JP2017509669A - 多重特異性抗体の軽鎖誤対合を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1995年に、Yamaguchiら(J. Immunol. Meth. 181 (1995) 259-267)(非特許文献1)は、リシルエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、メタロエンドペプチダーゼ、およびV8プロテアーゼを用いてマウス免疫グロブリンGを高度に特異的にタンパク質分解して断片化するための方法を報告した。この方法では、検討した反応条件のもとで、クロストリパイン、リシルエンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、およびV8プロテアーゼは、ヒンジ領域のIgG1およびIgG1-CMを選択的に切断することができなかった。
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定する段階。
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定し、それによって軽鎖誤対合を判定する段階。
a)すべての細胞が同じ多重特異性抗体を産生する多数の組換え哺乳動物細胞からなる組換え哺乳動物細胞のクローン集団によって産生される多重特異性抗体を含む試料を個々に、一定期間、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、
c)段階b)の結果から、各クローン細胞集団について多重特異性抗体の軽鎖誤対合の存在を判定する段階、および
d)段階c)の結果に基づいて、多重特異性抗体を産生する組換え細胞を選択する段階。
b)段階a)のインキュベーション混合物を脱塩し、段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階
である。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示内容を含む。したがって、例えば、「細胞(a cell)」への言及は、複数のそのような細胞および当業者に公知であるその等価物などを含む。同様に、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」といった用語もまた、本明細書において同義的に使用され得る。これとは対称的に、「1つの細胞(one cell)」への言及は、複数のそのような細胞を含まず、単一の(単離された)細胞に限定される。
タンパク質限定分解消化およびESI-MS解析に基づく、多重特異性抗体を調製する際の軽鎖誤対合を判定するための方法が、本明細書において報告される。この方法は、品質管理または細胞株選択のために使用することができる。
-Ides:ヒンジ領域より下を切断する(L234A、L235A変異を有する抗体においては使用できない)
-プラスミン:ヒンジ領域より上を切断する
-ペプシン:ヒンジ領域より下を切断する;分解されたFc領域を生じる
-Lys-C:ヒンジ領域より上を切断する。
特定の態様において、本明細書において報告される方法を用いて解析する抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えばUS4,816,567、およびMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855において説明されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒト以外の霊長類、例えばサルに由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
特定の態様において、本明細書において報告される方法において解析される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において概説されている。
本明細書において報告される方法において解析される抗体は、所望の1種または複数種の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;およびLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132においてさらに説明されている。
2つまたはそれ以上の抗原に結合できる二重特異性抗体または多重特異性抗体などの操作されたタンパク質は、当技術分野において公知である。このような多重特異的結合タンパク質は、細胞融合技術、化学的結合技術、または組換えDNA技術を用いて作製することができる。
1つの態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二価二重特異性抗体である。
軽鎖内部で
可変軽鎖ドメインVLは、該抗体の可変重鎖ドメインVHで置換されており、
重鎖内部で
可変重鎖ドメインVHは、該抗体の可変軽鎖ドメインVLで置換されている。
i)a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸(Kabatによる番号付与)は、正電荷を持ったアミノ酸によって置換されており、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸(KabatのEU指標による番号付与)は、負電荷を持ったアミノ酸によって置換されているか、
または
ii)b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸(Kabatによる番号付与)は、正電荷を持ったアミノ酸によって置換されており、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸(KabatのEU指標による番号付与)は、負電荷を持ったアミノ酸によって置換されている。
i)a)の第1の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸は、独立にリジン(K)、アルギニン(R)、もしくはヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付与)(1つの好ましい態様において、独立にリジン(K)もしくはアルギニン(R)による)、a)の第1の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸もしくは213位のアミノ酸は、独立にグルタミン酸(E)もしくはアスパラギン酸(D)によって置換されているか(KabatのEU指標による番号付与)、
または
ii)b)の第2の軽鎖の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸は、独立にリジン(K)、アルギニン(R)、もしくはヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付与)(1つの好ましい態様において、独立にリジン(K)もしくはアルギニン(R)による)、b)の第2の重鎖の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸もしくは213位のアミノ酸は、独立にグルタミン酸(E)もしくはアスパラギン酸(D)によって置換されている(KabatのEU指標による番号付与)。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替わっており、かつ第2の軽鎖および第2の重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二価二重特異性抗体である。
可変軽鎖ドメインVLは、該抗体の可変重鎖ドメインVHで置換されており、定常軽鎖ドメインCLは、該抗体の定常重鎖ドメインCH1で置換されており;
かつ
重鎖内部で
可変重鎖ドメインVHは、該抗体の可変軽鎖ドメインVLで置換されており、定常重鎖ドメインCH1は、該抗体の定常軽鎖ドメインCLで置換されている。
a)第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)第2の軽鎖および第2の重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二価二重特異性抗体である。
軽鎖内部で
定常軽鎖ドメインCLは、該抗体の定常重鎖ドメインCH1で置換されており;
かつ、重鎖内部で
定常重鎖ドメインCH1は、該抗体の定常軽鎖ドメインCLで置換されている。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、ならびに
b)1〜4個の別の抗原(すなわち、好ましくは1つの別の抗原、すなわち第2の抗原に特異的に結合する、第2および/または第3および/または第4および/または第5の抗原)に特異的に結合する1つ、2つ、3つ、または4つの単鎖Fab断片
を含み、
b)の該単鎖Fab断片が、a)の該完全長抗体に、該完全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端の位置でペプチドリンカーを介して融合されており、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
多重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、
b)ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH)、
または
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)および抗体定常ドメイン1(CH1)
からなる第1のポリペプチドであって、
該第1のポリペプチドが、そのVHドメインのN末端において、該完全長抗体の2本の重鎖の内の一方のC末端にペプチドリンカーを介して融合されている、第1のポリペプチド、
c)ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、
または
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)および抗体軽鎖定常ドメイン(CL)
からなる第2のポリペプチドであって、
該第2のポリペプチドが、そのVLドメインのN末端において、該完全長抗体の2本の重鎖の内の他方のC末端にペプチドリンカーを介して融合されている、第2のポリペプチド
を含み、
第1のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)と第2のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)とが一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
三価二重特異性抗体である。
i)重鎖可変ドメイン44位〜軽鎖可変ドメイン100位、または
ii)重鎖可変ドメイン105位〜軽鎖可変ドメイン43位、または
iii)重鎖可変ドメイン101位〜軽鎖可変ドメイン100位(番号付与は、常にKabatのEU指標に基づく)。
a)第1の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
b)可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替わっており、かつ/または定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替わっている、第2の抗原に特異的に結合する完全長抗体の第2の(改変された)軽鎖および第2の(改変された)重鎖を含み、かつ
c)1つまたは2つの別の抗原に(すなわち、第3および/または第4の抗原に)特異的に結合する1〜4個の抗原結合ペプチドが、a)および/またはb)の軽鎖または重鎖のC末端またはN末端にペプチドリンカーを介して融合されており、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
三重特異性または四重特異性の抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合する(かつ2つのFab断片を含む)、抗体の2本の軽鎖および2本の重鎖、
b) 第2の抗原に特異的に結合する、抗体の2つの追加のFab断片であって、a)の重鎖のC末端またはN末端のいずれかにペプチドリンカーを介して両方とも融合されている、抗体の2つの追加のFab断片
を含み、
その際、これらのFab断片において、以下の改変:
i)a)の両方のFab断片において、もしくはb)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつ/もしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
ii)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられ、かつ
b)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられるか、もしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
iii)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられるか、もしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられ、かつ
b)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつ定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
iv)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、かつb)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられるか、
または
v)a)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられ、かつb)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられる、
が行われたものであり、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二重特異性四価抗体である。
i)a)の両方のFab断片において、もしくはb)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。
i)a)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。
i)a)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。
i)b)の両方のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに入れ替えられ、
かつ/または
定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。
i)b)の両方のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに入れ替えられる。
a)第1の抗原に特異的に結合し、かつ第1のVH-CH1ドメイン対を含む、第1の抗体の(改変された)重鎖であって、該重鎖のC末端に、該第1の抗体の第2のVH-CH1ドメイン対のN末端がペプチドリンカーを介して融合されている、第1の抗体の(改変された)重鎖、
b)a)の該第1の抗体の2本の軽鎖、
c)第2の抗原に特異的に結合し、かつ第1のVH-CLドメイン対を含む、第2の抗体の(改変された)重鎖であって、該重鎖のC末端に、該第2の抗体の第2のVH-CLドメイン対のN末端がペプチドリンカーを介して融合されている、第2の抗体の(改変された)重鎖、および
d)CL-CH1ドメイン対をそれぞれ含む、c)の該第2の抗体の2本の(改変された)軽鎖を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二重特異性四価抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b)重鎖のN末端がペプチドリンカーを介して軽鎖のC末端に連結されている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の重鎖および軽鎖
を含み、
第1の抗原および第2の抗原が異なる、
二重特異性抗体である。
a)第1の抗原に特異的に結合し、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる、完全長抗体、ならびに
b)第2の抗原に特異的に結合する、VH2ドメインおよびVL2ドメインを含むFv断片であって、両方のドメインがジスルフィド架橋によって互いに連結されている、Fv断片
を含み、
VH2ドメインまたはVL2ドメインのどちらか一方のみが、第1の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖または軽鎖にペプチドリンカーを介して融合されており、
第1の抗原および第2の抗原が異なる抗原である、
二重特異性抗体である。
-N、R、Q、K、D、E、およびWより選択されるアミノ酸による、411位のアミノ酸Tの置換(KabatのEU指標による番号付与)
-R、W、Y、およびKより選択されるアミノ酸による、399位のアミノ酸Dの置換(KabatのEU指標による番号付与)、
-E、D、R、およびKより選択されるアミノ酸による、400位のアミノ酸Sの置換(KabatのEU指標による番号付与)、
-I、M、T、S、V、およびWより選択されるアミノ酸による、405位のアミノ酸Fの置換(KabatのEU指標による番号付与)、
-R、K、およびDより選択されるアミノ酸による、390位のアミノ酸Nの置換(KabatのEU指標による番号付与)、ならびに
-V、M、R、L、F、およびEより選択されるアミノ酸による、392位のアミノ酸Kの置換(KabatのEU指標による番号付与)。
その際、
i)第1のFc領域ポリペプチドがヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドがヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
ii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
iii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329Gを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
iv)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
v)第1のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドであるか、または
vi)第1のFc領域ポリペプチドがヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドがヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
vii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235Eを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
viii)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329Gを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
ix)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであるか、または
x)第1のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329G、S354C、T366Wを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドであり、第2のFc領域ポリペプチドが、変異S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407Vを有するヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドである。
その際、抗体は、第1のFc領域ポリペプチド中および第2のFc領域ポリペプチド中に、以下の変異の組合せ
i)I253A、H310A、およびH435A、または
ii)H310A、H433A、およびY436A、または
iii)L251D、L314D、およびL432D、または
iv)i)〜iii)の組合せ
を含む。
抗体は、例えば、US4,816,567において説明されているように、組換え法および組換え組成物を用いて作製することができる。必要とされる核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのこのような態様において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)である。1つの態様において、抗[[PRO]]抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収する段階を含む。
1. 多重特異性抗体の軽鎖対合を解析するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
2. 多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
3. 多重特異性抗体を産生する哺乳動物細胞を選択するための、組換え哺乳動物細胞によって産生される多重特異性抗体の、タンパク質分解酵素による限定消化の使用。
4. タンパク質分解酵素が、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、およびキモトリプシンからなる群より選択される、態様1〜3のいずれか1つに記載の使用。
5. タンパク質分解酵素がLys-Cである、態様4記載の使用。
6. インキュベートする段階が、35分〜45分間である、態様1〜5のいずれか1つに記載の使用。
7. インキュベートする段階が、約40分間である、態様6記載の使用。
8. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体が、脱グリコシル化多重特異性抗体である、態様1〜7のいずれか1つに記載の使用。
9. 抗体と酵素の重量比が約1:200である、態様1〜8のいずれか1つに記載の使用。
10. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度が、200〜600μg/mLである、態様1〜9のいずれか1つに記載の使用。
11. 多重特異性抗体が、モノクローナル多重特異性抗体である、態様1〜10のいずれか1つに記載の使用。
12. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む、態様1〜11のいずれか1つに記載の使用。
13. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む、態様1〜11のいずれか1つに記載の使用。
14. 以下の段階を含む、多重特異性抗体中の軽鎖対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定する段階。
15. 以下の段階を含む、多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定し、それによって軽鎖誤対合を判定する段階。
16. 以下の段階を含む、多重特異性抗体を産生する組換え哺乳動物細胞を選択するための方法:
a)すべての細胞が同じ多重特異性抗体を産生する多数の組換え哺乳動物細胞からなる組換え哺乳動物細胞のクローン集団によって産生される多重特異性抗体を含む試料を個々に、一定期間、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、
c)段階b)の結果から、各クローン細胞集団について多重特異性抗体の軽鎖誤対合の存在を判定する段階、および
d)段階c)の結果に基づいて、多重特異性抗体を産生する組換え細胞を選択する段階。
17. タンパク質分解酵素が、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、およびキモトリプシンからなる群より選択される、態様14〜16のいずれか1つに記載の方法。
18. タンパク質分解酵素がLys-Cである、態様17記載の方法。
19. インキュベートする段階が、35分〜45分間である、態様14〜18のいずれか1つに記載の方法。
20. インキュベートする段階が、約40分間である、態様19記載の方法。
21. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体が、脱グリコシル化多重特異性抗体である、態様14〜20のいずれか1つに記載の方法。
22. 抗体と酵素の重量比が約1:200である、態様14〜21のいずれか1つに記載の方法。
23. タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度が、200〜600μg/mLである、態様14〜22のいずれか1つに記載の方法。
24. 段階b)が、
b)段階a)のインキュベーション混合物を脱塩し、段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階
である、態様14〜23のいずれか1つに記載の方法。
25. 多重特異性抗体が、モノクローナル多重特異性抗体である、態様14〜24のいずれか1つに記載の方法。
26. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む、態様14〜25のいずれか1つに記載の方法。
27. 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む、態様14〜25のいずれか1つに記載の方法。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において示されている。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義したように、Kabatによる番号付与方式に従って番号付与され、言及される(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントは、化学合成によって作製したオリゴヌクレオチドから調製した。特異な(singular)制限エンドヌクレアーゼ切断部位にはさまれた600〜1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによって組み立て、続いて、指定された制限部位、例えば、KpnI/SacIまたはAscI/PacIを介して、pPCRScript(Stratagene)に基づくpGA4クローニングベクター中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子合成断片は、所与の仕様に従ってGeneart(Regensburg, Germany)に注文した。
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)またはSequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)で実施された二重鎖配列決定によって決定された。
GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomaxのVector NT1 Advance suiteバージョン8.0を、配列の作製、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。
前述の抗体を発現させるために、CMV-イントロンAプロモーターを含むもしくは含まないcDNA構成、またはCMVプロモーターを含むゲノム構成のいずれかに基づく、(例えば、HEK293 EBNAまたはHEK293-F細胞における)一過性発現のための発現プラスミドの変種を適用した。
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
-5'末端の独特な制限部位
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-続いて、cDNA構成の場合、イントロンA配列、
-ヒト抗体遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-cDNAとして、または免疫グロブリンのエキソン-イントロン構成を有するゲノム構成としてのいずれかの、ヒト抗体鎖(野生型またはドメイン交換されたもの)、
-ポリアデニル化シグナル配列を有する3'非翻訳領域、ならびに
-3'末端の独特な制限部位。
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に説明されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
10%の超低IgG FCS(fetal calf serum、Gibco(登録商標))、2mM L-グルタミン(Gibco(登録商標))、および250μg/mlジェネテシン(Gibco(登録商標))を添加したDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium、Gibco(登録商標))中で培養した、接着状態で増殖するHEK293-EBNA細胞(human embryonic kidney cell line 293 expressing Epstein-Barr-Virus nuclear antigen;アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ATCC CRL-10852、ロット959 218)において、(例えば、重鎖および改変された重鎖、ならびに対応する軽鎖および改変された軽鎖をコードする)各発現プラスミドを一過性に同時トランスフェクションすることによって、多重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションのために、FuGENE(商標)6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals)を、4:1(3:1〜6:1の範囲)のFuGENE(商標)試薬(μl)とDNA(μg)の比率で使用した。(改変型および野生型の)軽鎖および重鎖をコードするプラスミドを1:1(等モル)(1:2〜2:1の範囲)のモル比でそれぞれ用いて、各プラスミドからタンパク質を発現させた。3日目に、L-グルタミン(4mM)、グルコース[Sigma]、およびNAA[Gibco(登録商標)]を細胞に与えた。多重特異性抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクション後5〜11日目に遠心分離によって回収し、-20℃で保存した。例えばHEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組み換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203において与えられている。
製造業者の取扱い説明書に従ってHEK293-F系(Invitrogen)を用いて、(例えば、重鎖および改変された重鎖、ならびに対応する軽鎖および改変された軽鎖をコードする)各プラスミドで一過性トランスフェクションすることによって、多重特異性抗体を作製した。簡単に説明すると、無血清FreeStyle(商標)293発現培地(Invitrogen)を入れた振盪フラスコまたは撹拌発酵槽のいずれかにおいて、懸濁した状態で増殖するHEK293-F細胞(Invitrogen)を、4種の発現プラスミドおよび293フェクチン(商標)またはフェクチン(Invitrogen)の混合物を用いてトランスフェクトした。2L容振盪フラスコ(Corning)の場合、600mL中に1.0E*6細胞/mLの密度でHEK293-F細胞を播種し、120rpm、8%CO2でインキュベートした。翌日、約1.5E*6細胞/mLの細胞密度の細胞を、A)それぞれ重鎖または改変された重鎖、および等モル比の対応する軽鎖をコードする全プラスミドDNA(1μg/mL)600μgを含むOpti-MEM(Invitrogen)20mLならびにB)Opti-MEM 20ml+293フェクチンまたはフェクチン(2μL/mL)1.2mLからなる約42mLの混合物を用いてトランスフェクトした。グルコース消費に応じて、発酵の過程でグルコース溶液を添加した。分泌された抗体を含む上清を5〜10日後に回収し、抗体を上清から直接的に精製するか、または上清を凍結し、保存した。
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従いアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製した抗体および誘導体のタンパク質濃度を決定した。
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を、プロテインAアガロース-ビーズ(Roche)を用いる免疫沈降法によって推定した。プロテインAアガロースビーズ60μLを、TBS-NP40(50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1% Nonidet-P40)中で3回洗浄した。続いて、細胞培養上清1〜15mLを、TBS-NP40中で予め平衡にしたプロテインAアガロースビーズに添加した。室温で1時間インキュベーションした後、Ultrafree-MCフィルターカラム(Amicon)を用いて、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝生理食塩水(2×PBS、Roche)で2回、0.5mLの100mMクエン酸Na(pH5.0)で手短に4回、ビーズを洗浄した。NuPAGE(登録商標)LDS試料緩衝液(Invitrogen)35μlを添加することによって、結合した抗体を溶出させた。試料の半分をそれぞれ、NuPAGE(登録商標)試料還元剤と混合するか、または還元しないままにし、70℃で10分間加熱した。したがって、(非還元SDS-PAGEの場合はMOPS緩衝液を用い、還元SDS-PAGEの場合はNuPAGE(登録商標)抗酸化泳動用緩衝液添加剤(Invitrogen)を含むMES緩衝液を用いる)4〜12% NuPAGE(登録商標)Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen)に5〜30μlを添加し、クーマシーブルーで染色した。
標準プロトコールを参照して、ろ過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。端的に言えば、抗体をプロテインAセファロースカラム(GE healthcare)に添加し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で実行し、続いて、直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSまたは20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0におけるサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって単量体抗体から分離した。単量体抗体画分を集め、例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)遠心濃縮装置を用いて(必要に応じて)濃縮し、凍結し-20℃または-80℃で保存した。これらの試料の一部を、例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、または質量分析法によるその後のタンパク質解析および解析による特徴付けのために提供した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。具体的には、10%または4〜12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化泳動用緩衝液添加剤を含む)泳動用緩衝液またはMOPS(非還元ゲル)泳動用緩衝液を使用した。
抗体の凝集およびオリゴマー状態を判定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、HPLCクロマトグラフィーによって実施した。簡単に説明すると、プロテインAによって精製した抗体を、Agilent HPLC 1100システムにおいて300mM NaCl、50 mM KH2PO4/K2HPO4、pH 7.5でTosoh TSKgel G3000SWカラムに、またはDionex HPLCシステムにおいて2×PBSでSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に、かけた。溶出させたタンパク質を、UV吸光度およびピーク領域の積分によって定量した。BioRadゲルろ過標準物質151-1901が、標準物質としての機能を果たした。
タンパク質限定分解消化の後に多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法
予測される一次構造を、LysCによって限定消化したCrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)によって解析した。抗体を前もって脱グリコシル化しておくと有利であった。
四価二重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法
四価二重特異性抗体を、タンパク質濃度1mg/mLおよび100:1の抗体:酵素比で、37℃にて最長17時間、リン酸緩衝液またはTris緩衝液またはヒスチジン緩衝液において、N-グリコシダーゼFを用いて脱グリコシル化した。Lys-C(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)限定消化を、タンパク質濃度約0.9mg/mLおよび50:1の抗体:酵素比で、37℃にて16時間、100mMクエン酸緩衝液pH3.7において、100μgの脱グリコシル化四価二重特異性抗体を用いて実施した。
Claims (17)
- 多重特異性抗体の軽鎖対合を解析するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
- 多重特異性抗体中の軽鎖誤対合を判定するための、タンパク質分解酵素による多重特異性抗体の限定消化の使用。
- 多重特異性抗体を産生する哺乳動物細胞を選択するための、組換え哺乳動物細胞によって産生される多重特異性抗体の、タンパク質分解酵素による限定消化の使用。
- 以下の段階を含む、多重特異性抗体中の軽鎖対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定する段階。 - 以下の段階を含む、多重特異性抗体の軽鎖誤対合を判定するための方法:
a)一定期間、多重特異性抗体を含む試料をタンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、および
c)段階b)の結果から、多重特異性抗体の軽鎖対合を判定し、それによって軽鎖誤対合を判定する段階。 - 以下の段階を含む、多重特異性抗体を産生する組換え哺乳動物細胞を選択するための方法:
a)すべての細胞が同じ多重特異性抗体を産生する多数の組換え哺乳動物細胞からなる組換え哺乳動物細胞のクローン集団によって産生される多重特異性抗体を含む試料を個々に、一定期間、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする段階、
b)段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階、
c)段階b)の結果から、各クローン細胞集団について多重特異性抗体の軽鎖誤対合の存在を判定する段階、および
d)段階c)の結果に基づいて、多重特異性抗体を産生する組換え細胞を選択する段階。 - タンパク質分解酵素が、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、およびキモトリプシンからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用または方法。
- タンパク質分解酵素がLys-Cである、請求項7記載の使用または方法。
- インキュベートする段階が、35分〜45分間である、請求項1〜8のいずれか一項記載の使用または方法。
- インキュベートする段階が、約40分間である、請求項9記載の使用または方法。
- タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体が、脱グリコシル化多重特異性抗体である、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用または方法。
- 抗体と酵素の重量比が約1:200である、請求項1〜11のいずれか一項記載の使用または方法。
- タンパク質分解酵素と共にインキュベートされる多重特異性抗体の濃度が、200〜600μg/mLである、請求項1〜12のいずれか一項記載の使用または方法。
- 段階b)が、
b)段階a)のインキュベーション混合物を脱塩し、段階a)のタンパク質限定分解消化によって得られた断片の質量を質量分析によって特定する段階
である、請求項4〜13のいずれか一項記載の方法。 - 多重特異性抗体が、モノクローナル多重特異性抗体である、請求項1〜14のいずれか一項記載の使用または方法。
- 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも2本の軽鎖を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用または方法。
- 多重特異性抗体が、非ペプチド結合している少なくとも3つのポリペプチドを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用または方法。
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