JP2017191056A

JP2017191056A - 質量分析を用いた多成分一斉分析方法及び多成分一斉分析用プログラム

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Publication number: JP2017191056A
Application number: JP2016081561A
Authority: JP
Inventors: 豪中西; Takeshi Nakanishi; 真希山田; Maki Yamada; 芳博北; Yoshihiro Kita; 涼美徳岡; Suzumi Tokuoka
Original assignee: Shimadzu Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Shimadzu Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2017-10-19
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: JP6611009B2; EP3232194A1; US20170299557A1; US9989504B2

Abstract

【課題】リン脂質の脂肪酸組成を含めた一斉分析の作業の効率化を図るとともに正確性を向上させる。【解決手段】試料に含まれるリン脂質のリン脂質クラスを決定する１回目のLC/MS/MS分析を行ったあと（S2-S3)、検出されたリン脂質に絞って脂肪酸組成を決定する２回目のLC/MS/MS分析を行う（S4-S8）。リン脂質クラス決定用のMRMトランジションがリン脂質クラスの化合物毎に記載されたメソッドリストと、脂肪酸組成決定用のMRMトランジションがリン脂質化合物毎に記載されたメソッドリストを関連付けることで、検出されたリン脂質クラスの化合物に対応する脂肪酸組成決定用MRMトランジションを迅速に抽出することができ、２回目の分析のための分析メソッドを簡便に作成することができる。【選択図】図２

Description

本発明は、質量分析を利用して多種の化合物を一斉に分析する多成分一斉分析方法、及び、そうした多成分一斉分析を行うべく質量分析装置を制御するとともに該装置で得られたデータを処理するためのコンピュータプログラムに関し、さらに詳しくは、例えばリン脂質のように、その分子種を特徴付ける部分構造に別の多様な部分構造が結合することで膨大な種類が存在し得る化合物の分析に好適な多成分一斉分析方法及び多成分一斉分析用プログラムに関する。

生体内には多数のタンパク質や脂質などが存在している。それらは単独で存在する場合もあるが、多くの場合、何らかの修飾を受けることによって生体内で機能を発揮することがこれまでの研究で明らかになっている。例えばリン脂質は部分構造としてリン酸エステルを持つ脂質であり、生体中で主に細胞膜の主要構成成分として存在しているが、一部のリン脂質は生体内におけるシグナル伝達に関与するなど、生理活性を有することが知られている。また、血液中や生体組織中におけるリン脂質の変動は様々な疾患に関連していることが解明されつつある。

図３に示すように、リン脂質はグリセリンを中心骨格とするグリセロリン脂質とスフィンゴシンを中心骨格とするスフィンゴリン脂質の二つに大別される。図３（ａ）に示すように、グリセロリン脂質では、中心骨格であるグリセリンに脂肪酸及びリン酸が結合しており、さらにリン酸を介してコリン、エタノールアミン、イノシトール、セリンなどの塩基が結合した構造を有する。一方、スフィンゴリン脂質では、中心骨格であるスフィンゴシンに脂肪酸及びリン酸等が結合した構造を有する。グリセリン、スフィンゴシン、脂肪酸は疎水性部、リン酸や塩基は親水性部であり、リン脂質は疎水性部と親水性部とを１分子内に有する両親媒性物質である。

リン脂質は、リン脂質の種類（例えば図３中に記載したホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンなど）を決定付ける特徴的な部分構造である親水性の極性基部分の相違、結合している脂肪酸の炭素数並びに二重結合の数及び結合部位の相違、脂肪酸と中心骨格との結合様式（エステル型、エーテル型、アルキル型）などの様々な組み合わせにより、理論上、膨大な種類が存在し得る。従来、質量分析装置を用いてこうしたリン脂質の一斉分析を行う際には、リン脂質の種類を決定付ける特徴的な部分構造の相違に着目し、その特徴的な構造に対応する部位の脱離に関連する分子イオン、即ち、脱離した部位そのもの、又は逆に脱離によって残された側の構造に対応する分子イオンのいずれかを検出する手法が採られている。

例えば特許文献１には、分析対象の脂質種に特異的であるコリジョンエネルギの下での衝突誘起解離（ＣＩＤ）を伴うニュートラルロススキャン測定を行うことでＭＳ²段階での脂質の極性基部分（親水性部）に基づく選択操作を行い、さらにＭＳ³段階で脂質の疎水性部である脂肪族炭化水素鎖の分析を行うことで、脂質の網羅的な分析を行うことが記載されている。

また、タンデム四重極型質量分析装置における多重反応モニタリング（ＭＲＭ）測定を用いた網羅的分析としては、リン脂質の各クラス（分子種）の構造的な特徴を利用し、各リン脂質クラスに対応するＭＲＭトランジション（プリカーサイオンとプロダクトイオンのm/z値の組み合わせ）を分析条件として設定することで、生体試料からの疾患特異的なリン脂質の種類を特定したとの報告もなされている（非特許文献１参照）。ただし、こうしたリン脂質クラスの特徴的な部分構造を利用したＭＲＭ測定では、リン脂質を構成する脂肪酸の構造情報は入手できない。そのため、脂肪酸の脱離に基づくフラグメントイオンを対象としたＭＲＭ測定を同時に行うことで、特定のリン脂質の脂肪酸の構造情報も併せて取得しリン脂質の同定を行っている。この場合には、もともと分析対象のリン脂質のクラスが限定されているため、リン脂質クラスに対応するＭＲＭトランジションと脂肪酸構造に対応するＭＲＭトランジションとの組み合わせの総数はそれほど膨大にならずに済む。

一般に、タンデム四重極型質量分析装置を検出器とした液体クロマトグラフ（ＬＣ）やガスクロマトグラフ（ＧＣ）では、保持時間に対応して構造特異的なＭＲＭトランジションを様々に組み合わせた測定シーケンスを予め定めておくことで、目的試料に対する１回のＬＣ／ＭＳ分析又はＧＣ／ＭＳ分析によって多成分一斉分析を実施するようにしている。しかしながら、リン脂質の場合、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションの数は４００以上、脂肪酸組成を決定するためのＭＲＭトランジションの数は８００以上にもなる。そのため、分析対象であるリン脂質のクラスを予め限定せずに多成分一斉分析を行おうとすると、リン脂質をＬＣで分離したあとに保持時間毎に異なるＭＲＭトランジションの組み合わせを割り当てるにしても、１回のＬＣ／ＭＳ分析で全てのリン脂質を同定できるように測定シーケンスを組むことは実質的に不可能である。また、リン脂質の場合、ＭＲＭ測定のターゲットとする物質（部分構造）によって正イオン化モードと負イオン化モードとを切り替える必要があり、それらを同じ測定イベント（ＭＲＭトランジションを含む測定条件が相違する測定を時分割で繰り返し実施するための決められた測定時間範囲）で実施することが難しいという事情もある。

こうしたことから、リン脂質の多成分一斉分析は次のような手順で実行する必要がある。即ち、まず、目的試料に対し、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションを測定条件としたＬＣ／ＭＳ分析を行うことで、該試料に含まれる１又は複数のリン脂質のクラスを特定する。そのあと、同じ目的試料に対し、先に特定された（つまりは目的試料に含まれることが確認された）リン脂質クラスに絞り込んで脂肪酸組成を決定するためのＭＲＭトランジションを測定条件としたＬＣ／ＭＳ分析を行う。そして、その２回のＬＣ／ＭＳ分析の結果に基づいて、目的試料中のリン脂質を同定する。

このような２段階のＬＣ／ＭＳ分析を行う場合、１回目のＬＣ／ＭＳ分析におけるＭＲＭトランジションと２回目のＬＣ／ＭＳ分析におけるＭＲＭトランジションとが一対一の対応関係であれば、２回目のＬＣ／ＭＳ分析の際の測定シーケンスの作成は比較的簡単である。しかしながら、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションと脂肪酸組成を決定するためのＭＲＭトランジションとの対応関係は複雑であり、２回目のＬＣ／ＭＳ分析の際の測定シーケンスを作成するには、特定されたリン脂質クラスに対応し得る脂肪酸組成を確認するためのＭＲＭトランジションを膨大な数のリン脂質の組み合わせの中から選び出す作業が必要であり非常に煩雑で面倒である。また、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションに対応付けられる脂肪酸組成を決定するためのＭＲＭトランジションの数も様々であるため、測定シーケンスを作成する際の誤りも生じ易く、誤ってもそれに気づきにくいという問題もある。

また、こうした問題はリン脂質に限ったものではなく、例えば様々な長さ（アミノ酸配列長）のペプチドに糖鎖などの翻訳後修飾物が結合した翻訳後修飾を受けたペプチドや、基本骨格に結合している部分構造が代謝や意図的な改変によって様々に変化する化合物においても同様の問題が生じる。

特開２００６−２２６７３０号公報

サンソーリム（Sangsoo Lim）、ほか３名、「ラピッド・スクリーニング・オブ・ホスフォリピッド・バイオマーカー・キャンディデイツ・フロム・プロステート・カンカー、ウリン・サンプルズ・バイ・マルチプル・リアクション・モニタリング・オブ・ユーピーエルシー-イーエスアイ-マス／マス・アンド・スタスティカル・アプローチズ（Rapid Screening of Phospholipid Biomarker Candidates from Prostate Cancer Urine Samples by Multiple Reaction Monitoring of UPLC-ESI-MS/MS and Statistical Approaches）」、Bull. Korean Chem. Soc. 2014年、Vol. 35、No. 4、pp.1133-1138

本発明はこうした課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、リン脂質のような、それぞれが特徴的である複数の部分構造の組み合わせによって多数の種類がある化合物を質量分析を用いて多成分一斉分析する際に、効率良く精度の高い分析を行うことができるとともに、特に分析に際して必要な測定シーケンスの作成に要する手間を軽減し作業ミスを防止することができる多成分一斉分析方法及び多成分一斉分析用プログラムを提供することである。

上記課題を解決するためになされた本発明に係る多成分一斉分析方法は、ＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定が可能である質量分析装置を用い、グループを決定付ける第１の部分構造と鎖構造である第２の部分構造とが直接に又は中心骨格を介して結合されてなる化学構造を有する、一つの化合物群に含まれる複数種類の化合物を一斉に分析する多成分一斉分析方法であって、
a)少なくとも第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスに従って目的試料に対する１回目の測定を実施する第１の測定実行ステップと、
b)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて前記目的試料に含まれる前記一つの化合物群に含まれる化合物の一又は複数のグループを特定するグループ特定ステップと、
c)前記グループ特定ステップにおいて特定された一又は複数のグループにそれぞれ対応する第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを予め用意された情報から抽出し、少なくともその第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスを作成する測定シーケンス作成ステップと、
d)前記測定シーケンス作成ステップにおいて作成された測定シーケンスに従って前記目的試料に対する２回目又はそれ以降の測定を実施する第２の測定実行ステップと、
e)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果及び前記第２の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて、目的試料に含まれる、前記一つの化合物群に含まれる化合物の化学構造を推定する構造推定ステップと、
を有することを特徴としている。

また上記課題を解決するためになされた本発明に係る多成分一斉分析用プログラムは、ＭＲＭ測定が可能である質量分析装置を用い、グループを決定付ける第１の部分構造と鎖構造である第２の部分構造とが直接に又は中心骨格を介して結合されてなる化学構造を有する、一つの化合物群に含まれる複数種類の化合物を一斉に分析するために、前記質量分析装置で得られたデータを処理するとともに該質量分析装置の動作を制御するべくコンピュータ上で動作する多成分一斉分析用プログラムであって、
a)少なくとも第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスを作成する第１測定シーケンス作成ステップと、
b)前記第１測定シーケンス作成ステップで作成された測定シーケンスに従って目的試料に対する１回目の測定を実施するように各部の動作を制御する第１の測定実行ステップと、
c)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて前記目的試料に含まれる前記一つの化合物群に含まれる化合物の一又は複数のグループを特定するグループ特定ステップと、
d)前記グループ特定ステップにおいて特定された一又は複数のグループにそれぞれ対応する第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを予め用意された情報から抽出し、少なくともその第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスを作成する第２測定シーケンス作成ステップと、
e)前記第２測定シーケンス作成ステップにおいて作成された測定シーケンスに従って前記目的試料に対する２回目又はそれ以降の測定を実施するように各部の動作を制御する第２の測定実行ステップと、
f)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果及び前記第２の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて、目的試料に含まれる、前記一つの化合物群に含まれる化合物の化学構造を推定する構造推定ステップと、
をコンピュータに実行させることを特徴としている。

なお、本発明に係る多成分一斉分析方法及び多成分一斉分析用プログラムにおいては、目的試料に含まれる多数の化合物を或る程度分離するために、質量分析装置単独ではなく、液体クロマトグラフ又はガスクロマトグラフと質量分析装置とを組み合わせたＬＣ−ＭＳ又はＧＣ−ＭＳを用いるとよい。また、質量分析装置としてはタンデム四重極型質量分析装置を用いればよい。

また本発明に係る多成分一斉分析方法及び多成分一斉分析用プログラムにおいて、分析対象である典型的な化合物群はリン脂質である。リン脂質は、リン酸や塩基を含む極性基である第１の部分構造と、脂肪酸である第２の部分構造とが、グリセリン又はスフィンゴシンである中心骨格を介して結合されてなる化合物群である。

化合物群がリン脂質であり、装置としてＬＣ−ＭＳを用いる場合には、まず、リン脂質のクラスを決定するＭＲＭトランジション及び保持時間を測定条件とした測定シーケンスが作成され、該測定シーケンスに従ったＬＣ／ＭＳ分析が第１の測定実行ステップにおいて実施される。ＬＣにおける移動相流速などの分離条件が予め決められている場合には、各リン脂質クラスの保持時間は既知であり、既知である全てのリン脂質クラスを検出対象とすればよいから、第１の測定実行ステップで使用される測定シーケンスは予め作成された既定のものを利用することができる。つまり、第１の測定実行ステップにおける測定を実行しようとする度に測定シーケンスを作成する必要はない。なお、ＭＲＭ測定の際に衝突誘起解離によりプリカーサイオンを解離させる最適な衝突エネルギはリン脂質クラスに特異的であることが分かっているから、検出したいリン脂質クラス毎にそれぞれ衝突エネルギ値も変えるように測定シーケンスを作成しておくとよい。これは２回目以降のＬＣ／ＭＳ分析の際の測定シーケンスを作成する際も同様である。

グループ特定ステップでは、第１の測定実行ステップにより得られた結果に基づき、リン脂質毎にマスクロマトグラム（抽出イオンクロマトグラム）を作成し、該クロマトグラムにおいてピークを検出して定量演算を行うことにより、その目的試料に実際に含まれるリン脂質を特定する。目的試料には複数（最大で全ての）リン脂質が含まれる場合もあれば一つのみのリン脂質が含まれる場合もあり得る。

リン脂質に結合している脂肪酸の二重結合数や炭素数は非常に多様であるが、実用的には、過去に生体で検出された報告例があるリン脂質クラスと脂肪酸組成との組み合わせについてのみ考慮すれば十分である。そこで、例えば、リン脂質クラスと脂肪酸組成との組み合わせを一対多（一対一である場合もあり得る）で対応付けた情報を予め作成しておき、測定シーケンス作成ステップ（本発明に係る多成分一斉分析用プログラムにおいては第２の測定シーケンス作成ステップ）では、上記情報を利用して、実際に検出されたリン脂質クラスに対応付けられる脂肪酸組成を抽出し、その脂肪酸組成を決定するための一又は複数のＭＲＭトランジションをリン脂質クラス毎に求める。そして、検出されたリン脂質クラスに絞った、脂肪酸組成を決定するＭＲＭトランジション及び保持時間を測定条件とした測定シーケンスが作成される。

このように作成される測定シーケンスでは、目的試料に含まれないリン脂質クラスと脂肪酸組成との組み合わせについてのＭＲＭ測定は含まれないので、目的試料に含まれるリン脂質クラスの数にも依るものの、一般的には、リン脂質クラスと脂肪酸組成との全ての組み合わせに比べればその数は大幅に少なくなる。

なお、２回目以降のＬＣ／ＭＳ分析のための測定シーケンスでは、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションの下での測定は必ずしも必要ないが、２回目（又は２回目以降）のＬＣ／ＭＳ分析の結果のみから目的試料に含まれるリン脂質の構造推定に必要な情報が得られるようにするには、２回目以降のＬＣ／ＭＳ分析のための測定シーケンスにも、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションを組み入れておくことが好ましい。
即ち、本発明に係る多成分一斉分析用プログラムにおいて、好ましくは、
前記第２の測定シーケンス作成ステップでは、前記グループ特定ステップにおいて特定されたグループに特異的な第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションと、そのグループに対応する第２の部分構造を識別する１又は複数のＭＲＭトランジションとを組とした測定シーケンスを作成するようにするとよい。

そして、作成された測定シーケンスに従った目的試料に対する２回目のＬＣ／ＭＳ分析が第２の測定実行ステップにおいて実施される。構造推定ステップでは、第１の測定実行ステップにより得られたリン脂質クラスの識別結果と、第２の測定実行ステップにより得られた脂肪酸組成の識別結果とに基づいて、目的試料に含まれるリン脂質の化学構造が推定され、リン脂質の種類が特定される。

ただし、目的試料に含まれるリン脂質のクラスが少ない場合には問題ないが、目的試料に含まれるリン脂質のクラスが多い場合には、１回目のＬＣ／ＭＳ分析による絞り込みの効果が十分に発揮されず、同じ時間帯（時間範囲）に実行すべきＭＲＭトランジションの数が多すぎて一つのＭＲＭトランジション当たりの測定時間が十分に確保できない場合がある。そこで、そうした場合には、脂肪酸組成を決定するためのＬＣ／ＭＳ分析を一回ではなく複数回に分けて実行するとよい。

即ち、本発明に係る多成分一斉分析用プログラムにおいて、好ましくは、
前記第２の測定シーケンス作成ステップでは、同一時間帯に実質的に並行して実行すべきＭＲＭトランジションの数に応じて、前記第２の測定実行ステップにおける測定を２回以上実行するように測定シーケンスを作成するようにするとよい。
これにより、測定時間が増加し必要な試料の量も増えるものの、十分な感度で目的試料に含まれる化合物（リン脂質）を検出することができ、正確な化合物の構造推定が可能となる。

また、上述したように、前記グループ特定ステップにおいて特定されたグループに特異的な第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションと、そのグループに対応する第２の部分構造を識別する１又は複数のＭＲＭトランジションとを組とした測定シーケンスが作成され、この測定シーケンスに従って２回目以降のＬＣ／ＭＳ分析が実施された場合に、少なくとも同じ組に含まれる第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションの下で得られたクロマトグラムと、第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションの下で得られたクロマトグラムとを、時間軸を合わせた同一のグラフ上に描画するデータ処理ステップをさらに有するようにするとよい。

これによれば、ユーザは、例えば一つのリン脂質クラスに属する化合物の構造を推定するための複数のクロマトグラムを一つのグラフ上で視認することができる。それによって、ユーザは目的試料に含まれるリン脂質を迅速に判断することができる。また、そうした判断の基となった情報を紙ベース又は電子的に記録しておく際にも便利である。

本発明に係る質量分析装置を用いた多成分一斉分析方法及び多成分一斉分析用プログラムによれば、リン脂質のような、複数の部分構造の組み合わせによって膨大な種類が存在し得る化合物の一斉分析を、効率的に且つ高い精度で以て行うことができる。また、ユーザ自身が面倒な作業を行うことなく、そうした分析のための測定シーケンスを簡便に且つ正確に作成することができる。それによって、異なる部分構造をそれぞれ決定するために分析作業を複数回に分けるにも拘わらず、その分析のための測定シーケンスを作成するのに要する手間と時間を節約し、しかもユーザによる作業ミスを防止することができる。

本発明に係る多成分一斉分析方法の一例であるリン脂質一斉分析方法を実施するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムの一実施例の全体構成図。本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析の際の処理手順を示すフローチャート。分析対象であるリン脂質の化学構造の説明図。本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析の際のＭＲＭトランジションの説明図。本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析のためのメソッド編集の説明図。本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析での２回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析時のメソッドの一例を示す図。本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析で取得されるマスクロマトグラムの一例を示す図。

以下、本発明に係る多成分一斉分析方法の一例であるリン脂質一斉分析方法について、添付図面を参照して説明する。
図１は、リン脂質一斉分析方法を実施するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムの一実施例の全体構成図である。

本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは、液体クロマトグラフ（ＬＣ）部１と、質量分析部２と、データ処理部３と、制御部４と、入力部５と、表示部６と、を備える。
ＬＣ部１は、移動相容器１０から移動相を吸引して一定流量で送給するポンプ１１と、その移動相中に一定量の試料を注入するインジェクタ１２と、該試料に含まれる複数の化合物を時間方向に分離するカラム１３と、を備える。

質量分析部２は大気圧イオン化タンデム四重極型質量分析装置であり、大気圧雰囲気であるイオン化室２０と図示しない高性能の真空ポンプにより真空排気される高真空雰囲気である分析室２３との間に、段階的に真空度が高められた第１中間真空室２１及び第２中間真空室２２を備えた多段差動排気系の構成を有する。イオン化室２０には、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）法などによるイオン化を行うイオン化プローブ２０１が配置され、イオン化室２０と次段の第１中間真空室２１との間は細径の加熱キャピラリ２０２を通して連通している。

第１中間真空室２１と第２中間真空室２２との間は頂部に小孔を有するスキマー２１２で隔てられ、第１中間真空室２１と第２中間真空室２２とにはそれぞれ、イオンを収束させつつ後段へ輸送するためのイオンガイド２１１、２２１が設置されている。分析室２３には、多重極イオンガイド２３３が内部に設置されたコリジョンセル２３２を挟んでその前後に、イオンを質量電荷比m/zに応じて分離する前段四重極マスフィルタ２３１と後段四重極マスフィルタ２３４とが配置され、その後段にイオン検出器２３５が設置されている。電源部２４は、イオン化プローブ２０１、イオンガイド２１１、２２１、四重極マスフィルタ２３１、２３４、多重極イオンガイド２３３などにそれぞれ所定の電圧を印加するものである。

イオン検出器２３５による検出信号を受けるデータ処理部３は、機能ブロックとして、データ記憶部３１、クロマトグラム作成部３２、ピーク面積値算出部３３、リン脂質構造推定部３４などを含む。また、システム全体を制御する制御部４は、機能ブロックとして、分析制御部４１、リン脂質クラス決定メソッド作成部４２、既検出リン脂質クラス抽出部４３、脂肪酸組成決定メソッド作成部４４、リン脂質クラス決定用メソッド記憶部４５、脂肪酸組成決定用メソッド記憶部４６などを含む。

なお、データ処理部３や制御部４の少なくとも一部の機能は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現することができる。ここでは、リン脂質解析用ソフトウエア（プログラム）が予めコンピュータにインストールされ、このソフトウエアがコンピュータ上で動作することで後述する一連のリン脂質解析に関する分析や処理が実行される。

図２は本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析の際の処理手順を示すフローチャート、図４はリン脂質一斉分析の際のＭＲＭトランジションの説明図、図５はリン脂質一斉分析のためのメソッド編集の説明図、図６はリン脂質一斉分析での２回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析時のメソッドの一例を示す図、図７はリン脂質一斉分析で取得されるマスクロマトグラムの一例を示す図である。これら図面を参照しつつ、本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにおけるリン脂質一斉分析の動作及び処理について説明する。

ユーザ（オペレータ）が入力部５で所定の操作を行うと、上述したようにコンピュータにインストールされているリン脂質解析ソフトウエアが起動し、システムはリン脂質解析が可能な状態となる（ステップＳ１）。

まずリン脂質クラス決定メソッド作成部４２はリン脂質クラス決定用メソッド記憶部４５に格納されている情報に基づいて、リン脂質クラスを決定するためのＭＲＭトランジションをＭＳ／ＭＳ条件とした分析メソッド（本発明における測定シーケンスに相当）を作成する（ステップＳ２）。
ここでいう分析メソッドは、例えばＬＣ部１での試料注入時点を起点とした保持時間の範囲毎に、検出するＭＲＭトランジションを含むＭＳ／ＭＳ分析条件（イオン化モードの正負の極性、コリジョンエネルギ値など）が設定されたものである。一般的に、リン脂質クラスはＬＣによって分離されるから、異なるリン脂質クラスに対してはそれぞれ異なる（ただし一部重なる場合もある）保持時間範囲を設定することが可能である。また、リン脂質クラスを決定する際には、図４に示すように、リン酸分子とグリセロールの酸素分子との間の結合が解離（Ａ）によって切断されることで生成された親水性部のプロダクトイオンを検出する。この場合、プロダクトイオンの質量電荷比はリン脂質クラス毎に同じであるが、プリカーサイオンの質量電荷比は脂肪酸組成などにより多様であり、一つのリン脂質クラスに対応するＭＲＭトランジションの数は多い。

図５（ａ）はリン脂質クラス（例：ホスファチジルコリン＝ＰＣ、ホスファチジルエターノールアミン＝ＰＥ、ホスファチジルグリセロール＝ＰＧ、ホスファチジルセリン＝ＰＳ、ホスファチジルイノシトール＝ＰＩ、スフィンゴミエリン＝ＳＭ）を決定するための分析メソッドの一部の例である。なお、図中、ＰＣのあとの括弧内は（炭素数：二重結合数）である。図５の例においては、リン脂質クラス決定メソッドにおいて、炭素数と二重結合数とを含めた部分構造を特定しているが、リン酸や塩基を含む極性基を特定してもよい。

次いで、分析制御部４１はリン脂質クラス決定メソッド作成部４２により作成された分析メソッドに従って目的試料に対する１回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実行するように各部を制御する（ステップＳ３）。即ち、分析制御部４１の制御の下に、ＬＣ部１ではインジェクタ１２から移動相中に一定量の目的試料が注入され、該目的試料中の化合物はカラム１３を通過する際に分離されて溶出する。
一方、質量分析部２は、分析メソッドで指定された保持時間範囲に既定のＭＲＭトランジションについてのＭＲＭ測定を実行するように制御される。その際に、イオン化プローブ２０１を始めとする各部に印加される電圧は、分析メソッドで指定されている正イオンモード又は負イオンモードのいずれかで動作するように極性が決められ、また、前段四重極マスフィルタ２３１を通過したイオン（プリカーサイオン）がコリジョンセル２３２に入射するときのコリジョンエネルギは分析メソッドで指定されているコリジョンエネルギ値になるように印加電圧値が調整される。

そして、それぞれ所定の保持時間範囲内の異なるＭＲＭトランジション毎にイオン検出器２３５で得られたデータはデータ記憶部３１に一旦記憶される。データ処理部３においてクロマトグラム作成部３２はＭＲＭトランジション毎にデータ記憶部３１に記憶されているデータに基づいてマスクロマトグラムを作成し、ピーク面積値算出部３３はマスクロマトグラムにおいてピークを検出し、検出されたピークの面積値を算出する。或るＭＲＭトランジションに対応するマスクロマトグラム上でピークが検出され、そのピーク面積値が所定の閾値を超えていれば、該ＭＲＭトランジションに対応する化合物は目的試料中に存在すると判断することができる。そこで、ピーク面積値算出部３３はＭＲＭトランジションに対応する化合物毎にピーク面積値を記載したテーブルを作成して既検出リン脂質クラス抽出部４３へと送り、既検出リン脂質クラス抽出部４３はピーク面積値が閾値以下である化合物を削除することにより、目的試料に対してリン脂質クラス決定用分析メソッドの下で検出されたリン脂質クラスの化合物を全て抽出する（ステップＳ４）。

次いで脂肪酸組成決定メソッド作成部４４は、目的試料に対して検出されたリン脂質クラスの化合物（炭素数及び二重結合数が異なる化合物）の数をリン脂質クラス毎に計数し、その数が規定値以下であるか否かを判定する（ステップＳ５）。同じリン脂質クラスに含まれる炭素数及び二重結合数が異なる化合物は同じ保持時間範囲にＭＲＭ測定を実施する必要がある。そのため、同じリン脂質クラスに含まれる炭素数及び二重結合数が異なる化合物の数が多すぎると、一つのＭＲＭトランジションに割り当て可能な時間が短すぎて十分な信号強度が得られない。そのため、同じ時間帯に並行して（厳密には時分割で）実施可能なＭＲＭトランジションの数を制限し、それを超える場合には、脂肪酸組成を決定するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を２回以上実行することとしている。そこで、ステップＳ５でＮｏと判定された場合には、リン脂質クラス毎の化合物数に応じて分割数（脂肪酸組成決定のためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の実行回数）を決定する（ステップＳ１１）。

ステップＳ５でＹｅｓである場合、脂肪酸組成決定メソッド作成部４４は、脂肪酸組成決定用メソッド記憶部４６に保存されている、リン脂質クラスの化合物と脂肪酸組成（２本の脂肪酸鎖のそれぞれの長さと二重結合数との組み合わせ）との組み合わせを網羅したメソッドリストから、先に検出が確認されたリン脂質クラスの化合物に対応付けられているメソッドのみを選択する（ステップＳ６）。脂肪酸組成を決定する際には、図４に示すように、グリセロールの酸素分子と長鎖脂肪酸との間の結合が解離（Ｂ又はＢ’）によって切断されることで生成された疎水性部のプロダクトイオンを検出する。

図５（ｂ）は脂肪酸組成決定用メソッドリストの一例である。例えばいま、リン脂質クラス決定のための１回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により、図５（ａ）に示したリン脂質クラス決定メソッドリストの中で一点鎖線の囲みで示したＰＣ（３２：１）のリン脂質化合物が検出されたものとすると、図５（ｂ）に示した脂肪酸組成決定用メソッドリストの中でＰＣ（３２：１）に関連付けられている三つの組み合わせ、即ち、ＰＣ（３２：１−１４：０／１８：１）、ＰＣ（３２：１−１４：１／１８：０）、ＰＣ（３２：１−１６：０／１６：１）が抽出される。

図５から明らかであるように、図５（ａ）に示したリン脂質クラス決定メソッドリスト中の化合物と図５（ｂ）に示した脂肪酸組成決定用メソッドリスト中の化合物とは一対一である場合もあれば一対多である場合もあり、決まっているわけではない。しかしながら、リン脂質クラス決定メソッドリスト中の化合物と脂肪酸組成決定用メソッドリスト中の化合物とは関連付けがなされているから、検出されたリン脂質クラスの化合物に対応する脂肪酸組成決定用メソッドを速やかに抽出することができる。そして、目的試料中で検出された全てのリン脂質化合物に対応する脂肪酸組成決定用メソッドが抽出されたならば、一つのリン脂質化合物に対応するリン脂質クラス決定用のＭＲＭトランジションと、その一つのリン脂質化合物に対応する一又は複数の脂肪酸組成決定用のＭＲＭトランジションとを一組として並べるように２回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のための分析メソッドを作成する（ステップＳ７）。

例えば図６に示す分析メソッドにおいて、左端に矢印で示したＭＲＭトランジションはリン脂質クラス決定用のＭＲＭトランジションであり、それ以外は脂肪酸組成決定用のＭＲＭトランジションである。ここで挙げられているリン脂質クラス決定用ＭＲＭトランジションの下でのＭＲＭ測定はすでに行われているから必ずしも実行する必要はないものの、このようにリン脂質クラス決定用ＭＲＭトランジションも組み入れることで、一つの化合物（リン脂質）の構造を推定するために確認すべきＭＲＭトランジションを１回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の中で併せて評価することができる。また、後述するように、化合物（リン脂質）の構造を推定するための有用なデータであるクロマトグラムをまとめて描出する際にも都合がよい。

脂肪酸組成決定メソッド作成部４４により目的試料に対する２回目（又はそれ以降の）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のための分析メソッドが作成されたならば、分析制御部４１はこの分析メソッドに従って目的試料に対する２回目（又はそれ以降）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実行するように各部を制御する（ステップＳ８）。２回目以降のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は検出すべきＭＲＭトランジションが相違するだけで基本的には１回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析と同じである。

この分析では、目的試料中に存在するリン脂質のリン脂質クラスに対応する保持時間範囲中で、該リン脂質が有する脂肪酸組成に対応するＭＲＭトランジションに対応してのみ検出信号が得られる。換言すれば、或る保持時間範囲においてマスクロマトグラムに有意なピークが現れたならば、そのピークが得られたＭＲＭトランジションに対応する脂肪酸組成が、目的試料中のリン脂質の脂肪酸組成である。そこで、データ処理部３においてクロマトグラム作成部３２はＭＲＭトランジション毎にデータ記憶部３１に記憶されているデータに基づいてマスクロマトグラムを作成し、ピーク面積値算出部３３はマスクロマトグラムにおいてピークを検出し、検出されたピークの面積値を算出する。ピーク面積値算出部３３はＭＲＭトランジションに対応する化合物毎にピーク面積値を記載したテーブルを作成し、リン脂質構造推定部３４はピーク面積値が閾値を超えているものを見つけてリン脂質クラス毎に脂肪酸組成を推定する（ステップＳ９）。その後、リン脂質クラスと脂肪酸組成との組み合わせから、目的試料中のリン脂質の構造を推定し、リン脂質を特定して表示部６から解析結果として出力する（ステップＳ１０）。

また、ユーザが入力部５から所定の操作を行うと、クロマトグラム作成部３２は、２回目のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析で用いられた分析メソッドに列記されているＭＲＭトランジションの中でピークが検出されたＭＲＭトランジションのマスクロマトグラムのみを抽出して、一つのグラフ上に時間軸（横軸）を合わせて信号軸（縦軸）をずらして重ね書きしたマスクロマトグラムを作成し表示部６に描出する。図７はこうして描出されるマスクロマトグラムの一例であり、実際には各マスクロマトグラムは異なる表示色で示される。

この例では、上側にリン脂質クラス決定用ＭＲＭトランジション（図６中に矢印で示したＭＲＭトランジション）の下で得られた複数のマスクロマトグラム、下側に脂肪酸組成決定用ＭＲＭトランジション（図６中で矢印が付されていないＭＲＭトランジションで且つピークが得られたＭＲＭトランジション）の下で得られた複数のマスクロマトグラムがまとめて記載されているが、リン脂質クラス決定用ＭＲＭトランジションの下で得られたマスクロマトグラムと脂肪酸組成決定用ＭＲＭトランジションの下で得られたマスクロマトグラムとを組にして並べて配置してもよい。

このようにして本実施例のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いたリン脂質一斉分析方法によれば、ユーザによる面倒なメソッド作成なしに目的試料に含まれるリン脂質の脂肪酸組成を含めた一斉分析を行うことができる。

なお、上記リン脂質一斉分析方法はリン脂質に限らず、様々な化合物群の多成分一斉分析に利用することができる。具体的には、糖鎖を代表とする翻訳後修飾を受けたペプチド又はタンパク質の一斉分析、基本骨格に結合している部分構造が代謝によって様々に変化する代謝物の一斉分析、或いは、基本骨格に結合している部分構造が意図的な改変によって様々に変化する薬毒物などの一斉分析などにも有効である。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…液体クロマトグラフ（ＬＣ）部
１０…移動相容器
１１…ポンプ
１２…インジェクタ
１３…カラム
２…質量分析部
２０…イオン化室
２０１…イオン化プローブ
２０２…加熱キャピラリ
２１…第１中間真空室
２１１、２２１…イオンガイド
２１２…スキマー
２２…第２中間真空室
２３…分析室
２３１…前段四重極マスフィルタ
２３２…コリジョンセル
２３３…多重極イオンガイド
２３４…後段四重極マスフィルタ
２３５…イオン検出器
２４…電源部
３…データ処理部
３１…データ記憶部
３２…クロマトグラム作成部
３３…ピーク面積値算出部
３４…リン脂質構造推定部
４…制御部
４１…分析制御部
４２…リン脂質クラス決定メソッド作成部
４３…既検出リン脂質クラス抽出部
４４…脂肪酸組成決定メソッド作成部
４５…リン脂質クラス決定用メソッド記憶部
４６…脂肪酸組成決定用メソッド記憶部
５…入力部
６…表示部

Claims

ＭＲＭ測定が可能である質量分析装置を用い、グループを決定付ける第１の部分構造と鎖構造である第２の部分構造とが直接に又は中心骨格を介して結合されてなる化学構造を有する、一つの化合物群に含まれる複数種類の化合物を一斉に分析する多成分一斉分析方法であって、
a)少なくとも第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスに従って目的試料に対する１回目の測定を実施する第１の測定実行ステップと、
b)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて前記目的試料に含まれる前記一つの化合物群に含まれる化合物の一又は複数のグループを特定するグループ特定ステップと、
c)前記グループ特定ステップにおいて特定された一又は複数のグループにそれぞれ対応する第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを予め用意された情報から抽出し、少なくともその第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスを作成する測定シーケンス作成ステップと、
d)前記測定シーケンス作成ステップにおいて作成された測定シーケンスに従って前記目的試料に対する２回目又はそれ以降の測定を実施する第２の測定実行ステップと、
e)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果及び前記第２の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて、目的試料に含まれる、前記一つの化合物群に含まれる化合物の化学構造を推定する構造推定ステップと、
を有することを特徴とする質量分析装置を用いた多成分一斉分析方法。
請求項１に記載の質量分析を用いた多成分一斉分析方法であって、
分析対象である前記一つの化合物群は、リン酸を含む極性基である第１の部分構造と、脂肪酸である第２の部分構造とが、グリセリン又はスフィンゴシンである中心骨格を介して結合されたリン脂質であり、前記少なくとも第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションはリン脂質のクラスを特定するものであり、前記第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションは少なくとも脂肪酸の炭素数及び二重結合数を決定するものであることを特徴とする質量分析を用いた多成分一斉分析方法。
ＭＲＭ測定が可能である質量分析装置を用い、グループを決定付ける第１の部分構造と鎖構造である第２の部分構造とが直接に又は中心骨格を介して結合されてなる化学構造を有する、一つの化合物群に含まれる複数種類の化合物を一斉に分析するために、前記質量分析装置で得られたデータを処理するとともに該質量分析装置の動作を制御するべくコンピュータ上で動作する多成分一斉分析用プログラムであって、
a)少なくとも第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスを作成する第１の測定シーケンス作成ステップと、
b)前記第１の測定シーケンス作成ステップで作成された測定シーケンスに従って目的試料に対する１回目の測定を実施するように各部の動作を制御する第１の測定実行ステップと、
c)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて前記目的試料に含まれる前記一つの化合物群に含まれる化合物の一又は複数のグループを特定するグループ特定ステップと、
d)前記グループ特定ステップにおいて特定された一又は複数のグループにそれぞれ対応する第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを予め用意された情報から抽出し、少なくともその第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションを測定条件とした測定シーケンスを作成する第２の測定シーケンス作成ステップと、
e)前記第２の測定シーケンス作成ステップにおいて作成された測定シーケンスに従って前記目的試料に対する２回目又はそれ以降の測定を実施するように各部の動作を制御する第２の測定実行ステップと、
f)前記第１の測定実行ステップにより得られた結果及び前記第２の測定実行ステップにより得られた結果に基づいて、目的試料に含まれる、前記一つの化合物群に含まれる化合物の化学構造を推定する構造推定ステップと、
をコンピュータに実行させることを特徴とする多成分一斉分析用プログラム。
請求項３に記載の多成分一斉分析用プログラムであって、
分析対象である前記一つの化合物群は、リン酸を含む極性基である第１の部分構造と、脂肪酸である第２の部分構造とが、グリセリン又はスフィンゴシンである中心骨格を介して結合されたリン脂質であり、前記少なくとも第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションはリン脂質のクラスを特定するものであり、前記第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションは少なくとも脂肪酸の炭素数及び二重結合数を決定するものであることを特徴とする多成分一斉分析用プログラム。
請求項３又は４に記載の多成分一斉分析用プログラムであって、
前記第２の測定シーケンス作成ステップでは、前記グループ特定ステップにおいて特定されたグループに特異的な第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションと、そのグループに対応する第２の部分構造を識別する１又は複数のＭＲＭトランジションとを組とした測定シーケンスを作成することを特徴とする多成分一斉分析用プログラム。
請求項３〜５のいずれか１項に記載の多成分一斉分析用プログラムであって、
前記質量分析装置は衝突誘起解離を利用してイオンを解離させるイオン解離部を有する装置であり、
前記第１及び第２の測定シーケンス作成ステップでは、衝突誘起解離における衝突エネルギを測定条件の一つとして定め、ＭＲＭトランジションに応じて異なる衝突エネルギを設定することを特徴とする多成分一斉分析用プログラム。
請求項３〜６のいずれか１項に記載の多成分一斉分析用プログラムであって、
前記第２の測定シーケンス作成ステップでは、同一時間帯に実質的に並行して実行すべきＭＲＭトランジションの数に応じて、前記第２の測定実行ステップにおける測定を２回以上実行するように測定シーケンスを作成することを特徴とする多成分一斉分析用プログラム。
請求項５に記載の多成分一斉分析用プログラムであって、
少なくとも同じ組に含まれる第１の部分構造を識別するＭＲＭトランジションの下で得られたクロマトグラムと、第２の部分構造を識別するＭＲＭトランジションの下で得られたクロマトグラムとを時間軸を合わせた同一のグラフ上に描画するデータ処理ステップをさらに有することを特徴とする多成分一斉分析用プログラム。