JP2017160149A - 美容組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】
紫外線照射時のMMP−1産生抑制に加えて、細胞生存率も向上させることにより、総合的に皮膚の光老化を防止する物質を探索し、その用途を提供する。
【解決手段】
本発明は、FT−IR法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数3362,2875,1675,1559,1360,1200,1047及び835cm−1に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物、並びに化粧品学的、皮膚病学的及び/又は薬学的に許容される添加剤を含む美容組成物である。
【選択図】図1

Description

本発明は、美容組成物に関し、より詳細には皮膚の光老化現象を防止又は改善するための美容組成物に関する。
皮膚は、主として表皮、真皮及び皮下組織に分けられる。真皮は、表皮の基底層の下に位置し、コラーゲン及びエラスチンからなるタンパク質繊維と基質とからなる厚さ2mmの層である。真皮にあるコラーゲンは、真皮細胞外マトリックスの70〜80%(乾燥重量)を占め、その90%以上がI型コラーゲンである。コラーゲンは、皮膚にハリを与えるとともに、エラスチンを支える役目を果たす。エラスチンは、2%程であるが、皮膚に弾力を持たせる。タンパク質繊維の間を満たす基質は、プロテオグリカンやヒアルロン酸といった細胞外マトリックス成分である。
紫外線、乾燥等の外的要因が、皮膚組織から水分や細胞外マトリックス(コラーゲン、ヒアルロン酸等)を減少させ、皮膚の表皮や真皮の機能を低下させる。皮膚は、長期間の屋外作業等において紫外線に曝されることで、シワ、タルミやシミといった皮膚の老化現象を生じる。このような皮膚の老化を、加齢によるものと区別するために、光老化と呼んでいる。紫外線の長期暴露によってI型コラーゲンが顕著に減少することが報告されている(非特許文献1及び2)。I型コラーゲンの減少は、皮膚のはりに大きく関与する。また、真皮細胞外マトリックスの2〜4%(乾燥重量)を占める弾力線維エラスチンは、紫外線で暴露されると、弾力線維の網目構造の消失、無定型エラスチンの増加等の変化が認められている(非特許文献1及び3)。
紫外線には190〜290nmの短波長紫外線(UVC)、290〜320nmの中波長紫外線(UVB)及び320〜400nmの長波長紫外線(UVA)がある。皮膚組織とUVBとの関わりについては、in vitro実験において、UVB照射による細胞の脂質の過酸化(非特許文献4)、DNAの損傷(非特許文献5)等が知られている。細胞外マトリックス成分に注目すると、UVAの暴露が、線維芽細胞のコラーゲン合成能を減少させ(非特許文献6)、そして細胞外マトリックス成分分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ(Matrix meta11oproteinase、MMP)のmRNA発現を促進することが報告されている。このように、光老化現象は、長期の紫外線暴露等により、MMPの活性と発現量が増加し、細胞外マトリックス成分のコラーゲンの崩壊や減少を引き起こされると考えられる。
上記したように、紫外線暴露によるMMP−1コラゲナーゼの活性化と産生量の増大が光老化現象を招く一因であることから、発明者は、紫外線暴露により活性が上昇するMMP−1の産生を抑制する物質を探索することが、光老化による真皮マトリックスの構造変化を阻止するのに有効であると考えた。そこで、本発明者は、皮膚組織での挙動に近いとされる皮膚3次元モデルを用いて、MMP−1産生抑制効果を有する物質を探索した。
その結果、腐植酸、特にフルボ酸には、後述するように、MMP−1産生抑制効果があることが確認された。腐植は、主として、土壌中で植物残渣や微生物遺体の中の炭水化物及びタンパク質は、微生物によって分解され、その分解産物が縮合してできる重合体である。腐植には、フルボ酸やフミン酸といった無定形の重合体が含まれている。フミン酸は、アルカリに可溶であって酸に不溶な赤褐色ないし黒褐色無定形高分子有機酸である。一方、フルボ酸は、アルカリ及び酸に可溶な無定形高分子有機酸である。
H.Tanaka et.al.,Arch.Dermatol.Res.,285,352−355(1993) G.Herrmann et.al.,Exp.Dermatol.,Vol. 2,p92−97(1993) J.Uitto,Dermatol.Clin.,4(3),p433−446(1986) R.Hirose et.al., J.Invest.Dermatol.,Vol.90,No.5, p697−702(1988) B.Tebbe et.al., J.Invest.Dermatol.,Vol.108,No.3,p302−306(1997) J.Uitto,et.al., J.Am.Acad.Dermatol.,Vol.3,No.5,p441−461(1980)
本発明者は、後述する比較例1及び2に示すように、腐植抽出物の一種であるフルボ酸が、紫外線暴露時のMMP−1産生抑制効果を有しても、皮膚細胞の生存率の向上につながらないことがあることを知見した。光老化現象を抑止するためには、MMP−1産生抑制効果とともに、紫外線照射により発生する活性酸素がもたらす細胞毒性を緩和することも重要である。すなわち、光老化の防止物質は、紫外線暴露によるMMP−1産生を抑制するだけでなく、皮膚細胞の生存率を向上させることが極めて重要である。そこで、本発明の目的は、紫外線暴露時のMMP−1産生抑制に加えて、細胞生存率も向上させることにより、総合的に皮膚の光老化を防止する物質を探索し、その用途を提供することにある。
本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、特定波数(波長)赤外吸収によって規定されるフルボ酸を含有する腐植抽出物には、MMP−1産生抑制効果に加えて、細胞生存率も向上させることを発見した。この知見に基づいて、本発明者は、上記課題を解決した。すなわち、本発明は、FT−IR法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数3362,2875,1675,1559,1360,1200,1047及び835cm−1に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物、並びに化粧品学的、皮膚病学的及び/又は薬学的に許容される添加剤あるいは食品添加物を含む美容組成物を提供する。腐植物質の一種であるフルボ酸は多種多様な分子構造と置換基を有するところ、本発明で特定した赤外線吸収スペクトルで特徴づけられるフルボ酸には、紫外線暴露時のMMP−1の産生を抑制する効果とともに、活性酸素の発生を抑止しあるいは発生した活性酸素を速やかに除去して皮膚の細胞生存率を向上させる機能を有する。
前記腐植抽出物は、より特定的には、図1に示す赤外線吸収スペクトルを示すフルボ酸を含有する。
前記腐植抽出物は、ナフタレン環構造を有さないことが好ましい。
前記腐植抽出物中のフルボ酸の平均分子量は、4,000よりも小さいことが好ましい。
前記美容組成物は、皮膚の光老化防止に用いることが好ましい。
前記光老化の防止は、特にMMP−1の産生を抑制し、かつ皮膚細胞の細胞生存率を向上させることを特徴とする。
本発明の美容組成物は、経皮投与用であることが好ましい。
前記経皮投与用の美容組成物の形態は、例えば水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム又は粉体である。
本発明の美容組成物は、また、経口投与用であることが好ましい。
前記経口投与用の美容組成物の形態は、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤又はシロップである。
特定の赤外線吸収波長によって規定されるフルボ酸を含有する腐植抽出物を含有する本発明の美容組成物によれば、紫外線暴露時のMMP−1の産生を抑制するとともに、皮膚細胞の生存率を顕著に高める。本発明の美容組成物は、紫外線照射により発生する皮膚の光老化現象、例えば皮膚のタルミ、シワ、コジワ、クマ、シミ、肌荒れ等の防止や改善に有効である。
実施例1で使用した腐植抽出物(製品名:ヒューミクル(登録商標))のフルボ酸分画のATR法に基づくFT−IR吸収スペクトルの図である。 比較例1に示す、段戸森林土壌から抽出精製されたフルボ酸及びフミン酸のATR法に基づくFT−IR吸収スペクトル図である。 実施例1で使用した腐植抽出物の4%水溶液の3次元蛍光スペクトル図である。 比較例1で使用した段戸産フルボ酸の水溶液(濃度10μg/mL)及び段戸産フミン酸の水溶液(濃度10μg/mL)の3次元蛍光スペクトル図である。
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明の美容組成物には、上記した赤外線吸収ピークを有する腐植抽出物を使用することを必須とする。腐植抽出物は、上記の赤外線吸収特性を有するものであれば、その由来を問わない。この赤外線吸収スペクトルを有する腐植抽出物は、例えば、米国ユタ州エメリー郡にある古代植物堆積層(頁岩層)であるヒューミックシェール(humic shale)から得られる。ヒューミックシェールは、約7,000〜1億2,700万年前の多くの栄養素が含まれた肥沃な土壌が石油や石炭に変性することなく、有機物として残存したものである。前記時代に生息した植物が、氷河期に入ると地下に埋没し、バクテリア等の微生物によってピートモスに変化し、その上に新しい有機物が積み重なって、再度、バクテリア等で分解され、時間の経過とともに堆積層を形成したものである。形成された堆積層に含まれる腐植には、フルボ酸、フミン酸といった有機高分子重合体からなる主成分とし、70種以上の微量のミネラルを含有する。
腐植抽出物は、上記腐植を水(例えば蒸留水、イオン交換水、逆浸透圧水等)と混合することにより、水内に抽出される。その際、腐植を、水100重量部に対して通常、5〜35重量部、好ましくは15〜25重量部、特に好ましくは、17〜18重量部の割合で混合する。上記混合物を、室温で、通常、24〜96時間、好ましくは48〜72時間日間放置する。上記放置中、適宜、混合物を撹拌してもよい。次いで、上記混合物の上澄液又は濾液を腐植抽出物とする。液状の腐植抽出物のpHは、通常、3.0である。この液状の腐植抽出物を乾固して、粉末としてもよい。
上記腐植抽出物中のフルボ酸の平均分子量は、通常、4,000よりも小さく、好ましくは3,500以下であり、特に好ましくは3,000以下であり、さらに好ましくは3,000〜1,000である。
前記腐植抽出物は、市販のものでもよく、日本では例えば株式会社スタイルアンドバリュージャパンより製品名「ヒューミクル(登録商標)HCフルボ酸パウダー」として入手可能である。ヒューミクルの成分分析結果(試料湿重量中の含有量)を、表1に示す。
ヒューミクルの4%水溶液の全有機炭素(TOC)の測定、及びフルボ酸分画の全有機炭素(TOC)測定の結果から、ヒューミクル中の炭素のほぼ全量が有機炭素で占められ、そして有機炭素のほぼ全量がフルボ酸を構成していることが確認された。そして、ヒューミクル中のフルボ酸含有量は、約1%と推定された。
ヒューミクルのアルカリ(0.1N水酸化ナトリウム)及び酸(塩酸、pH2)可溶成分を抽出することにより、フルボ酸を分画した。ヒューミクル又はフルボ酸分画の物性試験方法とその分析結果を以下に示す。
(1)3次元分光蛍光光度法
ヒューミクルの4%水溶液の3次元励起−蛍光スペクトル(測定装置JASCO FP−8200)を図3に示す。比較のため、愛知県段戸森林土壌から抽出精製されたフルボ酸及びフミン酸(いずれも、日本腐植物質学会から「日本腐植物質学会 標準資料」として頒布されている、以下、それぞれ、段戸産フルボ酸及び段戸産フミン酸という)の3次元蛍光スペクトルを図4に示す。ヒューミクル及び段戸産フルボ酸の3次元励起−蛍光スペクトルには、フルボ酸由来の蛍光の特徴である、励起250nm付近−蛍光430nm付近のピーク及び、励起320nm付近−蛍光430nm付近のピークが出現している。
(2)GPC−UV/TC分析
GPC−UV/TC分析法は、水中溶存有機物を分子の大きさや排除の程度によって高速に分離し、分離した溶存分子をUV検出器及びTC検出器(Total Carbon Analyzer)でモニタリングする手法である。以下GPC−TC装置:
GPC:Shodex GPC SYSTEM 21
分離カラム TOSO HW−50S
溶離液 30mM NaHPO
UV吸収(220nm)検出器:GL7450(GL サイエンス製)
TC検出器:LCT−100(東レエンジニアリング製)
を用いて、ヒューミクル及び段戸産フルボ酸の分子量を測定した。
両者のTCクロマトグラムでは、段戸産フルボ酸のピーク位置が51分であるのに対して、ヒューミクル4%溶解液では54分であった。ピーク位置の保持時間を、使用した分離カラムの多糖類やPEG(ポリエチレングリコール)の排除特性で換算すると、段戸フルボ酸の分子量は、約4,000であり、ヒューミクル溶解液中の有機物の分子量は、約1,000〜3,000と推定された。
ピークトップとなった保持時間でのTC出力値(mV)とUV(220nm)吸収での出力値(mV)、及びUV出力値/TC出力値(単位有機物量(炭素量)当たりUV吸収の強さ)を表2に示す。
表2から、ヒューミクル溶解液のUV/TC値は、段戸産フルボ酸溶解液のものにほぼ近い。有機物の分子構造に由来する紫外吸光(220nm)に類似性があることは、両者の分子構造の骨格や官能基の種類に類似性があることを示している。
(3)フーリエ変換赤外分光光度計法(FT−IR)
前記フルボ酸分画のATR法(Attenuated Total Reflection、全反射吸収法)にて赤外線吸収スペクトルを取得した。具体的には、前記フルボ酸分画をDax−8樹脂(Spelco社製)に施用し、そこに吸着した有機物をアルカリ性溶液で脱着した。脱着した有機物を、さらにイオン交換樹脂に通して不要な塩類を取り除いた。得られた試料をATR法に基づくFT−IR分光分析(PerkinElmer Spectrum 65)に供した。
腐植抽出物(ヒューミクル)に含有されるフルボ酸の赤外線吸収スペクトルを図1に示す。比較のため、段戸産のフルボ酸及びフミン酸の赤外線吸収スペクトルを図2に示す。図1(ヒューミクル)及び図2(段戸産フルボ酸)から主要な赤外線吸収ピークをそれぞれ抽出し、その結果を波数で表3に示す。
ヒューミクルに含有されるフルボ酸及び段戸産フルボ酸は、共通して1200cm−1にカルボキシル基(C−O)吸収ピークを有するが、そのレベルは、ヒューミクルの方が段戸産フルボ酸よりも小さい。ヒューミクル中のフルボ酸が段戸産フルボ酸のスペクトルと明確に相違する点は、1559、1047及び835cm−1にトリ置換ベンゼンタイプのシグナルが観測され、そして3362及び1360cm−1にフェノールあるいはアルコールタイプのシグナルが観測されることである。これから、ヒューミクル中のフルボ酸は、段戸産フルボ酸と比べて、カルボキシル基が少なく、トリ置換ベンゼンタイプのフェノール化合物の構造が多いことが示唆される。
3次元分光蛍光分析やGPC−UV/TC分析の結果から、ヒューミクル中のフルボ酸は、段戸産フルボ酸と同様に、フルボ酸特有の分子構造の骨格や官能基を有する。ヒューミクル中のフルボ酸及び段戸産フルボ酸は、後述の実施例及び比較例に示すように、フルボ酸に基づくMMP−1産生抑制効果を奏する。
赤外分光分析の結果は、ヒューミクル中のフルボ酸が段戸産フルボ酸よりもカルボキシル基が少なく、トリ置換ベンゼンタイプのフェノール化合物の構造が異なっていることを示唆する。この分子構造の違いが、後述の実施例と比較例に示すように、皮膚3次元モデルに紫外線を照射したときの細胞生存率の相違に反映したと考えられる。すなわち、本発明で特定する特定の赤外線吸収スペクトル特性を有する中のフルボ酸を含有する腐植抽出物の添加された美容組成物のみが、紫外線照射による光老化現象を総合的に防止可能である。
本発明の美容組成物の摂取方法は、経皮摂取又は経口摂取である。よって、本発明の美容組成物は、乳液やクリームのような経皮投与剤、あるいは錠剤やドロップのような固形製剤やドリンク剤のような液剤などの経口投与剤の形態に加工される。光老化防止用の美容組成物としての観点から、水剤、乳剤、乳液、クリーム等での経皮投与が好ましい。
本発明の経皮投与美容組成物には、上記の腐植抽出物以外に、化粧品学的、皮膚病学的及び/又は薬学的に許容される添加剤として汎用されるものが添加される。例えば、水;エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、1,4−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール;メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール;オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類;オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂;カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類;ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類;カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤;フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤;ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤;ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤;ビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンF、ビタミンK等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体;フラボノイド、カロテノイド等の抗酸化剤;スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類;セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質;コレステロール、フィトステロール等のステロール類;メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類;パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−N−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−4−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤;ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物;ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料;赤色202号、黄色4号、青色404号等の着色料;香料;香油等が挙げられる。
本発明の経皮投与美容組成物の形態は、水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム、粉体又は固形物である。光老化防止用の即効性の観点から、水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム又は粉体の形態が好ましい。
本発明の経皮投与美容組成物には、化粧料や入浴料が含まれる。その具体的用途としては、サンタン化粧品、美容液、保湿化粧水、柔軟化粧水、収れん化粧水等のスキンケア化粧品;ファーミング化粧品、アンチセルライト化粧品等のボディ化粧品;並びに、基礎化粧品(化粧水、乳液、クリーム)、ファンデーション、下地クリーム、フェイスパウダー、ウォータープルーフ等のメイクアップ化粧品;石鹸、シャンプー、リンス、入浴剤等の入浴料が挙げられる。
本発明の経皮美容組成物中の腐植抽出物(フルボ酸を約3%含有)の含有量は、通常、0.01〜20%でよく、好ましくは0.05〜15%であり、より好ましくは0.1〜10%である。
本発明の経皮美容組成物の1日当たりの適用量は、腐植物質抽出物(フルボ酸を約3%含有)の適用量として、通常、100〜1,200mgでよく、好ましくは300〜1,200mgであり、特に好ましくは300〜600mgである。
本発明の経口投与美容組成物は、光老化防止機能を有する機能性食品が含まれる。この組成物には、汎用の食品添加物が添加される。例えば、経口投与の形態に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、アミノ酸、pH調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤等を発明の効果を損なわない質的および量的範囲で添加することが可能である。
本発明の経口投与美容組成物の形態は、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤又はシロップのような通常の食品とは異なる経口投与剤に加工される。
本発明の経口美容組成物中の腐植抽出物(フルボ酸を約3%含有)の含有量は、通常、0.1〜70重量%でよく、好ましくは0.1〜30重量%であり、より好ましくは0.1〜15重量%である。
本発明の経口美容組成物の1日当たりの摂取量は、腐植抽出物(フルボ酸を約3%含有)の摂取量として、通常、100〜1,200mgでよく、好ましくは、300〜1,200mg、さらに好ましくは300〜600mgである。
本発明の美容組成物の配合例を示す。しかし、本発明は、以下の配合例に限定されるものではない。
[配合例1]化粧水
[配合例2]クリーム
[配合例3]入浴剤
[配合例4]機能性食品(錠剤)
以下に、本発明の実施例及び比較例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
皮膚3次元モデルに紫外線を照射する試験において、腐植抽出物がMMP−1の産生を抑制するか否か、そしてMMP−1の産生抑制効果が細胞生存率の挙動に実際に影響するか否かを調べた。なお、実験は、n=3にて実施した。
1.美容組成物の調製
実施例1として、米国ユタ産の腐植の水性抽出物を乾固した製品である腐植抽出物(製品名:ヒューミクル、株式会社スタイルアンドバリュージャパン製)を水に0.1重量%又は0.01重量%溶解することにより、本発明の美容組成物を調製した。比較のため、日本腐植物質学会より入手した腐植標準物質である段戸産フルボ酸(比較例1)及び琵琶湖産フルボ酸(比較例2)を、それぞれ、水に0.1重量%に溶解し、比較例の美容組成物を調製した。
レチノイン酸は、ビタミンAを皮膚に浸透し易くした誘導体であり、皮膚細胞に取り込まれると酵素によってレチノール(ビタミンA)に還元される。レチノイン酸には、皮膚細胞の活動を活性化して、真皮コラーゲン等の皮膚細胞を作り、また、メラニン色素を皮膚表面に排出する作用を有し、その結果、シワ、シミ等の皮膚老化現象を改善する効果を奏することが知られている。そこで、陽性対照として、レチノイン酸(和光純薬株式会社製)を水に1%溶解させた美容組成物を調製した。
2.皮膚3次元モデルのUV照射試験
ヒトの皮膚と近似した構造を有し、化粧品等の動物実験代替モデルとなる皮膚3次元モデル(製品名EPI−200、(株)クラボウ製)を入手し、18時間の前培養した。このモデルの上部に、各試料を100μL添加し、さらに48時間培養した。その後、PBS(−)にて、モデル上部を洗浄した。
皮膚3次元モデルに照射する紫外線量を決めるために、予め、紫外線照射装置(製品名ハンディーUVランプ LUV−16 波長365nm、アズワン製)を用いて、無添加の皮膚3次元モデルにUV(波長365nm)をその照射量を変えて照射した。照射後の皮膚3次元モデルを、COインキュベーター内で37℃の温度で48時間培養した。培養後、後述するMMP−アッセイによりMMP−1産生量を、そしてMTTアッセイにより細胞生存率を測定した。その結果、UVの照射量の増加とともに、MMP−1が増大し、逆に細胞生存率が減少した。予備試験の結果から、細胞生存率が約70%となる120mJ/cmを、腐植物質又はレチノイン酸添加試験の紫外線照射量と決定した。
紫外線によって皮膚3次元モデルに惹起されるMMP−1コラゲナーゼが、3種類の腐植抽出物を添加によって抑制されるか否かを調べた。18時間の前培養を行った皮膚3次元モデルの試料に、各試験品100μL添加し、それぞれ、UVBを120mJ/cm照射し、さらに、37℃の温度で48時間培養した。
3.MMP−1アッセイ
培養終了後の培地上清を回収し、MMP−1アッセイに供した。MMP−1アッセイは、ELISAキット(フナコシ株式会社製)により実施した。各試料のMMP−1産生量を表5に示す。
4.紫外線照射後の細胞生存率測定(MTT−アッセイ)
紫外線照射後の細胞生存率を測定するため、3次元皮膚モデルをMTTアッセイに供した。MTTアッセイは、下記の手法により実施した。すなわち、培養終了後、MTT(3−(4,5−di−methylthiazol−2−yl)−2,5−diphenyltetrazolium bromide, yellow tetrazole)を1mg/mL含有するアッセイ培地(上記皮膚モデルに付属の物)を0.8mL含有する培地に交換し、さらに2時間培養した。培養後、イソプロパノール2mLを入れた24ウェルプレートに皮膚モデルを移し、4℃にて24時間静置し、静置後、300rpmのシェーカーにて10分間振盪後、イソプロパノール層に抽出されたホルマザン色素を540nmの波長で測光した。細胞生存率は、試験品無添加かつUVB無照射を100%として計算した。細胞生存率の測定結果を表5に示す。
表5を見ると、MMP−1アッセイに関して、無照射試験区のMMP−1産生量は、5.11±0.39ng/mLであった。この未添加区に紫外線を照射したところ、20.17±0.32ng/mLに増加した。比較例1及び2の試験区(フルボ酸濃度0.1%)に紫外線を照射したところ、MMP−1はそれぞれ、15.77±3.85ng/mL、及び12.94±3.16ng/mLとなった。比較例1及び2において、MMP−1の産生量が未添加区の産生量よりも抑制された。
実施例1の試験区のMMP−1産生量は、濃度0.1%で13.94±0.97ng/mL、そして濃度0.01%で14.18±4.65ng/mLであった。実施例1においても、MMP−1の産生量が未添加区の産生量よりも抑制された。
比較例1及び2、並びに実施例1のいずれにおいても、MMP−1の産生量が未添加区の産生量よりも抑制されたことから、各組成物中のフルボ酸が皮膚3次元モデルに適用してMMP−1産生を抑制したことがわかる。
次に、MTTアッセイに関して、未添加区(陰性対照)では、紫外線照射によって、細胞生存率が67.7±2.3%まで低下を示した。レチノイン酸添加区(陽性対照)では、78.6%±2.8%に改善された。
比較例1及び2の試験区では、細胞生存率が、それぞれ、65.1±6.1%及び69.4±7.1%となり、未添加区と比べて有意な差が認められなかった。比較例1及び2では、UVが三次元皮膚モデルの深層にまで到達し、発生した活性酸素による死滅が起こったと考えられる。比較例1や2の組成物では、細胞生存率の改善は望めないことが判明した。
実施例1の試験区では、腐植抽出物濃度0.01重量%で95.9±5.9%、そして濃度0.1重量%で98.5±5.8%となり、未添加区と比べて有意な差が認められた。陽性対照と比べても、実施例1の細胞生存率が優れることは、本発明の美容組成物の光老化防止に有効であることを明確に示している。
従来のフルボ酸を含有する比較例1及び2の組成物では、細胞生存率が改善しないのに対して、本発明の美容組成物のみが細胞生存率の改善を示したことは全く意外なことである。実施例1は、MMP−1産生量の抑制効果が比較例1及び2と同様であるにもかかわらず、細胞生存率が相違した理由は、実施例1の腐植抽出物は、比較例1及び2のフルボ酸や陽性対照のレチノイン酸と比べて、紫外線吸収度が低いこと、UVBにより発生する活性酸素の消去能が大きいこと等が考えられる。そして、この相違は、実施例1の腐植抽出物の構造が大きく寄与していると考えられる。例えば、実施例1の腐植抽出物は、他のフルボ酸と比べてカルボキシル基が少なく、トリ置換ベンゼンタイプのフェノール化合物の構造が多いこと、ナフタレン環構造を持たないことが紫外線吸収や活性酸素除去能の差につながったと推測される。

Claims (10)

  1. FT−IR法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数3362,2875,1675,1559,1360,1200,1047及び835cm−1に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物、並びに化粧品学的、皮膚病学的及び/又は薬学的に許容される添加剤あるいは食品添加物を含む美容組成物。
  2. 前記腐植抽出物は、図1に示す赤外線吸収スペクトルを示すフルボ酸を含有する、請求項1に記載の美容組成物。
  3. 前記腐植抽出物は、ナフタレン環構造を有さないことを特徴とする、請求項1又は2に記載の美容組成物。
  4. 前記腐植抽出物中のフルボ酸の平均分子量は、4,000よりも小さい、請求項1〜8のいずれか一項に記載の美容組成物。
  5. 皮膚の光老化防止用である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の美容組成物。
  6. 前記光老化防止は、MMP−1の産生を抑制し、かつ皮膚細胞の細胞生存率を向上させることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の美容組成物。
  7. 経皮投与用である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の美容組成物。
  8. 水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム又は粉体の形態である、請求項7に記載の美容組成物。
  9. 経口投与用である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の美容組成物。
  10. 散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤又はシロップの形態である、請求項9に記載の美容組成物。
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