JP2017207567A - 観察装置および方法並びに観察装置制御プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】観察域毎のオートフォーカス制御を高速化し、観察域の走査時間を短縮可能な観察装置および方法並びに観察制御プログラムを提供する。【解決手段】ステージ５１と、対物レンズを有する結像光学系１４と、培養容器５０の鉛直方向の位置を検出する変位センサ１８ａ，１８ｂを有する検出部１８と、培養容器５０の鉛直方向の位置に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御して対物レンズを光軸方向に移動させる結像光学系制御部２１と、ステージ５１を、主走査方向および副走査方向に移動させ、かつ主走査方向について往復移動させる水平方向駆動部１７とを備え、検出部１８が、培養容器５０に対する結像光学系１４の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置において培養容器５０の鉛直方向の位置を検出し、かつ主走査方向の移動方向の変更に応じて使用する変位センサを切り替える。【選択図】図１

Description

本発明は、観察対象が収容された容器が設置されたステージと観察対象の像を結像させる結像光学系とを相対的に移動させることによって、観察対象全体の像を観察する観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムに関するものである。

従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを判定する方法が提案されている。

ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。

一方、上述したように細胞を顕微鏡で撮像する際、高倍率な広視野画像を取得するため、たとえばウェルプレートなどの培養容器の範囲内を結像光学系の観察域によって走査し、観察域毎の画像を撮像した後、その観察域毎の画像を結合する、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている。

特開２０１１−８１２１１号公報

ここで、上述したような観察域毎の画像を撮像する際、培養容器の底面に結像光学系の焦点位置を合わせることが多いが、培養容器の底部の厚さには、ミリオーダーでの製造公差があり、高倍率な撮影を行う場合には、観察域毎に焦点位置を合わせる必要がある。一方、細胞の撮影時間は短い方が望ましく、高速撮影可能な装置が望まれている。

しかしながら、従来のオートフォーカス制御方法では、観察域毎に２秒程度の時間を要し、たとえば観察域の数が３００である場合には、オートフォーカス制御に要する時間だけで１００分かかることになり、高速撮影が不可能であった。

特許文献１においては、撮影時間を短縮するため、ある観察域の画像を撮像している時点において、その観察域に隣接する領域で焦点位置を先行して計測しておき、その前持って計測された焦点位置を用いてフォーカス制御を行って画像の撮像を行う方法が提案されている。

しかしながら、特許文献１においては、焦点位置を計測する際、やはり従来のオートフォーカス制御の場合と同様に、上記観察域に隣接する領域の画像を撮像し、その画像のコントラストに基づいて焦点位置を計測しているため、演算処理に時間がかかってしまう。したがって、ステージを高速に移動させた場合には、観察域が計測位置に到達した時点において演算処理およびその演算処理結果に基づくオートフォーカス制御が間に合わない可能性がある。

また、特許文献１では、観察域を一方向のみに走査する方法しか提案されておらず、このように一方向のみの走査では、走査時間が非常に長くなってしまう。

本発明は、上記の問題に鑑み、観察域毎のオートフォーカス制御を高速化することができ、これにより全ての範囲の観察域の走査時間を短縮することができる観察装置および方法並びに観察制御プログラムを提供することを目的とする。

本発明の観察装置は、観察対象が収容された容器が設置されるステージと、容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系と、対物レンズを光軸方向に移動させる結像光学系駆動部と、ステージに設置された容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有する検出部と、検出部によって検出された容器の鉛直方向の位置に基づいて、結像光学系駆動部を制御する結像光学系制御部と、ステージおよび結像光学系の少なくとも一方を、水平面内の主走査方向および主走査方向に直交する副走査方向に移動させ、かつ上記少なくとも一方を主走査方向について往復移動させる水平方向駆動部と、水平方向駆動部を制御する走査制御部とを備え、検出部が、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置において容器の鉛直方向の位置を検出し、かつ主走査方向の移動方向の変更に応じて、変位センサの主走査方向の位置または使用する変位センサを切り替える。

また、上記本発明の観察装置において、検出部は、対物レンズを挟んで主走査方向について並べて設けられた少なくとも２つの変位センサを有し、主走査方向の移動方向の変更に応じて、使用する変位センサを切り替えることができる。

また、上記本発明の観察装置において、検出部は、対物レンズを挟んで主走査方向について一方の側と他方の側とに変位センサを移動可能な変位センサ移動機構を有し、主走査方向の移動方向の変更に応じて、変位センサの位置を上記一方の側から上記他方の側に移動することができる。

また、上記本発明の観察装置において、変位センサ移動機構は、変位センサを上記一方の側から上記他方の側まで案内するガイド機構を備えることができる。

また、上記本発明の観察装置において、結像光学系制御部は、検出部によって容器の鉛直方向の位置が検出された後、予め設定された時間が経過した時点において結像光学系駆動部を制御して対物レンズを光軸方向に移動させることができる。

また、上記本発明の観察装置において、結像光学系制御部は、検出部によって容器の鉛直方向の位置が検出された後、その検出位置に結像光学系の観察域が到達した時点または検出位置に結像光学系の観察域が到達する直前において結像光学系駆動部を制御して対物レンズを光軸方向に移動させることができる。

また、上記本発明の観察装置において、結像光学系制御部は、走査制御部によってステージおよび結像光学系の少なくとも一方の移動速度が変更された場合、その変更後の移動速度に応じて、予め設定された時間を変更することができる。

また、上記本発明の観察装置においては、容器の範囲の主走査方向の両側に、ステージおよび結像光学系の少なくとも一方の主走査方向への移動の加減速域を設定し、その加減速域の主走査方向の幅と結像光学系と変位センサとの主走査方向の間隔とを同じにすることが望ましい。

また、上記本発明の観察装置においては、結像光学系、結像光学系駆動部および変位センサを一体的に鉛直方向に移動させる鉛直方向移動機構を備えることができる。

また、上記本発明の観察装置において、結像光学系駆動部は、圧電素子を備え、その圧電素子を用いて対物レンズを光軸方向に移動させることができる。

また、上記本発明の観察装置においては、変位センサとして、レーザ変位センサを用いることができる。

本発明の観察方法は、観察対象が収容された容器が設置されるステージおよび容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を主走査方向および主走査方向に直交する副走査方向に移動させ、かつ上記少なくとも一方を主走査方向について往復移動させる観察方法において、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置における容器の鉛直方向の位置を、少なくとも１つの変位センサを用いて検出し、その検出した容器の鉛直方向の位置に基づいて、対物レンズを光軸方向に移動させ、かつ主走査方向の移動方向の変更に応じて、変位センサの主走査方向の位置または使用する変位センサを切り替える。

本発明の観察装置制御プログラムは、観察対象が収容された容器が設置されるステージおよび容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を主走査方向および主走査方向に直交する副走査方向に移動させ、かつ上記少なくとも一方を主走査方向について往復移動させる手順をコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムにおいて、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置における容器の鉛直方向の位置を、少なくとも１つの変位センサを用いて検出する手順と、その検出した容器の鉛直方向の位置に基づいて、対物レンズを光軸方向に移動させる手順と、かつ主走査方向の移動方向の変更に応じて、変位センサの主走査方向の位置または使用する変位センサを切り替える手順とをコンピュータに実行させることを特徴とする。

本発明の観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムによれば、容器が設置されるステージおよび容器内の観察対象の像を結像させる結像光学系の少なくとも一方を主走査方向および副走査方向に移動させ、かつ上記少なくとも一方を主走査方向について往復移動させる。このように、主走査方向についてステージまたは結像光学系を往復移動させて結像光学系の観察域を走査することによって、上述した特許文献１のような一方向にのみステージを移動させて観察域を走査する場合と比較すると、観察域の走査時間を短縮することができる。

さらに、本発明では、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置における容器の鉛直方向の位置を、少なくとも１つの変位センサを用いて検出し、その検出した容器の鉛直方向の位置に基づいて、対物レンズを光軸方向に移動させることによってオートフォーカス制御を行うようにしたので、特許文献１のように撮像された画像のコントラストに基づいてオートフォーカス制御を行う場合と比較すると、高速にオートフォーカス制御を行うことができる。

さらに、本発明では、主走査方向の移動方向の変更に応じて、変位センサの主走査方向の位置または使用する変位センサを切り替えるようにしたので、観察域を往復移動させて走査する場合においても、常に、画像の撮像に先行して容器の位置の検出を行うことができる。

本発明の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示す図 結像光学系の構成を示す模式図 ステージの構成を示す斜視図 本発明の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 培養容器内における観察域の走査位置を示す図 培養容器内の任意の位置に観察域がある場合における結像光学系、第１の変位センサおよび第２の変位センサと、培養容器との位置関係を示す図 第１の変位センサと第２の変位センサとの切り替えを説明するための図 オートフォーカス制御のタイミングの一例を説明するための図 本発明の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの作用を説明するためのフローチャート 本発明の観察装置の第２の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 本発明の観察装置の第２の実施形態の検出部の構成を示す図 本発明の観察装置の第２の実施形態の検出部における変位センサの位置の切り替えを説明するための図 本発明の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムに対して鉛直方向移動機構を設けた例を示す図 本発明の観察装置の第２の実施形態を用いた顕微鏡観察システムに対して鉛直方向移動機構を設けた例を示す図

以下、本発明の観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムの第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡観察システムにおける顕微鏡装置１０の概略構成を示すブロック図である。

顕微鏡装置１０は、観察対象である培養された細胞の位相差画像を撮像するものである。具体的には、顕微鏡装置１０は、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１と、コンデンサレンズ１２と、スリット板１３と、結像光学系１４と、結像光学系駆動部１５と、撮像素子１６と、検出部１８とを備えている。

スリット板１３は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌが形成される。

図２は、結像光学系１４の詳細な構成を示す図である。結像光学系１４は、図２に示すように、位相差レンズ１４ａおよび結像レンズ１４ｄを備えている。そして、位相差レンズ１４ａは、対物レンズ１４ｂおよび位相板１４ｃを備えている。位相板１４ｃは、照明光Ｌの波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１３のスリットの大きさは、位相板１４ｃの位相リングと共役な関係にある。

位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、観察対象によって回折された回折光は大部分が位相板１４ｃの透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。

対物レンズ１４ｂを有する位相差レンズ１４ａは、図１に示す結像光学系駆動部１５によって対物レンズ１４ｂの光軸方向に移動するものである。なお、本実施形態においては、対物レンズ１４ｂと光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。位相差レンズ１４ａのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像素子１６によって撮像される位相差画像のコントラストが調整される。

また、位相差レンズ１４ａの倍率を変更可能な構成としてもよい。具体的には、異なる倍率を有する位相差レンズ１４ａまたは結像光学系１４を交換可能に構成するようにしてもよい。位相差レンズ１４ａまたは結像光学系１４の交換は、自動的に行うようにしてもよいし、ユーザが手動で行うようにしてもよい。

結像光学系駆動部１５は、たとえば圧電素子のようなアクチュエータを備えたものであり、後述する結像光学系制御部２１から出力された制御信号に基づいて駆動するものである。なお、結像光学系駆動部１５は、位相差レンズ１４ａを通過した位相差画像をそのまま通過させる構成となっている。また、結像光学系駆動部１５の構成は圧電素子に限らず、位相差レンズ１４ａをＺ方向に移動可能なものであればよく、その他の公知な構成を用いることができる。

結像レンズ１４ｄは、位相差レンズ１４ａおよび結像光学系駆動部１５を通過した位相差画像が入射され、これを撮像素子１６に結像するものである。

撮像素子１６は、結像レンズ１４ｄによって結像された位相差画像を撮像するものである。撮像素子１６としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。

検出部１８は、ステージ５１に設置された培養容器５０のＺ方向（鉛直方向）の位置を検出するものである。検出部１８は、具体的には、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを備えたものである。第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂは、位相差レンズ１４ａを挟んで、図１に示すＸ方向に並べて設けられている。本実施形態における第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂはレーザ変位計であり、培養容器５０にレーザ光を照射し、その反射光を検出することによって、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出するものである。なお、培養容器５０の底面とは、培養容器５０の底部と観察対象である細胞との境界面であり、すなわち観察対象設置面である。

検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報は、結像光学系制御部２１に出力され、結像光学系制御部２１は、入力された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。なお、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによる培養容器５０の位置の検出および結像光学系制御部２１によるオートオートフォーカス制御については、後で詳述する。

スリット板１３と位相差レンズ１４ａおよび検出部１８との間には、ステージ５１が設けられている。ステージ５１上には、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が設置される。

培養容器５０としては、シャーレ、ディッシュまたはウェルプレートなどを用いることができる。また、培養容器５０に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。

ステージ５１は、後述する水平方向駆動部１７（図４参照）によって互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動するものである。Ｘ方向およびＹ方向は、Ｚ方向に直交する方向であり、水平面内において互いに直交する方向である。本実施形態においては、Ｘ方向を主走査方向とし、Ｙ方向を副走査方向とする。

図３は、ステージ５１の一例を示す図である。ステージ５１の中央には、矩形の開口５１ａが形成されている。この開口５１ａを形成する部材の上に培養容器５０が設置され、培養容器５０内の細胞の位相差画像が開口５１ａを通過するように構成されている。

次に、顕微鏡装置１０を制御する顕微鏡制御装置２０の構成について説明する。図４は、本実施形態の顕微鏡観察システムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡装置１０については、顕微鏡制御装置２０の各部により制御される一部の構成のブロック図を示している。

顕微鏡制御装置２０は、顕微鏡装置１０全体を制御するものであり、特に、結像光学系制御部２１、走査制御部２２および表示制御部２３を備えたものである。

顕微鏡制御装置２０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えたコンピュータから構成されるものであり、ハードディスクに本発明の観察装置制御プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、この観察装置制御プログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図４に示す結像光学系制御部２１、走査制御部２２および表示制御部２３が機能する。

結像光学系制御部２１は、上述したように検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御するものである。そして、結像光学系駆動部１５の駆動によって結像光学系１４の対物レンズ１４ｂが光軸方向に移動し、オートフォーカス制御が行われる。

走査制御部２２は、水平方向駆動部１７を駆動制御し、これによりステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させるものである。水平方向駆動部１７は、圧電素子などを有するアクチュエータから構成されるものである。

以下、走査制御部２２によるステージ５１の移動制御および結像光学系制御部２１によるオートフォーカス制御について、詳細に説明する。

本実施形態においては、走査制御部２２による制御によってステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させ、結像光学系１４の観察域を培養容器５０内において２次元状に走査し、各観察域の位相差画像を撮像する。図５は、培養容器５０内における観察域の走査位置を実線Ｍで示した図である。なお、本実施形態においては、培養容器５０として６つのウェルＷを有するウェルプレートを用いる。

図５に示すように、結像光学系１４の観察域は、走査開始点Ｓから走査終了点Ｅまで実線Ｍに沿って移動する。すなわち、観察域は、Ｘ方向の正方向（図５の右方向）に走査された後、Ｙ方向（図５の下方向）に移動し、逆の負方向（図５の左方向）に走査される。次いで、観察域は、再びＹ方向に移動し、再び正方向に走査される。このように、観察域は、Ｘ方向についての往復移動とＹ方向への移動を繰り返し行うことによって、培養容器５０内を２次元状に走査される。

図６および図７は、培養容器５０内の任意の位置に観察域Ｒがある場合における結像光学系１４、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂと、培養容器５０との位置関係を示した図である。

本実施形態においては、図６および図７に示すように、第１の変位センサ１８ａと第２の変位センサ１８ｂが結像光学系１４を挟んでＸ方向に並べて設けられている。そして、結像光学系１４の観察域Ｒは、上述したように培養容器５０内を２次元状に走査されるが、この際、培養容器５０に対する結像光学系１４の観察域Ｒの位置よりも観察域Ｒの移動方向前側の位置において培養容器５０のＺ方向の位置が検出される。具体的には、観察域Ｒが、図６に示す矢印方向（図６の右方向）に移動している場合には、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂのうち、観察域Ｒの移動方向前側の第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出される。そして、観察域Ｒが、図６に示す位置から第１の変位センサ１８ａの位置まで移動した場合に、前もって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報が用いられてオートフォーカス制御が行われ、位相差画像の撮像が行われる。

一方、観察域Ｒが、図７の矢印方向（図７の左方向）に移動している場合には、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂのうち、観察域Ｒの移動方向前側の第２の変位センサ１８ｂによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出される。そして、観察域Ｒが、図７に示す位置から第２の変位センサ１８ｂの位置まで移動した場合に、前もって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報が用いられてオートフォーカス制御が行われ、位相差画像の撮像が行われる。

このように第１の変位センサ１８ａを用いた培養容器５０の検出と第２の変位センサ１８ｂを用いた培養容器５０の検出とを観察域Ｒの移動方向に応じて切り替えることによって、常に、観察域Ｒの位相差画像の撮像に先行して、その観察域Ｒの位置における培養容器５０のＺ方向の位置情報を取得することができる。

そして、結像光学系制御部２１は、上述したように先行して検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を駆動制御することによって、オートフォーカス制御を行う。具体的には、結像光学系制御部２１には、培養容器５０のＺ方向の位置情報と結像光学系１４の光軸方向の移動量との関係が予め設定されている。結像光学系制御部２１は、入力された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系１４の光軸方向の移動量を求め、その移動量に応じた制御信号を結像光学系駆動部１５に出力する。結像光学系駆動部１５は、入力された制御信号に基づいて駆動し、これにより結像光学系１４（対物レンズ１４ｂ）が光軸方向に移動し、培養容器５０のＺ方向の位置に応じたフォーカス調整が行われる。

本実施形態においては、上述したように各観察域Ｒについてそれぞれ前もって培養容器５０のＺ方向の位置が検出されるため、各観察域Ｒの培養容器５０の位置の検出タイミングと、位相差画像の撮像タイミングが時間的にずれる。したがって、結像光学系１４（対物レンズ１４ｂ）のＺ方向の移動、すなわちオートフォーカス制御は、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって培養容器５０の位置の検出が行われた後、その検出位置に観察域Ｒが到達するまでの間に行われる。

ここで、オートフォーカス制御のタイミングが早すぎる場合には、オートフォーカス制御の後、観察域Ｒが検出位置に到達するまでの間に、何らかの要因によって、培養容器５０のＺ方向の位置がずれる可能性があり、フォーカス位置がずれる可能性がある。

したがって、オートフォーカス制御のタイミングは、観察域Ｒが検出位置に到達する直前であって、かつその検出位置における位相差画像の撮像が間に合うタイミングであることが望ましい。なお、観察域Ｒが検出位置に到達する直前とは、たとえば図８に示すように、観察域ＲがＸ方向に順次移動し、検出部１８による検出位置が、斜線で示すＰｄの位置である場合には、観察域Ｒが、検出位置Ｐｄに隣接する観察域Ｒの位置Ｐｒを通過した時点から検出位置Ｐｄに到達するまでの間であることが望ましい。なお、観察域Ｒが検出位置Ｐｄに到達した時点でオートフォーカス制御を行うようにしてもよい。

本実施形態においては、オートフォーカス制御のタイミングが、上述したような望ましいタイミングとなるように、第１または第２の変位センサ１８ａ，１８ｂによる検出タイミングからその検出位置の位置情報を用いたオートフォーカス制御のタイミングまでの時間が予め設定されている。

なお、たとえば位相差レンズ１４ａの倍率の変更などによってステージ５１の移動速度が変更された場合には、そのステージ５１の移動速度の変更に応じて上記の予め設定された時間を変更するようにしてもよい。または、上記時間を変更する代わりに、ステージ５１の移動速度が変更された場合に、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂをＸ方向に移動させることによって、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂと結像光学系１４との距離を変更するようにしてもよい。

また、本実施形態のように、結像光学系１４を挟んで第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂをＸ方向に並べて設け、位相差画像の撮像に先行して培養容器５０の位置を検出する場合、培養容器５０の範囲の全域において培養容器５０の位置検出および位相差画像の撮像を行うには、図５に示すように、培養容器５０の範囲よりもＸ方向について外側の範囲Ｒ１，Ｒ２まで結像光学系１４、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを相対的に移動させる必要がある。そして、範囲Ｒ１のＸ方向の幅として、少なくとも第１の変位センサ１８ａと結像光学系１４とのＸ方向の間隔を確保する必要があり、範囲Ｒ２のＸ方向の幅として、少なくとも第２の変位センサ１８ｂと結像光学系１４とのＸ方向の間隔を確保する必要がある。そして、観察域Ｒの走査時間をできるだけ短縮するには、観察域Ｒの走査範囲をできるだけ狭くすることが望ましい。したがって、範囲Ｒ１のＸ方向の幅は、第１の変位センサ１８ａと結像光学系１４とのＸ方向の間隔とすることが望ましく、範囲Ｒ２のＸ方向の幅は、第２の変位センサ１８ｂと結像光学系１４とのＸ方向の間隔とすることが望ましい。

一方、ステージ５１をＸ方向に移動させることによって観察域Ｒを培養容器５０の範囲内において走査する場合、培養容器５０の範囲における観察域Ｒの移動速度は一定であることが望ましい。したがって、ステージ５１のＸ方向への移動開始時にはステージ５１が一定の速度になるまで加速する必要があり、ステージ５１のＸ方向への移動終了時には、ステージ５１を一定の速度から減速して停止させる必要がある。

また、ステージ５１のＸ方向への移動速度を一定の速度にする場合、加速域をほとんどもたせることなく急速に一定の速度に制御することは可能であるが、このような制御を行った場合、培養容器５０に細胞とともに収容された培養液などの液面が揺れてしまい、位相差画像の画質の低下を招く可能性がある。また、ステージ５１を停止する際にも同様の問題が発生する可能性がある。

そこで、本実施形態においては、図５に示す範囲Ｒ１および範囲Ｒ２をステージ５１のＸ方向への移動の加減速域に設定する。このように培養容器５０の範囲のＸ方向の両側に加減速域を設定することによって、走査範囲を無駄に広げることなく、かつ培養容器５０の範囲において観察域Ｒを一定の速度で走査することができる。さらに、上述したような培養液の液面の揺れも抑制することができる。

次に、図４に戻り、表示制御部２３は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察域Ｒの位相差画像を結合することによって、１枚の合成位相差画像を生成し、その合成位相差画像を表示装置３０に表示させるものである。

表示装置３０は、上述したように表示制御部２３によって生成された合成位相差画像を表示するものであり、たとえば液晶ディスプレイなどを備えたものである。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用するようにしてもよい。

入力装置４０は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。本実施形態の入力装置４０は、たとえば位相差レンズ１４ａの倍率の変更指示およびステージの移動速度の変更指示などの設定入力を受け付けるものである。

次に、本実施形態の顕微鏡観察システムの作用について、図９に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が、ステージ５１上に設置される（Ｓ１０）。

次に、ステージ５１が移動して結像光学系１４の観察域Ｒが、図５に示す走査開始点Ｓの位置に設定され、観察域Ｒの走査が開始される（Ｓ１２）。

ここで、本実施形態においては、上述したように各観察域Ｒについて、先行して培養容器５０の位置検出が行われ、その検出位置まで観察域Ｒが到達した時点において、位相差画像の撮像が行われる。そして、この培養容器５０の位置検出と位相差画像の撮像は、観察域Ｒを走査しながら行われ、ある位置の観察域Ｒの位相差画像の撮像と、その位置よりも走査方向について前側の位置における培養容器５０の位置検出とが並行して行わる。

具体的には、図６の矢印方向に観察域Ｒが移動している場合には、第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出され（Ｓ１４）、その検出された位置情報が、結像光学系制御部２１によって取得される。結像光学系制御部２１は、取得した培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系１４（対物レンズ１４ｂ）のＺ方向への移動量を算出し（Ｓ１６）、その移動量を培養容器５０の検出位置のＸ−Ｙ座標上の位置とともに記憶する（Ｓ１８）。

次いで、Ｓ１８において第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０の位置検出が行われた位置に向かって観察域Ｒが移動する（Ｓ２０）。そして、結像光学系制御部２１は、培養容器５０の位置検出が行われた位置に観察域Ｒが到達する直前において移動量を読み出し、その移動量に基づいてオートフォーカス制御を行う（Ｓ２２，Ｓ２４）。すなわち、結像光学系制御部２１は、予め記憶された移動量に基づいて結像光学系駆動部１５を駆動制御し、結像光学系１４をＺ方向に移動させる。そして、オートフォーカス制御後、培養容器５０の位置検出が行われた位置に観察域Ｒが到達した時点において、位相差画像の撮像を行う（Ｓ２６）。観察域Ｒの位相差画像は、撮像素子１６から表示制御部２３に出力されて記憶される。なお、上述したように、Ｓ２６における観察域Ｒの位相差画像の撮像が行われている間、上記観察域Ｒよりも走査方向について前側の位置において培養容器５０の位置検出が並行して行われる。

そして、観察域Ｒが、図５に示す加減速域の範囲Ｒ２まで移動し、Ｙ方向に移動した後、Ｘ方向について逆方向に走査される場合には（Ｓ２８，ＹＥＳ）、すなわち、観察域Ｒの移動方向が、図６の矢印方向から図７の矢印方向に変更された場合には、使用する変位センサを第１の変位センサ１８ａから第２の変位センサ１８ｂに切り替える（Ｓ３０）。

そして、全ての走査が終了していない場合には（Ｓ３２，ＮＯ）、再び、観察域ＲがＸ方向に移動し、上述した培養容器５０の位置検出と位相差画像の撮像が順次行われる（Ｓ１４〜Ｓ２６）。

観察域Ｒが、加減速域の範囲Ｒ１，Ｒ２まで移動する度に使用する変位センサが切り替えられ、全ての走査が終了するまでＳ１４〜Ｓ２６までの処理が繰り返して行われる。そして、観察域Ｒが、図５に示す走査終了点Ｅの位置に到達した時点において全ての走査が終了する（Ｓ３２，ＹＥＳ）。

全ての走査が終了した後、表示制御部２３は、各観察域Ｒの位相差画像を結合して合成位相差画像を生成し（Ｓ３４）、その生成した合成位相差画像を表示装置３０に表示させる（Ｓ３６）。

次に、本発明の第２の実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１０は、第２の実施形態の顕微鏡観察システムの概略構成を示す図である。第２の実施形態の顕微鏡観察システムは、第１の実施形態の顕微鏡観察システムとは、検出部の構成が異なる。第２の実施形態の顕微鏡観察システムは、その他の構成は、第１の実施形態と同様であるので、以下、第２の実施形態の顕微鏡観察システムの検出部の構成を中心に説明する。

第１の実施形態の検出部１８は、２つの変位センサを備え、観察域Ｒの移動方向の変更に応じて使用する変位センサを切り替えるようにしたが、第２の実施形態の検出部１９は、１つの変位センサを有し、観察域Ｒの移動方向の変更に応じて、その変位センサの位置を切り替えるようにしたものである。

図１１および図１２は、検出部１９の具体的な構成を示す図である。検出部１９は、図１１および図１２に示すように、変位センサ１９ａと変位センサ１９ａを案内してその位置を移動させるガイド機構１９ｂとを備えている。

変位センサ１９ａは、第１の実施形態の第１および第２の変位センサ１８ａ，１８ｂと同様であり、レーザ変位センサから構成されるものである。

ガイド機構１９ｂは、半円弧状のガイド部材を備えたものであり、このガイド部材に沿って変位センサ１９ａを移動させるものである。ガイド部材は、結像光学系１４（対物レンズ１４ｂ）を挟んでＸ方向について一方の側から他方の側に変位センサ１９ａを移動させるものである。

図１１は、観察域Ｒの移動方向が、図１１の矢印方向（図１１の右方向）である場合における変位センサ１９ａの位置を示す図である。一方、図１２は、観察域Ｒの移動方向が、図１２の矢印方向（図１２の左方向）である場合における変位センサ１９ａの位置を示す図である。観察域Ｒの移動方向が図１１の矢印方向から図１２に矢印方向に変更された場合には、変位センサ１９ａは図１１に示す位置からガイド機構１９ｂのガイド部材に沿って移動し、図１２に示す位置に切り替えられる。

なお、本実施形態においては、変位センサの位置を移動させる変位センサ移動機構として上述したガイド機構１９ｂを設けるようにしたが、変位センサ移動機構の構成としてはこれに限らず、変位センサの位置を同様に変更可能な構成であれば、その他の構成を用いてもよい。

第２の実施形態の顕微鏡観察システムのその他の構成および作用については、第１の実施形態の顕微鏡観察システムと同様である。

次に、上述した第１および第２の実施形態の顕微鏡観察システムの変形例について説明する。上記第１および第２の実施形態の顕微鏡観察システムにおいては、検出部１８，１９によって培養容器５０のＺ方向の位置を検出し、その検出情報を用いてオートフォーカス制御を行うようにしたが、たとえば培養容器５０の底部がステージ５１の設置面から浮いて設置されている場合または培養容器５０の底部が厚い場合などには、結像光学系１４と培養容器５０の底面との距離が大きくなり、結像光学系駆動部１５によって結像光学系１４をＺ方向に最大限移動させたとしても、結像光学系１４の被写界深度の範囲内に培養容器５０の底面の位置が収まらない場合がある。

そこで、上述したオートフォーカス制御によって培養容器５０の底面の位置が、結像光学系１４の被写界深度の範囲内に必ず収まるように、予めキャリブレーションを行うことが望ましい。

具体的には、たとえば第１の実施形態の顕微鏡観察システムにおいて、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを一体的にＺ方向に移動させる鉛直方向移動機構６０を設けることが望ましい。

鉛直方向移動機構６０は、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを一体的に保持する保持部６０ａと、保持部６０ａをＺ方向に移動させるＺ方向駆動部６０ｂとを備えている。

保持部６０ａは、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂの相対的な位置関係を維持した状態でこれらを保持するものである。Ｚ方向駆動部６０ｂは、たとえば圧電素子などのアクチュエータを備えたものである。なお、鉛直方向移動機構６０は、結像光学系１４によって結像された位相差画像をそのまま通過させる構成となっている。

そして、上述した位相差画像の撮像の前に、鉛直方向移動機構６０を用いて、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを一体的にＺ方向に移動させることによって、オートフォーカス制御のキャリブレーションが行われる。

キャリブレーションは、具体的には、まず、結像光学系駆動部１５を駆動することによって結像光学系１４のＺ方向の位置を基準位置に設定する。この基準位置とは、上述したオートフォーカス制御において基準となる位置であり、結像光学系１４のＺ方向の移動範囲の中心位置である。

次いで、Ｚ方向駆動部６０ｂにより保持部６０ａをＺ方向に移動させながら、各位置において結像光学系１４によって結像された像を撮像素子１６により検出し、各位置の位相差画像を取得する。そして、位相差画像のコントラストが最大となる位置を検出する。位相差画像のコントラストが最大となる位置については、たとえば保持部６０ａを鉛直方向上方に順次移動させた場合に位相差画像のピントが合わなくなった位置と、保持部６０ａを鉛直方向下方に順次移動させた場合に位相差画像のピントが合わなくなった位置とを検出し、これらの検出位置の中心位置を位相差画像のコントラストが最大となる位置として検出するようにすればよい。

そして、位相差画像のコントラストが最大となる位置を鉛直方向移動機構６０の基準位置として設定してキャリブレーションを終了する。キャリブレーションは、たとえば培養容器５０の底部の重心位置において行うようにすれば良いが、培養容器５０の底部の複数箇所で行うようにしてもよい。その場合、その複数箇所でそれぞれ検出された基準位置の平均を最終的な基準位置として設定するようにすればよい。

図１３は、第２の実施形態の顕微鏡観察システムに対して鉛直方向移動機構６１を設けた例を示す図である。

鉛直方向移動機構６１は、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５および検出部１９を一体的に保持する保持部６１ａと、保持部６１ａをＺ方向に移動させるＺ方向駆動部６１ｂとを備えている。

保持部６１ａは、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５および検出部１９の変位センサ１９ａの相対的な位置関係を維持した状態でこれらを保持するものである。Ｚ方向駆動部６１ｂは、上述したＺ方向駆動部６０ｂと同様に、たとえば圧電素子などのアクチュエータを備えたものである。

キャリブレーションの方法については、上述した第１の実施形態の顕微鏡観察システムの場合と同様である。

なお、上記実施形態においては、ステージ５１を移動させることによって観察域Ｒを走査するようにしたが、これに限らず、ステージ５１を固定とし、結像光学系１４およびその他の位相差画像の撮像に係る構成を移動させることによって観察域Ｒを走査するようにしてもよいし、ステージ５１と結像光学系１４およびその他の位相差画像の撮像に係る構成との双方を移動させることによって観察域Ｒを走査するようにしてもよい。

また、上記実施形態は、本発明を位相差顕微鏡に適用したものであるが、本発明は、位相差顕微鏡に限らず、微分干渉顕微鏡および明視野顕微鏡などのその他の顕微鏡に適用するようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、結像光学系１４によって結像された位相差画像を撮像素子１６によって撮像するようにしたが、撮像素子を設けることなく、結像光学系１４によって結像された観察対象の位相差像をユーザが直接観察できるように観察光学系などを設けるようにしてもよい。

１０ 顕微鏡装置
１１ 白色光源
１２ コンデンサレンズ
１３ スリット板
１４ 結像光学系
１４ａ 位相差レンズ
１４ｂ 対物レンズ
１４ｃ 位相板
１４ｄ 結像レンズ
１５ 結像光学系駆動部
１６ 撮像素子
１７ 水平方向駆動部
１８，１９ 検出部
１８ａ 第１の変位センサ
１８ｂ 第２の変位センサ
１９ 検出部
１９ａ 変位センサ
１９ｂ ガイド機構
２０ 顕微鏡制御装置
２１ 結像光学系制御部
２２ 走査制御部
２３ 表示制御部
３０ 表示装置
４０ 入力装置
５０ 培養容器
５１ ステージ
５１ａ 開口
６０，６１ 鉛直方向移動機構
６０ａ，６１ａ 保持部
６０ｂ，６１ｂ Ｚ方向駆動部
Ｓ 走査開始点
Ｅ 走査終了点
Ｌ 照明光
Ｍ 観察域の走査位置
Ｐｄ 検出位置
Ｐｒ 検出位置Ｐｄに隣接する観察域Ｒの位置
Ｒ 観察域
Ｒ１，Ｒ２ 加減速の範囲
Ｗ ウェル

Claims (13)

1. 観察対象が収容された容器が設置されるステージと、
   前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系と、
   前記対物レンズを光軸方向に移動させる結像光学系駆動部と、
   前記ステージに設置された前記容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有する検出部と、
   該検出部によって検出された前記容器の鉛直方向の位置に基づいて、前記結像光学系駆動部を制御する結像光学系制御部と、
   前記ステージおよび前記結像光学系の少なくとも一方を、水平面内の主走査方向および該主走査方向に直交する副走査方向に移動させ、かつ前記少なくとも一方を前記主走査方向について往復移動させる水平方向駆動部と、
   該水平方向駆動部を制御する走査制御部とを備え、
   前記検出部が、前記容器に対する前記結像光学系の観察域の位置よりも該観察域の移動方向前側の位置において前記容器の鉛直方向の位置を検出し、かつ前記主走査方向の移動方向の変更に応じて、前記変位センサの前記主走査方向の位置または使用する前記変位センサを切り替えることを特徴とする観察装置。
2. 前記検出部が、前記対物レンズを挟んで前記主走査方向について並べて設けられた少なくとも２つの前記変位センサを有し、前記主走査方向の移動方向の変更に応じて、使用する前記変位センサを切り替える請求項１記載の観察装置。
3. 前記検出部が、前記対物レンズを挟んで前記主走査方向について一方の側と他方の側とに前記変位センサを移動可能な変位センサ移動機構を有し、前記主走査方向の移動方向の変更に応じて、前記変位センサの位置を前記一方の側から前記他方の側に移動する請求項１記載の観察装置。
4. 前記変位センサ移動機構が、前記変位センサを前記一方の側から前記他方の側まで案内するガイド機構を備えた請求項３記載の観察装置。
5. 前記結像光学系制御部が、前記検出部によって前記容器の鉛直方向の位置が検出された後、予め設定された時間が経過した時点において前記結像光学系駆動部を制御して前記対物レンズを光軸方向に移動させる請求項１から４いずれか１項記載の観察装置。
6. 前記結像光学系制御部が、前記検出部によって前記容器の鉛直方向の位置が検出された後、該検出位置に前記結像光学系の観察域が到達した時点または前記検出位置に前記結像光学系の観察域が到達する直前において前記結像光学系駆動部を制御して前記対物レンズを光軸方向に移動させる請求項５記載の観察装置。
7. 前記結像光学系制御部が、前記走査制御部によって前記ステージおよび前記結像光学系の少なくとも一方の移動速度が変更された場合、該変更後の移動速度に応じて、前記予め設定された時間を変更する請求項５または６記載の観察装置。
8. 前記容器の範囲の前記主走査方向の両側に、前記ステージおよび前記結像光学系の少なくとも一方の前記主走査方向への移動の加減速域が設定されており、該加減速域の前記主走査方向の幅と前記結像光学系と前記変位センサとの前記主走査方向の間隔とが同じである請求項１から７いずれか１項記載の観察装置。
9. 前記結像光学系、前記結像光学系駆動部および前記変位センサを一体的に鉛直方向に移動させる鉛直方向移動機構を備えた請求項１から８いずれか１項記載の観察装置。
10. 前記結像光学系駆動部が、圧電素子を備え、該圧電素子を用いて前記対物レンズを光軸方向に移動させる請求項１から９いずれか１項記載の観察装置。
11. 前記変位センサが、レーザ変位センサである請求項１から１０いずれか１項記載の観察装置。
12. 観察対象が収容された容器が設置されるステージおよび前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を主走査方向および該主走査方向に直交する副走査方向に移動させ、かつ前記少なくとも一方を前記主走査方向について往復移動させる観察方法において、
    前記容器に対する前記結像光学系の観察域の位置よりも該観察域の移動方向前側の位置における前記容器の鉛直方向の位置を、少なくとも１つの変位センサを用いて検出し、該検出した容器の鉛直方向の位置に基づいて、前記対物レンズを光軸方向に移動させ、かつ前記主走査方向の移動方向の変更に応じて、前記変位センサの前記主走査方向の位置または使用する前記変位センサを切り替えることを特徴とする観察方法。
13. 観察対象が収容された容器が設置されるステージおよび前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系の少なくとも一方を主走査方向および該主走査方向に直交する副走査方向に移動させ、かつ前記少なくとも一方を前記主走査方向について往復移動させる手順をコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムにおいて、
    前記容器に対する前記結像光学系の観察域の位置よりも該観察域の移動方向前側の位置における前記容器の鉛直方向の位置を、少なくとも１つの変位センサを用いて検出する手順と、該検出した容器の鉛直方向の位置に基づいて、前記対物レンズを光軸方向に移動させる手順と、前記主走査方向の移動方向の変更に応じて、前記変位センサの前記主走査方向の位置または使用する前記変位センサを切り替える手順とをコンピュータに実行させることを特徴とする観察装置制御プログラム。