CN106061993A - 通过用芳基阴离子处理来降低蛋白质制剂的聚集物含量的方法 - Google Patents

通过用芳基阴离子处理来降低蛋白质制剂的聚集物含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106061993A
CN106061993A CN201480076391.3A CN201480076391A CN106061993A CN 106061993 A CN106061993 A CN 106061993A CN 201480076391 A CN201480076391 A CN 201480076391A CN 106061993 A CN106061993 A CN 106061993A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
certain embodiments
aryl anion
aryl
aggregation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480076391.3A
Other languages
English (en)
Inventor
彼得·斯坦利·加尼翁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agency for Science Technology and Research Singapore
Original Assignee
Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agency for Science Technology and Research Singapore filed Critical Agency for Science Technology and Research Singapore
Publication of CN106061993A publication Critical patent/CN106061993A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

降低具有靶蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法包括使所述制剂与芳基阴离子接触以形成混合物，和使所述混合物与至少一种正电性固体接触以去除过量的芳基阴离子。

Description

通过用芳基阴离子处理来降低蛋白质制剂的聚集物含量的 方法
背景技术
本文所公开的实施方案涉及用于增强包括抗体的蛋白质的纯化的方法。它们特别涉及用于降低聚集物的水平的方法，并且可以与细胞培养收获物澄清方法组合。它们进一步涉及这些能力与其它纯化方法的整合以实现期望的蛋白质纯度水平。
聚集物去除是蛋白质纯化的一个重要方面。已证明低浓度的黄色荧光杂环染料依沙吖啶降低抗体制剂的聚集物含量，并且这一结果可能是染色质去除的结果(Gan等，J.Chromatography A 1291(2013)33-40)。依沙吖啶具有作为蛋白质沉淀剂的悠久历史。
芳基阴离子染料甲基蓝被用于组织染色并且已被用于介导微生物燃料电池中的电子转移。甲基蓝还以名称棉蓝、甲蓝(Helvetia Blue)和酸性蓝93为人所知。该试剂尚未被用于蛋白质分级分离领域中。
发明内容
在一些方面，本文所公开的实施方案涉及降低包含靶蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法，所述方法包括使所述制剂与芳基阴离子接触以形成混合物和使所述混合物与至少一种正电性固体接触以去除过量的芳基阴离子。
具体实施方式
本文所公开的实施方案提供通过用芳基阴离子处理制剂来降低含有期望蛋白质的样品如蛋白质制剂中的聚集物的量的方法。在某些实施方案中，利用低水平的芳基阴离子来实现复合物和/或聚集物的降低。在某些实施方案中，以升高的电导率值(盐浓度)处理所述样品。在某些实施方案中，随后使处理的样品暴露于带有化学部分的固体材料，所述化学部分从所述蛋白质制剂选择性地去除芳基阴离子和聚集物。
提供用于纯化蛋白质的方法和试剂盒。在一些实施方案中，所公开的方法提供通过使此类期望的蛋白质与一种或多种芳基阴离子物种接触而从抗体或其它蛋白质制剂降低聚集物。在某些实施方案中，所公开的方法可以在所谓的生理条件到为此类条件最高达3倍或更高倍的电导率值的电导率水平范围下实施。此类升高的电导率水平可以允许将所述方法应用到酸性蛋白质，而不会有它们在处理期间发生沉淀的风险，且由此增加可以应用所公开的方法的期望蛋白质物种的多样性。在某些实施方案中，所公开的方法可以利用低浓度如0.1％到1.0％的芳基阴离子来实施。在某些实施方案中，所公开的方法提供使所述处理的蛋白质制剂与增强所述处理降低聚集物含量的总体能力的固体材料接触，所述降低聚集物含量通常与降低宿主蛋白质污染并行；并且提供去除过量芳基阴离子的额外优点。在某些实施方案中，芳基阴离子是甲基蓝。
在某些实施方案中，所公开的方法提供降低相比于期望蛋白质具有高分子量的聚集物如均质聚集物的水平，并且还提供降低流体动力学大小仅适度大于期望蛋白质的聚集物如异质聚集物的水平。在某些实施方案中，聚集物包括期望蛋白质和污染物的均质聚集物并且在某些此类实施方案中，所述污染物是核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。在某些实施方案中，基本上消除了期望蛋白质的均质聚集物的存在。在某些实施方案中，基本上消除了期望蛋白质和污染物的均质聚集物的存在。在某些实施方案中，基本上消除了不包含期望蛋白质的均质聚集物和异质聚集物的存在。
在某些实施方案中，所公开的方法另外提供污染物如DNA、内毒素和病毒水平的降低连同聚集物的降低。在某些实施方案中，所公开的方法通过另外包含除芳基阴离子自身以外的抗病毒剂来实施。
在某些实施方案中，目标蛋白质物种(例如，待纯化的期望蛋白质)是重组来源的，并且所述蛋白质制剂可以包括含细胞的细胞培养收获物、细胞培养物上清液、澄清的细胞培养物上清液、来自色谱柱的洗脱物或从前一纯化阶段获得的含蛋白质的溶液。在某些实施方案中，所述蛋白质制剂含有抗体，并且在某些此类实施方案中，所述抗体是IgG、IgM或其片段形式，或抗体或抗体片段的融合蛋白质，如Fc-融合蛋白质。在某些实施方案中，所述期望蛋白质可以是凝血蛋白质，如因子VIII。在某些实施方案中，所述期望蛋白质可以是肽激素，如人生长激素。
在某些实施方案中，实施所公开的方法以使得样品的电导率处于足够高的水平以基本上避免期望蛋白质从所述样品中沉淀出来。可以根据本领域内已知的方法通过添加盐或稀释剂来调节电导率。在某些实施方案中，所述电导率比被确定为避免期望蛋白质的显著沉淀所需的水平大5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm或20mS/cm。在某些实施方案中，所述电导率在通常被认为对应于生理电导率的范围如12-17mS/cm内。在某些实施方案中，所述电导率大于20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45ms/cm或大于45mS/cm。所述方法在升高的电导率下去除重要的污染物亚群的能力代表了所公开的方法的令人惊讶的特征之一，因为已知这些体系中的电荷相互作用在升高的电导率下会降低。在某些实施方案中，操作pH值可以是中性到微碱性的，并且仍然具有用于去除染色质的足够效力。在一些实施方案中，操作pH值可以是酸性的，如包括6或5或4的值，并且因此更低的pH值可以更有效地用于去除非组蛋白蛋白质。在此类实施方案中，它也可以用于降低电导率。
在某些实施方案中，芳基阴离子是甲基蓝。在相关的实施方案中，芳阴离子可以是除甲基蓝以外的芳基阴离子。
在某些实施方案中，所述芳基阴离子以足以促进聚集物的期望降低程度的基本上最低浓度被提供。在某些实施方案中，所述芳基阴离子的浓度可以小于(以重量/体积计)5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％。在某些实施方案中，所述芳基阴离子以0.1-1.0％、或0.2-0.8％、或0.04-0.06％的浓度被提供。
在某些实施方案中，所公开的方法可以在4-7、或4.5-6.0、或5.0到5.5、或5.1到5.3、或5.15到5.25、或中间值的操作pH值下实施。
在某些实施方案中，使所述样品另外与抗病毒剂如磷酸三(正丁基)酯接触。此类抗病毒剂可以以小于大约1％(w/v)、小于大约0.1％(w/v)、或小于大约0.01％(w/v)或小于大约0.001％的量存在。
在某些实施方案中，所述方法另外包括使所述样品与酰脲接触的步骤，所述酰脲的量足以使所述酰脲不溶于所述样品中。然后可以将含有期望蛋白质的上清液与包含沉淀污染物的剩余样品分离。在某些此类实施方案中，在使所述样品与所述芳基阴离子接触的步骤之前供应所述酰脲，在其它实施方案中，将所述酰脲基本上与使所述样品与所述芳基阴离子接触的步骤同时供应，并且在其它实施方案中，在使所述样品与所述芳基阴离子接触的步骤之后供应所述酰脲。在某些此类实施方案中，酰脲可以是以下中的任一种：尿酸、乙内酰脲(咪唑烷-2,4-二酮)、尿囊素(2,5-二氧代-4-咪唑烷基)脲、尿囊素氯羟铝、尿囊素铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲(尿囊素)、咪唑烷基脲、二咪唑烷基脲和嘌呤。在某些实施方案中，酰脲是尿囊素，并且在一些这样的情况下，尿囊素以大于0.56％(w/v)、1％、1.5％、2％或更大的浓度存在。在某些实施方案中，酰脲是尿酸，并且在一些这样的情况下，尿酸以大于0.0025％(w/v)、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、1％或更大的浓度存在。
在某些实施方案中，所述方法另外包括使所述样品与一定量的酰脲接触的步骤，在所述量下，所述酰脲完全溶解。在某些此类实施方案中，可溶性酰脲可以是脲、咪唑烷基脲或另一酰脲。在某些实施方案中，酰脲是脲，并且在一些此类情况下，脲以大于0.5M、或大于1M、或大于2M、或大于4M、或大于6M、或大于8M的浓度存在。这再次强调了所述方法令人惊讶的性质，其中避免沉淀是所述方法的特定目的。高可溶性酰脲如脲具有增加许多化合物的溶解度的一般作用，也就是说它们的存在阻碍沉淀物的形成。
在某些实施方案中，以下事实增强了所公开的方法的实用性：它们还加速细胞培养收获物中细胞碎片的沉降，并且显著降低DNA、内毒素和病毒(当存在时)的水平。实验数据表明，一些酰脲优先与聚集物、内毒素和病毒相互作用的能力促成了这些结果，并且相比于在酰脲不存在的情况下用多价阴离子进行的处理，低水平的溶解酰脲可以促成它们所支持的更高抗体回收率。在处理之后，可以通过沉降或过滤去除固体材料，留下上清液中基本上无聚集物的蛋白质。
在某些实施方案中，可以利用使所述样品与可溶性有机调节剂如非离子型有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂或酰脲接触的额外步骤来实施所公开的方法。在某些此类实施方案中，使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在使所述样品与所述芳基阴离子接触的步骤之前发生。在其它实施方案中，使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤基本上与使所述样品与所述芳基阴离子接触的步骤同时发生。在其它实施方案中，使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在使所述样品与所述芳基阴离子接触的步骤之后发生。在某些实施方案中，有机调节剂是非离子型有机聚合物，如聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇，并且在某些此类实施方案中，非离子有机聚合物具有大约1000D或更小、500D或更小，250D或更小或100D或更小的平均分子量。在某些实施方案中，有机调节剂是有机溶剂，如乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇或苯氧乙醇。在某些实施方案中，有机调节剂以大约1％(w/v)或更大的浓度被提供。在某些实施方案中，有机调节剂是表面活性剂，如吐温(Tween)、triton、CHAPS、CHAPSO或辛基葡糖苷，并且在某些此类实施方案中，表面活性剂以大约1％(w/v)或更小、大约0.1％或更小或大约0.02％(w/v)或更小的浓度被提供。在某些实施方案中，有机调节剂是以亚饱和量提供的酰脲，并且在某些此类实施方案中，酰脲是脲、乙内酰脲或尿囊素。
在某些实施方案中，所公开的方法提供用于方便实施所公开的方法的某些方法的试剂盒。此类试剂盒可以提供可用于实施所公开的方法的试剂，如一种或多种芳基阴离子、酰脲、有机调节剂、抗病毒剂和用于调节电导率的试剂。所述试剂盒可以提供适于实施用于纯化蛋白质的所公开的方法的量和浓度的材料。此类试剂盒可以适用于某些蛋白质如IgG或IgM抗体，并且可以适应于适合某些规模的蛋白质制剂和纯化的量。
在某些实施方案中，在所公开的方法之后可以使所述样品与固体材料接触，目的是所述固体具有在另外加工之前从所述样品选择性去除过量芳基阴离子或其它样品组分的效果。
在某些实施方案中，所公开的方法可以与常规的蛋白质纯化方法组合，以实现更高的纯化水平或去除其它污染物。例如，所公开的方法可以被实施以为涉及沉淀、色谱和液-液萃取法的常规纯化方法作准备。研发用于这些方法的适当条件并且将它们与本文所述的所公开方法整合以实现对产品的期望纯化，在本领域普通技术人员的能力范围内。
在某些实施方案中，操作条件可以相对于pH值和/或随着存在的螯合剂、有机聚合物或溶剂、表面活性剂、离液剂和各种盐物种而变化，以调节聚集物降低到的程度并且期望蛋白质保留于溶液中。
在一些实施方案中，提供了降低包含靶蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法，所述方法包括使所述制剂与芳基阴离子接触以形成混合物和使所述混合物与至少一种正电性固体接触以去除过量的芳基阴离子。
在一些实施方案中，本文所公开的方法进一步包括使混合物同时或依序与至少一种额外的正电性固体接触。
在一些实施方案中，本文所公开的方法进一步包括使所述混合物与过饱和的尿囊素接触。
在一些实施方案中，尿囊素以选自由以下组成的组的浓度范围存在：(a)约0.6％到约50％；(b)约1％到约10％；和(c)约1％到约2％。
在一些实施方案中，芳基阴离子是甲基蓝。
在一些实施方案中，芳基阴离子以选自由以下组成的组的浓度范围存在：(a)约0.1％到约0.5％；(b)约0.02％到约0.4％；和(c)约0.25％到约0.3％。
在一些实施方案中，操作电导率处于选自由以下组成的组的范围：(a)约0.1mS/cm到约50mS/cm；(b)约1mS/cm到约30mS/cm；和(c)约5mS/cm到约15mS/cm。
在一些实施方案中，操作pH值处于选自由以下组成的组的范围：(a)约3到约8；(b)约4到约7；(c)约5到约6；(d)约4.5到5.5；(e)约5.1到约5.3。
在一些实施方案中，所述混合物进一步包含抗病毒剂磷酸三(正丁基)酯。
在一些实施方案中，至少一种正电性固体的表面促进选自由以下组成的组的化学相互作用：静电相互作用、疏水相互作用、氢键合和金属亲和。
在一些实施方案中，至少一种正电性固体是颗粒物。
在一些实施方案中，靶蛋白质包括选自由重组蛋白质、抗体、生长激素和凝血因子组成的组中的一种。
在一些实施方案中，所述制剂是选自由以下组成的组中的一种：含细胞的细胞培养收获物、基本上无细胞的细胞培养收获物和部分纯化的蛋白质。
在一些实施方案中，提供用于方便实施本文所公开的方法的试剂盒。此类试剂盒可以包括用于实施所述方法的一种或多种必要试剂以及用于实施所述方法的说明书。
对术语进行了定义，使得可以更容易地理解所公开的方法。另外的定义在整个具体实施方式中有陈述。
“聚集物”是指在生理条件下稳定并且可在较广的pH值范围和电导率条件下保持稳定的两个或更多个分子的缔合物。聚集物通常包含至少一个生物分子如蛋白质、核酸或脂质和另一分子或金属离子。缔合可以通过任何类型或任何组合的化学相互作用发生。抗体的聚集物可以分为两个类别：“均质聚合物”是指两种或更多种相同组成的蛋白质的稳定缔合物；“异质聚集物”是指一种或多种相同或不同组成的蛋白质任选地与一种或多种非蛋白质分子的稳定缔合物。所述非蛋白质组分可以由来自由以下组成的组的一种或多种实体组成：核苷酸、内毒素、金属离子、脂质或细胞培养基组分。
“抗体”是指免疫球蛋白质、其复合形式或片段形式。该术语可以包括但不限于源于人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。“抗体”还可以包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白质部分的融合蛋白质。“抗体”还可以包括抗体片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组分，不论它们是否保留抗原结合功能。
“内毒素”是指存在于革兰氏阴性细菌的外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、热稳定性的脂多糖物质。
“非离子型有机聚合物”是指由连接的缺少带电荷基团的重复有机亚基构成的天然存在的或合成的碳氢化合物。它可为直链的，具有一些支链的主要直链的，或主要支链的。适于实施所公开的方法的示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH2-CH2-O)n-H。示例包括但不限于平均聚合物分子量范围为小于100道尔顿到超过1000道尔顿的组合物。
“芳基阴离子”是指由至少一个环、至少一个负电荷、净负电荷和任选不存在的正电荷组成的有机结构。例如，芳基阴离子可以不带正电荷。如果芳基阴离子带有正电荷，则它可以带有至少两个负电荷。如果它带有两个正电荷，则它可以带有至少3个负电荷等等。
“有机溶剂”是指以液体状态存在的天然存在的或合成的有机化合物。适于实施所公开的方法的示例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。
“有机聚合物”是指天然存在的有机单体的合成聚合物。示例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖或纤维素等。
“多核苷酸”是指由链中共价键结的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的示例。
“蛋白质”是指含有碳、氢、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肽键连接的氨基酸链构成的复杂有机大分子群中的任一种。蛋白质可以是天然或重组来源的。可用非氨基酸部分对蛋白质进行修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与其它化学部分缀合来修饰。蛋白质的示例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。
“不溶酰脲”是指在特定蛋白质制剂通常所用的条件下，含有超过其最大溶解度的量的酰脲的溶液。在某些实施方案中，所公开的方法提供了这样的具有酰脲的样品，在该样品的条件下，酰脲存在的量大于该酰脲在该样品中的溶解度，使得该酰脲的一些部分在该样品中以不溶形式存在。
“表面活性剂”包括例如通常包含疏水部分和亲水部分、使得它们被称为两亲性的的一类有机分子的“表面活性的试剂”。在水溶液中足够浓度下，表面活性剂可自缔合成簇，其疏水部分集中于中心以将与水的接触最小化，并且其亲水部分向外辐射以将与水的接触最大化。在生物制剂、特别是含有具疏水特性或具疏水特性区域的材料的那些生物制剂的存在下，表面活性剂的疏水部分倾向于与疏水物质的一些部分自发缔合，并通过表面活性剂的亲水部分的影响增加它们的溶解度。它们还可用于调节均溶解于水性溶剂中的不同疏水材料之间发生的疏水相互作用。适于实施所公开的方法的某些实施方案的表面活性剂的示例包括但不限于非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯表面活性剂(例如，吐温20、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯和吐温80、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和Triton(例如，聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)；以及两性离子型表面活性剂，例如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐)和辛基葡糖苷(例如，(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基环氧乙烷-3,4,5-三醇)。
“病毒”或“病毒粒子”是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的超显微的(直径大约为20nm到300nm)、代谢惰性的感染原：其由RNA或DNA核、蛋白质外壳和在更复杂的类型中包绕的包膜(surrounding envelope)构成。
在用于某些实施方案中的芳基阴离子的评价过程中，可以对应用条件研究如下。在某些实施方案中，芳基阴离子的使用对可以用于实施所述方法的条件潜在地构成一些限制。例如，可能期望采用显著阻止芳基阴离子与目标蛋白质之间的强相互作用的条件。获得此类条件的近似值的简单方法是将目标蛋白质应用于阴离子交换剂并且将其在盐梯度中洗脱。正好高于蛋白质洗脱的阀值的盐浓度大致鉴别可以最有效实施所述方法的最低电导率。该浓度将受pH值影响，pH值可以通过相同手段建模。假定将所述方法应用到细胞培养物上清液，则IgG抗体可以采用添加盐或改变pH值以避免显著损失。IgM抗体和非抗体蛋白质可以采用添加更高浓度的盐，甚至足以产生接近30mS/cm的电导率值(比生理电导率高约2倍)。
在某些实施方案中，一种评价用于含有IgG单克隆抗体的澄清的细胞培养物上清液的条件的有效手段是覆盖0.3％到0.7％芳基阴离子的范围，以及一半生理电导率到2倍生理电导率范围的电导率。如果结果表明这样做可能有益，则所述范围可以进一步被扩大，或缩小并以更精细的增量加以评价。
在某些实施方案中，用于研发根据用于澄清的细胞培养物上清液的所公开的方法的纯化程序的方便起点是使用0.1％甲基蓝。
在某些实施方案中，以在添加芳基阴离子之前将有机调节剂分散于蛋白质制剂中开始可以是有利的，因为所述实践可以提高抗体回收率。在添加芳基阴离子之前进行长期孵育似乎是不必要的；15分钟或更少是足够的，虽然更长孵育时间似乎没有缺点。实验数据总体上表明添加约1％的过饱和量的尿囊素增加IgG的回收率。
在某些实施方案中，建议在将芳基阴离子添加到样品中之前将它溶解于例如水或缓冲液中，以促进它们快速分布于整个蛋白质制剂中。应当例如通过将溶解的芳基阴离子逐渐注入到充分混合的悬浮液中来小心避免持久的局部过量。孵育时间应当为至少15分钟，较佳为60-120分钟，但似乎不会显著受益于大于120分钟的持续时间。
所述方法通常可以在环境温度下实施，但可以在更高或更低的温度(例如4℃到37℃范围)下进行。实验数据表明所述温度基本上不改变所得结果，这将使蛋白质的稳定性要求成为选择操作温度的重要因素。
在某些实施方案中，在将芳基阴离子添加到样品中之前，将其溶解或分散于例如水或缓冲液中，并且对pH值进行调节。这是因为芳基阴离子的某些制剂如游离酸形式是酸性的并且具有基本上以意外方式改变实验条件的潜力。
在涉及使用超饱和酰脲和芳基阴离子两者的某些实施方案中，以在添加芳基阴离子之前将酰脲分散于蛋白质制剂中开始通常可以是有利的，因为利用酰脲尿囊素的经历表明该实践可以提高抗体回收率。在添加芳基阴离子之前进行长期孵育似乎是不必要的；15分钟或更少是足够的，虽然更长孵育时间似乎没有缺点。
无论是在方法研发还是在制造期间，对于监测通过所述方法实现的聚集物离解或去除都存在多种选择。最简单的是在具有合适的选择性的柱上进行分析尺寸排阻色谱并且在280nm的UV波长下监测。这可以揭示HMW(高分子量)聚集物，因为它们通常体现合理地符合非聚集产物的大小的倍数的流体动力学尺寸。异质聚集物通常被该方法忽略，因为它们的流体动力学尺寸可能仅仅略大于非聚集产物的尺寸。在此类情况下，所述聚集物的异形组成可以通过以下方式来揭示：计算254nm下的UV吸光度与280nm下的吸光度的比率，然后比较该值与被认为完全不含相关污染物的纯化蛋白质的吸光度比率。含有例如DNA的异质聚集物将通过254/280的升高比率来揭示。
在某些实施方案中，所公开的方法可以在随后纯化之前与去除芳基阴离子和样品的潜在其它组分的处理整合。此类处理可以包括使样品暴露于带有性质与芳基阴离子的特征互补的化学部分的固体，目标在于它们将来自所述样品的剩余部分的芳基阴离子螯合。由于芳基阴离子被理解为带负电荷和疏水的，因而断定带正电荷的表面(包括带正电荷的疏水表面)应当尤其可用于螯合过量的芳基阴离子。可以包括另一表面组成的固体以螯合样品的其它组分。
在某些实施方案中，所公开的方法可以与一种或多种纯化方法整合，所述纯化方法包括但不限于蛋白A和其它形式的生物亲和色谱、阴离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、羟磷灰石或其它混合模式的色谱、和/或非色谱方法如沉淀和液-液萃取。研发用于各种方法的适当条件并且将它们与本文所公开的方法整合以实现特定抗体的必要纯化，在本领域普通技术人员的能力范围内。
实施例
实施例1.进行实验以确定在pH 5.2和生理电导率下甲基蓝的动态范围。样品是含有约1g/L IgG抗体、310,010ppm宿主蛋白质和10.5％聚集物的细胞培养收获物。在单独的实验中，将甲基蓝添加到0.01％、0.05％、0.1％和0.5％的最终量。将混合物孵育2小时，并且抽取样品用于分析。抗体回收率是106％、62％、21％和0％。宿主蛋白质含量是239,175ppm、246,497ppm、714,356ppm、0ppm。聚集物含量是8.6％、4.4％、14.6％、21.8％。在更高甲基蓝浓度下宿主蛋白质和聚集物的增加被判断为反映了IgG的损失。
实施例2.来自实施例1的4个处理样品进一步通过暴露于5％v/v的量的呈TREN40high(Bio-Works)形式的正电性金属亲和粒子而被处理。经过2个步骤(实施例1处理+实施例2处理)的IgG的回收率是90％、91％、87％、0％。聚集物降低到小于1％、小于2％、小于2％和不可测量(未检测到)。宿主蛋白质降低到约140,000ppm、约177,000ppm、约60,000ppm和不可测量的数量(未检测到)。这些结果是料想不到的，因为回收率值由于粒子接触步骤而大多增加，并且因为它们揭示了令人惊讶的协同效应。
实施例3.通过将尿囊素添加到1％的浓度来处理含IgG的细胞培养物，然后将pH值降低到5.2，并且将甲基蓝添加到0.1％的最终量。将混合物孵育2小时，然后如实施例3中所述将TREN粒子添加到5％v/v的最终量，并且再混合孵育4小时。通过离心去除固体，将pH值滴定到7，并且使所述液体通过PC1正电性深度过滤器(Sartorius)。IgG回收率是84％。聚集物从最初的13.4％降低到0.4％。宿主蛋白质从最初的234,557ppm降低到47,746ppm。
本领域普通技术人员应当理解如何将实验结果如上述实施例中所述的那些按比例放大或按比例缩小到满足它们的特定要求所需的任何体积。
本文所引用的所有参考文献均以引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的以引用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明公开的方法试图获得的所需性能而改变。
如对本领域技术人员将显而易见的是，可进行本公开的方法的许多更改和变化，而不脱离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，而不意在以任何方式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，所公开的方法的真正范围和精神由所附权利要求书指明。

Claims (14)

1.一种降低包含靶蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法，所述方法包括：
使所述制剂与芳基阴离子接触以形成混合物；和
使所述混合物与至少一种正电性固体接触以去除过量的芳基阴离子。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述混合物同时或依序与至少一种额外的正电性固体接触。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述混合物与过饱和的尿囊素接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中尿囊素以选自由以下组成的组的浓度范围存在：(a)约0.6％到约50％；(b)约1％到约10％；和(c)约1％到约2％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述芳基阴离子是甲基蓝。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述芳基阴离子以选自由以下组成的组的浓度范围存在：(a)约0.1％到约0.5％；(b)约0.02％到约0.4％；和(c)约0.25％到约0.3％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中操作电导率处于选自由以下组成的组的范围：(a)约0.1mS/cm到约50mS/cm；(b)约1mS/cm到约30mS/cm；和(c)约5mS/cm到约15mS/cm。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中操作pH值处于选自由以下组成的组的范围：(a)约3到约8；(b)约4到约7；(c)约5到约6；(d)约4.5到5.5；(e)约5.1到约5.3。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含抗病毒剂磷酸三(正丁基)酯。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种正电性固体的表面促进选自由以下组成的组的化学相互作用：静电相互作用、疏水相互作用、氢键合和金属亲和。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述至少一种正电性固体是颗粒物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白质包括选自由重组蛋白质、抗体、生长激素和凝血因子组成的组中的一种。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述制剂是选自由以下组成的组中的一种：含细胞的细胞培养收获物、基本上无细胞的细胞培养收获物和部分纯化的蛋白质。
14.一种供方便实施根据权利要求1-13中任一项所述的方法的试剂盒。
CN201480076391.3A 2014-02-27 2014-02-27 通过用芳基阴离子处理来降低蛋白质制剂的聚集物含量的方法 Pending CN106061993A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/SG2014/000085 WO2015130221A1 (en) 2014-02-27 2014-02-27 Methods for reducing aggregate content of protein preparations by treatment with aryl anions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106061993A true CN106061993A (zh) 2016-10-26

Family

ID=54009417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480076391.3A Pending CN106061993A (zh) 2014-02-27 2014-02-27 通过用芳基阴离子处理来降低蛋白质制剂的聚集物含量的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10329322B2 (zh)
EP (1) EP3116892A4 (zh)
JP (1) JP6403790B2 (zh)
KR (1) KR20160117628A (zh)
CN (1) CN106061993A (zh)
SG (1) SG11201607012TA (zh)
WO (1) WO2015130221A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014133458A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Agency For Science, Technology And Research Protein purification in the presence of nonionic organic polymers and electropositive surfaces
US10253063B2 (en) * 2013-02-28 2019-04-09 Agency For Science, Technology And Research Protein purification in the presence of nonionic organic polymers at elevated conductivity

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013180648A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Agency For Science, Technology And Research Methods for use of mixed multifunctional surfaces for reducing aggregate content in protein preparations
WO2013180650A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Agency For Science, Technology And Research Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283339A (en) * 1988-11-23 1994-02-01 California Institute Of Technology Immobilized metal aqueous two-phase extraction and precipitation
DE19544297A1 (de) * 1995-11-28 1997-06-05 Behringwerke Ag Verfahren zur Entfernung von aromatischen Verbindungen aus produkthaltigen Lösungen
CN103717284B (zh) * 2011-06-08 2016-02-24 新加坡科技研究局 通过约束共水合色谱纯化生物制品

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013180648A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Agency For Science, Technology And Research Methods for use of mixed multifunctional surfaces for reducing aggregate content in protein preparations
WO2013180650A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Agency For Science, Technology And Research Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAN H T等: "Characterization and removal of aggregates formed by nonspecific interaction of IgM monoclonal antibodies with chromatin catabolites during cell culture production", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
MCDONALD P等: "Selective antibody precipitation using polyelectrolytes: A novel approach to the purification of monoclonal antibodies", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
QIAN Y等: "Glucocorticoid receptor-mediated reduction of IgG-fusion protein aggregation in Chinese hamster ovary cells", 《BIOTECHNOLOGY PROGRESS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10329322B2 (en) 2019-06-25
EP3116892A4 (en) 2017-11-22
SG11201607012TA (en) 2016-09-29
EP3116892A1 (en) 2017-01-18
KR20160117628A (ko) 2016-10-10
WO2015130221A1 (en) 2015-09-03
JP6403790B2 (ja) 2018-10-10
JP2017507940A (ja) 2017-03-23
US20160362447A1 (en) 2016-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6491277B2 (ja) 正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法
US9988418B2 (en) Methods for reducing aggregate levels in protein preparations by treatment with thio-heterocyclic cations
US9695216B2 (en) Materials and methods for removing endotoxins from protein preparations
US10253063B2 (en) Protein purification in the presence of nonionic organic polymers at elevated conductivity
US10112971B2 (en) Protein purification in the presence of nonionic organic polymers and electropositive surfaces
US9920125B2 (en) Methods for use of mixed multifunctional surfaces for reducing aggregate content in protein preparations
CN106061993A (zh) 通过用芳基阴离子处理来降低蛋白质制剂的聚集物含量的方法
CN106061992A (zh) 通过用烷基阳离子处理来降低蛋白质制剂中的染色质含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161026