JP2017509669A

JP2017509669A - 多重特異性抗体の軽鎖誤対合を検出するための方法

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Publication number: JP2017509669A
Application number: JP2016560359A
Authority: JP
Inventors: マイケルモルホイ; マクシミリアンケーニッヒ; ヴィンセントラライレット; カチャモンタン; ビアンカグリュンワルダー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2017-04-06
Anticipated expiration: 2035-04-01
Also published as: CN113092788A; US20170115304A1; CN106164288A; EP4570917A3; SG10202107077QA; WO2015150446A1; US20200103413A1; EP3126389B1; EP4570917A2; KR20160140723A; SG11201608054YA; JP6666262B2; US11486882B2; KR102376287B1; EP3126389A1

Abstract

多重特異性抗体の軽鎖対合を解析するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用を開示する。

Description

タンパク質限定分解消化およびESI-MS解析に基づく、多重特異性抗体を調製する際の軽鎖誤対合を判定するための方法を、本明細書において報告する。本方法は、品質管理または細胞株選択のために使用することができる。

発明の背景
1995年に、Yamaguchiら(J. Immunol. Meth. 181 (1995) 259-267)（非特許文献1）は、リシルエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、メタロエンドペプチダーゼ、およびV8プロテアーゼを用いてマウス免疫グロブリンGを高度に特異的にタンパク質分解して断片化するための方法を報告した。この方法では、検討した反応条件のもとで、クロストリパイン、リシルエンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、およびV8プロテアーゼは、ヒンジ領域のIgG1およびIgG1-CMを選択的に切断することができなかった。

Matsudaら(FEBS Lett. 473 (2000) 349-357)（非特許文献2）は、免疫グロブリンGのFc領域のオリゴ糖の対合を判定する目的で、Fcに結合しているグリコフォームに関する情報をMSによって得るために、Lys-Cを用いてFc断片を調製するための方法を報告した。

Villanuevaら(J. Mass Spectrom. 37 (2002) 974-984)（非特許文献3）は、非特異的エキソプロテアーゼをマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF MS)と一緒に使用することに基づく、タンパク質の二次構造要素を両端、すなわちN末端およびC末端から迅速に位置付けるためのタンパク質限定分解方法を報告した。

WO2005/073732（特許文献1）では、高分子量のタンパク質を解析する方法、具体的には、抗体を含む高分子量タンパク質を解析する逆相LC/MS法が報告されている。

WO2006/047340（特許文献2）は、カラムによって単離したポリペプチド調製物を還元/酸化試薬およびカオトロピック剤にさらす(subjecting)ことおよび前記接触によって生成させたリフォールディングした活性タンパク質を単離することに関する。活性タンパク質は、Fcドメインを含むポリペプチドまたは断片を含む、高分子量タンパク質であり得る。

Kleemannら(Anal. Chem. 80 (2008) 2001-2009)（非特許文献4）は、LC-MSと組み合わせたタンパク質限定分解による、IgG1免疫グロブリンおよびペプチド-Fc融合タンパク質の特徴付けを報告した。エンドプロテイナーゼLys-Cを用いるタンパク質限定分解を適用すると、このリジン残基のC末端が主に切断された。

WO2005/073732 WO2006/047340

Yamaguchiら、J. Immunol. Meth. 181 (1995) 259-267 Matsudaら、FEBS Lett. 473 (2000) 349-357 Villanuevaら、J. Mass Spectrom. 37 (2002) 974-984 Kleemannら、Anal. Chem. 80 (2008) 2001-2009

完全な多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定することは、同重体の質量干渉に妨げられるため、多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定するためには、MS解析の前に(多重特異性)抗体のタンパク質限定分解が実施されなければならないことが判明している。

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、多重特異性抗体の軽鎖対合を解析するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用である。

本明細書において報告される1つの局面は、多重特異性抗体を産生する哺乳動物細胞を選択するための、組換え哺乳動物細胞によって産生される多重特異性抗体の、タンパク質分解酵素による限定消化の使用である。

前述のすべての局面の1つの態様において、解析/判定/選択は、消化された抗体の質量分析の結果を用いることによる。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、多重特異性抗体中の軽鎖対合を判定するための方法である:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法である:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定し、それによって軽鎖誤対合を判定する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、多重特異性抗体を産生する組換え哺乳動物細胞を選択するための方法である:
a)すべての細胞が同じ多重特異性抗体を産生する多数の組換え哺乳動物細胞からなる組換え哺乳動物細胞のクローン集団によって産生される多重特異性抗体を含む試料を個々に、一定期間、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、
c)段階b)の結果から、各クローン細胞集団について多重特異性抗体の軽鎖誤対合の存在を判定する段階、および
d)段階c)の結果に基づいて、多重特異性抗体を産生する組換え細胞を選択する段階。

すべての局面の1つの態様において、タンパク質分解酵素は、Lys-C、プラスミン、Asp-N、Arg-C、Glu-C、Ides、ペプシン、およびキモトリプシンからなる群より選択される。

1つの態様において、多重特異性抗体は二価抗体である。

すべての局面の1つの好ましい態様において、タンパク質分解酵素は、Lys-Cまたはプラスミンである。

1つの態様において、多重特異性抗体は、三価または四価の抗体である。1つの態様において、多重特異性抗体は、2本の軽鎖および2本の重鎖を含む完全長抗体であり、重鎖のC末端に、部分なし、Fv断片、Fab断片、scFv断片、およびscFab断片からなる群より選択される互いとは無関係な部分が、直接的にまたはペプチドリンカーを介して結合されている、完全長抗体である。

抗体が、重鎖のC末端に結合部位も結合している四価抗体である場合、2種のタンパク質分解酵素を用いる二重消化が必要とされる可能性がある。

1つの態様において、多重特異性抗体は、三価または四価の多重特異性抗体であり、方法は、2種のタンパク質分解酵素の混合物と共にインキュベートすることによる二重消化を含む。

1つの態様において、タンパク質分解酵素の混合物は、プラスミンおよびIdesである。1つの態様において、タンパク質分解酵素の混合物は、Lys-CおよびIdesである。

エフェクター機能を失っている(effector silent)抗体(L234A変異、L235A変異)の場合、Idesでは切断されず、ペプシンを選択しなければならない。

1つの態様において、タンパク質分解酵素の混合物は、プラスミンおよびペプシンである。1つの態様において、タンパク質分解酵素の混合物は、Lys-Cおよびペプシンである。

1つの好ましい態様において、多価抗体は二重特異性抗体である。

すべての局面の1つの態様において、インキュベートする段階は、最長で60分間である。すべての局面の1つの態様において、インキュベートする段階は、20分〜60分間である。すべての局面の1つの態様において、インキュベートする段階は、35分〜45分間である。

すべての局面の1つの好ましい態様において、インキュベートする段階は、約40分間である。

すべての局面の1つの態様において、タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体は、脱グリコシル化多重特異性抗体である。

すべての局面の1つの態様において、抗体と酵素の重量比は、1:150〜1:500である。すべての局面の1つの態様において、抗体と酵素の重量比は、1:200〜1:400である。すべての局面の1つの態様において、抗体と酵素の重量比は、約1:200である。

すべての局面の1つの態様において、タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度は、200〜600μg/mLである。

すべての局面の1つの態様において、段階b)は、
b)段階a)のインキュベーション混合物を脱塩し、段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階
である。

すべての局面の1つの態様において、多重特異性抗体は、モノクローナル多重特異性抗体である。

すべての局面の1つの態様において、多重特異性抗体は、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む。

すべての局面の1つの態様において、多重特異性抗体は、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む。

すべての局面の1つの態様において、質量分析は、オンラインの測定法である。

すべての局面の1つの態様において、質量分析は、オフラインの測定法である。1つの態様において、オフライン質量分析の前に、脱塩段階が行われる。

発明の詳細な説明
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示内容を含む。したがって、例えば、「細胞(a cell)」への言及は、複数のそのような細胞および当業者に公知であるその等価物などを含む。同様に、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」といった用語もまた、本明細書において同義的に使用され得る。これとは対称的に、「1つの細胞(one cell)」への言及は、複数のそのような細胞を含まず、単一の(単離された)細胞に限定される。

「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する(having)」といった用語が同義的に使用され得ることにも留意すべきである。

さらに、「含む(comprising)」という用語は、限定としての「からなる(consisting of)」という用語を包含することにも、留意すべきである。

「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、少なくとも二重特異性の抗体)を含む、様々な抗体構造体を包含し、ただし、これらの抗体構造体が多重特異性であり、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含むことを条件とする。

「非ペプチド結合している」という用語は、2つのポリペプチドが、(アミノ酸のアミノ基とカルボキシ基の間で形成される)ペプチド結合によって互いに結合していないことを意味する。それでもなお、これらのポリペプチドは、ジスルフィド結合のような他の共有結合によって、または非共有結合的に、結合し得る。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分は、ある特定の供給源または種に由来するが、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は、異なる供給源または種に由来する、抗体を意味する。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを意味する。抗体には5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらの内のいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

本明細書における「Fc領域」という用語は、定常領域についての少なくとも1つの部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域および変種Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端に及ぶ。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在する場合もあれば存在しない場合もある。本明細書において別段の指定がない限り、Fc領域中または定常領域中のアミノ酸残基の番号付与は、EU指標とも呼ばれるEU番号付与方式に従い、これは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242において説明されている。

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全長抗体」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、天然抗体の構造に実質的に同様の構造を有するか、または本明細書において定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は同義的に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて意味する。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫が継代の回数に関わらず含まれる。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は、本明細書に含まれる。

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を使用する非ヒト供給源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的には除く。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基およびヒトFRに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の態様において、ヒト化抗体は、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域についての少なくとも1つの部分を任意で含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。

「単離された」抗体とは、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC)によって測定した場合に95％または99％を超える純度まで精製される。抗体純度を評価するための方法に関する概要については、例えばFlatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。

「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得る変種抗体を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物を作製する間に発生するこのような変種は、通常、少量で存在する。様々な決定基(エピトープ)を対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するためのモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書において説明される。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合させるのに関与している抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを意味する。一般に、天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、類似した構造を有しており、各ドメインは、4つの保存されているフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む。(例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照されたい)。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを用いて、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングして、単離することができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。

「ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

発明の詳細な説明
タンパク質限定分解消化およびESI-MS解析に基づく、多重特異性抗体を調製する際の軽鎖誤対合を判定するための方法が、本明細書において報告される。この方法は、品質管理または細胞株選択のために使用することができる。

二価の多重特異性抗体において、すなわち、二価二重特異性抗体において、1つの軽鎖誤対合産物が存在し得る(図1を参照されたい)。

本明細書において報告される方法の1つの例示的な態様において、二価二重特異性抗体の2つの試料が、プラスミン(EC3.4.21.7)によって消化された。どの試料においても、消化後に、切断されていないインタクト抗体はまったく存在しなかった。試料1では、軽鎖が誤対合した約20％の抗体が検出可能(図3を参照されたい)であるのに対し、第2の試料では、軽鎖が誤対合した抗体はまったく検出できない(図4を参照されたい)。

本明細書において報告される方法の1つの例示的な態様において、二価二重特異性抗体の1つの試料が、Lys-Cによって限定消化された。この試料では、軽鎖が誤対合した抗体が検出可能である(図5を参照されたい)。

例えば、三価または四価の多重特異性抗体中に、2本より多い軽鎖が存在する場合、複数の軽鎖誤対合産物が存在し得る(図2を参照されたい)。完全抗体の質量分析による解析では、軽鎖が誤対合した産物の存在を判定することしかできず、起こり得る誤対合の化学量論および向きを検出することはできない(図6を参照されたい)。

この課題のために、様々なタンパク質分解酵素を選択することができる:
-Ides:ヒンジ領域より下を切断する(L234A、L235A変異を有する抗体においては使用できない)
-プラスミン:ヒンジ領域より上を切断する
-ペプシン:ヒンジ領域より下を切断する;分解されたFc領域を生じる
-Lys-C:ヒンジ領域より上を切断する。

本明細書において報告される方法の1つの例示的な態様において、四価二重特異性抗体の1つの試料が、Lys-Cによって限定消化された。

四価の多重特異性抗体の場合、軽鎖1および重鎖1断片に由来するFab領域形態中の誤対合は、ISCID値0で良く検出できるのに対し、第2の軽鎖を含むFc領域断片は、ISCID値90で良く検出できることが判明している。

Fc領域を除去するために、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて、酵素消化後にFc領域からFab断片を分離することができる。Fab断片は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーの通過画分中に存在する。

キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書において報告される方法を用いて解析する抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えばUS4,816,567、およびMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855において説明されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒト以外の霊長類、例えばサルに由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。

特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させる。通常、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR(またはその一部分)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部分)がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域についての少なくとも1つの部分も任意で含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるか、または向上させるために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基の由来元である抗体)に由来する対応する残基で置換されている。

ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633において概説されており、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321、およびUS 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34(特異性決定領域(SDR)グラフティングを説明); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (「リサーフェシング」を説明); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60(「FRシャッフリング」を説明);ならびにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68およびKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260(「FRシャッフリング」に取り組む「導かれた選択」アプローチを説明)においてさらに説明されている。

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法(例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照されたい)を用いて選択されたフレームワーク領域;特定のサブグループの軽鎖可変領域または重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;およびPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照されたい);ヒト成熟(体細胞性に変異した)フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照されたい);およびFRライブラリーをスクリーニングして得られたフレームワーク領域(例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684およびRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

ヒト抗体
特定の態様において、本明細書において報告される方法において解析される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において概説されている。

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、調製することができる。典型的には、このような動物は、内在性の免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいて、通常、内在性の免疫グロブリン遺伝子座は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照されたい。また、例えば、XENOMOUSE(商標)技術を説明するUS6,075,181およびUS6,150,584;HuMab(登録商標)技術を説明するUS5,770,429;K-M MOUSE(登録商標)技術を説明するUS7,041,870、ならびにVelociMouse(登録商標)技術を説明するUS2007/0061900も参照されたい。このような動物によって産生されるインタクト抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と結合させることによって、さらに改変することができる。

また、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は説明されている。(例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63;およびBoerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照されたい)。また、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって作製したヒト抗体が、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562において説明されている。その他の方法には、例えば、US 7,189,826(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の作製を説明)およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (ヒト-ヒトハイブリドーマを説明)において説明されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937およびVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191においても説明されている。

ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと結合させてよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を後述する。

ライブラリー由来の抗体
本明細書において報告される方法において解析される抗体は、所望の1種または複数種の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;およびLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132においてさらに説明されている。

いくつかのファージディスプレイ法では、VH遺伝子のレパートリーおよびVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングし、ファージライブラリー中で無作為に組み換え、次いで、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455で説明されているようにして、抗原結合ファージを求めてそれらをスクリーニングすることができる。典型的には、ファージは、単鎖Fv(scFv)断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734によって説明されているように、ナイーブレパートリーを(例えばヒトから)クローニングして、まったく免疫化せずに、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388によって説明されているように、幹細胞由来の再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むPCRプライマーを用いて可変性に富むCDR3領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報には、例えば、US5,750,373、ならびにUS2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936、およびUS2009/0002360が含まれる。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。

多重特異性抗体
2つまたはそれ以上の抗原に結合できる二重特異性抗体または多重特異性抗体などの操作されたタンパク質は、当技術分野において公知である。このような多重特異的結合タンパク質は、細胞融合技術、化学的結合技術、または組換えDNA技術を用いて作製することができる。

特定の態様において、本明細書において報告される方法において解析される抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。多重特異性抗体は、完全長抗体として調製することができる。

多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組み換え同時発現(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO93/08829、およびTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照されたい)および「ノブインホール(knob-in-hole)」操作(例えばUS5,731,168を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電気操縦(electrostatic steering)効果を操作すること(WO2009/089004);2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、US4,676,980およびBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照されたい);二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを用いること(例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照されたい);二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること(例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい);および単鎖Fv(sFv)二量体を用いること(例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照されたい);ならびに例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69で説明されているようにして、三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。

「オクトパス抗体(Octopus antibodies)」を含む、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる(例えば、US2006/0025576を参照されたい)。

また、本明細書の抗体または断片には、[[PRO]]ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Fab」または「DAF」が含まれる(例えば、US2008/0069820を参照されたい)。

また、本明細書の抗体または断片には、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、およびWO2010/145793において説明されている多重特異性抗体も含まれる。

多種多様な組換え多重特異性抗体形態、例として、例えばIgG抗体形態と単鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体が、ここ最近に開発されている(例えば、Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; WO2001/077342;およびMorrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234を参照されたい)。

また、抗体のコア構造(IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM)がもはや保持されていない他のいくつかの新しい形態、例えば、2つまたはそれ以上の抗原に結合できるダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディ、ミニボディ、いくつかの単鎖形態(scFv、ビス-scFv)が開発された(Holliger, P., et. al, Nature Biotech. 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。

このような形態はすべて、抗体コア(IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM)を別の結合タンパク質(例えばscFv) に融合するか、または例えば2つのFab断片もしくはscFvを融合するために、リンカーを使用する(Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14)。多重特異性抗体を人工的に作り出すのにリンカーが好都合であることは明らかであるが、リンカーはまた、治療現場に問題を引き起こす可能性もある。実際、これらの外来ペプチドは、リンカーそれ自体またはタンパク質とリンカーの間の連結部に対する免疫応答を誘発する可能性がある。さらに、これらのペプチドは、曲がりやすい性質が原因でタンパク質分解切断を起こす傾向が強く、その結果、不十分な抗体安定性、凝集、および高い免疫原性を招く可能性がある。さらに、Fc部分によってもたらされる、例えば、補体依存性細胞障害(CDC)または抗体依存性細胞障害(ADCC)などのエフェクター機能を、天然に存在する抗体との高度な類似性を維持することによって保持したい場合もある。

したがって、理想的には、(IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMのような)天然に存在する抗体と全般的構造が非常に似ており、ヒト配列からの逸脱が最小限である多重特異性抗体を開発することを目指すべきである。

1つのアプローチでは、天然抗体に非常に似ている二重特異性抗体が、二重特異性抗体の所望の特異性を有するマウスモノクローナル抗体を発現する2種の異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術(Milstein, C., and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540を参照されたい)を用いて作製された。結果として生じるハイブリッドハイブリドーマ(またはクアドローマ)細胞株内で2種の異なる抗体重鎖および抗体軽鎖がランダムに対合するため、最高で10種の異なる抗体種が生じ、その内の1つだけが、所望の機能的な二重特異性抗体である。誤対合した副産物が存在し、生産収率がかなり低くなるため、高度な精製処置が必要とされる(例えば、Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234を参照されたい)。一般に、組換え発現技術が使用される場合も、誤対合した副産物という同じ問題が依然として残る。

「ノブイントゥーホール(knobs-into-holes)」として公知である、誤対合した副産物という問題を回避するためのアプローチは、CH3ドメインに変異を導入して接触面を改変することによって、2つの異なる抗体重鎖の対合を強いることを目指す。一方の鎖において、かさ高いアミノ酸を側鎖の短いアミノ酸で置換して、「ホール」を作り出した。逆に、側鎖の大きなアミノ酸を他方のCH3ドメイン中に導入して、「ノブ」を作り出した。これら2本の重鎖(および2つの同一の軽鎖、これらは両方の重鎖に対して適切でなければならない)を同時発現させることによって、ホモ二量体形成(「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」)と比べて高収率のヘテロ二量体形成(「ノブ−ホール」)が観察された(Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621およびWO96/027011)。ヘテロ二量体の比率は、ファージディスプレイアプローチを用いて2つのCH3ドメインの相互作用面を改造すること、およびヘテロ二量体を安定化するためにジスルフィド架橋を導入することによって、さらに高めることができた(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)。ノブイントゥーホール技術に関する新しいアプローチが、例えばEP 1870459 A1において説明されている。この形式は非常に魅力的に思われるが、臨床治療(the clinic)に向けての発展を説明するデータは、現在のところ入手不可能である。この戦略の1つの重大な制約は、誤対合および不活性分子の形成を防止するために2つの親抗体の軽鎖が同一でなければならないということである。したがって、この技術は、第1の抗原および第2の抗原に対する2種の抗体を出発原料として(starting from)、3種または4種の抗原に対する組換えの三重特異性抗体または四重特異性抗体を容易に開発するための基本原理としては適切ではない。これらの抗体の重鎖および/または同一の軽鎖のいずれかを最初に最適化しなければならず、次いで、第3の抗原および第4の抗原に対する別の抗原結合ペプチドを追加しなければならないことがその理由である。

WO2006/093794は、ヘテロ二量体のタンパク質結合組成物に関する。WO99/37791は、多用途の抗体誘導体を説明している。Morrison, S.L., et al., J. Immunol. 160 (1998) 2802-2808は、IgGの機能的特性に可変領域ドメイン交換が与える影響に関する。

WO2013/02362は、ヘテロ二量体化ポリペプチドに関する。WO2013/12733は、ヘテロ二量体Fc領域を含むポリペプチドに関する。WO2012/131555は、操作されたヘテロ二量体免疫グロブリンに関する。EP 2647707は、操作されたヘテロ二量体免疫グロブリンに関する。

WO2013/026835は、ドメインが交換された(crossover)、Fcを含まない二重特異性抗体に関する。WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、およびSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191は、ドメインが交換された二価二重特異性IgG抗体に関する。

WO2009/080252において説明されている、軽鎖誤対合を防止するために1つの結合部(binding)中にVH/VL 置換/交換を有する多重特異性抗体(CrossMabVH-VL)(Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191も参照されたい)の場合、第1の抗原に対する軽鎖と第2の抗原に対する間違った重鎖とのミスマッチに起因する副産物は(そのようなドメイン交換を用いないアプローチと比べて)明らかに減少する。しかし、それらの調製は、完全に副産物がないわけではない。主な副産物は、ベンス・ジョーンズ型の相互作用に基づいている(Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191;補遺の図S1Iも参照されたい)。

二重特異性抗体
1つの態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二価二重特異性抗体である。

a)の抗体は、b)で報告される改変を含まず、a)の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。

b)の抗体において、
軽鎖内部で
可変軽鎖ドメインVLは、該抗体の可変重鎖ドメインVHで置換されており、
重鎖内部で
可変重鎖ドメインVHは、該抗体の可変軽鎖ドメインVLで置換されている。

1つの態様において、
i)a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸(Kabatによる番号付与)は、正電荷を持ったアミノ酸によって置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸(KabatのEU指標による番号付与)は、負電荷を持ったアミノ酸によって置換されているか、
または
ii)b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸(Kabatによる番号付与)は、正電荷を持ったアミノ酸によって置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸(KabatのEU指標による番号付与)は、負電荷を持ったアミノ酸によって置換されている。

1つの好ましい態様において、
i)a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸は、独立にリジン(K)、アルギニン(R)、もしくはヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付与)(1つの好ましい態様において、独立にリジン(K)もしくはアルギニン(R)による)、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸もしくは213位のアミノ酸は、独立にグルタミン酸(E)もしくはアスパラギン酸(D)によって置換されているか(KabatのEU指標による番号付与)、
または
ii)b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸は、独立にリジン(K)、アルギニン(R)、もしくはヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付与)(1つの好ましい態様において、独立にリジン(K)もしくはアルギニン(R)による)、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸もしくは213位のアミノ酸は、独立にグルタミン酸(E)もしくはアスパラギン酸(D)によって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

1つの態様では、第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124位および123位のアミノ酸は、Kによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

1つの態様では、第2の軽鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位のアミノ酸は、Eによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

1つの好ましい態様では、第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位および123位のアミノ酸はKによって置換されており、第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位のアミノ酸は、Eによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

1つの態様では、第2の重鎖の定常ドメインCLにおいて、124位および123位のアミノ酸はKによって置換されており、第2の軽鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位のアミノ酸はEによって置換されており、第1の軽鎖の可変ドメインVLにおいて、38位のアミノ酸はKによって置換されており、第1の重鎖の可変ドメインVHにおいて、39位のアミノ酸はEによって置換されており、第2の重鎖の可変ドメインVLにおいて、38位のアミノ酸はKによって置換されており、第2の軽鎖の可変ドメインVHにおいて、39位のアミノ酸はEによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替わっており、かつ第2の軽鎖および第2の重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二価二重特異性抗体である。

b)の抗体において、軽鎖内部で
可変軽鎖ドメインVLは、該抗体の可変重鎖ドメインVHで置換されており、定常軽鎖ドメインCLは、該抗体の定常重鎖ドメインCH1で置換されており;
かつ
重鎖内部で
可変重鎖ドメインVHは、該抗体の可変軽鎖ドメインVLで置換されており、定常重鎖ドメインCH1は、該抗体の定常軽鎖ドメインCLで置換されている。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二価二重特異性抗体である。

b)の抗体において、
軽鎖内部で
定常軽鎖ドメインCLは、該抗体の定常重鎖ドメインCH1で置換されており;
かつ、重鎖内部で
定常重鎖ドメインCH1は、該抗体の定常軽鎖ドメインCLで置換されている。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合し、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、ならびに
b)1〜4個の別の抗原(すなわち、好ましくは1つの別の抗原、すなわち第2の抗原に特異的に結合する、第2および/または第3および/または第4および/または第5の抗原)に特異的に結合する1つ、2つ、3つ、または4つの単鎖Fab断片
を含み、
b)の該単鎖Fab断片が、a)の該完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されており、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
多重特異性抗体である。

1つの態様において、第2の抗原に結合する1つまたは2つの同一の単鎖Fab断片は、該完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、第2の抗原に結合する1つまたは2つの同一の単鎖Fab断片は、該完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖のC末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、第2の抗原に結合する1つまたは2つの同一の単鎖Fab断片は、該完全長抗体に、該完全長抗体の軽鎖のC末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、第2の抗原に結合する2つの同一の単鎖Fab断片は、該完全長抗体に、該完全長抗体の各重鎖または各軽鎖のC末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、第2の抗原に結合する2つの同一の単鎖Fab断片は、該完全長抗体に、該完全長抗体の各重鎖のC末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、第2の抗原に結合する2つの同一の単鎖Fab断片は、該完全長抗体に、該完全長抗体の各軽鎖のC末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されている。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合し、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、
b)ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH)、
または
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体定常ドメイン1(CH1)
からなる第1のポリペプチドであって、
該第1のポリペプチドが、そのVHドメインのN末端において、該完全長抗体の2本の重鎖の内の一方のC末端にペプチドリンカーを介して融合されている、第1のポリペプチド、
c)ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、
または
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなる第2のポリペプチドであって、
該第2のポリペプチドが、そのVLドメインのN末端において、該完全長抗体の2本の重鎖の内の他方のC末端にペプチドリンカーを介して融合されている、第2のポリペプチド
を含み、
第1のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)と第2のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)とが一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
三価二重特異性抗体である。

1つの態様において、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)およびc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)は、結合しており、以下の位置の間のジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋を介して安定化される:
i)重鎖可変ドメイン44位〜軽鎖可変ドメイン100位、または
ii)重鎖可変ドメイン105位〜軽鎖可変ドメイン43位、または
iii)重鎖可変ドメイン101位〜軽鎖可変ドメイン100位(番号付与は、常にKabatのEU指標に基づく)。

安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入するための技術は、例えば、WO94/029350、Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393;またはSchmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721において説明されている。1つの態様において、b)およびc)のポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン44位と軽鎖可変ドメイン100位の間に存在する。1つの態様において、b)およびc)のポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン105位と軽鎖可変ドメイン43位の間に存在する。(番号付与は、常にKabatのEU指標に基づく)。1つの態様において、単鎖Fab断片の可変ドメインVHとVLの間に前記任意のジスルフィド安定化がなされていない三価二重特異性抗体が好ましい。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替わっており、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第2の(改変された)軽鎖および第2の(改変された)重鎖を含み、かつ
c)1つまたは2つの別の抗原に(すなわち、第3および/または第4の抗原に)特異的に結合する1〜4個の抗原結合ペプチドが、a)および/またはb)の軽鎖または重鎖のC末端またはN末端にペプチドリンカーを介して融合されており、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
三重特異性または四重特異性の抗体である。

1つの態様において、三重特異性または四重特異性の抗体は、c)において、1つまたは2つの別の抗原に特異的に結合する1つまたは2つの抗原結合ペプチドを含む。

1つの態様において、抗原結合ペプチドは、scFv断片およびscFab断片からなる群より選択される。

1つの態様において、抗原結合ペプチドは、scFv断片である。

1つの態様において、抗原結合ペプチドは、scFab断片である。

1つの態様において、抗原結合ペプチドは、a)および/またはb)の重鎖のC末端に融合されている。

1つの態様において、三重特異性または四重特異性の抗体は、c)において、1つの別の抗原に特異的に結合する1つまたは2つの抗原結合ペプチドを含む。

1つの態様において、三重特異性または四重特異性の抗体は、c)において、第3の抗原に特異的に結合する2つの同一の抗原結合ペプチドを含む。1つの好ましい態様において、このような2つの同一の抗原結合ペプチドは両方とも、a)およびb)の重鎖のC末端に、同じペプチドリンカーを介して融合されている。1つの好ましい態様において、2つの同一の抗原結合ペプチドは、scFv断片またはscFab断片のいずれかである。

1つの態様において、三重特異性または四重特異性の抗体は、c)において、第3および第4の抗原に特異的に結合する2つの抗原結合ペプチドを含む。1つの態様において、該2つの抗原結合ペプチドは両方とも、a)およびb)の重鎖のC末端に、同じペプチドコネクターを介して融合されている。1つの好ましい態様において、該2つの抗原結合ペプチドは、scFv断片またはscFab断片のいずれかである。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合する(かつ2つのFab断片を含む)、抗体の2本の軽鎖および2本の重鎖、
b) 第2の抗原に特異的に結合する、抗体の2つの追加のFab断片であって、a)の重鎖のC末端またはN末端のいずれかにペプチドリンカーを介して両方とも融合されている、抗体の2つの追加のFab断片
を含み、
その際、これらのFab断片において、以下の改変:
i)a)の両方のFab断片において、もしくはb)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつ/もしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
ii)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられ、かつ
b)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられるか、もしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
iii)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられるか、もしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられ、かつ
b)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
iv)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつb)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
v)a)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられ、かつb)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられる、
が行われたものであり、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二重特異性四価抗体である。

1つの態様において、前記追加のFab断片は両方とも、a)の重鎖のC末端またはa)の重鎖のN末端のいずれかに、ペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、前記追加のFab断片は両方とも、a)の重鎖のC末端のいずれかにペプチドリンカーを介して融合されている。

1つの態様において、前記追加のFab断片は両方とも、a)の重鎖のN末端にペプチドコネクターを介して融合されている。

1つの態様において、Fab断片において、以下の改変が行われる:
i)a)の両方のFab断片において、もしくはb)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。

1つの態様において、Fab断片において、以下の改変が行われる:
i)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。

1つの態様において、Fab断片において、以下の改変が行われる:
i)a)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。

1つの態様において、Fab断片において、以下の改変が行われる:
i)b)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。

1つの態様において、Fab断片において、以下の改変が行われる:
i)b)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合し、かつ第1のVH-CH1ドメイン対を含む、第1の抗体の(改変された)重鎖であって、該重鎖のC末端に、該第1の抗体の第2のVH-CH1ドメイン対のN末端がペプチドリンカーを介して融合されている、第1の抗体の(改変された)重鎖、
b)a)の該第1の抗体の2本の軽鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合し、かつ第1のVH-CLドメイン対を含む、第2の抗体の(改変された)重鎖であって、該重鎖のC末端に、該第2の抗体の第2のVH-CLドメイン対のN末端がペプチドリンカーを介して融合されている、第2の抗体の(改変された)重鎖、および
d)CL-CH1ドメイン対をそれぞれ含む、c)の該第2の抗体の2本の(改変された)軽鎖を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二重特異性四価抗体である。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b)重鎖のN末端がペプチドリンカーを介して軽鎖のC末端に連結されている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の重鎖および軽鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる、
二重特異性抗体である。

a)の抗体は、b)で報告される改変を含まず、重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。

本明細書において報告される1つの局面は、
a)第1の抗原に特異的に結合し、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、ならびに
b)第2の抗原に特異的に結合する、VH²ドメインおよびVL²ドメインを含むFv断片であって、両方のドメインがジスルフィド架橋によって互いに連結されている、Fv断片
を含み、
VH²ドメインまたはVL²ドメインのどちらか一方のみが、第1の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖または軽鎖にペプチドリンカーを介して融合されており、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二重特異性抗体である。

この二重特異性体において、a)の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。

1つの態様において、VH²ドメインまたはVL²ドメインの他方は、第1の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖にも軽鎖にもペプチドリンカーを介して融合されていない。

本明細書において報告されるすべての局面において、第1の軽鎖はVLドメインおよびCLドメインを含み、第1の重鎖は、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。

すべての局面の1つの態様において、本明細書において報告される抗体は、少なくとも2本の重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とする多重特異性抗体である。

ヘテロ二量体化を支援する目的でCH3を改変するためのいくつかのアプローチが、例えば、参照により本明細書に含まれるWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、WO2013/096291において説明されている。典型的には、当技術分野において公知のアプローチにおいて、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインは両方とも、1つの操作されたCH3ドメインを含む重鎖が、同じ構造の別の重鎖ともはやホモ二量体化できないように、相補的な様式で操作される(例えば、CH3を操作された第1の重鎖は、CH3を操作された別の第1の重鎖ともはやホモ二量体化できず;CH3を操作された第2の重鎖は、CH3を操作された別の第2の重鎖ともはやホモ二量体化できない)。その結果、1つの操作されたCH3ドメインを含む重鎖は、相補的な様式で操作された、CH3ドメインを含む別の重鎖とヘテロ二量体化することを余儀なくされる。本発明のこの態様では、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインは、アミノ酸置換によって相補的な様式で操作され、その結果、第1の重鎖および第2の重鎖はヘテロ二量体化することを余儀なくされ、一方で、(例えば、立体配置に関する理由のために)第1の重鎖および第2の重鎖は、もはやホモ二量体化できなくなる。

上記に挙げられ含められた、当技術分野において公知の重鎖ヘテロ二量体化を支援するための様々なアプローチは、本発明による多重特異性抗体(第1の抗原に特異的に結合する、第1の抗体に由来する「非交差Fab領域」および第2の抗原に特異的に結合する、第2の抗体に由来する「交差Fab領域」を、本発明に関して前述した特定のアミノ酸置換と組み合わせて含む)において使用される様々な代替手段として企図される。

本明細書において報告される多重特異性抗体のCH3ドメインは、例えば、WO96/027011、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621、およびMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681においていくつかの例を用いて詳細に説明されている「ノブイントゥーホール(knob-into-holes)」技術によって改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面を改変して、これら2つのCH3ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。(2本の重鎖の)2つのCH3ドメインのそれぞれが、「ノブ」となることができ、他方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体はさらに安定し(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)、収率は上昇する。

1つの好ましい態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにT366W変異、および「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S変異、L368A変異、およびY407V変異を含む(KabatのEU指標に従う番号付与)。また、例えば、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中へのY349C変異および「ホール鎖」のCH3ドメイン中へのE356C変異またはS354C変異の導入による、CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)。したがって、別の好ましい態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの内の一方におけるY349C変異およびT366W変異ならびに2つのCH3ドメインの内の他方におけるE356C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を含むか、または本明細書において報告される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの内の一方におけるY349C変異およびT366W変異ならびに2つのCH3ドメインの内の他方におけるS354C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を含む(一方のCH3ドメイン中の追加のY349C変異および他方のCH3ドメイン中の追加のE356C変異またはS354C変異が鎖間ジスルフィド架橋を形成する)(KabatのEU指標に従う番号付与)。

しかし、EP1870459A1において説明されている他のノブインホール技術もまた、代わりにまたは追加で使用することができる。1つの態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中のR409D変異およびK370E変異ならびに「ホール鎖」のCH3ドメイン中のD399K変異およびE357K変異を含む(KabatのEU指標に従う番号付与)。

1つの態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中のT366W変異ならびに「ホール鎖」のCH3ドメイン中のT366S変異、L368A変異、およびY407V変異、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中のR409D変異およびK370E変異ならびに「ホール鎖」のCH3ドメイン中のD399K変異およびE357K変異を含む(KabatのEU指標に従う番号付与)。

1つの態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの内の一方におけるY349C変異およびT366W変異ならびに2つのCH3ドメインの内の他方におけるS354C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を含むか、または本明細書において報告される多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの内の一方におけるY349C変異およびT366W変異ならびに2つのCH3ドメインの内の他方におけるS354C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインにおけるR409D変異およびK370E変異ならびに「ホール鎖」のCH3ドメインにおけるD399K変異およびE357K変異を含む(KabatのEU指標に従う番号付与)。

「ノブイントゥーホール技術」以外に、ヘテロ二量体化を強制するために多重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを改変するための他の技術が、当技術分野において公知である。これらの技術、特に、WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、およびWO2013/096291において説明されているものは、本明細書において報告される多重特異性抗体と組み合わせて、「ノブイントゥーホール技術」の代替手段として本明細書において企図される。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、EP1870459において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。このアプローチは、両方、すなわち第1の重鎖と第2の重鎖の間のCH3/CH3ドメイン境界面の特定のアミノ酸位置に、反対電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づいている。

したがって、この態様は、抗体の三次構造において、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインが、各抗体CH3ドメインの間に位置している境界面を形成し、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインの各アミノ酸配列が、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸をそれぞれ含み、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸から、第1のアミノ酸が、正電荷を持ったアミノ酸によって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸から、第2のアミノ酸が、負電荷を持ったアミノ酸によって置換されている、本明細書において報告される多重特異性抗体に関する。この態様による多重特異性抗体は、本明細書において、「CH3(+/-)に作り変えられた(engineered)多重特異性抗体」とも呼ばれる(略語「+/-」は、各CH3ドメインに導入された、反対の電荷を持つアミノ酸を意味する)。

本明細書において報告される前記CH3(+/-)に作り変えられた多重特異性抗体の1つの態様において、正電荷を持ったアミノ酸は、K、R、およびHより選択され、負電荷を持ったアミノ酸は、EまたはDより選択される。

本明細書において報告される前記CH3(+/-)に作り変えられた多重特異性抗体の1つの態様において、正電荷を持ったアミノ酸は、KおよびRより選択され、負電荷を持ったアミノ酸は、EまたはDより選択される。

本明細書において報告される前記CH3(+/-)に作り変えられた多重特異性抗体の1つの態様において、正電荷を持ったアミノ酸は、Kであり、負電荷を持ったアミノ酸は、Eである。

本明細書において報告される前記CH3(+/-)に作り変えられた多重特異性抗体の1つの態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409位のアミノ酸RはDによって置換されており、位のアミノ酸KはEによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399位のアミノ酸DはKによって置換されており、357位のアミノ酸EはKによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2013/157953において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の1つの態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはKによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351位のアミノ酸LはDによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の別の態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはKによって置換されており、351位のアミノ酸LはKによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351位のアミノ酸LはDによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される前記多重特異性抗体の別の態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはKによって置換されており、351位のアミノ酸LはKによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351位のアミノ酸LはDによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。さらに、次の置換の内の少なくとも1つが、他方の重鎖のCH3ドメイン中に含まれる:349位のアミノ酸YがEによって置換され、349位のアミノ酸YがDによって置換され、368位のアミノ酸LがEによって置換される(KabatのEU指標による番号付与)。1つの態様において、368位のアミノ酸Lは、Eによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2012/058768において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の1つの態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351位のアミノ酸LはYによって置換されており、407位のアミノ酸YはAによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはAによって置換されており、409位のアミノ酸KはFによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。別の態様において、前述の置換に加えて、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、411位のアミノ酸(もともとはT)、399位のアミノ酸(もともとはD)、400位のアミノ酸(もともとはS)、405位のアミノ酸(もともとはF)、390位のアミノ酸(もともとはN)、および392位のアミノ酸(もともとはK)の内の少なくとも1つが置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。好ましい置換は、以下のものである:
-N、R、Q、K、D、E、およびWより選択されるアミノ酸による、411位のアミノ酸Tの置換(KabatのEU指標による番号付与)
-R、W、Y、およびKより選択されるアミノ酸による、399位のアミノ酸Dの置換(KabatのEU指標による番号付与)、
-E、D、R、およびKより選択されるアミノ酸による、400位のアミノ酸Sの置換(KabatのEU指標による番号付与)、
-I、M、T、S、V、およびWより選択されるアミノ酸による、405位のアミノ酸Fの置換(KabatのEU指標による番号付与)、
-R、K、およびDより選択されるアミノ酸による、390位のアミノ酸Nの置換(KabatのEU指標による番号付与)、ならびに
-V、M、R、L、F、およびEより選択されるアミノ酸による、392位のアミノ酸Kの置換(KabatのEU指標による番号付与)。

(WO2012/058768に従って作り変えた)本明細書において報告される前記多重特異性抗体の別の態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351位のアミノ酸LはYによって置換されており、407位のアミノ酸YはAによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはVによって置換されており、409位のアミノ酸KはFによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の別の態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407位のアミノ酸YはAによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはAによって置換されており、409位のアミノ酸KはFによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。最後に言及した前記態様において、前記他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、392位のアミノ酸KはEによって置換されており、411位のアミノ酸TはEによって置換されており、399位のアミノ酸DはRによって置換されており、400位のアミノ酸SはRによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2011/143545において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の1つの態様において、両方の重鎖のCH3ドメインにおけるアミノ酸改変は、368位および/または409位に導入される(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2011/090762において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。WO2011/090762は、「ノブイントゥーホール」技術によるアミノ酸改変に関する。本明細書において報告される前記CH3(KiH)に作り変えられた多重特異性抗体の1つの態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはWによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407位のアミノ酸YはAによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。本明細書において報告される前記CH3(KiH)に作り変えられた多重特異性抗体の別の態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366位のアミノ酸TはYによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407位のアミノ酸YはTによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

IgG2アイソタイプのものである本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2011/090762において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2009/089004において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の1つの態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、392位のアミノ酸KまたはNは、負電荷を持ったアミノ酸によって(1つの好ましい態様においてはEまたはDによって、1つの好ましい態様においてはDによって)置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399位のアミノ酸D、356位のアミノ酸EもしくはD、または357位のアミノ酸Eは、正電荷を持ったアミノ酸によって置換されている(1つの好ましい態様においてはKもしくはR、1つの好ましい態様においてはKによって、1つの好ましい態様においては399位もしくは356位のアミノ酸がKによって置換されている)(KabatのEU指標による番号付与)。1つの別の態様において、前述の置換に加えて、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409位のアミノ酸KまたはRは、負電荷を持ったアミノ酸によって(1つの好ましい態様においてはEまたはDによって、1つの好ましい態様においてはDによって)置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。1つのさらに別の態様において、前述の置換に加えて、または前述の置換の代わりに、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、439位のアミノ酸Kおよび/または370位のアミノ酸Kは、負電荷を持ったアミノ酸によって(1つの好ましい態様においてはEまたはDによって、1つの好ましい態様においてはDによって)互いとは無関係に置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2007/147901において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。本明細書において報告される前記多重特異性抗体の1つの態様において、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、253位のアミノ酸KはEによって置換されており、282位のアミノ酸DはKによって置換されており、322位のアミノ酸KはDによって置換されており、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、239位のアミノ酸DはKによって置換されており、240位のアミノ酸EはKによって置換されており、292位のアミノ酸KはDによって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告される多重特異性抗体の1つの態様において、WO2007/110205において説明されるアプローチが、多重特異性抗体の第1の重鎖および第2の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。

本明細書において報告されるすべての局面および態様の1つの態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。本発明の1つの好ましい態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、抗体は、二価または三価の抗体である。1つの態様において、抗体は、二価の抗体である。

本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、多重特異性抗体は、IgGタイプの抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1のもの、または変異L234AおよびL235Aを有するヒトサブクラスIgG1のものであることを特徴とする。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG2のものであることを特徴とする。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG3のものであることを特徴とする。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG4のもの、または追加の変異S228Pを有するヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1またはヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、変異L234AおよびL235Aを有するヒトサブクラスIgG1のものであることを特徴とする(KabatのEU指標による番号付与)。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、変異L234A、L235A、およびP329Gを有するヒトサブクラスIgG1のものであることを特徴とする(KabatのEU指標による番号付与)。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、変異S228PおよびL235Eを有するヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする(KabatのEU指標による番号付与)。本明細書において報告されるすべての局面の1つの別の態様において、多重特異性抗体は、変異S228P、L235E、およびP329Gを有するヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする(KabatのEU指標による番号付与)。

本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、本明細書において指定したCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、付加的なC末端グリシン-リジンジペプチド(G446およびK447、KabatのEU指標による番号付与)を含む。本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、本明細書において指定したCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、付加的なC末端グリシン残基(G446、KabatのEU指標による番号付与)を含む。

1つの態様において、抗体は、第1のFc領域ポリペプチドおよび第2のFc領域ポリペプチドを含み、
その際、
i)第1のFc領域ポリペプチドがヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドがヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
ii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
iii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
iv)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
v)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
vi)第1のFc領域ポリペプチドがヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドがヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
vii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
viii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
ix)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
x)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドである。

1つの態様において、抗体は、第1のFc領域ポリペプチドおよび第2のFc領域ポリペプチドを含み、
その際、抗体は、第1のFc領域ポリペプチド中および第2のFc領域ポリペプチド中に、以下の変異の組合せ
i)I253A、H310A、およびH435A、または
ii)H310A、H433A、およびY436A、または
iii)L251D、L314D、およびL432D、または
iv)i)〜iii)の組合せ
を含む。

本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、本明細書において報告される抗体は、エフェクター機能を失っている抗体である。本明細書において報告されるすべての局面の1つの態様において、抗体は、エフェクター機能を失っている抗体であり、ヒトFcRnに結合しない。本明細書において報告されるすべての局面の1つの好ましい態様において、ヒトサブクラスIgG1の抗体であり、両方の重鎖に変異L234A、L235A、P329G、I253A、H310A、およびH434Aを有する(Kabatの指標による番号付与)。

組換え法および組換え組成物
抗体は、例えば、US4,816,567において説明されているように、組換え法および組換え組成物を用いて作製することができる。必要とされる核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのこのような態様において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)である。1つの態様において、抗[[PRO]]抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収する段階を含む。

抗体を組換え作製する場合、例えば前述したような抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞におけるその後のクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定され得る。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書において説明する原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合には特に、細菌において産生させることができる。細菌における抗体断片および抗体ポリペプチドの発現については、例えば、US5,648,237、US5,789,199、およびUS5,840,523を参照されたい。(E. coli(大腸菌)における抗体断片の発現を説明するCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または全面的にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する、真菌株および酵母株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。

グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。

植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば、US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978、およびUS6,417,429(トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES(商標)技術を説明している)を参照されたい。

脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させられる哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(例えばGraham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74で説明されている293または293細胞);仔ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252で説明されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(HepG2);マウス乳腺腫瘍(MMT060562);例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68で説明されている、TRI細胞;MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR^- CHO細胞(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。

具体的な態様
1. 多重特異性抗体の軽鎖対合を解析するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
2. 多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
3. 多重特異性抗体を産生する哺乳動物細胞を選択するための、組換え哺乳動物細胞によって産生される多重特異性抗体の、タンパク質分解酵素による限定消化の使用。
4. タンパク質分解酵素が、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、およびキモトリプシンからなる群より選択される、態様1〜3のいずれか1つに記載の使用。
5. タンパク質分解酵素がLys-Cである、態様4記載の使用。
6. インキュベートする段階が、35分〜45分間である、態様1〜5のいずれか1つに記載の使用。
7. インキュベートする段階が、約40分間である、態様6記載の使用。
8. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体が、脱グリコシル化多重特異性抗体である、態様1〜7のいずれか1つに記載の使用。
9. 抗体と酵素の重量比が約1:200である、態様1〜8のいずれか1つに記載の使用。
10. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度が、200〜600μg/mLである、態様1〜9のいずれか1つに記載の使用。
11. 多重特異性抗体が、モノクローナル多重特異性抗体である、態様1〜10のいずれか1つに記載の使用。
12. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む、態様1〜11のいずれか1つに記載の使用。
13. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む、態様1〜11のいずれか1つに記載の使用。
14. 以下の段階を含む、多重特異性抗体中の軽鎖対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定する段階。
15. 以下の段階を含む、多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定し、それによって軽鎖誤対合を判定する段階。
16. 以下の段階を含む、多重特異性抗体を産生する組換え哺乳動物細胞を選択するための方法:
a)すべての細胞が同じ多重特異性抗体を産生する多数の組換え哺乳動物細胞からなる組換え哺乳動物細胞のクローン集団によって産生される多重特異性抗体を含む試料を個々に、一定期間、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、
c)段階b)の結果から、各クローン細胞集団について多重特異性抗体の軽鎖誤対合の存在を判定する段階、および
d)段階c)の結果に基づいて、多重特異性抗体を産生する組換え細胞を選択する段階。
17. タンパク質分解酵素が、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、およびキモトリプシンからなる群より選択される、態様14〜16のいずれか1つに記載の方法。
18. タンパク質分解酵素がLys-Cである、態様17記載の方法。
19. インキュベートする段階が、35分〜45分間である、態様14〜18のいずれか1つに記載の方法。
20. インキュベートする段階が、約40分間である、態様19記載の方法。
21. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体が、脱グリコシル化多重特異性抗体である、態様14〜20のいずれか1つに記載の方法。
22. 抗体と酵素の重量比が約1:200である、態様14〜21のいずれか1つに記載の方法。
23. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度が、200〜600μg/mLである、態様14〜22のいずれか1つに記載の方法。
24. 段階b)が、
b)段階a)のインキュベーション混合物を脱塩し、段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階
である、態様14〜23のいずれか1つに記載の方法。
25. 多重特異性抗体が、モノクローナル多重特異性抗体である、態様14〜24のいずれか1つに記載の方法。
26. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む、態様14〜25のいずれか1つに記載の方法。
27. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む、態様14〜25のいずれか1つに記載の方法。

正しく組み立てられた形態の二価二重特異性抗体(1)および軽鎖が誤対合した形態の二価二重特異性抗体(2)。正しく組み立てられた形態の四価二重特異性抗体(1)および軽鎖が誤対合したいくつかの形態の四価二重特異性抗体(2、3、4、5)。プラスミンで消化した二価二重特異性抗体のIE;軽鎖1および重鎖1が第1の結合部位を形成し、軽鎖2および重鎖2が第2の結合部位を形成する;個々の対は、次の位置に予想されるはずである:A:軽鎖2+重鎖断片1、B:軽鎖1+重鎖1、C:軽鎖2+重鎖2、D:軽鎖1+重鎖2。プラスミンで消化した二価二重特異性抗体のIE;軽鎖1および重鎖1が第1の結合部位を形成し、軽鎖2および重鎖2が第2の結合部位を形成する;個々の対は、次の位置に予想されるはずである:A:軽鎖2+重鎖断片1、B:軽鎖1+重鎖1、C:軽鎖2+重鎖2、D:軽鎖1+重鎖2。 Lys-Cで限定消化した二価二重特異性抗体のIE;軽鎖1および重鎖1が第1の結合部位を形成し、軽鎖2および重鎖2が第2の結合部位を形成する;個々の対は、次の位置に予想されるはずである:A:軽鎖2+重鎖断片1、B:軽鎖1+重鎖1、C:軽鎖2+重鎖2、D:軽鎖1+重鎖2。四価二重特異性抗体のIE;A:3倍の軽鎖1;B:正しく組み立てられた抗体;C:3倍の軽鎖2。タンパク質分解消化された四価二重特異性抗体のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーの通過画分のMS解析、ISCID=0、A:正確に対合したFab、B:誤対合したFab。タンパク質分解消化された四価二重特異性抗体のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーの通過画分のMS解析、ISCID=90、A:正確に対合したFab、B:誤対合したFab。タンパク質分解消化された四価二重特異性抗体のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーの溶出液のMS解析、ISCID=0、B:正確に対合したFc-Fab、B:誤対合したFc-Fab。タンパク質分解消化された四価二重特異性抗体のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーの溶出液のMS解析、ISCID=90、A:正確に対合したFc-Fab、B:誤対合したFc-Fab。ペプシン消化した四価二重特異性抗体のEI。

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に修正を加えられることが理解される。

材料および一般的方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において示されている。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義したように、Kabatによる番号付与方式に従って番号付与され、言及される(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。

組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、化学合成によって作製したオリゴヌクレオチドから調製した。特異な(singular)制限エンドヌクレアーゼ切断部位にはさまれた600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによって組み立て、続いて、指定された制限部位、例えば、KpnI/SacIまたはAscI/PacIを介して、pPCRScript(Stratagene)に基づくpGA4クローニングベクター中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子合成断片は、所与の仕様に従ってGeneart(Regensburg, Germany)に注文した。

DNA配列決定
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)またはSequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)で実施された二重鎖配列決定によって決定された。

DNAおよびタンパク質の配列解析および配列データの管理
GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomaxのVector NT1 Advance suiteバージョン8.0を、配列の作製、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。

発現ベクター
前述の抗体を発現させるために、CMV-イントロンAプロモーターを含むもしくは含まないcDNA構成、またはCMVプロモーターを含むゲノム構成のいずれかに基づく、(例えば、HEK293 EBNAまたはHEK293-F細胞における)一過性発現のための発現プラスミドの変種を適用した。

抗体発現カセットのほかに、これらのベクターは以下を含んだ:
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。

抗体遺伝子の転写単位は、以下のエレメントから構成された:
-5'末端の独特な制限部位
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-続いて、cDNA構成の場合、イントロンA配列、
-ヒト抗体遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-cDNAとして、または免疫グロブリンのエキソン-イントロン構成を有するゲノム構成としてのいずれかの、ヒト抗体鎖(野生型またはドメイン交換されたもの)、
-ポリアデニル化シグナル配列を有する3'非翻訳領域、ならびに
-3'末端の独特な制限部位。

後述の抗体鎖を含む融合遺伝子をPCRおよび/または遺伝子合成によって作製し、公知の組換え法および組換え技術により、例えば、各ベクター中の独特な制限部位を用いて、一致する核酸セグメントを連結することによって、組み立てた。サブクローニングした核酸配列は、DNA配列決定によって確認した。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌培養物(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)からのプラスミド調製によって、より多量のプラスミドを調製した。

細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に説明されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。

後述するように、接着状態で増殖するHEK293-EBNAにおいて、または懸濁状態で増殖するHEK29-F細胞において、各発現プラスミドを一過性に同時トランスフェクションすることによって、多重特異性抗体を発現させた。

HEK293-EBNA系における一過性トランスフェクション
10％の超低IgG FCS(fetal calf serum、Gibco(登録商標))、2mM L-グルタミン(Gibco(登録商標))、および250μg/mlジェネテシン(Gibco(登録商標))を添加したDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium、Gibco(登録商標))中で培養した、接着状態で増殖するHEK293-EBNA細胞(human embryonic kidney cell line 293 expressing Epstein-Barr-Virus nuclear antigen;アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ATCC CRL-10852、ロット959 218)において、(例えば、重鎖および改変された重鎖、ならびに対応する軽鎖および改変された軽鎖をコードする)各発現プラスミドを一過性に同時トランスフェクションすることによって、多重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションのために、FuGENE(商標)6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals)を、4:1(3:1〜6:1の範囲)のFuGENE(商標)試薬(μl)とDNA(μg)の比率で使用した。(改変型および野生型の)軽鎖および重鎖をコードするプラスミドを1:1(等モル)(1:2〜2:1の範囲)のモル比でそれぞれ用いて、各プラスミドからタンパク質を発現させた。3日目に、L-グルタミン(4mM)、グルコース[Sigma]、およびNAA[Gibco(登録商標)]を細胞に与えた。多重特異性抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクション後5〜11日目に遠心分離によって回収し、-20℃で保存した。例えばHEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組み換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203において与えられている。

HEK293-F系における一過性トランスフェクション
製造業者の取扱い説明書に従ってHEK293-F系(Invitrogen)を用いて、(例えば、重鎖および改変された重鎖、ならびに対応する軽鎖および改変された軽鎖をコードする)各プラスミドで一過性トランスフェクションすることによって、多重特異性抗体を作製した。簡単に説明すると、無血清FreeStyle(商標)293発現培地(Invitrogen)を入れた振盪フラスコまたは撹拌発酵槽のいずれかにおいて、懸濁した状態で増殖するHEK293-F細胞(Invitrogen)を、4種の発現プラスミドおよび293フェクチン(商標)またはフェクチン(Invitrogen)の混合物を用いてトランスフェクトした。2L容振盪フラスコ(Corning)の場合、600mL中に1.0E*6細胞/mLの密度でHEK293-F細胞を播種し、120rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、約1.5E*6細胞/mLの細胞密度の細胞を、A)それぞれ重鎖または改変された重鎖、および等モル比の対応する軽鎖をコードする全プラスミドDNA(1μg/mL)600μgを含むOpti-MEM(Invitrogen)20mLならびにB)Opti-MEM 20ml+293フェクチンまたはフェクチン(2μL/mL)1.2mLからなる約42mLの混合物を用いてトランスフェクトした。グルコース消費に応じて、発酵の過程でグルコース溶液を添加した。分泌された抗体を含む上清を5〜10日後に回収し、抗体を上清から直接的に精製するか、または上清を凍結し、保存した。

タンパク質測定
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従いアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製した抗体および誘導体のタンパク質濃度を決定した。

上清中の抗体濃度の測定
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、プロテインAアガロース-ビーズ(Roche)を用いる免疫沈降法によって推定した。プロテインAアガロースビーズ60μLを、TBS-NP40(50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1％ Nonidet-P40)中で3回洗浄した。続いて、細胞培養上清1〜15mLを、TBS-NP40中で予め平衡にしたプロテインAアガロースビーズに添加した。室温で1時間インキュベーションした後、Ultrafree-MCフィルターカラム(Amicon)を用いて、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝生理食塩水(2×PBS、Roche)で2回、0.5mLの100mMクエン酸Na(pH5.0)で手短に4回、ビーズを洗浄した。NuPAGE(登録商標)LDS試料緩衝液(Invitrogen)35μlを添加することによって、結合した抗体を溶出させた。試料の半分をそれぞれ、NuPAGE(登録商標)試料還元剤と混合するか、または還元しないままにし、70℃で10分間加熱した。したがって、(非還元SDS-PAGEの場合はMOPS緩衝液を用い、還元SDS-PAGEの場合はNuPAGE(登録商標)抗酸化泳動用緩衝液添加剤(Invitrogen)を含むMES緩衝液を用いる)4〜12％ NuPAGE(登録商標)Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen)に5〜30μlを添加し、クーマシーブルーで染色した。

細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、アフィニティーHPLCクロマトグラフィーによって定量的に測定した。簡単に説明すると、Agilent HPLC 1100システムにおいて、プロテインAに結合する抗体および誘導体を含む細胞培養上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH 7.4にてApplied Biosystems Poros A/20カラムにかけ、200mM NaCl、100mMクエン酸、pH2.5を用いてマトリックスから溶出させた。溶出させたタンパク質を、UV吸光度およびピーク領域の積分によって定量した。精製された標準IgG1抗体が、標準物質としての機能を果たした。

別法として、細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、サンドイッチ-IgG-ELISAによって測定した。簡単に説明すると、StreptaWellハイバインドストレプトアビジンA-96ウェルマイクロタイタープレート(Roche)を、100μL/ウェルのビオチン標識抗ヒトIgG捕捉分子F(ab')2<h-Fcγ> BI(Dianova)(濃度0.1μg/mL)で、室温で1時間あるいは4℃で一晩、コーティングし、続いて、200μL/ウェルのPBS、0.05％ Tween(PBST、Sigma)で3回洗浄した。100μL/ウェルの、各抗体を含む細胞培養上清のPBS(Sigma)中希釈系列を、ウェルに添加し、マイクロタイタープレート振盪機上で室温で1〜2時間、インキュベートした。200μL/ウェルのPBSTでウェルを3回洗浄し、室温、マイクロタイタープレート振盪機上で1〜2時間、濃度0.1μg/mLのF(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)100μLを検出抗体として用いて、結合した抗体を検出した。未結合の検出抗体を、200μL/ウェルのPBSTで3回洗い流し、100μL ABTS/ウェルの添加によって、結合した検出抗体を検出した。吸光度の測定は、Tecan Fluor分光計を用いて405nmの測定波長(基準波長492nm)において実施した。

タンパク質精製
標準プロトコールを参照して、ろ過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。端的に言えば、抗体をプロテインAセファロースカラム(GE healthcare)に添加し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で実行し、続いて、直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSまたは20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0におけるサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって単量体抗体から分離した。単量体抗体画分を集め、例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)遠心濃縮装置を用いて(必要に応じて)濃縮し、凍結し-20℃または-80℃で保存した。これらの試料の一部を、例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、または質量分析法によるその後のタンパク質解析および解析による特徴付けのために提供した。

SDS-PAGE
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。具体的には、10％または4〜12％のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化泳動用緩衝液添加剤を含む)泳動用緩衝液またはMOPS(非還元ゲル)泳動用緩衝液を使用した。

解析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を判定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、HPLCクロマトグラフィーによって実施した。簡単に説明すると、プロテインAによって精製した抗体を、Agilent HPLC 1100システムにおいて300mM NaCl、50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄、pH 7.5でTosoh TSKgel G3000SWカラムに、またはDionex HPLCシステムにおいて2×PBSでSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に、かけた。溶出させたタンパク質を、UV吸光度およびピーク領域の積分によって定量した。BioRadゲルろ過標準物質151-1901が、標準物質としての機能を果たした。

実施例1
タンパク質限定分解消化の後に多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法
予測される一次構造を、LysCによって限定消化したCrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)によって解析した。抗体を前もって脱グリコシル化しておくと有利であった。

VH/VL CrossMabを、タンパク質濃度1mg/mLおよび100:1の抗体:酵素比で、37℃にて最長17時間、リン酸緩衝液またはTris緩衝液またはヒスチジン緩衝液において、N-グリコシダーゼFを用いて脱グリコシル化した。Lys-C(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)限定消化を、37℃にて40分間、Tris緩衝液pH8において、100μgの脱グリコシル化VH/VL CrossMabを用いて実施した。

質量分析の前に、Sephadex G25カラム(GE Healthcare)を用いるHPLCによって試料を脱塩した。

TriVersa NanoMate供給源(Advion)を装備したmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム(Bruker Daltonik)において、ESI-MSによって、総質量を測定した。

実施例2
四価二重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法
四価二重特異性抗体を、タンパク質濃度1mg/mLおよび100:1の抗体:酵素比で、37℃にて最長17時間、リン酸緩衝液またはTris緩衝液またはヒスチジン緩衝液において、N-グリコシダーゼFを用いて脱グリコシル化した。Lys-C(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)限定消化を、タンパク質濃度約0.9mg/mLおよび50:1の抗体:酵素比で、37℃にて16時間、100mMクエン酸緩衝液pH3.7において、100μgの脱グリコシル化四価二重特異性抗体を用いて実施した。

Claims

多重特異性抗体の軽鎖対合を解析するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
多重特異性抗体を産生する哺乳動物細胞を選択するための、組換え哺乳動物細胞によって産生される多重特異性抗体の、タンパク質分解酵素による限定消化の使用。
以下の段階を含む、多重特異性抗体中の軽鎖対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定する段階。
以下の段階を含む、多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定し、それによって軽鎖誤対合を判定する段階。
以下の段階を含む、多重特異性抗体を産生する組換え哺乳動物細胞を選択するための方法:
a)すべての細胞が同じ多重特異性抗体を産生する多数の組換え哺乳動物細胞からなる組換え哺乳動物細胞のクローン集団によって産生される多重特異性抗体を含む試料を個々に、一定期間、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、
c)段階b)の結果から、各クローン細胞集団について多重特異性抗体の軽鎖誤対合の存在を判定する段階、および
d)段階c)の結果に基づいて、多重特異性抗体を産生する組換え細胞を選択する段階。
タンパク質分解酵素が、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、およびキモトリプシンからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用または方法。
タンパク質分解酵素がLys-Cである、請求項7記載の使用または方法。
インキュベートする段階が、35分〜45分間である、請求項1〜8のいずれか一項記載の使用または方法。
インキュベートする段階が、約40分間である、請求項9記載の使用または方法。
タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体が、脱グリコシル化多重特異性抗体である、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用または方法。
抗体と酵素の重量比が約1:200である、請求項1〜11のいずれか一項記載の使用または方法。
タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度が、200〜600μg/mLである、請求項1〜12のいずれか一項記載の使用または方法。
段階b)が、
b)段階a)のインキュベーション混合物を脱塩し、段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階
である、請求項4〜13のいずれか一項記載の方法。
多重特異性抗体が、モノクローナル多重特異性抗体である、請求項1〜14のいずれか一項記載の使用または方法。
多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用または方法。
多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用または方法。