液(25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0、300mOsm/kg)に懸濁し、吸入によって投与する。これらのリポソームシプロフロキサシン調製物は、約1％の未封入シプロフロキサシンを含んだ。

製造工程は、以下の段階を含む。
1. 緩衝液の調製。
2. 脂質成分の計量。
3. 溶媒(tBuOH:EtOH:dH2O/49:49:2)中への脂質の溶解。
4. 脂質の溶媒溶液を、メチルアミンサルフェート緩衝液(10％v/v溶媒)と混合して、脂質濃度30mg/mLのメチルアミンサルフェート緩衝液が封入された多重層小胞(MLV)を形成させる段階。
5. 積み重ねられた4枚の孔径80nmのポリカーボネートフィルターから押し出して、大型の単層小胞(LUV)を作製する段階。2回目の押し出し通過を実施して、平均径が約100nmのリポソームを作製した。
6. 限外ろ過により、リポソームを約55mg/mLの総脂質に濃縮する段階。
7. 10倍体積量の緩衝液(145mM NaCl、5mMヒスチジン、pH6.0)に対するダイアフィルトレーションによって、エタノールを除去し、膜内外のpH勾配を生じさせる段階。
8. HPLCによる脂質濃度の測定。
9. リポソーム懸濁液を50℃まで加熱し、撹拌しながら粉末状シプロフロキサシン(脂質の総質量の60％)をゆっくりと添加する段階。シプロフロキサシンを漸増的に添加し(40分の期間にわたって4分毎に質量の10％)、その産物を50℃で20分間インキュベートし、続いて、最後のアリコートを添加して、薬物添加工程を完了させる。
10. 3倍体積量の145mM NaCl、5mMアセタート、pH4.0に対して、シプロフロキサシンを詰めたリポソームのダイアフィルトレーションを行って、遊離シプロフロキサシンは溶解できる条件下で未封入シプロフロキサシンを除去する段階。
11. 5倍体積量の145mM NaCl、25mMヒスチジン、pH6.0に対して、シプロフロキサシンを詰めたリポソームのダイアフィルトレーションを行って、残存する未封入シプロフロキサシンがあれば除去し、さらに、残りの溶媒レベルを低下させ、外部緩衝液を所望の最終製品緩衝液と交換する段階。
12. 製剤を限外ろ過して、シプロフロキサシン濃度を50mg/mLにする段階(工程内検査が必要とされる)。
13. 0.45/0.2μmフィルターシートに通してリポソームを前ろ過して、滅菌グレードフィルターを詰まらせる可能性がある微粒子を除去する段階。使用されるフィルターは、実際に滅菌グレードフィルターであるが;しかし、それらは、滅菌ろ過のための使用とは相容れない高圧で使用される。
14. 0.2μm滅菌グレードフィルターを通す、余分な(Redundant)ろ過。
15. 試料を瓶詰め保存および包装する段階。

全体的な製造スキームを図1に示す。

実施例2:
バイオフィルム中のM.アビウムおよびM.アブセサスに対するリポソームシプロフロキサシンの活性
リポソーム封入シプロフロキサシンおよび遊離シプロフロキサシンの調製:10mM酢酸ナトリウム、pH3.2中の濃度20mg/mLの未封入または「遊離」シプロフロキサシンの溶液を調製した。実施例1に従って、25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0中50mg/mLシプロフロキサシンの濃度でリポソーム封入シプロフロキサシン調製物を調製した。

感染モデルの説明:遊離シプロフロキサシンを含む製剤およびリポソーム封入シプロフロキサシンを含む製剤、ならびに空リポソーム対照および緩衝液対照を、4日間、96ウェルプレート上のM.アビウムおよびM.アブセサスバイオフィルムモデルにおいて評価した。

用量範囲試験のデザイン:1種類の濃度の遊離シプロフロキサシンもしくはリポソームシプロフロキサシン(50もしくは100mcg/mL)、対照としての空リポソーム、または陰性対照としての緩衝液単独を、3つのモデルで評価した。コロニー形成を、最初に、次いで4日目に報告した。

結果:表1は、各群のコロニー形成を示す。リポソームシプロフロキサシンによる処置は、これらの各モデルにおいて統計学的に有意な効果をもたらすことが判明したのに対し、シプロフロキサシン単独では、統計学的に有意な効果はなかった。

（表１）バイオフィルムコロニー形成

結論:リポソームシプロフロキサシン製剤のみが、バイオフィルム中のマイコバクテリアの死滅を示した。他のリポソーム抗生物質製剤を含む他の抗生物質は、マイコバクテリア感染症のバイオフィルムモデルにおいて細菌数を減少させる(すなわち、死滅させる)能力を示していなかったため、これは、前例のないことである。マイコバクテリアのバイオフィルムマトリックスによって提供される物理的保護、ならびに抗生物質を含む環境ストレスに対する表現型耐性(Islam et al.)が原因で、多数の要因により、休止状態の細菌、例えば、バイオフィルム中に存在するものを死滅させることは困難である可能性が高い。したがって、マイコバクテリアバイオフィルム感染症の治療は、極めて困難である(Islam et al.)。したがって、表1に示した結果は、これらのリポソームシプロフロキサシン製剤が休眠状態または休止状態の細菌の実質的かつ有効な死滅を提供したため、驚くべきものである。これは、複製期の細菌および複製期ではない(休止状態の)細菌から構成されるのが典型的であるNTM感染症の治療にとって不可欠な構成要素である。Islamらは、多数のマイコバクテリア種、最も顕著にはM.アビウムが、臨床環境だけでなく自然環境において多細胞群集として存在する(すなわちバイオフィルム)ことが判明していると述べ始めている。これらのマイコバクテリア群集のそれらの自然生息地での蔓延は、界面活性剤を含まないインビトロ培養物中でごく普通に観察されるマイコバクテリアの集合体および菌膜が、有機的な薬物耐性群集の遺伝学的にプログラムされた発達を示すという証拠によって、つまりバイオフィルムの重要な特徴によってさらに認識することができる。

実施例3
マクロファージ中のM.アビウムに対するリポソームシプロフロキサシンの活性
リポソーム封入シプロフロキサシンおよび遊離シプロフロキサシンの調製:10mM酢酸ナトリウム、pH3.2中の濃度20mg/mLの未封入または「遊離」シプロフロキサシンの溶液を調製した。実施例1に従って、25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0中50mg/mLシプロフロキサシンの濃度でリポソーム封入シプロフロキサシン調製物を調製した。THP-1ヒトマクロファージモデルにおいて適切な濃度に試料を希釈した。

感染モデルの説明:遊離シプロフロキサシンを含む製剤、リポソーム封入シプロフロキサシンを含む製剤、シプロフロキサシンのナノ結晶を含むリポソームを含む製剤、ならびに緩衝液対照を、THP-1ヒトマクロファージ中のM.アビウム細菌株において評価し、かつマクロファージにおける感染を4日後に測定した。

試験のデザイン:1種類の濃度の遊離シプロフロキサシンもしくはリポソームシプロフロキサシン(20mcg/mL)または陰性対照としての緩衝液単独を、2つのモデルで評価した。細菌のコロニー形成を、最初に、次いで4日目に報告した。

結果:表2は、各群のコロニー形成を示す。リポソームシプロフロキサシンによる処置は、これらの各マクロファージ感染モデルにおいて統計学的に有意な効果をもたらすことが判明したのに対し、シプロフロキサシン単独では、統計学的に有意な効果はなかった。

（表２）マクロファージ中のM.アビウムのコロニー形成

結論:どちらのリポソームシプロフロキサシン製剤も、M.アビウムマクロファージ感染モデルに対して、遊離シプロフロキサシンより優れた活性を有している。

実施例4
マクロファージ中のM.アブセサスに対するリポソームシプロフロキサシンの活性
リポソーム封入シプロフロキサシンおよび遊離シプロフロキサシンの調製:10mM酢酸ナトリウム、pH3.2中の濃度20mg/mLの未封入または「遊離」シプロフロキサシンの溶液を調製した。実施例1に従って、25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0中50mg/mLシプロフロキサシンの濃度でリポソーム封入シプロフロキサシン調製物を調製した。THP-1ヒトマクロファージモデルにおいて適切な濃度に試料を希釈した。

感染モデルの説明:遊離シプロフロキサシンを含む製剤、リポソーム封入シプロフロキサシンを含む製剤、空リポソームを含む製剤、ならびに緩衝液対照を、THP-1ヒトマクロファージ中のM.アブセサス細菌株において評価し、かつマクロファージにおける感染を4日後に測定した。

用量範囲試験のデザイン:1種類の濃度の遊離シプロフロキサシンもしくはリポソームシプロフロキサシン(10または20mcg/mL)、空リポソーム、または陰性対照としての緩衝液単独を2つのM.アブセサスモデルで評価した。細菌のコロニー形成を、最初に、次いで4日目に報告した。

結果:表3は、各群のコロニー形成を示す。リポソームシプロフロキサシンによる処置は、これらの各マクロファージ感染モデルにおいて統計学的に有意な効果をもたらすことが判明したのに対し、シプロフロキサシン単独では、統計学的に有意な効果はなかった。

（表３）マクロファージ中のM.アビウムのコロニー形成

結論:リポソームシプロフロキサシン製剤は、M.アブセサスマクロファージ感染モデルに対して、遊離シプロフロキサシンより優れた活性を有している。

実施例5
マクロファージ中のM.アブセサスに対するリポソームシプロフロキサシンの活性
リポソーム封入シプロフロキサシンおよび遊離シプロフロキサシンの調製:10mM酢酸ナトリウム、pH3.2中の濃度20mg/mLの未封入または「遊離」シプロフロキサシンの溶液を調製した。実施例1に従って、25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0中50mg/mLシプロフロキサシンの濃度でリポソーム封入シプロフロキサシン調製物を調製した。THP-1ヒトマクロファージモデルにおいて適切な濃度に試料を希釈した。

感染モデルの説明:遊離シプロフロキサシン含む製剤、リポソーム封入シプロフロキサシン含む製剤、空リポソームを含む製剤、ならびに緩衝液対照を、THP-1ヒトマクロファージ中のM.アブセサス細菌株において評価し、かつマクロファージにおける感染を4日後に測定した。

試験のデザイン:1種類の濃度の遊離シプロフロキサシンもしくはリポソームシプロフロキサシン(200mcg/mL)、空リポソーム、または陰性対照としての緩衝液単独を、2つのM.アブセサスモデルで評価した。細菌のコロニー形成を、最初に、次いで4日目に報告した。

結果:表4は、各群のコロニー形成を示す。リポソームシプロフロキサシンによる処置は、これらの各マクロファージ感染モデルにおいて統計学的に有意な効果をもたらすことが判明したのに対し、未封入シプロフロキサシン単独では、統計学的に有意な効果はなかった。

（表４）マクロファージ中のM.アビウムまたはM.アブセサスのコロニー形成

結論:M.アブセサスおよびM.アビウムのマクロファージ感染モデルにおいて、高濃度のリポソームシプロフロキサシンの方が、遊離シプロフロキサシンより有効であった。

実施例6
C57BL/6マウスにおけるM.アビウムに対するリポソームシプロフロキサシンの活性
リポソーム封入シプロフロキサシンおよび遊離シプロフロキサシンの調製:10mM酢酸ナトリウム、pH3.2中の濃度20mg/mLのシプロフロキサシンHCl(18mg/mLシプロフロキサシンに相当)の未封入または「遊離」シプロフロキサシンの溶液を調製した。実施例1に従って、25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0中50mg/mLシプロフロキサシンHCl(45mg/mLシプロフロキサシンに相当)の濃度でリポソーム封入シプロフロキサシン調製物を調製した。調製物「Pulmaquin」(吸入用の二重放出シプロフロキサシン(Dual-Release Ciprofloxacin for Inhalation)、DRCFI)は、遊離シプロフロキサシンおよびリポソーム封入シプロフロキサシンの体積比1:1の混合物である(シプロフロキサシンHClの濃度は35mg/mL)。マウスに投薬するのに適切な濃度に試料を希釈した。すなわち、Pulmaquinは、約35mg/mLのシプロフロキサシンHClを含み、25mg/mLは封入型であり、10mg/mLは未封入型または遊離型である。これは、内訳として22.5mg/mLが封入シプロフロキサシンであり9mg/mLが未封入または遊離シプロフロキサシンである、31.5mg/mLシプロフロキサシンと同等である。PulmaquinのpHは、4〜5の間で、未封入薬物のためのpH3.2と封入薬物のためのpH6.0の中間である。

感染モデルの説明:遊離シプロフロキサシンを含む製剤、リポソーム封入シプロフロキサシンを含む製剤、Pulmaquin、ならびに空リポソーム対照および生理食塩水対照を、10⁷個の量のマイコバクテリウム・アビウム亜種ホミニスイス(MAH)MAC104株を鼻腔内滴下することによって感染させたC57BL/6マウスにおいて評価し、かつ感染を1週間進行させた。

試験のデザイン:感染後1週間目に、生理食塩水対照、空リポソーム対照、遊離シプロフロキサシン、リポソーム封入シプロフロキサシン、またはPulmaquinのいずれかを0.33、0.66、および1mg/kgのシプロフロキサシン用量で3週間、毎日用いて、鼻腔内滴下による処置を開始した。空リポソーム対照の場合、空リポソームの用量は、用量1mg/kgのリポソーム封入シプロフロキサシンの脂質含有量と一致させた。マウスを捕獲し、肺中の細菌量を定量するために、肺および脾臓を7H10寒天上に広げた(plated)。実験グループ1つにつき、10匹のマウスを使用した。

結果:表5は、肺および脾臓の細菌量(コロニー形成単位、CFU)を示す。空リポソームおよび遊離シプロフロキサシンには、生理食塩水対照と比べて、マウスの肺におけるMAHの増殖に対して有意な効果がなかったのに対し、1mg/kgのリポソーム封入シプロフロキサシンまたはPulmaquinの投与は、それぞれ(1.06±0.5)×10⁷から(2.25±0.4)×10⁶(-79％)および(2.47±0.6)×10⁶(-77％)への、CFUの有意な減少を伴った(両方ともp<0.05、生理食塩水または空リポソームに対する)。0.33mg/kgおよび0.67mg/kgのリポソーム封入シプロフロキサシンまたはPulmaquinによる処置もまた、肺中のCFUを有意に減少させた(-37〜-67％)。

（表５）MAH感染マウスにおける肺中および脾臓中の細菌量(CFU)

*生理食塩水/空と比べてp<0.05
**遊離シプロフロキサシンと比べてp<0.05

結論:MAH肺感染症マウスをリポソーム封入シプロフロキサシンまたはPulmaquinで3週間、鼻腔内処置すると、肺中のMAH量が有意に減少した。

実施例7
マウスにおけるM.アブセサスに対するリポソームシプロフロキサシンの活性
リポソーム封入シプロフロキサシンおよび遊離シプロフロキサシンの調製:10mM酢酸ナトリウム、pH3.2中の濃度20mg/mLの未封入または「遊離」シプロフロキサシンHCl(18mg/mLシプロフロキサシンに相当)の溶液を調製した。実施例1に従って、25mMヒスチジン、145mM NaCl、pH6.0中50mg/mLシプロフロキサシンHCl(45mg/mLシプロフロキサシンに相当)の濃度でリポソーム封入シプロフロキサシン調製物を調製した。調製物「Pulmaquin」(吸入用の二重放出シプロフロキサシン(Dual-Release Ciprofloxacin for Inhalation)、DRCFI)は、遊離シプロフロキサシンおよびリポソーム封入シプロフロキサシン(シプロフロキサシンHClの濃度は35mg/mL、31.5mg/mLシプロフロキサシンに相当)の体積比1:1の混合物である。マウスに投薬するのに適切な濃度に試料を希釈した。

感染モデルの説明:遊離シプロフロキサシンを含む製剤、リポソーム封入シプロフロキサシンを含む製剤、Pulmaquin、ならびに空リポソーム対照および生理食塩水対照を、国立衛生研究所の患者に由来する臨床分離株である、緩衝液50μL(ハンクス平衡塩類溶液)中(5.4±0.3)×10⁷個の量のマイコバクテリウム・アブセサス株MA26を鼻腔内滴下することによって感染させたC57 BL/6J-lysbg-J/Jマウスにおいて評価し、かつ感染を1週間進行させた。

試験のデザイン:感染後1週間目に、生理食塩水対照、空リポソーム対照、遊離シプロフロキサシン、リポソーム封入シプロフロキサシン、またはPulmaquinのいずれかを1mg/kgのシプロフロキサシン用量で3週間または6週間、毎日用いて、鼻腔内滴下による処置を開始した。空リポソーム対照の場合、空リポソームの用量は、用量1mg/kgのリポソーム封入シプロフロキサシンの脂質含有量と一致させた。マウスを捕獲し、肺中の細菌量を定量するために、肺および脾臓を7H10寒天上に広げた(plated)。実験グループ1つにつき、10匹のマウスを使用した。

結果:表6は、肺および脾臓の細菌量(コロニー形成単位、CFU)を示す。空リポソームおよび遊離シプロフロキサシンには、未処置対照と比べて、マウスの肺におけるM.アブセサスの増殖に対して有意な効果がなかったのに対し、リポソーム封入シプロフロキサシンまたはPulmaquinの6週間の投与は、それぞれ、6週目に未処置の場合の(5.4±0.6)×10⁵から(1.4±0.5)×10³(-99.7％)および(3.0±0.4)×10³(-99.4％)への、CFUの有意な減少を伴った(両方ともp<0.05、未処置対照に対する)。リポソーム封入シプロフロキサシンまたはPulmaquinによる3週間の処置もまた、それぞれ、6週目の未処置の場合の(5.4±0.6)×10⁵から(2.6±0.6)×10⁴(-95.2％)および(2.1±0.4)×10⁴ (-96.1％)への、CFUの有意な減少を伴った(両方ともp<0.05、未処置対照に対する)。

（表６）M.アブセサス感染マウスにおける肺中および脾臓中の細菌量(CFU)

(*)対照と比べてp<0.05

結論:M.アブセサス肺感染症マウスをリポソーム封入シプロフロキサシンまたはPulmaquinで3週間または6週間、鼻腔内処置すると、肺中の細菌量が有意に減少した。

参照文献
以下のそれぞれは参照により組み入れられる。

[本発明1001]
製剤がリポソームを含み、該リポソームが、
脂質二重層;
凍結保存剤;および
100nmまたはそれ未満の寸法を有する、該脂質二重層によって取り囲まれた薬学的に活性な抗感染薬物のナノ結晶
を含む、非結核性抗酸菌感染症の治療における該製剤の使用。
[本発明1002]
前記凍結保存剤が、スクロースおよびトレハロースからなる群より選択されるポリオールであり;かつ
前記リポソームが表面活性剤をさらに含む、本発明1001の使用。
[本発明1003]
前記製剤が、
薬学的に許容される担体
をさらに含む、本発明1001または1002の使用。
[本発明1004]
前記担体中に溶解された薬学的に活性な抗感染薬物
をさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの使用。
[本発明1005]
前記リポソームが液状抗感染薬物中に分散されている、該液状抗感染薬物
をさらに含む、本発明1001または1002の使用。
[本発明1006]
前記抗感染薬物が、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、β-ラクタム、β-ラクタム阻害物質およびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン系抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス(butoconazole ciclopirax)、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、ならびにそれらの組合せを含む群より選択され、かつ
前記脂質二重層が、脂肪酸;リゾ脂質;スフィンゴ脂質;スフィンゴミエリン;糖脂質;グルコリピド;スフィンゴ糖脂質;パルミチン酸;ステアリン酸;アラキドン酸;オレイン酸;スルホン化単糖、スルホン化二糖、スルホン化オリゴ糖、またはスルホン化多糖を有する脂質;エーテル結合およびエステル結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、ジアセチルホスファート、ステアリルアミン、カルジオリピン、リン脂質、非対称アシル鎖を有する合成リン脂質;ならびに共有結合ポリマーを有する脂質からなる群より選択される脂質から構成されている、本発明1004または1005の使用。
[本発明1007]
前記脂質二重層がHSPCおよびコレステロールから構成されており;
前記凍結保存剤が、スクロースおよびトレハロースからなる群より選択され;
前記表面活性剤が、ポリソルベート20およびBRIJ20からなる群より選択され;
前記抗感染薬物がシプロフロキサシンであり;かつ
前記リポソームが、1:10〜10:1(w/w)の間の比で存在するポリオールおよびホスファチジルコリン豊富リン脂質から構成されており;かつ
該表面活性剤が0.01％〜1％の間の量で存在する、本発明1004〜1006のいずれかの使用。
[本発明1008]
患者の肺への吸入に適した1マイクロメートル〜12マイクロメートルの範囲の空気力学的直径を有するエアロゾル化粒子を生成するように前記製剤がエアロゾル化されており;
エアロゾル化された該製剤が、溶液中20mg/mL〜80mg/mLのシプロフロキサシン濃度で遊離シプロフロキサシンを含む液体担体、溶液中のリポソーム非封入シプロフロキサシン、および、該リポソーム内部に封入されたナノ結晶としてのシプロフロキサシンから構成されている、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1009]
前記エアロゾル化粒子が、2マイクロメートル〜8マイクロメートルの空気力学的直径を有し、前記リポソームが、20ナノメートル〜1マイクロメートルの直径を有し、かつ前記ナノ結晶が、10ナノメートルまたはそれ未満の寸法を有し;かつ
前記シプロフロキサシンが、30mg/mL〜70mg/mLの濃度で前記溶液中に存在する、本発明1008の使用。
[本発明1010]
前記シプロフロキサシンが、40mg/mL〜60mg/mLの濃度で前記溶液中に存在し;
前記リポソームが、単層であり、かつエアロゾル化後に90％またはそれ以上のレベルで構造的完全性を維持しており;かつ
7日〜56日の期間にわたって1日1回毎日前記エアロゾル化された製剤の吸入を繰り返すことによって前記使用が実施され、かつ前記感染症がバイオフィルム内に存在する、本発明1009の使用。
[本発明1011]
98％またはそれ以上の前記リポソームが、構造的完全性を維持しており、かつ、前記製剤をエアロゾル化した後にシプロフロキサシンのナノ結晶を封入し続けている、本発明1008〜1010のいずれかの使用。
[本発明1012]
前記感染症が前記患者の肺におけるバイオフィルムでの感染症であり、かつ、前記リポソームが、ある期間にわたってかつバイオフィルム感染症を治療するのに有効な速度で、薬物を放出する、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1013]
前記感染症が、マイコバクテリア、P.エルギノーサ(P.aeruginosa)、およびF.ツラレンシス(F.tularensis)からなる群より選択される微生物の感染症であり;かつ
前記リポソームが、約30対70の割合(±10％)のコレステロールおよび水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)すなわち天然ダイズレシチンの完全に水素添加された半合成誘導体から構成されており;
酢酸ナトリウムおよび等張緩衝液から構成された、経肺送達に適した賦形剤を、前記製剤がさらに含み;かつ
95％またはそれ以上の該リポソームが、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ肺組織に接触後に1時間当たり1％〜8％のシプロフロキサシン放出速度をもたらす、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1014]
前記リポソームが、29.4対70.6の割合のコレステロールおよび水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)を含み、かつ単層であり、かつ、98％またはそれ以上の該リポソームが、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ1時間当たり2％〜6％のシプロフロキサシン放出速度をもたらす、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1015]
前記リポソームが、0.1〜0.3％のポリソルベート20および200〜400mg/mLのスクロースからさらに構成されており;
前記エアロゾル化および前記吸入が、7日〜56日の期間にわたって毎日1回繰り返され;かつ
前記製剤が、75mg〜300mgのシプロフロキサシンを含む、前記本発明のいずれかの使用。
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、下記により完全に説明する製剤および方法論の詳細を読むと、当業者に明らかになると考えられる。

Claims (15)

1. 製剤がリポソームを含み、該リポソームが、
   脂質二重層;
   凍結保存剤;および
   100nmまたはそれ未満の寸法を有する、該脂質二重層によって取り囲まれた薬学的に活性な抗感染薬物のナノ結晶
   を含む、非結核性抗酸菌感染症の治療における該製剤の使用。
2. 前記凍結保存剤が、スクロースおよびトレハロースからなる群より選択されるポリオールであり;かつ
   前記リポソームが表面活性剤をさらに含む、請求項1に記載の使用。
3. 前記製剤が、
   薬学的に許容される担体
   をさらに含む、請求項1または2に記載の使用。
4. 前記担体中に溶解された薬学的に活性な抗感染薬物
   をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記リポソームが液状抗感染薬物中に分散されている、該液状抗感染薬物
   をさらに含む、請求項1または2に記載の使用。
6. 前記抗感染薬物が、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、β-ラクタム、β-ラクタム阻害物質およびβ-ラクタマーゼ阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン系抗真菌物質、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス(butoconazole ciclopirax)、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフタート、ナフチフィン、テルビナフィン、ならびにそれらの組合せを含む群より選択され、かつ
   前記脂質二重層が、脂肪酸;リゾ脂質;スフィンゴ脂質;スフィンゴミエリン;糖脂質;グルコリピド;スフィンゴ糖脂質;パルミチン酸;ステアリン酸;アラキドン酸;オレイン酸;スルホン化単糖、スルホン化二糖、スルホン化オリゴ糖、またはスルホン化多糖を有する脂質;エーテル結合およびエステル結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、ジアセチルホスファート、ステアリルアミン、カルジオリピン、リン脂質、非対称アシル鎖を有する合成リン脂質;ならびに共有結合ポリマーを有する脂質からなる群より選択される脂質から構成されている、請求項4または5に記載の使用。
7. 前記脂質二重層がHSPCおよびコレステロールから構成されており;
   前記凍結保存剤が、スクロースおよびトレハロースからなる群より選択され;
   前記表面活性剤が、ポリソルベート20およびBRIJ20からなる群より選択され;
   前記抗感染薬物がシプロフロキサシンであり;かつ
   前記リポソームが、1:10〜10:1(w/w)の間の比で存在するポリオールおよびホスファチジルコリン豊富リン脂質から構成されており;かつ
   該表面活性剤が0.01％〜1％の間の量で存在する、請求項4〜6のいずれか一項に記載の使用。
8. 患者の肺への吸入に適した1マイクロメートル〜12マイクロメートルの範囲の空気力学的直径を有するエアロゾル化粒子を生成するように前記製剤がエアロゾル化されており;
   エアロゾル化された該製剤が、溶液中20mg/mL〜80mg/mLのシプロフロキサシン濃度で遊離シプロフロキサシンを含む液体担体、溶液中のリポソーム非封入シプロフロキサシン、および、該リポソーム内部に封入されたナノ結晶としてのシプロフロキサシンから構成されている、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記エアロゾル化粒子が、2マイクロメートル〜8マイクロメートルの空気力学的直径を有し、前記リポソームが、20ナノメートル〜1マイクロメートルの直径を有し、かつ前記ナノ結晶が、10ナノメートルまたはそれ未満の寸法を有し;かつ
   前記シプロフロキサシンが、30mg/mL〜70mg/mLの濃度で前記溶液中に存在する、請求項8に記載の使用。
10. 前記シプロフロキサシンが、40mg/mL〜60mg/mLの濃度で前記溶液中に存在し;
    前記リポソームが、単層であり、かつエアロゾル化後に90％またはそれ以上のレベルで構造的完全性を維持しており;かつ
    7日〜56日の期間にわたって1日1回毎日前記エアロゾル化された製剤の吸入を繰り返すことによって前記使用が実施され、かつ前記感染症がバイオフィルム内に存在する、請求項9に記載の使用。
11. 98％またはそれ以上の前記リポソームが、構造的完全性を維持しており、かつ、前記製剤をエアロゾル化した後にシプロフロキサシンのナノ結晶を封入し続けている、請求項8〜10のいずれか一項に記載の使用。
12. 前記感染症が前記患者の肺におけるバイオフィルムでの感染症であり、かつ、前記リポソームが、ある期間にわたってかつバイオフィルム感染症を治療するのに有効な速度で、薬物を放出する、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記感染症が、マイコバクテリア、P.エルギノーサ(P.aeruginosa)、およびF.ツラレンシス(F.tularensis)からなる群より選択される微生物の感染症であり;かつ
    前記リポソームが、約30対70の割合(±10％)のコレステロールおよび水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)すなわち天然ダイズレシチンの完全に水素添加された半合成誘導体から構成されており;
    酢酸ナトリウムおよび等張緩衝液から構成された、経肺送達に適した賦形剤を、前記製剤がさらに含み;かつ
    95％またはそれ以上の該リポソームが、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ肺組織に接触後に1時間当たり1％〜8％のシプロフロキサシン放出速度をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
14. 前記リポソームが、29.4対70.6の割合のコレステロールおよび水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)を含み、かつ単層であり、かつ、98％またはそれ以上の該リポソームが、エアロゾル化された場合に完全性を維持しており、かつ1時間当たり2％〜6％のシプロフロキサシン放出速度をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
15. 前記リポソームが、0.1〜0.3％のポリソルベート20および200〜400mg/mLのスクロースからさらに構成されており;
    前記エアロゾル化および前記吸入が、7日〜56日の期間にわたって毎日1回繰り返され;かつ
    前記製剤が、75mg〜300mgのシプロフロキサシンを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。

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