CN107923826B - 用于分析组织样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明大体上涉及用于分析组织样品的方法。在某些方面,本发明提供的方法涉及获得包括不饱和化合物的组织样品;在该组织样品上以该不饱和化合物内的一个碳‑碳双键为目标进行自由基反应,由此产生多种化合物异构体;对该多种化合物异构体进行质谱分析以鉴别该碳‑碳双键在该不饱和化合物内的位置;及对该多种化合物异构体进行定量以便区分正常组织与病变组织。
Description
相关申请
本申请要求2015年5月29日提交的美国临时申请系列编号62/168,033的权益和优先权,其各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
政府支持
本发明是根据美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)授予的GM106016以及美国国家科学基金会(NationalScience Foundation)授予的CHE1308114在政府支持下完成。美国政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本发明大体上涉及用于分析组织样品的方法。
背景技术
脂质是结构多样的分子,因为这些分子由多种不同头基、主链及疏水性酰基链组成。脂质充当质膜的结构单元并且在生物系统中的信号转导和储能方面起到至关重要的作用。利用脂质中头基、酰基链长度及不饱和程度的变化可调节膜特性和功能,如粘度、脂质-蛋白质相互作用及脂质-脂质相互作用,所有这些对于正常细胞功能都很重要。相应地,由于总体脂质组成随疾病变化,故脂质概况在诊断实践中越来越多地被用作探查疾病状态的标志。
然而,在使用质谱法分析脂质概况时,异构和/或同量异位脂质呈现单峰,使得谱图解释以及如组合物内所含脂质物种的量等详细组成信息的采集变得困难。这具有深远意义,因为现有的研究显示,脂质酰基链中C=C的数量和位置在生物学上极为重要(Groeger等人,《自然-化学生物学(Nat Chem Biol)》6,433-441(2010);Lombard等人,《自然综述:微生物学(Nat Rev Micro)》10,507-515(2012);及Blanksby等人,《分析化学年评(AnnualReview of Analytical Chemistry)》3,433-465(2010))。举例来说,具有ω-6和ω-3脂肪酰基的磷脂(PL)可以在体内转化成具有相反生物活性的化合物(Groeger等人,《自然-化学生物学》6,433-441(2010))。
气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)是允许定量脂质(和/或其C=C异构体)的传统方法。然而,需要烦琐的样品制备、专用的GC柱并且需要耗费时间来优化色谱条件。考虑到脂质组中脂质的数量庞大并且类型不同,特别需要能够不用分离并且无差别地进行结构表征和定量的方法。质谱法(MS)由于具有优良的灵敏度和特异性,现已成为进行脂质分析的所选方法,但MS方法朝向同时进行全脂质组完全结构表征(“自上向下”脂质组学)和定量的扩展仍难以实现。相较于有关饱和脂质的分析,针对不饱和脂质的分析在两个方面面临挑战:C=C的数量和位置的鉴别以及脂质C=C异构体的定量。过去二十年里已经见证了成功表征脂质C=C异构体的基于化学衍生化的方法不断发展。不过,这些方法极少涉及这些异构体的定量。
发明内容
不饱和脂质在生物体总脂质中占较大比例,并且其物理特性、化学反应性及生物转化与多种生理和生理化学功能密切相关。然而,同时鉴别和定量脂质C=C异构体,尤其是在复杂混合物中鉴别和定量脂质C=C异构体在当前仍具有挑战性。本发明提供了通过将自由基反应(例如帕特诺-比希反应(Paternò-Büchireaction))与串联质谱法相结合来进行组织中脂质C=C异构体的整体表征和定量的方法。使用这些方法,已经证实在大鼠体内,脂肪酸(FA)18:1和含有C18:1的磷脂都以两种C=C异构形式存在:C18:1 n-7和C18:1 n-9,不过其相对比率随脂质和组织类型而不同。在小鼠的正常乳房组织与癌症乳房组织之间观察到FA18:1和含C18:1的磷酸胆碱的异构体组成存在明显差异。所要求的方法特别适合定量鸟枪法(shotgun)脂质组学并且通过准确定量基础的不饱和脂质促进先进生物研究。
在其它方面,本发明的方法可以应用于鸟枪法脂质组学。从组织样品中提取出脂质,并且接着将其转移至含有PB试剂的溶剂中。将溶剂转移至nanoESI管中。提供适当波长的紫外光以促进反应。建立喷雾电离条件,如对溶剂施加高电压,并产生PB反应产物的离子,随后使用MS和串联MS分析对这些离子进行质量分析。
在某些实施例中,本发明的方法可以用于在线HPLC-MS。将PB试剂混入HPLC的洗脱中。使连接HPLC和MS的毛细管部分暴露于适当波长的紫外光以起始反应。接着使溶液中的产物电离以使用MS和串联MS进行分析。
如上文所论述,本发明的方法可以用于定量分析。由脂质PB产物离子的CID获得特征性的片段离子,即PB试剂的中性丢失及C=C诊断离子被用作进行定量。当使用丙酮作为PB试剂时,将使用58Da的中性丢失扫描(neutral loss scan,NLS)定量由C-C双键组成的脂肪酸、甘油脂质及固醇脂质。在定量脂质C=C异构体的情况下,使用C=C诊断离子的离子强度进行相对或绝对定量。
在某些实施例中,本发明的方法可以用于体内组织分析。使用针触碰组织样品,并且接着将其插入含有溶剂和PB试剂的nanoESI管中。将用针取得的脂质样品溶解于溶剂中。提供适当波长的光以起始PB反应并且建立喷雾条件以电离反应产物,随后使用MS和串联MS进行分析。此类方法可以基于提取喷雾(extraction spray),该提取喷雾描述于例如颁予Purdue Research Foundation的国际专利申请公开号WO 2014/120411中,其内容以全文引用的方式并入本文中。
本发明的方法还可以用于MS成像。在MALDIMS中,可以将反应试剂混入MALDI基质中或单独地喷洒至组织上。当施加MADLI的UV激光进行解吸附电离时,可以起始反应。除MALDI激光外,也可以提供仅针对PB反应的独立光源。上述方法适用于使用激光消融进行表面分析的敞开式MS法,如激光消融电喷雾电离(LAESI,《分子生物学方法(Methods MolBiol.)》2010;656:159-71.doi:10.1007/978-l-60761-746-4_9)及电喷雾激光解吸附电离(《快速质谱通讯(Rapid Commun Mass Spectrom.)》2005;19(24):3701-4.)。使用如nanoDESI(《分析化学(Anal Chem.)》2012年1月3日;84(1):141-8.doi:10.102l/ac2021322)或液体萃取表面分析(LESA,《快速质谱通讯》2011年12月15日;25(23):3587-96.doi:10.1002/rcm.5274)等方法进行表面分析的敞开式MS。在这些方法中,一个通道(通道I)被用于递送溶剂以萃取化合物并且另一通道(通道II)被用于向MS进口输送含分析物的溶剂,在MS进口中,建立电离条件以电离所萃取的分析物。可以通过将PB试剂混合至萃取溶剂中并使通道II中的溶剂暴露于适当波长的紫外光来实施PB反应。
在某些方面,本发明提供用于分析组织样品的方法,这些方法涉及获得包括不饱和化合物的组织样品。在该组织样品上以该不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标进行自由基反应,由此产生多种化合物异构体。对该多种化合物异构体进行质谱分析以鉴别所述碳-碳双键在不饱和化合物内的位置。然后,对该多种化合物异构体定量以便区分正常组织与病变组织。可以对多种不同类型的不饱和化合物进行本发明的方法。例示性不饱和化合物包括脂质或脂肪酸。
多种不同类型的自由基反应可以被用于本发明的方法,只要该反应以不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标即可。在某些实施例中,自由基反应包括使不饱和化合物及用于自由基反应的试剂暴露于紫外光。在某些实施例中,自由基反应是帕特诺-比希(PB)反应。在此类实施例中,帕特诺-比希(PB)反应可以在包含丙酮的溶剂混合物中进行。
自由基反应可以在不饱和化合物处于质谱探针内时进行。在此类实施例中,质谱探针的至少一部分可以对紫外光透明。举例来说,质谱探针可以由对约200nm波长的紫外光透明的材料构成。在其它实施例中,自由基反应是在容器中进行并且在该反应之后,将化合物异构体转移至质谱探针中。在其它实施例中,自由基反应是结合高压液相色谱系统进行并且用于自由基反应的试剂是在洗脱溶剂内。
本发明的其它方面提供用于分析组织样品的方法,这些方法涉及使取样探针与包括不饱和化合物的组织接触,该接触方式使得不饱和化合物保留在取样探针上。将取样探针插入中空体中,其中在该中空体内存在用于自由基反应的试剂并且该自由基反应以不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标。在中空体内进行自由基反应以产生反应产物。将反应产物从中空体的远侧尖端排出。接着,在质谱仪中分析排出的反应产物以便鉴别所述碳-碳双键在不饱和化合物内的位置。可以对多种不同类型的不饱和化合物进行本发明的方法。例示性不饱和化合物包括脂质或脂肪酸。
样品探针可呈多种构造,并且带有远侧尖端的分析探针与本发明的方法相容。在某些实施例中,取样探针包括针。
多种不同类型的自由基反应可以被用于本发明的方法,只要该反应以不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标即可。在某些实施例中,自由基反应包括使不饱和化合物及用于自由基反应的试剂暴露于紫外光。在某些实施例中,自由基反应是帕特诺-比希(PB)反应。在此类实施例中,帕特诺-比希(PB)反应可以在包括丙酮的溶剂混合物中进行。
自由基反应可以在不饱和化合物处于质谱探针内时进行。在此类实施例中,可以在不饱和化合物流经中空体时,同时进行反应。在此类实施例中,质谱探针的至少一部分可以对紫外光透明(例如,整个中空体的至少一部分可以由石英玻璃或熔融硅石构成)。举例来说,质谱探针可以由对约200nm波长的紫外光透明的材料构成。
本发明的其它方面提供了用于使组织样品成像的方法。此类方法可以涉及将用于自由基反应的试剂引入包括不饱和化合物的组织中,其中该自由基反应以不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标。进行自由基反应以产生反应产物。扫描组织以使得反应产物以时间分辨的方式解吸附并电离。在质谱仪中分析解吸附并电离的反应产物。基于分析步骤的结果,产生组织的图像。在某些实施例中,该进行步骤与该扫描步骤是同时发生的。在其它实施例中,这些步骤是依序发生的。
在某些实施例中,扫描包括在组织上的多个不同位置处使用解吸附电喷雾电离探针进行解吸附电喷雾电离技术。用于自由基反应的试剂可以通过解吸附电喷雾电离探针引入组织中并且可以对组织施加紫外光。在某些实施例中,该进行步骤与该扫描步骤是同时发生的。在其它实施例中,这些步骤是依序发生的。
在其它实施例中,引入步骤包括将用于自由基反应的试剂以MALDI基质施加至组织。在此类实施例中,扫描涉及在组织上的多个不同位置处使用MALDI源进行MALDI技术。在某些实施例中,该进行步骤与该扫描步骤是同时发生的。在其它实施例中,这些步骤是依序发生的。
在某些实施例中,脂质和组织分析涉及使用小型质谱仪。可以使用适当波长的LED或LED阵列提供PB反应所需的光。PB反应电离源可以与具有串联MS能力的DAPI-MS仪器组合。
本领域中已知的任何类型的质谱仪都可以用于本发明的方法。举例来说,质谱仪可以是标准台式质谱仪。在其它实施例中,质谱仪是小型质谱仪。例示性小型质谱仪描述于例如Gao等人(《分析化学与生物分析化学(Z.Anal.Chem.)》2006,78,5994-6002)中,其内容以全文引用的方式并入本文中。与具有数千瓦功率的用于实验室规模仪器的泵送系统相比,小型质谱仪一般具有较小泵送系统,如用于Gao等人所描述的系统中的仅具有5L/min(0.3m3/hr)隔膜泵和11L/s涡轮泵的18W泵送系统。其它例示性小型质谱仪描述于例如Gao等人(《分析化学》,80:7198-7205,2008)、Hou等人(《分析化学》,83:1857-1861,2011)以及Sokol等人(《国际质谱学杂志(Int.J.Mass Spectrom)》,2011,306,187-195)中,其各自的内容以全文引用的方式并入本文中。小型质谱仪也描述于例如以下中:Xu等人(JALA,2010,15,433-439);Ouyang等人(《分析化学》,2009,81,2421-2425);Ouyang等人(《分析化学年评(Ann.Rev.Anal.Chem.)》,2009,2,187-214);Sanders等人(《欧洲质谱学杂志(Euro.J.MassSpectrom.)》,2009,16,11-20);Gao等人(《分析化学》,2006,78(17),5994-6002);Mulligan等人(《化学通讯(Chem.Com.)》,2006,1709-1711);以及Fico等人(《分析化学》,2007,79,8076-8082),其各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
本发明的方法可以任选地涉及使用不连续界面并且中性分子的电离可以与不连续界面的操作同步。此类系统和方法描述于例如Ouyang等人(美国专利号8,304,718)和Ouyang等人(美国专利号8,785,846)中,其各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
附图说明
图1A-B显示光化学衍生化-串联MS鉴别和定量不饱和脂质的原理。图1A显示P-B反应与nanoESI-MS相结合的例示性设置。图1B是说明产生不同脂质C=C异构体特有的独特诊断离子的方案(右)。+/-表示正/负电荷。仅带有电荷的片段可作为诊断离子被检测。图1C是FA 18:1n-9与FA 18:1n-7的4:1混合物的P-B反应谱图,其中观察到P-B反应产物的形成(m/z339.3)。图1D是完整FA 18:1n-9的CID质谱。没有撷取到C=C位置信息。图1E是质谱,显示在CID时,该FA 18:1混合物的P-B反应产物在m/z 171.1/197.2和m/z 199.1/225.2处释放两对不同的诊断离子,清楚地显示FA18:1n-9及n-7两种异构体的存在。图1F是等摩尔的PC18:1n-9/18:1 n-9和PC 18:1n12/18:1n12(m/z 786.6)的反应质谱。图1G是完整PC(m/z786.6)之CID质谱,其中没有撷取到C=C位置信息。图1H是由上述PC混合物得到的P-B反应产物(m/z 844.6)的CID质谱。以高丰度形成两对诊断离子(m/z 634.5/660.5和m/z 676.6/702.6),对应于各PC异构体中C=C的位置。
图2A-D显示脂质C=C异构体的相对和绝对定量的原理。图2A是P-B反应与串联MS相结合以产生供定量的诊断离子的方案。图2B显示摩尔比与相应强度比率之间的线性关系:PC C=C异构体(左)和FA C=C异构体(右)。图2C显示使用C18:1 n-6(IS,22.70μM)进行FA 18:1n-9或n-7的绝对定量的校准曲线。图2D显示在此研究中开发的两种绝对定量方法的性能的验证。
图3A-F显示大鼠脑中不饱和脂质的相对定量。图3A显示MUFA(FA16:1、FA18:1、FA19:1、FA 20:1及FA 22:1)和PUFA(FA 18:1、FA 20:4)的异构体组成,其中链长范围是16至22个碳。图3B显示含C18:1的PL的异构体组成。图3C显示溶血PE20:1的异构体组成。图3D显示PC1:0/16:1的异构体组成。图3E显示含C18:2的PL的异构体组成。图3F显示溶血PE22:5的异构体组成。图3G显示含C22:4的PL的异构体组成。图3H显示含C20:4的PL的异构体组成。图3I显示含C22:6的PL的异构体组成。异构体组成是以一种异构体的诊断离子的总强度在来自所有异构体的诊断离子的总强度中所占百分含量表示。
图4A-B显示在大鼠器官(包括脑、脂肪、肾、肝及肌肉)及小鼠乳癌组织中含有C18:l的PC和FA18:1异构体的异构体组成的变化。图4A显示在大鼠器官中PC16:0/18:1异构体的组成。图4B显示在大鼠器官中FA 18:1异构体的组成。
图4C-F显示正常小鼠乳房组织(WT)与癌症小鼠乳房组织之间FA18:1和含C18:1的PC(PC16:0/18:1、PC18:0/18:1、PC18:1/18:1)的异构体组成的比较。(图4C)FA18:1。(图4D)PC 16:0/18:1。(图4E)PC 18:0/18:1。(图4F)PC 18:1/18:1。
图5A-B显示前体离子注入时间对不同逆P-B反应通道(产生诊断离子的通道和由于丙酮的中性丢失而引起m/z 281的通道)具有的影响可忽略。图5A显示前体离子(m/z339)、由于58Da中性丢失产生的离子(m/z281)及诊断离子(m/z 171/197)的绝对强度随离子注入时间(10-200ms)的变化。图5B显示中性丢失的片段和诊断离子的相对强度随注入时间(10-200ms)的变化。诊断离子(m/z 171和197)和中性丢失的片段(m/z 281)的相对量与离子注入时间无关,其在10ms至200ms内经历20倍增加。
图6显示在254nmUV照射下,PC 18:1/18:1(两种C=C异构体的混合物)与丙酮之间的P-B反应的动力学。观察到较快反应速率:在0.4分钟内,反应变得稳定。之后,各异构体的诊断离子之间的比率变得恒定,由此为定量分析奠定基础(参见在时间点1、2及3时的三个串联谱图)。
图7A-D是油酸/顺异油酸混合物溶液(不同摩尔比)的P-B反应产物的CID质谱。
图8A-C显示能够对脂质C=C异构体绝对定量的三种方法。以FA18:1异构体为例来展示原理。IS:内标。
图9A-B显示利用CID,以正离子和负离子模式进行的PL的相对定量(以PC18:0/18:1和溶血PE18:1为例)。图9A显示PC18:0/18:1:完整PC的CID在m/z 184.1处产生特征离子,但无C=C位置信息。在P-B反应和串联MS之后,产生两对诊断离子(m/z 678.5/704.6和706.6/732.6),表明存在PC 18:0/18:1n9和PC 18:0/18:1n11。图9B显示对于溶血PE,也可以通过去质子化离子的CID获取酰基链信息(C18:1,m/z281.3)。值得注意的是,在P-B反应之后,其P-B反应产物的CID释放出衍生化的脂肪酰基(m/z 339.3),而无诊断离子。为了获取C=C位置信息,需要对m/z 339.3进行另一阶段断裂以产生含信息的诊断离子。实际上,在MS3-CID之后,观察到两对诊断离子(m/z 171.0/197.0和199.0/225.1),表明溶血PE18:1以溶血PE 18:1n9与溶血PE 18:1n1l的混合物形式存在。所用PC 18:0/18:1和溶血PE 18:1分别来自大鼠的脑和肾。
图10显示大鼠脂肪组织中FA 18:2的P-B反应产物的MS2离子阱CID质谱。检测到在m/z 171.0/197.1和211.0/237.1处的两对诊断离子。这两对之间40Da的质量差异表明,FA18:2中的两个C=C是亚甲基分离的。
图11A-D显示大鼠肾中FA 20:4的结构表征。图11A显示添加有1%(wt)LiCl的大鼠肾FA提取物的+nanoESI质谱。图11B显示在UV照射之后,该样品的+nanoESI质谱。图11C显示锂化FA20:4的P-B反应产物(m/z 311.3)断裂产生四对诊断离子(m/z 123/149、163/189、203/229、243/269,呈蓝色),对应于花生四烯酸(FA20:4n6)中的四个C=C。图11D显示当将20:4n3添加至该FA提取物样品中时,在m/z 165/191、205/231、245/271及285/311出现另一组不同的诊断离子,这些离子可以用于定量FA 20:4异构体。图11E显示Ω-6花生四烯酸和Ω-3花生四烯酸的诊断离子。
图12显示了说明IFA20:4n6/IFA 20:4n3与cFA 20:4n6/cFA20:4n3的线性关系的校准曲线。
图13显示C18:2在PC 18:0/18:2中仅呈C18:2n6形式。通过[PC 36:2+Cl]-的CID获取到PC36:2的酰基链信息。在此情况下,PC36:2(来自大鼠肝)被表征为PC 18:0/18:2。在P-B反应和串联MS之后,可以指定C18:2中的C=C位置在9Z和12Z处。
图14A-B显示PE 16:0/20:4中的C20:4脂肪酰基仅呈C20:4n6形式。图14C显示PC16:0/20:4n6的诊断离子的化学结构。
图15显示PC 16:0/22:6内的C22:6脂肪酰基仅呈C22:6 n3形式。
图16显示大鼠组织中油酸和顺异油酸的生物合成路径。
图17A-D显示来自大鼠组织的复杂脂质提取物样品的代表性PIS和NLS质谱。
图18A-F显示PIS质谱,其中呈现含有C16:0、C18:1、C18:0、C20:4、C22:6或C22:4的脂质集合。
图19是一组饼图,提供了在大鼠脑中鉴别的PL及其C=C异构体的概述。这些图显示本发明方法(左)与文献报道(右)在所鉴别的磷脂数量和类型方面的比较。
图20显示在大鼠肾、肝及肌肉中含C18:1的PL的异构体组成。
图21显示在P-B反应之前(上图)和之后(下图),来自大鼠脑的FA提取物样品的nanoESI质谱。
图22显示通过FA 18:1(大鼠脑、肝、肌肉、脂肪及肾)的P-B反应产物(m/z 339.3)的串联MS进行的FA 18:1异构体的相对定量。
图23A-D显示相较于由正常小鼠乳房组织(WT)得到的结果,在小鼠乳癌组织中观察到FA 18:1n7及含C18:1 n7的PC的一致性增加。来自正常组织(各图中的左边)和癌组织(各图中的右边)的(图23A)FA18:1、(图23B)PC 34:1、(图23C)PC 36:1及(图23D)PC 36:2的P-B反应产物的CID质谱。在(图23D)中,还清楚地观察到PC18:0/18:2的相对量减少。允许鉴别PC 18:0/18:2的诊断离子是m/z 678.5/704.5和718.5/744.6。
图24显示用于研究光化学产物形成的速率的不连续UV曝光反应设置的描绘。
图25A-E显示质谱和时间序列图,描绘了在7:3丙酮:H2O加1%乙酸中含有N2吹扫的5μM PC 16:0_18:1(n-9Z)的溶液的UV曝光情况。图25A显示MS1谱图,显示了在UV曝光之前在m/z 760.6处的前体信号。图25B显示6秒累积UV曝光稳态反应条件(N2吹扫的溶液),其中m/z 818.6是P-B反应产物。图25C显示m/z 818.6的射束型(Beam-type)CID,显示C=C诊断离子在m/z 650.6和676.6处。图25D显示在6秒稳态UV曝光之前、期间及之后m/z 760.6和818.6的XIC色谱图。图25E显示在4.5μL/min流动速率下,随着UV累积曝光时间增加,前体(m/z 760.6)和P-B反应产物(m/z 818.6)的离子强度。
图26A-D显示使用图24的实验装置,施加至N2吹扫的5μM油酸(n-9Z)于7:3丙酮:H2O加1%NH4OH中的溶液的在线P-B反应。图26A显示在UV之前油酸(m/z 281.2)的MS1谱图。图26B显示6秒UV曝光的MS1反应谱图,显示P-B产物在m/z 339.3处。图26C显示,m/z 339.3的射束型CID除显示在m/z 170.1和197.1处的诊断离子外,还显示单不饱和油酸离子(m/z281.2)。图26D显示时间序列图,描绘了m/z 281.2和339.3的相对强度随累积UV曝光的变化。
图27A显示在渐进地增加的流动速率下,在5秒UV曝光下,N2吹扫的5μM PC 16:0_18:1(n-9Z)于7:3丙酮:H2O加1%乙酸中的溶液的前体与P-B产物的强度比率。图27B显示在6秒UV曝光之后,由70:15:15丙酮:H2O:溶剂加1%乙酸构成的5μM PC16:0_18:1(n-9Z)溶液的P-B产率,其中溶剂在条形图的x轴上指示。对于最后一个条柱中的数据,使用了甲酸铵(AF)(2mM)代替乙酸。
图28A-E显示通过直接注射将P-B反应物施加至以负电离模式分析的市场上购买的酵母极性脂质提取物上。图28A显示在UV之前的MS1谱图。图28B显示在UV期间的MS1反应谱图(P-B产物呈红色)。图28C显示异构体PE16:0_18:1(n-9)和PE18:0_16:1(n-7)的P-B产物(m/z774.5)的MS2射束型CID。图28D显示来自图28B的m/z 339.2的MS3离子阱CID。图28E显示来自图28B的m/z 311.2的MS3离子阱CID。
图29A-B显示利用提取喷雾与P-B反应的组合,直接鉴别组织中脂质的C=C键位置的示意性概述。图29A显示利用不锈钢探针(200μm,o.d.)对组织取样及在毛细管中提取脂质且随后利用nano-ESI和紫外光(λ=254nm)进行MS分析。图29B显示丙酮与脂肪酸之间的帕特诺-比希(P-B)反应结合逆P-B反应中可能的指纹片段离子来定位双键位置。
图30A-I显示利用在线P-B反应和提取喷雾质谱的组合进行的直接脂质分析。图30A-C显示在UV照射-nano ESI诱导P-B反应之前及之后通过提取喷雾自大鼠脑、肾及肝取得的脂质样品的质谱。图30D显示在m/z 778.5处的PS 18:0-18:1的MS2CID,用于鉴别头基和酰基链的长度。图30E-F显示在P-B反应之前,在与不饱和脂质的P-B反应产物(FA18:1,m/z339.3;PS 18:0-18:1,m/z846.5)相同的m/z值处的背景峰的MS2CID,用于扣除化学噪音。图30G-H显示在P-B反应之后,不饱和脂质的P-B反应产物的MS2CID。根据新产生的指纹峰(对于n-9,m/z 171.0和197.0;对于n-7,m/z199.0和225.1),在肾中FA 18:1的双键可以直接鉴别为n-9和n-7。对于PS 18:0-18:1,形成不饱和酰基链18:1的P-B反应产物并且在谱图中出现在m/z 339.3处。图30I显示来自PS18:0-18:1的P-B反应产物的m/z 339.3的MS3CID,指示双键位置在n-9和n-7处。
图31A-E显示利用在线P-B反应和提取喷雾质谱的组合进行的直接脂质分析。在UV照射诱导P-B反应之前(图31A)和之后(图31B),利用提取喷雾以负离子模式从大鼠肾取得的脂质样品的质谱。图31C显示在m/z339.3处P-B反应产物的MS2CID,用于测定肾中FA18:1的双键。图31D显示在m/z 778.5处的PS 18:0-18:1的MS2CID,用于鉴别头基和酰基链的长度。图31E显示来自PS 18:0-18:1的P-B反应产物的m/z 339.4的MS3CID。
图32A-E显示用于脂质提取的溶剂的优化。在含70%丙酮+10%H2O+20%X的配制物中直接提取的脂质的MS谱图,X=(图32A)H2O、(图32B)异丙醛(IPA)、(图32C)乙腈(ACN)。图32D-E显示溶剂对FA 18:0[(M-H)-,m/z 283.3]、FA 18:1[(M-H)-,m/z 281.3]及P S18:0-18:1[(M-H)-,m/z 788.5]的信号强度的影响。
图33A-C显示用于脂质和丙酮的P-B反应的溶剂的优化。图33A显示溶剂对FA18:1[(M-H)-,m/z281.3;反应产物离子,m/z339.3]的反应时间的影响。图33B显示溶剂对FA18:1和PS18:0-18:1[(M-H)-,m/z788.5;反应产物离子,m/z 339.3]的反应产率的影响。图33C显示溶剂对FA 18:1和PS 18:0-18:1[(M-H)-,m/z 788.5;反应产物离子,m/z339.3]的反应产率的影响。
图34A-B显示用于脂质和丙酮的P-B反应的灯条件的优化。在(图34A)存在或(图34B)不存在预加热UV灯(λ=254nm)下FA 18:1[(M-H)-,m/z 281.3]和其P-B反应产物离子[(M+58-H)-,m/z 339.3]的总离子电流。
图35A-C显示所分析的脂质的动态范围。图35A显示总脂肪酸中经鉴别的脂肪酸的摩尔百分比。图35B显示总脂质中经鉴别的磷脂的摩尔百分比。图35C显示在大鼠脑中在m/z381.3处的FA 21:1的MS2CID谱且图35D显示在m/z339.3处的PG 34:2的MS3CID,用于确定双键位置。
图36显示在五只大鼠脑部包括下丘脑(左和右)、运动皮质(左和右)、小脑及脑干在内的六个区域中PA 18:1-18:1(n-9比n-7)的异构体比率(±SD,N=5)。
图37A-D显示利用反应性提取喷雾质谱以负离子模式得到的大鼠脑和肾中脂质的2D异构体比率(±SD,N=3)图像。在(图37A)完整大鼠脑和(图37B)肾中分布的FA 18:1(n-9比n-7)的2D异构体比率图像。在完整大鼠脑中分布的(图37C)LPA 18:1(n-9比n-7)和(图37D)PA 18:1-18:1(n-9比n-7)的2D异构体比率(±SD,n=3)图像。
图38A-D显示利用反应性提取喷雾质谱以负离子模式得到的大鼠脑中不饱和脂质的二维异构体比率图像。(图38A)大鼠脑背侧和(图38B)大鼠肾切片的功能区的示意性图示。图38C显示大鼠脑中PA 18:1-18:1的二维异构体比率(±SD,N=3-9)图像。图38D是取样之前和取样50次之后大鼠脑的一组照片。
图39A-D显示大鼠脑前额皮质和脑干中脂肪酸和磷脂的不饱和度。
图40显示冷冻和解冻对脂质不饱和度的影响。新鲜大鼠脑和解冻的在-20℃下冷冻14天的脑的六个解剖区(包括左和右下丘脑、左和右运动皮质、小脑及脑干)中PA18:1-18:1的异构体比率。
图41显示P-B反应是光化学反应。
图42显示使用小型质谱仪进行组织分析的例示性设置。
图43A-E显示脂质概况分析结果。
图44显示磷酸胆碱的CID。
图45显示使用标准化合物进行的在线P-B反应。
图46显示使用大鼠脑样品进行的在线P-B反应。
图47A显示使用PB-MS/MS测定C=C的设置和原理。图47B显示在添加有1%NH4OH的1:1丙酮:H2O中10μM的FA 18:1(9Z)的NanoESI。图47C显示当打开UV灯时的PB反应谱图。图47D显示PB产物(m/z 339.3)的MS2CID引起在m/z 171和197处的C=C诊断离子的形成。
图48A-D显示PS 16:1(9Z)/18:1(9Z)中双键位置的阐释。图48A显示PS 16:1(9Z)/18:1(9Z)的结构及观察到的裂解位点。图48B显示在m/z 816.5处PS的P-B反应产物的MS2CID。图48C显示来自PS的P-B反应产物的m/z339.4的MS3CID。图48D显示来自PS的P-B反应产物的m/z 311.3的MS3CID。
图49A显示在70:30丙酮/H2O中制备的5μM的PC 16:0/18:1的PB反应MS谱图。图49B显示完整PC离子(m/z 760.6)和其PB产物(m/z 818.6)的XIC。
图50A显示PB反应的直接输注设置。图50B显示在4.5μL/min流动速率下UV曝光5秒的5μM PC 16:0/18:1(9Z)(7:3丙酮:H2O加1%乙酸)的PB反应MS谱图。插图显示完整PC及其PB产物的XID。图50C显示完整PC及PB产物随UV曝光时间变化的图。图50D显示PB反应的流动注射设置。灯放置在距毛细管0.5cm处。
图51A显示I型诺里什反应(Norrish Type Ireaction)及随后的涉及脂质氧化的自由基反应。从溶剂系统去除O2以提高PB反应产率:PC16:0/18:1(9Z)的10秒PB反应的MS谱图。图51B显示无N2吹扫的情形。图51C显示有N2吹扫的情形。
图52A显示使用苯甲醛作为PB试剂在351nmUV照射下进行的PC18:1(6Z)/18:1(6Z)的PB反应。图52B显示PB产物的MS2CID产生在m/z 648.4及722.5处的C=C诊断离子。
图53A显示预测的FA18:1(9Z)和(11Z)的C=C诊断离子。图53B显示FA18:1(9Z)和(11Z)混合物的PB产物的MS2CID。
图54显示使用FA17:1(10Z)作为内标定量FA18:1(9Z)的NL58扫描。插图:校准曲线。
图55A显示使用C=C诊断离子强度进行定量。图55B显示FA18:1(9Z)和(11Z)混合物的MS2CID谱。图55C显示由诊断离子强度比率得到的相对定量随摩尔比的变化。图55D显示使用FA 18:1(6Z)作为内标进行的FA 18:1(9Z)和(11Z)的绝对定量。
图56显示通过在鸟枪法分析基础上应用PB-MS/MS鉴别的来自酵母极性提取物的GP的C=C。
图57显示在柱分离后和ESI-MS中结合PB的方案。
图58A-C显示(图58A)FA、GP(图58B)及(图58C)来自大鼠脑的C=C异构体的组成。图58D显示FA 18:1和PC 16:0/18:1的C=C异构体在不同组织类型中的分布。
图59A-F显示FA17:1(10Z)和FA18:1(9Z)(3.5μM,各自在丙酮/H2O=50/50v/v中,其中添加有0.1%NH4OH)的等摩尔混合物的负离子模式nanoESI质谱:图59A显示在利用丙酮光化学标记之前的情形且图59B显示在利用丙酮光化学标记之后的情形。图59C显示经标记FA17:1(m/z325)的MS2射束型CID。标记丢失是主要断裂通道。来自人类血浆的FA提取物的负离子模式nanoESI-MS:图59D显示在丙酮标记之前的情形且图59E显示在丙酮标记之后的情形。图59F显示在丙酮标记之后的58Da中性丢失扫描(NLS)。FA标注中带“*”符号的数字代表FA的丙酮标记的数量。
图60A-B显示在25倍稀释之后2μL大鼠血液中FA提取物的负离子模式nanoESI质谱如下所示:图60A显示标记之前且图60B显示标记之后的NLS(58Da)。“#”符号指示化学干扰。
图61A显示在光化学反应期间未处理和丙酮标记的FA 17:1和FA 18:1的提取离子色谱图。
图61B显示经标记FA17:1和FA 18:1的NLS(58Da)。插图显示基于NLS(使用FA 17:1(10Z)作为IS)的FA 18:1(9Z)的校准曲线。
图61C和61D显示使用不同反应溶剂条件,FA 20:4(5Z、8Z、11Z、14Z)的光化学反应MS谱图:图61C使用丙酮/水(50/50,v/v)且图61D使用乙醇/丙酮/水(40/30/30,v/v/v)。
图62A-E显示来自人类血浆的FA的C=C位置异构体的分析。图62A显示经标记FA18:1(m/z339.3)的PB-MS/MS。检测到在Δ9和Δ11位置处具有C=C的两种异构体。图62B显示用于对FA18:1Δ9和Δ11异构体相对定量的校准曲线。图62C显示基于由91.5%Δ9和8.5%Δ11异构体组成的FA18:1混合物的58DaNLS对总FA18:1定量的校准曲线。图62D显示ω-3和ω-6FA18:3异构体(m/z343.3,经锂化)的等摩尔混合物的PB-MS/MS。清楚地检测到各异构体的C=C诊断离子。图62E显示来自人类血浆的FA18:3的C=C诊断离子的放大区的PB-MS/MS。ω-6FA 18:3丰度比ω-3异构体高。
图63A显示人类血浆中不饱和FA的定量。
图63B显示RWPE1和PC3细胞中主要不饱和FA的量的比较。(d)RWPE1和PC3细胞中FA18:1的Δ9和Δ11异构体的量。在图63A和B中,误差条表示标准差,n=3。使用双尾学生t检验(two-tailedStudent'st-tests)评价RWPE1细胞和PC3细胞中FA之间的差异的统计显著性(***p<0.0005)。
图64在顶部显示在MS/MS期间PB反应和逆PB反应的反应方案。图64的底部显示在ABSciexQtrap4000MS上进行的PB反应结合nanoESI-MS/MS以通过NLS定量不饱和FA的实验设置。
图65说明估计人类血浆中FA的回收率(使用LIPID-MAPS FA提取方案)的原理。
图66A-C显示利用PB反应,在不同溶剂条件下进行的花生四烯酸(FA20:4(5Z、8Z、11Z、14Z))的光化学标记。图66A显示使用丙酮/水(50/50,v/v)作为溶剂的FA 20:4的PB反应质谱。图66B显示使用乙醇/丙酮/水(40/30/30,v/v)作为溶剂的FA20:4的PB反应质谱。图66C显示在m/z361.3处FA 20:4的PB产物的CID谱图,其中主要断裂通道是58Da(丙酮)和44Da(CO2)的中性丢失。
图67显示通过各异构体的两个诊断离子的相对强度测定FA18:1C=C异构体组成。插图是诊断离子质量范围的放大图和将诊断离子强度比率转化成异构体组成的校准曲线。
图68A显示纯油酸(FA18:1(9Z))和顺异油酸(FA18:1(11Z))的校准曲线。应注意,这两条校准曲线互不重叠,因为各异构体的标记产物显示不同的标记丢失程度。
图68B显示80%FA 18:1(9Z)和20%FA 18:1(11Z)的混合物的校准曲线。
图69A-B显示人类血浆中PUFA(FA18:3和FA 20:4)的分析。图69A显示添加有7.5μMFA17:1作为IS的FA提取物的nanoESI-MS谱图。图69B显示在PB反应之后的NLS谱图。使干燥的FA提取物(来自20μL人类血浆)在添加有7.46μM IS的400μL溶剂中复原。
图70A-D显示人类血浆中的FA18:3是ω-3(FA18:3(9Z、12Z、15Z)、α-亚油酸,ALA)和ω-6(FA18:3(6Z、9Z、12Z)、γ-亚油酸,GLA)异构体的混合物的情形。由于FA18:3是PUFA,故在标记之后因较显著的44Da丢失(负离子模式)而无法在MS/MS中产生大量诊断离子。因此,可利用+nanoESI-MS,通过添加氯化锂(5mM)来分析FA 18:3。相应地可以产生大量诊断离子并抑制44Da中性丢失。图70A显示在添加5mM LiCl之后,FA提取物的nanoESI-MS谱图。溶剂是含10%乙醇的丙酮/水(50/50,v/v)。图70B显示在光化学标记之后,FA提取物的nanoESI-MS谱图。标为红色的峰是FA 18:3(m/z343.5)、FA 18:2(m/z345.5)及FA 18:1(m/z347.5)的标记产物。图70C显示在m/z343.3处的背景离子的CID谱图。图70D显示标记的FA18:3(m/z 343.3)的CID谱图。
图71显示人类血浆中FA18:3异构体的鉴别和定量。图71显示FA 18:3ω-3/ω-6异构体的1:1混合物的CID谱图。呈红色的峰属于ω-6异构体,并且呈蓝色的峰属于ω-3异构体。下方放大的这几组峰显示FA 18:3ω-3/ω-6异构体的存在,其相对强度用于定量。
图72A-B显示使用AMPP方法定量人类血浆中的不饱和FA。图72A显示在AMPP衍生化之后,人类血浆的FA提取物的nanoESI-MS谱图。图72B显示在AMPP衍生化之后,该提取物的m/z 183.1的前体离子扫描谱图。FA 18:2-d11和FA 18:1-d17是在提取之前添加以评价回收率。
图73A-B显示正常前列腺细胞和癌症前列腺细胞的FA谱。图73A显示在正常前列腺细胞(RWPE1细胞)中FA的nanoESI-MS谱图。图73B显示在癌症前列腺细胞(PC3细胞)中FA的nanoESI-MS谱图。使用FA 17:1(10Z)作为IS。
图74A-B显示在正常人类前列腺细胞和癌症人类前列腺细胞中的FA 18:1是9Z和11Z异构体的混合物。图74A显示在正常前列腺细胞中FA 18:1的PB反应产物(m/z 339.3)的离子阱CID谱图。图74B显示在前列腺癌细胞中FA18:1的PB反应产物的离子阱CID谱图。图74A-B中离子阱CID条件是:Q3进入势垒,2V;活化时间,200ms;AF2(断裂能量),50(任意单位)。在m/z 171.1/197.2处的诊断离子是Δ9异构体特有的,而在m/z 199.2/225.2处的诊断离子是Δ11异构体特有的。Δ9异构体的相对量在前列腺癌细胞中较高。
图75说明一种用于高度选择性定量不饱和脂肪酸的方法,该方法需要使用光化学反应和串联质谱。此类方法可以在鸟枪法脂质组学方法中直接用于分析复杂生物样品中的脂肪酸。
具体实施方式
本发明的方法将光化学衍生化与串联质谱(PCD-MSn)相结合,由此允许在鸟枪法脂质组学方法中整体表征和定量复杂脂质混合物中的脂质C=C异构体。本发明的方法使用了自由基反应(例如帕特诺-比希(P-B)反应)来鉴别不饱和脂质中的C=C。工作原理包含三个关键部分(图1A):(1)首先,C=C键通过在254nm UV照射下与丙酮(还用作nanoESI溶剂)发生P-B反应而转化成其相应P-B反应产物。(2)接着依序分离反应产物,并进行CID断裂(串联MS),以破坏在原来C=C键处形成的氧杂环丁烷环,由此优选产生异构体特异性诊断离子(诊断离子)。(3)接着使用诊断离子的相对丰度开发能够对各种脂质物种的C=C异构体进行相对和绝对定量的有效方法。本发明的方法显示,PCD-MSn提高了脂质靶向性,允许鉴别包括大鼠脑中脂质C=C异构体的96种独特的脂质物种,并定量35种不饱和脂质。其还揭示了大鼠器官中不饱和脂质的异构体组成的非均质性。在癌组织中,检测到FA18:1和含C18:1的磷酸胆碱(PC)中C=C异构体相对量的明显变化,展示了本发明的方法作为诊断方法,例如癌症诊断方法的有用性。考虑到负责产生脂质C=C异构体的生物合成路径不同,这些方法广泛适用于涉及脂质C=C异构体的研究领域,如细胞生物学和疾病诊断。
在某些实施例中,本发明的方法可以用于:(1)定量大鼠脑中FA和PL C=C异构体的组成;(2)测定并比较不同大鼠组织间PL的异构体组成;(3)比较正常组织与癌组织之间PL的异构体组成。在本文中显示,P-B反应结合nanoESI-MS/MS允许通过含量丰富并且独特的诊断离子有效且可靠地表征脂质C=C异构体。该方法可以扩展到通过比较诊断离子的相对强度准确定量脂质C=C异构体。
光化学衍生化结合串联MS策略的原理
图1A中示出了P-B反应与nanoESI-MS相结合的实验设置的示意图。使用主要在254nm发射的低压汞(LP-Hg)灯作为UV源进行P-B反应。35反应动力学较快,因为在0.3至0.5分钟之后,达到稳定状态(参见以下实例)。对于含有一个C=C的脂质,反应产物是两种氧杂环丁烷区域异构体的混合物,因为在丙酮中含UV活化的羰基加成至脂质中的C=C时,不存在区域选择性。因此,在CID时,P-B反应产物产生两个诊断离子,其各自源自于一种区域异构体(图1B)。在CID之后优选形成大量C=C特异性诊断离子得益于CID敏感性高能氧杂环丁烷环,其为断裂抗性C=C的反应产物的。此外,一对诊断离子内的特征性26Da质量差异可用于鉴别诊断离子,尤其是在存在干扰的情况下。为了展示PCD-MSn对脂质C=C异构体混合物进行分析的能力,制备油酸(C18:1n-9)和顺异油酸(C18:1n-7)的4:1模拟混合物并加以分析。如果为完整FA,在m/z 281处(去质子化形式)的断裂没有产生能用于鉴别C=C的含信息的离子。相比之下,在P-B反应和串联MS之后,在m/z 171.1/197.2(FA 18:1n-9)和m/z199.1/225.1(FA 18:1n-7)处出现两对不同的诊断离子(图1E)。由于每对诊断离子是其特异性脂质C=C异构体特有的,故PCD-MSn可以同时分析无限数目的异构体。
随后,将PCD-MSn扩展至利用+nanoESI在结构上表征极性脂质。举例来说,制备两种PC C=C异构体,即1,2-二岩芹酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC 18:1n-12/18:1n-12)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC 18:1n-9/18:1n-9)的等摩尔混合物。各PC含有两个相同的酰基链,即C18:1n12或n-9。与不饱和FA类似,在完整PC的CID之后,除在m/z 184(PC或鞘磷脂中的磷酸胆碱头基,图1G)处的特征离子外,没有形成诊断离子。在P-B反应和串联MS之后,在m/z 634.5/702.6和m/z 676.5/702.6处产生两对诊断离子,与各PC18:1/18:1物种中的C 18:1n-12和C18:1 n-9一致。因此,使用FA(-nanoESI)和PC异构体(+nanoESI)为例,证实本发明的方法可以分析所有极性脂质,不管其携带的电荷如何,而且此类优势是归于P-B反应的自由基性质。36,37此外,值得指出的是,P-B反应对在不同位置的C=C无选择性,并且所有C=C都可能被衍生化。出于此原因,对于含有多于一个C=C的PL,第一步的P-B反应产物的CID质谱含有存在的所有C=C的信息。由于此类谱图要比后续阶段反应产物的谱图容易解释得多,故始终选择此类谱图来促进串联MS分析。
用于脂质C=C异构体定量分析的PCD-MSn的验证
为了验证PCD-MSn是定量脂质C=C异构体的方法,制备不同摩尔比的异构体混合物并进行分析(有关典型CID质谱,参见以下实例)。对于所有PC 18:1/18:1或FA 18:1异构体,观察到异构体的摩尔比与其相应诊断离子之间的强度比率呈优良的线性关系(图2A)(R2=0.9992和0.9994),表明PCD-MSn在脂质C=C异构体中的稳健性(图2B)。强度比率被定义为一种异构体的诊断离子的强度与另一种异构体的诊断离子的强度之间的比率,即
在PC 18:1/18:1和FA 18:1的相对定量中,准确率分别超过90%和95%(mol)。根据反应质谱,不饱和脂质未完全转化成其相应反应产物。不过,一旦反应变得稳定,各对诊断离子之间的强度比率亦会变得稳定(参见以下实例)。PCD-MSn的这种独特且极其有用的特征是归于P-B反应对C=C具有高度特异性,由此允许对脂质C=C异构体进行快速、可再现的定量分析。
FA
C=C异构体的绝对定量
一旦确立C=C异构体相对定量的基础,就开发用于绝对定量的方法。如果需要定量两种异构体(油酸和顺异油酸),并且可得到第三异构体(岩芹酸,FA18:1 n12),则可以构建两条校准曲线(针对油酸和顺异油酸)进行绝对定量(图2C)。此处,使用FA 18:1n12作为共用内标(IS)。通过将IS浓度保持恒定(22.7μM),同时在1.4至45.4μM范围内变化油酸或顺异油酸的浓度,来制备校准曲线。由于IS与两种FA混合,故研究油酸和顺异油酸共存是否会影响定量性能很重要。将由顺异油酸/IS和油酸/IS的校准曲线计算出的斜率(0.3587/0.2075=1.729,图2D)与使用顺异油酸/油酸混合物直接测量的斜率(A=1.694)(图2B)相比较。发现这两个斜率是一致的。因此,得出结论,多种异构体共存对其相互定量关系没有明显影响。这一特征使得PCD-MSn能够表征并定量无限数量的脂质C=C异构体。
在不能得到第三异构体的情况下,可以开发出用于绝对定量的替代方法。这些包括标准添加(参见以下实例)及在nanoESI中IS的使用结合利用PCD-MSn的相对定量(参见以下实例)。通过分析4:1摩尔比的FA 18:1 n-9/n-7的模拟混合物(cFA 18:1n-7=0.0032mg/mL)及来自大鼠脑的FA提取物来展示这三种方法的分析性能。PCD-MSn方法的定量能力是通过在不同方法间的一致性及其在定量FA异构体时的准确性得以证实。总体而言,前两种方法的分析性能(实验误差<7%,s.e.<15%)优于第三种方法,这可能是因为第三种方法的电离效率存在波动。
大鼠脑中FA和PL C=C异构体的相对定量
PCD-MSn一旦确立,就被用于定量来自大鼠脑的复杂FA和PL提取物中的脂质C=C异构体。直至近来,只有极少论文报道通过色谱法结合能够定位C=C的方法,如臭氧诱导解离(ozone-induced dissociation,OzID)来确定PL物种中C=C异构体的存在。除表征脂质C=C异构体外,本发明的方法也可以通过相对定量提供脂质C=C异构体组成信息。通过将PCD-MSn与鸟枪法脂质组学联用进行分析,无需任何色谱分离。对于不饱和FA,其包括单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。除FA 20:4外,断裂其P-B反应产物将释放大量诊断离子。已发现在大鼠脑中的不饱和FA中,FAA 16:1、18:2及20:4是纯的,呈FA 16:1n-7、FA 18:2 n-6及FA 20:4n-6形式。相比之下,FA19:1是n-8与n-10异构体的混合物,FA18:1和20:1也是n-7与n-9异构体的混合物,并且FA 22:1由n-7、n-9及n-11三种异构体组成(图3A)。FA20:4的P-B反应产率很高,但由于在PUFA及其反应产物CID时显著CO2丢失(-44Da)而无法产生诊断离子。为了避开此问题,使用Li+作为电荷载流子并且通过形成[PUFA+Li]+加合物成功地抑制CO2丢失。这一策略也与PCD-MSn相容并且使PUFAC=C异构体定量成为可能(参见以下实例)。锂化FA20:4的P-B反应产物的CID大量释放出四对锂化诊断离子(参见以下实例)。随后,对检测到的所有不饱和PL,包括磷脂酰胆碱(PC)、溶血PC(LPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血PE(LPE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血PI(LPI)、磷脂酰丝氨酸(PS)及溶血PS(LPS)进行整体分析。利用负离子CID定量不饱和PL异构体的原理在以下实例中详述(有关利用正离子CID定量的原理,参见图1G)。与FA 18:1n-7和n-9异构体共存相符,也鉴别出大鼠脑中所有含C18:1的PL为n-7与n-9异构体的混合物。对于含有相应脂肪酰基的其它FA及其相应PL(C18:2、C20:1、C20:4及C22:6),也普遍是这种情况(图3A及以下实例)。
这些观察结果是与使用游离FA作为基质的公认的PL合成机制相符合。
大鼠组织中脂质C=C异构体的非均质组成
为了研究和比较不同大鼠器官中脂质C=C异构体的异构体组成,对来自五个大鼠器官组织的FA和PL提取物进行分析。所有器官共有的丰富PC物种是本发明方法的初始焦点,即PC16:0/18:1。其P-B反应产物的串联MS产生两对诊断离子(m/z 650.5/676.6和678.5/704.5),有力地表明PC 16:0/18:1n-7和n-9异构体的存在(图4A-B)。出人意料的是,大鼠器官中PC 16:0/18:1的异构体组成显示较大变化。该变化在脑与肌肉之间最显著:在脑中,n-9异构体的诊断离子含量比由n-7异构体得到的诊断离子丰富,而在肌肉中情况则相反。所分析的所有大鼠器官中PC16:0/18:1n-7的相对量遵循以下顺序:脑<脂肪<肾<肝<肌肉。数据显示,游离FA与PL中的相应脂肪酰基之间存在相关性。对FA18:1和含C18:1的PL进行分析。在除脑以外的所有器官中,观察到从脂肪、肾、肝至肌肉FA18:1n-9和含18:1 n-9的PL的相对量的一致性增加。脑、肌肉、肾及肝含有24-26%且脂肪含有13%的FA 18:1 n-7。这些结果证实,FA异构体的组成在决定PL的异构体组成中起到作用,PL是质膜的主要组分并且对于正常蛋白质功能至关重要。就来自各器官的三组含C18:1的PL的异构体组成来说,观察到大鼠肾、肝及肌肉的非均质性(参见以下实例)。一般而言,发现n-7异构体的相对量从脑、肾、肝至肌肉增加,不过在全部三个器官中有许多PL不能检测到。
癌组织中PLC=C异构体的组成改变
在确定不同大鼠器官中脂质C=C异构体的组成改变之后,针对在正常细胞/组织与癌细胞/组织之间是否可能存在类似差异进行研究。通过选择小鼠乳癌作为研究模型,并使用正常小鼠乳房组织作为对照(野生型WT)来验证本发明的方法。在所有极性脂质提取物中,PC是含量最丰富的且能通过+nanoESF检测到的脂质物种。因此,接着使含有C18:1的PC,包括PC 16:0/18:1、PC 18:0/18:1、PC 18:1/18:1经历P-B反应及串联MS以测定其异构体组成(参见以下实例)。使用不同方案提取FA,并对FA 18:1的异构体定量以与含C18:1的PC相比较。
正如预期的,所研究的所有含C18:1的PC和FA 18:1由n-9和n-7异构体组成(参见以下实例)。最值得关注的现象是,如图4C-F所示,在大鼠乳癌组织中FA 18:1n-7和含C18:1n-7的PC的相对量升高(除PC16:0/18:1外)。在18:1和PC18:1/18:1中观察到最显著的n-7异构体增加。对于PC 18:1/18:1。还观察到另一异构体,即PC18:0/18:2 n-6。与FA 18:1 n-7和含C18:1n-7的PC相对,在乳癌组织中PC 18:0/18:2 n-6的相对量急剧下调(参见以下实例)。导致这些观察结果的可能机制可能是癌细胞中FA和PLC=C异构体的合成、转化及代谢的改变。这些差异为通过集中在如脂质C=C异构体组成等详细脂质组成信息来鉴别恶性病和疾病状态提供了新颖的视角。
定量方法
本文中的数据显示了PCD-MSn策略有效并准确地定量复杂组织提取物中的脂质C=C异构体的能力。该方法可以用作定量分析不饱和脂质的常规技术是出于以下原因:(1)该方法具有结构表征和异构体定量两种能力,由此允许分析无限数量的脂质C=C异构体。(2)诊断离子可以达到极高的信噪比(S/N),而这是定量分析特别希望的。首先,应用CID以产生诊断离子,在此期间移除MS1中的大部分干扰。其次,氧杂环丁烷环是可以优先裂解以产生大量诊断离子的高能结构。(3)P-B反应是基于自由基的反应,对C=C具有极高选择性,但与C=C位置无关,因此所有类型的不饱和脂质都可以被衍生化并以正离子和负离子两种模式进行分析。(4)由于诊断离子是在串联MS中产生,故这些离子可以容易地对应于其前体脂质,由此能够直接分析复杂混合物。因此,PCD-MSn是与与鸟枪法脂质组学相容的并且可以容易地与鸟枪法脂质组学结合以进行大规模定量分析,而不需要前端色谱分离或后端仪器改良。
通过由细胞演变出的传感器和传递途径构成的网络所维持的脂质C=C异构体组成对于与一系列细胞过程形成整体的膜动态平衡至关重要。然而,缺乏灵敏且稳健的方法的结果是,使针对脂质C=C异构体组成的系统性监测和分析极具挑战。本发明的方法提供了一种适合此类分析的方法,该方法能够为生物化学研究中令人困惑的问题提供重要证据,如:用于维持器官中脂质C=C异构体组成的非均质性的潜藏机制是什么?脂质C=C异构体的相对量变化如何影响细胞代谢并与发病机理相关?是否能利用C=C异构体组成进行疾病诊断,或使用外源脂质C=C异构体作为治疗剂干预、停止或甚至逆转疾病进展?由PCD-MSn和鸟枪法脂质组学获得的结果已经显示,FA和PL的异构体组成在正常细胞/组织与癌细胞/组织之间明显不同。因此,基于PCD-MSn的脂质组学为研究脂质C=C异构体在生物过程中的作用以及发现针对疾病诊断的生物标记物提供了新的机会。
以引用的方式并入
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等效物
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实例
实例1:材料和方法
脂肪酸提取方案:将1mL MeOH和25mM HCl(1%v)添加至50mg组织中,随后使样品在玻璃管中均质化。接着涡旋样品30秒,随后以2700rpm离心10分钟。随后取出上清液并蒸发至干。
磷脂提取方案:向50mg组织中添加300μL去离子水,随后使样品在玻璃管中均质化。制备提取溶剂,即氯仿/甲醇(1/1;v/v)(溶剂A),及10nM和50nM的LiCl溶液。氯仿是自VWR(美国伊利诺伊州(IL,USA))获得并且LiCl是自Alf Aesar(美国马萨诸塞州(MA,USA))获得。均质化之后,将4mL溶剂A添加至玻璃管中进行提取,并添加适当体积的50mM LiCl以使水相达到2mL的最终体积。接着封盖各管并涡旋样品20秒。之后,以2700rpm离心样品10分钟。将底部层收集到一个新的硼硅酸盐玻璃管中并将2mL氯仿添加至含残留顶部层的个别玻璃管中。接着封盖各管并涡旋20秒。再以2700rpm离心样品10分钟。收集底部层并与上一个步骤中收集的底部层合并。利用氮气蒸发器在氮气流下蒸发合并的底部层直至完全干燥。用4mL溶剂A使个别残余物悬浮,随后添加2mL的10mM LiCl。封盖各管并涡旋20秒,并且接着以2700rpm离心10分钟。重复以上两个步骤。将个别脂质提取物残余物再悬浮于溶剂A中。最后用氮气吹扫脂质提取物,封盖并在-20℃储存以进行MS分析。
GC-MS分析:先在真空下干燥脂肪酸样品,并且接着使其在乙酸乙酯中复原。
在GC-MS分析之前,将25μL样品与25μL衍生化试剂混合。接着,以10:1的分流比注入0.5μL最终溶液。
NanoESI-MS、在线帕特诺-比希反应及串联MS分析:将FA(美国密苏里州的(MO,USA)的Sigma-Aldrich)、PL(美国密苏里州的Sigma-Aldrich)及大鼠组织提取物全部溶解于50/50(v/v)丙酮/水中,随后进行MS分析。为便于利用-nanoESI检测FA,向样品中添加0.5%NH4OH。对于丙酮与C=C之间的P-B反应,使用在254nm下发射的低压汞(LP-Hg)灯(型号:80-1057-01,BHK,Inc.,美国加利福尼亚州(CA,USA))。所有MS实验都是在4000QTRAP三级四极/线性离子阱(LIT)混合质谱仪(Applied Biosystems/Sciex,加拿大多伦多(Toronto,Canada))上进行的。如论文中所描述,此仪器允许PIS和NLS。所用仪器参数如下:ESI电压,±1200-1800V;帘式气体,10psi;界面加热器温度,40℃;去簇电压:±20。前体离子隔离宽度设置成1.0Th。对于MS/MS,通过将离子注入时间保持在10至200ms内,将前体离子强度保持在约4×106计数。用于P-B反应产物的碰撞能量是35V(射束CID)或50a.u.(离子阱CID)。
实例2:离子注入时间对串联MS之后诊断离子的相对强度的影响
图5A-B和表1中的数据说明,当增加离子注入时间(从10至200ms)时,前体离子(P-B反应产物)、58Da中性丢失之后的离子及DI的绝对强度也都增加。然而,尽管注入时间增加20倍,但DI和58Da中性丢失之后的离子的相对强度仍极稳定。由于DI和中性丢失离子的产生是两条逆P-B反应路径,故结果表明,这两条逆反应路径之间的分支与注入时间无关。这一重要特征使得没有必要小心地控制进入离子阱中进行CID分析的前体离子量。
表1
离子注入时间(ms) | %诊断离子(m/z171/197) | %中性丢失离子(m/z281) |
10 | 0.14 | 0.86 |
20 | 0.14 | 0.86 |
50 | 0.14 | 0.86 |
100 | 0.14 | 0.86 |
200 | 0.15 | 0.85 |
实例3:P-B反应动力学
使用PC 18:1 n9/18:1 n9与18:1 n12/18:1 n12的混合物,通过+nanoESI研究P-B反应动力学。P-B反应产物的量以其提取离子电流(EIC)表示。一旦LP-Hg灯升温,就观察到反应产物量的快速增加。在约0.3至0.5分钟之后,反应变得稳定,达到平台期。
图6显示在254nm UV照射下,PC 18:1/18:1(两种C=C异构体的混合物)与丙酮之间P-B反应的动力学。观察到较快反应速率:在0.4分钟内,反应变得稳定。之后,各异构体的诊断离子之间的比率变得恒定,由此为定量分析奠定基础(参见在时间点1、2及3时的三个串联谱图)。
通过-nanoESI,对于不饱和脂肪酸观察到类似结果。图7A-D中显示了顺异油酸溶液的P-B反应产物(m/z 339.3)的EIC,以及EIC的放大图(在P-B反应起始之后3分钟)。
实例4:允许基于P-B反应和串联MS对脂质C=C异构体绝对定量的三种方法的原理
方法1:使用第三异构体作为IS进行绝对定量:使用不同于待定量的异构体的一种C=C异构体作为内标(IS)。接着,可以计算IS的诊断离子与样品中待分析的C=C异构体的诊断离子的比率。可以由使用IS制备的各异构体的校准曲线发现C=C异构体的绝对量。
方法2:标准添加:将已知量的一种异构体(存在于分析用样品中,例如FA 18:1n11)添加至混合物中。作为标准添加的结果,两对诊断离子之间的强度比率将改变。
定义以下参数:
I1表示在标准添加之前两对诊断离子之间的强度比率,
I2表示在标准添加之后两对诊断离子之间的强度比率,
Δc表示异构体浓度的增加(在此情况下是FA 18:1n11的浓度),
c1表示FA 18:1 n11的浓度,
c2表示FA 18:1n9的浓度。
由于C18:1n11与C18:1n9之间的校准曲线是I=1.6942x-0.017(x是浓度比率(FA18:1 n11比FA 18:1n9)),故得到,
因此,可以容易地得出FA 18:1 n11和FA 18:1n9的初始浓度
方法3(通过nanoESI进行的总浓度的绝对定量与通过P-B反应/串联MS进行的相对定量相结合):将含有不同碳数量的内标(IS)(例如FA17:1)添加至FA18:1异构体混合物中。利用NanoESI-MS分析对待定量的FA进行绝对定量。(1.需要事先制备校准曲线。2.假定各FAC=C异构体具有相等电离效率)。计算C18:1异构体的总浓度。通过P-B反应/串联MS测定各FA异构体的相对量,之后可以确定各异构体的绝对浓度。
实例5:不同类型磷脂的C=C异构体的相对定量
取决于PL头基的极性,可以按正离子或负离子模式分析PL。相应地,利用+nanoESI分析PC,而利用-nanoESI分析PA、PI、PE及PS。此处使用了两个实例(PC18:0/18:1和溶血PE18:1)来展示使用P-B反应/串联MS进行的PL的相对定量。可以通过PL甲酸盐、乙酸盐或氯化物加合物的(-)CID获取PL的酰基链信息(参见图9A-B)。
实例6:PUFA的结构表征和定量
对于所有大鼠器官中的FA18:2,其P-B反应产物的CID释放出两对诊断离子,符合在C9和C12处两个由亚甲基分离的C=C(FA 18:2n6)。参见图10。
然而,对于含有甚至更大数量C=C的PUFA,在完整PUFA和其P-B反应产物断裂期间丢失CO2(-44Da)的断裂路径占主导。其它断裂路径受到抑制并且C=C位置的指定变得困难。为了避开此问题,有意地添加锂以便能通过+nanoESI检测到呈[FA+Li]+形式的FA。如图11A-D中所示,锂化P-B反应产物的串联MS产生大量诊断离子(呈锂化形式),且CO2丢失现完全被抑制。这一策略允许多方面并且有效地表征和定量PUFA异构体。
图12显示的校准曲线说明IFA 20:4n6/IFA 20:4 n3与cFA20:4 n6/cFA20:4 n3的线性关系。数据也显示于下表2中。
表2
实例7:PL中的多不饱和脂肪酰基(C18:2、C20:4、C22:6等)在大鼠器官中作为纯n6
异构体存在
分析来自大鼠器官的PL提取物,并由其结果得出结论:多不饱和脂肪酰基作为纯异构体形式存在(C18:2和C20:4呈C18:2n6和C20:4 n6形式;及C22:6呈C22:6 n3形式),与先前鉴别的PUFA相符。
C18:2脂肪酰基(图13):鉴别出在m/z 786.6(+nanoESI)处的离子是PC 18:0/18:2(通过[PC+Cl]-的--nanoESI-MS/MS测定)。在相应P-B反应产物断裂之后,鉴别双键位置。由于PC 18:0/18:2具有两个C=C,故在m/z 678.5/704.6和m/z 718.5/744.6处观察到两对诊断离子。该两对之间40Da的质量差异表明存在两个由亚甲基分离的C=C,如框中所示。此外,由不存在任何其它诊断离子确定PC 18:0/18:2不存在其它异构体。
C20:4脂肪酰基:鉴别出在m/z 782.6(+nanoESI)处的离子是PC 16:0/20:4与PC18:2/18:2(较少量)的混合物。通过[PC+Cl]-的-MS/MS获取脂肪酰基信息。对于PC 16:0/20:4,观察到四对诊断离子,与C20:4中存在四个C=C一致。PC 18:2/18:2的两对诊断离子与PC 16:0/20:4n6的四对诊断离子中在674.6/692.6和714.6/740.6处的两对重叠。因此,鉴别出PC 18:2/18:2中的C18:2是C18:2 n6,它是与PC 18:0/18:2内的C18:2被表征的相同的异构体形式。实际上,对于多不饱和脂肪酰基(此处以C20:4为例),不管存在于何种PL物种类型内,其都是呈相同的纯异构体形式(有关其它多不饱和脂肪酰基的数据未示出)。
PC 16:0/20:4 n6(大鼠脑;图14A):左图:[PC 36:4+CH3COO]-的CID质谱,明显地表明存在两个PC物种,即PC 16:0/20:4和PC 18:2/18:2。右图:PC 36:4的P-B反应产物的CID质谱。可以通过使用诊断离子容易地指定各PC物种中双键的位置。图14C显示PC 16:0/20:4n6的诊断离子的化学结构。
PC 16:0/20:4n6(大鼠肝;图14B):通过类似分析,PE 16:0/20:4(来自大鼠肝)中的C20:4脂肪酰基也被表征为C20:4 n6。
C22:6脂肪酰基:鉴别出在m/z 806.6(+nanoESI)处的离子是PC 16:0/22:6,其中脂肪酰基信息是通过[PC+CH3COO]-加合物的-MS/MS获得。类似地,可以通过相应P-B反应产物的+nanoESI-MS/MS推断出C=C位置。观察到六对诊断离子,与C22:6中存在六个C=C一致。可以使用这六对诊断离子的质荷比(580.5/606.6、620.5/646.6、660.4/686.6、700.5/726.6、740.5/766.6、780.6/806.6;具有奇怪m/z的共存离子可能是来自除PC16:0/22:6外的PL片段)明确地指定这六个C=C的位置在4位、7位、10位、13位、16位及19位处。因此,C22:6仅呈C22:6n3形式。
PC 16:0/22:6n3(大鼠脑;图15):左图:[PC 38:6+CH3COO]-的CID质谱,显示在PC38:6内,C22:6在sn-2位置,且C16:0在sn-1位置。右图:PC 16:0/22:6的P-B反应产物的CID质谱。
实例8:前体离子扫描(PIS)和中性丢失扫描(NLS)加快对复杂混合物中某些类型
脂质的分析。
图16显示大鼠组织中油酸和顺异油酸的生物合成路径。考虑到来自大鼠组织的PL提取物的组成的复杂性,可以利用前体离子扫描(PIS)和中性丢失扫描(NLS)加快对属于特定种类的PL及其脂肪酰基的鉴别。举例来说,可以使用在m/z 184处(依据+MS/MS)的离子特异性提取所有PC、溶血PC及SM的信息,同时可以使用在m/z 241处(依据-MS/MS)的离子提取复杂脂质混合物中所有PI的信息。187Da和141Da的中性丢失分别是PS和PE特有的。大鼠脑的代表性PIS和NLS谱图显示于图17A-D中。
可以通过-MS/MS获得PL的脂肪酰基组成。为了使此方法更高效,可以对每一共同的脂肪酰基的m/z进行PIS以得到含有所扫描的脂肪酰基的所有PL的特征。图18A-F中显示了C16:0、C18:1、C18:0、C20:4、C22:6及C22:4的PIS质谱。由于PL各自含有两个脂肪酰基,故如果在这些谱图中有两个呈现共同m/z信号,则可以容易地鉴别PL内的两个脂肪酰基。
图19和下表3提供了有关从大鼠脑鉴别的PL异构体的数量和结构的概述。
表3
实例9:不同大鼠组织间PLC=C异构体组成的变化
本文中的数据显示,在所分析的所有大鼠组织中PC16:0/18:1的异构体组成在不同器官间变化。自然就提出一个问题:有关PC 16:0/18:1所观察到的趋势是否适用于其它PL?为了回答这一问题,对包括肾、肝及肌肉在内的其它大鼠组织中含C18:1的PL进行分析。由于针对PL提取物的nanoESI质谱(图20)证实,在这些组织中脂质组成不同,故所研究的各器官共有的含量丰富的PL物种极少。不过,这一事实并不妨碍了解不同器官中PL异构体组成的非均质性。
选择在各器官中含量最丰富的含C18:1的PL,并且观察到其异构体组成看起来类似。更值得关注的是,PL异构体组成的器官间变化是显而易见的并且与PC16:0/18:1的异构体组成(图4)一致,如图20所示。看起来,C18:1n7异构体的相对量在肌肉中最高并且在肾中最低。
图21显示在大鼠器官中FA 18:1异构体的组成。图22显示通过FA 18:1(大鼠脑、肝、肌肉、脂肪及肾)的P-B反应产物(m/z339.3)的串联MS进行的FA18:1异构体的相对定量。
实例10:正常和癌症小鼠乳房组织的分析
如图23中所示,相较于由正常小鼠乳房组织(WT)得到的结果,在小鼠乳癌组织中观察到FA 18:1n7及含C18:1n7的PC的一致性增加。来自正常组织(各图中的左边)和癌组织(各图中的右边)的(图23A)FA 18:1、(图23B)PC 34:1、(图23C)PC 36:1及(图23D)PC 36:2的P-B反应产物的CID质谱。在(图23D)中,还清楚地观察到PC 18:0/18:2的相对量减少。允许鉴别PC 18:0/18:2的诊断离子是m/z 678.5/704.5和718.5/744.6。另参见下表4-5。
表4
表5
实例11:帕特诺-比希反应结合直接输注ESI-MS
串联质谱(MSn,其中n是质量分析步骤的数量)结合软电离正成为脂质分析的优选平台。如所论述的,明确地测定C=C键位置一直是分析难题。以上说明了通过应用帕特诺-比希(P-B)反应的变化形式(UV激发的丙酮与不饱和脂质内C=C键之间的环加成反应)及在线纳米电喷雾电离(nanoESI)MSn,可以可靠地测定复杂混合物中磷脂和脂肪酸的C=C键位置。P-B反应可以通过UV照射硼硅酸盐nanoESI发射极和喷雾羽流实现。在本实例中,通过在ESI之前,在熔融硅石毛细管“微反应器”中实行该反应对以上方法进行了改良。注射泵推动溶液穿过卷绕的毛细管以延长光化学反应时间。参数研究显示,在6秒UV曝光内,在4.5μL/min下,PC 16:0_18:1(n-9Z)和油酸(n-9Z)在7:3的丙酮:H2O加1%调节剂的溶剂条件中分别达到50%和40%的P-B反应产率。反应在0.1-4.5μL/min流动速率范围内成功地实施并且也与脂质溶液中的多种LC溶剂相容。最后,通过分析酵母极性脂质提取物以展示其适用于生物提取混合物来测试此方法的效用,其中揭示了总计35种不饱和磷脂的C=C位置。
引言
脂质是具有疏水性特征的多种多样的分子并且作为主要生物分子,脂质执行至关重要的生物功能,如细胞膜的形成、细胞信号传导及储能。为了增进对生物系统中的脂质的了解,脂质组学领域已成为一种强大工具,旨在结构鉴别、空间及时间分布方面完全表征生物系统中的脂质物种。目前先进技术的脂质分析,除极少数外,都利用了大气压“软”电离源,例如电喷雾电离(ESI)与质谱法(MS)相结合,因为质谱法在低浓度下具有灵敏度并且通过串联MS(MSn,其中n是质量分析步骤的数量)在获得高水平结构信息方面具有选择性。
MS脂质分析的一个应用是发现疾病生物标记物,例如用于II型糖尿病和自闭症。随着有关更有效生物标记物的探索的发展,对于利用极少样品制剂获得高水平脂质结构信息的需求变得愈来愈重要,由此为分析化学工作者提出了具挑战性的问题。举例来说,脂肪酰基(FA)上C=C键的位置正成为磷脂(PL)与胆固醇相互作用及蛋白质结合中的必要因素,并且大部分可商购的MS平台可以提供有关饱和程度的数据,但C=C的位置通常是假定或未报道的。
存在若干使用MS方法测定C=C位置的方法并且可以大致分类为利用串联MS或化学衍生化。串联MS的实例包括高能CID(>1keV)串联飞行时间(TOF)、线性离子阱(LIT)串联MS及LC-离子迁移串联MS。化学衍生化策略涉及键特异性反应,这些反应可用于直接鉴别C=C键。文献中的主要方法涉及臭氧反应,其中已经报道若干变化形式,包括LC分离后溶液相臭氧分解、电喷雾羽流内臭氧分解(OzESI),及对在真空下基于质量所选择的离子,称为臭氧诱导解离(OzID)。
本文中的本发明方法可以涉及使用一种帕特诺-比希(P-B)反应形式进行在线衍生化以分析不饱和FA和PL的C=C键。P-B反应可以通过nanoESI羽流的紫外光(UV照射,约250nm)且随后光激发的丙酮与脂肪酰基烯烃官能团之间发生分子间[2+2]环加成反应以形成氧杂环丁烷产物来实现。针对氧杂环丁烷反应产物的低能CID产生在原来C=C位置具有26道尔顿(Da)间距的两个诊断性片段离子(有关示意性反应,参见方案1)。
本实例集中在使用连续流光化学微反应器实施本发明的方法。在分析化学中,广泛地使用了光化学反应器,通过在液相色谱法中进行柱后反应来增进电化学检测的灵敏度和选择性。流动式光化学也是有机合成中的一个正在发展的领域,其中传统的分批式反应器被主要在<1mmi.d.毛细管中的连续流动的溶液替代或增强。除分子间光加成反应外,在流动化学文献中还存在有关分子内[2+2]连续流光化学反应的几个实例。连续溶液流结合微反应器尺寸能够精确地控制溶液UV曝光,由此可以通过减少由过度或不均匀UV曝光所产生的不想要的副产物来增加产物产率。
在本实例中,使用了单不饱和磷脂酰胆碱(PC)16:0_18:1(n-9Z)作为模型系统来研究在包括曝光时间、流动速率及溶剂组成在内的多种实验条件下的反应产率。在7:3丙酮:H2O加1%乙酸中的5μM PC 16:0_18:1(n-9Z)在4.5μL/min流量下保持6秒的累积UV曝光达到50%的最大产率。在含有NH4OH代替乙酸的碱性条件下,以负电离模式,油酸(n-9Z)和磷脂酸(PA)18:0_18:1(n-9Z)也获得相约的产率。此外,在与PL的液相色谱分离相关的多种溶剂条件下,在0.1-4.5μL/min的流动速率范围内也成功地实施反应。最后,P-B反应被应用于在商业上购买的酵母极性脂质提取物的复杂混合物分析,其中通过ESI串联MS鉴别出35种不饱和PL的C=C位置。
以下方案1显示了UV激发的丙酮与单不饱和脂肪酸之间的反应。形成氧杂环丁烷环并且在MS/MS碰撞诱导解离(CID)后,产生诊断离子,由此鉴别C=C键位置。
方案1
脂质命名法:使用Lipid Maps计划(Fahy等人,《脂质研究杂志(J.Lipid Res.)》2009,50,S 9)及Blanksby和Mitchell的近期研究(《分析与生物分析化学(S.Anal.Bioanal.Chem.)》2015,1)中的简写符号来标识脂质结构。对于PL标准,指定头基、脂肪酰基立体位置、碳数目、不饱和程度及C=C立体取向。举例来说,PC 16:0_18:1(n-9Z)表示在sn1和sn2甘油位置上分别具有16个和18个碳的脂肪酰基链的甘油磷酸胆碱头基。在碳数之后的“0”和“1”是指脂肪酰基的不饱和程度。C=C键位置是通过从末端碳开始并朝向酰基链的酯前进,对碳依序计数来标识,即在n-9位置的C=C键是位于脂肪酰基的碳9与碳10之间。C=C键立体构型的Z和E命名在C=C位置标识符之后。对于酵母提取物中的PL分析,sn1和sn2脂肪酰基位置是任意指定的并且烯烃Z和E立体构型未指定。
化学试剂:所有标准脂质和酵母极性提取物都购自Avanti Polar Lipids,Inc.(美国阿拉巴马州阿拉巴斯特(Alabaster,AL,USA)),在氯仿中处于10或25mg/mL。使用1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC 16:0_18:1(n-9Z))、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(PA18:0_18:1(n-9Z))及顺-9-十八碳烯酸(油酸(n-9Z))作为标准。
用异丙醇(LC级;Macron Fine Chemicals;美国宾夕法尼亚州中央山谷(CenterValley,PA,USA))稀释于氯仿中的储备溶液,随后稀释得到最终工作溶液。ESI工作溶液中使用的主要有机溶剂都是LC级并且由丙酮(MacronFineChemicals)、甲醇(Macron FineChemicals)、乙腈(Sigma Aldrich;美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))、己烷(95%正己烷;Avantor;美国宾夕法尼亚州中央山谷)及异丙醇组成。超纯H2O是自纯化系统以0.03μS·cm获得(型号CASCADA AN MK2;Pall Life Sciences;美国纽约州华盛顿港(Port Washington,NY,USA))。使用氢氧化铵(28-30%呈NH3形式;Macron FineChemicals;美国宾夕法尼亚州中央山谷)和冰醋酸(Mallinckrodt Chemicals;美国密苏里州黑泽尔伍德(Hazelwood,MO,USA))作为溶液调节剂以分别在负离子和正离子ESI模式下增进脂质电离。
P-B反应和直接注射ESI:利用带185nm发射滤光片的20mA、2.54cm灯长度、0.95cm直径、双管低压汞(LP Hg)灯(型号:80-1057-01;BHK,Inc.;加拿大安大略省(Ontario,CA))起始PB反应。来自制造商的灯规格说明,在254nm下,在20cm距离处的主要发射强度是60μW/cm2。
使用注射泵(泵11Elite;HarvardApparatus;美国马萨诸塞州霍利斯顿(Holliston,MA,USA))输注填充有脂质溶液的注射器(不透气注射器,1700系列;HamiltonCompany;美国内华达州里诺(Reno,NV,USA))。使用氟化乙烯丙烯(FEP)管、FEP管套管、聚醚醚酮(PEEK)配件及PEEK接头(IDEXHealthandScience;美国华盛顿州橡树港(Oak Harbor,WA,USA))将注射器连接至熔融硅石,接着将熔融硅石连接至ESI源。根据制造商提供的规格,熔融硅石(部件1068150140;363μmo.d.,100μmi.d.;Polymicro Technologies/Molex;美国亚利桑那州菲尼克斯(Phoenix,AZ,USA))由含氟聚合物涂层组成,该涂层在310nm下实现UV透明度>10%。使用商购的ESI源以流动速率≥1μL/min进行实验(Turbo VTM;AppliedBiosystems/Sciex;加拿大多伦多(Toronto,Canada))。对于所有实验,将气体1、气体2及界面加热器设置成零。使用具有8μm尖端i.d.的熔融硅石nanoESI尖端(New Objective;美国马萨诸塞州沃本(Woburn,MA;USA))以达到<1μL/min流动速率。使用不锈钢接头(Valeo;美国德克萨斯州休斯顿(Houston,TX,USA))接合熔融硅石nanoESI尖端和UV透明熔融硅石并且该接头也是施加高电压DC的位置。有关溶液制备和MS条件的更多详情可以见于补充信息。
结果
本实例中有关通过不连续曝光和在线ESIMSn实行P-B反应的设置显示于图24中。这一布置由于随UV曝光程度变化对实验条件具有极小干扰,而被认为最适于探索性研究。将表面积:体积比是20,000m2/m3(微反应器尺寸)的涂有含氟聚合物的熔融硅石毛细管(100μmi.d.)连接至ESI源并用作UV透明材料。熔融硅石卷绕有约2.5cm直径的高密度聚乙烯管并且使用铝箔持久性覆盖该熔融硅石以使得每卷中有1cm长度暴露于灯。灯安置于距各曝光点0.5cm距离处并且通过用铝箔覆盖/揭开不连续区段来控制累积曝光时间。累积曝光时间是通过暴露于UV的熔融硅石管的总体积除以样品流动速率来测定。
为了研究使用图24中的设置的P-B产物形成速率,使用在7:3丙酮:H2O加1%乙酸中含有5μM单不饱和PC 16:0_18:1(n-9Z)的N2吹扫的溶液作为模型系统。对于每一曝光时间,实行反应若干分钟并且由从稳态反应条件得到的平均谱图获得报道的离子强度。假设产物和前体的电离效率相同,通过用反应期间的P-B强度除以反应之前的前体强度,估算出反应产率。样品暴露于紫外光之前的MS1谱图显示前体信号在m/z760.6处(图25A)并且在6秒的累积UV曝光之后,观察到在m/z816.6处的P-B反应产物是主要反应产物(图25B)。m/z816.6的射束型CID揭示在m/z 184.136处的磷酸胆碱头基以及在m/z650.6和676.5处的用于C=C定位的诊断离子(图25C)。诊断离子对应于单不饱和脂肪酰基中C9H18的丢失且被丙酮中的醛(m/z 650.6)或C(CH3)2(m/z 676.5)置换。这些离子清楚地显示C=C位置在18C脂肪酰基上的9碳与10碳之间。
在MS1反应谱图中,在m/z 802.6和876.6处观察到相对较低强度的副反应,以及m/z 100-300的低丰度化学噪音。相信m/z 802.6与由光诱导的丙酮均裂引起的诺里什型反应(Norrish type reaction)及随后与脂肪链中的C=C键共价反应有关。m/z 876.6处的反应产物当前尚不清楚,但可能是来自P-B产物上的非共价丙酮加合物。实施用于连续UV曝光的实验设置以验证所观察的反应现象不是图24中的实验装置引起。不连续UV曝光与连续UV曝光持续反应约9秒之间MS1谱图的比较揭示类似的反应现象,确定副反应不是不连续UV曝光的伪象。
相对于分批情形,流动式光化学的一个优势在于,增强了对样品UV曝光的控制,由此可以使不想要的副反应减到最少并且在一段较长时间中维持稳定离子强度。这对于鸟枪法脂质组学研究具有重要影响,在这些研究中,为了使低丰度离子信号平均化,通常需要延长输注时间。图25D中通过前体和6秒累积曝光的P-B产物峰面积的提取离子色谱图(XIC)显示了流动式光化学设置延长反应时间的能力。对于使用图24中的装置的典型实验,在4.5μL/min流量下,从UV曝光点至MS进口的总滞留时间是约1.2分钟。因此,可以预测反应产物的时序,由此确定光子起始PB反应并在关灯时猝灭。一旦观察到P-B反应产物,就需要约1分钟来达到稳态反应条件,这对于6秒不连续样品曝光大致是在所有卷绕内的总滞留时间。在稳态反应条件期间约2分钟的离子电流低波动展现延长分析时间以实现低丰度离子信号平均化的可行性。
为了探索P-B产物形成的限值随UV曝光的变化,以约1秒的增量记录前体和P-B产物强度(图25E)。强度值是从在1分钟稳态反应条件内平均化的反应谱图的峰高度获得。对于所述条件,观察到P-B反应产率的线性增加直到4秒并且其后斜率开始降低,直到在7秒时观察到平台期,反应产率是50%。关于在过量丙酮中并且在延长反应时间(>2小时)下曾对环戊烯(28%)和环己烯(8%)报道类似丙酮系统的产率。相应地,发现相较于先前文献中的报道,本文中烯烃制造的产率是合理的。
除在酸性条件下进行的正电离外,由于磷酸盐易于去质子化,还在碱性溶液条件下以负电离ESIMS分析许多脂质。为了研究在负电离下进行的P-B反应,使用与图24相同的实验设置,使用油酸(n-9Z)于7:3丙酮:H2O加1%NH4OH中的N2吹扫的溶液(5μM)作为模型化合物。图26A是显示在m/z281.2处的前体信号的MS1谱图并且图26B是在6秒累积UV曝光之后的MS1反应谱图。观察到在m/z339.3处的含量丰富的P-B产物,以及在m/z 323.3、395.3及397.3处的小峰。针对P-B反应产物(m/z339.3)的射束型CID显示在m/z 170.1和197.1处的C=C诊断离子,由此C=C键定位在FA上的碳9与碳10之间。m/z值对应于单不饱和脂肪酰基中C9H18的丢失且被丙酮中的醛(m/z170.1)或C(CH3)2(m/z197.1)置换。在给定实验条件下观察到的油酸和P-B产物强度的时间序列图揭示在约6秒的UV曝光时P-B产物平台期达到40%产率(图26D)。此外,用PA 18:0_18:1(n-9Z)进行的负电离实验也得到40%的产率。由此证实,单不饱和PL和FA的P-B反应产率与相关溶液pH及电离极性无关。
为了增加P-B产物的产率,在直接输注之前,用N2吹扫溶液。N2吹扫是一种用于去除溶液中的氧气的已确认方法并且被常规地用于定量荧光测量中。溶液中的基态分子氧是通过碰撞能量转移起作用的有效三线态自由基清除剂并且使荧光强度测量值降低。另外,经证实溶液中存在氧气会降低P-B反应产率。如果不用N2吹扫在7:3丙酮:H2O加1%乙酸中的5μM PC 16:0_18:1(n-9Z),则在m/z 650.4、622.4及606.4处观察到副反应峰,还在低m/z值处观察到化学噪音。在约2秒的曝光时间之后,P-B反应产率达到最大,约10%。这一数据显示,在实施在线P-B反应之前吹扫溶液中的氧气对于在给定实验条件下达到最大P-B产率很重要。
为了进一步检查连续流P-B反应实验设置的性能,在5秒的固定曝光时间下,测定产率随流动速率的变化(图27A)。由于绝对离子强度随流动速率变化并因此在同一图内不能直接比较,故在y轴上使用在反应稳态条件期间的强度比率[P-B强度/(P-B强度+前体强度)]。在同一图上,对于100-750nL/min,使用熔融硅石nanoESI尖端(8μmi.d.)并且对于更高流动速率,使用商购的ESI源。强度比率的极值在0.4-0.6范围内,不过大部分是在0.45-0.55之间,这与在几乎两个数量级的流动速率范围内P-B产物形成产率一致完全相符。
在数据中观察到的一个趋势是随每种源的流动速率降低,强度比率略有减小。据推测,该减小是在较低流动速率下扩散到溶液中的大气中的氧气增加的结果,而先前已展示,氧气增加会降低P-B产率。此外,在两种电离源之间观察到不同强度比率,这可以归于实验装置和条件,例如曝光时间长度和灯位置等的差异。尽管如此,数据显示在几乎两个数量级的流动速率范围内,强度比率相对稳定,由此扩大了可能的分析应用的范围。
到这里,已经针对7:3丙酮:H2O加1%乙酸的固定溶剂条件研究了反应条件。然而,实际上在ESIMS脂质分析中使用了多种溶剂条件。CHCl3是最常用的直接注射脂质溶剂,因为该溶剂被用作生物提取溶剂并且还提供良好的脂质电离效率。不幸的是,CHCl3的存在对P-B反应产率不利,并因此研究其它相关溶剂系统。
本文中报道的系统性研究涉及将甲醇、异丙醇、乙腈及己烷作为溶剂添加至在70:15:15丙酮:H2O:溶剂1%乙酸中的5μM PC 16:0_18:1(n-9Z)中并进行6秒的UV曝光(图27B)。所有溶剂都适于磷脂正相和反相LC分离,并且用于代替乙酸的甲酸铵是常用的LC-MS流动相盐。结果显示当添加至含有H2O和丙酮的PL溶液中时,相对于较大并且极性较低的溶剂(IPA和己烷),其产率是约10%的,较小并且极性较强的溶剂,例如乙腈和甲醇,产生较高的P-B产率(25%)。据推测,在用IPA和己烷情况下观察到的产率降低涉及与丙酮竞争以使脂肪酰基链溶剂化,由此减少了激发丙酮与烯烃官能团反应的机会。此外,已知竞争反应路径,如己烷脱氢,是与UV激发丙酮一起发生,由此降低P-B产率。有关最低丙酮溶剂比率的研究揭示对于含1%丙酮的1:1H2O:乙腈加1%乙酸,P-B产率是10%。对于在调节剂存在下丙酮:H2O比率<1,PC 16:0_18:1(n-9Z)的电离效率较差,但在添加乙腈情况下,电离效率大大增加。这些实验证实了P-B反应与LC溶剂相结合的可行性,使得P-B反应与在线LC-MS相结合成为可能。
至此在本实例中观察到的P-B反应是在控制条件下用标准脂质进行的。在生物样品的脂质组学应用中,一种主要方法是将脂质提取物直接注入质谱仪中,只要极少样品制备。相对于标准溶液,生物材料的脂质提取物的化学复杂性要高出几个数量级,这有可能降低P-B反应的有效性。然而,P-B反应的优势在于,在串联MS期间产生诊断离子,由此能够以高选择性与灵敏度鉴别个别PL物种中的C=C。
通过直接注射在7:3丙酮:H2O加1%酸/碱调节剂中稀释的商业上购买的酵母极性脂质提取物(0.1mg/ml)来展示应用于生物提取物的P-B反应。根据制造商,将丙酮和乙醚添加至氯仿:甲醇总提取物中且PL内含物在乙醚相中,将其浓缩并溶解于氯仿中。对于PL分析,先采用三级四极前体离子和中性丢失扫描,通过特征性的断裂路径鉴别PL物种头基。接着利用LIT MS3扫描来鉴别脂肪酰基链长度及饱和程度。最后,使样品暴露于6秒的UV照射并使预测的不饱和脂质的P-B产物的m/z经历LIT MS3扫描以检测C=C诊断离子。
对于负电离,酵母脂质提取物的MS1LIT谱图显示于图28A-B中。在暴露于UV之前,观察到PL物种的丰富信号(图28A)并且在UV照射期间,在谱图中观察到以红色字体指示的若干P-B反应峰(图28B)。在MS1反应谱图中未清楚观察到的反应产物仍可以基于由三级四极和产物离子扫描进行的PL鉴别,通过预测的P-B反应产物m/z值进行分析。举例来说,图28C-E显示了在P-B反应产物m/z 774.5处异构体PE 18:0_16:1(n-7)和PE16:0_18:1(n-9)的MS谱图。m/z 774.5的射束型CID产生在m/z 311.2和339.2处的片段离子,以及饱和与单不饱和脂肪酰基片段离子(分别是m/z283.2、255.2及281.2、253.2)(图28C)。图28B中m/z339.2的MS3离子阱CID显示18C单不饱和脂肪酰基(m/z281.2)的片段离子且诊断离子在m/z171.0和197.1处,指示C=C键在n-9位置(图28D)。此外,图28B中m/z 311.2的MS3离子阱CID显示16C单不饱和脂肪酰基(m/z 253.2)的片段离子且诊断离子在m/z 171.0和197.1处,指示C=C键在n-7位置(图28E)。
表6概述了在如所描述分析的酵母极性提取物中所鉴别的35种不饱和PL及C=C位置。这些结果显示MS3CID在减小背景噪声,由此灵敏地检测C=C诊断离子方面的能力。
表6
结论
呈现了将经典的[2+2]帕特诺-比希反应与在线ESI MSn相结合以定位不饱和脂质中的C=C键的方法。研究了在包括流动速率、溶剂组成及UV曝光时间在内的一系列ESI MS条件下的反应限值。在6秒的累积UV曝光下,在7:3丙酮:H2O加1%乙酸中的5μM PC 16:0_18:1(n-9Z)达到50%的最大产率。在负离子模式下,油酸和PA 18:0_18:1(n-9Z)的碱性溶液获得40%产率。由于溶液中分子氧的存在使P-B反应产率降低,故在分析之前用N2吹扫溶液。反应在0.1-4.5μL/min的流动速率范围成功地实施并显示相对恒定的反应产物形成。此外,还在添加LC分离中常规使用的替代溶剂,如乙腈、甲醇、异丙醇及己烷下实行了P-B反应。最后,证实应用该方法可在线分析酵母极性提取物的复杂混合物。尽管反应环境相对于模型系统要复杂得多,但鉴别出总计35种不饱和磷脂的C=C位置。此类研究使本文中的本发明涵盖通过T形接头柱后分离将P-B反应与在线LC-MS相结合,以测定复杂混合物中的脂质C=C。
实例12:分析组织中的不饱和脂质
利用简单程序通过质谱法(MS)进行直接组织分析是加速脂质组学分析中的关键步骤,尤其是对于研究异构体脂质的不饱和度来说。在本实例中,首次利用敞开式质谱法以单一步骤直接测定组织中不饱和脂质的带系统性结构特征的异构体结构,该敞开式质谱法是通过在线帕特诺-比希(P-B)反应和提取喷雾质谱法实施。通过将不锈钢丝刺入块状组织中,并且接着将其浸入预装载有用于提取、反应及ESI-MS检测的溶剂的nanoESI毛细管中来直接提取脂质。使用紫外光(λ=254nm)促进P-B反应以形成在C=C键的原来位置添加有氧杂环丁烷环的反应产物离子(+58Da),随后利用CID使其裂解以产生特征性的片段离子。可以在较宽的动态浓度范围(占大鼠脑中总脂质的0.0013%-0.5%)内以良好再现性鉴别脂质的不饱和度(检测到的脂质的异构体比率:RSD<10%,在一个组织的相同区域中取样;RSD<21%,在相同类型组织的相同区域取样)。由于本发明方法可以达成低至10μg/样品的样品消耗,故首先也测定大鼠脑和肾中不饱和脂质的异构体比率。在大鼠脑的不同区域中观察到溶血磷脂酸(LPA)18:1和磷脂酸(PA)18:1-18:1的异构体比率的明显差异,而在大鼠脑和肾两者中脂肪酸(FA)18:1的异构体比率相对稳定。
本研究首先通过将帕特诺-比希反应与提取喷雾质谱法相结合来直接测定组织中脂质的结构及C=C键的位置。由于样品消耗低至约10μg,故可以迅速测量一个较小区域(0.5mm×0.5mm)中的脂质异构体并且先以脑和肾中异构体比率的二维(2D)图进行分析。此技术提供了一个监测不饱和脂质的强大平台,由此能了解脂质的不饱和度对组织生物功能、生物合成路径且因此对组织疾病状态的影响。
引言
脂质是一组天然存在的分子,在细胞膜发育、能量产生和储存、激素产生、在疏水性环境中的膜蛋白隔离和保护,以及通过其自组装和聚集行为进行细胞信号传导过程中展示突出的物理化学特性。脂质的不饱和度,即C=C键的数量和位置,是决定脂质形状的重要参数之一,通过影响细胞膜弯曲(就膜渗透性来说)、跨膜结构及酶作用而与组织的生物功能和疾病状态密切相关。举例来说,发现当C=C键位于酰基链中间时,膜内的有序性最弱,并因此增强膜的流动性。此外,已发现含有18-22个碳并且在从脂质甲基端起第三个位置中安置有特征性C=C键的ω-3脂肪酸对于脑发育很重要并且在原发性和继发性冠心病预防试验中发挥心脏保护功能。然而,C=C位置的定位仍是一大难题并且需要可靠的分析平台来分析分子结构并将脂质异构体与许多可能性相区分。
相比之下,质谱法(MS)能够提供详细的分子信息并由于其高灵敏度、选择性及较宽的质量范围而因此被广泛用于测定个别脂质的身份和量。已开发出采用通过高能碰撞诱导解离(CID)直接断裂脂质或化学衍生化随后MS分析来测定C=C键的一系列基于MS的方法。典型地,在MS分析之前,需要以若干步骤提取、分离并纯化脂质,这可能需要长达一天的劳动密集型工作。这一类多步骤程序适用于分析大批量样品。同时,经显示,作为单步骤策略的敞开式电离质谱法在分析目标分析物方面表现良好。
在敞开式电离质谱法中,从呈自然状态的样品直接电离出分析物并将其转移至气相中,以极少的样品制剂进行MS分析。已开发出许多敞开式电离方法并且适用于直接脂质分析以及其在组织上的分布的二维(2D)成像,如解吸附电喷雾电离质谱法(DESI)、基质辅助次级离子质谱分析、探针电喷雾电离(PESI)、基质辅助激光解吸电喷雾电离(MALDESI)、简易敞开式声波喷雾电离(EASI)、大气压红外基质辅助激光解吸电离(APIR-MALDI)、纸喷雾以及针穿刺活检和喷雾电离。以敞开式电离质谱法测定双键位置的应用被首先以低温等离子体电离质谱法(LTP-MS)实现于来自细菌样品的微生物脂肪酸乙酯混合物中。然而,在组织样品中对双键直接定位方面取得极少进展。同时,尽管利用许多强大的成像平台以高分辨率良好分析出脂质浓度分布,但在组织区域之中异构体脂质比例的关系仍不清楚。
在本实例中,首次利用敞开式质谱法直接测定组织样品中不饱和脂质的带系统性结构特征的异构体结构,该敞开式质谱法是通过提取喷雾和在线帕特诺-比希(P-B)反应实施。另外,首次获得大鼠脑和肾中脂质异构体比率的空间分布的图像。
样品收集:大鼠是从Harlan实验室(美国印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN,USA))获得,圈养并在呼吸停止时斩首。所有手术都是根据普渡大学动物护理和使用委员会(Purdue University Animal Care and Use Committee)指导原则和ARRIVE指导原则进行。从身体取下各组织,包括脑、肾及肝,并且立即在-80℃下冷冻。分析之前,使组织分别在-20℃冷冻器中并且接着在4℃冷冻器保持1小时以逐渐解冻。接着,将组织转移至玻璃载片上并储存在冰箱中用于实验用途。
脂质的取样、提取及电离:如图29A所示,实施提取喷雾以直接分析组织。使用与组织活检类似的程序,将不锈钢丝(200mo.d.)插入组织中约2mm深度处,并且接着将其浸入具有拉长尖端的玻璃毛细管(1.5mmo.d.和0.86mmi.d.)中的20μL溶剂中进行nanoESI。制备的溶剂对于磷脂是丙酮:乙腈:水(v:v:v=70:20:10),而对于脂肪酸是丙酮:水(v:v=70:30)。接着,将脂质样品转移至溶剂中并对不锈钢丝施加1.8kVDC以产生nanoESI。
质谱法:所有质谱都是利用QTrap4000三级四极/线性离子阱混合质谱仪(AppliedBiosystems/Sciex,加拿大多伦多)记录。典型地,4000QTRAPMS的仪器设置如下:帘式气体,8psi;去簇电压,±20V;界面温度加热器,40℃;及扫描速率,1000Da/s,并使用Q3作为线性离子阱。
对于通过串联质谱定位不饱和脂肪酸上的C=C键,利用Q1四极阵列分离脂质的帕特诺-比希(P-B)反应产物,并且接着将其转移至Q3线性离子阱中进行共振活化(on-resonanceactivation)(离子阱CID)。根据各脂肪酸,激发能量(AF2)设置在30-70V范围内。对于不饱和磷脂,利用Q1四极阵列分离脂质或其P-B反应产物,并且接着加速至Q2四极阵列进行射束型碰撞诱导解离(CID)。对于不同分子物种,碰撞能量(CE)在25至50V间变化。磷脂中C=C位置是根据MS3CID中的谱图测定,其中通过射束型CID形成一个产物离子片段并在Q2中分离;接着在Q3线性离子阱中,通过施加30-70V的AF2进行进一步断裂。
脂质鉴别:通过将串联MS谱图与文献报道相比较来鉴别脂质。
帕特诺-比希(P-B)反应:使用低压汞灯(BHKInc.,加拿大安大略省)施加于254nm的UV照射以促进不饱和脂质与丙酮之间的帕特诺-比希反应。该汞灯是在距nanoESI尖端0.5-1.0cm距离处垂直安置。利用QTrap 4000分析脂质和反应产物。
结果
该设计和程序显示于图29A中。通过将不锈钢丝刺入块状组织中,并且接着将其浸入预装载有用于提取和反应的溶剂的nanoESI毛细管中来直接提取脂质。对该不锈钢丝施加高电压以产生nanoESI。使用发射254nm紫外光的低压汞灯来促进P-B反应以形成在C=C键的原来位置处添加有氧杂环丁烷环的反应产物离子(+58Da),随后利用CID使其裂解以产生特征性的片段离子(图29B)。
如在大鼠脑、肾和肝组织中证实,显示利用提取喷雾提取组织中的脂质的方法极高效。脂肪酸和磷脂迅速在m/z200至900的质量范围内呈现,并且当对ESI尖端施加高电压时,在20秒内强度达到平衡。另外,MS峰图案与常规脂质提取物谱图类似证实,脂质提取具有良好可靠性。同时,MS峰图案随组织类型不同而不同(图30A-I)。可以通过串联质谱容易地鉴别各磷脂或溶血磷脂的头基和酰基链(图31A-E)。有机溶剂的选择至关重要。该溶剂需要具有良好的脂质溶解度,适于电喷雾并确保较高的脂质反应效率。对若干溶剂配方进行测试(图32A-E)。发现溶剂70%丙酮:30%H2O(v:v)以及70%丙酮:20%ACN:10%H2O(v:v:v)分别提供分析脂肪酸和磷脂的最佳性能。
为了定位脂质各酰基链中个别双键的位置,进行P-B反应。如图31A-B中所示,不饱和脂肪酸或磷脂的强度明显降低,而在紫外光下辐射之后出现许多新的P-B反应产物离子峰。根据在离子阱质谱中利用CID进行的逆P-B反应得到的指纹片段指定双键位置。图31C中显示m/z 339.3的MS2CID质谱是P-B反应中脂肪酸(FA)18:1的产物离子。比较在P-B反应之前和之后的MS2谱图,基于在m/z 171.0和197.1以及m/z 199.0和225.1处的两对新产生的片段,指示双键分别在从脂质甲基端起第九个(n-9)或第七个(n-7)碳位置。另外,基于裂解的不饱和酰基链上P-B反应的产物离子的MS3CID谱图,在磷脂酰丝氨酸(PS)18:0-18:1的酰基链18:1中获得相同结果(图31E)。添加甲醇(MeOH)或乙腈(ACN)有助于提取磷脂,但由于MeOH或ACN吸收类似于254nm的波长的UV形成自由基,使得P-B反应产物的产率以不同程度降低(图33A-C)。值得关注的是,通过预加热灯以便更快速地达到最佳的光强度和波长条件,使P-B反应产物的半生长时间(half growth time)从1.5分钟加速至0.5分钟(图34A-B)。
反应性提取喷雾在较宽动态浓度范围内分析不饱和脂质显示出良好性能。如表7-8中所示,分析出大鼠脑中在三个数量级浓度范围内的三十一种不饱和脂质,具有良好的异构体比率再现性(RSD<10%,在一种组织的同一区域中取样,N=3)。
表7
表8
此外,也可以以良好信噪比分析痕量水平的不饱和脂质。在大鼠脑的直接分析中已经达到占总脂肪酸0.14%的FA 21:1及占总脂质0.0013%的磷脂酰甘油(PG)34:2的最低脂质丰度(图35A-D)。图35C-D显示在P-B反应之后测定双键的典型的FA 21:1和PG 34:2CID谱图。根据指纹峰,发现FA 21:1的四个可能的位置(n-8、n-9、n-10及n-12)及两个可能位置(n-7和n-9)。
除高灵敏度外,得益于值得注意的小取样区域(0.04cm2)和低样品消耗(约10μg)优势,也已首次绘制出大鼠脑和肾的不饱和脂质的异构体比率。为了进行2D成像,将完整大鼠脑或切割的肾安置在分辨率是500μm的一张方格纸上。接着,将取样探针插入组织中的精确坐标位置,深度为约2mm。在各区域的1至3个位置进行取样并且在每个位置取得3个重复样品,以获得代表性异构体比率。磷脂酸(PA)18:1-18:1、溶血磷脂酸(LPA)18:1及FA18:1由于其众所周知的信使功能及在利用甘油-3-磷酸酰基转移酶或溶血磷脂酸酰基转移酶配合的分子合成中的密切关系而被选作目标分子。对于大鼠脑成像,对称地鉴别并定量绘制包括脊髓、脑干、小脑、旁绒球(左和右)、下丘脑(左和右)、松果腺、顶叶皮质(左和右)、运动皮质(左和右)及嗅觉(左和右)在内的14个选定解剖区中的以上三种脂质(图36和37A-D)。PA18:1-18:1的更全面的图以及大鼠脑26个区域中的异构体比率提供于图38C中。得益于较低样品消耗,脑在取样50次之后仍保持良好情形(图38D)。
值得关注的是,在大鼠脑的不同区域中观察到LPA 18:1和PA 18:1-18:1的异构体比率的明显差异,而在所研究的大鼠脑和肾两者中,FA 18:1的异构体比率相对稳定。由于在类似条件下比较来自不同批次的五个脑的六个选定的解剖区时,其RSD均低于21%,故证实PA 18:1-18:1的异构体比率分布具有良好一致性。此外,还观察到31种脂质的独特异构体比率在同一大鼠脑的右前额皮质与脑干之间存在不同程度差异(图39A-D和表7-8)。这一结果可以表明,在PA 18:1-18:1和LPA 18:1合成中异构体FA 18:1的选择并非随机方法,而是与组织区域密切相关。尽管该路径并不清楚,但本发明平台使得有很大可能揭示该路径并且还为了解脂质的不饱和度对组织功能的影响提供支持性平台。此外,还通过比较三个新鲜大鼠脑与另外三个在-20℃冷冻14天的大鼠脑之间PA 18:1-18:1的异构体比率,研究了样品储存对脂质不饱和度的影响(图40)。选择大鼠脑的六个区域,包括下丘脑(左和右)、运动皮质(左和右)、小脑及脑干。当迅速在-20℃冷冻样品时,PA 18:1-18:1展示稳定并且一致的不饱和度。
总之,提取喷雾与P-B反应的组合能够直接鉴别不饱和FA链内双键的位置以更全面地表征组织中的不饱和脂质。通常在实验室中需要复杂设置的多步骤样品预处理可以简化成仅一个步骤的纳米喷雾尖端。可以在RSD<10%下以良好的异构体比率再现性分析在较宽动态浓度范围内的多种类型不饱和脂质。更重要的是,得益于值得注意的小取样区域和低样品消耗的优势,首次以二维形式分析不饱和脂质的异构体比率。反应性提取喷雾为研究不饱和脂质对组织生物功能和疾病状态的影响提供了强大的成像平台。
实例13:使用小型质谱仪进行不饱和脂质的直接组织分析和表征
脂质组学已成为发现人类疾病的生物标记物的可能领域。直接组织分析由于可以提供分子信息而能够用于临床诊断中。在本实例中使用了被设计用于床边应用的台式Mini12,通过直接取样电离来分析生物组织中的脂肪酸和脂质。另外,使用帕特诺-比希(PB)反应进行光化学衍生化以定量脂质的不饱和异构体的相对丰度。
P-B反应是由羰基和烯烃形成四元氧杂环丁烷环的光化学反应。其已被广泛用于许多天然有机产品(图41)。图42显示了在本实例中用于组织分析的设置。直接大鼠组织分析使用了提取喷雾法。NanoESI喷雾溶剂是100%甲醇。*H2O:丙酮=1:1作为P-B反应喷雾溶剂。
图45显示使用标准化合物进行的在线P-B反应。图46显示使用大鼠脑样品进行的在线P-B反应。脂质概况分析结果显示于图43A-E中。图43A、43C及43E显示了三个大鼠器官样品中脂肪酸的脂质概况。图43B、图43D及图43E显示了磷脂的脂质概况。这两个都使用了nanoESI(-)模式。图44显示了磷酸胆碱的CID。数据显示脂质分析可以帮助鉴别疾病的可能生物标记物。提取喷雾方法可以发现脂质概况,无需样品制备和真空环境。
在人体中,40%的总脂质是不饱和的。P-B反应与小型MS系统的组合可以可靠且高效地测定大鼠脑组织的脂肪酸中C=C双键的位置。
实例14:利用C=C位置特异性质谱方法进行定性和定量脂质分析
本实例显示了有关测定脂质中碳-碳双键(C=C)位置的方法的研究以及该方法在定性和定量脂质组学中的用途。
脂质是一组结构多样的复杂化合物,可以分为8个主要类别和许多亚类(术语根据LIPID MAPS)。由于细胞、组织或生物体中脂质的结构多样性及较大的动态范围,以传统方式很难分析生物样品中的完整脂质组成(脂质组)。MS的发展,尤其是软电离技术(与分离法联用)和串联质谱(MS/MS)的开发使基于MS的脂质分析成为脂质组学研究的主要工具。在许多值得注意的分析品质因数中,分子结构的高特异性是以基于MS的方法进行脂质分析的独特特征。举例来说,可以通过MS/MS容易地获得若干层脂质结构信息,包括脂质种类、键类型、脂肪酰基/烷基组成,并且甚至有时可以获得脂肪酰基/烷基链的位置。然而,基于大部分MS平台,利用MS/MS很少获得有关C=C键的位置及其构型(顺相对于反)的信息,并因此在有关脂质分析的大部分科学报道中未有报道或呈现该信息。不饱和脂质占生物系统中总脂质的相当大比例,并且其物理特性、化学反应性及生物转化与多种生理和生理化学功能密切相关。由于脂质C=C键位置异构体确实存在并且是通过各种生物合成路径产生,故如果不能测定C=C位置或区别并定量不饱和脂质异构体会明显阻碍对于与C=C位置差异有关的生物化学和生物结果的了解。
本实例说明了有关MS平台的研究,该平台提供C=C位置特异性以及定量生物样品中众多脂质物种的不饱和脂质异构体的能力。该技术的创新之处在于,对脂质C=C具有高度特异性反应性的光化学(帕特诺-比希,PB)反应与ESI-MS/MS(ESI:电喷雾电离)的在线结合。PB反应产物当经历MS/MS时产生C=C位置特异性片段离子,这些片段离子可以用于结构鉴别和定量。为了开发稳固并且广泛适用的脂质分析平台,解决了一系列问题,包括设计用于在线PB-ESI的稳固光反应器、开发用于脂质结构分析的全面MS/MS程序、用于自动鉴别和定量的数据分析工具及有关来自小型动物的不同组织类型的不饱和脂质的综合数据库。本实例显示了:用于帕特诺-比希(PB)反应与ESI-MS/MS的在线结合的反应/电离源的开发和优化;用于多种脂质种类的不饱和脂质的结构测定和定量的MS/MS方法的开发;用于鸟枪法和LC-MS/MS脂质组学分析的PB-ESI-MS/MS工作流程的开发;及使用不同大鼠器官的组织样品进行脂质组学分析的分析平台的验证。
由本文中的研究得到的结果是建立一个适于定性和定量鸟枪法以及基于LC的脂质组学分析的稳固并且广泛适用的平台。本文中收集到的数据构成了具有大鼠不同器官组织中不饱和脂质同功异型物的C=C位置、组成和量的信息的第一个不饱和脂质数据库。这一新的脂质分析能力推动了生物科学许多领域的研究,包括但不限于脂质分子生物学、功能性脂质组学、代谢组学及生物标记物发现。
背景
脂质作为一类重要的生物分子,发挥多种多样的功能,如先前公认的储能和细胞膜结构组分作用以及稍后确定的作为调控和细胞-细胞信号传导分子的作用。脂质的这些多种多样的功能是由其多种多样的结构引起。LIPID MAPS数据库记录了约40,000种(从4/2/2015起)独特的脂质结构并且这些结构在细胞(即膜)内和细胞器间分布不均一。脂质研究的一个主要难题是了解细胞如何维持和调控脂质动态平衡。随着生物学和生物分析工具的发展,完整细胞脂质组成(脂质组)以及脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用的表征现可接近系统水平。基于质谱法的细胞脂质分析已被确定作为脂质组学中的主要工具,用于提供整体脂质鉴别和定量。由此获得的脂质概况愈来愈多地被用于研究总体脂质组成的疾病相关变化。脂质组学仍处于相对早期阶段并且具有高灵敏度、特异性及处理量的脂质分析的开发将大大增进有关脂质多样性和脂质动态平衡的功能结果的研究。
基于MS的脂质组学方法:MS的高灵敏度和分子特异性以及其与如液相色谱法(LC)等分离技术的联用使其成为脂质分析中最常使用(80%)的技术。有两种MS方法几乎同等地被用于整体脂质分析:鸟枪法和LC-MS。对于鸟枪法,将脂质提取物直接输注至典型地使用电喷雾电离(ESI)作为电离源的质谱仪中。或者,可以在MS分析之前,利用LC分离脂质提取物。两种方法之间的选择取决于分析的目的。由于速度快,鸟枪法特别适于通过比较正常/病变样品的整体脂质概况进行疾病诊断。对于准确脂质定量,或鉴别极复杂样品中的低丰度脂质物种,联用方法允许进行高保真度结构鉴别和准确定量。与ESI相同,基质辅助激光解吸电离(MALDI)是另一种可以用于脂质电离的有效方法。近年来,MALDI-MS由于其成像能力而引起越来越多的研究兴趣。
利用MS/MS进行脂质鉴别和定量:利用高分辨率质谱仪简单地测量质量将提供元素组成,但由于有许多可能的分子同量异位和异构物种共存而不能提供细部结构信息。串联质谱法(MS/MS)是脂质鉴别和定量中使用的关键技术。MS/MS实验含有至少三个关键要素:前体离子的产生和分离、解离前体离子的气相反应以及产物离子的质量分析。过去三十年的累积成果已综合性开发出用于多种脂质种类的MS/MS方法。这些MS/MS方法中大部分已经在装备有低能碰撞诱导解离(CID)的MS仪器实施。空间串联仪器,如三级四极MS或高级MS(highbred MS),可以执行联合MS/MS实验(中性丢失扫描、前体离子扫描、产物离子扫描),由此允许对复杂混合物中的脂质迅速分类以及灵敏检测(反应监测)和定量。时间串联质谱仪,如四极离子阱MS,允许进行更高阶段的MS/MS实验(即MS3或MS4)及不同类型活化以实现细部结构表征。
结构特异性分析中的难题:脂质是结构多样的分子,可以分成8个种类及许多亚类。在哺乳动物细胞中检测到的主要脂质种类包括脂肪酸(FA)、甘油脂质(GL)、甘油磷脂(GP)、鞘脂(SP)及固醇脂类(ST)。GP可以进一步分成甘油磷酸胆碱(PC)、甘油磷酸乙醇胺(PE)、甘油磷酸丝氨酸(PS)、甘油磷酸甘油(PG)、甘油磷酸肌醇(PI)及甘油磷酸酯(PA)。根据LIPIDMAPS,存在五个不同层面的结构表征,从最低至最高列于下:第1层.脂质种类/物种鉴别;第2层.键类型/羟基鉴别;第3层.脂肪酰基/烷基;第4层.脂肪酰基/烷基位置;及第5层.确定化学结构,包括立体化学和碳-碳双键(C=C)位置/几何结构。当前,脂质结构分析通常可以达到第3层,表征脂质中的脂肪酰基或烷基组成。通过仔细的数据解释,可以扩展至第4层,获得有关酰基/烷基链位置的信息。举例来说,通过观察由MS/MSCID以阳离子模式得到的特征性m/z 184(磷酸胆碱)片段离子并且检测由PC乙酸阴离子加合物([PC+CH3COO]-)的MS/MS CID得到的脂肪酰基阴离子:m/z 257(16:0,具有16个碳原子的饱和酰基链)和m/z 281(18:1,18个碳和一个C=C),可以将分子质量是759.6g/mol的磷脂酰胆碱(PC)鉴别为PC 16:0/18:1。此外,根据经验规则,即sn-2典型地是以比sn-1酰基阴离子高的强度产生,可以将16:0和18:1酰基链分别指定为sn-1和sn-2位置。然而,利用装备于大部分商购MS平台上的低能CID很难达到第5层,如C=C位置和构型的鉴别。这一困难根本上来源于需要明显较高的活化能来破坏C-C或C=C键,由此不能产生有关C=C的片段离子,使得没有确定C=C位置的线索。
用于测定C=C的现有方法:为了解决此问题,已经获得两种独特方法用于开发测定C=C的基于MS的方法。一种方法涉及在MS分析之前进行C=C选择性反应,如臭氧分解、烷硫基化、甲氧汞化、环氧化等。这些反应将C=C官能团转化成可以利用MS或低能CID比较容易地分析的其它基团。其中,离线或在线臭氧分解由于能够与HPLC、ESI结合并且适用于众多种类的脂质而引起最大关注。然而,当分析复杂脂质混合物时,由于不同脂质物种可能产生相同的臭氧分解产物,故关于C=C位置通常获得不确定的结果。作为在MS之前进行C=C衍生化的替代,开发出了若干基于串联MS的方法来测定C=C,包括使用高能CID(约keV)进行的完整脂质电荷远程断裂、二锂化脂质加合物离子的多级MS/MS CID及臭氧诱导解离(OzID)。这些方法由于需要专门的MS仪表或电离条件而未被广泛用于脂质组学研究。
在线帕特诺-比希(PB)反应与ESI-MS/MS结合
C=C的独特化学性质是其易受自由基攻击,由此提出利用涉及自由基的MS分析进行研究。本文中的实例集中在开发在ESI和MS界面区域中以脂质C=C为目标的自由基反应。对于基于ESI的脂质组学,此方法具有两个引人注目的性质。第一,自由基反应很快(受扩散速率限制)并且可以容易地与任一直接ESI输注方法结合或在分离之后且在ESI-MS之前在线进行。第二,由于反应是在质谱仪外发生,故这些反应可以应用于由ESI界面组成的任何类型的MS。不过,在有机化学所报道的针对C=C的大量自由基反应中,用于脂质分析的良好反应候选物应当满足以下因素:1.对于C=C的高特异性;2.合理的反应产率;3.不会直接裂解C=C以使得在完整脂质与反应改性的脂质之间存在可检测的联系用于进一步结构分析;反应物对脂质的分析具有最小干扰(例如电离效率、带电特性)。
本文中显示,帕特诺-比希(P-B)反应(一种经典的[2+2]光化学反应)可以与在线ESI-MS/MS相结合并且快速且灵敏地测定复杂脂质提取物中C=C的位置。反应机制涉及UV将醛或酮内的羰基激发至其激发态,随后添加至C=C上并形成双自由基。双自由基闭环形成四元氧杂环丁烷环。取决于羰基与C=C键的相对位置,形成两个氧杂环丁烷位置异构体(结构1和2),如图47A所示。PB反应产物很稳定并且可以进行质量分离并经历CID。在初步研究中,将脂质分析物溶解于1:1的水/丙酮中,其中丙酮充当PB反应试剂。该反应仅在nanoESI源极区执行并且利用发射波长集中在254nm的UV灯照射(设置显示于图47A的插图中)。图47C展现以负离子模式nanoESI在线分析的油酸FA18:1(9Z)(10μM)的PB反应。仅在UV照射打开时观察到相对于完整FA阴离子(m/z 281)质量增加58Da(丙酮的质量)的丰富PB反应产物(m/z339)(相较于图47B,UV关闭时的情形)。PB反应产物(m/z 339.3)的MS2CID促进逆PB反应(图47A)。在m/z 281处的产物离子由逆PB路径,通过丢失中性丙酮(58Da)产生。在m/z 171处(具有结构3)和197处(具有结构4)的产物离子分别由逆PB路径,使氧杂环丁烷环在P-B反应产物1和2内的原始C=O和C=C位点处断裂产生。具有结构3和4的片段离子由于在原始C=C位点处添加“O”与添加“C3H6”的差异而始终存在26Da的质量差异。因此,这些离子称为C=C诊断离子。由于其互补片段以中性物存在而未检测到。
此PB-MS/MS策略也可以用于其它种类脂质,如GP,以及识别不同酰基链中的个别C=C位置。图48A显示了PS 16:1(9Z)/18:1(9Z)中C=C测定的实例(m/z 758.6是去质子化离子,结构显示于图47D中)。在m/z 816.5处其PB反应产物的MS2CID引起PS特有的87Da中性丢失(NL)并产生对应于两个游离酰基链的离子,即在m/z253.2和281.2处的R1COO-和R2COO-。另外,分别在m/z 311.2和339.3处观察到PB反应改性的两条酰基链。这些PB反应产物离子的MS3CID数据显示于图48C和48D中。基于C=C诊断离子3的通用化学式CnH(2n-3)O3 -,可以可靠地测定双键位于各酰基链的C9与C10之间。综合酰基链组成信息,直接地得出结论,一条酰基链是在C9与C10之间具有双键的C16,并且另一条是在C9与C10之间含有双键的C18链。以上程序也形成不饱和脂质结构表征的基础。
从有关模型FA和GP的研究未观察到基于丙酮的PB反应对不同种类脂质或特定C=C位置或构型的反应性或选择性存在明显差异。这一特性表明,其有可能充当不饱和脂质分析的更通用方法。其它引人注目的特征包括其与“鸟枪法”脂质组学的相容性、简单并且低成本的反应实验设置(紫外灯设置的成本低于200美元)、不需要改良质谱仪、易于解释的质谱及廉价的恢复私有化的试剂(reprivatizing reagent)。这些方面使得PB反应成为进一步开发用于鸟枪法和基于LC-MS的脂质组学方法的稳固且广泛适用的工具的理想候选。
C=C位置特异性脂质组学工具的缺乏导致不能区别和定量C=C异构体,使得占总脂质相当大比例的不饱和脂质的研究缺少一环。因此,无法了解与C=C位置差异有关的生物后果并且对于研究病理病况下脂质组的改变认识不足。本文中的方法提供了有关MS平台的研究,该平台提供C=C位置特异性以及定量生物样品中众多脂质物种的不饱和脂质异构体的能力。如本文所论述在线PB反应与ESI-MS/MS相结合满足这些需求。本文中收集到的数据也将构成具有小动物不同组织中不饱和脂质同功异型物的C=C位置、组成和量的信息的第一个不饱和脂质数据库。这一新的脂质分析能力推动了生物科学许多领域的研究,包括但不限于脂质分子生物学、功能性脂质组学、代谢组学及生物标记物发现。
用于帕特诺-比希(PB)反应与ESI-MS/MS的在线结合的反应/电离源的优化
传统上,APB反应在有机合成中是在本体溶液中进行的。鉴于这种类型反应的量子产率相对较低(0.01-0.1),故在有机合成中采用了高浓度反应物(在mM至M范围内)、较长反应时间(在3-24小时范围内的UV照射)及非极性溶剂。当使用ESI-MS/MS时,这些条件不能与典型脂质分析条件直接相容,而且也不是PB反应与MS/MS的在线结合所需要的。为了解决这些问题,开发出允许进行在线光化学反应以及利用MS进行原位反应监测和产物分析的反应器和方法。该研究允许表征对于获得良好PB反应产率并利用MS灵敏检测脂质很重要的因素。
流动式光化学是有机合成中的一个正在发展的领域,其中传统的分批式反应器被主要在<1mmi.d.毛细管(微反应器)中的连续流动的溶液替代。连续溶液流结合微反应器尺寸能够精确地控制溶液UV曝光,由此可以通过减少由过度或不均匀UV曝光产生的不想要的副产物来增加产物产率。有几个关于进行连续流光化学反应的实例,如分子间光加成以及用于“足迹分析”的OH与蛋白质的反应。基于这些成功的实例,研究在nanoESI发射极的源极区中以及在ESI的分析物溶液输送管中(独立反应和ESI)进行PB反应。
起初,在PB反应中使用静态nanoESI源,无需另外泵送溶剂(图47A)。已经实施多种脂质物种的PB反应,但典型地具有较低至中等的反应产率(10-40%)。举例来说,在m/z818.6处产生PC16:0/18:1(9Z)(5μM)的PB反应产物,反应产率是约10%(图49A)。此外,如图49B中显示的提取离子计时图(extracted ion chronogram,XIC)所示,该反应典型地需要30秒至1分钟的前置时间来达到稳态。这一现象清楚地表明,相当大一部分的反应在nanoESI尖端内发生,排除nanoESI羽流区域中,因在此仅允许约毫秒的反应时间(源极区中液滴的寿命)。nanoESI喷雾发射极是由硼硅酸盐玻璃制成,在尖端头部(估计小于100μm)处的薄壁区域对250nm部分透明。鉴于静态nanoESI的流动速率低(10nL/min),在喷射端处由于喷雾引起的分子浓度变化是可忽略的(约1μL体积)。因此,在nanoESI尖端内的反应导致随时间变化积累P-B反应产物并且最后在前几分钟内达到稳态。通过使用明显更高的流动速率(约1-5μL/min)且未观察到明显P-B反应产物的实验证实,该假设是正确的。
由于PB反应主要在nanoESI尖端发生,故可以使用石英玻璃或熔融硅石作为nanoESI尖端的材料以提高反应产率。这两种类型的材料都对约200nm波长透明并因此允许较多光子穿过。还研究了UV灯相对于nanoESI尖端和MS界面的位置对反应产率的影响。在初步研究中,使用初级发射约254nm波长的5W的低压汞(LP-Hg)灯。将研究其它类型的UV灯,如产生在200-300nm范围内的相当大光强度的氙气等离子体闪光灯(Xenon plasma flash-lamp),及可用于小型化反应区的LED UV灯。
为了使PB反应与流动速率在μL/min范围内的输注型ESI源相容,在ESI输送管中执行P-B反应较为适合。具有UV透明涂层的熔融硅石毛细管被选作溶液输送管。对于反应区,该毛细管在中心且距毛细管0.5cm处卷绕(直径3cm)有UV灯(图50A)。对于4.5μL/min的溶液流动速率,1cm曝光对应于在毛细管中1.1秒的反应时间。图50B显示了在5秒UV曝光之后,PC16:0/18:1(9Z)(5μM于7:3丙酮:H2O加1%乙酸中)的ESI MS谱图。形成PB产物(m/z818.6),产率45%,比由nanoESI源获得的产率高得多(图47A)。此外,从图50B的插图中显示的XIC可以看出,在UV灯打开时间期间,PB反应产物信号极稳定。这一特性对于MS/MS针对PB产物发挥良好性能很重要。这一直接输注设置允许通过改变溶液流动速率或暴露于UV的毛细管的长度来改变UV曝光时间,由此可以获得动力学信息。已发现,使用7:3丙酮:H2O加1%乙酸作为溶剂,PC 16:0/18:1(9Z)的PB反应可以在10秒内达到68%产率。基于这一有前景的结果,计划进一步针对常用于基于ESI的脂质分析的一系列ESI流动速度(100nL-50μL)优化“直接输注”设置的构造(灯距离、灯功率)。
对于直接输注设置,使用了P-B反应试剂,即丙酮,作为ESI的共溶剂,不过该溶剂通常不被用作正相或反相HPLC分离的洗脱溶剂。为了解决这一缺点,使用了“流动注射概念”,用T形管将PB反应试剂经样品输送管输送至ESI源,同时光化学反应区位于“T形”接头之后。“流动注射”的示意性设置示于图50D中。使用PC16:0/18:1(9Z)测试此装置。将此脂质溶解于70%/30%(正相LC分离的常用溶剂组成)异丙醇/H2O中,并以1μL/min的流动速度抽吸至ESI源。利用另一注射泵以1μL/min递送丙酮并经T形管递送至脂质溶液输送管中。在混合之后,溶液的组成是丙酮:异丙醇:H2O(50%/35%/15%)。随后的P-B反应(5秒)提供了与图50B极其类似的谱图。如下文所论述,进一步研究该设置与在线HPLC和ESI-MS/MS的结合情况。
使用图50D中显示的反应设置表征对于PB反应性能以及使用代表哺乳动物细胞中的主要脂质种类(FA、GL、GP、SP、ST)的模型脂质化合物进行脂质检测至关重要的实验参数。评价的重要方面将包括使副反应减到最少的条件、适于PB并且与脂质的ESI相容的溶剂系统,以及使用不同类型羰基化合物作为PB试剂的分析效用。
触发PB反应的UV激发波长也可以起始I型诺里什反应,引起丙酮α-碳键的光化学裂解及乙酰基自由基和甲基自由基的形成(图51A)。这两个自由基可以从有机溶剂和脂质获取H原子以形成多种二级自由基或添加至C=C键上。当溶液含有痕量O2时,二级脂质自由基进入充分表征的脂质过氧化路径,形成氧化和降解的脂质产物。实际上,甚至是在新鲜制备的溶液中也观察到此情形。图51B显示5μM PC16:0/18:1(9Z)在丙酮:水(1:1)中的10秒PB反应。在低m/z范围(100-300)内的一组新峰来自于自由基诱导的脂质降解,引起脂质离子信号的明显丧失且PB反应产率仅为12%(针对UV照射之前的完整脂质信号归一化)。尝试用N2吹扫此脂质溶液以移除痕量O2并且达到70%的高PB反应产率(图51C)。这些初步结果表示了控制竞争性副反应以便获得良好PB反应产率的重要性。对于本文所涉及的实验,将在即将进行PB反应之前用N2吹扫脂质溶液。II型诺里什反应的参与程度和影响将用不同种类的模型脂质表征。将检查有机溶剂对副反应程度的影响。
在初步研究中,使用了由50-70%丙酮(体积%)组成的水性溶剂系统来使PB反应产率最大并减少在采用有机溶剂时可能的自由基副反应。然而,对于通过ESI电离和检测来说,以上条件未必是最佳条件。此外,有机溶剂,如CHCl3、己烷、乙腈及脂肪醇常用于脂质提取、分离及ESI;因此,有必要研究有机溶剂组合物对P-B反应和ESI的性能的影响。测试以下溶剂组合物:丙酮:H2O:X=70:15:15(v:v:v),其中X是有机溶剂。当使用PC 16:0/18:1(9Z)作为正离子模式ESI(“直接输注设置”)的模型化合物时,仅15%CHCl3的条件显示明显干扰PB反应,而所有其它有机溶剂在6秒UV曝光中显示可接受的PB反应产率(20-30%)。将测试来自主要种类的标准化合物并测定适合PB反应和ESI分析两者的溶液组成。关键评价标准包括PB反应产率、完整脂质和P-B反应产物的绝对离子计数、副反应程度、与LC溶剂的相容性。
丙酮作为PB试剂有利于良好地共溶解极性和非极性脂质和溶剂,而且不会干扰ESI-MS检测。出于以上原因,在提出的有关方法开发和优化的大部分研究中将使用丙酮。为了进一步研究PB反应在脂质分析中的效用,调查一大组羰基化合物作为PB试剂是有益的。候选物应当具有的一些特性包括高PB反应选择性、良好的反应产率、由PB反应产物的低能CID优先形成C=C诊断离子。发现与较长波长(300-500nm)相容以使得可以使用不同类型光源的PB试剂也是值得关注的。表9列出了待研究的若干候选物、其实现n→π*跃迁以引起PB反应的最大吸收波长(λmax),以及用于测定C=C位置的特征性诊断离子对之间的Δ质量。
表9
初步研究显示,使用UV 350nm灯,苯甲醛可以与PC 18:1(6Z)/18:1(6Z)以合理的效率反应(图52A)。PB产物(m/z 836.6,图52B)的MS2CID在m/z 648.5和722.5产生丰富的C=C诊断离子,且特征性Δ质量是74Da。相较于使用丙酮作为PB试剂,当使用苯甲醛时副反应较少,这可能与所用UV光子能量较低有关。将表9中列出的试剂用于与不同脂质种类的代表性模型化合物反应并且研究其在不饱和脂质C=C分析中的性能。除中性PB试剂外,出于增加如胆固醇和甘油脂质等中性脂质的电离效率的目的,还研究了带电荷的酮类。
在某些替代性设置中,PB反应可以不与ESI-MS结合,由此可以独立地优化条件。举例来说,用于PB反应的被卷绕的UV透明熔融硅石设置可以离线使用作为流动式微反应器。脂质分子可以用高浓度纯丙酮溶解以使PB反应产率最大。反应之后,通过干燥移除丙酮并且可以将残留脂质溶解于适于ESI的溶剂中。
此外,本发明的方法可以使用MALDF进行。表9中提出进行研究的若干PB试剂(即,苯甲醛、苯甲酮及苯乙酮)具有与UV MALDI波长(337或355nm)重叠的UV吸收带。这些试剂如果与不饱和脂质分子共溶解于基质中,则可以被UV激发并且在解吸附和电离期间与C=C反应。PB反应能力可以大幅增进许多应用于生物MS成像中的不饱和脂质的结构表征。
开发用于不饱和脂质的结构测定和定量分析的MS/MS方法
PB-MS/MS用于C=C测定的分析能力高度取决于特定不饱和脂质的PB反应产物的气相断裂特性。鉴于不同脂质种类的结构多样性,将针对各特定脂质种类定制串联MS方法以使可以获得的包括头基、酰基链、C=C位置测定在内的结构信息的量最大。还将集中在开发基于确定的MS/MS条件表征脂质C=C位置异构体及对其定量的方法。主要脂质种类中C=C位置已知的纯不饱和脂质将被用作方法开发的模型。本实例提供了有关使用基于CID的MS/MS获得不饱和脂质的结构和定量信息的标准指导。
基于碰撞活化的MS/MS方法已经被充分确立用于分析不同种类脂质。常常从种类/子结构特异性断裂通道(称为MS/MS联动扫描)获得丰富的结构信息。因此,使这些现有的MS/MS方法具有测定C=C位置的附加能力,由此可以获得多层结构信息将具有重要意义。在初步研究中,使用确定适于FA和GP的电离和CID条件研究这两类脂质的一小组标准混合物的PB-MS/MS。对于C=C诊断离子的形成通常观察到两个现象:1)它是一个便捷的断裂通道,可以由脂质的各种离子形式产生;及2)使用确定的适于完整脂质离子的MS/MS条件,它不干扰或抑制含结构信息的片段离子。后一项是有利的,因为所有已知的知识都可以直接应用于数据解释。还注意到,PB产物的离子形式实际上影响C=C诊断离子的形成。呈锂离子加合物形式的α-亚麻酸FA 18:3(9Z、12Z、15Z)的PB产物在负离子模式(m/z 343.3)下CID以高丰度产生具有三个C=C键的三对诊断离子。然而,去质子化PB产物(m/z 335.3)CID仅由9Z位置产生具有相对较高强度的一对诊断离子;其它两对或以相对较低强度存在或与主要58Da丧失重叠。很明显,对于C=C表征来说,更优选锂加合物的CID。
在这些实例中,使用了代表五个主要脂质种类(FA、GL、GP、SP、ST)及其亚类(在表10中列出)的脂质进行扩展研究。
表10
评价可以通过使用公认的MS/MS条件进行PB-MS/MS获得的如头基、酰基链、C=C位置等结构信息的量。通过操纵离子性质,即离子电荷极性(正离子对负离子)及电荷载流子的身份(例如H+对Li+)进一步改良这些条件。使用三级四极/线性离子阱质谱仪比较不同类型的CID,如射束型碰撞活化与共振碰撞活化。
PB-MS/MS在产生带有C=C键位置信息的诊断片段离子方面具有独特特性;因此,其能够基于观察特征性的诊断离子区别各C=C区域异构体。在初步研究中,这是用已经通过小鼠和人类脑组织分析观察的FA18:1C=C异构体,即油酸(9Z)和顺异油酸(11Z)测试的。使11Z与9Z的2:1摩尔比混合物经历PB-MS/MS(m/z 339.3,图53A-B)。正如预期的,11Z(m/z199、225)和9Z(m/z 171、197)分别形成独有的C=C诊断离子对,由此允许明确地检测9Z和11ZC=C区域异构体,即使其PB反应产物不具有任何质量差异。这一组数据清楚地展示了PB-MS/MS在C=C异构体结构表征中的潜能。在本实例中,检查了一系列可商购的模型C=C键异构体,包括MUFA(FA 20:19Z对11Z)、PUFA(FA20:4n-6对n-3)及磷脂(PC18:1(6Z)/18:1(6Z)对PC 18:1(9Z)/18:1(9Z))。应注意使用分解曲线方法形成诊断离子的CID条件及其对异构体混合物分析的影响。由于每种C=C位置异构体提供具有独特质量的诊断离子,故PB-MS/MS方法不受混合物中共存的C=C键异构体的数量限制。使用FA18:1(9Z)、(11Z)及(6Z)异构体混合物对其进行测试。
产生C=C诊断离子的能力也为使用PB-MS/MS定量不饱和脂质提供了可能。本实例说明了适于以下两种情况的定量方法的开发:1)在无C=C位置异构体情况下不饱和脂质的绝对定量或在存在C=C异构体情况下的总体定量;及2)C=C位置异构体的相对和绝对定量。
串联MS被广泛用于脂质定量,通过使用种类或亚类特异性断裂通道(联动扫描)实现了高分子特异性和高灵敏度。由于在作为主要可用断裂方法的低能CID下难以由完整FA离子形成含结构信息的片段离子,使得用于FA定量的MS/MS的开发滞后。GC-MS或HPLC-MS是当前选择用于FA定量的分析法;不过在分析之前,始终需要进行离线样品衍生化。因此,开发用于定量FA混合物分析阶段的基于MS/MS的方法可以大大增加分子特异性、灵敏度、定量准确性及线性动态范围。NL58Da是从具有不同链长度的MUFA的PB-MS/MS观察到的常见断裂通道并且其占总片段离子强度的60-70%。这两个方面表明,58Da的NL应当是适于定量目的的良好候选。使用FA 17:1(10Z)作为内标,测试有关FA 18:1(9Z)的定量。图54显示了FA18:1(9Z)(1.1μM,m/z 339.4)和FA 17:1(m/z325.3,0.75μM)的PB产物的58Da的NL谱图。在0.4至6μM范围内及在0.2μM的检测限(LOD)下获得校准曲线。此结果有利地与常用GC-MS方法相比较。针对哺乳动物细胞中天然存在的碳数在16至24范围内的MUFA和PUFA的定量进一步评价NL 58扫描。内标选择(链长和不饱和度)、碰撞能量及其它参数的影响将针对其分析品质因数进行表征。使用FA 18:1(9Z)和(11Z)评价NL58Da在FA C=C异构体总体定量中的适用性。
鉴于独特的诊断离子是由不同C=C键位置异构体的CID形成,故一种简单的方法是使用诊断离子的离子强度作为定量的量度,如图55A中所图示。使用FA18:1(9Z)和FA18:1(11Z)测试此想法的可行性。图55B显示了由总浓度保持在10μM但具有不同摩尔比(C11Z:C9Z=41至1:4)的9Z与11Z的混合物产生的m/z 339.3谱的放大的PB-MS2CID。对每对诊断离子的离子强度求和并绘制离子强度比率(I11Z:I9Z)对浓度比率(C11Z:C9Z)的图。此类校准曲线显示于图55C中。线性拟合得到0.9952的R2值及小于10%的相对标准差(RSD)。此结果显示,诊断离子强度可以用于定量C=C异构体。
基于校准曲线的相对标准差研究CID中使用的活化能及CID类型(共振CID对比射束型CID)。由此确定在定量分析中每组异构体脂质的最佳CID条件。这一知识可以直接转移用于复杂混合物分析。
由于校准曲线是由离子强度比率和浓度比率建立,故评价在不同浓度范围中是否保持相同线性关系很重要。基于FA 18:1(9Z)和(11Z)的初步研究显示在0.1μM至100μM的总浓度范围内校准曲线变化极小。另外,估计异构体比率的线性动态范围跨度。
测试两种不同方法并针对其在脂质异构体定量分析中的分析品质因数进行比较。使用FA 18:1C=C异构体进行方法开发。由于使用PB-MS/MS定量不饱和脂质的原理(图55C)是基于C=C诊断离子强度,故最佳内标(IS)应当是并非天然存在于该系统中的C=C键异构体。岩芹酸FA18:1(6Z)通常在小鼠或人类细胞中不能检测到,并因此成为定量FA18:1(9Z)和(11Z)异构体的较佳内标选择。6Z的PB反应产物的碰撞活化在m/z155和181处产生诊断离子。基于9Z/6Z和11Z/6Z的诊断离子强度比率,获得9Z和11Z的两条校准曲线,如图55D所示,其中6Z的浓度恒定保持在10μM,而9Z和11Z的浓度在1.5-45μM范围内变化。获得9Z和11Z异构体的优良线性关系。这一IS方法的优势在于,避开了由PB反应、电离及CID效率引起的实验变化。
取决于可得性,可以使用一种C=C异构体作为参照用于标准添加。在FA 18:19Z与11Z异构体的模拟混合物中测试使用FA 18:1(11Z)进行的标准添加。记录下在标准添加之前和之后的PB-MS2CID。使用这一信息,通过使用图55C中描述的相对校准曲线,计算标准添加之前和之后11Z与9Z的浓度比率。将以上信息与标准添加中的已知量相结合,分别以良好准确性测定9Z和11Z的绝对浓度。
用于脂质组学研究的PB-ESI-MS/MS平台的开发
可以对生物样品中的脂质提取物直接进行基于MS的脂质组学分析(所谓的鸟枪法脂质组学)或者可以将该分析与LC分离相结合。鸟枪法通过提供结构和定量信息来促进对脂质组的高通量整体分析并且成为生物标记物检测和验证的强大工具。由于生物样品的脂质提取物的较高复杂性(200-400种脂质物种)、不同的化学-物理性质及较宽的动态范围(4-6个数量级的浓度差),故低丰度脂质、具有低电离效率的脂质及脂质异构体的鉴别和定量一直是鸟枪法分析生物样品的脂质提取物的难题。当在MS分析之前或联合MS分析进行分离,如LC时,这一问题得到有效解决。当前,鸟枪法和LC-MS(/MS)方法是以几乎相等的频率采用并且一起占有关脂质组学的科学报道的80%。在这两个平台上实施PB-MS/MS策略以在复杂脂质混合物分析中增强C=C特异性具有重要意义。
使用nanoESI和ESI设置实施PB-MS/MS以对商业上获得的来自酵母(Avanti)的酵母极性提取物进行鸟枪分析。酵母极性提取物主要由FA和GP组成并且每一亚类的相对组成已有记录。PB-MS/MS与直接输注ESI设置相结合允许鉴别35种不饱和GP物种,包括PC、PE、PI、PA、PS、LPC、LPE、LPA、LPS,并确定C=C位置(详细分子信息显示于图56中)。由于PB-MS/MS方法不能提供C=C的绝对构型,故对C=C计数的命名法是从酰基链的甲基端(例如n-7或n-9)开始,以检测从生物样品鉴别的脂质的C=C位置。鉴别的GP含有16:0、18:0、16:1(n-7)及18:1(n-9)的酰基链的组合。特别应当注意的是,可以可靠地鉴别出摩尔%是约0.1%的一些低浓度物种,如LPA 18:1(n-9)和LPS 16:l(n-7)。有趣的是,由此系统未观察到C=C位置异构体。这些初步结果展示了应用在线PB-MS/MS进行鸟枪法脂质分析的可行性。
Agi lent 1200HPLC将与TurboESI-4000MS界面相结合(二者在PI的实验室内有提供)。PB反应是在LC分离之后且在ESI-MS/MS分析之前,使用上述“流动注射装置”实施,其中PB试剂(丙酮)将通过T形管递送至洗脱物中。整体设置的示意图显示于图57中。此布置将对该分离方法带来最小干扰。使用上文关于本实例所述的条件提供有关选择初步测试参数的指导。这些参数包括脂质洗脱剂/丙酮的混合比率、在此类溶剂条件下的PB反应时间(UV曝光时间)及UV曝光所需的熔融硅石毛细管长度。可以通过当前HPLC系统管理的最低流动速率是250μL/min。此流动速率将需要在最佳溶剂条件下约3m的熔融硅石毛细管暴露以达到10秒的UV曝光时间。对于初始测试,进行HPLC洗脱剂的24:1分流比,以使得10μL/min洗脱剂与经T形管递送5-10μL/min的丙酮溶液混合,持续10秒PB反应,相当于20cm的毛细管暴露长度。使用“流动注射”设置模拟此条件。一个注射器以10μL/min泵送溶解于H2O:ACN:IPA(43:42:15)、5mM甲酸铵(AF)(即常见LC恒溶剂洗脱分离条件)中的标准PC。以10μL/min递送丙酮并且PC得到良好的PB反应产率。
基于CID的PB-MS/MS方法可以提供有关不同种类不饱和脂质的C=C特异性结构信息及定量信息。为了使此类方法适用于大规模脂质组学研究,基于PB反应产物的独特CID断裂化学合理地设计适于发现模式和目标脂质分析的MS/MS数据采集工作流程很重要。
便捷地鉴别PB产物以进行后续MS/MS是获得C=C键位置信息和定量的重要步骤。这对于鸟枪法是有帮助的,因为PB反应由不饱和脂质产生另外的m/z峰(分子物种),使得由生物样品脂质提取物得到的已经很繁杂的MS谱图变得更复杂。测试两种方法以解决此难题,包括58Da中性丢失(NL58)扫描和数据依赖性PB搜索。以上的NL58扫描初步研究显示,NL58(自氧杂环丁烷环失去丙酮)是PB反应产物特有的并且通常对于FA和中性脂质(即,CE、MG)会观察到。因此,NL58MS/MS扫描应当能够快速且灵敏地发现这些脂质种类的PB反应产物。由于仅检测到P-B反应产物,故所述谱图明显简化,并且灵敏度增强。使用酵母提取物作为模型系统进一步优化NL 58扫描。评估是基于可以鉴别的脂质物种的数量及检测限。鉴于PB研究是针对NL 58不是丰富断裂通道的脂质种类,如对于GP,首先以由不饱和酰基链组成的GP为目标,在负离子模式下,通过使用“多前体离子散射(multiple precursor ionscattering,MPIS)”方法,如PIS m/z279(FA 18:2)、281(FA 18:1)、301(FA20:5)进行。利用计算机,通过将58Da添加至不饱和脂质物种中来产生APB m/z清单并进一步选择以用于PB-MS/MS分析。
对于许多脂质组学研究来说,以一系列已知脂质物种作为检测和定量的目标是有意义的。这是典型地在空间串联质谱仪,如三级四极MS上使用选择反应监测(selectedreaction monitoring,SRM;又称为MRM,多反应监测)来进行。母离子与片段离子之间的确定的关系,称为“跃迁(transition)”,最终决定此方法的分析品质因数。已知与PB反应产物有关的独特片段,即形成C=C诊断离子NL58Da,可直接将其用于跃迁中。通过以脂质标准为目标来测试这些跃迁,该脂质标准被掺入酵母提取物中,旨在确定进行特异性且灵敏地检测的最佳跃迁次数。
将开发数据处理工具以便利由PB反应产物的CID谱图自动测定C=C位置。该程序是由matlab编写且将针对从模型脂质物种采集到的数据进行初步测试,并且接着利用来自生物样品的脂质提取物进行优化。该程序将具有以下几层功能:1)诊断离子选择规则。除标准选择演算法(3x噪声级)外,还将选择质量差异是26Da(由使用丙酮作为PB试剂引起)的峰。2)测定C=C位置。将采用种类特异性演算法来测定C=C键位置。对于MUFA和GP,将使用以负离子模式收集的PB-MS2或MS3CID数据。为简单起见,C=C键的位置可以根据诊断离子对的较低质量峰(CnH(2n-3)O3 -)计算。数字n表示由羧酸计数的C=C键的位置。对于PUFA、CE及GL,将使用以碱性金属加合物作为电荷载流子在正离子模式下收集的PB-MS2/MS3CID数据并且将相应地改变C=C测定式以反映诊断离子结构。对于PUFA,将以同一系列诊断离子的40Da(C3H4)间距交叉复核C=C测定,该间距是用亚甲基隔开的C=C的特征标志。
将鉴别出C=C的物种与由脂质标准产生的MS/MS谱数据库相比较,并人工地解释从脂质提取物采集到的数据。谱图类似性评分将与C=C位置一起作为评分系统报道,并且将人工评价具有较低类似性评分的谱图。
验证及应用于大鼠脂质分析
基于进行PB-MS/MS的最佳参数,使用来自大鼠组织的脂质提取物验证其在不饱和脂质分析中的效用,旨在强调其在C=C位置异构体检测和定量方面的独特能力。尚未获得有关哺乳动物脂质组的许多内源性脂质种类的此类型信息,并且因此将形成进行进一步方法开发以及与能够测定C=C的其它分析方法(例如OzID)交叉比较的基准。该计划的另一目标是建立有关生物样品中不饱和脂质的数据库,其中具有可靠的C=C指配以及C=C异构体的组成(如果这些异构体存在的话)。这一数据库也将被用于自动测定未知脂质C=C。
使用上述nanoESI设置,对来自大鼠脑的极性脂质提取物进行初始鸟枪法脂质分析。使用既定的提取条件,对20-50mg组织进行脂质提取。使N2干燥的提取物在添加有1%酸或碱的1:1丙酮/H2O溶液中复原,以正电离或负电离模式进行PB-MS/MS。发现除了FA 16:1(n-7)、18:2(n-6)及20:4(n-6)外,所有检测的游离FA都具有C=C位置异构体。举例来说,FA19:1是n-8与n-10异构体的混合物,FA 18:1和20:1是n-7与n-9异构体的混合物,而FA22:1由在n-7、n-9或n-11处具有C=C的三种异构体组成(图58A)。其相对组成是基于上文所论述的C=C特异性诊断离子强度比率确定。值得注意的是,利用PB-MS/MS观察到的C=C组成与先前使用GC-MS对于大鼠脑中游离FA的鉴别和定量的报道一致,不过样品消耗要少得多且分析时间较短。与游离FA 18:1C=C异构体组成一致,大鼠脑中所有含有18:1的GP都是n-7与n-9异构体的混合物,不过这两种C=C异构体的相对比率随不同物种不同。一般观察到含有相同酰基链的游离FA与GP之间C=C异构体组成的一致性。大鼠脑GP分析使得自(L)/PS、PE、PC、PI、PA的85个分子物种被指定完整结构,其中50%具有至少一种C=C异构体形式。这是首次记录生物样品中一广阔系列GP及其分子特异性C=C位置以及C=C异构体组成。
使用大鼠脑组织脂质提取物,使用以上鉴别的条件进一步验证用于鸟枪法脂质组学的PB-MS/MS,目的是扩大其它种类脂质(CL、GL、CE、SM)的结构表征,执行定量分析及克服低丰度脂质分析的限制。大鼠脑脂质提取物也被用于验证上述HPLC-PB-MS/MS平台。交叉比较由这两种方法收集的数据并通过汇集由这两种方法鉴别的不饱和脂质构建相对完整的脂质概况。使用手动标注的质谱数据构建可搜索的数据库并且评价或训练计算机辅助C=C测定及C=C异构体的相对定量。有关大鼠脑脂质的分析也将确立覆盖样品制备、脂质提取、分离、PB-MS/MS及数据解释各方面的一系列方案。
这一数据说明,使用鸟枪法或基于分离的平台,PB-MS/MS可以应用于不同类型的生物样品,如血浆和各种组织类型。数据显示,尽管在不同类型大鼠组织,如脑、脂肪、肾、肝及肌肉中始终观察到游离FA 18:1和PC 16:0/18:1的n-7和n-9C=C异构体形式,但这两种异构体形式的相对比率在不同组织间不同(注意,肌肉中PC 16:0/18:1(n-7)异构体的比重较之其余组织中要高得多,图58D)。这些发现很重要,因为其首次证实C=C异构体分布在不同类型组织中是不相同的,这与其在其局部环境中的独特生物功能相关。
实例15:利用质谱快速定量不饱和脂肪酸的光化学标记
脂肪酸(FA)分析提供了表型信息并且对于众多生物和生物医学研究具有相当大意义。使用传统气相色谱法-质谱分析定量不饱和FA,尤其是可靠的指定碳-碳双键(C=C)位置是消耗样品,也耗时的。在本研究中,开发了一种不借助色谱分离来分析不饱和FA的快速、灵敏的定量方法。该方法是基于FA中C=C的溶液相光化学标记(in-solutionphotochemical tagging)及随后通过中性丢失扫描串联质谱气相脱标记。此方法允许直接定量生物样品(血液、血浆及细胞系)中的一系列不饱和FA。传统上被忽略的FA C=C位置异构体的定量信息现可以获得并且被用于研究正常人类前列腺细胞与癌症人类前列腺细胞之间的FA变化。
对于所有活生物体来说,脂肪酸由于在多种生物功能中起到至关重要的作用而成为必不可少的。其有助于储能,其在信号传导中发挥必不可少的功能,而且其是如磷脂、糖脂、胆固醇酯等复合脂质的结构单元。FA的结构和生物物理特性是由链的长度以及碳-碳双键(C=C)的数量、位置及构型决定。已知许多不饱和FA具有C=C位置异构体,各自执行独特的生物功能。举例来说,从甲基端计数,ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6PUFA)的第一个C=C位于第六个碳处;据报道,相较于其ω-3C=C位置异构体,这些脂肪酸发挥不同的促炎和消炎功能。有力证据显示不饱和FA组成变化与多种慢性疾病的发生和发展之间存在相关性。
尽管气相色谱法-质谱法(GC-MS)仍是主要的FA分析方法,但鸟枪法脂质分析由于操作简单、速度快以及能够获得多个种类的脂质概况而被愈来愈多地被使用。在鸟枪法中,利用电喷雾电离(ESI)使未加工脂质提取物中的FA电离并在不分离情况下利用MS进行分析。由准确的质量测量值可以容易地推断分子信息,如FA链长和不饱和度。不幸的是,被证实作为定性和定量分析的强大技术的串联质谱法(MS/MS)不能直接用于完整FA的分析。这是因为,可以由FA阴离子通过在低能量条件下碰撞诱导解离(CID)产生的含结构信息的片段离子极少。这一情形也使其不能鉴别不饱和FA中C=C键的位置,尤其是对于单不饱和FA(MUFA)来说。
已经研究替代方法。经显示,对FA的羧酸官能团进行电荷转换衍生化(Charge-switchderivatization)在FA分析中具有若干优势。首先,它大幅提高在正离子ESI模式下FA的电离效率,由此提高分析的灵敏度。更重要的是,所得到的FA离子的CID现可以提供丰富的特征性片段离子,由此能够检测和定量不饱和FA。通过选择适当衍生化基团,可以由MS/MS产生含结构信息的片段离子,从而提供C=C位置线索。科学文献已报道通过电荷转换衍生化和鸟枪法分析来鉴别在人类血浆中浓度相对较低的FA18:3C=C位置异构体,即α-亚麻酸和γ-亚麻酸(常常又称为ω-3和ω-6FA 18:3)。
在本研究中,研究了使用溶液相光化学标记随后利用MS/MS进行气相脱标记来鉴别并定量复杂样品中的不饱和FA的新方法。近期的研究显示,光化学反应,即帕特诺-比希(PB)反应与在线MS/MS相结合能够可靠地指定各种脂质种类的C=C位置。在该方法中,在电喷雾(ESI)方法期间,用UV照射电子激发的丙酮标记脂肪酰基链中的每个C=C。接着,利用MS/MS分析通过ESI电离的丙酮标记的脂质,产生对C=C键位置具有特异性的片段离子(称为C=C诊断离子)。用MS测量C=C诊断离子提供有关鉴别和定量C=C位置异构体的信息。除产生C=C诊断离子外,还发现被标记的不饱和FA的CID后,标记丢失(-58Da,即丙酮丢失)是主要断裂通道。这一高丰度丙酮丢失限制了基于检测C=C诊断离子进行FA分析的灵敏度。不过,在此处所报道的新开发的方法中,利用了这一丙酮丢失断裂通道来得出搜寻和定量复杂生物样品中不饱和FA的有效手段。使用中性丢失扫描选择被丙酮特异性标记的不饱和FA并且现可以容易地进行其定量。
为了测试这一想法,通过PB反应对FA 18:1(9Z)(油酸)与FA 17:1(10Z)(顺-10-十七碳烯酸)的等摩尔混合物进行丙酮光化学标记。图59A和59B分别显示了在光化学标记之前和之后此类混合物(各自在丙酮/H2O(50/50,v/v)加0.1%NH4OH中为3.5μM)的负离子模式nanoESI谱图。以良好强度清楚地检测到在m/z 325和339处丙酮标记的FA的形成,其各自相较于相应完整FA(在m/z 267处的FA 17:1和在m/z281处的FA 18:1)具有58Da质量增加。经标记FA(也称为PB-MS/MS),即经标记FA 17:1(m/z 325)的MS2CID引起明显标记丢失(-58Da)并产生具有特征性26Da质量差异的一对C=C诊断离子(图59C)。这一组实验证实,溶液相丙酮标记及气相丙酮脱标记的方法是有效。
接着,用这一方法分析人类血浆中的FA提取物(20μL)。鉴于FA 17:1(10Z)在人类血浆中的丰度可忽略,将其作为内标(IS)添加至提取物中。NanoESI-MS揭示,该提取物含有多种饱和和不饱和FA(图59D)。主要物种包括FA 14:0(227.3)、16:1(253.3)、16:0(225.4)、18:2( 279.3)、18:1( 281.3)、18:0( 283.3)及20:4( 303.3)。在光化学标记(图59E)之后,不饱和FA的相对强度明显降低,同时伴随经标记FA的出现(用“*”指示,例如对于FA 16:1,311.4;对于FA 18:2,337.5和395.5;对于FA 18:1,m/z 339.3;对于IS, 325.2)。由于标记反应(PB反应)的产率不是100%,由此产生较为复杂的谱图。
然而,通过利用CID进行中性丢失扫描,使反应谱图大幅简化并且仅检测到混合物中的不饱和FA(图59F)。值得注意的是,饱和FA根本不会出现在NLS(58Da)谱图(图59F)中,证实了利用PB反应对不饱和FA标记的高选择性。通过在分析工作流程中并入MS/MS,使不饱和FA的检测和鉴别较之仅利用MS的分析更灵敏并且更具特异性。图60A和B概述了在分析2μL大鼠全血样品中进行的此类比较。对FA提取物进行25倍稀释并且MS谱图中最丰富的峰,如255和283实际上源于背景化学干扰(在图60A中以“#”标注)。在 253、279、281及303处的低强度峰与FA16:1、18:2、18:1及20:4质量相配;不过,如果质量测量值不准确,则其身份仍有疑问。如图60B中所示,通过应用58DaNLS,清楚地鉴别出经标记的FA 16:1、18:2及18:1。有关这些FA的身份的指定可信度很高,因为标记和脱标记方法对不饱和FA具有特异性。
在实现不饱和FA的选择性检测情况下,进一步评价其在定量分析中的应用。受PB反应中丙酮量子产率的限制,对于MUFA,标记只能达到30-60%产率。在这一情况下,维持相对稳定的标记效率对于定量分析至关重要。图61A显示了FA 18:1(9Z)与17:1(10Z)的等摩尔混合物中完整FA和经标记FA的提取离子色谱图。很明显,两种FA以类似动力学反应;标记在30秒UV照射内达到平台期并且在分析时间段(10-20分钟)期间,经标记FA的信号稳定。有趣的是,FA 17:1(10Z)的反应产率(约58%)略高于FA 18:1(9Z)(约50%)。基于58DaNLS(图61B),使用FA 17:1(10Z)作为IS(7.5μM),获得FA 18:1(9Z)的校准曲线。该曲线显示优良的线性(R2=0.9999)及灵敏的检测(检测限,LOD=15nM),与常规GC-MS分析相当。关于具有16至24个碳的MUFA一致地获得具有良好线性和检测限的校准曲线(参见表11)。
表11
预先测定FA 18:1的摩尔组成是91.5%油酸和8.5%顺异油酸,并用于制备标准溶液以制作FA18:1的校准曲线。FA 16:1、FA 18:1及FA 18:2的溶剂条件是含5%乙醇的丙酮/H2O。FA 18:2、18:3及20:4的溶剂条件:含40%乙醇的丙酮/H2O。
丙酮/水(50/50,v/v)由于其快速反应动力学而成为标记MUFA的良好反应溶剂系统。然而,这一条件导致依序标记PUFA中的多个C=C。举例来说,花生四烯酸(FA20:4(5Z、8Z、11Z、14Z))具有四个C=C并因此可以形成四种丙酮标记产物(在m/z 361、419、477、535处),如图61C中所示。不过,这一过度反应是不合需要的,因为该反应会减少最适用于结构鉴别的单独标记产物的量。此外,发现副反应,例如I型诺里什反应(形成在m/z 347.4、405.4、463.4、519.4处的离子)较具竞争性,会干扰不饱和FA的检测和定量。经显示,乙醇通过光还原电子激发的丙酮而减慢PB反应。已发现,将乙醇添加至反应溶剂系统中,即乙醇/丙酮/水(40/30/30,v/v/v),使PUFA的单一丙酮标记产物最多。如图61D中所示,FA 20:4(在m/z 361处)的单一丙酮标记产物占所有标记产物约80%并且相较于图61C中使用丙酮/水(50/50)的情形,其绝对强度增加约5倍。这一产物(m/z361)的MS2CID显示明显标记丢失以及关于PUFA通常观察到的较小的连续44Da丢失(图66)。使用FA17:1(10Z)作为IS定量FA20:4是通过58Da NLS以良好线性实现,并且在乙醇/丙酮/水(40/30/30,v/v/v)溶剂条件下获得80nM的LOD。
在哺乳动物脂质组中,许多不饱和FA是以C=C位置异构体的混合物存在,需要一种强大的分析方法来实现每种C=C位置异构体的定量。通过光化学标记和58DaNLS,可以通过一种更灵敏地方式定量C=C位置异构体的总量。使用先前确定的方法,通过由PB-MS/MS数据测量C=C诊断离子强度比率,可以获得C=C位置异构体的摩尔比。接着,可以通过将总量与C=C位置异构体的摩尔比信息组合来定量每种异构体。已发现这一方法成功用于对FA18:1Δ9与Δ11异构体的一系列混合物进行的实验。值得注意的是,在相同CID条件下,C=C位置异构体可具有不同的标记丢失程度。因此,纯异构体的校准曲线并不相互重叠(图68)。这一现象表明,为了更准确地定量FA C=C位置异构体混合物,应当使用与实际样品中所检测到相同的异构体组成制备校准溶液。
人类血浆中的不饱和FA分析.
使用光化学标记随后58DaNLS的方法分析人类血浆(20μL)中的FA。将FA 17:1(10Z)(7.5μM)作为IS添加至提取物中。由nanoESI-MS得到的FA谱显示于图59D中,而不饱和FA谱可以通过58Da NLS发现(图59F)。在定量研究之前,为了确定C=C位置和任何C=C位置异构体的存在,对个别不饱和FA(单一丙酮标记的FA)应用PB-MS/MS。发现FA 16:1(9)、18:2(9,12)及20:4(5,8,11,14)以纯形式存在,其中括弧中的数字指示C=C位置。接着,通过58Da NLS对这些FA定量并测定如下:28.9±1.6μM的FA 16:1;193±20μM的FA 18:2;及18.2±2.3μM的FA 20:4(图69)。PB-MS/MS揭示,FA 18:1和FA 18:3具有C=C位置异构体。如图62A所示,经标记FA 18:1(在m/z 339处)的MS/MS CID在m/z 171、197及m/z 199、225处产生两对诊断离子。检测这些诊断离子清楚地表明C=C位置异构体分别存在于Δ9和Δ11处。基于诊断离子强度比率(Δ11/Δ9=0.0662)及已定立的该两种异构体的摩尔比校准曲线(图62B),发现FA 18:1由91.5%Δ9和8.5%Δ11异构体组成。
制备由相同组成的C=C位置异构体组成但总浓度不同的一组校准溶液并用于产生58Da NLS校准曲线,如图62C所示。发现FA 18:1的总浓度是276±36μM,对应于253±33μM的Δ9异构体和23±3μM的Δ11异构体。PB-MS/MS显示,FA 18:3是ω-3(C=C在Δ9、12、15处)和ω-6(C=C在Δ6、9、12处)异构体的混合物(图70)。受其在人类血浆中相对较低的丰度(7.5±1.5μM)限制,很难准确测定这两种异构体之间的摩尔比。然而,通过将由FA 18:3ω-3和ω-6标准的1:1(摩尔比)混合物观察到的C=C诊断离子(图62D)与从人类血浆观察到的C=C诊断离子(图62E)相比较,发现ω-3异构体的丰度高于ω-6异构体(图71)。这一发现与先前文献中的报道一致。
人类血浆中六个主要的不饱和FA物种的定量数据概述于图63A中。另外,将文献中报道的电荷转换方法用于同一组人类血浆样品进行交叉验证。两种方法提供相对误差在10%内的一致的定量测量值(图72)。然而,在线光化学标记结合58Da NLS方法提供了可靠地鉴别和定量不饱和FA及其C=C位置异构体的独特益处。举例来说,可能因为FA 18:1中Δ11异构体的浓度相对较低(<10%),电荷转换方法未报道FA 18:1C=C位置异构体。
正常人类前列腺细胞与癌症人类前列腺细胞中不饱和FA的定量.
定量监测代谢物,如脂肪酸的变化已愈来愈多地被用于辅助癌症生物学研究。经显示,正常细胞与癌细胞的FA谱由于细胞代谢改变而显著变化。然而,在C=C位置特异性水平上,一般无法测定不饱和FA的身份;因此,异构体上个别C=C位置的变化仍不被了解。通过使用光化学标记随后58Da NLS方法,可以实现以高分子特异性定量不饱和FA。使用正常人类前列腺细胞(RWPE1)和癌症人类前列腺细胞(PC3细胞)作为模型系统进行比较研究。发现主要FA物种包括FA 16:0、16:1、18:0、18:1及18:2(该两个细胞系的FA谱概述于图73中)。使用所述方法测定两个细胞系中FA 16:1和FA 18:2是纯的,并且C=C分别位于Δ9和Δ9、12处,而FA 18:1由Δ9和Δ11异构体组成(图74)。
在前列腺癌细胞(PC3,图63B)中检测到不饱和FA(16:1、18:1及18:2)的量明显升高,与文献报道一致。确切地说,作为两个细胞系中最丰富的不饱和FA物种,PC3细胞中FA18:1的总量是RWPE1细胞中其总量的6.0±1.7倍(图63B)。FA 16:1和FA 18:2在PC3细胞中相较于在RWPE1细胞中也分别增加3.4±0.5倍和3.7±0.7倍。有趣的是,尽管FA 18:1的Δ9和Δ11异构体的绝对量都在PC3细胞中增加,但FA 18:1中Δ11异构体的相对贡献减小。如图63B插图的饼图中所示,Δ11异构体的组成%从RWPE1细胞中的48.0±1.3%降低至PC3细胞中的31.0±0.9%。FA 18:1的Δ9和Δ11异构体是由FA 16:0(棕榈酸)生物合成,但具有相反的链伸长率和不饱和次序。正常与癌症前列腺癌细胞中FA 18:1C=C位置异构体的绝对量和相对浓度的明显变化指示这两个细胞系之间FA18:1生物合成或代谢路径的变化。
开发出一种利用溶液相光化学标记和在线串联MS(58Da NLS)的组合能够快速并且灵敏地定量不饱和FA和其C=C位置异构体的新方法。这一方法与鸟枪法脂质组学工作流程相容以分析生物样品中的复杂FA混合物。使用这一方法,实现以与传统GC-MS和电荷转换衍生化方法相当的性能定量人类血浆和细胞系中的不饱和FA。更重要的是,现可以在高可信度下进行FAC=C位置异构体分析。现可以容易地获得如不饱和FA异构体组成和相对丰度等信息进行生物研究,如分别利用FA 18:1和FA 18:3ω-3/ω-6所展示。预期将这一方法应用于疾病研究可提供对调控FA异构体的生物方法的另一层理解,由此可能发现脂质生物标记物。
脂肪酸标准品、大鼠全血及人类血浆样品都是购自商业供应商。FA提取上遵循LIPID-MAPS方案进行(http://www.l ipidmaps.org/protocols/PP0000005301.pdf)。将初级发射带在254nm的低压汞灯放置在距nanoESI发射极1.0cm处以起始光化学反应。所有MS实验都是在4000QTRAP三级四极/线性离子阱质谱仪(Sciex)上进行。
化学试剂和材料
所有FA和氘标记的FA标准品都是购自Cayman Chemical(密歇根州安娜堡(AnnArbor,MI))并且不经进一步纯化即使用。汇集的人类血浆(肝素锂作为抗凝血剂)是购自Innovative Research(密歇根州诺维(Novi,MI))。其它化学试剂是购自Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯)。
细胞培养
所有细胞都在供应5%CO2的37℃潮湿恒温箱中培养。将前列腺癌PC3细胞保持在补充有10%胎牛血清(FBS)、100青霉素及100μg/mL链霉素的F-12K培养基中。在补充有30μg/ml牛垂体提取物和0.2ng/ml人类重组表皮生长因子(Invitrogen,加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))的角质细胞无血清培养基中培养正常前列腺上皮RWPE1细胞。
从人类血浆和细胞提取FA的方案
使用以下方法从人类血浆提取FA:
将30μL dPBS添加至在16mm×125mm玻璃管中的20μL人类血浆中,随后添加60μL甲醇。接着,用1M HCl酸化混合物以达到25mM最终浓度。
在添加0.1mL异辛烷之后,涡旋样品并以3000g离心1分钟以分离各层。移出顶部层并转移至10mm×75mm玻璃管中。
重复步骤2一次。
合并有机层。在真空下或使用氮气流干燥提取物。
使用以下方法从细胞提取FA:
以3000rpm离心在16mm×125mm玻璃管中的含五百万个细胞的1mLH2O,持续2分钟,之后丢弃上部水层。
向细胞中添加300μLdPBS,随后添加600μL甲醇。用HCl酸化细胞悬浮液以达到25mM最终浓度。
在添加1mL异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)之后,涡旋样品并以3000g离心1分钟以分离各层。移出顶部层并转移至10mm×75mm玻璃管中。
重复步骤3。
合并有机层。在真空下或在氮气流下干燥提取物。
光化学标记和串联MS分析
对于定量,在MS分析之前,将MUFA溶解于含5%乙醇的丙酮/水(50/50v/v)中,而PUFA则溶解于含40%乙醇的丙酮/水(50/50v/v)中。为便利通过负离子模式nanoESI-MS检测FA,将0.5%(v/v)NH4OH(28%-30%呈NEB形式)添加至所有FA溶液中。使用硼硅酸盐玻璃毛细管尖端(1.5mm o.d.和0.86mm i.d.),利用P-1000Flaming/Brown微电极拉制仪(Sutter Instrument;美国加利福尼亚州诺瓦托(Novato,CA,USA))拉制约10μm外径的NanoESI尖端。从硼硅酸盐玻璃尖端的背面开口装载脂质溶液。将不锈钢丝插入该尖端中,充当电接触,且nanoESI尖端与MS取样口对准。为了起始通过PB反应1进行的光化学标记,将低压汞(LP-Hg)灯(254nm,型号:80-1057-01,BHK,Inc.;美国加利福尼亚州)放在距nanoESI发射极1.0cm处。所有MS实验都是在4000QTRAP三级四极/线性离子阱(LIT)混合质谱仪(Applied Biosystems/Sciex,加拿大多伦多)上进行,并且其示意图显示于图64中。所用仪器参数如下:ESI电压,-1200-1800V;帘式气体,10psi;界面加热器温度,40℃;去簇电压:-20V。对于所选PB反应产物的MS/MS分析,隔离宽度设置成1.5Th,并且前体强度保持在约4×106计数。离子注入时间是10-200毫秒。用于FA的PB反应产物的碰撞能(CE)被优化成35V(射束型CID)或50(任意单位)(共振离子阱CID)。对于中性丢失扫描(NLS),使用35V的CE。
人类血浆中游离FA的分析
根据图65中所示的方案估计FA提取效率(使用同位素标记的内标)。结果显示于表12中。
表12
如图66中所示,优化用于PUFA的标记条件。如下测定FA C=C异构体组成。可以使用诊断离子的质荷比准确地确定各FAC=C异构体中C=C的位置。此外,近期的研究显示,诊断离子的总强度也可以用于定量脂质C=C异构体。图66显示汇集的人类血浆中FA18:1的PB产物(m/z339.3)的CID质谱,由此两对诊断离子(m/z 171、197及m/z 199、225)清楚地指示存在两种FA 18:1C=C异构体(Δ9和Δ11)。通过将两对诊断离子之间的比率输入校准曲线(图66中的插图)中,测定汇集的人类血浆中的FA18:1由91.5%Δ9异构体和8.5%Δ11异构体组成。
如图69-72中所示,对低丰度PUFA及其异构体定量。
利用FA的电荷转换AMPP衍生化进行交叉验证。AMPP衍生化已被开发作为提高脂肪酸检测灵敏度的有效方法。在本研究中,采用了这一策略定量人类血浆中的脂肪酸,使用亚油酸-d11和油酸-d17作为内标,验证所开发的PB/NLS方法。同位素物的电离效率与相应脂肪酸相同。在衍生化之后,可以利用正离子nanoESI-MS以高灵敏度检测脂肪酸和内标,并且每种AMPP衍生化的脂肪酸在CID时在m/z183.3处产生特征性的离子(图70)。通过比较前体离子扫描(PIS)谱图中脂肪酸与其相应同位素物之间的峰值比率,测定人类血浆中FA18:1和FA A 18:2的浓度是254μM和180μM,与利用PB/NLS方法获得的结果(276.4±35.6μM和193.3±20.3μM)一致。
如图73和74中所示分析正常和癌症前列腺细胞中的不饱和FA。
Claims (27)
1.一种用于分析组织样品的方法,所述方法包括:
获得包含不饱和化合物的体外组织样品;
在所述体外组织样品上以所述不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标进行自由基反应,由此产生多种化合物异构体;
对所述多种化合物异构体进行质谱分析以鉴别所述碳-碳双键在所述不饱和化合物内的位置;及
对所述多种化合物异构体定量,其中所述多种化合物异构体的摩尔比与在自由基反应过程中产生的诊断离子之间的强度比呈线性关系,所述强度比为其中一种化合物异构体的诊断离子的强度与另一种化合物异构体的诊断离子之间的比率;以及
将来自所述体外组织样品的多种化合物异构体的量与来自正常对照组织样品的化合物异构体的量进行比较,以分析所述组织样品,其中所述正常对照组织样品的组织类型与所述体外组织样品的类型相同。
2.根据权利要求 1 所述的方法,其中所述不饱和化合物是脂质或脂肪酸。
3.根据权利要求 1 所述的方法,其中所述自由基反应包括使所述不饱和化合物及用于所述自由基反应的试剂暴露于紫外光。
4.根据权利要求 3 所述的方法,其中所述自由基反应是在所述不饱和化合物处于质谱探针内时进行。
5.根据权利要求 4 所述的方法,其中所述质谱探针的至少一部分对紫外光透明。
6.根据权利要求 5 所述的方法,其中所述质谱探针是由对约 200 nm 波长的紫外光透明的材料所构成。
7.根据权利要求 3 所述的方法,其中所述自由基反应是在容器中进行并且在所述反应之后,将所述化合物异构体转移至质谱探针中。
8.根据权利要求 1 所述的方法,其中所述自由基反应是结合高压液相色谱系统进行并且用于所述自由基反应的试剂是在洗脱溶剂内。
9.根据权利要求 1 所述的方法,其中所述自由基反应是帕特诺-比希( PB )反应。
10.根据权利要求 9 所述的方法,其中所述帕特诺-比希( PB )反应是在包含丙酮的溶剂混合物中进行。
11.一种用于分析组织样品的方法,所述方法包括:
使取样探针与包含不饱和化合物的体外组织样品接触,该接触方式使得所述不饱和化合物保留在所述取样探针上;
将所述取样探针插入中空体中,其中在所述中空体内存在用于自由基反应的试剂并且所述自由基反应以所述不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标,由此产生多种化合物异构体;
在所述中空体内进行所述自由基反应以产生所述多种化合物异构体;
将所述多种化合物异构体从所述中空体的远侧尖端排出;及
在质谱仪中分析所述排出的多种化合物异构体以鉴别所述碳-碳双键在所述不饱和化合物内的位置;
对所述多种化合物异构体定量,其中所述多种化合物异构体的摩尔比与在自由基反应过程中产生的诊断离子之间的强度比呈线性关系,所述强度比为其中一种化合物异构体的诊断离子的强度与另一种化合物异构体的诊断离子之间的比率;以及
将来自所述体外组织样品的多种化合物异构体的量与来自正常对照组织样品的化合物异构体的量进行比较,以分析所述组织样品,其中所述正常对照组织样品的组织类型与所述体外组织样品的类型相同。
12.根据权利要求 11 所述的方法,其中所述不饱和化合物是脂质或脂肪酸。
13.根据权利要求 11 所述的方法,其中所述取样探针包含针。
14.根据权利要求 13 所述的方法,其中所述自由基反应包括使所述不饱和化合物及用于所述自由基反应的试剂暴露于紫外光。
15.根据权利要求 14 所述的方法,其中在所述不饱和化合物流经所述中空体时,同时进行所述反应。
16.根据权利要求 15 所述的方法,其中所述中空体的至少一部分对紫外光透明。
17.根据权利要求 16 所述的方法,其中所述中空体由对约 200 nm 波长的紫外光透明的材料所构成。
18.根据权利要求 17 所述的方法,其中所述中空体由石英玻璃或熔融硅石构成。
19.根据权利要求 11 所述的方法,其中所述自由基反应是帕特诺-比希( PB )反应。
20.根据权利要求 19所述的方法,其中所述帕特诺-比希( PB ) 反应是在包含丙酮的溶剂混合物中进行。
21.一种用于使组织样品成像的方法,所述方法包括:
将用于自由基反应的试剂引入包含不饱和化合物的体外组织样品中,其中所述自由基反应以所述不饱和化合物内的一个碳-碳双键为目标,由此产生多种化合物异构体;
进行所述自由基反应以产生所述多种化合物异构体;
扫描所述体外组织样品以使得所述多种化合物异构体以时间分辨的方式解吸附并电离;
在质谱仪中分析所述解吸附并电离的多种化合物异构体;及
基于所述分析步骤的结果,产生所述体外组织样品的图像;
对所述多种化合物异构体定量,其中所述多种化合物异构体的摩尔比与在自由基反应过程中产生的诊断离子之间的强度比呈线性关系,所述强度比为其中一种化合物异构体的诊断离子的强度与另一种化合物异构体的诊断离子之间的比率;以及
将来自所述体外组织样品的多种化合物异构体的量与来自正常对照组织样品的化合物异构体的量进行比较,以分析所述组织样品,其中所述正常对照组织样品的组织类型与所述体外组织样品的类型相同。
22.根据权利要求 21 所述的方法,其中所述扫描包括在所述体外组织样品上的多个不同位置处使用解吸附电喷雾电离探针进行解吸附电喷雾电离技术。
23.根据权利要求 22 所述的方法,其中用于所述自由基反应的所述试剂是通过所述解吸附电喷雾电离探针引入所述体外组织样品中并且紫外光被施加至所述样品。
24.根据权利要求 23 所述的方法,其中所述进行步骤和所述扫描步骤是同时发生的。
25.根据权利要求 21 所述的方法,其中所述引入步骤包括将用于自由基反应的试剂以MALDI基质施加至所述体外组织样品。
26.根据权利要求 25 所述的方法,其中所述扫描包括在所述体外组织样品上的多个不同位置处使用MALDI源进行MALDI技术。
27.根据权利要求 26 所述的方法,其中所述进行步骤与所述扫描步骤是同时发生的。
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