JP2017500025A - 抗菌剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
上述した背景技術は、ただ本発明の背景に対する理解を助けるためのもので、この技術分野で通常の知識を有する者にとって既に知られた従来技術に該当するだけにとどまるものではない。
(a)空調装置内の悪臭誘発微生物のミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)、ミクロバクテリウム・フラベッセンス(Microbacterium flavescens)、メチロバクテリウム・タングクエンス(Methylobacterium dankookense)、メチロバクテリウム・フィロスフェレ(Methylobacterium phyllosphaerae)、メチロバクテリウム・ターダム(Methylobacterium tardum)、メチロバクテリウム・ラディオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)、スフィンゴモナス・ドクドネンシス(Sphingomonas dokdonensis)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンス(Sphingomonas ginsenosidimutans)、スフィンゴモナス・フミ(Sphingomonas humi)、スフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニス(Staphylococcus hominis subsp. hominis)、及びスタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)からなる群から選択される1つ以上またはその培養物を準備する段階と、
(b)前記微生物に分析しようとする試料を接触させる段階と、
(c)前記微生物の生育の抑制または悪臭の発生が減少したか否かを測定する段階と、
(d)前記微生物の生育が抑制されるか、悪臭の発生が減少した時、前記試料が前記微生物に対する抗菌活性を保有していると判別する段階。
(i)本発明は、空調装置内の悪臭を誘発する微生物を提供する。
(ii)また、本発明は、前記微生物を制御できる抗菌剤のスクリーニング方法を提供する。
(iii)さらに、本発明は、前記微生物を制御して空調装置内の悪臭を除去する方法を提供する。
(iv)本発明の空調装置内の悪臭誘発微生物は、新規な抗菌剤の開発または前記微生物の代謝産物の化学的性質を究明して悪臭を遮断するための芳香剤の開発に利用される。
1.悪臭車種の確保及び空調装置の分離
本発明者らは、車両内部のような密閉された環境で発生する悪臭の原因を究明するために、季節別(冬期:2〜3月、夏期:6〜7月)に悪臭が発生する中古車10種を確保し、それぞれの車両に装着されている空調装置を分離し、空調装置内の悪臭誘発微生物によるバイオフィルムが形成されていると予想されるエバポレータコアを引き離して試片をサンプリングした(表1)。
前記悪臭中古車1〜10から確保したエバポレータコアから得たエバポレータコアのサンプルを、使用するまで4℃で冷蔵保管し、ポリエチレンバッグに密封して保管した。微生物を分離培養するためにそれぞれのエバポレータコアの前面部及び後面部を含む任意の部位から、滅菌したラジオペンチを用いて各5gずつ試料を採取した後、混合して使用した(図1)。
前記エバポレータコアから採取した試料からの微生物の分離は、次の過程による。
1)エバポレータコアで抽出した試料を混合して攪拌器に入れる。
2)滅菌された1×PBS(Phosphate Buffered Saline)200mlを前記攪拌器に入れる。
3)混合された試料とPBSを30秒間攪拌する。
4)攪拌器を氷に1分間置く。
5)前記3)〜4)過程を2回さらに繰り返す。
6)懸濁液を4℃で3分間13,000rpmで遠心分離する。
7)上澄液だけ採って新しいチューブに移して入れる。
8)滅菌された綿棒を上澄液に濡らして、サンプルを採取したエバポレータコアの表面を複数回ぬぐい取る。
9)ぬぐい取った綿棒は、上澄液にヘッド部分だけ入れてボルテックスする。
10)前記6)過程で得た沈殿物と9)の混合物とを混合して接種原液として用いる。
前記1)〜10)の過程を車種1〜10に装着されているエバポレータコアに対してそれぞれ物理的分離を施して微生物を分離した。
エアコンの細菌の分離は、通常、一般細菌という好気性従属栄養細菌を従属栄養平板培養により分離する。一般細菌の分離は、PTYG寒天培地(PTYG agar medium)及びR2A寒天培地(R2A agar medium)の複合栄養培地を用いて28〜30℃で14日間培養(PTYG寒天培地はペプトン0.25g(Difco)、トリプトン0.25g(Difco)、 酵母エキス0.5g(Difco)、グルコース0.5g(Difco)、MgSO4 30mg(Sigma)、CaCl2 3mg(Sigma)、バクト寒天(Bacto agar)15mg(Difco)を蒸溜水980mlに入れてpH7.0に調整した後、121℃で15分間高圧滅菌して用い、R2A寒天培地は、酵母エキス0.5g(Difco)、プロテオースペプトンNo.3 0.5g(Difco)、カザミノ酸0.5g(Difco)、デキストロース0.5g(Difco)、可溶性でんぷん0.5g(Difco)、ピルビン酸ナトリウム0.3g(Difco)、硫酸二カリウム0.3g(Difco)、硫酸マグネシウム0.05g(Difco)、バクト寒天15g(Difcoを蒸溜水980mlに入れてpH7.2に調整した後(最終1000ml)、121℃で15分間高圧滅菌して使用)し、非優占細菌の分離のためにカナマイシン、アンピシリン及びクロラムフェニコールを100ppm濃度でフィルタ滅菌した後、培地温度が50℃になった時に接種して抗菌剤の培地を製作した。
1)分離培養された培地でかびとバクテリアを分けて分離する。
2)形態学的に異なる様々な細菌を、ループを用いて複合培地に接種して純粋分離する。
3)接種された培地のうちの最も生育の良い培地を選択して継代培養する。
4)かびは、菌糸の終端部を、外科用メスを用いて分離した後、複合培地に接種する。
5)かび菌株も、接種された培地のうちの最も生育の良い培地を選択して継代培養する。
前記分離微生物の正確な同定のために、次の段階を含む16SrRNAの同定を行った。
REP−PCRは、細菌染色体の構造を分析する分子生物学的方法であって、各細菌菌株と他の細菌を分けて識別できるフィンガープリント方法である。REP−PCRを行うために下記の各手順によって遺伝的特性を分析した。
1)Lyse−N−Go PCR試薬(Thermo)2.5μlをPCRチューブに入れる。
2)クリーンベンチでコロニーをピペットで採取して該チューブに入れてピペッティングする。この時、採った量によって溶液が濁ることのないように注意する。
3)製造業者の指示によってPCR装置で培養する。
下記表2に記載する成分を用いて、下記表3に記載したように、予備変性段階93℃で7分、変性段階92℃で1分、冷却段階(annealing)51.5℃で1分、延長段階(extension)65℃で8分間の変性、冷却、延長過程を33回繰り返してPCR増幅過程を行った。
それぞれのPCRによって増幅されたDNA断片を採取し、EtBrを添加した1.2〜1.5%のアガロースゲルを使用し、6×ダイとサンプルを1:5の比率で混合して、できるだけ多くローディングした。大部分のPCR産物は100〜1000bpであるため、100bpのラダーを共にローディングして、できるだけゆっくり(50V)ブロモフェノールブルーとキシレンシアノール色素の中間がゲル全体の中間となるように電気泳動した。ゲル上のDNAパターンが同一の菌株は同じ菌株であるとみなした。
16SrRNA遺伝子は、バクテリアの遺伝学的分類を同定するために用いられ、REP−PCRにより分類されたバクテリアの属及び種の水準での同定が可能である。
(1)細胞溶解の手順
1)Lyse−N−Go PCR試薬(Thermo)5μlをPCRチューブに入れる。
2)クリーンベンチでコロニーをピペットで採取し、該チューブに入れてピペッティングする。この時採取した量は、溶液が少し濁るようになる程度である。
3)製造業者の指示によってPCR装置で溶解する(表4)。
PCR条件(合計50μl):DNAとTaqを除いた残り溶液を下記表5のように必要量だけ混合して該溶液に44.5μlを加えた。次に、表6のように予備変性段階94℃で5分、変性段階94℃で1分、冷却段階(annealing)55℃で1分、延長段階(extension)72℃で1分30秒を行い、変性、冷却及び延長段階を29回施してPCR増幅過程を行った。
16SrRNA遺伝子のPCRにより増幅した産物を、Qiaquick PCR purifcation kitを用いて下記の手順により精製した。
1)PCR製品の5倍のPBバッファーを入れる。
2)混合液をQIAquickカラムに分注する。
3)DNAを結合させるために1分間遠心分離し、通過した混合液を除去する。
4)洗浄のために750μlのPEバッファーをQIAquickカラムに入れて1分間遠心分離し、通過した混合液を除去する。
5)1分間再び遠心分離する。
6)QIAquickカラムを新たなチューブに移す。
7)DNAを抽出するために30μlのEBバッファーを入れて1分間置く。
8)1分間遠心分離してEBに溶けたDNAをチューブに集める。
1)純粋分離され培養された微生物を液体栄養培地に接種する。
2)接種された培地を28℃で5〜7日間培養する。
3)固体栄養培地に、液体培地で培養された菌体を100μl採って接種する。
4)接種した菌体をスプレッダーを用いて均一に広げる。
5)ペトリ皿を密封して28℃で10日間培養する。
1.実験過程
本発明者らは、現在、市販されている多様な抗菌剤を用いて、前記実施例1で選別された優占微生物に対する抗菌度を評価した。本発明で利用した抗菌剤は次の通りである。
A抗菌剤:韓国P&G社から購入した繊維脱臭剤
B抗菌剤:(株)PARUから購入した手洗浄剤
C抗菌剤:メチルアルコール45〜50%、硫酸クロム(CAS 10101−53−8)1〜5%、ブロム系1〜5%及び水を含む量産抗菌剤
D抗菌剤:陽イオン抗菌剤(日本パーカーライジング)
E抗菌剤:メチルイソチアゾリノン(Methylisothiazolinone、CAS 26172−55−4)、ブロノポール(Bronopol、CAS 52−51−7)などを含むイソチアゾリン系抗菌剤(日本パーカーライジング)
1)滅菌された濾過紙の準備
2)5種類の抗菌剤の準備(対照群:抗菌剤の無処理群、実験群:抗菌剤A、抗菌剤B、抗菌剤C、抗菌剤D、及び抗菌剤E)
3)抗菌剤に濾過紙を投入
4)それぞれの悪臭誘発微生物を栄養培地に塗布
5)悪臭誘発微生物が塗布された栄養培地にそれぞれの抗菌剤が含まれた濾過紙を載置
6)28〜30℃で5日間培養
7)生育抑制区域の測定
前記方法により悪臭誘発微生物12種に対する生育抑制区域の直径を測定した結果は次の表8の通りである。
本発明者らは、悪臭微生物が除去または分離された状態のエバポレータコアを得るために前記エバポレータコアに生息する優占微生物のうち、実施例1の悪臭微生物を除いた無臭微生物の組合せをエバポレータコアの材質のアルミニウムフィンを用いて培養した(表10、図3)。
1)純粋分離され培養された無臭微生物をR2A液体培地に接種する。
2)接種された培地を28℃で5〜7日間培養する。
3)121℃で20分間高圧滅菌したアルミニウムフィンを準備する。
4)それぞれの抗菌剤に浸漬して表面を均一にコーティングする。
5)コーティングされたアルミニウムフィンをペトリ皿に載置する。
6)培養された無臭微生物の接種液1mlを遠心分離して上澄液を捨てる。
7)滅菌された1×PBSを1ml入れて再び遠心分離する。
8)前記7)の方法を2回繰り返す。
9)PBSで洗浄した無臭微生物を100μlずつアルミニウムフィンの中間に落とす。
10)準備されたアルミニウムフィン上に接種して室温で乾かす。
11)ペトリ皿を密封して28℃で1ヶ月間培養する。
Claims (31)
- 次の段階を含む空調装置内の悪臭を誘発する微生物に対する抗菌剤のスクリーニング方法:
(a)空調装置内の悪臭誘発微生物のミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)、ミクロバクテリウム・フラベッセンス(Microbacterium flavescens)、メチロバクテリウム・タングクエンス(Methylobacterium dankookense)、メチロバクテリウム・フィロスフェレ(Methylobacterium phyllosphaerae)、メチロバクテリウム・ターダム(Methylobacterium tardum)、メチロバクテリウム・ラディオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)、スフィンゴモナス・ドクドネンシス(Sphingomonas dokdonensis)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンス(Sphingomonas ginsenosidimutans)、スフィンゴモナス・フミ(Sphingomonas humi)、スフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニス(Staphylococcus hominis subsp. hominis)、及びスタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)からなる群から選択される1つ以上、またはその培養物を準備する段階と、
(b)前記微生物に分析しようとする試料を接触させる段階と、
(c)前記微生物の生育の抑制または悪臭の発生が減少したか否かを測定する段階と、
(d)前記微生物の生育が抑制されるか、悪臭の発生が減少した時、前記試料が前記微生物に対する抗菌活性を保有していると判別する段階。 - 前記空調装置がエアコンであることを特徴とする、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記微生物が、空調装置内のエバポレータコアにバイオフィルムを形成して悪臭を誘発することを特徴とする、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記エバポレータコアは、その材質がアルミニウム、アルミニウム合金、銅または銅合金であることを特徴とする、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 前記微生物が、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクムHKMC−112(寄託番号:KCCM11395P)、ミクロバクテリウム・フラベッセンスHKMC−104(寄託番号:KCCM11387P)、メチロバクテリウム・タングクエンスHKMC−101(寄託番号:KCCM11384P)、メチロバクテリウム・フィロスフェレHKMC−102(寄託番号:KCCM11385P)、メチロバクテリウム・ターダムHKMC−103(寄託番号:KCCM11386P)、メチロバクテリウム・ラディオトレランスHKMC−111(寄託番号:KCCM11394P)、スフィンゴモナス・ドクドネンシスHKMC−105(寄託番号:KCCM11388P)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンスHKMC−106(寄託番号:KCCM11389P)、スフィンゴモナス・フミHKMC−107(寄託番号:KCCM11390P)、スフィンゴモナス・メロニスHKMC−108(寄託番号:KCCM11391P)、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニスHKMC−109(寄託番号:KCCM11392P)、及びスタフィロコッカス・ワーネリHKMC−110(寄託番号:KCCM11393P)からなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記抗菌剤が、前記微生物以外にも他のメチロバクテリウム属微生物に対する抗菌活性をさらに保有することを特徴とする、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記他のメチロバクテリウム属微生物が、メチロバクテリウム・フィロスフェレ(Methylobacterium phyllosphaerae)、メチロバクテリウム・ターダム(Methylobacterium tardum)、またはメチロバクテリウム・ラディオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)であることを特徴とする、請求項6に記載のスクリーニング方法。
- 前記メチロバクテリウム・フィロスフェレが寄託番号KCCM11385Pで寄託されたメチロバクテリウム・フィロスフェレHKMC−102であり、メチロバクテリウム・ターダムが寄託番号KCCM11386Pで寄託されたメチロバクテリウム・ターダムHKMC−103であり、メチロバクテリウム・ラディオトレランスが寄託番号KCCM11394Pで寄託されたメチロバクテリウム・ラディオトレランスHKMC−111であることを特徴とする、請求項7に記載のスクリーニング方法。
- 前記抗菌剤が、ミクロバクテリウム属微生物、スフィンゴモナス属微生物、及びスタフィロコッカス属微生物からなる群から選択される1つ以上の微生物に対する抗菌活性をさらに保有することを特徴とする、請求項1に記載のクリーニング方法。
- 前記ミクロバクテリウム属微生物が、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)及びミクロバクテリウム・フラベッセンス(Microbacterium flavescens)からなる群から選択される1つ以上の悪臭誘発微生物であることを特徴とする、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 前記ミクロバクテリウム属微生物が、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクムHKMC−112(寄託番号:KCCM11395P)及びミクロバクテリウム・フラベッセンスHKMC−104(寄託番号:KCCM11387P)からなる群から選択される1つ以上の悪臭誘発微生物であることを特徴とする、請求項10に記載のスクリーニング方法。
- 前記スフィンゴモナス属微生物が、スフィンゴモナス・ドクドネンシス(Sphingomonas dokdonensis)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンス(Sphingomonas ginsenosidimutans)、スフィンゴモナス・フミ(Sphingomonas humi)、及びスフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)からなる群から選択される1つ以上の悪臭誘発微生物であることを特徴とする、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 前記スフィンゴモナス属微生物が、スフィンゴモナス・ドクドネンシスHKMC−105(寄託番号:KCCM11388P)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンスHKMC−106(寄託番号:KCCM11389P)、スフィンゴモナス・フミHKMC−107(寄託番号:KCCM11390P)、及びスフィンゴモナス・メロニスHKMC−108(寄託番号:KCCM11391P)からなる群から選択される1つ以上の悪臭誘発微生物であることを特徴とする、請求項12に記載のスクリーニング方法。
- 前記スタフィロコッカス属微生物が、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニス(Staphylococcus hominis subsp. hominis)及びスタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)からなる群から選択される1つ以上の悪臭誘発微生物であることを特徴とする、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 前記スタフィロコッカス属微生物が、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニスHKMC−109(寄託番号:KCCM11392P)及びスタフィロコッカス・ワーネリHKMC−110(寄託番号:KCCM11393P)からなる群から選択される1つ以上の悪臭誘発微生物であることを特徴とする、請求項14に記載のスクリーニング方法。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のミクロバクテリウム・トリコテセノリティクムHKMC−112(寄託番号:KCCM11395P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のミクロバクテリウム・フラベッセンスHKMC−104(寄託番号:KCCM11387P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のメチロバクテリウム・タングクエンスHKMC−101(寄託番号:KCCM11384P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のメチロバクテリウム・フィロスフェレHKMC−102(寄託番号:KCCM11385P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のメチロバクテリウム・ターダムHKMC−103(寄託番号:KCCM11386P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のメチロバクテリウム・ラディオトレランスHKMC−111(寄託番号:KCCM11394P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のスフィンゴモナス・ドクドネンシスHKMC−105(寄託番号:KCCM11388P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のスフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンスHKMC−106(寄託番号:KCCM11389P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のスフィンゴモナス・フミHKMC−107(寄託番号:KCCM11390P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のスフィンゴモナス・メロニスHKMC−108(寄託番号:KCCM11391P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のスタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニスHKMC−109(寄託番号:KCCM11392P)。
- 請求項5に記載の空調装置内の悪臭誘発微生物のスタフィロコッカス・ワーネリHKMC−110(寄託番号:KCCM11393P)。
- 請求項1に記載の抗菌剤を空調装置内に塗布または噴射する段階を含むことを特徴とする、空調装置内の悪臭誘発微生物の生育抑制方法。
- 請求項1に記載の抗菌剤を空調装置内に塗布または噴射する段階を含むことを特徴とする、空調装置内の悪臭除去方法。
- 空調装置内で悪臭誘発微生物のミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)、ミクロバクテリウム・フラベッセンス(Microbacterium flavescens)、メチロバクテリウム・タングクエンス(Methylobacterium dankookense)、メチロバクテリウム・フィロスフェレ(Methylobacterium phyllosphaerae)、メチロバクテリウム・ターダム(Methylobacterium tardum)、メチロバクテリウム・ラディオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)、スフィンゴモナス・ドクドネンシス(Sphingomonas dokdonensis)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンス(Sphingomonas ginsenosidimutans)、スフィンゴモナス・フミ(Sphingomonas humi)、スフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニス(Staphylococcus hominis subsp. hominis)、及びスタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)からなる群から選択される1つ以上を、前記空調装置から分離または死滅させる段階を含むことを特徴とする、空調装置内の悪臭除去方法。
- 空調装置内で悪臭誘発微生物のミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム(Microbacterium trichothecenolyticum)、ミクロバクテリウム・フラベッセンス(Microbacterium flavescens)、メチロバクテリウム・タングクエンス(Methylobacterium dankookense)、メチロバクテリウム・フィロスフェレ(Methylobacterium phyllosphaerae)、メチロバクテリウム・ターダム(Methylobacterium tardum)、メチロバクテリウム・ラディオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)、スフィンゴモナス・ドクドネンシス(Sphingomonas dokdonensis)、スフィンゴモナス・ギンセノシディミュータンス(Sphingomonas ginsenosidimutans)、スフィンゴモナス・フミ(Sphingomonas humi)、スフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)、スタフィロコッカス・ホミニス亜種ホミニス(Staphylococcus hominis subsp. hominis)、及びスタフィロコッカス・ワーネリ(Staphylococcus warneri)からなる群から選択される1つ以上の生育を抑制させる段階を含むことを特徴とする、空調装置内の悪臭除去方法。
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