JP2017506629A - 抗リンパ腫ペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は（ｉ）１０〜１６個のアミノ酸からなり；（ｉｉ）（ａ）グアニジニウム基を含む側鎖、または（ｂ）アミノ基を含む側鎖のいずれかをもつ、少なくとも８個のカチオン性アミノ酸を有し、該カチオン性アミノ酸の７個以下が連続しており、（ｉｉｉ）連続していない２個のトリプトファン残基、または全てが連続してはいない３個のトリプトファン残基を有するペプチドであって、必要に応じて塩、エステルもしくはアミドの形であるペプチド、または上記ペプチドのペプチド疑似体を提供する。本発明はさらに、これらの化合物を含む医薬組成物、治療における、特に抗腫瘍剤、例えば抗リンパ腫剤としての、これらの化合物の使用、および治療目的ではないこれらの化合物の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は新規のペプチド、およびその固形腫瘍、特にリンパ腫の治療における使用に関する。

リンパ腫とは 一般的にリンパ細胞の固形腫瘍のことを指す。悪性のＴリンパ球、Ｂリンパ球またはナチュラルキラー細胞はしばしばリンパ節に発生し、リンパ節の肥大（腫瘍）となって現れる。リンパ腫は脾臓、骨髄、皮膚、脳、腸、および骨にできることもある。

２０１１年におけるリンパ腫であるか、またはその寛解期にあるアメリカ国民は６５万人を超え、国内において７番目に多いがんである。２つの主なタイプのリンパ腫はホジキンリンパ腫（ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であり、いずれも加齢と強い相関を示す。ＮＨＬは通常年配の患者がなる一方、ＨＬは主に若い成人にみられる。最新の治療（化学療法、放射線療法、またはそれらの併用）により、近年リンパ腫の予後は改善されてきた。しかしながら、治療にはいまだいくつかの副作用が伴い、その多くが長期的で深刻なもの（例えば、副次的ながんの形成）である。例えば生殖能の喪失など、これらの副作用の多くは治療の代償として年配の患者には許容可能であるかもしれないが、若い患者の人生にとっては深刻な影響を与えるものである。ゆえに患者の長い予後を改善するための新しい薬剤および治療戦略の開発に向けた努力が続けられている。

過去１０年間、我々はα‐へリックスカチオン性両親媒性ペプチド（ＣＡＰ）を用いた、固形腫瘍の病巣内治療に向けた新たな戦略を開発してきた。このアプローチの裏付けとなる理論的根拠は、ホスファチジルセリンおよびシアル酸などの過剰発現により、がん細胞膜には多くの場合負の電荷を持ったマクロ分子が多く含まれるということである。このアニオン性の上昇により、がん細胞は、がんでない細胞よりも、正の電荷をもつＣＡＰとのイオン性相互作用をしやすくなる。この初期のイオン性相互作用に続いて、膜の破壊、および最終的にはがん細胞の半選択的な溶解が起きる。わずか９個のアミノ酸を含むペプチドであるＬＴＸ−３１５（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｄｉｐ−Ｌｙｓ、配列番号：１）は、Ｌｙｔｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ ＡＳにより、臨床試験（フェーズＩ）において様々な種の固形腫瘍に対する試験が行われている。

しかしながら，ＣＡＰを用いたリンパ腫瘍の治療は他の種の固形腫瘍に比べてより難しい課題である。ほとんどの固形腫瘍が対象として明確であるのに対して、リンパ腫は多くの場合、性質上より散在的であり、多数の正常リンパ球を含んでいる。ゆえにＣＡＰの限定された選択性は、正常リンパ球、他の免疫細胞，および周辺の健常な組織に許容することのできないレベルの副次的なダメージを与えることになる。したがってさらに選択的なアプローチがリンパ腫の治療に対しては必要であるだろう。

Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１０）５９：１２８５１２９４）は、ＣＡＰを用いた病巣内における治療はマウスのリンパ腫を退縮させ、防御免疫応答を開始させることができるが、これらの分子（例えば、Ｗ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｗ‐ＤｉｐＫ‐Ｋ‐Ｗ‐Ｋ‐アミド、配列番号：２）は標的がん細胞に対して特に選択性をもたないことを示した。

したがって、経済的に製造および処方することができる、効果的でありながら選択的な薬剤を利用した、代替的または改良された抗リンパ腫治療が要求されている。その薬剤は、特異的な免疫を誘導することにより、再発および転移に対する直接的な抗腫瘍効果および保護作用を持つことが好ましい。

これらの要求に対して、発明者らは抗リンパ腫活性がある新規クラスのペプチドを作り出し、試験を行った。
したがって本発明の第一の態様は、
（ｉ）１０〜１６個のアミノ酸からなり；
（ｉｉ）
（ａ）グアニジニウム基を含む側鎖、または
（ｂ）アミノ基を含む側鎖
のいずれかをもつ、少なくとも８個のカチオン性アミノ酸を有し、該カチオン性アミノ酸の７個以下が連続しており；
（ｉｉｉ）連続していない２個のトリプトファン残基、または全てが連続してはいない３個のトリプトファン残基を有するペプチド；または、上記ペプチドのペプチド疑似体を提供する。

本発明の好ましい様態は、
（ｉ）１０〜１６個のアミノ酸からなり；
（ｉｉ）グアニジニウム基を含む側鎖をもつ少なくとも８個のアミノ酸残基を有し、該カチオン性アミノ酸の７個以下が連続しており；
（ｉｉｉ）連続していない２個のトリプトファン残基、または全てが連続してはいない３個のトリプトファン残基を有するペプチド；または、上記ペプチドのペプチド疑似体を提供する。

本発明のペプチドは環状であってもよく、その環化にはアミノおよび／またはカルボキシ末端または１以上のアミノ酸側鎖が関わっていてもいなくてもよいが、好ましくは線状である。同様に、本発明のペプチド疑似体は環状分子であってもよいが、好ましくは線状である。通常、本発明のペプチドに関する特徴および好ましい実施形態は、適当な変更を加えて本発明のペプチド疑似体に適応する。

好ましいペプチドは１２〜１５個または１６個のアミノ酸、および９個以上、例えば９または１０個の上で定義したようなカチオン性アミノ酸を有する。好ましいペプチドは３個のトリプトファン（一般に認められている３文字および１文字のコードでＴｒｐまたはＷ）残基を有する。好ましくは、ペプチドはこれらの２つのタイプのアミノ酸しか有さないが、Ｔｒｐ残基およびカチオン性の残基の間のスペーサーとして働く他のアミノ酸を含んでいてもよい。したがってペプチドは１〜６個の他の残基、好ましくは１個、２個、３個、または４個の他の残基（便宜上Ｘ残基と呼ぶ）を含んでいてもよい。これらの残基は、同じものであっても異なっていてもよいが、小さく（例えば、側鎖の水素ではない原子が４個以下である）、非電荷および非極性であることが好ましい。好ましい残基としてはグリシン（Ｇ）および６−アミノヘキサン酸が挙げられる。したがって、そのような残基を含む実施形態において、ペプチドは通常、Ｔｒｐ残基および本明細書で定義したようなカチオン性アミノ酸の両方に隣接した残基Ｘを含み、それぞれのＴｒｐ残基がＸ残基と隣接していてもよい。Ｘ残基が組み込まれたペプチドの例としては以下のものが挙げられる：
ＷＸＲＲＲＲＲＸＷＸＲＲＲＲＸＷ（配列番号：３）
ＷＸＲＲＲＲＷＲＲＲＲＸＷ（配列番号：４）
ＲＲＲＲＸＷＸＲＲＲＲＷ（配列番号：５）
ＫＫＫＫＸＷＸＫＫＫＫＷ（配列番号：６）
ＫＲＫＲＸＷＸＫＲＫＲＷ（配列番号：７）、および
ＷＲＷＲＷＸＸＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号：２７）。

グアニジニウム基を含む側鎖を有する好ましいアミノ酸残基は、アルギニン（本明細書で用いられている３文字コードおよび１文字コードではＡｒｇまたはＲ）およびホモアルギニンである。グアニジニウム基はグアニジンがプロトン化されたカチオン（生理的条件下でプロトン化されたもの）であり、次の式、ＲＮＨＣ（ＮＨ₂）₂ ⁺で表わすことができる。本明細書では便宜的に、グアニジニウム基を含む側鎖を有するアミノ酸残基をグアニジウム含有残基と呼ぶ。

「側鎖」は様々なアミノ酸の基（しばしばＲ基と呼ばれる）を指し、一般的にα炭素に結合しているが、β−アミノ酸などのβ炭素に結合していてもよい。
アミノ基を含む側鎖を持つ好ましいアミノ酸は、リシン（３文字コードおよび１文字コードでＬｙｓまたはＫ）およびアミノカプロン酸やオルニチンなどのリシンの誘導体（側鎖は１以上のアミノ基を含んでいてもよい）である。アミノ基（‐ＮＨ₂）は通常線状の（または分岐した）アルキル基（例えば、Ｃ₂−Ｃ₈アルキル）に結合しており、側鎖は通常他のヘテロ原子を含まない。

ペプチドが３個のＴｒｐ残基を有しているときには、それらは、２個のＴｒｐ残基が隣接しないようにペプチド中に分散していることが好ましい。どの２個のＴｒｐ残基の間も、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも３個のカチオン性アミノ酸で隔てられている。

いくつかの好ましい実施形態では、Ｔｒｐ残基はペプチドまたはペプチド疑似体のＮ末端および／またはＣ末端に見られる。
好ましくは本発明のペプチドは６個以下、さらに好ましくは５個以下の連続した、本明細書で定義したようなカチオン性アミノ酸を有する。

本発明のペプチドおよびペプチド疑似体は全ての鏡像異性体を含み，特に本発明の分子はＤ型および／またはＬ型のアミノ酸を含んでいてもよい。
本発明のペプチドは好ましくは少なくとも８個のグアニジウム含有残基を含み、好ましくは全てのカチオン性アミノ酸がこの種のものである。あるいは、ペプチドは、そのカチオン性アミノ酸の全てが側鎖にアミノ基を含む種類のもの（例えばＬｙｓ）であってもよいし、２種類のカチオン性アミノ酸の混合物、例えばアミノ基を含む側鎖を有する１〜３個のカチオン性アミノ酸であってもよい。

いくつかの好ましい実施形態においては、本発明の分子は少なくとも５個の連続した、上で定義したようなカチオン性アミノ酸のブロックを１つ含み、必要に応じて、そのようなカチオン性アミノ酸が少なくとも３個連続した２つ目のブロックを含んでいてもよい。好ましくは、これらは全てグアニジウム含有残基である。

本発明の分子はアミド化、エステル化されていてもよく、塩であってもよく、これらの形で投与してもよい。好適で生理学的に許容可能な塩は当業者に周知であり、無機塩または有機塩が挙げられ、好ましい塩としてはトリフルオロ酢酸塩，酢酸塩および塩酸塩が挙げられる。分子はＮおよび／またはＣ末端が修飾されたものであってもよい。好ましい例としては、Ｎ末端をアセチル化することでアルキル化したアミンを形成したり、チオール修飾、例えばＮ末端にシステアミン基を形成したりすることが挙げられる。Ｃ末端は簡単にアミド化されるが、代わりにエステルを形成することもできる。Ｃ末端がアミド化される方が好ましい。ゆえに「ペプチド」は修飾されたＮおよび／またはＣ末端を有するペプチドを含み、ペプチド疑似体は同様に修飾されてもよい。

カチオン性残基は非遺伝学的にコードされていてもよく、ペプチドは他の非遺伝学的にコードされたアミノ酸を含んでいてもよい。つまり、遺伝子コードの２０個の標準アミノ酸以外のアミノ酸がＸ残基の中に含まれていてもよい。

ペプチド疑似体は通常、対応するペプチドの、極性、３次元的大きさおよび機能（生理活性）が保たれていることより特徴づけられるが、しばしばさらに安定性の高い結合により１以上のペプチド結合が置換される。「安定性のある」とは加水分解酵素による酵素分解に対して抵抗性がある、という意味である。一般的にアミド結合を置き換える結合（アミド結合代替物）は、アミド結合の特性、例えばコンフォメーション、立体的な嵩高さ、電気的性質、水素結合をつくる可能性などの多くを保存している。“Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”， Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ， Ｌａｒｓｅｎ， Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ ａｎｄ Ｍａｄｓｅｎ （Ｅｄｓ） １９９６， Ｈｏｒｗｏｏｄ Ａｃａｄ．Ｐｕｂの１４章において、ペプチド疑似体の合成およびデザインの技術についての一般的な議論が行われている。好適なアミド結合代替物としては以下の基が挙げられる：Ｎ−アルキル化した基（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， １９９５， ４６，４７）、レトロ逆アミド〔ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ ａｍｉｄｅ〕（Ｃｈｏｒｅｖ， Ｍ ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ， Ｍ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ， １９９３， ２６， ２６６）、チオアミド（Ｓｈｅｒｍａｎ Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９０， １１２， ４３３）、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン（Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ．Ｖ．ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｈ．Ｏ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９５， ６０， ５１０７）、ヒドロキシメチレン 、フルオロビニル（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ３１， ７２９７）、ビニル、メチレンアミノ（Ｓａｓａｋｉ， Ｙ ａｎｄ Ａｂｅ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １９９７ ４５， １３）、メチレンチオ（Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １９９３， １３， １９）、アルカン（Ｌａｖｉｅｌｌｅ， Ｓ． ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， １９９３， ４２， ２７０）およびスルホンアミド（Ｌｕｉｓｉ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９３， ３４， ２３９１）。

本発明のペプチド疑似体である化合物は通常、アミノ酸、例えばＡｒｇなどのグアニジウム含有残基またはＴｒｐと大きさおよび機能がほとんど等しい、同定可能なサブユニットを有する。「アミノ酸」という用語はしたがって、本明細書においてはペプチド疑似体化合物のサブユニットの等価物を呼ぶため、便宜的に使うことが出来る。

上記の文献で議論されているように、アミド結合の置換と同じように、ジペプチド疑似体構造またはトリペプチド疑似体構造によるさらに大きな構造部位の置換にペプチド疑似体は関わっており、この場合、アゾール由来の疑似体などの、ペプチド結合が関わっている疑似的な部位はジペプチドの置換に用いることができる。

しかしながら、上述のとおりペプチド疑似体、つまりペプチド疑似体の骨格においてアミド結合だけが置換されていることが好ましい。
好適なペプチド疑似体としては、ボラン、または水素化アルミニウムリチウムなどのヒドリド試薬による還元剤処理により、アミド結合がメチレンアミンに還元された還元型のペプチドが挙げられる。そのような還元は、分子の全体的なカチオン性を増加させるという更なる利点を有する。

他のペプチド疑似体としては、例えば、アミドを官能基化したポリグリシンの段階的な合成により形成された、ぺプトイドが挙げられる。いくつかのペプチド疑似体の骨格は、パーメチル化されたペプチドなどの、ペプチド前駆体から容易に得ることができ、適当な方法はＯｓｔｒｅｓｈ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９４） ９１， １１１３８−１１１４２に記載されている。強い塩基性の環境はＯ−メチル化よりもＮ−メチル化にとって都合がよく、一部のまたは全てのペプチド結合内の窒素原子およびＮ末端の窒素がメチル化する。

好ましいペプチド疑似体の骨格としては、置換されたアルカンおよびアルケンのほかに、ポリエステル、ポリアミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。ペプチド疑似体は、好ましくは本明細書で述べたように、修飾されていてもよいＮ末端およびＣ末端を含む。

βおよびγアミノ酸は(アミノ酸と同様に「アミノ酸」という用語に含まれており、Ｎ−置換グリシンも同様である。本発明の化合物はβペプチドおよびデプシペプチドを含む。

本明細書に記載される分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるリンパ腫細胞に対する良好な細胞毒性と、リンパ腫細胞への選択性の組み合わせを示す。獲得免疫反応についても、マウスモデルにおけるリンパ腫細胞を用いたリチャレンジの後の生存率の向上を通して示される。したがってこれらの分子は相当に治療的に有益なものである。これは実施例１〜３に示されている有効性に関するデータだけではなく、本発明の分子が循環器系への有害な相互作用を起こさないということを示す実施例４の心臓毒性に関するデータによっても裏付けられている。

さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義された本発明のペプチドまたはペプチド疑似体と、薬学的に許容可能な、希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、治療に使用するための、本明細書で定義された本発明のペプチドまたはペプチド疑似体、または本明細書で定義された医薬組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、腫瘍またはがん細胞の治療に使用するための、本明細書で定義された本発明のペプチドまたはペプチド疑似体、または本明細書で定義された医薬組成物を提供する。治療には腫瘍の成長、定着、浸潤もしくは転移の阻害または軽減が含まれる。本発明により治療される腫瘍は通常固形でがん性のものである。治療には、例えば当初に治療した腫瘍に対する特異的免疫の誘導を介した、同一のまたは類似のタイプのさらなる腫瘍の定着を防ぐことができる、予防的な治療も含まれる。このような予防的な治療は標的腫瘍の治療において二次的なものであってもよいし、状況によっては、治療の一次的な目的であってもよい。治療されたがん細胞は同様に、成長および／またはその浸潤を阻害されるか軽減される。

本明細書に記載される組成物、使用および治療方法はさらに二つ目の治療薬、特に他の抗がん剤または本発明のペプチドまたはペプチド疑似体の効果を補助する薬剤を含んでいてもよい。追加される抗がん剤は通常リンパ腫に対して活性を有するものである。

本明細書に記載される分子は、抗腫瘍性，抗がん性または抗悪性腫瘍性をもつ薬剤であると考えられる。がん細胞は腫瘍内に存在しているものであってもよいし、腫瘍の形態学的な特徴を持たないもの、例えば体内に循環しているものであってもよい。

好ましいがんの標的はリンパ腫、例えばバーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫または皮膚リンパ腫である。本発明によりＴリンパ腫およびＢリンパ腫はともに治療することができる。通常、固形腫瘍が治療され、治療は好ましくは病巣内、すなわち腫瘍内で行われる。

さらなる態様において、本発明は腫瘍またはがん細胞を治療する方法を提供し、その方法には、本明細書で定義された本発明のペプチドまたはペプチド疑似体の薬学的に有効な量を患者に投与することも含まれる。通常、患者は、がん、特にリンパ腫であると診断されているなどで、治療が必要であることが確認されている。

さらなる態様において、本発明は腫瘍またはがん細胞の治療のための薬剤の製造における、本明細書で定義された本発明のペプチドまたはペプチド疑似体の使用を提供する。
治療は、上述したように、腫瘍の成長を軽減すること、例えば腫瘍の大きさを、例えば少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０または５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％縮小することを含む。治療により腫瘍が根絶することもあるが、腫瘍が根絶しなくとも治療が成功したと判断することもできる。主要な目標は平均余命を伸ばし、および／またはクオリティーオブライフを改善することである。リンパ腫と診断された後の予後は臨床医により評価することができ、生存率の改善は、１年、５年、または１０年のどの時点でも、データまたは余命に対して判断すればよい。

理論に縛られることを望むものではないが、本明細書の実施例でさらに議論するように、本発明の分子はカスパーゼとは独立したやり方で、強い防御免疫応答を生み出すことに限定して働いているように見える。細胞の溶解を含むネクローシスの兆候が見られるが、走査電子顕微鏡写真は、多くの固形腫瘍に対して溶解性のある古典的なＣＡＰ’ｓ、例えばＬＴＸ‐３１５について見られるものとは類似していない。本発明の分子の場合では、さらに激しい事象が起きていると示唆され、他のがん細胞よりもリンパ腫細胞に対していくらか特異的である。理論に縛られることを望むものではないが、これらの分子の作用機序はリンパ細胞固有の特性と関係していることを示唆している。可能な説明としては、もしかすると、リンパ細胞には細胞表面積を増加させる微絨毛が多くあることから、より多くの割合のペプチドおよび細胞間で相互作用が可能になるということである。本発明の好ましいペプチドの解析によると、直接それらが細胞膜を溶解する著しい効果を有しているようではなく、代わりに細胞膜を透過することができることが示唆される。観察によると、ミトコンドリアの溶解の結果として細胞死が起きるのではないということが考えられる。したがって本発明の分子は、カスパーゼの活性とは独立したプログラム細胞死として機能するのかもしれない。

したがって、他の見地からは、本発明は、リンパ腫の治療に使用するための、特にカスパーゼと独立した方法でのリンパ腫の治療に使用するための、本明細書で定義された本発明のペプチドまたはペプチド疑似体、または本明細書で定義された医薬組成物、を提供する。

本発明の分子は利便性のある手段によって、特に腸内投与、非経口または局所的な経路によって投与することができる。非経口的な経路が好ましく、腫瘍内（病巣内）投与が特に好ましい。局所的投与は特定のケース、特にがん性のリンパ腫の治療においては好ましい。したがって投与は局部（局所的または腫瘍内など）におけるものであってもよいし、全身的なものであってもよい。

当業者は、当該技術分野において知られており、文献において広く記載されている従来の方法により、本発明の分子を投与経路に適した医薬組成物に処方することができる。
活性成分は、必要に応じて他の活性剤と組み合わせて、錠剤、ピル，粉薬（例えば吸入用粉薬）、トローチ、分包剤、カプセル、エリキシエル〔ｅｌｉｘｉｒ〕、懸濁液、乳濁液、クリーム、泡状剤、ゲル、溶液、シロップ剤、エアロゾル剤（固体または液状の媒質内）、ローション、軟膏、軟質および硬質のゼラチンカプセル、座薬、滅菌した注射用薬剤、滅菌した分包粉末剤などの従来のガレヌス製剤〔ｇａｌｅｎｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ〕を製造するための、１以上の従来の担体、希釈剤および／または賦形剤と一体化してもよい。

適当な担体、賦形剤、および希釈剤の例は、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アラビアガム、リン酸カルシウム、不活性アルギン酸類、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ウォーターシロップ、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、高張塩水、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油もしくは硬質な脂肪などの脂肪性物質、またはそれらの適当な混合物である。好ましい賦形剤および希釈剤はマンニトールおよび高張塩水（生理食塩水）である。

組成物はさらに潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、甘味料、香味料などを含んでいてもよい。
非経口的に投与できる形態は、滅菌されており、生理学的に許容できない薬剤が入っていないものとすべきであり、また投与時の刺激または他の副作用を最小限にするためにモル浸透圧濃度が低いものとすべきであり、それゆえ溶液は、好ましくは等張であるか、わずかに高張であるもの、例えば高張塩水（生理食塩水）とすべきである。適当な担体としては、非経口的溶液の投与に慣習的に使われている、生食注射液、リンガー液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖／生理食塩水注射液、乳酸リンゲル注射液、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １５ｔｈ ｅｄ．， Ｅａｓｔｏｎ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ｐｐ． １４０５−１４１２および１４６１−１４８７ （１９７５）およびＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＸＩＶ， １４ｔｈ ｅｄ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （１９７５）に記載されているような他の溶液などの、水性の担体が挙げられる。溶液は非経口溶液に通常用いられる保存料、抗菌剤、バッファーおよび抗酸化剤や、バイオポリマーに適合し、製品の製造、保存、または使用に支障をきたさない、賦形剤および他の添加剤を含んでもよい。

さらに精巧な送達システム、例えばリポソームを用いてもよく、特に全身的に送達する際には、水溶液中の本発明のペプチドを包含したリポソームを用いてもよい。
医薬用途においては、 ペプチドまたは疑似体は通常５〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｌ、例えば４０〜６０ｍｇ／ｌの濃度で簡単に投与することができる。

本明細書に記載される分子は都合の良いいかなる方法において合成してもよい。通常、存在する反応基（アミノ基および／またはカルボキシル末端および一部の側鎖）は合成の間中にわたって保護される。

当該技術分野において、ペプチド合成の方法は良く知られているが、本発明では特に固相担体上において合成を行うこと（ＳＰＰＳ：固層ペプチド合成法）が都合がよく、そのような担体およびそれに伴う技術は当該技術分野において良く知られている。ペプチドの形成において、遊離のＮ末端に段階的に付加していく方が好ましいが、Ｃ末端またはＮ末端のどちらから始めてもよい。

本発明の分子の合成方法は本発明の更なる態様を構成する。例えば、一の実施形態において、本明細書で定義された本発明の分子の合成方法が提供され、その方法は、１以上の保護基を有する本発明の分子の生成および当該保護基の除去を含む。好ましくは、分子は固体担体上で、アミノ酸またはそれと同等のサブユニットを段階的に付加していくことによって形成され、その次に（ｉ）残っている保護基の除去、および（ｉｉ）固相担体からのペプチドの除去、をいずれかの順で行う。

アミノ酸の保護基としては広い選択肢が知られている（例えば、 Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ［２００９］ １０９， ２４５５２５０４参照）。ペプチドがＣ末端から形成されるとき、付加されたそれぞれの新しい残基のα‐アミノ基上にアミン保護基があり、次のカップリング段階の前に選択的に除去される必要がある。適当なアミン保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃとも示される）および９−フルオレニルメチル‐カルボニル（Ｆｍｏｃとも示される）が挙げられる。例えば実施例に記載しているようなＦｍｏｃに基づくＳＰＰＳ合成法が好ましい。これらの処理は自動化されていてもよく、Ｆｍｏｃで保護されたＮ末端を有し、必要な側鎖が保護されているアミノ酸は容易に入手することができる。Ｎ末端の保護基としてＦｍｏｃが用いられているときには、塩基性条件下で安定であり、弱い酸で化学変化を起こす保護基、例えばＢｏｃまたはベンジル基を、反応性のアミノ酸側鎖を保護するために用いてもよい。

保護基を除去するためには多岐にわたる手順が存在する。しかしながら、これらは用いられる合成戦略と一致したものでなければならない。側鎖の保護基は次のカップリング工程に進む前の、一時的なα‐アミノ保護基の除去に用いる条件に対して安定でなければならない。

活性分子を含む投与単位は、好ましくは０．１〜１０ｍｇ、例えば１．５ｍｇの、本発明の抗腫瘍分子を含む。医薬組成物はさらに他の活性成分を含んでいてもよく、他の活性成分としては、他の抗がん作用のあるペプチドなどの、他の細胞毒性をもつ薬剤または抗腫瘍剤が挙げられる。他の活性成分としては、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＣＳＦおよび成長因子などの異なった種のサイトカイン、免疫調節剤、シスプラチンなどの化学療法剤、または抗体、またはがんワクチンを挙げることもできる。

このような組成物を全身的に用いるにあたっては、活性分子の血清中濃度が少なくとも約５μｇ／ｍｌに達するような量で、活性分子が存在するようにする。通常、血清中濃度は５００μｇ／ｍｌを超える必要はない。好ましい血清中濃度は約１００μｇ／ｍｌである。全身的に投与される組成物中に、１〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で含まれる生理活性のある分子を取り込むことにより、そのような血清中濃度にすることができる。通常、その分子は１００ｍｇ／ｋｇを超える容量で投与される必要はない。

本発明のさらなる態様において、本明細書で定義された分子および（ｂ）他の抗がん剤は、腫瘍またはがん細胞の治療、または腫瘍の成長，定着、浸潤、もしくは転移の予防または軽減において、別々に、同時に、または連続的に用いるための組合せ製剤として提供される。

上記の記載は本発明の多数の特徴が記載されており、多くの場合ではそれぞれの特徴における好ましい実施形態が記載されている。所定の特徴のそれぞれの好ましい実施形態が、本発明の最も一般的な形態において他の特徴と組み合わせたとき、他の特徴の好ましい実施形態と組み合わせたとき、のいずれにおいても好ましい、本発明の分子、使用、方法などを提供し得ることが認められる。複数の好ましい実施形態を選択することの効果は、付加的なものであってもよいし、相乗的なものであってもよい。したがってこのような全ての組み合わせは、技術内容が明らかに相互的に排他的なものであったり、矛盾したりしていないかぎりにおいて想定される。通常、それぞれの特徴およびその好ましい実施形態は他の特徴から独立したものであり、したがって、好ましい実施形態の組み合わせは、当業者にそのような新しい概念や情報を与えることなく、もっとも一般的な定義の一部を記載するために示されてもよい。

本発明は以下の非限定的な実施例（比較例を含む）および以下の図面を参照して記載される。

Ａ２０細胞に対するキメラペプチドを用いた、第１の活性／選択性のスクリーニング（ＭＴＴアッセイ）。選択性を決定するために、５つの最も活性のあるペプチド（１ｂ、６ａ、７、４ｂおよび４ｃ）を用いてＭＲＣ−５細胞に対する試験を行った。ペプチド６ａを更なる研究のために選択した。示したＩＣ₅₀値は３連の実験を３回独立して行った平均値である。 Ａ２０リンパ腫およびＭＲＣ−５繊維芽細胞に対する、６ａのアナログについて行った、第２の活性／選択性のスクリーニング（ＭＴＴアッセイ）。ペプチドを短くし、活性を減少させることなく、選択性を上昇させるために、３通りの修飾を行なった。ペプチド１１を更なる研究のために選択した。示したＩＣ₅₀値は３連の実験を３回独立して行った平均値である。 ペプチド６ａおよび１１の、全体的な活性および選択性を決定するための、数種類のリンパ腫細胞株および赤血球に対する、パネルスクリーニング（ＭＴＴアッセイ）。示したＩＣ₅₀値は、ＲＢＣを除き（２回の独立した実験）、３連の実験を３回独立して行った平均値である。 ６ａおよび１１の作用機序についての試験結果。Ａ２０細胞をペプチドで処理し（ＩＣ₅₀の濃度）、全ての事例においてＴＢＴＣをポジティブコントロールとして用いた。（Ａ）ＴＭＲＥを用いた、ペプチドによるミトコンドリア膜の電位における効果の測定。４時間後はどちらのペプチドでも同様の効果であったが、６ａにおいてより早く効果が表れた。（Ｂ）ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩを用いた染色による、細胞膜上に移行したホスファチジルセリンの存在および細胞の完全性の検証。影響した細胞の２／３で膜の破壊の兆候があった。（Ｃ）蛍光で標識した基質を用いた、カスパーゼの活性化に対するスクリーニング。１時間の処理中において、いずれのペプチドもイニシエーターカスパーゼ／エフェクターカスパーゼの活性化を誘導しなかった。Ａ〜Ｃの結果から、細胞膜の完全性が損なわれるのはカスパーゼ非依存的な作用機序によるということが示される。 電子顕微鏡観察。（ＡおよびＢ）未処理のＲａｍｏｓ細胞の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による顕微鏡写真。（Ｃ、Ｄ、およびＥ）時間研究−Ｒａｍｏｓ細胞をペプチド６ａで処理し、様々な時点においてサンプルを調製した。（Ｆ）崩壊した細胞においてほとんどのミトコンドリアが正常であり、カスパーゼスクリーニングの結果を裏付けている。（ＧおよびＨ）未処理のＡ２０細胞の走査型電子顕微鏡写真。（ＩおよびＪ）６ａによる処理後。広い濃度域（１〜１０×ＩＣ₅₀）において同様の効果が見られた。 ペプチド６ａおよび１１の腫瘍内における効果。生存曲線はログランク検定により比較した。 ペプチド６ａおよび１１による処理後の防御免疫応答。生存曲線はログランク検定により比較した。 ＥＷＬ−６（ＷＧＲＲＲＲＲＧＷＧＲＲＲＲＧＷ、配列番号：８）を、テレメートリー装置を付けた〔ｔｅｌｅｍｅｔｅｒｉｚｅｄ〕ラットに投与した後の脈圧における作用を示したグラフである。 ＥＷＬ−６（配列番号：８）を、テレメートリー装置を付けたラットに投与した後の平均動脈圧における作用を示したグラフである。

実施例１−ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける研究
材料および方法
使用した化学物質および試薬
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリブチルすずクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｃａｓｐａｓｅ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ ＩＩ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ （Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）。

ペプチド合成
全てのペプチドは標準的なＦｍｏｃ合成プロトコールおよびアミノ酸誘導体を用いて、ペプチド合成装置Ｔｒｉｂｕｔｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により合成した。Ｔｂｔ β−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルインドール−３−イル）アラニン）のＦｍｏｃ−誘導体はＨａｕｇ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ５１（１４） ｐｐ． ４３０６１４に記載された方法で調製した。

合成後、ペプチドは９５％ ＴＦＡ、２．５％ 水および２．５％ トリイソプロピルシランを含有したカクテルを用いて、３時間以上かけてＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ （Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）から分離した。ＴＦＡを減圧下で除去し、完全に脱保護化し、Ｃ末端をアミド化したペプチドをジエチルエーテルで沈殿させた。

ペプチド精製および特性評価
Ｃ１８（２０×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å）Ｉｎｅｒｓｉｌ ＯＤＳ−３カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いたウォーターズ社の６００Ｅ セミ分取ＨＰＬＣシステムで原料を精製した。ペプチドの純度はＣ１８（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å）Ｓｕｎｆｉｒｅカラムを用いた分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（ウォーターズ社 ２６９５システム）で測定した。１．０ｍｌ／分の流量で０〜５０％Ｂのグラジエントで３０分、２１４ｎｍにセットしたピークを検出することで解析を行った。全てのＨＰＬＣの溶媒（水およびアセトニトリル）は０．１％ＴＦＡを含んでいた。試験に用いた全てのペプチドは９５％以上の純度を有していた。

精製したペプチドの分子量はＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ法（ＭＡＬＤＩ ｍｉｃｒｏ ＭＸ、 ウォーターズ社、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により測定した。質量スペクトルはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとした陽イオン（反射）モードで取得した。精製したペプチドは凍結乾燥し（標準）、使用するまで−２０℃で保存した。

細胞培養
用いられた全ての細胞株はマイコプラズマ試験を行い、５％ＣＯ₂、３７℃で培養した（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）。用いられた種々の細胞株（ＡＴＣＣ番号および継代数を含む）は以下の表に記載されている。

ＲＢＣの単離および溶血アッセイ
２人の健康なドナーから採取した血液サンプルにヘパリン処理を行い、洗浄した。ＲＢＣをＰＢＳで再懸濁し、ヘマトクリット値が１０％になるまで希釈した。ＲＢＣを直ちにペプチドで１時間３７℃で処理した。処理後に細胞をスピンダウンし、上清１００μＬを９６ウェルのプレートに移した。４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

細胞毒性アッセイ
Ａ２０およびＭＲＣ−５に対する最初のスクリーニングは手作業で行ない、リンパ腫パネルスクリーンは自動化プラットフォーム（Ｂｉｏｍｅｋ ＮＸ、 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いてＭａｒｂｉｏ（Ｔｒｏｍｓｏｅ）において行った。

細胞は自動で計測（Ｚ１ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ、 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）され、９６ウェルのプレートに播種された。プレートはアッセイの開始前に少なくとも１６時間インキュベートした。

増殖培地を除去し、細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で１回洗浄した。１００μＬのペプチド溶液（５００〜１０μｇ／ｍＬの異なった濃度）で４時間細胞を処理した。ネガティブおよびポジティブコントロールとして、それぞれ通常のアッセイ培地および０．１％トライトンを含有したアッセイ培地を用いた。その後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれのウェルに１０μＬ加え、プレートをさらに２時間インキュベートした。次いでこの培地を７０μＬ慎重に取り除き、１００μＬの酸性化したイソプロパノールを添加した。細胞をマイクロピペットで攪拌し振とう（３０分）することで、形成されたホルマザンの結晶を溶かした。還元されたＭＴＴ（ホルマザン色素）の吸光度はＶｅｒｓａ Ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により５９０ｎｍで測定した。全てのアッセイは特に断らない限り３連で行った。

Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩアッセイ
このアッセイはＭＴＴアッセイに準じて、およびＴｏｅｒｆｏｓｓ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ ２０１２， １８（３）：ｐ．１７０６）を基にして行った。簡潔にいうと、Ａ２０細胞は最終濃度３×１０⁵細胞／ｍｌで用い、化合物６ａおよび１１（ＩＣ₅₀濃度）を含有したＲＰＭＩ−１６４０培地に播種した。アポトーシス誘導のコントロールとして、０．５μＭ ＴＢＴＣで処理した細胞を用いた。ネガティブコントロールとしては未処理細胞を用いた。１時間のインキュベーション後、細胞を回収し、遠心分離し、０．１４Ｍ ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨバッファーに１×１０⁶細胞／ｍＬとなるように再懸濁した。

次に細胞をａｎｎｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、１０分間、暗所、室温でインキュベートした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）フローサイトメーターのＦＬ−１およびＦＬ−３チャネルを用いて染色した細胞を解析した。

ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の評価
このアッセイはＡｕｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １８１８（１１） ｐ． ２９１７２５を基にして行なった。簡潔にいうと、Ａ２０細胞（３×１０⁵細胞／ｍｌ）を１２ウェルのプレートに播種し、１〜４時間、決定されたＩＣ₅₀値の６ａおよび１１でインキュベートした。ポジティブコントロールとしてＴＢＴＣ（０．１μｍ）で処理した細胞を用い、ネガティブコントロールとして未処理細胞を用いた。各実験終了２０分前に最終濃度が１００ｎＭとなるようにＴＭＲＥを添加した。次に、細胞を回収し、最終濃度が１×１０⁶細胞／ｍｌとなるようにＨＢＳＳで再懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターのＦＬ−２チャネルで解析した。

カスパーゼ活性スクリーニング
カスパーゼ２、−３／７、−６、−８、−９、および−１０の関与について調べるために、Ａｕｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（前述）に従ってカスパーゼＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ ＩＩ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて活性スクリーニングを行った。簡潔にいうと、Ａ２０細胞（３×１０⁵細胞／ｍｌ）を１×ＩＣ₅₀の６ａ、１×ＩＣ₅₀の１１または０．５μＭのＴＢＴＣで１時間処理した。次に細胞を溶解し、ライセートをＤＬ−ジチオトレイトール溶液と共に反応バッファーに添加した。７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリンで標識したカスパーゼの基質を添加し、３７℃で２時間インキュベートし、蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）で解析した。カスパーゼ活性は処理したサンプルおよび未処理のコントロールサンプルの蛍光強度を比較することにより決定した。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
Ｒａｍｏｓ細胞（２×１０⁵細胞／ｍｌ）を、ペプチドを含んだ血清無添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁し、培養フラスコ（ＮＵＮＣ Ｅａｓｙ ｆｌａｓｋ ２５ｃｍ²、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社， Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。既に決定したＩＣ₅₀値によりペプチド濃度を選択した。全ての細胞をカルノフスキー〔Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ〕固定液（ホルムアルデヒド−グルタルアルデヒドのカコジルサン緩衝溶液（ｐＨ７．２））により、４℃、オーバーナイトで前固定した。固定液をカルノフスキー緩衝溶液に置き換え、１％の四酸化オスミウムで後固定を行った。濃度を段階的に変えたエタノールで脱水したあと、サンプルをアセトニトリルおよびｅｐｏｎ ｒｅｓｉｎ（ＡＧＡＲ １００、ＤＤＳＡ、ＭＮＡおよびＤＭＰ−３０）を１：１で混合したものにオーバーナイトで浸透させた。次の日純粋な樹脂を加え、２４時間重合させた。超薄切片を準備してホルムバール、炭素を固定した銅製のグリッド上に置いた。サンプルを酢酸ウラニル（５％）およびレイノルズクエン酸鉛で染色して対比した。ＪＥＯＬ−１０１０透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，Ａｋａｉｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）でサンプルを解析した。画像の取得にはオリンパスＭｏｒａｄａ ＴＥＭ サイドマウントＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｓｏｆｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ， Ｍｕｅｎｓｔｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。

走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）
ＳＥＭの研究ではＴＥＭを用いた実験と同じ手法でインキュベーションを行った。全ての細胞をＭｃＤｏｗｅｌｌ固定液で４℃、オーバーナイトで固定した。後固定に１％四酸化オスミニウムを用い、濃度を段階的に変えたエタノールで脱水を行った。化学的脱水にはヘキサメチルジシラザンを使用した。切片をアルミニウムのスタブに載せ、試験の前に、９０秒間スパッタリングにより被覆した。サンプルをＪＥＯＬ社ＪＳＭ−６３００走査電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，Ａｋａｉｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）で解析し、画像の取得をＥＤＡＸ Ｐｈｏｅｎｉｘ ＥＤＡＭ ＩＩＩ ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ（ＥＤＡＸ Ｉｎｃ．，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）により行った。

結果およびディスカッション
短いペプチドに対する最初の工程として、１ｂ中の、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）（１４アミノ酸）のモデルを、トリプトファンおよびアルギニン残基（１〜６個のアミノ酸）を交互に含む一連の短いＡＭＰで置き換えた（図１および下記表１参照）。

ペプチド２（１０ｍｅｒ）および４ａ（１２ｍｅｒ）では、驚くほど活性が大きく異なっており（ΔＩＣ₅₀＝５８μｍ）、高い活性には最低限の疎水性および電荷が必要であることが示唆される。４ａのトリプトファンの片方または両方を超疎水性であるＴｂｔアミノ酸に置き換えても（→それぞれ４ｂおよび４ｃ）、わずかな効果しか見られなかった。３つめのトリプトファンを組み込んでも（→６ａ）ほとんど効果がなかった。４ｂおよび６ａではわずかな活性の増加（ΔＩＣ₅₀＜５μｍ）が見られ、一方で４ｃでは予期しなかったわずかな活性の減少が観察された。したがって、これは、疎水性が活性においてプラスの役割を果たすには下限と上限があることを示している。

さらに電荷を増やしても（４ａ→５および６ａ→７参照）活性にはわずかな影響しか与えなかった（ΔＩＣ₅₀≒１μｍ）
最初のスクリーニング工程で、ペプチドアナログを正常ヒト繊維芽細胞で試験し（ＳＩ−１）、その結果を腫瘍周辺の健康な細胞に対する細胞毒性を評価するために用いた。

Ａ２０リンパ腫スクリーニングで５つのもっとも活性のあるペプチドのＳＩ−１値を決定した。Ｔｂｔ−ペプチドである４ｂおよび４ｃはほとんど選択性を示さず、ＫＬＡ−ペプチドである１ｂでは低い選択性しかなかった。反対に、ＲＷ−ペプチドである６ａおよび７はともに１０よりも高いＳＩ−１値であり、高い選択性を示した。６ａは７よりもＡ２０に対してわずかに活性が低いが、１アミノ酸分短く、有意によいＳＩ−１値を持つ。活性、選択性およびペプチドの長さを統合した判定基準に留意することで、６ａを更なる研究のために選択した。

それぞれのアルギニンを除くことによって、Ａ２０およびＭＲＣ−５細胞に対して、一定の活性の減少が見られた（図２および下記表２参照）

疎水性トリプトファンとカチオン性アルギニンがそれぞれ固まっているペプチド（６ｂ）と、それらがペプチドの全体に分散しているもの（６ｃ）の２つのアナログを準備して試験を行った。これらの構成の並び替えを行っても、Ａ２０細胞におけるＩＣ₅₀値はほとんど影響されず、高次構造はこれらのペプチドの活性にに対する機能を担っていないように見える。６ｂのＳＩ−１値は有意に６ａよりも低く、一方で６ｃではＳＩ−１が大きく上昇している。連続したアルギニンの数が少なければ、ＩＣ₅₀値はほとんど変わらなかったが、選択性は劇的に増加した。

２個のグリシンを除去すると（→１１）わずかに活性が上昇し、顕著に、しかし許容可能な範囲でＳＩ−１は減少した。これらのペプチドでは連続したアルギニンの最大数とＳＩ−１値の間に明らかな相関性がある。表３参照。

ヒトリンパ腫細胞株パネルに対して６ａおよび１１で試験を行った。図３参照。マウスＡ２０細胞株を含め、上記のスクリーニングで用いた８つの細胞株の全てで試験を行った。どちらのペプチドもＢおよびＴリンパ腫に対して優れた活性を示した。全体的に、６ａは１１よりも試験に用いた全てのリンパ腫に対して活性が強かった。どちらのペプチドももっとも一般的な種のＢリンパ腫、つまりびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−６）およびバーキットリンパ腫（ＲａｍｏｓおよびＮａｍａｌａｗａ）に対して高い活性を示した（＜１０μｍ）。３つのＴリンパ腫株に対して試験を行うと、６ａおよび１１のいずれもＩＣ₅₀値が４．６μＭである、類似した非常に高い活性を示した。

赤血球細胞（ＲＢＣ）に対して試験を行ったときには、いずれのペプチドも有意な溶血を誘導しなかった。最大濃度（３０９μｍ）において６ａで試験を行ったときには２．３％でのみ溶血が見られ、一方、最大濃度（３２０μｍ）の１１では１．１％のみ溶血した。

作用機序
６ａおよび１１が細胞毒性作用を及ぼすメカニズムについて検討した。十分に確立されたフローサイトメトリーのアッセイを用いることで、ミトコンドリア膜電位の変化（ΔΨｍ）を、細胞膜の組成および完全性とともに調べた。

Ａ２０細胞をペプチドで処理し、染色剤としてＴＭＲＥを用いて６０分、１２０分、１８０分および２４０分におけるΔΨｍを測定した。結果、６ａは１１よりも早く作用したが、処理後４時間ではいずれのペプチドでもΔΨｍに対して同じ効果を示した（図４Ａ参照）。多くの細胞内における事象がミトコンドリアの機能に影響することから、観察されたΔΨｍの低下は必ずしもミトコンドリア膜が溶解した指標ではない。

アポトーシスおよびネクローシスについて試験を行うために、細胞外膜に移行するホスファチジルセリン（ＰＳ）の量および細胞膜の完全性について、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩの二重標識によって定量化した。Ａ２０細胞をペプチドで１時間処理した。非常に多くの処理細胞がＰＳ染色に対して陽性であったにもかかわらず、大部分（≒６０％）の細胞膜は悪化の兆候を見せた（図４Ｂ参照）。しかしながら、細胞膜の崩壊が一次的なまたは二次的なネクローシスによるものかどうかはこれらの結果から推測することは不可能である。

カスパーゼはアポトーシス（プログラム細胞死）において重要な役割を果たす酵素である。アポトーシスが誘導されるかどうかを調査するために、蛍光で標識した基質を用いて、処理細胞のカスパーゼの活性化に対するスクリーニングを行った。図４Ｃで示されるように、イニシエーターカスパーゼとエフェクターカスパーゼのどちらも活性化されなかった。

次に、６ａで細胞を処理し、ＴＥＭおよびＳＥＭを用いてその効果を調べた。顕微鏡写真は様々な時点および濃度において撮影した。古典的なアポトーシス（例えば膜膨張、クロマチンの凝縮、ミトコンドリアの崩壊など）を裏付ける証拠は見られず、カスパーゼのスクリーニング結果を裏付けている。その代わり、多くのネクローシスの兆候がＴＥＭにより観察された。さらに、かなり多くの溶解した細胞においても、正常なミトコンドリアは依然として観察された（図５Ｆ）。これはさらにミトコンドリア膜の崩壊が細胞死の一次的な原因ではないという考えを裏付ける。

しかしながら、ＳＥＭ解析により大量の細胞内物質が押し出される処理細胞の驚くべき画像を得た。これらのＳＥＭの結果は、溶解性のペプチドおよびリンパ腫細胞を用いて行った、発明者らのグループによる以前の研究（上記Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．）と顕著に異なったものである。

８種の異なったリンパ腫細胞株に対して、ペプチド６ａおよびそのもっとも有望なアナログであるペプチド１１で試験を行った。いずれのペプチドも試験に用いた細胞株の多くに対して印象的な活性を有していた。興味深いことに、ペプチド１１は他の種のがん（非リンパ腫）細胞に対して低い活性しか示さなかった（表４参照）。正常繊維芽細胞に対してはペプチド１１はほとんど活性を示さなかった。

リンパ細胞には多くの微絨毛があるという事実が可能性のある説明として考えられるかもしれない。細胞表面積が増加することにより、ペプチドおよび細胞間においてより高い割合で相互作用が起きるようになる。しかしながら、リンパ細胞特有の細胞間の差異（例えば代謝経路）を細胞毒性の根拠として無視することはできない。

実施例２−ｉｎ ｖｉｖｏにおける研究
材料および方法
ペプチド
試験に使う２つのペプチド６ａ（ＷＲＷＲＷＧＧＲＲＲＲＲＲＲ−アミド、配列番号：２４）およびペプチド１１（ＷＲＲＲＲＲＷＲＲＲＲＷ−アミド、配列番号：２５）は標準的なＦｍｏｃ法プロトコールに従って独自に合成した。全てのペプチドは分取ＨＰＬＣを用いて精製し（＞９５％）、凍結乾燥させて、トリフルオロ酢酸塩として用いた。

細胞株
自然に発生するＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマウスＢ細胞リンパ腫であるＡ２０細胞を、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。細胞培養は５％のＣＯ₂、３７℃の加湿条件に保った。

動物
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。全てのマウスは地方および欧州倫理委員会のガイドラインに沿って、特定の病原体が存在しないゲージで飼育した。

Ａ２０リンパ腫の病巣内治療
Ａ２０腫瘍細胞を採取し、ＲＰＭＩ−１６４０内で洗浄し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部左側に接種（皮内）した（１マウスあたり５×１０⁶細胞／５０μｌ ＲＰＭＩ−１６４０）。腫瘍の大きさが２０ｍｍ²に達したら、マウスを３つのグループに分けて処理した；グループ１−溶媒（０．９％ＮａＣｌ／滅菌Ｈ₂Ｏ）で処理した９匹のマウス、グループ２ａ−腫瘍をペプチド６ａで処理した８匹のマウス、グループ３ａ−腫瘍をペプチド１１で処理した９匹のマウス。病巣内注射は１日１回、３日連続して行った。

腫瘍の大きさは電子キャリバーを用いて週３回測定し、楕円の面積としてあらわした［（最大寸法／２）×（最少寸法／２）×３．４］。腫瘍が１００ｍｍ²を超えたときに動物を殺した。腫瘍がその大きさに達しなくても、潰瘍が現れたり、転移が生じたりした場合にも動物を殺した。

２回目の腫瘍移植
６ａおよび１１の処理後にＡ２０リンパ腫が完全に退縮した動物に、再びＡ２０リンパ腫細胞を移植した。動物が回復してからて４週間後に、腹部右側（１回目の腫瘍移植部位の反対側）に細胞（５×１０⁶）を接種（皮内）した。

統計分析
生存曲線はログランク検定により比較した。各群は一元配置ＡＮＯＶＡ検定およびＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いて比較した。Ｐ＜０．０５で有意差があるとした。

結果
１匹を除いてＡ２０細胞を接種された全ての動物に腫瘍が発生し、６〜７日以内に腫瘍はペプチド処理を開始するのに十分に大きく（約２０ｍｍ²）なった。

２１日以内に、腫瘍の大きさにより、９匹のコントロールマウスのうちの８匹を安楽死させた。生理食塩水で処理したコントロール動物に比べ、グループ２ａおよび３ａの全ての動物において、腫瘍増殖に対する明らかな抑制効果が見られた。

１１で処理した９匹のマウスのうち６匹、および６ａで処理した８匹のマウスのうち４匹において、腫瘍は完全に退縮した（図６参照）。コントロールに比べてどちらの処理群においても、（腫瘍崩壊症候群などの）全身毒性の兆候はなく、生存率は有意に増加した。

処理の４週間後、Ａ２０リンパ腫生細胞を用いた腫瘍移植を回復したマウスに行った。ナイーブコントロールマウス（グループ４）にはすぐに腫瘍が発生し、１８日以内に全てのマウスを安楽死させた。

腫瘍の再移植から１０日後、６ａの処理後に回復した４匹のマウス（グループ２ｂ）のうち３匹に腫瘍が発生した。しかしながら、コントロール動物に比べて腫瘍増殖は有意に遅かった。２匹のマウスにおける腫瘍は小さくなり、完全に退縮した。多少驚くべきことには、残りの２匹の動物は初め腫瘍がなかったが、１か月後には肋骨周辺に腫瘍が急速に増殖したので、安楽死せざるをえなかった。研究の終了時には（腫瘍の再移植から２か月後）、腫瘍のない動物は１匹のみであった。このマウスを犠牲にしたときに、内臓、四肢のリンパ節、およびリンパ組織が関わる消化器における、異常の兆候を調べるため解剖を行った。消化器の脂肪に「真珠の連なりのようなもの」があったが、これが悪性のものなのか、通常のリンパ組織であるのかははっきりとしない。

これらの結果から判断すると、６ａでの処理による病巣内治療は、Ａ２０リンパ腫細胞に対する免疫反応を誘導したように見える。しかしながら、４匹のうち、腫瘍がないままの１匹のマウスでのみ腫瘍増殖は抑制されただけであり（図２参照）、免疫反応は腫瘍増殖を抑制するほどに十分に強くはない。

同様の結果が、１１で処理後に回復したマウス（グループ３ｂ）でも、初めのうちは見られた。腫瘍再移植後１０日以内に、測定可能な腫瘍が発生した６匹のうち５匹のマウスで腫瘍が小さくなり、完全に退縮した。しかしながら、グループ２ｂ（１匹は例外）と異なり、これらの動物には研究の終了時まで腫瘍がないままであった。腫瘍再移植２か月後、５匹のマウス（腫瘍無）（図７参照）を犠牲にし、グループ２ｂのマウスと同様に解剖を行った。いずれのマウスにも異常の兆候はなかった。

これは予備的研究でしかないが、それにもかかわらずこの結果は顕著で、とても有望なものだと考えられるだろう。
試験を行ったいずれのペプチドも、全身的な毒性を引き起こすことなしに、処理したマウスの大部分で完全な腫瘍の退縮を示し、一次的な抗腫瘍効果を発揮した。しかしながら，再移植の研究では明らかな違いが見られた。いずれのペプチドも二次的な効果を誘導したが、真の防御免疫を引き起こしたのはペプチド１１のみであった。

実施例３−ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるさらなる研究
実施例１で記載したように、ＷＲＷＲＷ−ＧＧ−ＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号：２６）の配列であるペプチドをＡ２０細胞で試験した。ＩＣ₅₀値は１３．２μＭであり、活性はあるが、そのポリアルギニンの等価物であるペプチド６ａのように効果的なものではない。

実施例４−循環器におけるＥＷＬ−６の毒性の評価
材料および方法
テストシステム：雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｐｏｒｔａｇｅ， ＭＩ）ラット（３２０〜４００ｇ）にはＣｏｒＤｙｎａｍｉｃｓ社により、ＤＳＩ社（Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）のテレメートリートランスミッターが取り付けられた。

試験化合物，溶媒および製剤：ＥＷＬ−６は配列ＷＧＲＲＲＲＲＧＷＧＲＲＲＲＧＷを有するペプチドである。
ＥＷＬ−６は約−２０℃に設定された冷凍庫内において、遮光下で保存された。ＥＷＬ−６が含まれる製剤を１ｍＬ／ｋｇ／回の投与量となるように静脈注射用製剤用の０．９％塩化ナトリウム注射溶液（Ｕ．Ｓ．Ｐ）中で調製した。注射前に投与量を０．２μＭのポリプロピレンフィルターを通して濾過した。

試験化合物の投与：各ラットを手で押さえて、および溶媒またはＥＷＬ−６を１日２回約１〜２分かけて静脈内投与した。１日分の投与量は約４時間ごとに分けられた。
血行動態評価：脈圧（図８）および平均動脈圧（図９）は初日の投与から−１〜８時間にわたってテレメートリーにより記録し、初日の投与から−１〜８時間の１分平均で報告された。

結果
ＥＷＬ−６の投与後、コントロールと比較して、脈圧（図８）または平均動脈圧（図９）において顕著な差は見られず、これは本発明のペプチドには循環器に対する毒性がないことを示している。

Claims (21)

1. （ｉ）１０〜１６個のアミノ酸からなり；
   （ｉｉ）
   （ａ）グアニジニウム基を含む側鎖、または
   （ｂ）アミノ基を含む側鎖
   のいずれかをもつ、少なくとも８個のカチオン性アミノ酸を有し、該カチオン性アミノ酸の７個以下が連続しており、
   （ｉｉｉ）連続していない２個のトリプトファン残基、または全てが連続してはいない３個のトリプトファン残基を有するペプチドであって、必要に応じて塩、エステルもしくはアミドの形であるペプチド；
   または、上記ペプチドのペプチド疑似体。
2. 前記カチオン性アミノ酸が、アルギニン、ホモアルギニン、リシン、アミノカプロン酸、およびオルニチンからなる一覧から選択された、請求項１のペプチドまたはペプチド疑似体。
3. 前記カチオン性アミノ酸が、グアニジニウム基を含む側鎖を有する、請求項１に記載のペプチドまたはペプチド疑似体。
4. カチオン性アミノ酸またはトリプトファンのいずれでもない１〜６個の他のアミノ酸をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体。
5. 前記他のアミノ酸が、トリプトファン残基および請求項１〜３のいずれか１項で定義されているカチオン性アミノ酸の双方に隣接している、請求項４のペプチドまたはペプチド疑似体。
6. 前記他のアミノ酸が、水素原子が４個以下の側鎖を有し、非電荷であり、かつ非極性である、請求項４または５のペプチドまたはペプチド疑似体。
7. 前記他のアミノ酸がグリシンおよび６−アミノヘキサン酸から選択された、請求項４〜６のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体。
8. ３個のトリプトファン残基を有する、請求項１〜７のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体。
9. 請求項１〜３のいずれか１項で定義されたカチオン性アミノ酸を９または１０個有する、請求項１〜８のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体。
10. Ｎ末端および／またはＣ末端にトリプトファン残基を有する、請求項１〜９のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体。
11. 請求項１〜３のいずれか１項で定義されたカチオン性アミノ酸を少なくとも５個連続して有する、請求項１〜１０のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体。
12. 以下の配列の１種を有する、請求項１〜７のいずれか１項のペプチドまたはペプチド疑似体：
    ＷＸＲＲＲＲＲＸＷＸＲＲＲＲＸＷ；
    ＷＸＲＲＲＲＷＲＲＲＲＸＷ；
    ＲＲＲＲＸＷＸＲＲＲＲＷ；
    ＫＫＫＫＸＷＸＫＫＫＫＷ；
    ＫＲＫＲＸＷＸＫＲＫＲＷ；または
    ＷＲＷＲＷＸＸＲＲＲＲＲＲＲ。
    ［配列式中、Ｗはトリプトファンをあらわし、Ｒはアルギニンをあらわし、Ｘはカチオン性アミノ酸またはトリプトファン残基ではないアミノ酸をあらわす］。
13. 以下の配列の１種を有する、請求項１のペプチドまたはペプチド疑似体：
    ＷＲＷＲＷＧＧＲＲＲＲＲＲＲ、ＷＲＲＲＲＲＷＲＲＲＲＷ、またはＷＧＲＲＲＲＲＧＷＧＲＲＲＲＧＷ。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項で定義されたペプチドまたはペプチド疑似体と、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬組成物。
15. 治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項で定義されたペプチドもしくはペプチド疑似体、または請求項１４で定義された医薬組成物。
16. 腫瘍またはがん細胞の治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項で定義されたペプチドもしくはペプチド疑似体、または請求項１４で定義された医薬組成物。
17. 前記腫瘍またはがん細胞がリンパ腫である、請求項１６に記載された使用のためのペプチド、ペプチド疑似体、または医薬組成物。
18. 前記リンパ腫がカスパーゼに依存しないやり方で治療される、請求項１７に記載された使用のためのペプチド、ペプチド疑似体、または医薬組成物。
19. 腫瘍またはがん細胞の治療方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項で定義されたペプチドもしくはペプチド疑似体、または請求項１４で定義された医薬組成物を、必要とする患者に薬学的に有効な量投与することを含む方法。
20. 腫瘍またはがん細胞の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１３のいずれか１項で定義されたペプチドもしくはペプチド疑似体、または請求項１４で定義された医薬組成物の、使用。
21. がん細胞を溶解するための、請求項１〜１３のいずれか１項で定義されたペプチドまたはペプチド疑似体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用。