JP2017169571A - 気分障害および自殺を誘発する、薬剤の潜在的なリスクの評価:専用プラットフォームの使用 - Google Patents
気分障害および自殺を誘発する、薬剤の潜在的なリスクの評価:専用プラットフォームの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
−編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2並びに5−HT2C受容体を発現する特定の哺乳類細胞株、特にヒト細胞株を用いて、および
−対照細胞および試験化合物で処理した細胞の間で、
a)これらの編集酵素の活性(細胞RNA抽出物中で測定された5−HT2CRmRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールの分析により得られる);および/または
b)これら編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現(すなわち、Q−PCRによる、またはウェスタンブロットによる)
を比較することにより、
これらの化合物が5−HT情報伝達の慢性的な変化により精神状態が変わる起こり得るリスクを予想できることを明らかにした。
a)哺乳類細胞を含む生体サンプルを得る工程(ここで、前記哺乳類細胞は、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにセロトニン2C受容体(5HTR2C)を発現する);
b)前記哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程;
c)同一の細胞抽出物において、
−細胞RNA抽出物中で測定される5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および/または
−前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的発現
を決定する工程;
d)試験化合物で処理した前記細胞と、非処理の対照細胞または対照化合物に接触させた細胞との間で、工程c)において得られた結果を比較する工程
を含んでなる方法に関する。
a)哺乳類細胞を含む生体サンプルを得る工程(ここで、前記哺乳類細胞は、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2並びに5−HT2C受容体を発現している);
b)前記哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程;
c)同一の細胞抽出物において:
−細胞RNA抽出物において測定される5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および/または、
−前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現
を決定する工程;
d)試験化合物で処理した前記細胞と未処理の対照細胞または対照化合物と接触させた細胞との間で、工程c)で得られた結果を比較する工程;
e)試験化合物が、得たいと望まれるHT2CR編集プロフィールおよび/または編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2活性に変化を示すか、示さないかで、試験化合物を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
−細胞RNA抽出物中で測定される5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および、場合によって、
−前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的発現
を決定することを含んでなる、方法に関する。
−細胞RNA抽出物中で測定される5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および、
−前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的発現
を決定することを含んでなる、方法に関する。
mRNAのかなりの数の編集アイソフォームを発現する能力を有し、これらの細胞において、これらのADAR1a、ADAR1bおよびADAR2酵素が受容体の様々な編集アイソフォームの産生を活発に制御することを示す。
1)5HT2CR、ADAR1およびADAR2酵素、好ましくは、ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2酵素の一定かつ構成的な発現を有し、
2)前記哺乳類細胞が、5HT2CRの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理されたときに、
−かなりの数の5HT2CRの編集アイソフォームを発現させる能力を有し、
−好ましくは、前記哺乳類細胞を5HT2CRの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理したときに、少なくとも編集を受けた編集部位Aを示す少なくとも1種の5HT2CRアイソフォームを、少なくとも編集を受けた編集部位Bを示す少なくとも1種の5HT2CRアイソフォームを、少なくとも編集を受けた編集部位Cを示す少なくとも1種の5HT2CRアイソフォームを、少なくとも編集を受けた編集部位Dを示す少なくとも1種の5HT2CRアイソフォームを、および少なくとも編集を受けた編集部位Eを示す少なくとも1種の5HT2CRアイソフォームを、好ましくは、非編集の5HT2CRアイソフォームと共に発現する能力を有し、
−より好ましくは、すべての5HT2CRの編集および非編集アイソフォームを発現することができる。
a)5HT2CR、ADAR1およびADAR2酵素、好ましくは、ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2酵素の一定かつ構成的な発現を有し、
b)−前記哺乳類細胞を5HT2CRの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理したときに、かなりの数の5HT2CR編集アイソフォーム、好ましくは、すべての5HT2CR編集アイソフォームを発現する能力を有する{ここで、5HT2CRの編集を変化させる能力を有する薬剤が、科学者の共同体および/または米国食品医薬局(FD)から、精神のまたは精神神経性の副作用などの、前記薬剤を与えられた一部の患者における副作用のリスクについての警告を呈する既知の薬剤であって、この変化がこの警告と関連しうる}。
a)細胞RNAにおいて測定される5−HT2cR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率(%)、好ましくは±SEM(n≧3、4、5および6)、または、少なくとも、工程c)におけるシグネチャと関連して選ばれる編集部位(A、B、C、Dおよび/またはE編集部位)に対応するアイソフォームのセットの平均比率、または、少なくとも、対照および/または基準で処理したサンプルにおいて見いだされ、かつ、工程c)におけるシグネチャと関連して選ばれる編集部位(A、B、C、Dおよび/またはE編集部位)に対応する主要なアイソフォームの平均的比率を決定する工程;
b)場合によって、対照群および場合によって基準群、好ましくは基準の薬剤で処理した群と比較したときに、代数学的なデルタの関数においてこれらのアイソフォームを分類する工程;
c)編集酵素の活性に関連する重要なシグネチャを、好ましくは、酵素活性の産物の分類によって、より好ましくは、A、B、C、D、およびE編集部位から選択される少なくとも、2、好ましくは、3、または4の編集部位の編集のパーセンテージを算出し、関連づける方法によって、より好ましくは、そのシグネチャの各部において見いだされるそれぞれの編集部位の編集のパーセンテージを算出し、関連づける方法によって、決定する工程;並びに
d)場合によって、ADAR1の作用(ADAR I)またはADAR2(ADAR II)と関連した、すべてのアイソフォームまたは選択されたアイソフォームにより表される%を測定することによって、発現した活性を分類する工程。
マウスまたはラット哺乳類細胞株の場合:
順方向:5’−TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC−3’(配列番号1)、
逆方向:5’−GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC−3’(配列番号2);
ヒト細胞株の場合:
順方向:5’−TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC−3’(配列番号1)、
逆方向:5’−GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC−3’(配列番号2);
かつ、2段階目のPCRは以下のプライマーセットにより行われる:
マウスまたはラット哺乳類細胞株の場合:
順方向:5’−TTTGTGCCCCGTCTGGAT−3’(配列番号5)、
逆方向:5’−GCCTTAGTCCGCGAATTG−3’(配列番号6);
ヒト細胞株の場合:
順方向:5’−ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC−3’(配列番号3)、
逆方向:5’−GCAATCTTCATGATGGCCTTA−3’(配列番号4)。
A)前記哺乳類細胞から全RNAを抽出する工程(適切な場合にはその後mRNAの精製を行う);
B)工程A)で抽出されたRNAを逆転写する工程;および
C)編集されうる編集部位を含む5HTR2C mRNA断片に特異的な少なくとも1対のプライマーであって、RNA抽出物中に存在しうるすべての編集形態および非編集形態を増幅できるように選択されたプライマーを用いて、工程B)で得られたcDNAをPCR増幅する工程。
A)前記哺乳類細胞から全RNAを抽出する工程(適切な場合にはその後mRNAの精製を行う);
B)工程A)で抽出されたRNAを逆転写する工程;および
C)編集されうる編集部位を含む5HTR2C mRNA断片に特異的な少なくとも1対のプライマーであって、RNA抽出物中に存在しうるすべての編集形態および非編集形態を増幅できるように選択されたプライマーを用いて、工程B)で得られたcDNAをPCR増幅する工程
{ここで逆転写の工程B)は、5HTR2C遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる}。
D)適切な場合には、工程C)で得られたPCR産物を精製する工程;
E)適切な場合には、工程D)で得られたPCR産物を定量する工程;
F)二本鎖cDNAを、具体的には加熱およびその後の急激な冷却により、一本鎖cDNAに解離させる工程;
G)一本鎖cDNAをキャピラリー電気泳動により分離する工程;並びに
H)蛍光の読み取りにより編集プロフィールを得る工程、および適切な場合には、蛍光リーダーに付随したオペレーティングシステムを用いてプロフィールデータを取得する工程。
−ヒトADAR1−150アイソフォームmRNA増幅:
順方向:5’−GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC−3’(配列番号7)、
逆方向:5’−CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG−3’(配列番号8);
−ヒトADAR1−110アイソフォームmRNA増幅:
順方向:5’−CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC−3’(配列番号9)、
逆方向:5’−CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC−3’(配列番号10);
−ヒトADAR2 mRNA増幅:
順方向:5’−GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC−3’(配列番号11)、
逆方向:5’−GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC−3’(配列番号12);
−マウスADAR1−150アイソフォームmRNA増幅:
順方向:5’−GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC−3’(配列番号13)、
逆方向:5’−CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC−3’(配列番号14);
−マウスADAR1−110アイソフォームmRNA増幅:
順方向:5’−TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG−3’(配列番号15)、
逆方向:5’−CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC−3’(配列番号14);および
−マウスADAR2 mRNA増幅:
順方向:5’−GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC−3’(配列番号16)、
逆方向:5’−GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC−3’(配列番号17)。
a)細胞株由来の哺乳類細胞であって、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2並びにセロトニン2C受容体(5HTR2C)を発現する哺乳類細胞;並びに
b)前記哺乳類細胞のRNA抽出物中に存在しうる5−HT2CR mRNAの各アイソフォームを、2段階のPCRを含んでなるネステッドPCRを伴うCE−SSCP法により測定するための2セットのプライマー;および/または
c)編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的発現を、定量的Q−PCRにより測定するための1セットのプライマー
を含んでなるキットに関する。
a)前記処置患者由来の哺乳類白血球、好ましくは、白血球または単球細胞を含む生体サンプルを得る工程;
b)ヒト白血球を含む前記生体サンプルの細胞抽出物中で、各編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現、並びに、場合によって、細胞RNA抽出物中に存在抽出物中で測定される5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールを決定する工程;
d)前記IFNα処理患者由来の前記細胞と、非処理対照細胞または対照化合物で処理した細胞との間で、工程b)で得られた結果を比較する工程(IFNα処理細胞は、事前にIFNα処理の最初にまたは最中に同一の患者から得た)
を含んでなる方法に関する。事前にIFNαで処理した細胞は、IFNα処置の初期の、または処置中の同一の患者から取得した。
(a)哺乳類細胞株(好ましくは、本発明の方法のために描写された特徴を有するこれらの細胞株)、好ましくは、神経芽細胞細胞株、より好ましくは、SH−SY5Y細胞株上で、5HT2CRの編集を変化させるそれらの能力に基づいて、心理学的または神経心理学的な効果などの毒性若しくは副作用を有する、または有しないと知られている化合物をスクリーニングする工程;
(b)前記スクリーニングに基づいて、基準パネルのメンバーを選択する工程であって、前記パネルが、5HT2CRの編集を変化させるそれらの能力に関して異なっており、かつ、場合によって、それらの毒性または副作用に関して異なっていても良いメンバーを含んでなる、工程;
(c)前記5HT2CRの編集に関して未知の活性の試験化合物をスクリーニングし、5HT2CRの編集の変化に対するその影響を決定し、それにより前記試験化合物に対する5HT2CRの編集プロフィールと、場合によって、ADARの発現とを得る工程;
(d)前記試験化合物と前記基準パネルとに対する5HT2CRの編集プロフィールおよび、場合によって、ADARの発現を比較する工程;
(e)試験化合物により引き起こされる5HTR2Cの編集の変化が基準化合物の変化と同じであるとの推定に基づいて、試験化合物の潜在的な毒性を予測し、または5HTR2CのmRNA編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な有望な治療化合物として試験化合物を選択する工程であって、5HT2CRの編集プロフィールおよび場合によってADARの発現を変化させるそれらの能力に基づいて前記哺乳類細胞上でスクリーニングする工程が、請求項1〜15におけるような、上記の本発明の方法のために描写されたイン・ビトロの細胞ベースアッセイである点で同じである、工程
を含んでなる、方法にも関する。
10種の異なる細胞株から、下記の条件で用いたときに最も興味深いものとしてSH−SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞株を選択した。
薬剤またはhIFNα処理の前日に、SH−SY5Y細胞を6ウェルプレートに106細胞/ウェルの濃度で播種した。一つの6ウェルプレートを一つの実験条件で用いた(濃度または処理時間)。播種の翌日に、培地を取り除き、細胞を10μMの試験化合物溶液または1000IU/mlのhIFNα(PBLバイオメディカルラボラトリーズ社製)溶液で24時間インキュベートした。hIFNαの用量応答実験のために、細胞を1、10、100および1000IU/mlのhIFNα溶液でインキュベートした。hIFNαのタイムコース実験のために、細胞を1000IU/mlのhIFNα溶液で24、48および72時間処理した。様々な処理の後で、細胞をRLT溶解緩衝液内に直接溶解し、全RNAを製造者のプロトコルに従って精製した(キアゲン社製、RNeasy Plus miniキット、参照番号:74134)。その後、Thermoscript RT−PCRシステムPlusTaq(インビトロジェン社製、11146−032)で全RNAを逆転写し、得られたcDNAをCE−SSCPおよび定量的リアルタイムPCRに用いた。
mIFNαの実験のために、8匹の雄(Balb/cJマウス、チャールズ・リバー社製)に10000IUのmIFNα(PBLバイオメディカルラボラトリーズ社製)を一度にi.p.経路で注射した。対照マウスは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で同じ経路で注射した。注射の8時間後に、動物を断頭し、全血液、腹側の皮膚および脳を回収した。全RNAを、血液の場合は、マウスRiboPure血液RNA単離キット(Ambion社製、参照番号:1951)で、皮膚の場合は、組織破壊後にTRIzol試薬(インビトロジェン社製、参照番号:15596−026)で、脳の場合は、RNeasy 脂質miniキット(キアゲン社製、参照番号:74804)を用いて精製した。その後、全RNAをThermoscriptRT−PCRシステムPlusTaq(インビトロジェン社製、11146−032)を用いて逆転写し、得られたcDNAをCE−SSCPおよび定量的リアルタイムPCRに用いた。SSCP決定に用いた方法は、マウスおよびヒトサンプルに関して既に記載されている(2008年6月13日に出願された特許PCT/EP2008/057519)。
製造者の説明書に従って、全RNAを組織または細胞抽出物から抽出し、精製した(キアゲン社製 RNeasy、Miniキット)。GeneQuant分光光度計(ファルマシアバイオテク社製)を用いて260nmでの吸光度および260/280nmの比率の両方を測定し、抽出したRNAの量と純度を評価した。ゲノムDNAによるコンタミネーションの可能性を排除するために、その後、8μlのRNA(88ng〜1.3μg)の各々を、1ユニットのDNaseI(インビトロジェン社製)で、最終容量10μlで室温で15分間処理した。反応は、1μlの25mM EDTAを添加することにより停止させ、その後、65℃で10分間加熱した。15ユニットのThermoScript逆転写酵素(ThermoScript RT−PCRシステム、インビトロジェン社製)および最終濃度2.5μMのオリコ(dT)プライマーを用いて、DNaseIで処理したRNA(10μl)の逆転写を行った。
1μlの50分の1希釈のRT−1段階目PCR産物、または、ヒト5−HT2cR(若しくは5HT2CR)のアイソフォームの32種のスタンダードを持つプラスミドから増幅した250bpのcDNAを、追加のネステッドPCR用のテンプレートとして用いた。これら32のスタンダードは、ヒト5−HT2cRの非編集(NE)および編集アイソフォームに対応する。HPLC精製した蛍光プライマー(順方向プライマー:FAM−ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC−3’(配列番号3)、逆方向プライマー:VIC−GCAATCTTCATGATGGCCTTA−3’(配列番号4);最終濃度各0.2μM)および0.2ユニットのプラチナpfxDNAポリメラーゼ(インビトロジェン社製)を用いて、最終容量20μlで増幅を行った。
電気泳動シグナルは、その後、社内ソフトウェアを用いて処理した。最初に、各サンプルの電気泳動プロフィールの時間の基準を、泳動スタンダードであるROX標識スタンダードを用いて調整した。これにより、FAM−およびVIC標識鎖で、特有の時間の基準でスタンダードとサンプルのシグナルを正確に逆重畳積分することが可能となる。その後、バックグラウンドを調整し、差し引いて、各シグナルの下で全領域を標準化した。
であるとの仮定に基づいて行われた。最適なフィッティングは、エラー(SSE)
で表されるr2値の算出の後に統計的に評価された。最高の理論上最適なフィッティングであれば、r2=1が得られる。
これらの初期値が、統計分析に用いられた。
非処理マウスまたは細胞からのサンプルのΔCtの平均値が決定され、処理された動物または細胞に対応するサンプルのための基準点として用いられた。個々の変動を含む、未処理と処理の動物または細胞との差異は、等式(ΔCt(処理された個々のサンプル)−ΔCt(未処理サンプルの平均)=ΔΔCt)により算出した。各サンプルにおける標的遺伝子の発現の変化(n倍)は、2−ΔΔCtにより算出され、平均と標準偏差(SD)はここから導出した。
a−選択の判断基準 分子のイン・ビトロでのスクリーニングに相応しいものとするために、細胞株を下記の主要な点で確認しなければならない:
−ヒト起源であること;
−対照の条件において、編集プロフィールの再現性のある評価を可能とする範囲で5−HT2cR受容体を発現すること;
−比較的定常状態において、ヒト脳における通常の皮質構造で見られるものと類似した編集酵素を発現すること。
様々な10種の細胞株の中で、下記の条件で用いるときに最も興味深いものとしてSH−SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞株を選択した。
RQ(相対的定量)は、供給者により記載された通りに算出した。各組織または細胞株において、ADAR1a遺伝子の発現を基準として取得し、そのRQを1とした。
タンパク質抽出物を、12%アクリルアミド変性ゲル上でSDS−PAGEにより分離し、PROTRAN BA85ニトロセルロース膜(ワットマン社製、参照番号:10 401 197)に転写した。ADAR1タンパク質の検出のために、ニトロセルロース膜をL−15アフィニティー精製済みヤギポリクローナル抗体(サンタクルーズ社製、参照番号:sc−19077)でブロットした。構成的(p110)および誘導性(p150)ADAR1アイソフォームの両方に対応するバンドを矢印で示す。タンパク質スタンダード(プレシジョンPlusタンパク質スタンダード、バイオラッド社製、参照番号:161−0363)が、同様に示されている。目的のタンパク質に対応するバンドは、Li−Cor Odissey装置によりスキャンし、MCIDソフトウェアを用いて更に定量した(図5参照)。各スキャンおよび各実験条件で得られた光学密度を括弧内に示す(表6参照)。変換により、未処理細胞におけるADAR1aアイソフォームのODを基準として取得し、1とした。
上記で示されたように、主にC型肝炎を処置するためのインターフェロンアルファの処置は、多くの患者(30〜50%)において深刻な気分の変化を引き起こしうる。従って、この分子はADAR1のADAR1a誘導性アイソフォームの強力な誘導剤であることが知られているので、本発明者らが選択した細胞株でINFαの効果を分析することは興味深い。
本発明者らは、気分変化および自殺リスクに関するFDAの警告の対象となっている、またはなっていない様々なクラスの典型的な分子にこの種の成分分析を用いることを決定した。培養したSH−SY5Y細胞に対して、それらの各々を10μMの濃度で48時間適用した後に、編集プロフィールのイン・ビトロ スクリーニングを行った。5−HT2c mRNAの編集プロフィールの分析は、上記と同じ成分のセットを用いて行い、分析した(図3参照)。
Claims (21)
- 試験化合物の患者への投与の後に、試験化合物の潜在的な毒性または副作用を決定するためのイン・ビトロの方法であって、
a)哺乳類細胞を含む生体サンプルを取得する工程(ここで、前記哺乳類細胞が、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2並びにセロトニン2C受容体(5HTR2C)を発現している)、
b)前記哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程、
c)同一の細胞抽出物において:
−細胞RNA抽出物において測定される5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および/または、
−前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現
を決定する工程、
d)試験化合物で処理した前記細胞と非処理の対照細胞との間で、工程c)で得られた結果を比較する工程
を含んでなる、方法。 - s5HTR2CのADAR依存性A−to−I mRNA編集のmRNA編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法であって、
a)哺乳類細胞を含む生体サンプルを取得する工程(ここで、前記哺乳類細胞が、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2並びに5−HT2C受容体を発現している)、
b)前記哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程、
c)同一の細胞抽出物において:
−細胞RNA抽出物において測定される5−HT2CRのmRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および/または、
−前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現
を決定する工程、
d)試験化合物で処理した前記細胞と未処理の対照細胞との間で、工程c)で得られた結果を比較する工程
を含んでなる、方法。 - 工程c)において、5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの編集プロフィールと、前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現とが、同一の細胞抽出物において決定される、請求項1または2に記載の方法。
- 工程c)において、5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの編集プロフィールと、前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現とが、同一の細胞抽出物において決定される場合に、それらが同一の全RNA細胞抽出物において決定される、請求項3に記載の方法。
- 工程c)において、編集プロフィールの決定結果の分析により、これらの編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の活性指数の取得が可能になる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において、前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現が、前記編集酵素のmRNA発現の測定または細胞抽出物において発現する前記編集酵素タンパク質の測定により決定される、請求項1〜3または5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)において、前記哺乳類細胞が、細胞株、特に、ヒト、マウスまたはラット由来であって、5HT2CR、ADAR1およびADAR2酵素、好ましくは、ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2酵素、の一定かつ構成的な発現を示す細胞株である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)において、前記哺乳類細胞が、5HT2CRの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理されたときに、少なくとも編集部位Aが編集された少なくとも1種の5HT2CRアイソフォーム、少なくとも編集部位Bが編集された少なくとも1種の5HT2CRアイソフォーム、少なくとも編集部位Cが編集された少なくとも1種の5HT2CRアイソフォーム、少なくとも編集部位Dが編集された少なくとも1種の5HT2CRアイソフォームおよび少なくとも編集部位Eが編集された少なくとも1種の5HT2CRアイソフォーム、好ましくは、編集された5TH2CRのすべてのアイソフォームを発現する能力を更に有する、請求項7に記載の方法。
- 工程a)において、前記哺乳類細胞が、神経芽細胞腫細胞株、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞株由来である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)において、前記哺乳類細胞が、ヒト神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞株である、請求項9に記載の方法。
- 前記試験化合物の投与後の患者における潜在的な毒性若しくは副作用、またはs5HTR2CのmRNA編集の変化に関連する処置された病状が、精神疾患、統合失調症、うつ病、うつ病による自殺または異常摂食行動からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)において、前記哺乳類細胞が、前記哺乳類細胞の培養に適した培地において試験化合物の存在下で培養される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)において、5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの編集プロフィールおよび/または前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現を同一の細胞抽出物において決定する工程c)の前に、前記哺乳類細胞を試験化合物の存在下で、少なくとも1時間、好ましくは、少なくとも5、10、16、24時間培養する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において、細胞RNA抽出物において測定される5−TH2CR mRNAの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールが、2段階PCRを含んでなるネステッドPCRを伴うCE−SSCP法により測定され、かつ、1段階目のPCRが、
マウスまたはラット哺乳類細胞株の場合:
順方向:5’−TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC−3’、
逆方向:5’−GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC−3’
ヒト細胞株の場合:
順方向:5’−TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC−3’、
逆方向:5’−GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC−3’
のプライマーセットにより行われ、かつ、
2段階目のPCRが、
マウスまたはラット細胞株の場合:
順方向:5’−TTTGTGCCCCGTCTGGAT−3’、
逆方向:5’−GCCTTAGTCCGCGAATTG−3’;および
ヒト細胞株の場合:
順方向:5’−ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC−3’、
逆方向:5’−GCAATCTTCATGATGGCCTTA−3’
のプライマーセットで行われる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 工程c)において、ADAR mRNAのPCR増幅に特異的な1対のプライマーが、−ヒトADAR1−150アイソフォームmRNAの増幅の場合:
順方向:5’−GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC−3’
逆方向:5’−CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG−3’
−ヒトADAR1−110アイソフォームmRNAの増幅の場合:
順方向:5’−CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC−3’
逆方向:5’−CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC−3’
−ヒトADAR2 mRNAの増幅の場合:
順方向:5’−GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC−3’
逆方向:5’−GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC−3’
−マウスADAR1−150アイソフォームmRNAの増幅の場合:
順方向:5’−GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC−3’
逆方向:5’−CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC−3’
−マウスADAR1−110アイソフォームmRNAの増幅の場合:
順方向:5’−TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG−3’
逆方向:5’−CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC−3’および
−マウスADAR2 mRNAの増幅の場合:
順方向:5’−GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC−3’
逆方向:5’−GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC−3’
から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 試験化合物の潜在的な毒性を予測する、または、セロトニン2C受容体(5HTR2C)のADAR依存性A−to−I mRNA編集のmRNA編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法であって、
(a)哺乳類細胞株(好ましくは、本発明の方法のために描写された特徴を有するこれらの細胞株)、好ましくは、神経芽細胞腫細胞株、より好ましくは、SH−SY5Y細胞株上で、5HT2CRの編集を変化させる能力に基づいて、化合物をスクリーニングする工程であって、これらの化合物が毒性若しくは副作用を有する、または有しないと知られている、工程;
(b)前記スクリーニングに基づいて、基準パネルのメンバーを選択する工程であって、前記パネルが、5HT2CRの編集を変化させるそれらの能力に関して異なっており、かつ、場合によって、それらの毒性または副作用に関して異なっていても良いメンバーを含んでなる、工程;
(c)前記5HT2CRの編集に関して未知の活性の試験化合物をスクリーニングして、5HT2CRの編集の変化についてその影響を決定し、それにより前記試験化合物に対する5HT2CRの編集プロフィールと、場合によって、ADARの発現とを得る工程;
(d)前記試験化合物と前記基準パネルとに対する5HT2CRの編集プロフィールおよび、場合によって、ADARの発現を比較する工程;
(e)試験化合物により引き起こされる5HTR2Cの編集の変化が基準化合物のそれと同じであるとの推定に基づいて、試験化合物の潜在的な毒性を予測し、または5HTR2CのmRNA編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な潜在的治療化合物として試験化合物を選択する工程
を含んでなり、
5HT2CRの編集プロフィールおよび場合によってADARの発現を変化させるそれらの能力に対して前記哺乳類細胞上でスクリーニングする工程が、請求項1〜15の工程c)に対応し、かつ、5−HT2CR mRNAの同定された各アイソフォームの編集プロフィールおよび前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的な発現が決定される、方法。 - 化合物を試験するに適した動物モデル、好ましくはマウスまたはラットにイン・ビボでその試験化合物を更に投与し、かつ、全血液および/または皮膚サンプル、または脳における5HTR2CのmRNA編集、および/または、発現したADARアイソフォームの変化を決定することにより、この動物モデルにおけるその投与の後のこの試験化合物の潜在的な毒性または副作用を評価する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 患者への試験化合物の投与後に試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用を決定するための、または、5HTR2CのADAR依存性A−to−I mRNA編集のmRNA編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのキットであって、
(a)編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2、ならびにセロトニン2C受容体(5HTR2C)を発現する、細胞株に由来する哺乳類細胞;および
(b)2段階PCRを含んでなるネステッドPCRを伴う定量的(Q)PCRにより、前記哺乳類細胞のRNA抽出物に存在する5−HT2CR mRNAの各アイソフォームを測定するための2セットのプライマー;ならびに、場合により、
(c)定量的Q−PCRにより、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の定量的発現を測定するための1セットのプライマー
を含んでなる、キット。 - 前記哺乳類細胞が、神経芽細胞腫細胞株由来、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞株由来であり、より好ましくは、ヒト神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞株である、請求項18に記載のキット。
- 前記哺乳類細胞が、神経芽細胞腫細胞株由来、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞株由来であり、より好ましくは、ヒト神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞株である、請求項18に記載のキット。
- 請求項16のb)において選択された基準パネルおよび/または前記基準パネルに対する5HT2CRの編集プロフィールならびに場合によりADARの発現を更に含んでなる、請求項18〜20のいずれか一項に記載のキット。
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