JP2017222699A - 正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法 - Google Patents
正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】抗体と抗体を含む凝集物とを含むサンプル中の凝集物を低下させる方法であって、(i)0.1%(重量/体積)の正電荷有機添加剤を前記サンプル中に加えること、及び(ii)0.56%〜1%(重量/体積)、1〜2%(重量/体積)、2〜5%(重量/体積)、5〜10%(重量/体積)又は10〜15%(重量/体積)の範囲の濃度のアラントインをサンプル中に加えることを含み、前記アラントインを加えた後、前記サンプルは未溶解のアラントインを含む。
【選択図】なし
Description
1)成分たる不純物は、しばしば、非ヒト由来であり、生きている非ヒト宿主細に胞により分泌され、又は非ヒト宿主細胞が死に際し溶解するとき培地中に放出される。生きているヒトにおいて、そのような非ヒト不純物は存在しない;及び
2)成分たる不純物は、死細胞成分がすぐに除去されるヒトインビボ系と比較して、高い濃度で蓄積する。
従って、組み換え産物は、典型的には生体系において起こらない濃度で強力に相互作用する不純物の高いレベルに晒される。その間、組み換えタンパク質の高い発現レベルは、それらを、これらの非ヒト不純物との非特異的な会合のための好適な基質にし、複合体及び凝集体を含有する異種の組成物の望ましくないヘテロ会合の形成に好都合である。
用語は、本発明がより容易に理解されるために定義される。付加的な定義は、詳細な説明の全体にわたって説明される。
HMW凝集体の低減及びヘテロ−凝集体の分離について、正電荷有機添加剤の比較。モノクローナルIgM含有の浄化された細胞培養上清を、200mMのアルギニン、10mMのEDTA、50mMのMESを含む、pH6.5の緩衝液において、実施されたサイズ排除クロマトグラフィによって分析した。その物質は、11%のHMW凝集体及びヘテロ−凝集体の実質的な存在を示す、0.506の254/280比を示したIgMピークを含んでいた。上清の電気伝導率を、塩化ナトリウムの添加によって、20mS/cmまで上げた。9つのサンプルを、0.01、0.05、及び0.1%のPEI−1200、0.01、0.05、及び0.1%のエタクリジン、並びに0.01、0.05、及び0.1%のクロルヘキシジンで処理し、30分間インキュベートし、次いでSECにより分析した(結果は以下に示す)。0.1%のクロルヘキシジンのサンプルは、分析の前に沈殿した。サンプルを30分間インキュベーションし、次いでSECにより分析した。エタクリジンだけHMW凝集体を除去した。効果的なヘテロ−凝集体の分離も維持した。PEIは、全ての濃度で、97%より優れた回収率、及び良好なヘテロ−凝集体の分離を提供したが、ヘテロ−凝集体の低減には乏しかった。クロルヘキシジンは、ほぼエタクリジン及びPEIの中間であった。
HMW凝集体の低減及びヘテロ−凝集体の分離について、正電荷有機添加剤の比較。他の抗体を用いて、実施例1の形式を再び実施した。この抗体は7.5%のHMW凝集体及び低いヘテロ−凝集体が内容物であることを示した。傾向は、基本的に実施例1におけるサンプルと同じであるが、明らかな違いがあり、明らかに、抗体の特性に起因し得る。以下に示す。
より高い電気伝導率の効果。実施例2の一連のエタクリジンを、40mS/cmの上清の電気伝導率で再び実施した。HMW凝集体及びヘテロ−凝集体レベルは、未処理の対照において20mS/cmより低い値であった。HMW凝集体はエタクリジンの濃度に対しては同様の傾向を示したが、回収率が低い一方、ヘテロ−凝集体は反対方向に向かう傾向がある。
モノクローナルIgM含有の細胞培養上清におけるDNA抗体のヘテロ−凝集体のレベルを低下させることについて、作用濃度の測定。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィは、モノクローナルIgMクローン85をDNAと大いに複合化したことを示した。これは、ほぼ、280nmでのUV吸光度と同等である、254nmでのIgMピークのUV吸光度によって明らかとなった。DNA−フリー(free)IgMは約2:1の280/254比を有する。IgMからDNAを解離するための最も有効な組合せを測定するため、正電荷有機添加剤PEI−1300及びウレイドアラントインの様々な組合せと、モノクローナルIgM含有の浄化された細胞培養上清の10mLサンプルを合わせて、実験を行った。サンプルは、最初は、不純物の存在のためにその色が黄褐色であり、少しばかりの濁りは沈殿の存在を示す。乾燥アラントイン粉末の直接の添加によって、全てのサンプルをアラントインで飽和した。アラントインを含むサンプルの全ては、見かけが濃い乳白色である。PEIの原液を、酢酸を用いてpH7.0とした50%のPEI−1300(Sigma)を滴定することによって調製し、水を加えて最終的なPEI濃度を10%とした。PEIを、サンプルに加え、2%、1%、0.5%、0.025%、0.0125%、及び0.00625%の最終濃度とした。PEIを欠くがアラントインを含む、実験対照を調製した。別の対照を、アラントインの不存在下で、0.05%PEIで調製した。後者の対照において、濁度は変わらないままであり、PEI−1300だけでは、実質的なDNA又は他のサンプルの内容物の沈殿を起こす能力が無いことを示す。それぞれのサンプルを0.22μmの膜を通してろ過した。サンプルを容易にろ過し、処理後、光学的に透明に光っていた。これは、本発明の特定の特徴である。それぞれのサンプルを、pH7.0で、50mMのHepesで平衡化したヒドロキシアパタイトのカラム(CHT type II、40μm、1mL、5×50mm、1mL/分)に適用し;pH7.0で、50mMのHepes、2MのNaClで洗浄し;初期条件に再平衡化した;pH7.0で、250mMのリン酸ナトリウムに、10カラム容量(CV)の直線勾配で溶離した;次いで、pH7.0で、500mMのリン酸塩で洗浄した。PEIだけのサンプルは、部分的な分離を示した。非常に大きいDNAピークは、洗浄工程で溶離した。アラントインだけのサンプルは、DNA複合体のより少ない低減を示したが、非常に少ないDNAは洗浄のピークで溶離した。PEI/アラントインで処理したサンプルの全てから溶離したIgMは、IgMから分離した実質的に完全なDNAを示す理想的な280/254比を与え、ごく少量のDNAのみが洗浄工程で溶離した1%のPEIにて前記実験から回収されたヒドロキシアパタイトで分画したIgMを分析的SECカラムに適用した。IgMを、DNAが残っていることを示さない、95%より高い純度であると推定した。この例は、供給材料における高いDNAレベルの存在により通常は無効となる方法によって、有効な産物回収を可能とする本発明の能力を説明する。それは、正電荷有機添加剤及び水素供与体/受容体の組合せがDNA(正電荷有機添加剤に対して高い親和性を有する)と、DNAより低いが正電荷有機添加剤に対する高い親和性を有する産物との間の微細な区別を達成できることも明らかにする。この実験は、また、重要な見識及びこの技術の価値のある実施例をもたらした。PEIだけの処理におけるDNAピークは、ほぼ、未処理のサンプルにおけるDNAピークの2倍の大きさであった。これは、ほぼ、元のサンプルにおけるDNAの半分をタンパク質とのヘテロ−凝集体に含むことを示し、それらの分離の重要性を強調する。この実施例は、また、非常に透明な生物サンプルを達成できる、極めて珍しく、望ましい結果を達成する前記方法の能力を強調する。多くの方法は、細胞培養上清を浄化するために存在するが、全て、サンプルにおいて明らかな曇りを残し、この曇りは、しばしば後の精製のための方法に干渉すると疑われる。前記方法で処理された溶液の著しい透明さは、とりわけ、未溶解アラントインと併用して実施したとき、他の方法との明らかな差異を強調する。
好ましい添加の順序の決定。実験を、0.025%のPEI−1300及び飽和アラントインで処理した実施例4に記載の抗体の2分割量において実施した。PEIを、一つの実験において、最初に加え、他において、アラントインを最初に加えた。サンプルをろ過し、上記のとおり、ヒドロキシアパタイトカラムに適用した。アラントインで最初に処理したもののIgMピークは、ほぼ、PEIで最初に処理したものの2倍の大きさであった。これらの結果は、産物回収率を最大化するための添加の順番の重要性を強調し、また、正電荷有機添加剤とタンパク質との相互作用を調節するアラントインの能力を強調する。
インキュベーション時間の測定。実験を、PEIの添加前に1〜30分、及びPEIの添加後、濾過の前に1〜30分間の間隔でインキュベートしたアラントインにおいて実施した。ヒドロキシアパタイトカラムでの280/254比、又はIgMピークの大きさにおいて、明らかな傾向は無かった。これは、DNA分離及び除去の速度が速いということを示唆する。
モノリスにおける立体排除クロマトグラフィによるIgMの精製。IgM−B07細胞培養上清のサンプルを、上記のとおり、1%のPEI−1200及び飽和アラントインで処理した。8mLのヒドロキシルモノリス(BIA Separations)を、pH7.0で、50mMのHepes、100mMのNaCl、10mMのEDTA、10%のポリエチレングリコール6000を用いて、平衡化した。処理したIgM上清を、10%のPEGで適用した;カラムを、平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、3.75CV直線勾配で、pH7.0で、50mMのHepes、100mMのNaClに溶離した。未処理のサンプルを、その後、参考までに、クロマトグラフした。未処理の参考用サンプルは、ブロードな、立下りの(trailing)、薄い、混濁したピークに溶離した。処理したサンプルは、シャープな、対称的な、濃縮した、光学的に透明なピークに溶離し、凝集体の立下りの(trailing)ピークからよく分離した。分析的SECは、処理したサンプルからのIgMが、95%より高い純度であり、ただこの一度だけのクロマトグラフィ工程後に凝集体が無いことを示した。
酵素により消化されたDNAの除去。DNAをフラグメントに消化するため、モノクローナルIgMクローンA4を、ベンゾナーゼ(benzonase)で事前に処理した。ついで、ヘテロ−凝集体を分離するために、飽和アラントイン及び0.01%のPEI−1300で処理した。沈殿物を除去し、立体排除クロマトグラフィによって、サンプルは分画した。DNAが実質的に溶離した抗体に存在しないことは、小さいDNAフラグメントの除去に対する本発明の有効性が大きいDNAの除去に対するその有効性と同等であることを示している。
PEI−1300の代わりにエタクリジンを用いること以外は、実施例4の形式を再び実施した。エタクリジンが、より狭いダイナミックレンジを提供するが、同様の結果を生み出すということが見出された。抗体回収率は、0.00625%に下がるまでのエタクリジンの濃度に反比例した。DNA分離の効率は、0.001%〜0.00625%のエタクリジンの濃度に比例した。
クロルヘキシジンとのIgM−DNA複合体の分離。ろ過したIgM85含有細胞培養上清を強力なアニオン交換多孔性粒子の樹脂(EMD TMAE)に適用し、1MのNaCl(pH7.0)に、直線勾配で分画した。高いDNA含有量が知られているにもかかわらず、DNAピークは全DNAの約2%を表すように見えた。IgM及びDNAの間で溶離する、254nmでの高い吸収を有するピークは、DNAの残りがヘテロ−凝集体に存在していたことを示した。飽和アラントインで処理したIgM85のサンプルは、小さいが、ヘテロ−凝集体の量における一定の低減と、対応するDNAピークにおける増加とを示した。クロルヘキシジンを、0.001〜1%の範囲のレベルで、アラントイン−飽和サンプルに加え、処理したサンプルはアニオン交換体に適用した。ヘテロ−凝集体を分離し、DNAは、0.01〜1.0%の範囲のクロルヘキシジンにおいて除去した。複合体を、低い濃度で部分的にだけ分離し、DNAの低減は最小であった。激しい抗体の低減を、1%及び0.5%のクロルヘキシジンで観察した。これらの結果は、クロルヘキシジンがヘテロ−凝集体の分離、及び飽和アラントインの存在下でのDNA除去に有効である一方、その有効な範囲がPEI−1300又はエタクリジンより高くも狭くもあることを示す。この実施例は、また、事前にDNAを除去してしまう本発明のため、IgMの回収方法としてのアニオン交換クロマトグラフィの実施可能性を説明する。実施例4との比較は、IgMの回収方法としてのヒドロキシアパタイトの実施可能性を示した。
上記の実験によって明らかにされるように、正電荷有機添加剤の疎水性の増加は、例えば一連のPEI、エタクリジン、クロルヘキシジンにおいて、有用なダイナミックレンジの狭小化、及び注目するタンパク質の損失の増加という結果となる。実験に基づく比較を、0.02%のエタクリジン又は0.02%のPEI−1300と組み合わせて、1%の尿と1%のアラントインとの間で作成した。IgM回収率は、双方のウレイドとPEI、及びアラントインとエタクリジンに対して同等であったが、エタクリジンと尿酸の組合せでは約94%まで低減した。これらの結果は未溶解溶液の飽和成分アラントイン(約36mM)が、エタクリジンと抗体との相互作用を変性することを示すことを解釈した。凝集体の分離は、全ての処理において同等であった。SECもまた、全ての上記実験のように、処理の結果として、抗体ピークの見かけの大きさが低減することが明らかとなった。これは、溶出時間において、僅かだが明確な増加が観察され、肉盛りした特性によって明確に明らかとなった。254/280比の平行した低減は、サイズにおける変化が、抗体と会合する254−ドミナント(dominant)の不純物の除去に起因することを示す。
細胞含有の培地ブロス(broth)へのアラントイン及びエタクリジンの添加。1.5Lのハイブリドーマ培地ブロスを振とうフラスコから回収した。電気伝導率を25mS/cmに調整し、アラントイン及びエタクリジンを、1%(w/v)及び0.02%(w/v)となるようにそれぞれブロス(broth)に加え、20分間室温でよく混合した。混合物を遠心分離により浄化し、分析的SECによって分析した。この初期では、ヘテロ−凝集体を観察せず、IgMピークの254/280ピーク高さ比が1:2であり、IgMがほとんどDNA不純物を含まないことを示した。この実施例は、DNAの除去、及び細胞除去と凝集体の分離を統合できることを示す。
モノクローナルIgM含有の細胞培養上清における、DNA−抗体のヘテロ−凝集体のレベルを低下させるための作用濃度の測定。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィは、モノクローナルIgMクローン85をDNAと大いに複合化したことを示した。これは、ほぼ、280nmでのそのUV吸光度と同等である、254nmでのIgMピークのUV吸光度によって明らかとなった。DNA−フリー(free)IgMは、約2:1の280/254比を有する。IgMからDNAを解離するための最も有効な組合せを測定するため、正電荷有機添加剤PEI−1300及び1Mの尿素の様々な組合せと、モノクローナルIgM含有の浄化した細胞培養上清の10mLサンプルを合わせて、実験を行った。サンプルは、最初は、不純物の存在のためにその色が黄褐色であり、少しばかりの濁りは、沈殿の存在を示す。PEIの原液を、酢酸を用いてpH7.0とした50%のPEI−1300(Sigma)を滴定することによって調製し、水を加えて最終的なPEIの濃度を10%とした。PEIを、サンプルに加え、2%、1%、0.5%、0.025%、0.0125%、及び0.00625%の最終濃度とした。乾燥尿素を、1Mの濃度に加えた。PEIを欠くが、1Mの尿素を含む、実験対照を調製した。別の対照を、尿素の不存在下で0.05%のPEIで調製した。後者の対照において、濁度は変わらないままであった。それぞれのサンプルを0.22μmの膜を通してろ過した。それぞれのサンプルを、pH7.0で、50mMのHepesと平衡化した、ヒドロキシアパタイトのカラム(CHT type II、40μm、1mL、5×50mm、1mL/分)に適用し;pH7.0で、50mMのHepes、2MのNaClで洗浄し;初期条件に再平衡化し;pH7.0で、250mMのリン酸ナトリウムに、10カラム容量(CV)の直線勾配で溶離し;次いで、pH7.0で、500mMのリン酸塩で洗浄した。PEIだけのサンプルは、ヘテロ−凝集体の部分的な分離を示したが、洗浄工程における非常に大きいDNAピークはヘテロ−凝集体の分離が、それにもかかわらず、実質的にあったことを示した。尿素だけのサンプルは、ヘテロ−凝集体のより少ない低減、及び洗浄工程のピークにおいてより少ないDNAを示した。PEI/尿素で処理したサンプルの全てから溶離したIgMは、ただ無視してよい量だけの洗浄工程で溶離したDNAと共に、実質的に完全なヘテロ−凝集体の分離を示す、2.0より優れた280/254比を与えた。1%のPEIでの実験から回収したヒドロキシアパタイトを、分析的SECカラムに適用した。0.2%未満のHMW凝集体と、IgMを95%より高い純度であると概算し、ヘテロ−凝集体は見られなかった。回収率は98〜99%であった。この実施例は、供給材料における高いDNAレベルの存在により通常は無効化された方法によって、有効な産物回収を可能とする本発明の能力を説明する。これらの結果は、未処理のサンプルと比較して、抗体と他のタンパク質と共に元のサンプルにおける大部分のDNAをヘテロ−凝集体に含むことの重要な点を強調する。
好ましい添加の順番の測定。実験を、0.025%のPEI−1300及び1Mの尿素で処理した実施例14に記載の抗体の2分割量において行った。PEIを、一つの実験において、最初に加え、他において、尿素を最初に加えた。サンプルをろ過し、上記のとおり、ヒドロキシアパタイトカラムに適用した。尿素で最初に処理したもののIgMのピークは、ほぼ、PEIで最初に処理したもののピーク2倍の大きさであった。これらの結果は、産物回収率を最大化するための添加の順番の重要性を強調し、また、正電荷有機添加剤とタンパク質との相互作用を調整する尿素の能力を強調する。
モノリスにおけるサイズ排除クロマトグラフィによる複数の構成要素からなるIgMの精製。IgM−B07細胞培養上清のサンプルを、1%のPEI−1200及び10%のプロピレングリコールで処理した。8mLのヒドロキシルモノリス(BIA Separations)を、pH7.0で、50mMのHepes、100mMのNaCl、10mMのEDTA、10%のポリエチレングリコール6000を用いて平衡化した。処理されたIgM上清を10%のPEGで適用した;カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、3.75CV直線勾配で、pH7.0で、50mMのHepes、100mMのNaClに溶離した。未処理のサンプルを、その後、参考までに、クロマトグラフした。未処理の参考用サンプルは、ブロードな、立下りの(trailing)、薄い、混濁したピークに溶離した。処理したサンプルは、シャープな、対照的な、濃縮した、光学的に透明なピークに溶離した。分析的SECでは、処理したサンプルからのIgMが、0.1%未満のHMW凝集体と共に、95%より高い純度であることを示し、ヘテロ−凝集体は見られなかった。
クロルヘキシジンと、IgMヘテロ−凝集体の測定。ろ過したIgM85含有細胞培養上清を強力なアニオン交換多孔性粒子の樹脂(EMD TMAE)に適用し、1MのNaCl(pH7.0)に直線勾配で分画した。高いDNA容量が知られているにもかかわらず、DNAピークは、全DNAの約2%だけを表すように見えた。IgM及びDNAの間で溶離する、254nmでの高い吸収を有するピークは、DNAの残りがヘテロ−凝集体に存在していたことを示した。1Mの尿素で処理したIgM85のサンプルは(クロルヘキシジンを含まない)、小さいが、ヘテロ−凝集体の量における一定の低減と、対応するDNAピークにおける増加とを示した。クロルヘキシジンを、0.001%〜1%の範囲のレベルで、1Mの尿素サンプルに加え、処理したサンプルはアニオン交換体に適用した。ヘテロ−凝集体を分離し、DNAは0.01〜1.0%の範囲のクロルヘキシジンにおいて除去した。ヘテロ−凝集体を、低い濃度で部分的にだけ分離し、DNAの低減は最小化であった。深刻な抗体の低減を、0.5%及び1%のクロルヘキシジンで観察した。これらの結果は、クロルヘキシジンが、HMW凝集体の除去及びヘテロ−凝集体の分離に対して有効であり、その有効な範囲が、PEI−1300又はエタクリジンより高くも及び狭くもあることを示す。この実施例は、また、事前にDNAを除去してしまう本発明のためIgMの回収方法としてのアニオン交換クロマトグラフィの実施可能性を説明する。実施例14との比較は、IgMの回収方法としてのヒドロキシアパタイトの実施可能性を示した。
ウイルス及びDNAの低減。マウス白血病ウイルス(MuLV)、マウス微小ウイルス(MVM)、及びチャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞の生きたサンプルを含む細胞培養を、1%のアラントイン及び0.025%のエタクリジンで処理した。全ての実験を、生理学的な条件で行った。MuLVは1.6logで低減した。MVMは3.1logで低減した。CHO培養におけるDNAは2.1logで低減した。アラントインの不存在下で0.025%のエタクリジンで処理した並行するサンプルの種類は、効果的でなく、1.3logsでMuLVを、1.4logsでMVMを、及び1.6logsでDNAを低下させた。
Claims (69)
- 所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集を低下させる方法であって、正電荷有機添加剤及び未溶解ウレイドと、前記サンプルを接触させる工程を含む方法。
- 電気伝導率の値が15mS/cm以上での、所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集を低下させる方法であって、0.1%以下の濃度で正電荷有機添加剤を添加する工程を含む方法。
- 所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集を低下させる方法であって、前記サンプルの電気伝導率の値が5mS/cm以上であり、沈殿物の形成を減らすための1以上の有機添加剤の存在下で、0.1%以下の濃度で正電荷有機添加剤を添加する工程を含み、前記1以上の有機添加剤が、ウレイド、有機溶媒、又は界面活性剤からなる群から選択される方法。
- 所望のタンパク質を含むサンプルの内容物の凝集量を低下させる方法であって、凝集体を含有する前記サンプルを供給する工程を含み、前記所望のタンパク質が前記サンプルにおける溶液中に存在し、正電荷有機添加剤と前記サンプルを接触させる工程を含む方法。
- 前記ウレイドがアラントインである、請求項1又は3に記載の方法。
- 前記ウレイドが約0.5〜約2重量/体積%の範囲で存在する、請求項1、3、又は5に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤がエタクリジン、クロルヘキシジン、ポリエチレンイミン、メチレンブルー、及び塩化ベンザルコニウムからなる群から選択される1種を含む、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 前記ウレイドが正電荷有機添加剤の前に添加される、請求項1、5、又は6に記載の方法。
- 塩が、実質的に、前記所望のタンパク質の沈殿を防ぐためのレベルで加えられる、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
- 前記所望のタンパク質が抗体、第VIII因子、成長ホルモン、及び組み換えタンパク質からなる群から選択される1種を含む、請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤が1重量/体積%以下のレベルで加えられる、請求項1〜10の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤が0.1重量/体積%以下のレベルで加えられる、請求項1〜11の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤が0.01重量/体積%以下のレベルで加えられる、請求項1〜12の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤が0.001重量/体積%以下のレベルで加えられる、請求項1〜13の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤が、0.02%〜0.03%の濃度で存在する、請求項1〜12の何れか1項に記載の方法。
- 複数種類の正電荷有機添加剤が存在する、請求項1〜15の何れか1項に記載の方法。
- 前記複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が1重量/体積%以下である、請求項16に記載の方法。
- 前記複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が0.1重量/体積%以下である、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が0.01重量/体積%以下である、請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- 前記複数種類の正電荷有機添加剤の凝集体の濃度が0.001重量/体積%以下である、請求項16〜19の何れか1項に記載の方法。
- 前記未溶解ウレイドがアラントインである、請求項1記載の方法。
- アラントインが、約0.56重量/体積%〜約1重量/体積%の範囲の濃度で存在する、請求項1〜21の何れか1項に記載の方法。
- アラントインが、約1重量/体積%〜約2重量/体積%の範囲の濃度で存在する、請求項1〜22の何れか1項に記載の方法。
- アラントインが、約2重量/体積%〜約5重量/体積%の範囲の濃度で存在する、請求項1〜23の何れか1項に記載の方法。
- アラントインが、約5重量/体積%〜約10重量/体積%の範囲の濃度で存在する、請求項1〜24の何れか1項に記載の方法。
- アラントインが、約10重量/体積%〜約15重量/体積%の範囲の濃度で存在する、請求項1〜25の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤の添加の前に、ウレイドが前記サンプルに添加される、請求項1〜26の何れか1項に記載の方法。
- 沈殿を通して、前記所望のタンパク質の実質的な減量を抑えるために、前記サンプルの電気伝導率が十分に高いレベルに調整される、請求項1〜27の何れか1項に記載の方法。
- 前記サンプルの電気伝導率が、前記所望のタンパク質の実質的な減量を抑えるのに必要であるレベルより高いレベルに調整される、請求項1〜28の何れか1項に記載の方法。
- 前記サンプルの電気伝導率が生理学上の電気伝導率の2倍まで調整される、請求項1〜29の何れか1項に記載の方法。
- 前記サンプルの電気伝導率が生理学上の電気伝導率の3倍以上まで調整される、請求項1〜30の何れか1項に記載の方法。
- 前記サンプルの電気伝導率が、前記所望のタンパク質の実質的な減量を抑えるために十分な高さのままであるが、低減される、請求項1〜31の何れか1項に記載の方法。
- 前記正電荷有機添加剤の添加の前に、前記サンプルの電気伝導率が調整される、請求項1〜32の何れか1項に記載の方法。
- 有機溶媒が存在する、請求項1〜33の何れか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、リン酸トリ(n−ブチル)、及びグリセロールからなる群から選択される1種を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記有機溶媒が約0.01〜約20重量/体積%の範囲の濃度で含まれる、請求項34又は35に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、イソプロパノール、又はリン酸トリ(n−ブチル)を、約0.01〜約1%の範囲の濃度で含む、請求項36に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、又はイソプロパノールを、約1〜約5%の範囲の濃度で含む、請求項36に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エタノール、又はイソプロパノールを、約5〜約10%の範囲の濃度で含む、請求項36に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はグリセロールを、約10〜約20%の範囲の濃度で含む、請求項36に記載の方法。
- 有機溶媒が存在し、エタノール、イソプロパノール、及びリン酸トリ(n−ブチル)からなる群から選択される1種を含む、請求項1〜40の何れか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒の濃度が1%未満である、請求項41記載の方法。
- 前記有機溶媒の濃度が0.1%未満である、請求項41又は42に記載の方法。
- 前記有機溶媒の濃度が0.01%未満である、請求項41〜43の何れか1項に記載の方法。
- 可溶性ウレイドが存在する、請求項1〜44の何れか1項に記載の方法。
- 前記可溶性ウレイドが尿素である、請求項45に記載の方法。
- 前記可溶性ウレイドが、約0.5〜約1Mの範囲の濃度で存在する、請求項45又は46に記載の方法。
- 前記可溶性ウレイドが、約1〜約2Mの範囲の濃度で存在する、請求項45〜47の何れか1項に記載の方法。
- 前記可溶性ウレイドが、約2〜約4Mの範囲の濃度で存在する、請求項45〜48の何れか1項に記載の方法。
- 前記可溶性ウレイドが、約4〜約8Mの範囲の濃度で存在する、請求項45〜49の何れか1項に記載の方法。
- 界面活性剤が存在する、請求項1〜50の何れか1項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記非イオン性の界面活性剤が、トゥイーン(Tween)及びトリトン(Triton)からなる群から選択される1種を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記界面活性剤が双性イオンの界面活性剤を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記双性イオンの界面活性剤がCHAPS、CHAPSO、及びオクタグルコシドからなる群から選択される1種を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記界面活性剤が1%未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項51〜55の何れか1項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が0.1%未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項51〜56の何れか1項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が0.01%未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項51〜57の何れか1項に記載の方法。
- キレート剤が存在する、請求項1〜58の何れか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が正に帯電される、請求項59に記載の方法。
- 前記正に帯電したキレート剤が、トリス(2−アミノエチル)アミン又はデフェロキサミンを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記キレート剤が100mM未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項59〜61の何れか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が50mM未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項59〜62の何れか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が20mM未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項59〜63の何れか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が10mM未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項59〜64の何れか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が5mM未満の非ゼロ濃度で存在する、請求項59〜65の何れか1項に記載の方法。
- 以下:(a)有機溶媒、(b)有機ポリマー、(c)可溶性ウレイド、(d)界面活性剤、(e)キレート剤、及び(f)塩のうちの複数が存在する、請求項1〜66の何れか1項に記載の方法。
- 残りの不純物から前記所望のタンパク質を分画するための後の処理工程の前に、前記接触したサンプルが、少なくとも1つの正電荷有機添加剤を除去するために、1以上の固形物に晒される、請求項1〜67の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1〜68の何れか1項に記載の方法を実行するためのキット。
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