JP2017504357A - 抗ヒトｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体およびその疼痛における作用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗ヒトｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体およびその疼痛における使用を提供する。具体的に、本発明は、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦタンパク質前駆体ドメインの１９〜１２８番目のアミノ酸を認識する抗体ポリペプチド、上記抗体ポリペプチドをコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクター、前記ベクターを含む宿主、前記抗体を含む薬物組成物および慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における前記抗体の使用を提供する。
Description
本発明は、抗ヒト脳由来神経栄養因子前駆体タンパク質（ｐｒｏＢＤＮＦ）モノクローナル抗体の製造分野、および様々な急性および慢性疼痛、たとえば術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群などの緩和および／または抑制における前記モノクローナル抗体の作用に関する。
疼痛は、体温、呼吸、心拍数、血圧に続く５つ目のバイタルサインであり、生体が傷つけられた場合の警告として生体の一連の防御的保護反応を引き起こすことができる。しかし、過剰の疼痛は、生体自身を損傷させ、かつ生体にとって耐えられない苦しみになることがある。そのため、鎮痛（analgesia）は、医療従事者が直面する重要な任務である。慢性疼痛は、人類の生存および生活品質を脅かし、しかも家庭と社会に大きな負担を負わせる。米国疼痛学会（American Pain Society）の報告によると、米国では、慢性疼痛の罹患率は３５．５％であり、１．０５億人と推測されている。毎年１０００億ドル以上かかり、直接に医療保健の支出の消耗および労働時間の損失につながる。
現在、最も使われている鎮痛薬は、パラセタモール、非ステロイド性抗炎症鎮痛薬およびオピオイド受容体作動薬、たとえばトラマドールやモルヒネなどを含む。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）は、鎮痛効果が低く、かつ胃腸管出血、腎不全や肝臓機能損害などの副作用が生じることがある。一方、オピオイド系薬物は、投与量が多すぎると、呼吸を抑制し、また長期間に使用すると、便秘、乱用、依存や嗜癖などの副作用が生じる。近年、ほかの鎮痛薬、たとえば抗うつ薬（たとえばイーライリリー社のデュロキセチン）、抗けいれん薬（たとえばファイザー社の製品のプレガバリン、商品名リリカ）や選択性シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）（たとえばファイザー社のパレコキシブ）阻害剤なども市場に入ってきた。
新規な鎮痛薬の開発の仕方は、機序に基づいた薬物の新たな標的の開発であり、主に疼痛の機序に対する検討を通じて疼痛の発生と進展の重要な因子または標的を見つけることによって、当該因子または標的に関与して鎮痛作用を実現させる新しい薬物を開発する。このような基礎研究成果の事業化に基づいた臨床応用は、現在、大量に試験されているが、成功例はまだ非常に少ない。
中では、典型的な例は、抗神経成長因子（Nerve Growth Factor、ＮＧＦ）抗体の開発である。ＮＧＦは、神経栄養因子ファミリーの一員で、発育においてニューロンの生存およびアポトーシスに対して重要な作用を果たす。大量の基礎研究によって、ＮＧＦは疼痛の進展を促進することが示されたため、ＮＧＦの遮断は疼痛治療の重要な方法かもしれない。そのため、ＮＧＦ抗体に対する研究が非常に多く、中にはTanezumab（ファイザー）、SAR164877/REGN475（サノフィ／Regeneron）およびNJ-42160443/AMG403（ジョンソン・エンド・ジョンソン社／アムジェン社）が含まれる。これらの薬物は、動物モデルにおいて鎮痛効果を示し、臨床第Ｉ／ＩＩ相においても臨床安全性および鎮痛効果を示したが、臨床第ＩＩＩ相の試験において、ＮＧＦ抗体とＮＳＡＩＤ薬物の併用による関節リウマチおよび強直性脊椎炎などの患者に対する鎮痛作用の臨床治療効果および安全性の評価において、少数の患者に無痛性虚血性大腿骨頭壊死が生じた（Garber K Fate of novel painkiller mAbs hangs in balance. Nat Biotechnol 2011, 173-174； Seidel M, Lane N, Control of Arthritis Pain with Anti-Nerve-Growth Factor, Risk and Benefit, Curr Rheumatol Rep, 2012,583-585）。
そのため、新しい作用機序の鎮痛薬の開発にはまだ巨大なマーケットの需要が存在する。
中では、典型的な例は、抗神経成長因子（Nerve Growth Factor、ＮＧＦ）抗体の開発である。ＮＧＦは、神経栄養因子ファミリーの一員で、発育においてニューロンの生存およびアポトーシスに対して重要な作用を果たす。大量の基礎研究によって、ＮＧＦは疼痛の進展を促進することが示されたため、ＮＧＦの遮断は疼痛治療の重要な方法かもしれない。そのため、ＮＧＦ抗体に対する研究が非常に多く、中にはTanezumab（ファイザー）、SAR164877/REGN475（サノフィ／Regeneron）およびNJ-42160443/AMG403（ジョンソン・エンド・ジョンソン社／アムジェン社）が含まれる。これらの薬物は、動物モデルにおいて鎮痛効果を示し、臨床第Ｉ／ＩＩ相においても臨床安全性および鎮痛効果を示したが、臨床第ＩＩＩ相の試験において、ＮＧＦ抗体とＮＳＡＩＤ薬物の併用による関節リウマチおよび強直性脊椎炎などの患者に対する鎮痛作用の臨床治療効果および安全性の評価において、少数の患者に無痛性虚血性大腿骨頭壊死が生じた（Garber K Fate of novel painkiller mAbs hangs in balance. Nat Biotechnol 2011, 173-174； Seidel M, Lane N, Control of Arthritis Pain with Anti-Nerve-Growth Factor, Risk and Benefit, Curr Rheumatol Rep, 2012,583-585）。
そのため、新しい作用機序の鎮痛薬の開発にはまだ巨大なマーケットの需要が存在する。
脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ（brain derived neurotrophic factor）は、神経成長因子に続いて発見された神経栄養因子であり、分子量が１２．４ｋＤａで、主に中枢神経系に分布するが、末梢神経系にもＢＤＮＦの合成があり、ニューロンの生存、分化、シナプス可塑性および損傷修復などの調節の面で重要な機能を担う。現在、ＢＤＮＦは、神経系の発育および情動障害を調節する重要な因子だけでなく、重要な痛覚の神経修飾物質でもあることを示す証拠が現れた。
脳由来神経栄養因子の前駆体ｐｒｏＢＤＮＦ（precursor for brain-derived neurotrophic factor）は、ＢＤＮＦ遺伝子から転写、翻訳を経て小胞体内で合成されたものであり、そのペプチド鎖の長さは２４７個のアミノ酸であり、アミノ酸配列の理論分子量は２７．８ＫＤであるが、タンパク質のグリコシル化修飾の程度が異なるため、分子量は３２〜３６ｋＤの範囲内にある。ＰｒｏＢＤＮＦ分子のアミノ酸配列の１〜１８番目の部分はシグナルペプチド配列で、分泌の過程で２つの断片が生成し、その一つの断片は配列の１９〜１２９番目のアミノ酸、すなわち前駆体ドメインを含むポリペプチド断片で、前駆体ドメイン（proBDNF pro-domain）と呼ばれ、もう一つの断片は配列の１３０〜２４７番目、すなわち成熟ドメインでコードされる断片で、加工を経て生物活性を有する成熟体ＢＤＮＦになる。
脳由来神経栄養因子の前駆体ｐｒｏＢＤＮＦ（precursor for brain-derived neurotrophic factor）は、ＢＤＮＦ遺伝子から転写、翻訳を経て小胞体内で合成されたものであり、そのペプチド鎖の長さは２４７個のアミノ酸であり、アミノ酸配列の理論分子量は２７．８ＫＤであるが、タンパク質のグリコシル化修飾の程度が異なるため、分子量は３２〜３６ｋＤの範囲内にある。ＰｒｏＢＤＮＦ分子のアミノ酸配列の１〜１８番目の部分はシグナルペプチド配列で、分泌の過程で２つの断片が生成し、その一つの断片は配列の１９〜１２９番目のアミノ酸、すなわち前駆体ドメインを含むポリペプチド断片で、前駆体ドメイン（proBDNF pro-domain）と呼ばれ、もう一つの断片は配列の１３０〜２４７番目、すなわち成熟ドメインでコードされる断片で、加工を経て生物活性を有する成熟体ＢＤＮＦになる。
現在、大量の証拠によって、ｐｒｏＢＤＮＦは、成熟ＢＤＮＦ合成の中間産物だけでなく、配位子としてその高親和力の受容体ｐ７５神経栄養因子受容体（P75 neurotrophin receptor、ｐ７５ＮＴＲ）と結合して生物学的機能を発揮することもできることが示されている。現在、ｐｒｏＢＤＮＦ−ｐ７５ＮＴＲシグナル経路の疼痛における作用はまだ明らかではないが、一つの観点として、疼痛の脊髄感作の機序は海馬の長期増強（Long-term potentiation、ＬＴＰ）／長期抑圧（long-term depression、ＬＴＤ）の形成機序と似ていると思われる一方、ＢＤＮＦ−ＴｒｋＢおよびｐｒｏＢＤＮＦ−ｐ７５ＮＴＲシグナル経路はＬＴＰ／ＬＴＤを調節する重要なシグナル分子である。
中南大学の張艶玲の２０１２年の実験研究では、ラットの後ろ足を切った後、その後根神経節のｐｒｏＢＤＮＦ発現が向上し、ラットの後ろ足にｐｒｏＢＤＮＦのアデノウイルスベクターを注射した後、当該アデノウイルスベクターは神経線維においてｐｒｏＢＤＮＦを大量に発現し、過剰発現のｐｒｏＢＤＮＦはラットの後ろ足の機械刺激逃避閾値の顕著な低下および足底組織の炎症反応につながり、腹腔から抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体を投与した後、ラットの後ろ足を切った後の逃避閾値が増加したことが示された。
切創様痛は、急性疼痛に属する。急性と慢性の疼痛は、いずれも末梢性感作と中枢性感作が現れ得るが、両者の間の違いは、末梢性感作において局部の組織の神経線維または軸索が放出する伝達物質および細胞内シグナル経路が異なり、そして後根神経節では関連の痛覚の伝達物質およびシグナル伝達経路も異なり、後者の持続時間もより長いことである。また、中枢性感作において、脊髄膠細胞の持続的活性化も急性と慢性の疼痛の機序の間に最も重要な違いかもしれない。
切創様痛は、急性疼痛に属する。急性と慢性の疼痛は、いずれも末梢性感作と中枢性感作が現れ得るが、両者の間の違いは、末梢性感作において局部の組織の神経線維または軸索が放出する伝達物質および細胞内シグナル経路が異なり、そして後根神経節では関連の痛覚の伝達物質およびシグナル伝達経路も異なり、後者の持続時間もより長いことである。また、中枢性感作において、脊髄膠細胞の持続的活性化も急性と慢性の疼痛の機序の間に最も重要な違いかもしれない。
本発明の一つは、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦタンパク質前駆体ドメインの１９〜１２８番目のアミノ酸を認識する抗体ポリペプチドであって、（ａ）配列番号１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２で表されるＣＤＲ２領域、（ｃ）配列番号３で表されるＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含有する重鎖の可変領域、および／または（ｄ）配列番号４で表されるＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号５で表されるＣＤＲ２領域、（ｆ）配列番号６で表されるＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含有する軽鎖の可変領域を含む、抗体ポリペプチドに関する。
一つの具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドはモノクローナル抗体である。より具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドは、重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号７であり、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号８である。もう一つの具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドが有する重鎖のアミノ酸配列が配列番号９であり、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号１０である。もう一つの具体的な実施形態において、前記の抗体ポリペプチドは、ヒト化の抗体ポリペプチド、キメラの抗体ポリペプチド、親和性成熟の抗体ポリペプチド、またはその一種または複数種の組み合わせから選ばれる。もう一つの具体的な実施形態において、前記の抗体ポリペプチドは上記抗体ポリペプチドと競合する抗体ポリペプチドである。
一つの具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドはモノクローナル抗体である。より具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドは、重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号７であり、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号８である。もう一つの具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドが有する重鎖のアミノ酸配列が配列番号９であり、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号１０である。もう一つの具体的な実施形態において、前記の抗体ポリペプチドは、ヒト化の抗体ポリペプチド、キメラの抗体ポリペプチド、親和性成熟の抗体ポリペプチド、またはその一種または複数種の組み合わせから選ばれる。もう一つの具体的な実施形態において、前記の抗体ポリペプチドは上記抗体ポリペプチドと競合する抗体ポリペプチドである。
本発明のもう一つは、上記抗体ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。一つの具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドの重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１１で、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１２である。もう一つの具体的な実施形態において、前記抗体ポリペプチドの重鎖のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１３で、軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１４である。
本発明のもう一つは、前記核酸配列を含むベクターに関する。
本発明のもう一つは、前記ベクターを含む宿主に関する。
本発明のもう一つは、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦ前駆体ドメインを認識する一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用であって、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における使用に関する。
本発明のもう一つは、前記核酸配列を含むベクターに関する。
本発明のもう一つは、前記ベクターを含む宿主に関する。
本発明のもう一つは、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦ前駆体ドメインを認識する一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用であって、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における使用に関する。
本発明のもう一つは、術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における前記抗体ポリペプチドの使用に関する。
本発明のもう一つは、有効量の前記抗体ポリペプチドを含む薬物組成物に関する。一つの具体的な実施形態において、前記薬物組成物は静脈または腹腔注射の形態によって投与される。
本発明の抗体ポリペプチドおよび相応の薬物組成物は、特異的にｐｒｏＢＤＮＦの前駆体ドメイン（pro-domain）を認識することができ、様々な急性疼痛だけでなく、慢性疼痛、たとえば術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群を抑制および／または予防することができ、既存技術では達し得ない技術効果を獲得し、広範かつ優れた臨床応用の将来性を有する。
本発明のもう一つは、有効量の前記抗体ポリペプチドを含む薬物組成物に関する。一つの具体的な実施形態において、前記薬物組成物は静脈または腹腔注射の形態によって投与される。
本発明の抗体ポリペプチドおよび相応の薬物組成物は、特異的にｐｒｏＢＤＮＦの前駆体ドメイン（pro-domain）を認識することができ、様々な急性疼痛だけでなく、慢性疼痛、たとえば術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群を抑制および／または予防することができ、既存技術では達し得ない技術効果を獲得し、広範かつ優れた臨床応用の将来性を有する。
具体的な実施形態
本発明の抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体ポリペプチドは、特異的にｐｒｏＢＤＮＦの前駆体ドメイン（pro-domain）の１９〜１２８番目のアミノ酸を認識し、（ａ）配列番号１で表されるＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２で表されるＣＤＲ２領域、（ｃ）配列番号３で表されるＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含有する重鎖の可変領域、および／または（ｄ）配列番号４で表されるＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号５で表されるＣＤＲ２領域、（ｆ）配列番号６で表されるＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含有する軽鎖の可変領域を含む、抗体ポリペプチドに関する。各疼痛の評価実験において、当該抗体で処理されたマウスは、ブランクコントロール群と比べて顕著な疼痛抑制および予防効果を示す。本発明の抗体ポリペプチドは、様々な急性疼痛だけでなく、慢性疼痛、たとえば術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群を抑制および／または予防することができる。
本発明の抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体ポリペプチドは、特異的にｐｒｏＢＤＮＦの前駆体ドメイン（pro-domain）の１９〜１２８番目のアミノ酸を認識し、（ａ）配列番号１で表されるＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２で表されるＣＤＲ２領域、（ｃ）配列番号３で表されるＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含有する重鎖の可変領域、および／または（ｄ）配列番号４で表されるＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号５で表されるＣＤＲ２領域、（ｆ）配列番号６で表されるＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含有する軽鎖の可変領域を含む、抗体ポリペプチドに関する。各疼痛の評価実験において、当該抗体で処理されたマウスは、ブランクコントロール群と比べて顕著な疼痛抑制および予防効果を示す。本発明の抗体ポリペプチドは、様々な急性疼痛だけでなく、慢性疼痛、たとえば術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群を抑制および／または予防することができる。
本発明に係る「抗体ポリペプチド」とは、免疫グロブリンの可変領域内における少なくとも一つの抗原認識部位を通じて特異的に標的部位、たとえば多糖、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどを認識することができる免疫グロブリン分子である。ここで用いられる用語の抗体ポリペプチドは、インタクト（intact）なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含み、さらにその断片、たとえば一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体断片、単離したＣＤＲ断片、およびその誘導体、たとえばその突然変異体、または少なくとも一つの抗原結合部位を含む修飾された免疫グロブリン分子構造を含む。
インタクトな抗体とは、２つの同様の重鎖と軽鎖からなり、各鎖はそれぞれ可変領域（Ｖ領域）および一つまたは複数の定常領域（Ｃ領域）を含む。可変領域は抗原と結合することを担当し、定常領域は主にエフェクター分子と結合することを担当する。主に抗原を認識することを担当する、各可変領域に高度の多様性を有する３つの柔軟なループがあり、これは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変領域のほかの部分は、柔軟性のないβシートを含み、かついわゆるフレームワーク領域（ＦＲｓ）を支える。ＣＤＲとＦＲは、互いに挟んで並び、サンドイッチ構造になっている。
インタクトな抗体とは、２つの同様の重鎖と軽鎖からなり、各鎖はそれぞれ可変領域（Ｖ領域）および一つまたは複数の定常領域（Ｃ領域）を含む。可変領域は抗原と結合することを担当し、定常領域は主にエフェクター分子と結合することを担当する。主に抗原を認識することを担当する、各可変領域に高度の多様性を有する３つの柔軟なループがあり、これは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変領域のほかの部分は、柔軟性のないβシートを含み、かついわゆるフレームワーク領域（ＦＲｓ）を支える。ＣＤＲとＦＲは、互いに挟んで並び、サンドイッチ構造になっている。
「一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）断片」とは、遺伝子工学によって構築された抗体断片であり、リンカーによって連結した重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）を有する組換えタンパク質で、リンカーはこの２つのドメインを関連させて抗原結合部位を形成する。ＳｃＦＶの大きさは、通常、完全抗体の１／６である。
「Ｆｄ断片」とは、重鎖ＶＨとＣＨ１からなる抗体断片である。
「Ｆａｂ断片」とは、Ｆｄ断片（重鎖ＶＨとＣＨ１からなる）と軽鎖全体とが鎖間ジスルフィド結合によって形成したヘテロ二量体である。「Ｆａｂ抗体」の大きさは、インタクトな抗体の１／３であり、抗原結合部位が一つだけ含まれている。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、連結した２つのＦａｂ断片を含む２価断片である。
「単一ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域からなる。当該抗体断片は一つだけのドメインからなるため、そのように名付けられた。当該断片の大きさは、インタクトな抗体の１／１２である。
「Ｆｄ断片」とは、重鎖ＶＨとＣＨ１からなる抗体断片である。
「Ｆａｂ断片」とは、Ｆｄ断片（重鎖ＶＨとＣＨ１からなる）と軽鎖全体とが鎖間ジスルフィド結合によって形成したヘテロ二量体である。「Ｆａｂ抗体」の大きさは、インタクトな抗体の１／３であり、抗原結合部位が一つだけ含まれている。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、連結した２つのＦａｂ断片を含む２価断片である。
「単一ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域からなる。当該抗体断片は一つだけのドメインからなるため、そのように名付けられた。当該断片の大きさは、インタクトな抗体の１／１２である。
「誘導体」は、たとえばファージディスプレイ技術によって前記抗体を得る誘導体を含む場合、たとえばBIAcoreシステムで使用される表面プラスモン共鳴技術によってＥＧＦＲまたはＣＤ３抗原エピトープと結合するファージ抗体の効率を増加させることができる（Schier，ヒト抗体，ヒト抗体ハイブリドーマ7（1996），97-105；Malmborg，免疫学方法雑誌183（1995），7-13）。さらに、たとえばWO 89/09622に記載のキメラ抗体の生成方法、EP-A10239400およびWO90/07861に記載のヒト化抗体の生成方法、WO91/10741、WO94/02602およびWO96/33735に記載の異種抗体、たとえばマウスにおけるヒト抗体を生成する方法を含む。
本発明で使用される抗体またはその断片は、本分野で既知の通常の技術、たとえばアミノ酸の欠失、挿入、置換、増加、および／または転移ならびに／あるいはほかの修飾方法を単独で使用しまたは併用し、さらに修飾してもよい。抗体のアミノ酸配列に対してそのＤＮＡ配列にこのような修飾の方法を導入することは周知である。
本発明で使用される抗体またはその断片は、本分野で既知の通常の技術、たとえばアミノ酸の欠失、挿入、置換、増加、および／または転移ならびに／あるいはほかの修飾方法を単独で使用しまたは併用し、さらに修飾してもよい。抗体のアミノ酸配列に対してそのＤＮＡ配列にこのような修飾の方法を導入することは周知である。
本発明で使用される抗体または抗体断片は、ヒト化のものでも、キメラのものでも、マウス化のものでもよい。ここで使用される「ヒト化抗体」とは、ヒトが生成する抗体に相応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または本分野で既知の技術または本願で公開されるヒト化抗体を製造する技術によって製造される抗体である。ヒト化抗体は、主にマウス由来（またはほかの非ヒト由来）のモノクローナル抗体を遺伝子クローニングおよびＤＮＡ組み換え技術によって改造し、新たに発現する抗体であり、その大半のアミノ酸配列はヒト由来配列に変わり、親マウスのモノクローナル抗体の親和性および特異性を残しつつ、その異種性を減少し、人体への応用に有利である。ヒト化抗体は、キメラ抗体、グラフティング抗体（CDR grafting antibody、ＣＤＲ移植抗体とも呼ばれる）、表面再構築抗体または完全ヒト化抗体を含む。また、ヒト化抗体は、本分野で既知の様々な技術によって生成することができるが、たとえばヒト抗体を発現するファージライブラリーからヒト化抗体を選んでもよい。さらに、ヒト化抗体は、遺伝子組み換え動物にヒト免疫グロブリン部位を導入することによって製造することができ、前記遺伝子組み換え動物は、たとえば内在性免疫グロブリン遺伝子が既に部分的にまたは完全に不活性化されたマウスでもよい。また、ヒト化抗体は、特定の抗原に対する抗体を生成するヒトＢ細胞を不死化させることによって製造することができる。
「キメラ抗体」とは、抗体における重鎖および軽鎖の一部のアミノ酸配列は一つの特定の種類の抗体由来の相応の配列と相同性を有するが、当該鎖のほかの部分はもう一つの特定の種類の相応の配列と相同性を有する。典型的に、これらのキメラ抗体において、重鎖および軽鎖の可変領域はいずれも一種の哺乳動物の可変領域と類似しているが、その定常領域はもう一種の哺乳動物の配列と相同性を有する。キメラ抗体の優位点は、これらの可変領域は容易に現在既知の源から現在得られる非ヒト由来宿主のリンパ腫細胞またはＢ細胞とたとえばヒト細胞調製物から得られる定常領域と組み合わせて製造することができることである。当該キメラ抗体の特異性はその由来に影響されず、その定常領域はヒト由来のものであるため、ヒト受容体の免疫反応を引き起こす可能性が低い。当然、キメラ抗体の定義は、ここで具体的に記載されている例に限定されない。
グラフティング抗体は、ＣＤＲ移植抗体（CDR grafting antibody）とも呼ばれ、抗体の可変領域のＣＤＲは抗体が抗原を認識および結合する領域で、直接抗体の特異性を決める。マウス由来モノクローナル抗体のＣＤＲをヒト由来抗体の可変領域にヒト由来抗体のＣＤＲの代わりに移植し、ヒト由来抗体にマウス由来モノクローナル抗体の抗原結合特異性を持たせると同時に、その異種性を減少する。しかし、抗原は主に抗体のＣＤＲと接触するが、ＦＲ領域もよく作用に関与し、ＣＤＲの空間配置に影響する。そのため、ヒト由来ＦＲ領域に換えた後、このようなマウス由来ＣＤＲとヒト由来ＦＲが融合したＶ領域は、モノクローナル抗体の本来のＣＤＲ配置を変えたせいか、抗原と結合する能力は低下し、ひいては顕著に低下する。既に抗体に対して分子設計を行い、ヒト由来ＦＲ領域にマウス由来ＦＲ領域の一部の重要な残基を導入することができるが、配置が適当な場合、その親和性はマウス抗体の本来のものに相当する。
表面再構築抗体とは、異種抗体の表面のアミノ酸残基に対してヒト化の改造を行う。当該方法の原則は、ヒト抗体と明らかに違う領域だけを置換し、抗体の活性を維持しながら、異種性を減少すると同時に、ヒト抗体の表面の残基と類似のアミノ酸を選んで置換することである。また、置換される箇所はできるだけ少なくし、側鎖の大きさ、電荷、疎水性に影響する残基、または水素結合を形成することによって抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配座に影響する残基はできるだけ置換しない。
完全ヒト化抗体とは、ヒト抗体遺伝子に対して、遺伝子組み換えまたは染色体組み換えの技術によって、ヒト抗体をコードする遺伝子を全部遺伝子工学的に改造された抗体遺伝子欠失動物に導入し、動物にヒト抗体を発現させ、抗体の完全ヒト化を実現させる。
完全ヒト化抗体とは、ヒト抗体遺伝子に対して、遺伝子組み換えまたは染色体組み換えの技術によって、ヒト抗体をコードする遺伝子を全部遺伝子工学的に改造された抗体遺伝子欠失動物に導入し、動物にヒト抗体を発現させ、抗体の完全ヒト化を実現させる。
ここで用いられる用語「競合」とは、抗体ポリペプチドが体外実験において免疫学的に競合性を表し、免疫競争の測定方法およびその条件は本分野で公知である。本発明の抗体ポリペプチドと競合する抗体ポリペプチドは、たとえば抗体ポリペプチドの重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）の一つまたは複数のアミノ酸または抗体ポリペプチドのフレームワーク領域の一つまたは複数のアミノ酸に対して本分野で公知の遺伝子工学的方法によって保存的置換を行うことによって、得られた類似および／または同様の抗原結合性質を有する抗体ポリペプチドを含んでもよい。
本発明のもう一つは、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターに関する。前記ベクターは、真核細胞のベクターまたは原核細胞のベクターでもよく、以下の条件を満足すればよい。（ａ）そのコード配列は、複製起点の配列を含むことで、当該ベクターは宿主細胞において複製される。（ｂ）選別マーカーをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子でコードされるタンパク質は当該宿主細胞が特定の選択培地で生存および生長するために必要なものである。宿主細胞にトランスフェクションまたは形質転換によって当該遺伝子を含むベクターが導入されていない場合、宿主は特定の選択培地で生存することができない。典型的な選別マーカー遺伝子でコードされるタンパク質は、抗生物質または毒素に耐性を有するタンパク質を含み、抗生物質または毒素は、たとえばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキサートなどを含む。栄養欠失の関連タンパク質を補い、培地に存在しない重要な栄養成分を提供する、たとえばＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が挙げられる。耐性スクリーニングを使用する例は、ネオマイシン耐性遺伝子を含む外来ベクターをトランスフェクトすることによって、宿主細胞を薬物ネオマイシンまたはＧ４１８を含む培地の場合、生存および生長を続けさせるものを含む。もう一つの例は、哺乳動物細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）においてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）選別マーカーを使用することであり、哺乳動物細胞の宿主細胞とは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含まず、核酸を合成することができず、ＨＴを含む培地でしか生長することができない、ＤＨＦＲ欠失型の細胞である。ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするとき、上記培地条件の選択で目的遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を同時に含む外来ベクターの陽性クローンを選別できるが、（ｃ）そのコード配列はプロモーターの配列を含み、（ｄ）発現ベクターはさらにほかの構成配列を含み、シグナルペプチド配列、転写終止配列、エンハンサー配列などが含まれ、好ましくは本発明のベクターは真核細胞ベクターである。好ましくは、本発明のベクターは、抗体の真核発現に使用されるｐＨベクターで、ＣＭＶのプロモーター、内部リボソーム進入部位配列（Internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）、ＤＨＦＲ選別マーカーなどの構成要素を含む。メトトレキサート（ＭＴＸ）はＤＨＦＲの阻害剤で、その作用を阻害することができる。細胞培地にＭＴＸが含まれる場合、ＤＨＦＲが抑制され、フィードバック調節によって、当該遺伝子を自己増幅させ、その上流および下流の遺伝子もつれて増幅することによって、目的遺伝子も増幅し、すなわち目的タンパク質の発現量を向上させることができる。
本発明のもう一つは、必要な多機能抗体ポリペプチドの発現に使用される、前記ベクターを含む宿主細胞に関する。「宿主細胞」は、挿入されたポリヌクレオチドを含むベクターを受け入れ得る、または受け入れた、単一の細胞または細胞培養物を含む。
本発明の宿主細胞は、使用されるベクターに合わせ、任意の原核宿主細胞または真核宿主細胞でもよい。真核宿主細胞は、酵母、昆虫細胞、植物細胞を含み、哺乳動物細胞などが好ましく、真核細胞には複雑な目的タンパク質の翻訳後修飾（たとえばグリコシル化）が存在するため、規模的培養への応用が多くなってきた。よく使用される宿主細胞系は、サル腎臓細胞（COS-7 ATCC CRL 1651）、ヒト胚胎腎臓細胞293およびそのサブクローン細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL10）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などを含む。好ましくは、本発明の真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
本発明の宿主細胞は、使用されるベクターに合わせ、任意の原核宿主細胞または真核宿主細胞でもよい。真核宿主細胞は、酵母、昆虫細胞、植物細胞を含み、哺乳動物細胞などが好ましく、真核細胞には複雑な目的タンパク質の翻訳後修飾（たとえばグリコシル化）が存在するため、規模的培養への応用が多くなってきた。よく使用される宿主細胞系は、サル腎臓細胞（COS-7 ATCC CRL 1651）、ヒト胚胎腎臓細胞293およびそのサブクローン細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL10）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などを含む。好ましくは、本発明の真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
本発明は、さらに、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦ前駆体ドメインを認識する一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用であって、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における使用を含む。
本発明は、さらに、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦ前駆体ドメインの１９〜１２８番目のアミノ酸を認識する一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用であって、術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる急性および慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における使用を含む。
本発明は、さらに、特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦ前駆体ドメインの１９〜１２８番目のアミノ酸を認識する一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用であって、術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる急性および慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における使用を含む。
本発明は、さらに、前記抗体ポリペプチドを含む薬物組成物を含む。当該組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬物組成物は通常の経路で投与することができ、静脈内、腹腔内注射が含まれるが、これらに限られない。また、本発明の薬物組成物は、ほかの疼痛抑制／予防剤と併用してもよい。
本発明に係る薬物、化合物または薬物組成物に適用される「有効量」とは、有益な所要の結果に必要な量で、前記結果は疼痛を軽減または減少する臨床結果を含む。有効量は、一回または複数回の投与によって実現される。本発明の目的のために、有効量とは、疼痛の強度の治療、軽減、減少、抑制および／または疼痛の予防に必要な量である。臨床条件でわかるように、有効量の薬物は別の薬物と一緒にまたは単独で得られる。そのため、「有効量」は一種または複数種の薬剤を投与する条件下のもの、または、単一の薬剤が一種または複数種のほかの薬剤と一緒に投与されるときに所要の結果が得られる場合、当該単一の薬剤は有効量で投与されたものと考えられる。具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の状況などの要素を考えて決めるべきであり、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
本発明に係る薬物、化合物または薬物組成物に適用される「有効量」とは、有益な所要の結果に必要な量で、前記結果は疼痛を軽減または減少する臨床結果を含む。有効量は、一回または複数回の投与によって実現される。本発明の目的のために、有効量とは、疼痛の強度の治療、軽減、減少、抑制および／または疼痛の予防に必要な量である。臨床条件でわかるように、有効量の薬物は別の薬物と一緒にまたは単独で得られる。そのため、「有効量」は一種または複数種の薬剤を投与する条件下のもの、または、単一の薬剤が一種または複数種のほかの薬剤と一緒に投与されるときに所要の結果が得られる場合、当該単一の薬剤は有効量で投与されたものと考えられる。具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の状況などの要素を考えて決めるべきであり、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９）に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。
実施例１：ヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原の原核発現
１．１ ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦベクターの構築および同定
ヒト腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧのｃＤＮＡを鋳型（RAYGENE社から購入）とし、以下のようなプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＰＲＯＢＤＮＦ−Ｆ：５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣ３’（配列番号：１５）
ＰＲＯＢＤＮＦ−Ｒ：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＧ３’（配列番号：１６）
両末端に酵素切断部位ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩがあるＰＲＯ ＢＤＮＦ遺伝子断片（７０３ｂｐ）を得、ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩで（NEB公司から購入）二重酵素切断し、目的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦを得た。ベクタープラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novogen社から購入）をＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩで二重酵素切断し、アガロースゲル電気泳動後、ベクター断片を回収し、前記目的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦとＴ４リガーゼ（NEB社から購入）の作用下で連結し、さらに大腸菌ＴＯＰ１０（LIFE社から購入）に形質転換し、アンピシリン耐性によるスクリーニングを行い、ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩ酵素切断で断片が挿入された陽性クローンを同定し、かつシークエンシングによって、正確なヒトｐｒｏＢＤＮＦ遺伝子配列を含む原核発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを得たことが検証された。
１．１ ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦベクターの構築および同定
ヒト腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧのｃＤＮＡを鋳型（RAYGENE社から購入）とし、以下のようなプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＰＲＯＢＤＮＦ−Ｆ：５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣ３’（配列番号：１５）
ＰＲＯＢＤＮＦ−Ｒ：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＧ３’（配列番号：１６）
両末端に酵素切断部位ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩがあるＰＲＯ ＢＤＮＦ遺伝子断片（７０３ｂｐ）を得、ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩで（NEB公司から購入）二重酵素切断し、目的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦを得た。ベクタープラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novogen社から購入）をＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩで二重酵素切断し、アガロースゲル電気泳動後、ベクター断片を回収し、前記目的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦとＴ４リガーゼ（NEB社から購入）の作用下で連結し、さらに大腸菌ＴＯＰ１０（LIFE社から購入）に形質転換し、アンピシリン耐性によるスクリーニングを行い、ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩ酵素切断で断片が挿入された陽性クローンを同定し、かつシークエンシングによって、正確なヒトｐｒｏＢＤＮＦ遺伝子配列を含む原核発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを得たことが検証された。
１．２ ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質の発現と精製
ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦプラスミドを発現宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社から購入）に形質転換し、かつアンピシリン耐性のプレートに広く塗り、３７℃で逆さまで一晩培養し、単一のクローンを取って誘導発現を行い、単一のクローンを取った後ＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで振とう培養し、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを入れ、３０℃で４ｈ誘導した後菌液を収集した。遠心で沈殿を収集し、１／１０体積の緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を入れて再懸濁させ、ＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を入れて氷の上に置いて超音波（超音波３秒、間隔１０秒、一組９９回、計４組）で処理し、１５ｍｉｎ遠心し（４℃、１２０００ｇ）、遠心で上清を収集し、Ni-NTA Agarose（QIAGEN社から購入）でアフィニティークロマトグラフィ−を行い、精製して目的発現タンパク質を得た後、ＰＢＳ溶液に対して透析を行い、さらに１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで透析後の精製タンパク質の純度を分析し、Ａ２８０でその含有量を検出し、かつ少量を取ってＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行ってその分子量を検出した。図１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果のように、第一レーンにおける精製して得られた目的バンドの分子量は３０ｋＤ近くで、その分子量はｐｒｏＢＤＮＦ分子の理論分子量の２７．８ｋＤと基本的に一致する。
ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦプラスミドを発現宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社から購入）に形質転換し、かつアンピシリン耐性のプレートに広く塗り、３７℃で逆さまで一晩培養し、単一のクローンを取って誘導発現を行い、単一のクローンを取った後ＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで振とう培養し、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを入れ、３０℃で４ｈ誘導した後菌液を収集した。遠心で沈殿を収集し、１／１０体積の緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を入れて再懸濁させ、ＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を入れて氷の上に置いて超音波（超音波３秒、間隔１０秒、一組９９回、計４組）で処理し、１５ｍｉｎ遠心し（４℃、１２０００ｇ）、遠心で上清を収集し、Ni-NTA Agarose（QIAGEN社から購入）でアフィニティークロマトグラフィ−を行い、精製して目的発現タンパク質を得た後、ＰＢＳ溶液に対して透析を行い、さらに１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで透析後の精製タンパク質の純度を分析し、Ａ２８０でその含有量を検出し、かつ少量を取ってＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行ってその分子量を検出した。図１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果のように、第一レーンにおける精製して得られた目的バンドの分子量は３０ｋＤ近くで、その分子量はｐｒｏＢＤＮＦ分子の理論分子量の２７．８ｋＤと基本的に一致する。
実施例２：ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン（human proBDNF pro-domain）の真核発現
２．１ ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン発現ベクターＶ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎの構築
上記で得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＢＤＮＦｐｒｏＶＦ１ ５’ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧ３’（配列番号：１７）
ＢＤＮＦｐｒｏＶＲ１ ５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧ３’（配列番号：１８）
両末端に酵素切断部位ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩがあるヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片を得た（３５０ｂｐ）。当該ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（NEB社から購入）で二重酵素切断し、得られた前駆体ドメイン遺伝子断片を同様のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（NEB社から購入）二重酵素切断を行ったベクターＶ５Ｆ（RAYGENE社から購入）とＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した後、宿主菌ＴＯＰ１０（LIFE社から購入）に形質転換し、陽性クローンを取ってＰＣＲ同定を行い、かつシークエンシングによって正確と同定され、Ｖ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドの構築に成功した。
２．１ ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン発現ベクターＶ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎの構築
上記で得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＢＤＮＦｐｒｏＶＦ１ ５’ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧ３’（配列番号：１７）
ＢＤＮＦｐｒｏＶＲ１ ５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧ３’（配列番号：１８）
両末端に酵素切断部位ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩがあるヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片を得た（３５０ｂｐ）。当該ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（NEB社から購入）で二重酵素切断し、得られた前駆体ドメイン遺伝子断片を同様のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（NEB社から購入）二重酵素切断を行ったベクターＶ５Ｆ（RAYGENE社から購入）とＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した後、宿主菌ＴＯＰ１０（LIFE社から購入）に形質転換し、陽性クローンを取ってＰＣＲ同定を行い、かつシークエンシングによって正確と同定され、Ｖ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドの構築に成功した。
２．２ ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の発現と精製
良好に生長したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、LIFE社から購入）を１×１０６細胞／ｍＬの密度で細胞三角フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで一晩培養して使用に備えた。上記工程で得られたＶ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドとリポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、LIFE社から購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈してやさしく混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートしたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで７２ｈ培養した。細胞培養液を収集し、４５００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、細胞を除去して上清を取った。１ｍｌのＦＬＡＧ抗体親和フィラー（ANTI-FLAG Agarose Affinity Gel、Sigma-Aldrich社から購入）をカラムに充填し、ＦＬＡＧ親和カラムを５〜１０カラム体積の分解緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で平衡化した。遠心した細胞培養液の上清を１ｍｌ／ｍｉｎでＦＬＡＧ親和カラムにかけ、通った液を収集して４℃で保存した。５〜１０カラム体積の洗浄緩衝液１（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で洗浄し、洗浄液１を収集し、４℃で保存した。４〜５カラム体積の洗浄緩衝液２（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で洗浄し、洗浄液２を収集し、４℃で保存した。４〜５カラム体積の溶離緩衝液（５０ｍＭグリシン．ＨＣｌ、ｐＨ３．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で溶離し、溶離液を収集して中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を入れ、透析液（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で４℃で一晩透析し、保存し、そして少量を取ってＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行った。図２に示す電気泳動結果のように、第一レーンにおける目的バンドの分子量は２０ｋＤ程度で、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の理論分子量の１３ｋＤよりもやや大きい。理論で示されるものに限らず、これは発現されたタンパク質の真核システムにおけるグリコシル化の程度に関係するかもしれない。
良好に生長したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、LIFE社から購入）を１×１０６細胞／ｍＬの密度で細胞三角フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで一晩培養して使用に備えた。上記工程で得られたＶ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドとリポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、LIFE社から購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈してやさしく混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートしたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで７２ｈ培養した。細胞培養液を収集し、４５００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、細胞を除去して上清を取った。１ｍｌのＦＬＡＧ抗体親和フィラー（ANTI-FLAG Agarose Affinity Gel、Sigma-Aldrich社から購入）をカラムに充填し、ＦＬＡＧ親和カラムを５〜１０カラム体積の分解緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で平衡化した。遠心した細胞培養液の上清を１ｍｌ／ｍｉｎでＦＬＡＧ親和カラムにかけ、通った液を収集して４℃で保存した。５〜１０カラム体積の洗浄緩衝液１（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で洗浄し、洗浄液１を収集し、４℃で保存した。４〜５カラム体積の洗浄緩衝液２（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で洗浄し、洗浄液２を収集し、４℃で保存した。４〜５カラム体積の溶離緩衝液（５０ｍＭグリシン．ＨＣｌ、ｐＨ３．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で溶離し、溶離液を収集して中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を入れ、透析液（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で４℃で一晩透析し、保存し、そして少量を取ってＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行った。図２に示す電気泳動結果のように、第一レーンにおける目的バンドの分子量は２０ｋＤ程度で、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の理論分子量の１３ｋＤよりもやや大きい。理論で示されるものに限らず、これは発現されたタンパク質の真核システムにおけるグリコシル化の程度に関係するかもしれない。
実施例３：ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質（ラットｐｒｏＢＤＮＦ ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ−Ｆｃ）の真核発現
３．１ ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合発現ベクターＶ５ＦＣ−ｒａｔ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ−Ｆｃの構築
ラットのｃＤＮＡ（RAYGENEから購入）を鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＲａｔｐｒｏＦ１ ５’ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣ３’（配列番号：１９）
ＲａｔｐｒｏＲ１ ５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡＣＡＴＧ３’（配列番号：２０）
両末端に酵素切断部位ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩがあるラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片を得た（３５６ｂｐ）。当該ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ（NEB社から購入）で二重酵素切断し、得られた前駆体ドメイン遺伝子断片を同様のＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ（NEB社から購入）二重酵素切断を行ったＦｃ融合発現ベクターＶ５ＦＣ（RAYGENE社から購入）とＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した後、宿主菌ＴＯＰ１０（LIFE社から購入）に形質転換し、陽性クローンを取ってＰＣＲ同定を行い、かつシークエンシングによって正確と同定され、Ｖ５ＦＣ−ｒａｔ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドの構築に成功した。
３．１ ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合発現ベクターＶ５ＦＣ−ｒａｔ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ−Ｆｃの構築
ラットのｃＤＮＡ（RAYGENEから購入）を鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＲａｔｐｒｏＦ１ ５’ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣ３’（配列番号：１９）
ＲａｔｐｒｏＲ１ ５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡＣＡＴＧ３’（配列番号：２０）
両末端に酵素切断部位ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩがあるラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片を得た（３５６ｂｐ）。当該ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ（NEB社から購入）で二重酵素切断し、得られた前駆体ドメイン遺伝子断片を同様のＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ（NEB社から購入）二重酵素切断を行ったＦｃ融合発現ベクターＶ５ＦＣ（RAYGENE社から購入）とＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した後、宿主菌ＴＯＰ１０（LIFE社から購入）に形質転換し、陽性クローンを取ってＰＣＲ同定を行い、かつシークエンシングによって正確と同定され、Ｖ５ＦＣ−ｒａｔ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドの構築に成功した。
３．２ ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質の発現と精製
良好に生長したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、LIFE社から購入）を１×１０６細胞／ｍＬの密度で細胞三角フラスコに接種し、３７℃、５％ ＣＯ２、１２０ｒｐｍで一晩培養して使用に備えた。上記工程で得られたＶ５ＦＣ−ｒａｔ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドとリポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、LIFE社から購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈してやさしく混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートしたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に入れ、３７℃、５％ ＣＯ２、１２０ｒｐｍで７２ｈ培養した。細胞培養液を収集し、４５００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、細胞を除去して上清を取った。１ｍｌのproteinA抗体親和フィラー（proteinA Agarose、RAYGENE社から購入）をカラムに充填し、proteinA親和カラムを５〜１０カラム体積の分解緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で平衡化した。遠心した細胞培養液の上清を１ｍｌ／ｍｉｎでproteinA親和カラムにかけ、通った液を収集して４℃で保存した。５〜１０カラム体積のＰＢＳ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄し、洗浄液１を収集し、４℃で保存した。４〜５カラム体積の溶離緩衝液（１００ｍＭグリシン．ＨＣｌ、ｐＨ２．５）で溶離し、溶離液を収集して１０％体積の中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を入れ、透析液（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で４℃で一晩透析し、保存し、そして少量を取ってＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行った。図３に示す電気泳動結果のように、第一レーンにおける目的バンドの分子量は４４．３ｋＤ程度で、ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質（ラットｐｒｏＢＤＮＦ ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ−Ｆｃ）の理論分子量に相当する。
良好に生長したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、LIFE社から購入）を１×１０６細胞／ｍＬの密度で細胞三角フラスコに接種し、３７℃、５％ ＣＯ２、１２０ｒｐｍで一晩培養して使用に備えた。上記工程で得られたＶ５ＦＣ−ｒａｔ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドとリポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、LIFE社から購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈してやさしく混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートし、インキュベートしたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に入れ、３７℃、５％ ＣＯ２、１２０ｒｐｍで７２ｈ培養した。細胞培養液を収集し、４５００ｇで１５ｍｉｎ遠心し、細胞を除去して上清を取った。１ｍｌのproteinA抗体親和フィラー（proteinA Agarose、RAYGENE社から購入）をカラムに充填し、proteinA親和カラムを５〜１０カラム体積の分解緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で平衡化した。遠心した細胞培養液の上清を１ｍｌ／ｍｉｎでproteinA親和カラムにかけ、通った液を収集して４℃で保存した。５〜１０カラム体積のＰＢＳ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄し、洗浄液１を収集し、４℃で保存した。４〜５カラム体積の溶離緩衝液（１００ｍＭグリシン．ＨＣｌ、ｐＨ２．５）で溶離し、溶離液を収集して１０％体積の中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を入れ、透析液（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセリン）で４℃で一晩透析し、保存し、そして少量を取ってＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行った。図３に示す電気泳動結果のように、第一レーンにおける目的バンドの分子量は４４．３ｋＤ程度で、ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質（ラットｐｒｏＢＤＮＦ ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ−Ｆｃ）の理論分子量に相当する。
実施例４ ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインモノクローナル抗体の製造と同定
４．１ 組換えタンパク質による免疫
上記実施例１で得られた精製ヒト１ｍｌ ｐｒｏＢＤＮＦタンパク質（１．０ｍｇ／ｍＬ）を抗原として１ｍＬの完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社から購入）と十分に乳化混合し、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して皮下免疫を行い、各マウスに１００μｇのヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原で免疫を行った。４週間後、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原と不完全フロイントアジュバントを乳化混合し、マウスに腹腔注射して免疫を行い、各マウスに５０μｇずつ、その後２週間ごとに、腹腔に５０μｇの抗原による強化免疫を続けた。４回目の強化免疫の１週間後、上記実施例２で得られた精製ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質をコーティングし、ＥＬＩＳＡ法によってマウスの血清抗体価を検出し、マウスの血清抗体価が＞１０５になるまで強化免疫を続けた。最後の強化免疫の３週間後、上記ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質２０μｇで脾内免疫を行い、使用に備えた。
４．１ 組換えタンパク質による免疫
上記実施例１で得られた精製ヒト１ｍｌ ｐｒｏＢＤＮＦタンパク質（１．０ｍｇ／ｍＬ）を抗原として１ｍＬの完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社から購入）と十分に乳化混合し、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して皮下免疫を行い、各マウスに１００μｇのヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原で免疫を行った。４週間後、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原と不完全フロイントアジュバントを乳化混合し、マウスに腹腔注射して免疫を行い、各マウスに５０μｇずつ、その後２週間ごとに、腹腔に５０μｇの抗原による強化免疫を続けた。４回目の強化免疫の１週間後、上記実施例２で得られた精製ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質をコーティングし、ＥＬＩＳＡ法によってマウスの血清抗体価を検出し、マウスの血清抗体価が＞１０５になるまで強化免疫を続けた。最後の強化免疫の３週間後、上記ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質２０μｇで脾内免疫を行い、使用に備えた。
４．２ ヒトｐｒｏＢＤＮＦハイブリドーマ細胞株の構築
マウスの脾内強化免疫の４日間後、無菌の状況で脾臓を取り、１００メッシュのフィルターネットでリンパ球を分離し、骨髄腫細胞系ＳＰ２／０と融合し、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）の選択性培養を３日間行った後、ＨＴ培地を追加し、１週間培養を続けた。本発明の上記実施例のヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原でコーティングし、ＥＬＩＳＡで陽性クローンをスクリーニングし、有限希釈法でサブクローンを３回行い、２か月続けて培養し、最後に安定したハイブリドーマ細胞系を得た（各クローンをそれぞれ２Ｂ１１、２Ｃ７、５Ｃ１０、４Ｃ３、６Ｆ３、２Ｆ３、８Ｅ１、１Ｇ７と名付けた）。
マウスの脾内強化免疫の４日間後、無菌の状況で脾臓を取り、１００メッシュのフィルターネットでリンパ球を分離し、骨髄腫細胞系ＳＰ２／０と融合し、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）の選択性培養を３日間行った後、ＨＴ培地を追加し、１週間培養を続けた。本発明の上記実施例のヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原でコーティングし、ＥＬＩＳＡで陽性クローンをスクリーニングし、有限希釈法でサブクローンを３回行い、２か月続けて培養し、最後に安定したハイブリドーマ細胞系を得た（各クローンをそれぞれ２Ｂ１１、２Ｃ７、５Ｃ１０、４Ｃ３、６Ｆ３、２Ｆ３、８Ｅ１、１Ｇ７と名付けた）。
４．３ 抗体の精製
それぞれハイブリドーマ細胞を取ってクローニングし、５×１０５細胞／マウスの量でそれぞれ各群の相応のマウスの腹腔に注射して腹水を作り、腹水を１００ｍｌ取って２倍体積の０．０６Ｍ、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝で希釈し、ゆっくり４％オクタン酸を滴下し、滴下しながら撹拌した。３０ｍｉｎ撹拌した後、混濁液を１００００ｇで３０ｍｉｎ遠心した。沈殿を捨て、上清液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で一晩透析した。透析液を取り、ゆっくり等体積の飽和硫酸アンモニウムを入れ、２時間静置した。混濁液を１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心した。上清液を捨て、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで溶解させた。溶解させた溶液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析し、その間に液を２回交換し、２回の液交換の時間の間隔は５時間以上であった。透析溶液を１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿を捨て、上清液を収集した。
プロテインＧ親和カラム（GE社から購入）を室温に戻し、５カラム体積のＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した。前記で収集した上清液をカラムにかけ、５カラム体積のＰＢＳで洗浄した。ｐＨ２．３、０．１Ｍのグリシン塩酸溶液で溶離させ、溶離液に１／１０体積の１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液ｐＨ９．０を入れて中和した。溶液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析し、その間に液を２回交換し、２回の液交換の時間の間隔は５時間超であった。透析溶液を１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、上清液を０．２２μｍろ過膜でろ過して保存し、精製された各クローンに相応して生成したモノクローナル抗体を得た。
それぞれハイブリドーマ細胞を取ってクローニングし、５×１０５細胞／マウスの量でそれぞれ各群の相応のマウスの腹腔に注射して腹水を作り、腹水を１００ｍｌ取って２倍体積の０．０６Ｍ、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝で希釈し、ゆっくり４％オクタン酸を滴下し、滴下しながら撹拌した。３０ｍｉｎ撹拌した後、混濁液を１００００ｇで３０ｍｉｎ遠心した。沈殿を捨て、上清液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で一晩透析した。透析液を取り、ゆっくり等体積の飽和硫酸アンモニウムを入れ、２時間静置した。混濁液を１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心した。上清液を捨て、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで溶解させた。溶解させた溶液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析し、その間に液を２回交換し、２回の液交換の時間の間隔は５時間以上であった。透析溶液を１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿を捨て、上清液を収集した。
プロテインＧ親和カラム（GE社から購入）を室温に戻し、５カラム体積のＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した。前記で収集した上清液をカラムにかけ、５カラム体積のＰＢＳで洗浄した。ｐＨ２．３、０．１Ｍのグリシン塩酸溶液で溶離させ、溶離液に１／１０体積の１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液ｐＨ９．０を入れて中和した。溶液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析し、その間に液を２回交換し、２回の液交換の時間の間隔は５時間超であった。透析溶液を１００００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、上清液を０．２２μｍろ過膜でろ過して保存し、精製された各クローンに相応して生成したモノクローナル抗体を得た。
４．４ ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体結合領域の同定
実験群１：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例１で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質を希釈した。各群は８つのウェルを含み、それぞれ後の相応の８つの精製されたモノクローナル抗体の添加に使用した。
実験群２：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例２で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質を希釈した。各群は８つのウェルを含み、それぞれ後の相応の８つの精製されたモノクローナル抗体の添加に使用した。
実験群１および２の希釈したタンパク質をそれぞれ５０μｌ（５０ｎｇ）の体積および質量で４℃で一晩コーティングした。その後、上清を捨て、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、５％の粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。その後、実験群１および２の８つのウェルにそれぞれ前記実施例３．３で得られた８つの精製されたモノクローナル抗体を５０μｌ（１μｇ／ｍｌ）入れ、３７℃で１時間結合させた。０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウス第二抗体を５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を入れて１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。実験を２回繰り返し、２回の吸光度の測定値の平均値を取った。吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。
図４に示すように、精製されたモノクローナル抗体２Ｂ１１は、ヒトｐｒｏＢＤＮＦおよびヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインのいずれとも結合し、当該抗体２Ｂ１１が２つのタンパク質の共通の領域、すなわちヒトｐｒｏＢＤＮＦの前駆体ドメイン領域に結合した。
実験群１：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例１で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質を希釈した。各群は８つのウェルを含み、それぞれ後の相応の８つの精製されたモノクローナル抗体の添加に使用した。
実験群２：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例２で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質を希釈した。各群は８つのウェルを含み、それぞれ後の相応の８つの精製されたモノクローナル抗体の添加に使用した。
実験群１および２の希釈したタンパク質をそれぞれ５０μｌ（５０ｎｇ）の体積および質量で４℃で一晩コーティングした。その後、上清を捨て、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、５％の粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。その後、実験群１および２の８つのウェルにそれぞれ前記実施例３．３で得られた８つの精製されたモノクローナル抗体を５０μｌ（１μｇ／ｍｌ）入れ、３７℃で１時間結合させた。０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウス第二抗体を５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を入れて１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。実験を２回繰り返し、２回の吸光度の測定値の平均値を取った。吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。
図４に示すように、精製されたモノクローナル抗体２Ｂ１１は、ヒトｐｒｏＢＤＮＦおよびヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインのいずれとも結合し、当該抗体２Ｂ１１が２つのタンパク質の共通の領域、すなわちヒトｐｒｏＢＤＮＦの前駆体ドメイン領域に結合した。
４．５ モノクローナル抗体２Ｂ１１の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
１０ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１ｍｌの水に溶解させ、１ｍｌの０．５Ｍ ＮａＩＯ４を入れ、４℃で３０ｍｉｎ反応させた。１ｍｌの０．１６Ｍエチレングリコールを入れた。４℃で３０ｍｉｎ反応させた。１０ｍｇの２Ｂ１１抗体を０．０５Ｍ、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液に透析し、酸化したＨＲＰと２Ｂ１１抗体を均一に混合し、４℃で一晩透析し、０．４ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＮａＢＨ４を入れ、４℃で２ｈ撹拌し、低濃度のＮａＨ２ＰＯ４溶液のＰＨを弱酸性に調節し、等体積のグリセリンを入れて使用に備えた。
１０ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１ｍｌの水に溶解させ、１ｍｌの０．５Ｍ ＮａＩＯ４を入れ、４℃で３０ｍｉｎ反応させた。１ｍｌの０．１６Ｍエチレングリコールを入れた。４℃で３０ｍｉｎ反応させた。１０ｍｇの２Ｂ１１抗体を０．０５Ｍ、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液に透析し、酸化したＨＲＰと２Ｂ１１抗体を均一に混合し、４℃で一晩透析し、０．４ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＮａＢＨ４を入れ、４℃で２ｈ撹拌し、低濃度のＮａＨ２ＰＯ４溶液のＰＨを弱酸性に調節し、等体積のグリセリンを入れて使用に備えた。
４．６ ＥＬＩＳＡ法による抗体２Ｂ１１とｐｒｏＢＤＮＦの結合の種属特異性の測定
実験群１：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例１で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質を希釈した。
実験群２：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で原核発現のマウスｐｒｏＢＤＮＦ（Alomone labs社から購入）を希釈した。
実験群３：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例３における真核発現のラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインを希釈した。
実験群１、２および３の希釈したタンパク質をそれぞれ５０μｌ（５０ｎｇ）の体積および質量で４℃で一晩コーティングした。その後、上清を捨て、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、さらに５％の粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。上清を捨て、希釈した実施例４．５における西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の２Ｂ１１抗体を１μｇ／ｍｌで５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。上清を捨て、各ウェルを０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を入れて１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。
図５に示すように、クローン２Ｂ１１は本発明における実施例１で製造されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質および市販のマウスｐｒｏＢＤＮＦタンパク質ならびに実施例３における真核発現のラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインのいずれとも結合した。
実験群１：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例１で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質を希釈した。
実験群２：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で原核発現のマウスｐｒｏＢＤＮＦ（Alomone labs社から購入）を希釈した。
実験群３：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例３における真核発現のラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインを希釈した。
実験群１、２および３の希釈したタンパク質をそれぞれ５０μｌ（５０ｎｇ）の体積および質量で４℃で一晩コーティングした。その後、上清を捨て、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、さらに５％の粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。上清を捨て、希釈した実施例４．５における西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の２Ｂ１１抗体を１μｇ／ｍｌで５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。上清を捨て、各ウェルを０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を入れて１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。
図５に示すように、クローン２Ｂ１１は本発明における実施例１で製造されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質および市販のマウスｐｒｏＢＤＮＦタンパク質ならびに実施例３における真核発現のラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインのいずれとも結合した。
４．７ ＥＬＩＳＡ法によるクローン２Ｂ１１の抗体サブタイプの測定
分類する抗体の数によって６つの実験群を設け、各実験群の各ウェルに希釈した原核発現のヒトｐｒｏＢＤＮＦ（５０ｎｇ）タンパク質を入れ、体積が５０μｌで、４℃で一晩コーティングした。上清を捨て、各ウェルをＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、５％の粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。上清を捨て、各ウェルに希釈した上記精製された２Ｂ１１クローンの抗体を１μｇ／ｍｌで５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。その後、上清を捨て、各ウェルを０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、実験群１〜６に対して相応の６種類の分類抗体（Sigma-Aldrich社から購入）：ヒツジ抗マウスＩｇＧ１、ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ａ、ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ｂ、ヒツジ抗マウスＩｇＧ３、ヒツジ抗マウスＩｇＡおよびヒツジ抗マウスＩｇＭを入れ、３７℃で１時間結合させた。上清を捨て、さらに各ウェルを０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰで標識されたロバ抗ヒツジ第二抗体を５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。上清を捨て、各ウェルを０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を入れて１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。図６に示すように、クローン２Ｂ１１はＩｇＧ１型と同定された。
分類する抗体の数によって６つの実験群を設け、各実験群の各ウェルに希釈した原核発現のヒトｐｒｏＢＤＮＦ（５０ｎｇ）タンパク質を入れ、体積が５０μｌで、４℃で一晩コーティングした。上清を捨て、各ウェルをＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、５％の粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。上清を捨て、各ウェルに希釈した上記精製された２Ｂ１１クローンの抗体を１μｇ／ｍｌで５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。その後、上清を捨て、各ウェルを０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、実験群１〜６に対して相応の６種類の分類抗体（Sigma-Aldrich社から購入）：ヒツジ抗マウスＩｇＧ１、ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ａ、ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ｂ、ヒツジ抗マウスＩｇＧ３、ヒツジ抗マウスＩｇＡおよびヒツジ抗マウスＩｇＭを入れ、３７℃で１時間結合させた。上清を捨て、さらに各ウェルを０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰで標識されたロバ抗ヒツジ第二抗体を５０μｌ入れ、３７℃で１時間結合させた。上清を捨て、各ウェルを０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を入れて１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。図６に示すように、クローン２Ｂ１１はＩｇＧ１型と同定された。
実施例５ モノクローナル抗体２Ｂ１１のシークエンシング
５’−ＲＡＣＥ法で２Ｂ１１の配列をクローニングしてシークエンシングした（具体的な操作はTakara 5’-full RACE Kitの説明書を参照する）。アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で全ＲＮＡにおける露出した５’リン酸基に対して脱リン酸反応をさせた。全ＲＮＡの使用量は２μｇで、反応後フェノール／クロロホルムで抽出して回収した。タバコ酸性ピロホスファターゼ（Tobacco Acid Pyrophosphatase、ＴＡＰ）でｍＲＮＡの５’キャップ構造を脱離させ、一つのリン酸基を残した。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼで5’RACE AdaptorをｍＲＮＡに連結し、反応後フェノール／クロロホルムで抽出して回収した。逆転写酵素で逆転写反応を行い、使用されたプライマーはキットで提供されたRandom 9 mersである。
逆転写産物を鋳型とし、高正確性酵素で目的遺伝子をＰＣＲ増幅し、使用されたプライマーは以下の通りである。
５’：５’ＲＡＣＥ Ｏｕｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡ）、キットで提供；（配列番号：１９）
３’：
重鎖：ｍＩｇＧ１−ｏｕｔ ｐｒｉｍｅｒ（ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴ）（配列番号：２０）
軽鎖：ｍκ−ｏｕｔ ｐｒｉｍｅｒ（ＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧ）（配列番号：２１）
上記増幅で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ネステッドＰＣＲを行った。使用されたプライマーは以下の通りである。
５’：
５’ＲＡＣＥ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧ）、キットで提供（配列番号：２２）
３’：
重鎖：ｍＩｇＧ１−ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴ）（配列番号：２３）
軽鎖：ｍκ−ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧ）（配列番号：２４）
上記増幅で得られたＰＣＲ産物を精製し、ＴＡクローン（pGEM-T Easy Vector Kit、promega社から購入。方法は当該キットの操作手順を参照する。）によって、それぞれＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＨおよびＴｅａｓｙ−２Ｂ１１Ｖκベクターを得た後、シークエンシングによってモノクローナル抗体２Ｂ１１の重鎖および軽鎖の配列を得た。重鎖および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される。KabatManによって重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域の配列は、それぞれ配列番号７および配列番号８で表されると確認された。Kabat番号付けによって重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１〜３で表され、軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４〜６で表されると確認された。
５’−ＲＡＣＥ法で２Ｂ１１の配列をクローニングしてシークエンシングした（具体的な操作はTakara 5’-full RACE Kitの説明書を参照する）。アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で全ＲＮＡにおける露出した５’リン酸基に対して脱リン酸反応をさせた。全ＲＮＡの使用量は２μｇで、反応後フェノール／クロロホルムで抽出して回収した。タバコ酸性ピロホスファターゼ（Tobacco Acid Pyrophosphatase、ＴＡＰ）でｍＲＮＡの５’キャップ構造を脱離させ、一つのリン酸基を残した。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼで5’RACE AdaptorをｍＲＮＡに連結し、反応後フェノール／クロロホルムで抽出して回収した。逆転写酵素で逆転写反応を行い、使用されたプライマーはキットで提供されたRandom 9 mersである。
逆転写産物を鋳型とし、高正確性酵素で目的遺伝子をＰＣＲ増幅し、使用されたプライマーは以下の通りである。
５’：５’ＲＡＣＥ Ｏｕｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡ）、キットで提供；（配列番号：１９）
３’：
重鎖：ｍＩｇＧ１−ｏｕｔ ｐｒｉｍｅｒ（ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴ）（配列番号：２０）
軽鎖：ｍκ−ｏｕｔ ｐｒｉｍｅｒ（ＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧ）（配列番号：２１）
上記増幅で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ネステッドＰＣＲを行った。使用されたプライマーは以下の通りである。
５’：
５’ＲＡＣＥ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧ）、キットで提供（配列番号：２２）
３’：
重鎖：ｍＩｇＧ１−ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴ）（配列番号：２３）
軽鎖：ｍκ−ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧ）（配列番号：２４）
上記増幅で得られたＰＣＲ産物を精製し、ＴＡクローン（pGEM-T Easy Vector Kit、promega社から購入。方法は当該キットの操作手順を参照する。）によって、それぞれＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＨおよびＴｅａｓｙ−２Ｂ１１Ｖκベクターを得た後、シークエンシングによってモノクローナル抗体２Ｂ１１の重鎖および軽鎖の配列を得た。重鎖および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される。KabatManによって重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域の配列は、それぞれ配列番号７および配列番号８で表されると確認された。Kabat番号付けによって重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１〜３で表され、軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４〜６で表されると確認された。
実施例６ キメラ抗体ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１およびｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１の構築および結合活性の初歩的同定
６．１ ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１の構築
本発明の実施例５で構築されたベクターＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＨを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
２ＢＶＨＦ（５’−ｇｇｃｔｇｔｔｃａｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｔｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｃｔｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｇｔｇｇａｇ−３’）配列番号：２５および
２ＢＶＨＲ（５’−ｃｇａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｔｇａｃｔｇ−３’）配列番号：２６
2B11抗体の重鎖の可変領域を得た。
同時に、抗体ベクターｐＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（すなわちｐＨ−ＣＨ１２、このベクターの構築方法はＰＣＴ／ＣＮ２００９／０７４０９０の実施例７．１を参照する）を鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行った。
プライマーＦｃＦ（５’−ｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇ−３’）配列番号：２７および
プライマーＰＩＨＲ（５’−ｃｇｃｔｔｔｔｇａｇａｇｇｇａｇｔａｃｔｃａｃ−３’）配列番号：２８
ヒトＩｇＧ１の定常領域を得た。
上記２つのＰＣＲ増幅の断片を回収した後、架橋し、さらに以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
Ｎｈｅ（５’−ｃｃｔａｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇａｇａｇｔｇｃｔｇａｔｔｃｔｔｔｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔｃａｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｔ−３’）配列番号：２９および
前記プライマーＰＩＨＲ 配列番号：２８
産物のアガロースゲルを回収した後、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（NEB社から購入）で二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたベクターｐＨに連結し、キメラの２Ｂ１１重鎖を含む発現プラスミドｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１を得、ＰＣＲ同定およびシークエンシング確認を行った。
６．１ ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１の構築
本発明の実施例５で構築されたベクターＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＨを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
２ＢＶＨＦ（５’−ｇｇｃｔｇｔｔｃａｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｔｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｃｔｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｇｔｇｇａｇ−３’）配列番号：２５および
２ＢＶＨＲ（５’−ｃｇａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｔｇａｃｔｇ−３’）配列番号：２６
2B11抗体の重鎖の可変領域を得た。
同時に、抗体ベクターｐＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（すなわちｐＨ−ＣＨ１２、このベクターの構築方法はＰＣＴ／ＣＮ２００９／０７４０９０の実施例７．１を参照する）を鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行った。
プライマーＦｃＦ（５’−ｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇ−３’）配列番号：２７および
プライマーＰＩＨＲ（５’−ｃｇｃｔｔｔｔｇａｇａｇｇｇａｇｔａｃｔｃａｃ−３’）配列番号：２８
ヒトＩｇＧ１の定常領域を得た。
上記２つのＰＣＲ増幅の断片を回収した後、架橋し、さらに以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
Ｎｈｅ（５’−ｃｃｔａｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇａｇａｇｔｇｃｔｇａｔｔｃｔｔｔｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔｃａｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｔ−３’）配列番号：２９および
前記プライマーＰＩＨＲ 配列番号：２８
産物のアガロースゲルを回収した後、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（NEB社から購入）で二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたベクターｐＨに連結し、キメラの２Ｂ１１重鎖を含む発現プラスミドｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１を得、ＰＣＲ同定およびシークエンシング確認を行った。
６．２ ベクターｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１の構築
本発明の実施例５で構築されたベクターＴｅａｓｙ−２Ｂ１１Ｖκを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
２ＢＶκＦ（５’−ｃｔｔｇｃａｔｔｃｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｇｇｔｔｔｃｃａｇｇｔｇｃａａｇａｔｇｔｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｔｃ−３’）（配列番号：３０）および
２ＢＶκＲ（５’−ａｇｃｃａｃｃｇｔａｃｇｔｔｔｔａｔｔｔｃｃａａｃｔｔｔｇ−３’）（配列番号：３１）
モノクローナル抗体２Ｂ１１の軽鎖の可変領域を得、断片を回収し、さらに以下のプライマーで上記増幅断片を増幅した。
Ｅｃｏ（５’−ｇａｔｃｇａｔａｔｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｔｇａｔｇｇｔｃｃｔｔｇｃｔｃａｇｔｔｔｃｔｔｇｃａｔｔｃｔｔｇｔｔｇ−３’）（配列番号：３２）および
２ＢＶκＲ（配列番号：３１）
得られた増幅産物のアガロースゲルを回収した後、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ社から購入）で二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたベクターｐＫに連結し、キメラの２Ｂ１１軽鎖を含む発現プラスミドｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１を得、ＰＣＲ同定およびシークエンシング確認を行った。
本発明の実施例５で構築されたベクターＴｅａｓｙ−２Ｂ１１Ｖκを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
２ＢＶκＦ（５’−ｃｔｔｇｃａｔｔｃｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｇｇｔｔｔｃｃａｇｇｔｇｃａａｇａｔｇｔｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｔｃ−３’）（配列番号：３０）および
２ＢＶκＲ（５’−ａｇｃｃａｃｃｇｔａｃｇｔｔｔｔａｔｔｔｃｃａａｃｔｔｔｇ−３’）（配列番号：３１）
モノクローナル抗体２Ｂ１１の軽鎖の可変領域を得、断片を回収し、さらに以下のプライマーで上記増幅断片を増幅した。
Ｅｃｏ（５’−ｇａｔｃｇａｔａｔｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｔｇａｔｇｇｔｃｃｔｔｇｃｔｃａｇｔｔｔｃｔｔｇｃａｔｔｃｔｔｇｔｔｇ−３’）（配列番号：３２）および
２ＢＶκＲ（配列番号：３１）
得られた増幅産物のアガロースゲルを回収した後、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ社から購入）で二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたベクターｐＫに連結し、キメラの２Ｂ１１軽鎖を含む発現プラスミドｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１を得、ＰＣＲ同定およびシークエンシング確認を行った。
実施例７ キメラ抗体ベクターＣＨ２Ｂ１１の構築および結合活性の初歩的同定
上記構築された発現ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１およびｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１を懸濁細胞ＣＨＯにコトランスフェクトして発現させ、３日後培養した細胞の上清を収集した。培養したＣＨＯ細胞の上清に発現されたキメラ抗体ＣＨ２Ｂ１１が含まれた。
培養した細胞の上清を取ってＥＬＩＳＡ結合実験を行った。コーティングした本発明実施例１で製造されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質の実験群１だけで、後で各ウェルに相応の８つのモノクローナル抗体のクローンではなく、本実施例における細胞上清の勾配希釈液を入れた以外、実験方法は基本的に本発明実施例４．４の方法と同様である。同様に吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。
実験結果は、図７に示すように、キメラ抗体ＣＨ２Ｂ１の培養したＣＨＯ細胞の上清液は１：３２で希釈された後も、ヒトｐｒｏＢＤＮＦと結合する活性を示した。
上記構築された発現ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１およびｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１を懸濁細胞ＣＨＯにコトランスフェクトして発現させ、３日後培養した細胞の上清を収集した。培養したＣＨＯ細胞の上清に発現されたキメラ抗体ＣＨ２Ｂ１１が含まれた。
培養した細胞の上清を取ってＥＬＩＳＡ結合実験を行った。コーティングした本発明実施例１で製造されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質の実験群１だけで、後で各ウェルに相応の８つのモノクローナル抗体のクローンではなく、本実施例における細胞上清の勾配希釈液を入れた以外、実験方法は基本的に本発明実施例４．４の方法と同様である。同様に吸光度値が陰性コントロールウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。
実験結果は、図７に示すように、キメラ抗体ＣＨ２Ｂ１の培養したＣＨＯ細胞の上清液は１：３２で希釈された後も、ヒトｐｒｏＢＤＮＦと結合する活性を示した。
実施例８ モノクローナル抗体２Ｂ１１の鎮痛作用
８．１ ２Ｂ１１静脈注射のホルマリンによって誘発される二相性の疼痛に対する軽減
ＳＤラット（体重２００−２５０ｇ）を２Ｂ１１群とブランクコントロール（本実験では同体積のＰＢＳをブランクコントロール群とした）群に分けた。モデル構築は、主に１％ホルマリンをマウスの足底に５０μｌ注射する方法を使用した。モデル構築の半時間前に、尾静脉から２Ｂ１１（７５μｇ／ｋｇ）または等量のブランクコントロールを注射した。尾静脉投与の形態は、ラットの尻尾を温かい水で洗浄した後、ポビドンヨードで駐車する部位を消毒し、注射量の薬物を入れた無菌１ｍＬ注射器で、やや負圧で尻尾と約１０度の角度から刺し、突破感が現れて暗赤色の血液が注射器に入ったとき、２Ｂ１１を濃度５００μｇ／ｋｇで計３００μＬ注射した。
ホルマリンによる炎症性疼痛のモデル構築方法は、主にBellasio Sらの方法を参照し、まずマウスを透明樹脂ガラス箱（３０×２０×２０ｃｍ）に入れて３０ｍｉｎ慣れさせた後、その右後ろ足底に１％ホルマリン溶液を５０μｌ皮下注射し、注射後すぐ箱に戻し、同時に５ｍｉｎおきに、注射後１ｈ以内でマウスが注射した足を舐めるか噛む時間を記録した。足底へのホルマリンの皮下注射は、典型的な急性炎症性疼痛モデルで、このモデルでは動物は特殊な自発的な疼痛行為を表し、足を舐めるか噛む行為で、足を舐めるか噛む時間が長ければ長いほど、疼痛の程度が強いことを示す。このような自発的な疼痛行為は、通常、２相に分かれ、第１相は注射後０〜５ｍｉｎに、第２相は注射後１５〜６０ｍｉｎに現れ、２相の間に間欠期が現れる。中では、第２相は疼痛感作（中枢性感作）の機序に関連すると思われる。
図８および相応の下記表１のデータが示すように、２Ｂ１１群では、第１相の足を舐める時間はブランクコントロール群よりも短縮したが、第２相は、２Ｂ１１群では、動物の足を舐める時間はブランクコントロール群よりも顕著に減少し、２Ｂ１１がホルマリンの第２相に顕著な鎮痛効果があることが示された。（＊＊、Ｐ＜０．０１、コントロール群と比較する）。
８．１ ２Ｂ１１静脈注射のホルマリンによって誘発される二相性の疼痛に対する軽減
ＳＤラット（体重２００−２５０ｇ）を２Ｂ１１群とブランクコントロール（本実験では同体積のＰＢＳをブランクコントロール群とした）群に分けた。モデル構築は、主に１％ホルマリンをマウスの足底に５０μｌ注射する方法を使用した。モデル構築の半時間前に、尾静脉から２Ｂ１１（７５μｇ／ｋｇ）または等量のブランクコントロールを注射した。尾静脉投与の形態は、ラットの尻尾を温かい水で洗浄した後、ポビドンヨードで駐車する部位を消毒し、注射量の薬物を入れた無菌１ｍＬ注射器で、やや負圧で尻尾と約１０度の角度から刺し、突破感が現れて暗赤色の血液が注射器に入ったとき、２Ｂ１１を濃度５００μｇ／ｋｇで計３００μＬ注射した。
ホルマリンによる炎症性疼痛のモデル構築方法は、主にBellasio Sらの方法を参照し、まずマウスを透明樹脂ガラス箱（３０×２０×２０ｃｍ）に入れて３０ｍｉｎ慣れさせた後、その右後ろ足底に１％ホルマリン溶液を５０μｌ皮下注射し、注射後すぐ箱に戻し、同時に５ｍｉｎおきに、注射後１ｈ以内でマウスが注射した足を舐めるか噛む時間を記録した。足底へのホルマリンの皮下注射は、典型的な急性炎症性疼痛モデルで、このモデルでは動物は特殊な自発的な疼痛行為を表し、足を舐めるか噛む行為で、足を舐めるか噛む時間が長ければ長いほど、疼痛の程度が強いことを示す。このような自発的な疼痛行為は、通常、２相に分かれ、第１相は注射後０〜５ｍｉｎに、第２相は注射後１５〜６０ｍｉｎに現れ、２相の間に間欠期が現れる。中では、第２相は疼痛感作（中枢性感作）の機序に関連すると思われる。
図８および相応の下記表１のデータが示すように、２Ｂ１１群では、第１相の足を舐める時間はブランクコントロール群よりも短縮したが、第２相は、２Ｂ１１群では、動物の足を舐める時間はブランクコントロール群よりも顕著に減少し、２Ｂ１１がホルマリンの第２相に顕著な鎮痛効果があることが示された。（＊＊、Ｐ＜０．０１、コントロール群と比較する）。
８．２ ２Ｂ１１静脈注射のＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）によって誘発される慢性炎症性疼痛に対する軽減
本実験では、２Ｂ１１のＣＦＡによって誘発される慢性炎症性疼痛に対する作用を観察した。ＣＦＡの足底注射によって誘発される疼痛は、典型的な慢性炎症性疼痛モデルで、持続時間が長い。足底にＣＦＡを注射した後、ラットの機械的痛覚閾値を低下させ、持続時間は３週間超である。
実験の群分けは、実施例８．１と同様である。モデル構築の１日前に、Von Freyフィラメント法でそのラットの逃避閾値（Paw Withdrawal Threshold、ＰＷＴ）を観察した。Von Freyフィラメントは、１８９６年にMaximilian von Freyによって設計された、触覚測定装置である。フィラメントは異なる直径のナイロンフィラメントで、使用時これらのフィラメントを皮膚（または動物の足底などの測定部位）と接触させてある程度の力でフィラメントをＳ状に曲がらせる。フィラメントを曲がらせる力は持続的なものだと思われるため、これらのフィラメントは正確に測定領域に加わった力を反映する。Von Freyフィラメントは、各種類の疼痛後機械的痛覚感作の測定に最も使われる道具の一つである。
本実験では、２Ｂ１１のＣＦＡによって誘発される慢性炎症性疼痛に対する作用を観察した。ＣＦＡの足底注射によって誘発される疼痛は、典型的な慢性炎症性疼痛モデルで、持続時間が長い。足底にＣＦＡを注射した後、ラットの機械的痛覚閾値を低下させ、持続時間は３週間超である。
実験の群分けは、実施例８．１と同様である。モデル構築の１日前に、Von Freyフィラメント法でそのラットの逃避閾値（Paw Withdrawal Threshold、ＰＷＴ）を観察した。Von Freyフィラメントは、１８９６年にMaximilian von Freyによって設計された、触覚測定装置である。フィラメントは異なる直径のナイロンフィラメントで、使用時これらのフィラメントを皮膚（または動物の足底などの測定部位）と接触させてある程度の力でフィラメントをＳ状に曲がらせる。フィラメントを曲がらせる力は持続的なものだと思われるため、これらのフィラメントは正確に測定領域に加わった力を反映する。Von Freyフィラメントは、各種類の疼痛後機械的痛覚感作の測定に最も使われる道具の一つである。
ラットまたはマウスの後ろ足にVon Freyフィラメントで痛覚閾値を測定する具体的な方法は以下の通りである。
Chaplandらの方法を参照し、ラットを上げた網状の金属ネットに置き、実験者が自由に後ろ足底に接触できるようにし、透明の有機ガラスカバーをし、実験を始める前にラットの毛の整理および探究活動が基本的になくなるようにラットを３０分間環境に慣れさせ、実験時間は８：００〜１６：００で、実験のときは光線が十分で、環境は静かで、温度は適当であった。
Chaplandらの方法を参照し、ラットを上げた網状の金属ネットに置き、実験者が自由に後ろ足底に接触できるようにし、透明の有機ガラスカバーをし、実験を始める前にラットの毛の整理および探究活動が基本的になくなるようにラットを３０分間環境に慣れさせ、実験時間は８：００〜１６：００で、実験のときは光線が十分で、環境は静かで、温度は適当であった。
実験を開始するとき、Up and Down法［dixon，Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1980, 20: 441-62］で、９本の異なる強度のVon freyフィラメント（０．６、１、１．４、２、４、６、８、１０、１５ｇ）を使用し、２Ｇから、順に下から上に垂直にラットの損傷側の後ろ足のひらの中央領域を刺激し、そのフィラメントをＳ状に軽く曲がらせ、そのまま６〜８秒維持し、前回の刺激の行動学的反応が正常に戻るように、連続の２回の刺激の間に３０秒の間隔を置いた。その損傷側の後ろ足の逃避反射を観察し、ラットが刺激の時間内でまたはvon Freyフィラメントを取る時にすぐ現れた快速の逃避反射を陽性反応としたが、身体活動、たとえば移動による逃避反射を陽性とせず、この場合その回の測定を繰り返した。ラットにこの陽性反応が現れなかった場合、その上の大きい目盛りのフィラメントを選んで足底を刺激し、陽性反応が現れた場合、その下の小さい目盛りのフィラメントを選んで刺激し、このように繰り返し、刺激の上限と下限はそれぞれ１５Ｇと０．６Ｇであった。Dixonによって紹介されたUp and down方法で５０％ＰＷＴを推算した。ラットに測定時間内でまたはvon Freyフィラメントを取る瞬間に快速の逃避反射または足を舐める反応が現れたら、陽性反応とし、「×」で表し、反応がなかったら、陰性反応とし、「○」で表す。以上の測定方法によって、一連の「○」と「×」からなる配列が得られ、「×」が現れる前の「○」を起点とし、当該起点を含む６回の連続の刺激反応、たとえば、「ＯＸＯＸＯＯ」を選び、５０％ＰＷＴを推算する重要な配列とした。しかし、当該配列は６回ではなくてもよく、ラットの異なる強度のフィラメントに対する反応によって、配列の組成の最小値は４回、たとえば「ＸＸＸＸ」で、ラットの２．０〜０．６Ｇの強度の範囲内の刺激はいずれも陽性でもよく、６回で、２．０〜１５Ｇの範囲内の強度の刺激はいずれも陰性でもよい。連続の陽性または陰性反応が現れたラットの５０％ＰＷＴはそれぞれ０．６Ｇと１５Ｇとされるが、陽性反応も陰性反応も現れた場合の５０％ＰＷＴは以下の式で推算される。
50％ g 閾値 = (10 [Xf+kδ])/10,000
ここで、Ｘｆ＝最後の陽性反応を起こしたフィラメントの対数値（フィラメントに示してある）、Ｋ＝陽性／陰性反応の組み合わせの定数（表を参照）、δ＝刺激間の平均差（対数値、ここでは０．２２４）である。
50％ g 閾値 = (10 [Xf+kδ])/10,000
ここで、Ｘｆ＝最後の陽性反応を起こしたフィラメントの対数値（フィラメントに示してある）、Ｋ＝陽性／陰性反応の組み合わせの定数（表を参照）、δ＝刺激間の平均差（対数値、ここでは０．２２４）である。
各実験群のマウスに足底から１００μＬのＣＦＡを注射した後、ＣＦＡ注射後の５日目までに、尾静脈からそれぞれ２Ｂ１１（７５μｇ／ｋｇ・日）またはＰＢＳを１２時間おきに投与した。注射後から術後の５日目まで、異なる時点でＰＷＴの変化を観察した。
図９および相応の下記表３のデータが示すように、ブランクコントロール群では、マウスはＣＦＡの足底注射後、後ろ足の逃避閾値ＰＷＴが基礎値よりも顕著に低下し、注射後の５日目まで続いた。一方、２Ｂ１１群では、マウスはＣＦＡ注射後の２日目でブランクコントロール群に対して顕著に改善し、かつＰＷＴ値が高くなっていき、注射後の５日目に、２Ｂ１１群のＰＷＴがコントロール群よりも顕著に高かった。これは、２Ｂ１１が顕著にＣＦＡによる慢性炎症性疼痛を軽減すること示した（図９）。＊、ｐ＜０．０５、コントロール群と比較する。＊＊、ｐ＜０．０１、コントロール群と比較する。
図９および相応の下記表３のデータが示すように、ブランクコントロール群では、マウスはＣＦＡの足底注射後、後ろ足の逃避閾値ＰＷＴが基礎値よりも顕著に低下し、注射後の５日目まで続いた。一方、２Ｂ１１群では、マウスはＣＦＡ注射後の２日目でブランクコントロール群に対して顕著に改善し、かつＰＷＴ値が高くなっていき、注射後の５日目に、２Ｂ１１群のＰＷＴがコントロール群よりも顕著に高かった。これは、２Ｂ１１が顕著にＣＦＡによる慢性炎症性疼痛を軽減すること示した（図９）。＊、ｐ＜０．０５、コントロール群と比較する。＊＊、ｐ＜０．０１、コントロール群と比較する。
８．３ ２Ｂ１１の静脈注射の切創様痛に対する作用
ラットの後ろ足切創様痛のモデルは、外科で疼痛に最も使用される動物モデルである。ラットの後ろ足を切った後、ラットは切られた側の肢体を上げ、体重を支えることができない一方、足を舐める。そのため、よく疼痛スコアで切った後の痛みの程度を表す。通常、１時間で計算し、５分間おきに、ラットの着地の状況を観察し、後ろ足を上げ続ける場合、２点とし、着地するが体重を支えることができない場合（カゴの網が変形するかを基準とする）、１点とし、完全に着地して体重を支えることができない場合、０点とし、点数が高いほど、疼痛程度が高いことを示す。足切創様痛の評価は、よく累積疼痛スコア（cumulative pain score、ＣＰＳ）がよく使用される。ＣＰＳが高いほど、疼痛強度が強い。一方、切った後、機械痛覚閾値も低下する。そのため、この２つの方法によってｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体（２Ｂ１１）の切創様痛に対する作用を評価した。
ラットの後ろ足切創様痛のモデルは、外科で疼痛に最も使用される動物モデルである。ラットの後ろ足を切った後、ラットは切られた側の肢体を上げ、体重を支えることができない一方、足を舐める。そのため、よく疼痛スコアで切った後の痛みの程度を表す。通常、１時間で計算し、５分間おきに、ラットの着地の状況を観察し、後ろ足を上げ続ける場合、２点とし、着地するが体重を支えることができない場合（カゴの網が変形するかを基準とする）、１点とし、完全に着地して体重を支えることができない場合、０点とし、点数が高いほど、疼痛程度が高いことを示す。足切創様痛の評価は、よく累積疼痛スコア（cumulative pain score、ＣＰＳ）がよく使用される。ＣＰＳが高いほど、疼痛強度が強い。一方、切った後、機械痛覚閾値も低下する。そのため、この２つの方法によってｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体（２Ｂ１１）の切創様痛に対する作用を評価した。
実験の群分けは、実施例８．１と同様である。施術の１５分間前に、尾静脈注射で５００μｇ／ｋｇの２Ｂ１１を投与し、術後の異なる時点でラットの疼痛スコア（図１０および相応の下記表４）および後ろ足の機械痛覚閾値（図１１および相応の下記表５）を観察し、以下のことがわかった。
２Ｂ１１実験群では、マウスの切る手術の１ｈｒ後から測定した疼痛スコアは、ブランクコントロール群よりも顕著に低く、特に切る手術の３ｈｒ後で差が最も顕著で、手術の６時間後も、２Ｂ１１群の疼痛スコアがブランクコントロール群よりも顕著に低かった。
２Ｂ１１実験群では、マウスの切る手術の１ｈｒ後から測定した疼痛スコアは、ブランクコントロール群よりも顕著に低く、特に切る手術の３ｈｒ後で差が最も顕著で、手術の６時間後も、２Ｂ１１群の疼痛スコアがブランクコントロール群よりも顕著に低かった。
８．４ ２Ｂ１１腹腔注射の酢酸腹腔注射によって誘発される内臓痛に対する軽減
マウスは酢酸を腹腔注射された後、主な所見は腹壁収縮、ピンと伸ばすなどのライジング反応で（Writhing Test）、特に注射１時間後は最も顕著で、酢酸を注射した後１時間以内のライジング反応を観察するのは、鎮痛薬のスクリーニングに最も使用されるモデルの一つである。６％醋酸（０．２ｍｌ）を腹腔注射すると、マウスに化学性内臓痛が起こる。
実験の群分けは、実施例８．１と同様である。酢酸注射の３０分間前に、各実験群のマウスにそれぞれ腹腔注射によって本発明のモノクローナル抗体２Ｂ１１（５００ｕｇ／ｋｇ、０．２ｍｌ）または同体積のブランクコントロール（ここはＰＢＳ）を投与した。
図１２および相応の下記表６のデータが示すように、２Ｂ１１実験群のマウスはブランクコントロール群よりも現れたライジング反応が顕著に減少し、これは本発明のモノクローナル抗体２Ｂ１１で前処理すると酢酸腹腔注射によって誘発される内臓痛を軽減できることを示す。
マウスは酢酸を腹腔注射された後、主な所見は腹壁収縮、ピンと伸ばすなどのライジング反応で（Writhing Test）、特に注射１時間後は最も顕著で、酢酸を注射した後１時間以内のライジング反応を観察するのは、鎮痛薬のスクリーニングに最も使用されるモデルの一つである。６％醋酸（０．２ｍｌ）を腹腔注射すると、マウスに化学性内臓痛が起こる。
実験の群分けは、実施例８．１と同様である。酢酸注射の３０分間前に、各実験群のマウスにそれぞれ腹腔注射によって本発明のモノクローナル抗体２Ｂ１１（５００ｕｇ／ｋｇ、０．２ｍｌ）または同体積のブランクコントロール（ここはＰＢＳ）を投与した。
図１２および相応の下記表６のデータが示すように、２Ｂ１１実験群のマウスはブランクコントロール群よりも現れたライジング反応が顕著に減少し、これは本発明のモノクローナル抗体２Ｂ１１で前処理すると酢酸腹腔注射によって誘発される内臓痛を軽減できることを示す。
Claims (17)
- 特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦタンパク質前駆体ドメインの１９〜１２８番目のアミノ酸を認識する抗体ポリペプチドであって、
１）以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１で表されるＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号２で表されるＣＤＲ２領域、
（ｃ）配列番号３で表されるＣＤＲ３領域
を含有する重鎖の可変領域、および／または
２）以下のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号４で表されるＣＤＲ１領域、
（ｅ）配列番号５で表されるＣＤＲ２領域、
（ｆ）配列番号６で表されるＣＤＲ３領域
を含有する軽鎖の可変領域
を含む、前記抗体ポリペプチド。 - モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。
- 重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号７である、請求項１または２に記載の抗体ポリペプチド。
- 軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号８である、請求項３に記載の抗体ポリペプチド。
- 重鎖のアミノ酸配列が配列番号９である、請求項１または２に記載の抗体ポリペプチド。
- 軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０である、請求項５に記載の抗体ポリペプチド。
- ヒト化の抗体ポリペプチド、キメラの抗体ポリペプチド、親和性成熟の抗体ポリペプチド、またはその一種または複数種の組み合わせから選ばれる、請求項２に記載の抗体ポリペプチド。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチドと競合する、抗体ポリペプチド。
- 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチドをコードする、核酸配列。
- 抗体ポリペプチドの重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１１で表され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１２で表される、請求項９に記載の核酸配列。
- 抗体ポリペプチドの重鎖のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１３で表され、軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸が配列番号１４で表される、請求項１０に記載の核酸配列。
- 請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 請求項１２に記載のベクターを含む、宿主。
- 特異的にｐｒｏ−ＢＤＮＦ前駆体ドメインを認識する一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用であって、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる慢性疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における、前記使用。
- 術後疼痛、急性炎症性疼痛、慢性炎症性疼痛、幻肢痛、糖尿病性疼痛、神経病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内臓痛、癌性痛、関節炎性疼痛、頭蓋顔面痛、三叉神経痛、片頭痛、複合性局所疼痛症候群、およびその組み合わせから選ばれる疼痛を緩和および／または抑制する薬物の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の一種または複数種の抗体ポリペプチドの使用。
- 有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチドを含む、薬物組成物。
- 静脈または腹腔注射の形態によって投与される、請求項１６に記載の薬物組成物。
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