抗人proBDNF单克隆抗体及其在疼痛的作用
技术领域
本发明涉及抗人脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)单克隆抗体的制备领域,以及所述单克隆抗体在减缓和/或抑制各类急性、慢性疼痛,比如手术后疼痛,急性炎性疼痛,慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域综合症等中的作用。
背景技术
疼痛是继体温、呼吸、心率,血压之后第五大生命体征,其可作为机体受到伤害的一种警告引起机体一系列防御性保护反应。但过度的疼痛会对机体本身造成损害,并成为机体一种难以忍受的折磨。因此,镇痛(analgesia)是医务工作者面临的重要任务。慢性疼痛一直威胁着人类的生存和生活质量,同时也对家庭和社会造成很大的负担。据美国疼痛协会报道,美国慢性疼痛的患病率估计为35.5%,达1.05亿人。每年花费超1000亿美元,直接导致了医疗保健支出消耗和工作时间的损失。
目前最常用的镇痛药包括对乙酰氨基酚、非甾体消炎镇痛药和阿片样受体激动剂如曲马多和吗啡等。非甾体抗炎药(NSAIDs)镇痛效能较弱,且有可能导致胃肠道出血、肾衰及肝功能损害等副作用;而阿片类药物剂量过大可呼吸抑制,而长期使用则导致便秘、滥用、依赖及成瘾等副作用。近些年来,也有另外一些镇痛药也进入了市场,如抗抑郁药(如礼来公司的度洛西汀)、抗惊厥药(如辉瑞公司的产品普瑞加林,商品名乐瑞卡)和选择性环氧合酶2(COX-2)(如辉瑞公司的帕瑞昔布)抑制剂等。
一种新的镇痛药物开发的模式是机制介导的药物新靶点开发,这主要通过对疼痛的机制探讨,寻找调控疼痛发生和发展的重要因子或靶点,从而开发对其干预达到镇痛作用的新药物。这种基于基础研究成果转化的临床应用目前正在被大量试验,然而成功例子少之又少。
其中,一个典型的例子是抗神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)抗体的开发。NGF是神经营养因子家族成员,在发育中对神经元的生存及凋亡起着重要的作用。大量的基础研究显示NGF可促进疼痛进程,因此阻断NGF可能是治疗疼痛重要的方法。因此对NGF抗体的研发非常多,其中包括了Tanezumab(辉瑞)、SAR164877/REGN475(赛诺菲/Regeneron)和NJ-42160443/AMG403(强生公司/安进公司)。虽然,这些药物在动物模型上显示出镇痛效果,临床I/II期也显示出有临床安全性及镇痛效果,然而在临床III期试验中,NGF抗体联合NSAID
药物对类风湿性关节炎及强直性脊柱炎等病人镇痛作用的临床疗效和安全性评价中,少数病人出现无痛性缺血性股骨头坏死(Garber K Fate of novel painkiller mAbs hangs in balance.Nat Biotechnol 2011,173-174;Seidel M,Lane N,Control of Arthritis Pain with Anti-Nerve-Growth Factor,Risk and Benefit,Curr Rheumatol Rep,2012,583-585)。
因此,对新作用机制镇痛剂的开发仍然存在着巨大的市场需求。
脑源性神经营养因子BDNF(brain derived neurotrophic factor)是继神经生长因子之后被发现的神经营养因子,分子量为12.4kDa,主要分布于中枢神经系统中,但在周围神经系统也有BDNF的合成,在调节神经元存活、分化、突触可塑性以及损伤修复等方面具有重要功能。目前有证据显示BDNF不仅是调控神经系统发育和情感障碍的重要因子,同时也是重要的痛觉调质。
脑源性神经营养因子的前体proBDNF(precursor for brain-derived neurotrophic factor)是由BDNF基因经过转录、翻译后在内质网内合成的其肽链长度为247个氨基酸,氨基酸序列理论分子量为27.8KD,但是由于蛋白糖基化修饰程度不同,分子量可以在32-36kD的范围内。ProBDNF的分子氨基酸序列第1-18位点是信号肽序列,在分泌的过程中产生2个片段,其中一个片段是包含序列第19-129位氨基酸即前体结构域的多肽片段,称为前体结构域(proBDNF pro-domain),另一个片段则是氨基酸序列第130-247即成熟结构域所编码的片段,经加工后形成有生物活性的成体BDNF。
目前大量证据显示proBDNF不仅作为成熟BDNF合成的中间产物,也可作为配体与其高亲和力受体p75神经营养因子受体(P75neurotrophin receptor,p75NTR)结合发挥生物学功效。目前proBDNF-p75NTR信号通路在疼痛中的作用尚不清楚,然而有观点认为疼痛的脊髓敏感化机制与海马的长时程增强(Long-term potentiation,LTP)/长时程抑制(long-term depression,LTD)形成机制相似而BDNF-TrkB及proBDNF-p75NTR信号通路则是调控LTP/LTD的重要信号分子。
中南大学张艳玲2012年实验研究表示:大鼠后足切割后,其背根神经节proBDNF表达上调;大鼠后足注射proBDNF腺病毒载体后,该腺病毒载体在神经纤维上大量表达proBDNF,过表达的proBDNF导致大鼠后足机械刺激缩足阈值明显降低和足底组织的炎症反应;利用腹腔给予抗proBDNF多克隆抗体后增加大鼠后足切割后的缩足阈值。
切割痛属于急性疼痛。急性和慢性疼痛均可以出现外周敏感化和中枢敏感化,两者之间区别在于外周敏感化中局部组织神经纤维或轴突释放的递质及细胞内信号通路不同,同时在背根神经节相关的痛觉递质以及信号传导通路也有所不同,后者持续的时间也更长;另外,中
枢敏感化中,脊髓胶质细胞的持续激活时可能也是急慢性疼痛机制两者之间最重要的区别之一。
发明内容
本发明一方面涉及特异性识别pro-BDNF蛋白前体结构域第19位至第128位氨基酸的抗体多肽,其包括包含如下氨基酸序列的重链可变区:(a)如SEQ ID NO:1所示的CDR1区域,如SEQ ID NO:2所示的CDR2区域,(c)如SEQ ID NO:3所示的CDR3区域,和/或包含如下氨基酸序列的轻链可变区:(d)如SEQ ID NO:4所示的CDR1区域,(e)如SEQ ID NO:5所示的CDR2区域,(f)如SEQ ID NO:6所示的CDR3区域。
在一个具体实施方案中,所述抗体多肽为单克隆抗体。在更具体的实施方案中,所述抗体多肽为重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8。在另一具体的实施方案中,所述抗体多肽具有重链氨基酸序列为SEQ ID NO:9,轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:10。在另一个具体实施方案中,所述的抗体多肽可以选自人源化的抗体多肽,嵌合的抗体多肽,亲和力成熟的抗体多肽,或其一种或多种的组合。在另一个具体实施方案中,所述的抗体多肽为与上述抗体多肽竞争的抗体多肽。
本发明另一方面涉及编码上述抗体多肽的核酸序列。在一个具体的实施方案中,其中编码所述抗体多肽的重链可变区氨基酸序列的核酸为SEQ ID NO:11所示,其中编码轻链可变区氨基酸序列的核酸为SEQ ID NO:12所示。在另一个具体实施方案中,其中编码所述抗体多肽的重链氨基酸序列的核酸为SEQ ID NO:13所示,其中编码轻链氨基酸序列的核酸为SEQ ID NO:14所示。
本发明另一方面涉及包含所述核酸序列的载体。
本发明另一方面涉及包含所述载体的宿主。
本发明另一方面涉及特异性识别pro-BDNF前体结构域的一种或多种抗体多肽在制备减缓和/或抑制选自如下慢性疼痛的药物中的应用:慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域综合症,及其组合。
本发明另一方面涉及所述抗体多肽在制备减缓和/或抑制选自如下疼痛的药物中的应用:手术后疼痛,急性炎性疼痛,慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域综合症,及其组合。
本发明另一方面涉及包含有效量的所述抗体多肽的药物组合物。在一个具体实施方案中,所述药物组合物通过静脉或腹腔注射方式给药。
本发明的抗体多肽和相应的药物组合物,能够特异性识别proBDNF的前体结构域(pro-domain),表现出不仅抑制和/或预防各类急性,还可以抑制和/或预防慢性疼痛,比如手术后疼痛,急性炎性疼痛,慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域综合症,获得了现有技术不曾达到的技术效果,具有广泛和良好的临床应用前景。
附图说明
图1显示本发明实施例1中宿主菌BL21(DE3)表达的人proBDNF蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果。1,纯化的人proBDNF蛋白;2,低分子量蛋白标记(Protein Molecular Weight Marker(Low),购自TAKARA,货号:3450)
图2显示本发明实施例2中HEK293F细胞表达的人proBDNF前体结构域蛋白纯化后的SDA-PAGE电泳结果。1,纯化的人前体结构域蛋白;2,低分子量蛋白标记低分子量蛋白标记(Protein Molecular Weight Marker(Low),购自TAKARA,货号:3450)
图3显示本发明实施例3中HEK293F细胞表达的大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白纯化后的SDA-PAGE电泳结果。1,纯化的大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白;2,低分子量蛋白标记低分子量蛋白标记(Protein Molecular Weight Marker(Low),购自TAKARA,货号:3450)
图4显示本发明实施例3中各杂交瘤细胞株产生的抗proBDNF单克隆抗体与人proBDNF和人proBDNF前体结构域的特异性抗原结合区域实验结果
图5显示本发明实施例4中的抗proBDNF单克隆抗体抗体2B11与人proBDNF前体结构域、大鼠proBDNF前体结构域和小鼠proBDNF的特异性抗原实验结果
图6显示本发明实施例3的抗proBDNF单克隆抗体2B11的亚型分析结果
图7显示本发明实施例6的人鼠嵌合抗体CH2B11与本发明实施例1的人proBDNF蛋白的在不同稀释条件下的结合活性实验结果。
图8显示尾静脉注射2B11相对于空白对照对由福尔马林引起的SD大鼠舔足时间所代表的双相性疼痛的作用
图9显示尾静脉注射2B11相对于空白对照对由CFA足底注射诱发的慢性持续性炎性痛的作用
图10显示尾静脉注射2B11相对于空白对照对大鼠后足切割痛的疼痛评分的影响
图11显示尾静脉注射2B11相对于空白对照对大鼠后足切割痛的机械痛域的影响
图12显示腹腔注射2B11相对于空白对照对醋酸诱发的小鼠扭体反应的作用
具体实施方式
本发明的抗proBDNF抗体多肽,能够特异性识别proBDNF的前体结构域(pro-domain)第19位至第128位氨基酸,其包括包含如下氨基酸序列的重链可变区(a)如SEQ ID NO:1所示的CDR1区域,(b)如SEQ ID NO:2所示的CDR2区域,(c)如SEQ ID NO:3所示的CDR3区域,和/或包含如下氨基酸序列的轻链可变区:(d)如SEQ ID NO:4所示的CDR1区域,(e)如SEQ ID NO:5所示的CDR2区域,(f)如SEQ ID NO:6所示的CDR3区域。在各项疼痛评价实验中,该抗体处理的小鼠与空白对照组小鼠相比表现出显著的疼痛抑制和预防效果。本发明的抗体多肽不仅抑制和/或预防各类急性,还可以抑制和/或预防慢性疼痛,比如手术后疼痛,急性炎性疼痛,慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域综合症等。
本发明所述的“抗体多肽”指的是能够通过免疫球蛋白可变区内的至少一个抗原识别位点特异性识别靶位点,例如多糖,多核苷酸,脂类,多肽等的免疫球蛋白分子。此处所用的术语抗体多肽包括完整的多克隆抗体和单克隆抗体,还包括其片段,例如单链抗体(scFV),Fd片段,Fab片段,F(ab’)2片段,单结构域抗体片段,分离的CDR片段,及其衍生物例如其突变体,或包含至少一个抗原结合位点的修饰的免疫球蛋白分子结构。
完整抗体指由两个同样的重链和轻链组成,各条链分别包含一个可变区(V区)和一个或多个恒定区(C区)。可变区负责与抗原结合,而恒定区主要负责结合效应分子。在各可变区有三个具有高度多样性的柔性的环,称作互补决定区(CDR),其主要负责识别抗原。可变区的其他部分包含刚性的β片层并支持所谓的框架区(FRs)。CDR和FR间隔排列形成三明治结构。
“单链抗体(scFV)片段”指的是通过基因工程构建的抗体片段,其是有通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白,接头使得这两个结构域相关联以形成抗原结合位点。ScFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。
“Fd片段”指的是由重链VH和CH1组成抗体片段。
“Fab片段”指的是由Fd片段(由重链VH和CH1组成)和整条轻链通过链间二硫键形成的异二聚物。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3,其只包含一个抗原结合位点。
“F(ab’)2片段“指的是包含两个相连的Fab片段的二价片段。
“单结构域抗体”由重链可变区或轻链可变区组成。由于该抗体片段只由一个结构域组成,所以得名。该片段的大小是一个完整抗体的1/12。
“衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时,可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与EGFR或CD3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier,人抗体杂交瘤7(1996),97-105;Malmborg,免疫学方法杂志183(1995),7-13)。还包括,例如WO 89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法,EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法,WO91/10741,WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法。
本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术,例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的。
本发明使用的抗体或抗体片段可以是人源化的,嵌合的或鼠源的。此处所用的“人源化抗体”指的是具有对应于人所产生抗体的氨基酸序列的抗体,和/或通过本领域已知的和本申请公开的制备人源化抗体的技术制备的抗体。人源化抗体主要指鼠源(或其它非人源的)单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造,重新表达的抗体,其大部分氨基酸序列为人源序列取代,基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性,又降低了其异源性,有利应用于人体。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体(也称CDR植入抗体CDR grafting antibody)、表面重塑抗体或全人源化抗体。人源化抗体还可以使用本领域已知的各种方法产生,例如人源化抗体选自一个噬菌体文库,其中该噬菌体文库表达人抗体。人源化抗体还可以通过在转基因动物中引入人免疫球蛋白位点而制备,所述的转基因动物例如,内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全灭活的小鼠。此外,人源化抗体还可以通过使得产生针对特定抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化而制备。
“嵌合抗体”指的一个抗体中重链和轻链的一部分氨基酸序列与来自一个特定种类的抗体的对应的序列同源,但该链的其他部分与另一个特定种类的对应序列同源。典型的是,在这些嵌合抗体中,重链和轻链的可变区都类似于一个哺乳动物种类的可变区,而其恒定区域来自另一哺乳动物种类的序列同源。嵌合抗体的优势是,这些可变区可以方便地从现有已知的来源使用现有可获得的非人源宿主的淋巴瘤细胞或B细胞与来自例如人细胞制备物得到的恒定区组合而制备。该嵌合抗体的特异性不受其来源的影响,由于其恒定区为人源的,因此不太可能引起人受体的免疫反应。当然,嵌合抗体的定义不限于此处具体所述例子的限定。
改型抗体也称CDR植入抗体(CDR grafting antibody),抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域,直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区,替代人源抗体CDR,使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性,同时减少其异源性。然而,抗原虽然主要和抗体的CDR接触,但FR区也常参与作用,影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后,这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区,可能改变了单抗原有的CDR构型,结合抗原的能力会下降甚至明显下降。已能对抗体进行分子设计,在人源FR区引入鼠源FR区的某些关键残基,如配置得当,其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当。
表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体差别明显的区域,在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换;另外,所替换的区段不应过多,对于影响侧链大小、电荷、疏水性,或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区(CDR)构象的残基尽量不替换。
全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术,将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中,使动物表达人类抗体,达到抗体全人源化的目的。
本文中所用的术语“竞争”指的是抗体多肽在体外实验中表现出免疫学竞争性,免疫竞争的测定方法及其条件是本领域内公知的。与本发明的抗体多肽竞争的抗体多肽可以包括,例如通过对抗体多肽的重链和/或轻链可变区的CDR区域(CDR1,CDR2,CDR3)的一个或多个氨基酸或者抗体多肽的框架区的一个或多个氨基酸进行本领域内公知的基因工程方法进行保守性替换,而得到的具有相似和/或相同的抗原结合性质的抗体多肽。
在本发明的另一方面,涉及包含有编码上述多肽的核苷酸序列的载体。所述载体可以是真核细胞载体或原核细胞载体,只要所述载体满足:(a)其编码序列包含复制起始的序列,使得该载体能够在宿主细胞中得以复制,(b)其包含有编码筛选标记的基因序列,该基因编码的蛋白是该宿主细胞在特定的选择培养基中生存和生长所必需的。在宿主细胞如果没有被转染或转化包含该基因的载体的情况下,宿主细胞不能在特定选择培养基中生存。典型的筛选标记基因编码的蛋白包括具有对抗生素或毒素具有耐受性的蛋白,抗生素或毒素包括例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等;补偿营养缺陷的相关蛋白,供应培养基中不存在的关键营养成分,例如编码D-丙氨酸消旋酶基因。采用抗性筛选的例子包括,通过转染包含新霉素抗性基因的外源载体,使宿主细胞获得在含有药物新霉素或G418的培养基的情况下,继续生存生长。另外一个例子是在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选标记,哺乳动物细胞宿主细胞是指DHFR缺陷型的细
胞,不含二氢叶酸还原酶基因,不能合成核酸,必须在含有HT的培养基里生长。在利用载体转染宿主细胞时,可以通过上述培养基条件的选择筛选得到同时包含目的基因和DHFR基因的外源载体的阳性克隆,(c)其编码序列包含启动子的序列,(d)表达载体还可能包括其它组成序列,包括信号肽序列、转录终止序列、增强子序列等,优选地,本发明的载体为真核细胞载体。优选地,本发明的载体为来自用于抗体真核表达的的pH载体,其包含了CMV的启动子、内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES)、DHFR筛选标记等元件。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的抑制剂,可阻碍其作用。当细胞培养基内含有MTX时,DHFR被抑制,通过反馈调节,使得该基因自我扩增,连带其上下游基因都会扩增,如此目的基因也得到扩增,即可提高目的蛋白的表达量。
在本发明的另一方面,涉及包含有所述载体的宿主细胞,用于表达所需的多功能抗体多肽。“宿主细胞”包括单个的细胞或细胞培养物,其能够并且已经接受包含插入的多核苷酸的载体。
与使用的载体相适应,本发明的宿主细胞可以是任意的原核宿主细胞或真核宿主细胞。真核宿主细胞,包括酵母、昆虫细胞、植物细胞,哺乳动物细胞等可以是优选的,因为真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化),越来越多的被用于规模化的培养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞(COS-7ATCC CRL 1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克隆细胞系,幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10),中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。优选地,本发明的真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
本发明还包括特异性识别pro-BDNF前体结构域的一种或多种抗体多肽在制备减缓和/或抑制选自如下慢性疼痛的药物中的应用:慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域疼痛综合症,及其组合。
本发明还包括特异性识别pro-BDNF前体结构域的第19-128位氨基酸的一种或多种抗体多肽在制备减缓和/或抑制选自如下急慢性疼痛的药物中的应用:手术后疼痛,急性炎性疼痛,慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、三叉神经痛、偏头痛,复杂区域疼痛综合症,及其组合。
本发明还包括包含所述抗体多肽的药物组合物。该组合物还可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以通过常规途径给药,其中包括但不限于静脉内,腹腔内注射等。本发明的药物组合物还可以与其他的疼痛抑制/预防剂合并使用。
本发明所述的药物、化合物或药物组合适用的“有效量”是指足以产生有益的和所需的结
果的量,所述结果包括减轻或减少痛感的临床结果。有效量可以通过一次或多次给药来进行。为本发明的目的,有效量是指足够治疗,减轻,减少,抑制疼痛的强度和/或预防疼痛的量。如同在临床条件下所理解的,有效量的药物可以连同或不连同另外一种药物可获得。因此,“有效量”可以被认为在给药一种或多种药剂的条件下进行,如果在与一种或多种其他药剂一同给药时可以获得或已经获得了所需的结果,则该单一种药剂可以认为是被有效量给药了。具体的剂量应当考虑给药途径,病人状况等因素来决定,这些是熟练医师的技能范围之内的。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不能用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件实施。
实施例1:人proBDNF抗原的原核表达
1.1pET22b-proBDNF载体构建及鉴定
以人肿瘤细胞U87MG的cDNA为模板(购自RAYGENE公司),以如下引物进行PC扩增,
PROBDNF-F:5’GCGAATTCCCCATGAAAGAAGCAAACATCC 3’(SEQ ID No:15)
PROBDNF-R:5’CCGCTCGAGTTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAATG 3’(SEQ ID No:16)
获得两端带有酶切位点ECORI/XhoI的PRO BDNF基因片段(703bp),用ECORI/XhoI双酶切(购自NEB公司),得到目的基因片段proBDNF。将载体质粒pET22b(购自Novogen公司。)用ECORI/XhoI双酶切,琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段,与前述目的基因片段proBDNF在T4连接酶(购自NEB公司)作用下连接,然后转化大肠杆菌TOP10(购自LIFE公司),经氨苄抗性进行筛选,经ECORI/XhoI酶切鉴定含插入片断的阳性克隆,并通过测序验证,得到含有正确的人proBDNF基因序列的原核表达质粒pET22b-proBDNF。
1.2人proBDNF蛋白的表达与纯化
将pET22b-proBDNF质粒转化于表达宿主菌BL21(DE3)(购自Novagen公司),并平铺于氨苄青霉素抗性的平皿上37℃倒置培养过夜,挑取单克隆进行诱导表达,挑取单克隆后振荡培养至OD600为0.6-0.8,加入终浓度为1mM IPTG,30℃诱导4h后收集菌液。通过离心收集沉淀,加入1/10体积的缓冲液A(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,10mM咪唑,pH 8.0)重悬,加入PMSF(终浓度为1mM)置冰上超声(超声3秒,间隔10秒,一轮99次,共4轮),离心(4℃,12000g)15min,离心收集上清,通过Ni-NTA Agarose(购自QIAGEN公司)亲和柱层
析,纯化得到目的表达蛋白,然后对PBS溶液进行透析,再通过12%SDS-PAGE分析透析后的纯化蛋白的纯度,A280检测其含量,并取少量进行SDS PAGE电泳检测其分子量。如图1所示的SDS-PAGE结果显示第一栏中纯化得到的目的条带分子量在30kD附近,该分子量与proBDNF分子的理论分子量27.8kD基本符合。
实施例2:人proBDNF前体结构域(人proBDNF pro-domain)的真核表达
2.1人proBDNF前体结构域表达载体V5F-pro-domain的构建
以上述得到的质粒pET22b-proBDNF为模板,以下列引物进行PCR扩增,
BDNFproVF1 5’GCTGGCTAGCACCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAG 3’(SEQ ID NO:17)
BDNFproVR1 5’CCGCTCGAGGTGGCGCCGGACCCTCATG 3’(SEQ ID NO:18)
获得两端带有酶切位点NheI/XhoI的人proBDNF前体结构域基因片段(350bp)。将该PCR片段用限制性内切酶NheI/XhoI(购自NEB公司)进行双酶切,获得的前体结构域基因片段和经同样NheI/XhoI(购自NEB公司)双酶切的载体V5F(购自RAYGENE公司)通过T4DNA连接酶连接后,转化于宿主菌TOP10(购自LIFE公司)中,挑取阳性克隆进行PCR鉴定,并通过测序验证正确,成功构建V5F-pro-domain质粒。
2.2人proBDNF前体结构域蛋白的表达与纯化
将生长良好的HEK293F细胞(HEK293F,购自LIFE公司)以1×106细胞/毫升的密度接种于细胞三角培养瓶,37℃,5%CO2120rpm培养过夜备用;将上述步骤获得的V5F-pro-domain质粒与脂质体(293Fectin,购自LIFE公司)分别用DMEM稀释并温和混合,室温孵育20min,将孵育好的DNA-脂质体复合物加至HEK293F细胞中,37℃5%CO2120rpm培养72h。收集细胞培养液,4500g离心15min,除去细胞取上清。取1ml的FLAG抗体亲和填料(ANTI-FLAG Agarose Affinity Gel,购自Sigma-Aldrich公司)装柱,将FLAG亲和柱用裂解缓冲液(50mM PB,0.3M NaCl,5%甘油)平衡5-10个柱体积。将离心后的细胞培养液上清以1ml/min通过FLAG亲和柱收集流穿液4℃保存。用清洗缓冲液1(50mM PB,pH7.8,0.3M NaCl,5%甘油)洗5-10个柱体积,收集洗杂液1,于4℃保存。用清洗缓冲液2(50mM PB,pH7.8,0.5M NaCl,5%甘油)洗4-5个柱体积,收集洗杂液2,于4℃保存。用洗脱缓冲液(50mM Glycine.HCl,pH3.0,0.3M NaCl,5%甘油)洗4-5个柱体积,收集洗脱液加入中和缓冲液(1M Tris.HCl pH8.0),在透析液(50mM PB,pH7.8,0.3M NaCl,5%甘油)中4℃透析过夜,保存,并取少量进行SDS PAGE电泳。如图2所示的电泳结果显示第一栏的目的条带的分子量在20kD左右,略大于人proBDNF前体结构域蛋白的理论分子量13kD相当。不限于
理论所表示的,这可能与表达的目的蛋白在真核系统中的糖基化程度有关。
实施例3:大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白(大鼠proBDNF pro-domain-Fc)的真核表达
3.1大鼠proBDNF前体结构域融合表达载体V5FC-rat-pro-domai-Fc的构建
以大鼠cDNA(购自RAYGENE公司)为模板,以下列引物进行PCR扩增,
RatproF1 5’GCTGGCTAGCGCGCCCATGAAAGAAGCAAAC 3’(SEQ ID NO:19)
RatproR1 5’CCGCTCGAG GCGCCGAACCCTCATAGACATG 3’(SEQ ID NO:20)
获得两端带有酶切位点NheI/BamHI的大鼠proBDNF前体结构域基因片段(356bp)。将该PCR片段用限制性内切酶NheI/BamHI(购自NEB公司)进行双酶切,获得的前体结构域基因片段和经同样NheI/BamHI(购自NEB公司)双酶切的Fc融合表达载体V5FC(购自RAYGENE公司)通过T4DNA连接酶连接后,转化于宿主菌TOP10(购自LIFE公司)中,挑取阳性克隆进行PCR鉴定,并通过测序验证正确,成功构建V5FC-rat-pro-domain质粒。
3.2大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白的表达与纯化
将生长良好的HEK293F细胞(HEK293F,购自LIFE公司)以1×106细胞/毫升的密度接种于细胞三角培养瓶,37℃,5%CO2120rpm培养过夜备用;将上述步骤获得的V5FC-rat-pro-domain质粒与脂质体(293Fectin,购自LIFE公司)分别用DMEM稀释并温和混合,室温孵育20min,将孵育好的DNA-脂质体复合物加至HEK293F细胞中,37℃5%CO2120rpm培养72h。收集细胞培养液,4500g离心15min,除去细胞取上清。取1ml的proteinA亲和填料(proteinA Agarose,购自RAYGENE公司)装柱,将proteinA亲和柱用裂解缓冲液(50mM PB,0.3M NaCl,5%甘油)平衡5-10个柱体积。将离心后的细胞培养液上清以1ml/min通过proteinA亲和柱收集流穿液4℃保存。用PBS(20mM PB,pH7.8,0.15M NaCl)洗5-10个柱体积,收集洗杂液1,于4℃保存。用洗脱缓冲液(100mM Glycine.HCl,pH2.5,)洗4-5个柱体积,收集洗脱液加入10%体积中和缓冲液(1M Tris.HCl pH8.0),在透析液(50mM PB,pH7.8,0.3M NaCl,5%甘油)中4℃透析过夜,保存,并取少量进行SDS PAGE电泳。如图3所示的电泳结果显示第一栏的目的条带的分子量在44.3kD左右,与大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白(大鼠proBDNF pro-domain-Fc)的理论分子量相当。
实施例4抗人proBDNF前体结构域单克隆抗体的制备和鉴定
4.1重组蛋白免疫
将上述实施例1中得到的纯化人1ml proBDNF蛋白(1.0mg/mL)作为抗原与1mL完全弗氏佐剂(购自Sigma-Aldrich公司)充分乳化混合皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠,每只小鼠
免疫100μg人proBDNF抗原。4周后人proBDNF抗原与不完全弗氏佐剂乳化混合,腹腔注射免疫小鼠,50μg每只小鼠,其后间隔2周,继续腹腔50μg抗原加强免疫。在第4次加强免疫1周后,以上述实施例2中获得的纯化人proBDNF前体结构域蛋白进行包被,通过ELISA法检测小鼠抗血清效价,继续加强免疫,直至小鼠的抗血清效价达到>105。最后一次加强免疫3周后,脾内免疫上述人proBDNF前体结构域蛋白20μg,备用。
4.2人proBDNF杂交瘤细胞株建立
小鼠经脾内加强免疫后4天,在无菌情况下取脾,用100目滤网滤过分离淋巴细胞,与骨髓瘤细胞系SP2/0融合,经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷(hypoxathine,aminop terin and thymidine,HAT)选择性培养3天后,补加HT培养基,继续培养1周。以本发明上述实施例的人proBDNF抗原包被,ELISA筛选阳性克隆,以有限稀释法进行3次亚克隆,继续连续培养2个月,最后获得稳定杂交瘤细胞系(各克隆分别命名为:2B11,2C7,5C10,4C3,6F3,2F3,8E1,1G7)。
4.3抗体的纯化
分别取上述杂交瘤细胞克隆,以5×105细胞/小鼠的量分别注射各组对应的小鼠腹腔以制备腹水,取腹水100ml用2倍体积的0.06M pH 4.0的乙酸钠缓冲液稀释,缓慢滴入4%辛酸,边滴边搅拌。搅拌30min然后将混浊液于10000g下离心30min。弃去沉淀,上清液0.01M,pH 7.4的磷酸缓冲液透析过夜。取出透析液,缓慢加入等体积的饱和硫铵,静置2小时。将混浊液于10000g离心10min。弃上清液,用0.01M,pH7.4的PBS溶解。将溶解后的溶液用0.01M,pH7.4的PBS透析,其间换液两次,两次换液时间的间隔不得少于5小时。将透析溶液于10000g离心10min,弃去沉淀,收集上清液。
取蛋白G亲和柱(购自GE公司。)回复室温,用PBS(0.01M PB,0.15M NaCl,pH 7.4)平衡5个柱体积。将前段所述收集的上清液上柱,用PBS洗5个柱体积。以pH2.3,0.1M甘氨酸盐酸溶液洗脱,洗脱液加入1/10体积1M磷酸氢二钠溶液pH9.0中和。将溶液用0.01M,pH7.4的PBS透析,其间换液两次,两次换液时间间隔大于5小时。将透析溶液于10000g离心10min,上清液通过0.22um滤膜过滤保存,得到纯化的对应各克隆产生的单克隆抗体。
4.4ELISA法鉴定单克隆抗体结合区域
实验组1:用PBS(0.01M PB,0.15M NaCl,pH 7.4)对实施例1中获得的纯化的人proBDNF蛋白进行稀释。每组包含8个孔,分别用于随后加入对应的8个纯化的单克隆抗体。
实验组2:用PBS(0.01M PB,0.15M NaCl,pH 7.4)对实施例2中获得的纯化的人proBDNF前体结构域蛋白进行稀释。每组包含8个孔,分别用于随后加入对应的8个纯化的单克隆抗体。
实验组1和2稀释的蛋白分别以50ul(50ng)的体积和质量在4℃进行包被过夜。然后弃去上清,各孔用PBS洗2次,用含5%奶粉的PBS在37℃封闭2小时。然后实验组1和28个孔分别加入前述实施例3.3中获得的8个纯化的单克隆抗体50ul(1ug/ml),37℃结合1小时。用含0.5%Tween-20的PBST洗涤3次后,加入HRP标记的羊抗鼠二抗50ul,37℃结合1小时。用含0.5%Tween-20的PBST洗涤5次后,加入ABTS底物显色15分钟,酶标仪测定405nm吸光度值。实验重复2次,取两次测量吸光度值的平均值。以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。
如图4所示,纯化的单克隆抗体2B11与人proBDNF和人proBDNF前体结构域均结合,显示该抗体2B11结合于两蛋白的共有区段,即人proBDNF的前体结构域区域。
4.5单克隆抗体2B11的辣根过氧化物酶标记
将10mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml水中,加入1ml 0.5M NaIO4,在4℃反应30min。加1ml 0.16M乙二醇。4℃反应30min。将10mg 2B11抗体透析至0.05M PH 9.5碳酸缓冲液,将氧化的HRP与2B11抗体混匀,4℃透析过夜加入0.4ml 1mg/ml NaBH4,4℃搅拌2h,用低浓度的NaH2PO4溶液调PH至弱酸性,加入等体积甘油备用。
4.6ELISA法测定抗体2B11结合proBDNF的种属特异性
实验组1:用PBS(0.01M PB,0.15M NaCl,pH 7.4)对实施例1中获得纯化的人proBDNF蛋白进行稀释。
实验组2:用PBS(0.01M PB,0.15M NaCl,pH 7.4)对原核表达的小鼠proBDNF(购自Alomone labs公司)进行稀释。
实验组3:用PBS(0.01M PB,0.15M NaCl,pH 7.4)对实施例3中真核表达的大鼠proBDNF前体结构域进行稀释。
实验组1、2和3稀释的蛋白分别以50ul(50ng)的体积和质量在4℃进行包被过夜。然后弃去上清,各孔用PBS洗2次,然后用含5%奶粉的PBS在37℃封闭2小时。弃去上清,加入稀释的实施例4.5中辣根过氧化物酶标记的2B11抗体1ug/ml 50ul,37℃结合1小时。弃去上清,各孔用含0.5%Tween-20的PBST洗涤3次后,加入ABTS底物显色15分钟,酶标仪测定405nm吸光度值。以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。
如图5所示,克隆2B11与本发明中实施例1制备得到的人proBDNF蛋白和商购的鼠proBDNF蛋白以及实施例3中真核表达的大鼠proBDNF前体结构域均结合。
4.7ELISA法测定克隆2B11的抗体亚型
根据分型抗体的数目建立加入6个实验组,各实验组每孔加入稀释的原核表达的人proBDNF(50ng)蛋白,体积50ul,4℃包被过夜。弃去上清,各孔用PBS(0.01M PB,0.15M
NaCl,pH 7.4)洗2次,用含5%奶粉的PBS在37℃封闭2小时。弃去上清,每孔加入稀释的上述纯化的2B11克隆的抗体1ug/ml 50ul,37℃结合1小时。然后弃去上清,各孔用含0.5%Tween-20的PBST洗涤3次后,对实验组1-6分别加入相应的6种分型抗体(购自Sigma-Aldrich公司):羊抗鼠IgG1、羊抗鼠IgG2a、羊抗鼠IgG2b、羊抗鼠IgG3、羊抗鼠IgA及羊抗鼠IgM,37℃结合1小时。弃去上清,各孔然后用含0.5%Tween-20的PBST洗涤3次后,加入HRP标记的驴抗羊二抗50ul,37℃结合1小时。弃去上清,各孔用含0.5%Tween-20的PBST洗涤5次后,加入ABTS底物显色15分钟,酶标仪测定405nm吸光度值。以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。如图6所示,克隆2B11经鉴定为IgG1型。
实施例5单克隆抗体2B11的序列测定
用5’-RACE法克隆2B11的序列并测序确定(具体操作请参考Takara 5’-full RACE Kit说明书):用碱性磷酸酶(CIAP)对总RNA中暴露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。总RNA用量为2ug,反应后酚氯仿抽提回收。用烟草酸焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase,TAP)去掉mRNA的5’帽子结构,保留一个磷酸基团。用T4RNA连接酶把5’RACE Adaptor连接到mRNA上,反应后酚氯仿抽提回收。用逆转录酶进行逆转录反应,所用引物为Kit提供的Random 9mers。
以逆转录产物为模板,用高保真酶PCR扩增目的基因,所用引物为:
5’:5’RACE Outer Primer(CATGGCTACATGCTGACAGCCTA),Kit提供;(SEQ ID NO:19)
3’:
重链:mIgG1-out primer(CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT)(SEQ ID NO:20)
轻链:mκ-out primer(AGGTGCTGTCTTTGCTGTCCTG)(SEQ ID NO:21)
以上述扩增所得PCR产物为模板,进行巢式PCR,所用引物为:
5’:
5’RACE Inner Primer(CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG);Kit提供(SEQ ID NO:22)
3’:
重链:mIgG1-inner primer(CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT)(SEQ ID NO:23)
轻链:mκ-inner primer(GTTCAAGAAGCACACGACTGAGG)(SEQ ID NO:24)。
将上述扩增所得PCR产物纯化,经TA克隆(pGEM-T Easy Vector Kit,购自promega公司,方法参见该kit操作步骤),分别得到Teasy-2B11VH和Teasy-2B11Vκ载体,然后测序分析得
到单克隆抗体2B11的重链和轻链序列。重链和轻链的序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。根据KabatMan确定重链可变区和轻链可变区的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。根据Kabat编号规则确定重链可变区的CDR1,CDR2,CDR3的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示,确定轻链可变区的CDR1,CDR2,CDR3的序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。
实施例6嵌合抗体载体pH-CH2B11和pK-CH2B11的构建及结合活性的初步鉴定
6.1载体pH-CH2B11的构建
以本发明实施例5中构建的载体Teasy-2B11VH为模板,通过以下引物进行PCR扩增,
2BVHF(5’-ggctgttcacagcctttcctggtttcctgtct gaggtgaaggtggtggag-3’)SEQ ID NO:25和
2BVHR(5’-cgatgggcccttggtggaggc tgaggagacggtgactg-3’)SEQ ID NO:26
得到2B11抗体的重链可变区。
同时以抗体载体pH-EGFRvIII(亦即pH-CH12,该载体的构建方法见PCT/CN2009/074090的实施例7.1)为模板,进行PCR扩增
引物FcF(5’-gcctccaccaagggcccatcg gtcttccccctgg-3’)SEQ ID NO:27和
引物PIHR(5’-cgcttttgagagggagtactcac-3’)SEQ ID NO:28
得到人IgG1的恒定区。
上述两个PCR扩增片段回收后搭桥,再用如下引物进行PCR扩增:
Nhe(5’-cctagctagccaccatgagagtgctgattcttttgt ggctgttcacagcctttcct-3’)SEQ ID NO:29和
前述引物PIHR SEQ ID NO:28产物琼脂糖胶回收后NheI和NotI(购自NEB公司)双酶切,连接于同样双酶切的载体pH中,得到包含嵌合的2B11重链的表达质粒pH-CH2B11,对其进行PCR鉴定及测序确认。
6.2载体pK-CH2B11的构建
以本发明实施例5构建Teasy-2B11Vκ为模板,以以下引物PCR扩增,
2BVκF(5’-cttgcattcttgttgctttggtttccaggtgcaagatgt gacatccagatgactc-3’)(SEQ ID NO:30)和
2BVκR(5’-agccaccgtacg ttttatttccaactttg-3’)(SEQ ID NO:31)
得到单克隆抗体2B11的轻链可变区,片段回收,然后再用如下引物对上述PCR扩增片段进行扩增,
Eco(5’-gatcgatatccaccatggacatgatggtccttgctcagtttcttgcattcttgttg-3’),(SEQ ID NO:32)和
2BVκR(SEQ ID NO:31),
所得扩增产物经琼脂糖胶回收后EcoRV和BsiWI(购自NEB公司)双酶切,连接于同样双酶切的载体pK中,得到包含嵌合的2B11轻链的表达质粒pK-CH2B11,对其进行PCR鉴定及测序确认。
实施例7嵌合抗体CH2B11的构建及结合活性的初步鉴定
将上述构建的表达载体pH-CH2B11和pK-CH2B11共转染于悬浮细胞CHO中表达,3天后收集培养的细胞上清。培养的CHO细胞上清中所包含的表达的嵌合抗体CH2B11。
取培养的细胞上清进行ELISA结合实验。实验方法基本与本发明实施例4.4的方法相同,除了只包含包被的本发明实施例1制备的人proBDNF蛋白的实验组1,以及随后各孔加入本实施例中的细胞上清的梯度稀释液,而非对应的8个单克隆抗体克隆。同样以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。
实验结果如图7所示,嵌合抗体CH2B1的培养的CHO细胞上清液经1:32稀释后,仍显示具有结合人proBDNF的活性。
实施例8:单克隆抗体2B11的镇痛作用
8.1静脉注射2B11减轻福尔马林引起的双相性疼痛
将SD大鼠(体重200-250g)分为2B11组和空白对照(本实验采用同体积的PBS作为空白对照组)组。造模主要是采用1%福尔马林50ul,注射至小鼠足底。在造模半小时前,经尾静脉注射2B11(75μg/kg)或等量的空白对照。尾静脉给药方式为将大鼠尾巴用温水洗净后,用络合碘消毒待注射部位,以装有注射药量的无菌1ML注射器,以大约10度角平行于尾巴略带负压穿刺,待出现突破感并有暗红色血液回流入注射器时,注入浓度500ug/kg,共300μL 2B11。
福尔马林炎性痛造模方法主要参照Bellasio S等的方法,先将小鼠放入透明树脂玻璃盒(30×20×20cm)适应30min,随后在其右后足底皮下注射50ul 1%福尔马林溶液,注射后即刻放回盒内,同时以5min为一时间段,记录注射后1h内小鼠舔和咬注射足的时间。足底皮下注射福尔马林是一种经典的急性炎性疼痛模型,在该模型中动物会出现特殊的自发性疼痛行为,表现为舔足和咬足,舔足或咬足的时间越长,说明疼痛程度越强。这种自发性疼痛行为一般可分为2相,第一相在注射后0-5min出现,第二相出现在注射后15-60min,在两相之间会出现一个间歇期。其中第二相被认为与疼痛敏感化(中枢敏感化)机制有关。
如图8和对应的下表1数据所示,2B11组第一相舔足时间较空白对照组缩短;而在第二相,2B11组动物舔足时间较空白对照组显著减少,说明2B11对福尔马林第二相具有很明显的镇痛效果。(**,p<0.01,对照组相比)。
表1
8.2静脉注射2B11减轻CFA(完全性弗氏佐剂)诱发的慢性炎性疼痛
本实验观察2B11对CFA诱发的慢性炎性疼痛的作用。CFA足底注射诱发疼痛为经典的慢性炎性疼痛模型,持续时间长。足底注射CFA后,导致大鼠的机械性痛阈下降,持续时间超过3周。
实验分组同实施例8.1。造模前一天,采用Von Frey纤维丝方法观察其大鼠收缩阈值(Paw Withdrawal Threshold,PWT)。Von frey filament于1896年由Maximilian von Frey设计,是一个触觉测量器。触丝由不同直径的尼龙纤维丝制成,使用时将这些纤维丝接触到皮肤(或动物脚底板等待测部位)并加以一定的力使纤维丝弯曲形成一个S形。因为这个使纤维丝弯曲的力量可以被认为是持续性的,所以这些纤维丝可以精确的反映加到待测区域的力量。Von frey filament现在是测量各种疼痛后机械痛敏的最常用工具之一。
在大鼠或小鼠后足使用von frey纤维丝测量痛阈的具体方法如下:
参照Chapland等的方法,将大鼠置于升高的网格状的金属网上,以使后足底可以被实验者自由接触到,盖以透明的有机玻璃罩,并在实验开始前让大鼠适应环境30分钟,等待大鼠的梳理和探究活动基本消失,实验时间在8:00-16:00,实验时光线充足,环境安静,温度适宜。
实验开始时,采用Up and Down法[dixon,Dixon WJ.Efficient analysis of experimental observations.Annu Rev Pharmacol Toxicol,1980,20:441-62],用9根不同强度的Von frey纤维丝(0.6,1,1.4,2,4,6,8,10,15g),从2G开始,依次由下向上垂直刺激大鼠损伤侧后爪趾面的中间区域,使其纤维丝轻度弯曲成s形,并保持6-8秒,相邻两次刺激之间间隔30秒,以使上一次刺激的行为学反应恢复正常。观察其损伤侧后肢缩足反射,大鼠在刺激时间内或在移开von Frey filaments时立即出现快速的缩足反射,记为阳性反应,但身体活动如移动引起的缩足反射
不记为阳性反应,此种情况下将重复该次测量。若大鼠没有出现此阳性反应,则选择其上的一个较大刻度的纤维丝刺激足底部:若出现阳性反应,则继续选择其下的一个较小刻度的纤维丝刺激,依此类推,刺激的上线和下线分别为15G和0.6G。根据Dixon介绍的Up and down方法推算50%PWT。若大鼠在测试时间内或在移开von frey纤毛的瞬间出现快速的缩足反射或舔足反应,则记为阳性反应,以“X”表示,如无反应,则视为阴性反应,以“O”表示。根据以上测试方法,则可以得到一串以“O”和“X”组合的序列,以出现“X”的前一次的“O”为起点,选择包括该起点的6次连续刺激反应,如“OXOXOO”,作为推算50%PWT的关键序列。但该序列组成也并非仅固定于6次,根据大鼠对不同力度纤毛的反应,最小序列组成为4次,如“XXXX”,发生在大鼠对2.0-0.6G力度范围的刺激均为阳性;也可为6次在2.0-15G范围力度的刺激均为阴性。发生持续阳性或阴性反应的大鼠50%PWT分别被认定为0.6G和15G;而既有阳性反应也有阴性反应的50%PWT则根据下列公式推算:
50%g threshold=(10[Xf+kδ])/10,000
其中Xf=最后一根引起阳性反应的纤毛的对数值(纤毛上标有);K=阳性/阴性反应组合下的常数(见附表);δ=刺激间平均差(对数值,这里为0.224)。
表2
对各实验组小鼠足底注射100μLCFA,然后经尾静脉分别给予2B11(75μg/kg每天)或PBS,12小时一次至注射CFA后第五天。在注射后不同时间段至术后第五天,观察PWT变化。
如图9和对应的下表3数据所示,空白对照组小鼠在CFA足底注射后,后足收缩阈值PWT较基础值显著降低,持续至注射后第五天;而在2B11组小鼠在CFA注射后第二天痛阈相对于空白对照组明显改善,且PWT值逐渐升高,在注射第五天,2B11组的PWT显著高于对照组。这说明2B11可显著减轻CFA导致的慢性炎性疼痛(图9)。*,p<0.05,与对照组相比;**,p<0.01,与对照组相比。
表3
8.3静脉注射2B11对切割痛的作用
大鼠后足切割痛模型是外科疼痛最常用的动物模型。大鼠后足切割后,表现为切割侧肢体抬高,不再负重,同时舔足。因此,人们经常采用疼痛评分来显示切割后疼痛的程度。一般以小时计算,每隔5分钟,观察大鼠着地情况,如果后足持续抬高,则为2分,着地不负重(以鼠笼的网格是否变形为基准)为1分,完全着地且负重为0分,分数越高,提示疼痛程度越强。人们经常采用累积疼痛评分(cumulative pain score,CPS)对切割足疼痛程度进行评估。CPS越高,疼痛强度越强。另一方面,切割后,机械痛阈也会下降。因此,我们采用这两种方法对proBDNF单克隆抗体(2B11)对切割痛的作用。
实验分组同实施例8.1。术前15分钟,采用尾静脉注射给予500ug/kg的2B11,在术后不同时间段观察大鼠的疼痛评分(图10和对应的下表4)和后足机械痛阈(图11和对应的下表5),可以看到:
2B11实验组小鼠在切割手术1hr后开始测量的疼痛评分明显低于空白对照组小鼠,尤其以切割手术后第3hr差距最为明显,在术后6小时,2B11组的疼痛评分仍然显著低于空白对照组;
表4
2B11实验组小鼠在切割手术3hr和6hr后开始测量的机械痛阈明显高于空白对照组小鼠。
表5
上述表4和5的结果共同表明本发明的单克隆抗体2B11对切割痛具有良好的和显著的镇痛作用。
8.4腹腔注射2B11减轻醋酸腹腔注射引发的内脏痛
小鼠在腹腔注射醋酸后主要表现为腹壁收缩、伸直等扭体反应(Writhing Test),尤其在注射后1小时表现最为明显,观察注射醋酸后1小时内扭体反应成为筛选镇痛药的常用模型之一。腹腔注射0.6%醋酸(0.2ml)只小鼠导致化学性内脏痛。
实验分组同实施例8.1。注射醋酸前30分钟,对各实验组小鼠分别腹腔注射本发明的单克隆抗体2B11(500ug/kg,0.2ml)或相同体积的空白对照(这里指的是PBS)。
如图12和对应的下表6数据所示,2B11实验组小鼠较空白对照组小鼠出现的扭体反应显著减少,说明给予本发明单克隆抗体2B11进行预处理可减轻醋酸腹腔注射引起内脏痛。
表6
|
空白对照组扭体反应(次数/小时) |
2B11组扭体反应(次数/小时) |
|
117 |
74 |
|
78 |
58 |
|
90 |
57 |
|
95 |
47 |
|
137 |
62 |
|
89 |
53 |
|
101 |
22 |
均值 |
101 |
53.3 |