JP2017176186A - 線維症感受性il22ra2遺伝子およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】線維症に対する素因の検出、線維症の診断および予後診断、ならびに治療活性薬のスクリーニングに使用することができる線維症感受性遺伝子座、IL22RA2遺伝子座、の同定法の提供。
【解決手段】肝炎ウイルスまたは寄生虫に感染した被験者において肝線維症または肝硬変を発症するリスクのインビトロ決定方法であって、前記被験者の生体試料中のIL22RA2遺伝子座における一塩基多型(SNP)の存在を検出することを含み、前記SNPが、rs6570136、rs7774663、rs11154915およびrs2064501であり、SPN rs6570136についてのG対立遺伝子、SPN rs7774663についてのT対立遺伝子、SPN rs11154915についてのT対立遺伝子、および/またはSPN rs2064501についてのC対立遺伝子の存在が、肝線維症または肝硬変を発症するリスクの指標となる、方法。
【選択図】なし
【解決手段】肝炎ウイルスまたは寄生虫に感染した被験者において肝線維症または肝硬変を発症するリスクのインビトロ決定方法であって、前記被験者の生体試料中のIL22RA2遺伝子座における一塩基多型(SNP)の存在を検出することを含み、前記SNPが、rs6570136、rs7774663、rs11154915およびrs2064501であり、SPN rs6570136についてのG対立遺伝子、SPN rs7774663についてのT対立遺伝子、SPN rs11154915についてのT対立遺伝子、および/またはSPN rs2064501についてのC対立遺伝子の存在が、肝線維症または肝硬変を発症するリスクの指標となる、方法。
【選択図】なし
Description
一般に、本発明は、遺伝学および医学の分野に関する。詳細には、本発明は、肝疾患、肝硬変、皮膚ケロイド、肥満および任意の線維性疾患ならびにまた他の組織、例えば心臓、血管もしくは脳、の疾患の際に発生する、組織内の細胞外マトリックスタンパク質(ECMP:Extra Cellular Matrix Protein)の、潜在的に線維症を生じさせる結果になる、異常沈着の診断もしくは予後診断に用いることができるか、またはかかる異常ECMP沈着もしくは線維症に対する素因の検出に用いることができる、ヒト感受性遺伝子の同定を開示する。より詳細には、本発明は、線維症に対する感受性に関係があり、および治療活性薬のスクリーニングの新規標的を代表する染色体6上のIL22RA2遺伝子の特定の対立遺伝子を開示する。より詳細には、本発明は、IL22RA2遺伝子おける特定の突然変異、および発現産物、ならびにこれらの突然変異に基づく診断ツールおよびキットに関する。
組織内の細胞外マトリックスタンパク質の蓄積は、有害な作用を及ぼすことがある。組織内のECMPの異常沈着は、組織線維症を生じさせる結果となることがある。
線維症は、とりわけ傷害に応答した、器官、その任意の部分または組織、例えば肝臓、その任意の部分または組織における、線維性結合組織の過剰増殖である。
異常な線維症は、様々な病因の慢性肝炎、例えば、肝炎ウイルスおよび住血吸虫感染症において発生する。住血吸虫に感染した特定の被験者が進行の遅い線維症患者(slow fibrosers)であるのに対して、他者が進行の速い線維症患者(rapid fibrosers)であること、およびこれが、一部分にはChr 6q22−q23に位置する主要な遺伝子に依存することが以前証明されている(非特許文献1;非特許文献2)。特許文献1では、CTGF(CCN2)をこの領域の線維症感受性遺伝子として同定している。
住血吸虫症は、蠕虫によって引き起こされ、該蠕虫は、その宿主の血管系で発育し、産卵し、卵のいくつかが肝臓に輸送され、そこにおいて、それらが門脈周囲腔において炎症を引き起こす。ぜん虫は、そのヒト宿主にて何年も生きるので、多くの組織破壊を伴う慢性肝臓炎症が感染被験者において共通する。組織修復には、後に正常肝細胞にターンオーバーされ置換される、損傷組織でのECMP沈着が必要である。一部の患者においては、ECMPが静脈瘤、腹水の原因となる血流を低減させる線維症沈着を形成する門脈周囲の空間に蓄積する。何ヶ月または何年もの慢性または反復傷害の後、線維症は、永久的かつ不可逆的になる。被験者は、線維症の結果、死亡する。
南国では、3億5千万人の感染被験者の5〜10%が重度の肝線維症を発症し得ると推定される。住血吸虫感染被験者における肝線維症進行の予測および追跡を可能にする良好なマーカーはない。
肝線維症の診断は、主として肝生検、弾性率測定および超音波解析に基づく。
生検は、臨床状況に依存して、経皮(percutanous)、経頸静脈、X線撮影ガイド細針または腹腔鏡ルート経由で得られる。病理組織学的検査により、臨床家は、壊死性炎症の重症度を等級分けすること、および線維症の程度を段階分けすることができる。Metavirスコアリングシステムは、次のような1〜4のスケールで線維症の段階にスコアを割り当てる:F0=線維症なし、F1=隔壁を伴わないポータル線維症、F2=ポータル線維化および少数の隔壁、F3=肝硬変を伴わない多数の隔壁、F4=肝硬変(非特許文献3)。肝生検は、侵襲的で費用のかかる手順であり、肝臓の小部分のみをサンプリングする。それ故、肝生検は、肝線維症の全体的な評価をすることができず、サンプリング変動や、観察者間および内誤差にさらされる。加えて、肝生検は、3%の有意な罹病率および0.03%の死亡率に関連する。可能性のある合併症には、生検に関連する局所血腫、感染症、および疼痛が含まれる。
非侵襲的試験(すなわち、血清マーカー、弾性率測定、超音波解析)も用いられるが、まだ日常的に臨床使用できる状態ではない。
血液マーカーのパネルは、大抵、ウイルス性C型肝炎のためにC型慢性肝炎又は肝硬変を有する患者において試験されてきた。これらの研究は、血清マーカーで患者のおおよそ35%において線維症を判定または除外できることを明らかにした(非特許文献4)。しかし、患者を個々に見るとき、これらのマーカーでは線維症の様々な段階を確実に区別することができなかった。より最近の研究は、血清マーカーの3つのパネルを組み込んで、診断精度を向上させるアルゴリズム的アプローチを考案した(非特許文献5)。評価された3つのパネルは、APRI(血小板比率インデックスに対するアスパラギン酸トランスアミナーゼ)、フォーンズ(Forns)インデックス(血小板、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、コレステロール)およびフィブロテスト(GGT、ハプトグロビン、ビリルビン、アポリポタンパク質A、アルファ−2−マクログロブリン)であった。APRI、続いてのフィブロテストからなるアルゴリズムは、線維症の診断精度を90%より上に押し上げた。このグループは、このアルゴリズムを使用することで肝生検の50%まで必要性を取り除くことができると推定した。しかし、このアルゴリズムを用いて線維症の個々の段階を区別することはできない。これらの血清マーカーの制限は、高活性肝炎症があるときの偽陽性の可能性があることである。
フィブロスキャンは、肝線維症をステージングする別のアプローチであり、これは、エラストグラフィに基づき、これは、平均肝組織硬度を迅速に測定することを提供する(非特許文献6)。プローブを利用して、低周波および振幅の振動を肝臓に伝達する。この振動が弾性剪断波を引き起こし、肝臓を介したその弾性剪断波の速度は、キロパスカル(kPa)で測定された組織硬度に直接比例する。フィブロスキャン技法の感度は、肝生検と比較して79〜95%の範囲、特に78〜95%の範囲であった。しかし、この技法の限界は、流体または脂肪組織での弾性波の減衰と関連し、この減衰が患者における線維症の評価を損なわせることになる。加えて、フィブロスキャンは、極めて高価な計器である。
肝臓からのHCV根治のための今日の標準治療(SOC: Standard-Of-Care)は、PEG化I型インターフェロン(PegIFN)および合成ヌクレオシドリバビリン(RBV)療法からなる(非特許文献7;非特許文献8)。しかし、この標準療法は、限られた予測不能な効力である、処置の中止につながることが多い広範な毒性プロファイルを有し、また非常に高価である。遺伝子型1および4の慢性HCV感染個体の半分未満しか標準療法(PegIFN/RBV)の長期処置(48週)に応答しない(非特許文献9)。
Desseinら、1999
Mohamed-Aliら、1999
Bedossaら、1996
Sebastianiら、2006
Parkesら、2006
Ziolら、2005
Fried MWら、N Engl J Med.、2002、347(13):975-82
EASL Clinical Practice Guideline: Management of hepatitis C virus infection、J Hepatol.2011;55:245-264
Testino Gら、Hepatogastroenterology 2011;58(106):536-8
したがって、処置を最適にするために、非応答者に対する副作用を回避するために、および処置費用を低減させるために、処置に応答する機会が高い患者を選択する方法が必要とされている。
全体的に、線維症進行および処置効率を予後する効率的方法が、なお必要とされている。
本発明の目的は、線維症予後診断および処置のための新規遺伝学的アプローチを提供することである。本発明は、別のヒト線維症感受性遺伝子座、IL22RA2遺伝子座、の同定を今般開示し、これは異常ECMP沈着、とりわけ線維症に対する素因の検出、異常ECMP沈着、とりわけ線維症の診断および予後診断、ならびに治療活性薬のスクリーニングのために用いることができる。詳細には、本発明は、被験者からの試料においてIL22RA2遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法にあり、前記変化の存在は、異常ECMP沈着もしくは線維症の存在または異常ECMP沈着もしくは線維症に対する素因の指標となる方法にある。
本発明の特定の目的は、被験者において発生する異常ECMP沈着もしくは線維症に対する素因の検出または異常ECMP沈着もしくは線維症の診断および/または予後診断のインビトロ法にあり、この方法は、被験者からの試料におけるIL22RA2遺伝子またはポリペプチドの変化の存在を検出することを含み、前記変化の存在は、異常ECMP沈着もしくは線維症の存在、または異常ECMP沈着もしくは線維症に対する素因の指標となる方法にある。本発明の特定の目的は、異常ECMP沈着または線維症の進行の評価(予測)のための方法にある。
好ましい実施形態において、前記変化は、IL22RA2遺伝子の開始コドンの上流500kb以内、好ましくは100kb、好ましくは20kb、かつIL22RA2遺伝子の3’UTRの下流500kb以内、好ましくは100kb、好ましくは20kbに位置する。好ましくは、この変化は、IL22RA2遺伝子の開始コドンの上流10kb領域、かつ非翻訳領域(3’UTR)の下流10kb領域の周囲配列にある。
別の好ましい実施形態において、前記変化は、1つ以上の塩基の突然変異、挿入または欠失である。より好ましい実施形態において、前記変化は、線維症と関連性のある1つまたはいくつかの一塩基多型(単数もしくは複数)SNP(単数もしくは複数)またはSNPのハプロタイプである。好ましくは、前記一塩基多型は、SNP隣接IL22RA2遺伝子であり、これはIL22RA2遺伝子の近くにある対立遺伝子変異体である。
本発明の方法は、肝線維症疾患、肝硬変、皮膚ケロイド、肥厚性瘢痕および肥満から選択されるヒト線維性疾患、アルコール中毒または薬物肝毒性に発生する、線維症の検出および予後診断を可能にする。とりわけ、肝線維症は、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)(S.japonicum)またはマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)(S.mansoni)感染症によって引き起こされることがある。
特定の実施形態において、本方法は、被験者、好ましくは肝炎ウイルスまたは寄生虫に感染した被験者の生体試料中のIL22RA2遺伝子座におけるSNPの遺伝子型同定を含み、ここで、SNP rs6570136における遺伝子型GG、SNP rs7774663における遺伝子型TT、SNP rs11154915における遺伝子型TT、CT、および/またはSNP rs2064501における遺伝子型CCの存在は、被験者における線維症などの異常ECMP沈着を発症しているリスク、または線維症などの異常ECMP沈着の発症リスク、または線維症の予後不良のリスクの指標となる。線維症は、より詳細には肝線維症である。
あるいは、本方法は、本明細書中で述べるものと連鎖不平衡(LD: Linkage Disequilibrium)にある任意のSNPの遺伝子型同定を含み得る。
好ましくは、IL22RA2遺伝子座の変化を、選択的ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、ミクロ配列決定アッセイ、および/または対立遺伝子特異的増幅アッセイを行うことによって決定される。
本発明の別の態様では、IL22RA2遺伝子の前記変化を制限酵素消化によって決定し、少なくとも1つの前記SNPの検出が線維症の指標である。
本発明はまた、線維症などの異常ECMP沈着を有する被験者、または発症する素因がある被験者のための治療化合物を選択する方法にも関し、前記方法は、被験化合物をIL22RA2ポリペプチドもしくは遺伝子またはその断片と接触させること、およびIL22RA2遺伝子に関連する経路の生物学的活性または機能を向上または低減させる前記被験化合物の能力を測定することを含む。
本発明のさらなる主題は、ウイルス感染症に罹患している患者の抗ウイルス薬および/またはインターフェロンでの処置に応答する尤度を決定するためのインビトロ法であり、この方法は、患者の生体試料におけるIL22RA2遺伝子座の変化またはIL22RA2タンパク質発現もしくは活性の変化を決定することを含む。
特定の実施形態において、本方法は、被験者の生体試料中のIL22RA2遺伝子座におけるSNPの遺伝子型同定を含み、ここで、SNP rs11154915についてのTT遺伝子型、SNP rs6570136についてのAGもしくはGG遺伝子型、SNP rs2064501についてのCT遺伝子型、および/またはSNP rs1543509についてのAA遺伝子型の存在は、処置に対する患者の陽性応答に有利になる。あるいは、本方法は、本明細書中で述べるものと連鎖不平衡(LD)にある任意のSNPの遺伝子型同定を含み得る。
特定の実施形態において、処置は、抗ウイルス薬を、場合によりインターフェロンと共に含む。
好ましくは、前記抗ウイルス薬は、ウイルス複製の阻害剤、例えばリバビリン、である。
本発明は、ヒトにおける線維症、とりわけ肝線維症の疾患進行を予測する有益な遺伝子マーカーを提供する。
ECMPの異常蓄積または線維症の早期検出、およびかかる蓄積または線維症の定期的モニタリングは、このプロセスを停止させること、およびさらには逆行させることが可能な抗線維症療法の開始を可能にすることになる。これは次に、ヒト線維症疾患、例えば肝線維症または肝硬変への進行を防ぎ、そして、この病状に伴う罹患率と死亡率を抑えるであろう。これらの様々な早期線維症検出技術の開発は、肝疾患患者の将来のケアにとって吉兆である。
本発明者らは、ヒト線維症と関連性のある遺伝子を今般同定した。本発明者らは、日本住血吸虫およびマンソン住血吸虫にそれぞれ感染した中国人、スーダン人およびブラジル人コホートにおける線維症が、IL22RA2遺伝子にある対立遺伝子変異体に顕著に依存することを証明した。IL22R−BPとも称するIL22RA2(「インターロイキン−22受容体アルファ−2(InterLeukin-22 Receptor Alpha-2)」にちなんで)遺伝子は、IL−22のその受容体への結合について競合する可溶性形態のIL−22受容体をコードする。
より詳細には、本発明者らは、(日本住血吸虫に曝露された)中国人、(マンソン住血吸虫に曝露された)スーダン人およびブラジル人であって、すべて風土病地域で生活している人々の独立した試料について症例コントロール研究を行った。各試料に少なくとも2名の観察者による超音波検査を用いて肝線維症(HF: Hepatic Fibrosis)を評価した。IL22RA2(マイナー対立遺伝子頻度>10%)におけるすべてのTag SNPを試験した。関連SNPと連鎖不平衡にあるSNPを、観察される関連性の説明から外すことができるように、本発明者らは、IL22RA2の3’および5’における500kb領域のSNPを評価した。
したがって、本発明は、被験者における肝線維症を発症しているリスク、または肝線維症の発症リスク、または肝線維症の予後不良のリスクを決定する方法を提供し、この方法は、前記被験者からの試料のIL22RA2遺伝子座におけるリスク関連一塩基多型(SNP: Single Nucleotide Polymorphism)対立遺伝子の存在の検出を含む。
より詳細には、本発明は、肝線維症を発症しているリスク、または肝線維症の発症のリスク、または肝線維症の予後不良のリスクを決定する方法を提供し、この方法は、前記被験者からの試料のIL22RA2遺伝子座におけるSNPの遺伝子型同定を含む。
本発明の別の目的は、ウイルス感染処置に対する応答を予測するための遺伝学的アプローチを提供することである。本発明は、抗ウイルス処置応答遺伝子座、IL22RA2遺伝子座の同定を今般開示し、これはウイルス感染、とりわけHCVに罹患している患者の抗ウイルス処置に対する応答の予測に用いることができる。詳細には、本発明は、被験者からの試料においてIL22RA2遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法にあり、前記変化の存在は、その処置の応答の指標、すなわち、患者がその処置に応答しないリスクのレベルの指標となる、方法にある。
本発明の方法は、ウイルス感染症、特にC型肝炎に罹患している患者に抗ウイルス薬、例えばリバビリン、およびインターフェロンを投与する処置に対する応答の予測を可能にする。
本発明は、とりわけC型肝炎における、抗ウイルス処置に対する応答を予測する有益なマーカーを提供する。
抗ウイルス処置に対する応答被験者および非応答被験者の早期同定により、患者の遺伝子型に基づく個別化(個人別)処置の開始が可能となる。これは次に、医師がより多くのインフォームドディシジョンを行うのに役立ち、不必要な出費および無用の副作用を回避することになる。これらの様々な早期予測技法の開発は、ウイルス感染症、とりわけC型肝炎の患者の将来のケアにとって吉兆である。
本発明者らは、抗ウイルス処置に対する応答と関連性のある遺伝子を今般同定した。本発明者らは、HCVに感染した様々なコホートにおける抗ウイルス処置リバビリン−IFNに対する応答が、IL22RA2遺伝子にある対立遺伝子変異体に依存することを証明した。
本発明者らが収集した実験データにより、試験した集団に依存する特定の対立遺伝子の関連性を確認することはできなかったが、本発明は、試験したすべての集団における線維症と有意に相関することが分かった特定のSNPに限定されない。実際、不十分なコホート、交絡変数の不完全な評価、前記集団におけるSNPのより低い頻度などを含むいくつかの理由が、いくつかの集団において有意な相関を確認することができないことを説明し得る。
(定義)
本発明の文脈の中で、用語「細胞外マトリックスタンパク質(ECMP)の異常沈着」は、すべてのタイプのヒト組織に蓄積し得る細胞外マトリックス成分(ラミニン、フィブロネクチンEIIIA、コラーゲンIおよびIV、プロコラーゲンIII、エラスチン、テネイシンを含む)をいう。かかる蓄積は、例えば動脈、心臓または脳内で発生すると、有害であり得る。沈着が大規模であると、その蓄積の結果として組織の線維化が生ずる。
本発明の文脈の中で、用語「細胞外マトリックスタンパク質(ECMP)の異常沈着」は、すべてのタイプのヒト組織に蓄積し得る細胞外マトリックス成分(ラミニン、フィブロネクチンEIIIA、コラーゲンIおよびIV、プロコラーゲンIII、エラスチン、テネイシンを含む)をいう。かかる蓄積は、例えば動脈、心臓または脳内で発生すると、有害であり得る。沈着が大規模であると、その蓄積の結果として組織の線維化が生ずる。
本発明の文脈の中で、「線維症」は、すべての線維性ヒト疾患、例えば、肝疾患、肝硬変、皮膚ケロイド、肥厚性瘢痕、強皮症、肥満および任意の線維性疾患において発生する、すべてのタイプのヒト線維症を指す。
本発明の文脈の中で、「肝線維症」または「HF]は、肝臓、その組織、またはその組織に任意の部分において発生するすべてのタイプの線維症を指す。肝線維症は、とりわけ傷害に応答して発生する。肝線維症は、最終的には肝硬変およびその合併症、門脈高血圧、肝不全および肝細胞癌につながる、慢性肝傷害に対する一般的応答であり得る。肝線維症は、過剰な結合組織が肝臓で構築される過剰増殖性創傷治癒である。細胞外マトリックスは、過剰産生されるか、不完全に分解されるかのいずれかであるか、または両方である。引き金は、とりわけ炎症性成分がある場合は、慢性傷害である。様々なタイプの慢性肝傷害が、例えば、化学線維症(CCl4)、細菌性のもの(すなわち、ブルセラ症)、寄生虫性のもの(住血吸虫種によって引き起こされるビルハルチア病(bilharziosis)/住血吸虫症、またはエキノコックス感染症)またはウイルス性のもの(すなわち、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBC)もしくはC型肝炎ウイルス(HCV)感染によって引き起こされる肝炎)などの線維症を引き起こし得る。
本発明の文脈の中で、「皮膚ケロイド」は、皮膚上の瘢痕組織の過剰増殖である。より詳細には、ケロイドおよび肥厚性瘢痕(HSc)は、外傷、炎症、手術、火傷後およびときには自発的に生じる、ヒトに固有の皮膚線維増殖性障害である。これらの障害は、真皮および皮下組織のコラーゲンの過剰沈着を特徴とする。正常な創傷修復の細線瘢痕の特徴と反対に、ケロイドおよびHScの過増殖性瘢痕は、典型的に、外観を損ない、拘縮、そう痒および疼痛をもたらす。ケロイドは、黒人、ヒスパニックおよび東洋人の中で家系上の傾向がある個体に発生する。HScとは異なり、ケロイド瘢痕は、元の創縁を超えて拡大および拡張し、滅多に退縮しない。これらの障害は、細胞遊走および増殖、炎症、サイトカインおよび細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の増加した合成および分泌、ならびに新たに合成されるマトリックスの再構築を含む、創傷治癒の基本プロセスの異常を表す。生物学的に、ケロイドは、細胞外マトリックス成分、とりわけコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンおよびプロテオグリカンの過剰沈着を伴う異型繊維芽細胞の集合を特徴とする線維性組織である。一般に、ケロイドは、相対的に無細胞の中心部と、病変の深い真皮の部分において結節を形成する厚く、豊富なコラーゲンの束を含む。治癒の炎症期中の成長因子の放出および活性化は、血管新生、上皮再形成、繊維芽細胞およびマトリックス沈着の動員および増殖を含む瘢痕プロセスの前提条件である。そのとき、IL22RA2を含む調節性サイトカインの活性の異常産生が、ケロイドの発生の一因となり得る。
本発明の文脈の中で、「IL22RA2遺伝子座」は、IL22RA2コード配列、IL22RA2非コード配列(例えば、イントロン)、転写および/または翻訳を制御するIL22RA2調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど)を含む細胞または生物におけるすべての配列または産物、例えばIL22RA2 RNA(例えば、mRNA)およびIL22RA2ポリペプチド(例えば、前タンパク質および成熟タンパク質)などのすべての対応する発現産物;ならびにIL22RA2遺伝子の開始コドンの上流500kb領域、好ましくは100kb、好ましくは20kb領域、非翻訳領域(3’UTR)の下流500kb領域、好ましくは100kb、好ましくは20kb領域の周囲配列を指す。例えば、IL22RA2遺伝子座は、表1のSNPを含む周囲配列を含む。
本発明の文脈の中で、用語「予後診断」は、成人、小児および出生前の早期、症状前の段階および後期段階を含む様々な段階での検出、モニタリング、投薬および比較などを含む。予後診断は、典型的には、線維症の進行の評価(予測)、および最も適切な処置を定義するための被験者の特性化(薬理遺伝学)などを含む。本発明は、線維症またはIL22RA2遺伝子座における突然変異または多型から生じる関連障害の進行速度を決定するための予後診断方法を提供する。
「試料」は、核酸またはポリペプチドを含有する、患者または被験者由来の任意の生体試料であり得る。かかる試料の例としては、体液、組織、細胞試料、器官、生検材料などが挙げられる。最も好ましい試料は、血液、血漿、唾液、尿、精液などである。試料を従来の技法に従って収集してもよく、診断に直接使用してもよいし、または保管してもよい。
「患者」は、年齢または性別のいかんを問わず、任意の哺乳動物、好ましくは人間であり得る。患者は、アレナウイルス科のウイルス(例えば、ラッサウイルス)、コロナウイルス科のウイルス(例えば、重症急性呼吸器症候群ウイルス)、フラビウイルス科のウイルス(例えば、CまたはB型肝炎ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス)、フィロウイルス科のウイルス(例えば、エボラ、マールブルグ)、ヘルペスウイルス科のウイルス(例えば、単純疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス)、オルトミクソウイルス科のウイルス(例えば、インフルエンザAおよびB)、パラミクソウイルス科のウイルス(例えば、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、PMV、麻疹)、ポックスウイルス科のウイルス(例えば、ワクシニア、痘瘡)、ラブドウイルス科のウイルス(例えば、水疱性口内炎ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、狂犬病)、レトロウイルス科のウイルス(例えば、HIVおよび他のレトロウイルス)、トガウイルス科のウイルス(例えば、チクングニア、シンドビス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス)からなる群より選択されるウイルスを含むウイルスに感染していることがある。特定の実施形態において、患者は、C型肝炎ウイルス、例えば、遺伝子型1のC型肝炎ウイルスに感染している。
ウイルス感染症に罹患している患者についての抗ウイルス薬および/またはインターフェロンでの処置に対して応答する尤度を決定するための方法において、用語「ウイルス感染症」は、リバビリンおよび/またはIFNで処置することができるすべてのタイプのヒトウイルス感染症、例えば、C型肝炎、B型肝炎、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)気管支炎、アデノウイルス性疾患、インフルエンザならびにリバビリンおよび/またはIFNで処置することができる任意のウイルス感染症を指す。
本発明の文脈の中で、「応答者」は、抗ウイルス薬、とりわけリバビリン、および/またはIFNでの処置に対して応答する患者、すなわち、ウイルス負荷量が低減する、患者の症状の少なくとも1つが軽減される、または疾患の進行が停止もしくは減速される患者の表現型をいう。
本発明の文脈の中で、「非応答者」は、抗ウイルス薬、とりわけリバビリン、および/またはIFNでの処置に対して応答しない患者、または応答するが1年もしくは2年以内に再発する患者の表現型をいう。処置に対する非応答は、実質的に減少されないウイルス負荷量をいい、患者の症状は軽減されないか、または疾患が進行する。再発する患者は、短期間処置に対して応答するが、処置終了から1年または2年以内に再びそのウイルス負荷量よび症状が増加する。
用語「処置」または「抗ウイルス処置」は、抗ウイルス薬および/またはインターフェロン(IFN)の投与をいう。
好ましくは、インターフェロンは、インターフェロンガンマである。しかし、インターフェロンアルファ2B、PEG化インターフェロンアルファ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファ2Aおよびリンパ芽球様インターフェロンタウを含む、他のインターフェロンを包含する。好ましい実施形態において、インターフェロンは、PEG化インターフェロン、例えばPEG化インターフェロンガンマである。
「抗ウイルス薬」は、細胞へのウイルス侵入もしくはその複製に干渉するか、またはウイルスタンパク質の活性を阻害する任意の化合物であり得る。例えば、抗ウイルス薬は、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド(Imiqimod)、リバビリン、イノシン5’−一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンであり得る。より一般的には、抗ウイルス薬は、ウイルスプロテアーゼ阻害剤であり得る。
ウイルスがHCVウイルスであるとき、抗ウイルス薬は、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCV侵入、HCVアセンブリ、HCV放出またはHCV NS5Aタンパク質の阻害剤であり得る。
好ましい態様において、インターフェロンは、インターフェロンガンマ、例えば、PEG化インターフェロンガンマである。別の好ましい態様において、インターフェロンは、インターフェロンアルファ、例えば、PEG化インターフェロンアルファである。特定の実施形態において、処置は、リバビリンおよびインターフェロンガンマまたはアルファ、好ましくはPEG化インターフェロンガンマまたはアルファを含む。
(変化)
変化を、IL22RA2 DNA、RNAまたはポリペプチドレベルで決定することができる。任意に、検出を、IL22RA2遺伝子座のすべてもしくは一部を配列決定によって、またはIL22RA2遺伝子座のすべてもしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは増幅によって行う。さらに好ましくは、IL22RA2遺伝子座特異的増幅を変化同定段階前に行う。IL22RA2遺伝子座の変化は、単独での、または様々な組み合わせ(単数もしくは複数)での、遺伝子座のコーディングおよび/または非コーディング領域における任意の形態の突然変異(単数もしくは複数)、欠失(単数もしくは複数)、再配列(単数もしくは複数)および/または挿入であり得る。より具体的には、突然変異は、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子座のコーディングまたは非コーディング部分における2以上の残基(例えば、2の残基から全遺伝子または遺伝子座まで)の任意の領域を包含し得る。より大きい欠失も起こることがあるが、典型的な欠失は、より小さい領域、例えば、約50未満の連続する塩基対のドメイン(イントロン)または反復配列または断片に影響を及ぼす。挿入は、遺伝子座のコーディングまたは非コーディング部分における1または複数の残基の付加を包含し得る。挿入は、典型的に、遺伝子座における1〜50の塩基対の付加を含み得る。再配列は、配列の反転を含む。IL22RA2遺伝子座の変化の結果により、終止コドン、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のRNAスプライシングまたはプロセッシング、産物の不安定化、切断されたポリペプチド産物などが作成され得る。変化の結果により、変更した機能、安定性、標的指向性または構造を有するIL22RA2ポリペプチドが産生され得る。変化は、タンパク質発現の低減を引き起こすこともあり、または代わりに前記タンパク質産生の増加を引き起こすこともある。
変化を、IL22RA2 DNA、RNAまたはポリペプチドレベルで決定することができる。任意に、検出を、IL22RA2遺伝子座のすべてもしくは一部を配列決定によって、またはIL22RA2遺伝子座のすべてもしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは増幅によって行う。さらに好ましくは、IL22RA2遺伝子座特異的増幅を変化同定段階前に行う。IL22RA2遺伝子座の変化は、単独での、または様々な組み合わせ(単数もしくは複数)での、遺伝子座のコーディングおよび/または非コーディング領域における任意の形態の突然変異(単数もしくは複数)、欠失(単数もしくは複数)、再配列(単数もしくは複数)および/または挿入であり得る。より具体的には、突然変異は、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子座のコーディングまたは非コーディング部分における2以上の残基(例えば、2の残基から全遺伝子または遺伝子座まで)の任意の領域を包含し得る。より大きい欠失も起こることがあるが、典型的な欠失は、より小さい領域、例えば、約50未満の連続する塩基対のドメイン(イントロン)または反復配列または断片に影響を及ぼす。挿入は、遺伝子座のコーディングまたは非コーディング部分における1または複数の残基の付加を包含し得る。挿入は、典型的に、遺伝子座における1〜50の塩基対の付加を含み得る。再配列は、配列の反転を含む。IL22RA2遺伝子座の変化の結果により、終止コドン、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のRNAスプライシングまたはプロセッシング、産物の不安定化、切断されたポリペプチド産物などが作成され得る。変化の結果により、変更した機能、安定性、標的指向性または構造を有するIL22RA2ポリペプチドが産生され得る。変化は、タンパク質発現の低減を引き起こすこともあり、または代わりに前記タンパク質産生の増加を引き起こすこともある。
好ましい実施形態において、前記変化は、1つ以上の塩基の突然変異、挿入または欠失である。本発明による方法の特定の実施形態において、IL22RA2遺伝子座の変化は、IL22RA2遺伝子または対応する発現産物の点突然変異、欠失および挿入、さらに好ましくは点突然変異および欠失から選択される。変化をIL22RA2 DNA、RNAまたはポリペプチドのレベルで決定することができる。
最も好ましい実施形態において、本方法は、表1Aに示す位置のいずれかにおけるSNPの存在を決定するためのIL22RA2遺伝子の遺伝子型同定を含む。
表1A:IL22RA2遺伝子座における線維症関連SNP
Hapmap:CEU 欧州人コホート、YOR アフリカ人コホート(ヨルバ族)、CHB アジア人コホート(中国人)
Hapmap:CEU 欧州人コホート、YOR アフリカ人コホート(ヨルバ族)、CHB アジア人コホート(中国人)
好ましくは、本方法は、rs6570136、rs7774663、rs11154915およびrs2064501からなる群において選択されるSNPの遺伝子型同定を含む。
SPN rs6570136についてのG対立遺伝子、より詳細にはGG遺伝子型の存在は、患者にとって有害である。すなわち、その存在は、ECMPの異常沈着、または線維症、とりわけ肝線維症を発症する可能性が高い患者を示す。
SPN rs7774663についてのT対立遺伝子、より詳細にはTT遺伝子型の存在は、患者にとって有害である。すなわち、その存在は、ECMPの異常沈着、または線維症、とりわけ肝線維症を発症する可能性が高い患者を示す。
SPN rs11154915についてのT対立遺伝子、より詳細にはTTまたはCT遺伝子型の存在は、患者にとって有害である。すなわち、その存在は、ECMPの異常沈着、または線維症、とりわけ肝線維症を発症する可能性が高い患者を示す。
SPN rs2064501についてのC対立遺伝子、より詳細にはCC遺伝子型の存在は、患者にとって有害である。すなわち、その存在は、ECMPの異常沈着、または線維症、とりわけ肝線維症を発症する可能性が高い患者を示す。
同じビンにおけるSNPは、高度に相関しており(r2>0.8)、本発明の方法において同様に有用である。強い連鎖不平衡にある(r2>0.6を生じさせる)SNPも包含される。
本発明の別の方法は、表1Bにおいて定義するように、非応答の遺伝子型を患者が含むかどうかを決定することを含み得る。
全員がHCVに感染している、123名の被験者(69名の応答被験者および54名の非応答被験者)に対して解析を行った。
表1B:IL22RA2遺伝子座における抗ウイルス処置応答関連変化
好ましくは、本方法は、rs11154915、rs6570136、rs2064501およびrs1543509からなる群において選択されるSNPの遺伝子型同定を含む。
SNP rs11154915についてのTT遺伝子型の存在は、抗ウイルス処置に対する患者の陽性応答に有利になる。
SNP rs6570136についてのAGまたはGG遺伝子型の存在は、抗ウイルス処置に対する患者の陽性応答に有利になる。
SNP rs2064501についてのCT遺伝子型の存在は、抗ウイルス処置に対する患者の陽性応答に有利になる。
SNP rs1543509についてのAA遺伝子型の存在は、抗ウイルス処置に対する患者の陽性応答に有利になる。
同じビンにおけるSNPは、高度に相関しており(r2>0.8)、本発明の方法において同様に有用である。強い連鎖不平衡にあるSNPも包含される。
各遺伝子型に関連するオッズ比(odd ratios)を表1Bに示す。各SNPを単独で評価したとき、オッズ比は1.9〜4まで変動し;すべてのSNPを同じ多変量解析モデル(SNP間の交絡効果を考慮に入れる)で一緒に評価したとき、ORは1.9〜13まで変動する。4多型すべてについて応答者遺伝子型を保有する被験者は、すべての遺伝子型について非応答者遺伝子型を保有する被験者よりも処置に応答する可能性が約50〜300倍高くなる。
連鎖不平衡(LD)は、ゲノムにわたって異なる遺伝子座における対立遺伝子のランダムでない関連性と定義される。2つ以上の遺伝子座における対立遺伝子は、それらの組み合わせがその集団において偶然に予測される頻度より高頻度または低頻度で発生する場合、LDにある。
LDによってDNA領域に原因遺伝子座があるとき、近接する1つ以上のSNPは、形質とも関連性がある可能性が高い。したがって、異常ECMP沈着と関連性のある第一のSNPと(r2>0.6を生じさせる)強いLDにある任意のSNPがこの形質と関連性があることになる。
所与のSNPと連鎖不平衡にあるさらなるSNPの同定には、(a)複数の個体からの第一のSNPを含むかまたは包囲するゲノム領域から断片を増幅すること;(b)前記第一のSNPを有するかまたは包囲するゲノム領域の第二のSNPを同定すること;(c)前記第一のSNPと第二のSNPとの間の連鎖不平衡解析を行うこと;および(d)前記第一のマーカーと連鎖不平衡にあるような前記第二のSNPを選択することが含まれる。工程(b)および(c)を含む部分的組み合わせも企図される。
SNPを同定するための方法、および連鎖不平衡解析を行うための方法を、当業者は、過度の実験を伴うことなく、周知の方法を用いることによって行うことができる。
多くのSNPが、他の近接SNP対立遺伝子と強いLDを示す対立遺伝子を有すること、および強いLDを有するゲノム領域において、等間隔のSNPの選択、または他のSNP(代理SNPもしくはTag SNP)とそれらのLDに基づいて選ばれたものにより、統計解析力のほんのわずかな損失で遺伝子型同定されないSNPの遺伝情報の大部分を捕捉することができることは周知である。関連のある研究において、このLD領域は、ほんの少数のSNP(Tag SNP)を使用することで十分にカバーされ、SNPと研究している表現型との間の統計的関連性は、該SNPが原因変異体であるか、または原因変異体とLDにあることを意味する。LDを測定するために最も一般的に用いられている2つの測定基準は、D’およびr2であり、互いにおよび対立遺伝子頻度によってそれらを記述することができる。代理(またはTag SNP)が、1つ以上の他のSNPとLD(r2≧0.8)にあるSNPと定義されることは一般的なコンセンサスである。代理SNPの遺伝子型は、LDにより他のSNPの遺伝子型を予測することができ、また逆も可であろう。詳細には、本明細書で用いるSNPのうちの1つとLDにある任意のSNPを、そのLDに従ってr2≧0.8と定義される1つ以上の代理SNPによって置き換えることができる。
連鎖不平衡にあるこれらのSNPも、本発明による方法、より詳細には、本発明による診断方法において使用することができる。
変化したIL22RA2 RNA発現の存在を決定することによってIL22RA2遺伝子の変化を検出することができる。変化したRNA発現には、変化したRNA配列の存在、変化したRNAスプライシングまたはプロセッシングの存在、変化したRNA量の存在などが含まれる。これらの存在を、例えばIL22RA2 RNAのすべてもしくは一部の配列決定、または前記RNAのすべてもしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは選択的増幅を含む、当該技術分野において公知の様々な技法によって検出することができる。
さらなる変異体において、本方法は、変化したIL22RA2ポリペプチド発現の存在を検出することを含む。変化したIL22RA2ポリペプチド発現には、変化したポリペプチド配列の存在、変化したIL22RA2ポリペプチド量の存在、変化した組織分布の存在などが含まれる。これらの存在を、例えば配列決定および/または特異的リガンド(例えば抗体)への結合を含む、当該技術分野において公知の様々な技法によって検出することができる。
上に示したように、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅、および/または特異的リガンド(例えば抗体)への結合を含む、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて、変化したIL22RA2遺伝子またはRNA発現または配列を検出または定量することができる。他の適切な方法には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット(DNAについて)、ノーザンブロット(RNAについて)、一本鎖高次構造解析(SSCA)、PFGE、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)、ゲル移動、クランプ変性ゲル電気泳動(clamped denaturing gel celectrophoresis)、ヘテロ二本鎖分析、RNA分解酵素保護、化学的ミスマッチ切断、ELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)および免疫酵素アッセイ(IEMA)を含む。これらのアプローチのいくつか(例えば、SSCAおよびCGGE)は、変化した配列の存在の結果としての核酸の電気泳動移動度の変化に基づく。これらの技法によって、ゲル上での移動度のシフトにより、変化した配列を可視化する。その後、断片を配列決定して変化を確認し得る。他のいくつかは、被験者からの核酸と野生型または変化したIL22RA2遺伝子またはRNAに特異的なプローブとの間の特異的ハイブリダイゼーションに基づく。プローブは、懸濁液の中にあってもよく、また、基板上に固定されていてもよい。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。これらのアプローチのいくつかは、ポリペプチド配列または発現レベルの評価、例えば、ノーザンブロット、ELISAおよびRIAに特に適している。これら後者には、ポリペプチドに特異的なリガンド、さらに好ましくは特異的抗体を使用する必要がある。
好ましい実施形態において、本方法は、被験者からの試料において変化したIL22RA2遺伝子発現プロファイルの存在を検出することを含む。上に示したように、この検出を、より好ましくは、前記試料に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび/または選択的増幅によって達成することができる。
(配列決定)
自動シークエンサーを使用して、当該技術分野において周知の技法を用いて配列決定を行うことができる。完全IL22RA2遺伝子座について、またはより好ましくは、その特定のドメインについて、典型的には有害な突然変異もしくは他の変化を有することが公知であるか、または保有すると疑われるものについて、配列決定を行うことができる。
自動シークエンサーを使用して、当該技術分野において周知の技法を用いて配列決定を行うことができる。完全IL22RA2遺伝子座について、またはより好ましくは、その特定のドメインについて、典型的には有害な突然変異もしくは他の変化を有することが公知であるか、または保有すると疑われるものについて、配列決定を行うことができる。
(増幅)
増幅は、核酸複製を開始するのに役立つ相補核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づく。当該技術分野において公知の様々な技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)および核酸配列ベース増幅(NASBA)によって増幅を行うことができる。市販の試薬およびプロトコルを用いてこれらの技法を行うことができる。好ましい技法は、対立遺伝子特異的PCRまたはPCR−SSCPを用いる。通常、増幅は、反応を開始するために特定の核酸プライマーの使用を必要とする。IL22RA2遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーは、IL22RA2遺伝子座の標的領域に隣接する前記遺伝子座の部分と特異的にハイブリダイズすることができ、前記標的領域は、線維症または関連障害を有する特定の被験者において変化する。
増幅は、核酸複製を開始するのに役立つ相補核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づく。当該技術分野において公知の様々な技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)および核酸配列ベース増幅(NASBA)によって増幅を行うことができる。市販の試薬およびプロトコルを用いてこれらの技法を行うことができる。好ましい技法は、対立遺伝子特異的PCRまたはPCR−SSCPを用いる。通常、増幅は、反応を開始するために特定の核酸プライマーの使用を必要とする。IL22RA2遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーは、IL22RA2遺伝子座の標的領域に隣接する前記遺伝子座の部分と特異的にハイブリダイズすることができ、前記標的領域は、線維症または関連障害を有する特定の被験者において変化する。
本発明は、周囲領域を含むIL22RA2遺伝子または遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーを使用する。かかるプライマーは、好ましくは、IL22RA2遺伝子座における核酸配列に相補的であり、特異的にハイブリダイズする。特定のプライマーは、IL22RA2遺伝子座の標的領域に隣接する前記遺伝子座の部分と特異的にハイブリダイズすることができ、前記標的領域は、線維症または関連障害を有する特定の被験者において変化する。
(選択的ハイブリダイゼーション)
ハイブリダイゼーション検出方法は、核酸配列変化(単数または複数)を検出するのに役立つ相補核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。特定の検出技法には、野生型または変化したIL22RA2遺伝子またはRNAに特異的な核酸プローブの使用、その後のハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁液内にあってもよく、または、(核酸アレイまたはチップ技術のように)基板または支持体の上に固定化されていてもよい。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。この点において、本発明の特定の実施形態は、被験者からの試料を変化したIL22RA2遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、およびハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい実施形態において、本方法は、野生型IL22RA2遺伝子座に対して、およびその変化した様々な型に対してそれぞれ特異的であるプローブのセットと試料を同時に接触させることを含む。この実施形態では、試料におけるIL22RA2遺伝子座の様々な形態の変化の存在を直接検出することが可能である。また、様々な被験者からの様々な試料を並行して処理することができる。
ハイブリダイゼーション検出方法は、核酸配列変化(単数または複数)を検出するのに役立つ相補核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。特定の検出技法には、野生型または変化したIL22RA2遺伝子またはRNAに特異的な核酸プローブの使用、その後のハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁液内にあってもよく、または、(核酸アレイまたはチップ技術のように)基板または支持体の上に固定化されていてもよい。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。この点において、本発明の特定の実施形態は、被験者からの試料を変化したIL22RA2遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、およびハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい実施形態において、本方法は、野生型IL22RA2遺伝子座に対して、およびその変化した様々な型に対してそれぞれ特異的であるプローブのセットと試料を同時に接触させることを含む。この実施形態では、試料におけるIL22RA2遺伝子座の様々な形態の変化の存在を直接検出することが可能である。また、様々な被験者からの様々な試料を並行して処理することができる。
本発明のこの文脈の中で、プローブは、IL22RA2遺伝子またはRNA(の標的部分)に相補的であり、かつ特異的ハイブリダイゼーションが可能であるポリヌクレオチド配列であって、線維症に対する素因があるか、または線維症と関連のあるIL22RA2対立遺伝子に関連したポリヌクレオチド多型の検出に適しているポリヌクレオチド配列をいう。プローブは、好ましくは、IL22RA2遺伝子、RNA、またはその標的部分に完全に相補的である。プローブは、典型的に、8〜1000ヌクレオチド長、例えば、10〜800、さらに好ましくは15〜700、典型的には20〜500の一本鎖核酸を含む。より長いプローブも使用できることは理解されたい。本発明の好ましいプローブは、変化を保有するIL22RA2遺伝子座またはRNAの領域に特異的にハイブリダイズすることができる、8〜500ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。
本発明の方法は、変化した(例えば、突然変異した)IL22RA2遺伝子またはRNAに特異的な核酸プローブ、すなわち、前記変化したIL22RA2遺伝子またはRNAに特異的にハイブリダイズし、前記変化を欠くIL22RA2遺伝子またはRNAには本質的にハイブリダイズしない核酸プローブを用いる。特異性は、標的配列に対するハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって生じるシグナルと区別することができる特異的シグナルを生じることを示す。本発明によるプローブを設計するためには、完全相補配列が好ましい。しかし、特異的シグナルを非特異的ハイブリダイゼーションと区別できる限り、特定のミスマッチが許容され得ることは理解されたい。かかるプローブの特定の例は、上の表1に示す点突然変異を有するIL22RA2遺伝子座またはRNAを含むゲノム領域の標的部分に相補的な核酸配列である。
プローブの配列は、本願において提供するようなIL22RA2遺伝子およびRNAの配列から誘導することができる。ヌクレオチド置換が行われてもよく、プローブの化学的修飾が行われてもよい。かかる化学的修飾を達成して、ハイブリッド(例えば、インターカレーション基)を増加させること、またはプローブを標識することができる。標識の典型的な例としては、限定ではないが、放射能、蛍光、発光、酵素標識などが挙げられる。本発明は、被験者における線維症もしくは関連障害の存在または線維症もしくは関連障害に対する素因を検出する方法における、あるいは線維症または関連障害の処置に対する被験者の応答を評価する方法における、上で説明したような核酸プローブの使用にも関する。
(特異的リガンド結合)
上に示したように、IL22RA2遺伝子座の変化をIL22RA2ポリペプチド配列または発現レベルの変化(単数または複数)についてのスクリーニングによって検出することもできる。この点において、IL22RA2ポリペプチドに特異的なリガンドと試料を接触させること、および複合体の形成を測定することも説明されている。異なるタイプのリガンド、例えば特異的抗体を使用することができる。特定の実施形態では、試料をIL22RA2ポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の形成を測定する。免疫複合体を検出するための様々な方法、例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)および免疫酵素アッセイ(IEMA)を用いることができる。本発明の文脈の中で、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、また実質的に同じ抗原特異性を有するその断片または誘導体も指す。断片には、Fab、Fab’2、CDR領域などが含まれる。誘導体には、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体などが含まれる。IL22RA2ポリペプチドに特異的な抗体は、IL22RA2ポリペプチドに選択的に結合する抗体、すなわち、IL22RA2ポリペプチドまたはエピトープを含むその断片に対する抗体を指す。他の抗原に対する非特異的結合が起こり得るが、標的IL22RA2ポリペプチドに対する結合は、より高い親和性で起こり、非特異的結合と容易に識別することができる。
上に示したように、IL22RA2遺伝子座の変化をIL22RA2ポリペプチド配列または発現レベルの変化(単数または複数)についてのスクリーニングによって検出することもできる。この点において、IL22RA2ポリペプチドに特異的なリガンドと試料を接触させること、および複合体の形成を測定することも説明されている。異なるタイプのリガンド、例えば特異的抗体を使用することができる。特定の実施形態では、試料をIL22RA2ポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の形成を測定する。免疫複合体を検出するための様々な方法、例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)および免疫酵素アッセイ(IEMA)を用いることができる。本発明の文脈の中で、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、また実質的に同じ抗原特異性を有するその断片または誘導体も指す。断片には、Fab、Fab’2、CDR領域などが含まれる。誘導体には、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体などが含まれる。IL22RA2ポリペプチドに特異的な抗体は、IL22RA2ポリペプチドに選択的に結合する抗体、すなわち、IL22RA2ポリペプチドまたはエピトープを含むその断片に対する抗体を指す。他の抗原に対する非特異的結合が起こり得るが、標的IL22RA2ポリペプチドに対する結合は、より高い親和性で起こり、非特異的結合と容易に識別することができる。
被験者からの試料においてIL22RA2遺伝子座もしくはポリペプチドの変化、IL22RA2遺伝子もしくはポリペプチド発現の変化、および/またはIL22RA2活性の変化の存在を検出するための製品および試薬を含む診断キットも開示する。前記診断キットは、本発明で記載した任意のプライマー、任意のプライマーペア、任意の核酸プローブおよび/または任意のリガンド、好ましくは抗体を含む。前記診断キットは、ハイブリダイゼーション、増幅または抗原抗体免疫反応を行うための試薬および/またはプロトコルをさらに含むことができる。
(薬物スクリーニング)
薬物候補または先例をスクリーニングする新たな方法も記載する。これらの方法には、結合アッセイおよび/または機能アッセイが含まれ、インビトロ、細胞系、動物などで行うことができる。本発明の特定の目的は、生物活性化合物を選択する方法であって、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2遺伝子またはポリペプチドと接触させること、および前記IL22RA2遺伝子またはポリペプチドに結合する前記被験化合物の能力を測定することを含む方法にある。前記遺伝子またはポリペプチドへの結合は、前記標的の活性を変調させ、したがって被験者におけるECMPの何らかの異常沈着または線維症につながる経路に影響を及ぼす化合物の能力についての表示をもたらす。好ましい実施形態において、本方法には、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2ポリペプチドまたはその断片と接触させること、および前記IL22RA2ポリペプチドまたは断片に結合する前記被験化合物の能力を測定することが含まれる。断片は、好ましくは、IL22RA2ポリペプチドの結合部位を含む。好ましくは、前記IL22RA2遺伝子もしくはポリペプチドまたはその断片は、変化したまたは突然変異したIL22RA2遺伝子もしくはポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。本発明の特定の目的は、ECMPの何らかの異常沈着または線維症に対して活性な化合物を選択する方法であって、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2ポリペプチドまたは結合部位を含むその断片と接触させること、および前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片に結合する前記被験化合物の能力を測定することを含む方法にある。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。薬物候補のスクリーニング方法は、本発明によるIL22RA2ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を被験化合物と接触させること、および前記IL22RA2に結合してIL22RA2ポリペプチドの活性を変調させる前記被験化合物の能力を測定することを含む。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。結合の測定を様々な技法、例えば、被験化合物の標識、標識された参照リガンドとの競合によって行うことができる。生物活性化合物の選択方法は、インビトロで被験化合物をIL22RA2ポリペプチドと接触させること、および前記IL22RA2ポリペプチドの活性を変調させる前記被験化合物の能力を測定することも含む。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。ECMPの何らかの異常沈着もしくは線維症を有するか、または発症する素因がある被験者のための生物活性化合物を選択する方法は、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2遺伝子と接触させること、および前記IL22RA2遺伝子の発現を変調させる前記被験化合物の能力を測定することも含む。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。
薬物候補または先例をスクリーニングする新たな方法も記載する。これらの方法には、結合アッセイおよび/または機能アッセイが含まれ、インビトロ、細胞系、動物などで行うことができる。本発明の特定の目的は、生物活性化合物を選択する方法であって、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2遺伝子またはポリペプチドと接触させること、および前記IL22RA2遺伝子またはポリペプチドに結合する前記被験化合物の能力を測定することを含む方法にある。前記遺伝子またはポリペプチドへの結合は、前記標的の活性を変調させ、したがって被験者におけるECMPの何らかの異常沈着または線維症につながる経路に影響を及ぼす化合物の能力についての表示をもたらす。好ましい実施形態において、本方法には、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2ポリペプチドまたはその断片と接触させること、および前記IL22RA2ポリペプチドまたは断片に結合する前記被験化合物の能力を測定することが含まれる。断片は、好ましくは、IL22RA2ポリペプチドの結合部位を含む。好ましくは、前記IL22RA2遺伝子もしくはポリペプチドまたはその断片は、変化したまたは突然変異したIL22RA2遺伝子もしくはポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。本発明の特定の目的は、ECMPの何らかの異常沈着または線維症に対して活性な化合物を選択する方法であって、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2ポリペプチドまたは結合部位を含むその断片と接触させること、および前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片に結合する前記被験化合物の能力を測定することを含む方法にある。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。薬物候補のスクリーニング方法は、本発明によるIL22RA2ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を被験化合物と接触させること、および前記IL22RA2に結合してIL22RA2ポリペプチドの活性を変調させる前記被験化合物の能力を測定することを含む。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。結合の測定を様々な技法、例えば、被験化合物の標識、標識された参照リガンドとの競合によって行うことができる。生物活性化合物の選択方法は、インビトロで被験化合物をIL22RA2ポリペプチドと接触させること、および前記IL22RA2ポリペプチドの活性を変調させる前記被験化合物の能力を測定することも含む。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。ECMPの何らかの異常沈着もしくは線維症を有するか、または発症する素因がある被験者のための生物活性化合物を選択する方法は、インビトロで被験化合物を本発明によるIL22RA2遺伝子と接触させること、および前記IL22RA2遺伝子の発現を変調させる前記被験化合物の能力を測定することも含む。好ましくは、前記IL22RA2ポリペプチドまたはその断片は、変化したもしくは突然変異したIL22RA2ポリペプチド、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。
活性化合物、詳細にはECMPの何らかの異常沈着または線維症に対して活性な化合物をスクリーニング、選択または同定する方法は、レポーター構築物であって、IL22RA2遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞と被験化合物を接触させること、およびレポーター遺伝子の発現を変調させる(例えば、活性化する、または阻害する)被験化合物を選択することも含む。好ましくは、前記IL22RA2遺伝子プロモーターまたはその断片は、変化したまたは突然変異したIL22RA2遺伝子プロモーター、または変化もしくは突然変異を含むその断片である。
上記スクリーニングアッセイを任意の適切なデバイス、例えば、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコなどで行うことができる。典型的に、アッセイをマルチウェルプレートで行う。いくつかの被験化合物を並行してアッセイすることができる。さらに、被験化合物は、様々な起源、性質および組成物であり得る。被験化合物は、単離された状態または他の物質との混合物における任意の有機または無機物質、例えば、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などであり得る。化合物は、例えば、生成物のコンビナトリアルライブラリーのすべてまたは一部であり得る。
本発明のさらなる態様及び利点は、次の実施例のセクションにおいて開示されるが、これは、例示とみなされるべきであって、本出願の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
(実施例1)
ヒト住血吸虫感染症におけるIL−22の産生および変調
ヒト住血吸虫感染症におけるIL−22の産生
本発明者らは、日本住血吸虫感染症に曝露された140名の被験者からのPBMCの培養物におけるIL−22レベルと、同じ地域において匹敵する生活条件で生活しているが、以前に住血吸虫感染症に曝露されたことがない20名のコントロールの培養物におけるIL−22レベルとを比較した(図1A)。曝露被験者の静止培養物において、IL−22は、72および144時間の時点で検出され、培養時間0での住血吸虫卵の添加により有意に増大した。コントロール静止培養物において、IL−22は、144時間の時点でしか検出されず、卵の添加により増大しなかった。本発明者らは、144時間培養物において有意なIL−17Aを検出したが、IL−17レベルは、卵刺激により増大しなかった(図1B)。それ故、培養物におけるIL−22は、Th17によって産生された可能性がない。曝露患者の血液におけるIL22+細胞のFACSによる解析により、IL−22がCD3+CD4+およびCD3−CD4−によって産生され、これらのどの細胞集団もIL−17を産生しないことが示された(図1C)。後者は、NK細胞である可能性が高い。コントロールおよび風土病被験者におけるCD3+CD4+IL17−IL22+T細胞およびCD3−CD4−IL17−IL22+のパーセンテージを図1Cに示す。
ヒト住血吸虫感染症におけるIL−22の産生および変調
ヒト住血吸虫感染症におけるIL−22の産生
本発明者らは、日本住血吸虫感染症に曝露された140名の被験者からのPBMCの培養物におけるIL−22レベルと、同じ地域において匹敵する生活条件で生活しているが、以前に住血吸虫感染症に曝露されたことがない20名のコントロールの培養物におけるIL−22レベルとを比較した(図1A)。曝露被験者の静止培養物において、IL−22は、72および144時間の時点で検出され、培養時間0での住血吸虫卵の添加により有意に増大した。コントロール静止培養物において、IL−22は、144時間の時点でしか検出されず、卵の添加により増大しなかった。本発明者らは、144時間培養物において有意なIL−17Aを検出したが、IL−17レベルは、卵刺激により増大しなかった(図1B)。それ故、培養物におけるIL−22は、Th17によって産生された可能性がない。曝露患者の血液におけるIL22+細胞のFACSによる解析により、IL−22がCD3+CD4+およびCD3−CD4−によって産生され、これらのどの細胞集団もIL−17を産生しないことが示された(図1C)。後者は、NK細胞である可能性が高い。コントロールおよび風土病被験者におけるCD3+CD4+IL17−IL22+T細胞およびCD3−CD4−IL17−IL22+のパーセンテージを図1Cに示す。
IL−22産生の変調は、抗住血吸虫処置によって変更され、および肝線維症に応じて変調される。
卵刺激培養物におけるIL−22レベルは、曝露被験者間で顕著に変動した。抗住血吸虫プラジカンテル処置は、ぜん虫を破壊し、再感染が発生するまで産卵を遮断するので、本発明者らは、プラジカンテル処置の差がIL−22産生を変調し得るかどうかを評価した。特定の患者は、少なくとも10年間、毎年処置を受けており、他者は、過去10年間に処置を一度も受けておらず、もう一方の他者は、過去10年間に1〜10回の処置を受けていた。図2Aは、プラジカンテル処置数が、被験者のPBMCによるIL−22産生に対して有意な影響を及ぼしたこと:卵刺激培養物におけるIL−22が過去10年にわたる処置数に伴って有意に増加した(p=0.005、この回帰モデルにおける共変数は性別であったp=0.08)を示す;しかしこの効果は、1年に少なくとも1回、毎年処置を受けた被験体についてははるかに小さかった。おそらく、これらの被験者は再感染しなかったからである(下記参照)。その上、過去10年にわたってのプラジカンテル処置の頻度は、曝露被験者からのPBMCによるIL−22産生に対して有意な影響を及ぼした。そこで、本発明者らは、培養物におけるIL−22レベルが患者の肝疾患の程度と関係があるかどうかを評価した。図22Bは、IL−22が、肝線維症グレードによって測定した場合に軽度肝疾患の被験者において低く、線維症グレードの増加に伴って着実に増加して、中心部門膜周囲線維症が進行した被験者において最大レベルに達したことを示す。これは、IL−22の産生増加が、重度の肝疾患に応答して/関連して発生し得ることを示唆している。しかし、顕著なこととして、極めて重度の肝線維症(HFグレードD、E、F)を有する患者からのIL−22は、多くのIL−22を産生できなかった。
このパターンでのプラジカンテル処置数の効果を図2Cに示す。プラジカンテル処置は、すべての線維症群からの細胞によって産生されるIL−22に影響を及ぼした。3つの観察が本発明者らの研究にとって最も関連がある:第一に、進行線維症(CLH)におけるIL−22産生の増加は、異なるプラジカンテルレジメンで観察されるが、患者の処置の頻度の差には起因しない;第二に、プラジカンテル処置は、重度の線維症グレードを有する被験者からの細胞の培養物の場合を除いてすべての培養物においてIL−22産生を向上させた;第三に、高プラジカンテルレジメン(>10、毎年少なくとも1回)での被験者は、軽度線維症群であり、この群で観察されたIL−22産生の増加の理由の説明となる。要約すると、IL−22は、2つの独立した因子、プラジカンテル処置と肝疾患の程度による影響を受ける。さらに、極めて重度の肝疾患を有する被験者は、多くのIL−22を産生することができず、プラジカンテル処置によって改善されなかったが、その同じ処置に、軽度肝線維症から進行性肝線維症を有する被験者によるIL−22産生に対する顕著な増進効果があった。
IL−6およびおそらくIL−1βは、肝線維症グレードが異なり、かつ処置レジメンが異なる患者においてIL−22産生の重要な調節因子となり得る。
本発明者らは、曝露被験者からのPBMCの24時間培養物における卵刺激により、サイトカインIL−6、IL−1βおよびIL−23が有意に増大される(IL23(p=3.10−6)、IL−6(p<10−6)およびIL−1β(p<10−6))ことを観察した(図3A)。これら3つのサイトカインのいずれかが、IL−22レベルを変調する役割を果たすことができるかどうかを決定するために、本発明者らは、これら3つのサイトカインを含む卵刺激培養物におけるIL−22レベル、患者の年齢および性別に関する線形回帰分析を行った。この分析は、IL−22とIL−6とのより有意な(p=0.0002)関連性およびIL−βとの弱い関連性(p=0.06)を示した。IL−23は、この回帰モデルから除外された。この結果を図3Bおよび3Cに図示し、これらは、プラジカンテル処置に伴うIL−6、IL−1βおよびIL−23の変動(図3B)ならびに肝線維症に伴うIL−6、IL−1βおよびIL−23の変動(図3C)を示す。したがって、プラジカンテル処置とIL−22との間および線維症グレードとIL−22との間の関連因子は、少なくとも一部は、IL−6である。
上に提示した結果は、保護IL−22応答の動員が肝損傷に伴って増加し、最も重度の肝疾患が一部にはかかる応答を動員できない結果になり得るという見解と一致する。この仮説をさらに試験するために、本発明者らは、IL−22が肝線維症のコントロールにおいて実際に重要であること、および肝疾患に対して有意な影響を及ぼすことを示す遺伝学的証拠を検索した。
(実施例2)
日本住血吸虫が風土病である地域で生活している中国人漁師および農民の2つの試料において、IL22 BPをコードするIL22RA2の多型が肝線維症と関連する
日本住血吸虫が風土病である地域で生活している中国人漁師および農民の2つの試料において、IL22 BPをコードするIL22RA2の多型が肝線維症と関連する
材料および方法
統計解析
多変数ロジスティック回帰を用いて、線維症を発症する個体の確率と遺伝子変異体との間の関係を、住血吸虫に感染した被験者における疾患進行に影響を及ぼすことが公知の主な共変数を含めて分析した。統計SPSSソフトウェア(バージョン10.0)をこの分析に使用した。年齢、性別、および感染への曝露を回帰モデルで試験し、それらが疾患との関連性(p<0.05)を示した場合は保持した。コホートを性別および年齢について合せたので、これらの共変数は、遺伝子変異体と疾患との間の関連性に殆ど影響を及ぼさなかった。これらの共変数を中国人漁師(曝露、処置数)または中国人農民(HBV感染症、出生地)の場合のように正確に評価できるときには、HBV感染および感染症への曝露を回帰モデルに含めた。
統計解析
多変数ロジスティック回帰を用いて、線維症を発症する個体の確率と遺伝子変異体との間の関係を、住血吸虫に感染した被験者における疾患進行に影響を及ぼすことが公知の主な共変数を含めて分析した。統計SPSSソフトウェア(バージョン10.0)をこの分析に使用した。年齢、性別、および感染への曝露を回帰モデルで試験し、それらが疾患との関連性(p<0.05)を示した場合は保持した。コホートを性別および年齢について合せたので、これらの共変数は、遺伝子変異体と疾患との間の関連性に殆ど影響を及ぼさなかった。これらの共変数を中国人漁師(曝露、処置数)または中国人農民(HBV感染症、出生地)の場合のように正確に評価できるときには、HBV感染および感染症への曝露を回帰モデルに含めた。
DNA抽出
血液の5〜15mLのアリコートをクエン酸ナトリウムで採取し、−20℃で保持した。標準塩析法(Sambrookら、1989)を用いてDNAを抽出した。
血液の5〜15mLのアリコートをクエン酸ナトリウムで採取し、−20℃で保持した。標準塩析法(Sambrookら、1989)を用いてDNAを抽出した。
DNA増幅
FTAカードから精製したすべてのDNAを遺伝子型同定前に予備増幅した。1パンチの生体試料(FTA1結合口腔細胞DNA)または100ngのゲノムDNAと、1.5ODの15塩基完全変性ランダムプライマー(Genetix、Paris、France)と、200mM dNTPと、5mM MgCl2と、5mLの10x PCRバッファーと、0.5単位の高忠実度Taq DNAポリメラーゼ(BIOTAQ DNA Polymerase、Bioline、London、England)とを含有する50μLの反応系でポリメラーゼ連鎖反応(全ゲノム増幅)を行った。試料をマルチブロックサーモサイクラーで次のように増幅した:94℃で3分の予備変性工程、94℃で1分、37℃2分、1分の勾配(37〜55℃)および55℃で4分からなる50サイクル。72℃で5分の最終伸長工程。
FTAカードから精製したすべてのDNAを遺伝子型同定前に予備増幅した。1パンチの生体試料(FTA1結合口腔細胞DNA)または100ngのゲノムDNAと、1.5ODの15塩基完全変性ランダムプライマー(Genetix、Paris、France)と、200mM dNTPと、5mM MgCl2と、5mLの10x PCRバッファーと、0.5単位の高忠実度Taq DNAポリメラーゼ(BIOTAQ DNA Polymerase、Bioline、London、England)とを含有する50μLの反応系でポリメラーゼ連鎖反応(全ゲノム増幅)を行った。試料をマルチブロックサーモサイクラーで次のように増幅した:94℃で3分の予備変性工程、94℃で1分、37℃2分、1分の勾配(37〜55℃)および55℃で4分からなる50サイクル。72℃で5分の最終伸長工程。
配列決定
ABI Prism自動シークエンサーにおいてABI Prism BioDye Terminatorサイクル配列決定システム(PE Applied Biosystems、Foster City、USA)を用いて、精製PCR産物を配列決定した。両方の鎖の配列決定における配列決定反応は、GATC biotech(GATC、Marseille France)が行った。
ABI Prism自動シークエンサーにおいてABI Prism BioDye Terminatorサイクル配列決定システム(PE Applied Biosystems、Foster City、USA)を用いて、精製PCR産物を配列決定した。両方の鎖の配列決定における配列決定反応は、GATC biotech(GATC、Marseille France)が行った。
特異的TaqManプローブを用いるPCRによる多型遺伝子型同定
TaqManプローブアッセイ(Applied Biosystems、Lafayette USA)を用いて対立遺伝子識別を評価した。各反応系は、5μLの全体積中に1.25ngのゲノムDNA、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems、Lafayette USA)、900nMの各プライマーおよび200nMの各蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを含有した。ABI Prism Sequence Detection System 7900(Applied Biosystems、Lafayette USA)において次の条件を用いてRT−PCRを行った:2分間50℃、10分間95℃、および40増幅サイクル(15秒間の95℃変性、1分間の60℃アニーリング/伸長)。
TaqManプローブアッセイ(Applied Biosystems、Lafayette USA)を用いて対立遺伝子識別を評価した。各反応系は、5μLの全体積中に1.25ngのゲノムDNA、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems、Lafayette USA)、900nMの各プライマーおよび200nMの各蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを含有した。ABI Prism Sequence Detection System 7900(Applied Biosystems、Lafayette USA)において次の条件を用いてRT−PCRを行った:2分間50℃、10分間95℃、および40増幅サイクル(15秒間の95℃変性、1分間の60℃アニーリング/伸長)。
結果
本発明者らは、中国人において10%より大きいマイナー対立遺伝子頻度を有する遺伝子の3’および5’におけるIL22RA2(29.7Kb)および10Kbに含まれるSNPをHapMapデータベース(HapMap data basis)において選択した。図4のように位置する、n=10(ビンI)、5(II)、2(III)、3(IV)、13(V)および3(VI)を含有する6つの相関ビン(r2=0.8)、ならびに4つのシングルトンにこれらのSNPをグループ分けした。本発明者らは、日本住血吸虫が少なくとも40年間風土病である洞庭湖において少なくとも20年間漁をしてきた中国人漁師(n=268、軽度HFを有する176名の被験者および重度HFを有する92名の患者)の試料における各ビンからの1つまたは2つのSNPについて遺伝子型を同定した。本発明者らは、2つのビンに属する3つのSNPがHFと関連性があることを発見した。ビンIにおけるSNP rs6570136 GG(p=0.007、OR=2.7(CI=1.3−5.6))およびrs7774663 TT(p=0.006、OR=2.5(1.3−4.7))の両方、ならびにrs7749054 TT(p=0.045、OR=1.8(1.1−3.1))は、HFといくつかの関連性を示した(表2)。この統計モデルに導入した有意な共変数は、性別(p<10−3、OR=6.9(2.8−17))、曝露(漁業年数)(p=0.05、OR=1.02(1−1.05))、脾摘(p=0.008、OR=6.6(1.6−27))であった。同じ共変数の存在下で同じモデルにおいて2つのSNPを同時に試験する多変数解析は、rs6570136(p=0.007、OR=2.9(1.4−6))の存在下で試験したとき、SNPrs11154915 TCが関連付けられることを示した(=0.04、OR=1.9(1−3.5))。興味深いことに(スーダン人およびブラジル人での研究を参照されたし)、SNP rs 2064501は、HFとの関連傾向を示し、この傾向は、他のSNPが回帰モデルに導入されたときに低減されなかった。
本発明者らは、中国人において10%より大きいマイナー対立遺伝子頻度を有する遺伝子の3’および5’におけるIL22RA2(29.7Kb)および10Kbに含まれるSNPをHapMapデータベース(HapMap data basis)において選択した。図4のように位置する、n=10(ビンI)、5(II)、2(III)、3(IV)、13(V)および3(VI)を含有する6つの相関ビン(r2=0.8)、ならびに4つのシングルトンにこれらのSNPをグループ分けした。本発明者らは、日本住血吸虫が少なくとも40年間風土病である洞庭湖において少なくとも20年間漁をしてきた中国人漁師(n=268、軽度HFを有する176名の被験者および重度HFを有する92名の患者)の試料における各ビンからの1つまたは2つのSNPについて遺伝子型を同定した。本発明者らは、2つのビンに属する3つのSNPがHFと関連性があることを発見した。ビンIにおけるSNP rs6570136 GG(p=0.007、OR=2.7(CI=1.3−5.6))およびrs7774663 TT(p=0.006、OR=2.5(1.3−4.7))の両方、ならびにrs7749054 TT(p=0.045、OR=1.8(1.1−3.1))は、HFといくつかの関連性を示した(表2)。この統計モデルに導入した有意な共変数は、性別(p<10−3、OR=6.9(2.8−17))、曝露(漁業年数)(p=0.05、OR=1.02(1−1.05))、脾摘(p=0.008、OR=6.6(1.6−27))であった。同じ共変数の存在下で同じモデルにおいて2つのSNPを同時に試験する多変数解析は、rs6570136(p=0.007、OR=2.9(1.4−6))の存在下で試験したとき、SNPrs11154915 TCが関連付けられることを示した(=0.04、OR=1.9(1−3.5))。興味深いことに(スーダン人およびブラジル人での研究を参照されたし)、SNP rs 2064501は、HFとの関連傾向を示し、この傾向は、他のSNPが回帰モデルに導入されたときに低減されなかった。
最後に、rs7749054とHFの関連性がSNP rs6570136またはSNP rs7774663いずれかの存在下で完全に失われたので、rs7749054の関連性は、ビンIにおけるSNPとのそのLDに起因する可能性が高かった。
表2.肝線維症と関連性のあるIL22RA2のSNP:中国人漁師での解析
そこで、本発明者らは、日本住血吸虫が風土病である地域からの農民からの第二の中国人試料においてこれらの結果を再現しようと試みた。この試料は、腹水、静脈瘤からの出血および肝硬変を含む重度肝疾患について臨床診療中の外来患者から病院ベースで募集されたので、漁師試料とは異なる。募集患者の92.2%は、日本住血吸虫が依然として風土病である地域で生活しており、7.8%は、住血吸虫が風土病である地域で生活していたが、彼らの地域内での伝染は10〜15年前に中断されていた。これらの被験者の割合(86.5%)は、以前にHBVに感染した証拠があり(20.9%AgHBS+)、一名の患者はHCVに感染していた。したがって、この第二の試料の大部分の農民における肝疾患は、住血吸虫感染症とHBV感染症の両方に起因する可能性が高い。
漁師試料において試験したすべてのSNPを、農民試料(298名、軽度肝疾患の被験者97名および重度肝疾患の被験者201名)で遺伝子型を同定した。肝疾患との関連性が3つの異なるビンからの4つのSNPで観察された:ビンIにおけるSNP rs6570136 GG、GA(p=0.009、OR=2(1.2−3.3))およびrs7774663 TT、TC(p=0.01、OR=2(1.2−3.3)の両方;ビンIVにおけるSNP rs 276466 GA(p=0.01、OR=2.2(1.2−4));ビンVにおけるSNP rs1114915 CC、CT(p=0.04、OR=5.7(1.1−29.6))(表3)。関連性についての傾向は、ビンIIIにおけるSNP rs202563 AA、GG(p=0.06)、およびSNP rs2064501 CT(p=0.08)についても観察された。これらの関連性試験における共変数は、年齢(p=0.05、OR=1.03(1−1.06)、性別(p=0.02、OR=2.3(1.1−4.8)、および患者が風土病地域で生活しているのか/非風土病地域で生活しているのか(p=0.09、OR=2)であった。
異なるビンからのSNPで行った多変数解析は、可能性のある2つの統計モデルを示した:一方のモデルは、ビンIにおけるSNP rs6570136(またはrs7774663)(p=.03、OR=1.8(1.1−3))およびビンVにおけるSNP rs11154915(p=0.1、OR=4(0.8−21.2))を含み;他方のモデルは、SNP rs276466(p=0.02、OR=2(1.1−3.8))およびSNP rs11154915(p=0.05、OR=9.2(1.1−80))を含んだ。この解析は、これら2つのモデル間を識別することができなかった。
表3:肝線維症と関連性のあるIL22RA2のSNP;中国人農民での解析
(実施例3)
マンソン住血吸虫に曝露されたスーダンおよびブラジルからの集団への関連性の拡大
本発明者らの観察をマンソン住血吸虫に感染した被験者に拡大することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、スーダンからの試料およびブラジルからの試料における同じSNPを試験した。再度、中国人農民の場合と同様にスーダン人試料における有意な割合の被験者もHBVに感染したことがあったが、HBVに感染したことのあるブラジル人は殆どいなかった。
マンソン住血吸虫に曝露されたスーダンおよびブラジルからの集団への関連性の拡大
本発明者らの観察をマンソン住血吸虫に感染した被験者に拡大することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、スーダンからの試料およびブラジルからの試料における同じSNPを試験した。再度、中国人農民の場合と同様にスーダン人試料における有意な割合の被験者もHBVに感染したことがあったが、HBVに感染したことのあるブラジル人は殆どいなかった。
スーダン人試料(n=202、144の軽度HFおよび58の重度HF)の遺伝子型を同定することで、SNP rs6570136 GG(p=0.01、OR=3.1(1.3−7.2))、rs7774663 TT、TC(p=0.01、OR=1.7(1−3.1)、rs11154915 TT(p=0.05、OR=6.2(1−35.3))はHFとの関連性を示すが、SNPrs7749054 TT(p=0.07、OR=2(1−3.6)およびrs2064501 CC(p= 0.06、OR=2.7 1−7.3))についても関連性の傾向が検出されることが示された。表4を参照。
表4.中国人において検出された関連性のマンソン住血吸虫に感染したスーダン人への拡大
同様に、ブラジル人試料(n=161、119の軽度HFおよび42の重度HF)においてこれらの同じSNPの遺伝子型を同定することで、SNP rs6570136 GG(p=0.0001、OR=6(2.4−14.7))、rs7774663 TT(p=0.03、OR=3(1.4−6.8))およびSNPrs7749054 TT(p=0.03、OR=2.8(1.2−5.6)についてHFとの関連性が示された。さらに、rs11154915 TT、TCは、HFとの関連性の傾向を示した(p=0.14、OR=2.4(0.9−6.5))。
表5を参照:
表5を参照:
表5.マンソン住血吸虫に感染したブラジル人における関連性の再現
スーダン人試料において多変数解析を行い、SNP rs6570136、20564501および11154915の独立した関連性を確認した。rs11154915と関連性のある高ORがこの多変数モデルにおいて確認されたことは、最も注目に値した。さらに、両方のSNPについての憎悪遺伝子型を有する被験者は、両方のモデルにおいて25より高いHFについてのORを有した。この多変数解析では、SNP rs7749054の関連性がSNP rs6570136の存在下で失われることが示され、この関連性がNSP rs6570136と無関係ではないことを確証した。
要約すると、同じ相関ビンに属するSNP rs6570136 GGおよびrs7774663 TTは、試験した4つすべての試料においてHFと関連性があった。SNPrs11154915 TT、CTおよびrs2064501 CCは、すべての試料においてHFとの関連性の傾向を示した;これらのSNPが、SNP rs6570136とは無関係に作用することを示す多変数解析によって、より重要なこれらの傾向を確認した;これら2つのSNPを考慮に入れて、SNP rs6570136のHFとの関連性の強度が増大した。
(実施例4)
IL22RA2におけるSNPと抗HCV処置に対する応答との関連性
本発明者らは、HCV遺伝子型1または4に感染したか、または感染している123名の被験者(リバビリン+IFNでの処置に対する応答者69名、非応答者54名)に対する遺伝子解析を行った。本発明者らは、Hapmapデータを用いてIL22RA2において同定した7つのビン各々の少なくとも1つのSNPを試験した。一変数解析により、SNPrs2064501(ビンVI、p=0.013)およびSNP rs1543509(ビンVII、p=0.012)との関連性が示され、またSNP rs7774663およびrs6570136(ビンI、p<0.13)、SNP rs77449054(ビンII、p=0.1)、SNP rs202563(ビンIII、p=0.07)、SNP rs28366(ビンIV p=0.15)ならびにSNP rs2064501(ビンVI、p=0.2)との可能性のある関連性も示唆された。処置に対する応答との可能性のある関連性におけるこの多いSNP数は、試験したSNP間の相関関係に起因し得、異なるSNPが互いに対して交絡効果を発揮し得ることも示唆した。そこで段階的多変数解析に着手した。
IL22RA2におけるSNPと抗HCV処置に対する応答との関連性
本発明者らは、HCV遺伝子型1または4に感染したか、または感染している123名の被験者(リバビリン+IFNでの処置に対する応答者69名、非応答者54名)に対する遺伝子解析を行った。本発明者らは、Hapmapデータを用いてIL22RA2において同定した7つのビン各々の少なくとも1つのSNPを試験した。一変数解析により、SNPrs2064501(ビンVI、p=0.013)およびSNP rs1543509(ビンVII、p=0.012)との関連性が示され、またSNP rs7774663およびrs6570136(ビンI、p<0.13)、SNP rs77449054(ビンII、p=0.1)、SNP rs202563(ビンIII、p=0.07)、SNP rs28366(ビンIV p=0.15)ならびにSNP rs2064501(ビンVI、p=0.2)との可能性のある関連性も示唆された。処置に対する応答との可能性のある関連性におけるこの多いSNP数は、試験したSNP間の相関関係に起因し得、異なるSNPが互いに対して交絡効果を発揮し得ることも示唆した。そこで段階的多変数解析に着手した。
すべてのSNPの2つずつの試験により、処置に対する応答とSNP rs202563およびrs6570136の関連性が等価であるが、SNP rs276466およびrs28366がSNP rs6570136による回帰モデルから明確に除外されることが示された。すべての試験により、処置に対する応答とSNP rs1154915の関連性が、この回帰モデルにおいて他のSNP(例えば、SNP rs6570136またはSNP rs2064501またはSNP rs1543509)の存在によって増大することが示された。処置に対する応答とrs6570136の関連性は、SNP rs2064501またはrs1543509の存在下で失われたが、この関連性は、該モデルにSNP rs11154915を加えると(モデル内に3つのSNP)、回復した。SNP rs1154915 TT応答者遺伝子型は、ビンIの非応答者遺伝子型と100%関連性があるので、この回復は、SNP rs11154915とSNP rs6570136(またはビンIにおける任意のSNP)間の強い連鎖不平衡に起因する。そのため、このモデルは、少なくとも3つのSNP(rs11154915(p=0.03)、rs7774663(またはrs6570136、p=0.03)およびSNP rs2064501(p=0.001))を含む必要がある。最後に、SNP rs1543509およびビンIからのSNP(p=0.15)もこのモデルに入る。
要約すると、本発明者らは、IL22RA2における4つの異なるビンに属するSNPが独立して処置に対する応答と関連があることを発見した。重要なことに、TagSNPを試験して得たこれらの結果を同じビンにおける任意のSNPに拡大することができる。したがって、ビンI、V、VIおよびVIIにおけるすべてではないが大部分のSNPが、IFN+リバビリン処置に対して応答する遺伝子マーカーであると予想される。これらの同定したビンうちの3つが線維症の進行と関連性があったことも分かる(ビンVIIにおけるSNPは、まだ線維症に関して試験していない)。興味深いことに、肝線維症を悪化させる大部分の遺伝子型は、処置に対するより良好な応答と関連性がある。
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Claims (3)
- 肝炎ウイルスまたは寄生虫に感染した被験者において肝線維症または肝硬変を発症するリスクのインビトロ決定方法であって、前記被験者の生体試料中のIL22RA2遺伝子座における一塩基多型(SNP)の存在を検出することを含み、前記SNPが、rs6570136、rs7774663、rs11154915およびrs2064501であり、SPN rs6570136についてのG対立遺伝子、SPN rs7774663についてのT対立遺伝子、SPN rs11154915についてのT対立遺伝子、および/またはSPN rs2064501についてのC対立遺伝子の存在が、肝線維症または肝硬変を発症するリスクの指標となる、方法。
- 前記被験者が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)またはマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)に感染している、請求項1に記載の方法。
- 前記SNPの存在が、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび/または選択的増幅、または制限酵素消化によって検出される、請求項1または2に記載の方法。
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