JP7165293B2

JP7165293B2 - 美容組成物

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Publication number: JP7165293B2
Application number: JP2018172290A
Authority: JP
Inventors: 一茂原
Original assignee: フェイスラボ株式会社
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2038-09-14
Also published as: JP2020045289A

Description

本発明は、美容組成物に関し、より詳細にはバラエキスを有効成分とする美容組成物に関する。

生物が生きてゆく上で欠かせない酸素は、体内にとりこまれた後、その一部が、通常の酸素よりも反応性の高い活性酸素種へと変わる。高い反応性を有する活性酸素は、エネルギー産生や生体防御システムに利用される。しかし、活性酸素が体内に過剰に蓄積されると、以下に示すような生体機能の損傷や疾患の原因となる酸化ストレスとなる。

コラーゲンは、動物の皮膚等の結合組織を形成する構造タンパク質である。皮膚コラーゲンは、皮膚の真皮に存在する繊維芽細胞により産生され、皮膚の構造維持に貢献し、皮膚を若々しく保ち、シワを作らないために重要である。紫外線等の酸化ストレスによって、コラーゲン量が減少し、細胞外マトリックスが分解することが知られている。

ヒアルロン酸は、主に皮膚真皮の繊維芽細胞やその他結合組織の細胞によって産生され、細胞外マトリックスの主成分である。ヒアルロン酸は、滑液中に高濃度で存在し、関節の水分保持と潤滑を担う等、様々な細胞間相互作用に関与する。ヒアルロン酸もまた、紫外線等の酸化ストレスによって分解される。

細胞外マトリックス内のコラーゲン・エラスチンの架橋構造は、肌の弾力を保持する重要な役割を果たしている。エラスチン分解酵素であるエラスターゼは、紫外線による刺激によって誘導される。エラスチンが分解されると、架橋構造が脆くなり、肌の弾力が失われる。

ヒトの皮膚に存在するメラニン色素は、フェノール類物質が高分子化して色素になった物質の総称である。メラノサイト内でのチロシン→ドーパ→ドーパキノン→メラニン色素の反応によって作られる。メラニン色素の最も重要な役割は、紫外線防御である。紫外線を受けると、チロシナーゼが活性化し、上記各反応が促進される。メラニンを含む細胞は、徐々に角質上層へ移動し、リパーゼのような脂質代謝酵素やエラスターゼのようなタンパク質分解酵素の作用によって細胞間の接着が分解され、最終的に角質は剥離、脱落する。メラニン色素は、紫外線による日光障害や悪性腫瘍の発症を抑制する一方で、肌のシミやソバカスの原因になる。

生物は、紫外線曝露等によって活性酸素種（ＲＯＳ）が過剰に生成することを未然に防ぎ、また、発生したＲＯＳを捕捉するような抗酸化機能物質や機構を必要としている。食品中にも、ビタミンＥ、ビタミンＣのような抗酸化因子がある。現在、新規な抗酸化物質の探索も行われている。

例えば、特許文献１は、ジャスミン、ローズ、ベチバー及びローレルの一種以上の植物抽出物からなる抗酸化剤を提案する。この抗酸化剤を含む香料組成物を配合した皮膚外用剤は、香料としての機能に経皮的な抗酸化作用を賦与することができる。特許文献２は、ハイブリッド・ティー・ローズ又はその抽出物を含有する化粧品組成物を提案する。この化粧品組成物は、抗老化作用が高く、とりわけコラゲナーゼ活性阻害作用が高い。特許文献３は、ダマスクバラの溶媒抽出物を含有する化粧料を提案する。この化粧料は、抗酸化作用、抗炎症作用及び美白作用を有する抽出物を有効成分とする化粧料であって、肌の老化（シワ、タルミ等）の予防及び改善効果、肌のハリ、ツヤの向上効果、外的要因（紫外線や化学物質）による酸化ダメージ及び炎症から肌を保護する効果、並びにシミ、ソバカス、肝斑等を予防及び改善する効果を奏する。特許文献４は、β－エンドルフィン及びβ－エンドルフィン産生促進剤と、抗炎症剤とを含有してなる皮膚外用剤を提案する。β－エンドルフィン産生促進剤は、テルミナリアエキス、セイヨウオトギリソウエキス、トウキンセンカエキス、ジャイアントケルプエキス、又はローズウォーターから選択される。この皮膚外用剤は、抗酸化効果が相乗的に増強され、少量の配合により抗酸化剤の効果を十分に発揮し、皮膚中での活性酸素生成に起因する過酸化脂質の生成を抑制し、肌の炎症，肌荒れを防止あるいは改善する効果を有する。

糖化ストレスと呼ばれる血中糖濃度の高い状態が続くと、タンパク質と糖類との架橋反応によって、最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＡＧＥ）と呼ばれる変性タンパク質が生成する。ＡＧＥが体内に蓄積すると、組織の老化を促進させる原因となる。例えば、皮膚中のＡＧＥ化したコラーゲンは、皮膚弾力性を弱めてシワの形成に関与する。

特開２００７－２９１０３１（抗酸化香料組成物及びこれを含有する皮膚外用剤）特開２０１１－２３６１４７（ハイブリッド・ティー・ローズまたはその抽出物を含有する化粧品組成物、飲食品組成物及び医薬品組成物）特開２０１４－２４０３７５（化粧料）特開２００６－８５３７（皮膚外用剤）

本発明は、天然の植物成分由来で安全性の高い新規な美容組成物を提供することを目的とする。

バラ科バラ属の植物であるローズは、美を象徴する花として歴史的になじみ深い植物である。ローズは、原種の数が多く、また、古来、交配が繰りかえされてきたため、バラの登録品種数は４０，０００以上といわれている。中でも、“白バラの祖”と言われているアルバローズは、爽やかで上品な香りを放ち、リラックス作用がある。本発明者は、意外にも、アルバローズの水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物に美容に役立つ様々な生理活性があることを発見し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、アルバローズ水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物を有効成分として含む美容組成物を提供する。

前記親水性有機溶媒は、例えばエタノールである。

本発明の美容組成物は、抗酸化活性、皮膚コラーゲン量産生、エラスターゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性、及びＡＧＥ形成阻害活性の少なくとも一の機能を発揮させるために用いられることが好ましい。

本発明の美容組成物は、さらに、化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。

本発明は、また、アルバローズを水蒸気蒸留に供して、アルバローズ水蒸気蒸留及びアルバローズ水蒸気蒸留残渣を得る工程、及び
前記アルバローズ水蒸気蒸留残渣を親水性有機溶媒を用いた溶媒抽出にかけてアルバローズ水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物を得る工程
を含む、美容組成物の製造方法を提供する。

前記親水性有機溶媒は、例えばエタノールである。

本発明の美容組成物の有効成分であるアルバローズ蒸留残渣親水性有機溶媒抽出物は、後述の実施例で証明されるように、抗酸化活性、コラーゲン産生促進、エラスターゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性、メラニン生成抑制等の抗光老化作用やＡＧＥ形成阻害活性のような抗糖老化作用を示す。強い抗酸化活性は、具体的には、老化防止や疾患予防に役立つ。コラーゲン産生促進作用は、皮膚老化防止に役立つ。エラスターゼ活性阻害作用やＡＧＥ（特にＡＧＥ化コラーゲン）形成阻害作用は、肌の弾力保持、チロシナーゼ活性阻害作用やメラニン生成抑制作用は、美白に役立つ。したがって、上記アルバローズ蒸留残渣親水性有機溶媒抽出物を含む本発明の美容組成物は、抗老化化粧品、ＵＶ化粧品等に極めて有用である。

アルバローズの水蒸気蒸留後に副生される蒸留残渣は、通常は廃棄されてしまうところ、本発明によって蒸留残渣を有効利用することが可能となる。

アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物（濃度１０～４００μｇ／ｍＬ）を成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ－Ａｄ）へ添加した際のコラーゲン産生能を測定した結果である。濃度１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬのエタノール抽出物の添加されたＥＭＥＭ培地でＮＨＤＦ－Ａｄ細胞を培養後、コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法で測定し、そして細胞生存率をＭＴＴ法で測定した。ＤＭＳＯのみを添加したコントロールのコラーゲン量及び細胞生存率を１００とし、各試験のコラーゲン産生比（％）及び細胞生存率（％）を示す。図中、折れ線は、１細胞当たりのコラーゲン産生量を示す。濃度１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の添加により、コラーゲン産生量が上昇した。したがって、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、コラーゲンを産生して皮膚の抗老化に寄与する成分が含まれていることが判明した。上記培養試験において、ＥＬＩＳＡ法でヒアルロン酸量を測定した結果を示す。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のいずれの濃度の添加によっても、ヒアルロン酸量の上昇は認められなかった。したがって、これらの濃度範囲のアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物は、ヒアルロン酸産生能に影響を及ぼさないといえる。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物（濃度１０～４００μｇ／ｍＬ）のエラスターゼ阻害活性を測定した結果を示す。１００μｇ／ｍＬの濃度のアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、約４０％のエラスターゼ阻害活性が認められた。この結果から、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には肌弾力保持機能を持つ成分が含まれているといえる。Ｌ－ＤＯＰＡを基質とした場合のアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物（濃度１０～４００μｇ／ｍＬ）のチロシナーゼ阻害活性を測定した結果を示す。濃度１００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物に濃度依存的なチロシナーゼ活性の阻害効果が認められた。Ｌ－チロシンを基質とした場合のアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物（濃度１０～４００μｇ／ｍＬ）のチロシナーゼ阻害活性を測定した結果を示す。濃度１００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の添加によって、チロシナーゼ活性の阻害が認められた。この効果は、Ｌ－ＤＯＰＡよりもＬ－チロシンを基質とした場合の方がより強い。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のメラニン生成抑制効果を測定した結果を示す。濃度１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の添加により、メラニン産生の低下が認められた。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、メラニンの合成を阻害し、美白成分を促す成分が含まれている。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物（濃度４００μｇ／ｍＬ～１６ｍｇ／ｍＬ）によるＡＧＥ形成阻害活性を示す図である。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、顕著なＡＧＥ産生量の減少が濃度依存的に認められた。アルバローズ蒸留エタノール抽出物には、強力な抗ＡＧＥ活性があり、糖化を阻害する物質の存在が示唆された。

以下に、本発明の一実施の形態を示すことによって、本発明を詳細に説明する。本発明の美容組成物は、アルバローズ水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物を有効成分として含む。

アルバローズ（学名ロサ・アルバ）は、オールドローズの一系統であり、ロサ・ダマスケナとロサ・カニナの自然交雑種といわれている。水蒸気蒸留にかけるアルバローズ原料は、花、花弁、がく、葉、茎、種子、根等でよく、好ましくは花、特に好ましくは花弁である。水蒸気蒸留操作は、常法に基づく。

蒸留後の残渣を親水性有機溶媒にて溶剤抽出する。溶剤抽出にかける蒸留残渣原料は、含水の残渣自体、凍結物、乾燥物、凍結乾燥物等のいずれでもよい。好ましくは、凍結乾燥物である。

親水性有機溶媒の例として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール，グリセロール、プロピレングリコール、３－ブチレングリコール等の低級アルコール；アセトン、メチルケトン等のケトン；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のカルボン酸エステル等が挙げられる。親水性有機溶媒は、一種単独、又は二種以上の併用であってもよい。好ましくは、エタノールである。

上記溶剤抽出時の温度は、通常、２０～２８℃でよく、好ましくは２５℃である。抽出時間は、通常、２４～４８時間でよい。抽出時に適宜の振盪手段や攪拌手段を用いることが好ましい。

上記アルバローズ蒸留残渣親水性有機溶媒抽出物を、適宜、ろ過や遠心分離機にかけて精製する。さらに、美容組成物の効能を阻害しない限り、脱色処理、脱臭処理等の精製を行ってもよい。

精製されたアルバローズ蒸留残渣親水性有機溶媒抽出物は、適宜、エバポレーション、凍結乾燥等の濃縮手段によって濃縮又は乾固してもよい。さらに、濃縮又は乾固した抽出物を再度、水、アルコール等の溶媒に溶解してもよい。

アルバローズ蒸留残渣親水性有機溶媒抽出物は、後述の実施例に示すように、抗酸化活性、皮膚コラーゲン量産生、エラスターゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性、及びＡＧＥ形成阻害活性を示す。したがって、本発明の美容組成物は、上記効能の少なくとも一種を発揮させるために用いられることが好ましい。

本発明の美容組成物は、さらに、化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。添加剤の例には、水；エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、１，４－ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色２０２号、黄色４号、青色４０４号等の着色料；香料；香油；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；フラボノイド、カロテノイド、タンニン類、没食子酸、トコフェロール、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、チオレドキシン、チオレドキシンリダクターゼ、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール等の抗酸化剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル－Ｎ－アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル－４－イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ｔ－シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸、アスコルビン酸、ハイドロキノン、エラグ酸、ニコチン酸、レゾルシノール、トラネキサム酸、４－メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン、４－ＨＰＢ、ヒドロキシ安息香酸、ビタミンＥ、α－ヒドロキシ酸、ＡＭＰ等の美白剤；１，３－ブチレングリコール（ＢＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、ベタイン、トレハロース、ヒアルロン酸Ｎａ、水溶性コラーゲン、尿素等の保湿剤等が挙げられる。

本発明の美容組成物の具体的用途としては、サンタン化粧品、美容液、保湿化粧水、柔軟化粧水、収れん化粧水等のスキンケア化粧品；ファーミング化粧品、アンチセルライト化粧品等のボディ化粧品；基礎化粧品（化粧水、乳液、クリーム）、ファンデーション、下地クリーム、フェイスパウダー、ウォータープルーフ等のメイクアップ化粧品；石鹸、シャンプー、リンス、入浴剤等の入浴料；毛髪剤、育毛剤等が挙げられる。

本発明の美容組成物の形態は、上記用途に応じて、水剤、液剤、エアゾール、乳剤、乳液、エマルション、ローション、クリーム、軟膏、粉体又は固形物であり得る。即効性の観点から、水剤、液剤、エアゾール、ローション、乳剤、乳液、エマルション等に加工される。

本発明の美容組成物中のアルバローズ蒸留残渣親水性有機溶媒抽出物の配合量は、使用目的に応じて適宜決められるが、抽出物の固形分として、通常、０．０００１～０．５質量％でよく、好ましくは０．０００１～０．３質量％であり、より好ましくは０．００１～０．１質量％である。

本発明の美容組成物の処方例を示す。しかし、本発明は、以下の処方例に限定されるものではない。
［処方例１］化粧水

［処方例２］乳液

［処方例３］クリーム

［処方例４］入浴剤

本発明は、また、上記美容組成物の製造方法を提供する。該製造方法は、アルバローズを水蒸気蒸留に供して、アルバローズ水蒸気蒸留及びアルバローズ水蒸気蒸留残渣を得る工程、及び、前記アルバローズ水蒸気蒸留残渣を親水性有機溶媒を用いた溶媒抽出にかけてアルバローズ水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物を得る工程を含む。各工程の説明は上記したとおりである。

以下に本発明の美容組成物の実施例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

（１）アルバローズ水蒸気蒸留残渣エタノール抽出物の調製
アルバローズの花部からなる原料を水蒸気蒸留に供して、アルバローズ水蒸気蒸留物及びアルバローズ蒸留残渣を得た。アルバローズ蒸留残渣の含水率８６．７％であった。

このアルバローズ水蒸気蒸留残渣を凍結乾燥機にて乾燥させ、その乾燥物のエタノール抽出を行った。エタノール抽出は、室温にて２００ｒｐｍの攪拌速度で振盪しながら、２４時間行った。エタノール抽出液をろ過し、ロータリーエバポレーターにて温度４５℃で濃縮後、デシケータ内で乾固させた。この乾固物を、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物という。アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のエタノール抽出率（＝乾固物重量／抽出に用いた原料の重量）は、２９．９％であった。

（２）抗酸化活性試験
上記で得られたアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物について、スーパーオキシド消去活性能をＯＲＡＣ（ＯｘｙｇｅｎＲａｄｉｃａｌＡｂｓｏｒｂａｎｃｅＣａｐａｃｉｔｙ）法により測定した。ＯＲＡＣ法は、活性酸素による蛍光試薬の消光スピードを抗酸化物質が遅延する能力を抗酸化物質の抗酸化能として評価する方法である。例えば酸化物質ＡＡＰＨ（２，２‘－アゾビス（２－アミノプロパン）二塩酸塩）により発生させた活性酸素ペルオキシルラジカルに試料中の蛍光試薬フルオレセインを酸化させる。もし、試料中に抗酸化物質が存在すれば、抗酸化物質がペルオキシルラジカルを消去するので、フルオセレインの消光スピードが遅延する。

上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の溶液（ｐＨ７．４）０．３ｍＬに４８ｎＭフルオレセイン溶液１．８ｍＬを加えた後、４３ｍＭＡＡＰＨ（ｐＨ７．４）を０．９ｍＬ添加した。この混合液を１０秒間、ボルテックスした後、分光蛍光光度計（製品名ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ製）で蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、測定波長５２０ｎｍ）を測定した。

得られた蛍光強度からスーパーオキシド消去活性能を算出した（ｎ＝４）。結果を表５に示す。スーパーオキシド消去活性能は、サンプル１ｍｇ当たりの抗酸化活性を、トロロックス（ビタミンＥ誘導体；指標とする抗酸化物質）等量として表したものであり、値が大きいほど抗酸化活性が高いことを示す。

表５に示すとおり、アルバローズ水蒸気蒸留残渣のエタノール抽出物のスーパーオキシド消去活性能は、１．６７ｍｇＴＥ／ｍｇであった。すなわち、上記エタノール抽出物は、抗酸化物質トロロックスの約１．６７倍という高い抗酸化活性を示した。

（３）コラーゲン・ヒアルロン酸産生試験
上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物を繊維芽細胞培液へ添加した際のコラーゲン及びヒアルロン酸の産生能を測定した。具体的には、モデル細胞としての成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ－Ａｄ、１．０×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を濃度１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬのエタノール抽出物２μＬの添加されたＥＭＥＭ培地（９９８μＬ）中で、５％ＣＯ_２＋９５％エアーの存在下、３７℃で７２時間培養した。培養後、コラーゲン及びヒアルロン酸量をＥＬＩＳＡ法で測定し、そして細胞生存率をＭＴＴ法で測定した。コラーゲン産生試験の陽性対照としてアスコルビン酸（１００μｇ／ｍＬ）、そして、ヒアルロン産生酸試験の陽性対照としてＮ－アセチルグルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）を繊維芽細胞培液に添加した系での測定も行った。

ＤＭＳＯのみを添加したコントロールのコラーゲン量、ヒアルロン酸量、及び細胞生存率を１００とし、各試験のコラーゲン産生比（％）及びヒアルロン酸産生比（％）をそれぞれ、図１及び図２に示す（ｎ＝３）。図１及び２中、折れ線は、それぞれ、１細胞当たりのコラーゲン産生量及びヒアルロン酸産生量を示す。

図１のコラーゲン産生量を見ると、濃度１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の添加により、コラーゲン産生量が有意に上昇した。したがって、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、コラーゲンを産生して皮膚の抗老化に寄与する成分が含まれていることが判明した。これから、上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、肌水分保持効果、関節痛改善効果等の効果を発揮させる用途が期待される。

一方、図２のヒアルロン酸産生量を見ると、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のいずれの濃度の添加によっても、ヒアルロン酸量の上昇は認められなかった。したがって、これらの濃度域のアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物はヒアルロン酸酸性能に影響を及ぼさないことが判明した。

（４）エラスターゼ阻害活性試験
アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のエラスターゼ阻害活性を測定した。具体的には、モデル細胞としての成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ－Ａｄ、１．２×１０^６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に溶解バッファー〔０．２ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＰＭＳＦ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００〕を１．２５ｍＬ加えて、氷水中で２分間のソニケーション後、室温にて１０分間放置した。ライセートを４℃の温度で４００ｇ×１５分の遠心分離処理にかけた。遠心分離後の上清２５μＬに０．２ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２３μＬと濃度１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬの上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物２μＬを加え、３７℃の温度で１５分間、放置した。次いで、５ｍＭのサブストレート（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐＮＡ）を５０μＬ添加し、３７℃で２時間、放置した。その後、吸光光度計（製品名ＥＬｘ８００、ＢｉｏＴｅｃｋ製）で４０６ｎｍの吸光度を測定した。また、エラスターゼ活性阻害剤（陽性対照）として０．０４ｍＭフォスフォラミドンを添加した系でも測定を行った。

ＤＭＳＯのみを添加したコントロールの吸光度を１００とし、各試験の吸光度の比率（エラスターゼ活性）を図３に示す（ｎ＝３）。なお、濃度４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物では、サンプル自身の着色のためにエラスターゼ活性を測定不能であった。

図３に示すように、１００μｇ／ｍＬの濃度のアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、約４０％のエラスターゼ阻害活性が認められた。この結果は、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物に肌弾力保持機能を持つ成分が含まれていることを示唆する。よって、上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物に、肌弾力保持機能を発揮させる用途が期待される。

（５）チロシナーゼ阻害活性試験
上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のチロシナーゼ阻害活性を評価した。具体的には、濃度１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬのエタノール抽出物の存在下で、Ｌ－ＤＯＰＡ（３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）－Ｌ－アラニン）又はＬ－チロシンを基質としてマッシュルームチロシナーゼによるＤＯＰＡクロム産生量を示す４７５ｎｍの吸光度を前記吸光光度計で測定した。陽性対照として阻害剤であるコウジ酸（３．３μｇ／ｍＬ）を添加した系の吸光度も測定した。

ＤＭＳＯのみを添加したコントロールの吸光度を１００として、各系のチロシナーゼ活性（％）を、Ｌ－ＤＯＰＡの場合を図４に示し、そしてＬ－チロシンの場合を図５に示す（ｎ＝３）。

図４のＬ－ＤＯＰＡを基質とした場合、濃度１００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物に濃度依存的なチロシナーゼ活性の阻害効果が認められた。

図５のＬ－チロシンを基質とした場合でも、濃度１００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の添加により、濃度依存的なチロシナーゼ活性の阻害効果が認められた。この効果は、Ｌ－ＤＯＰＡよりもＬ－チロシンを基質とした場合の方がより強く認められた。

以上の結果より、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、チロシナーゼを阻害し、メラニンの定着を防止する成分が含まれており、美白効果が期待できることが示唆された。

（６）メラニン生成抑制試験
上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物のメラニン生成抑制作用を評価した。具体的には、モデル細胞として用いたヒトメラノーマ細胞（Ｇ３６１、１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１ｍＬ／ｗｅｌｌ）を濃度１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物２μＬの添加されたＥＭＥＭ培地（９９８μＬ）中で、５％ＣＯ_２＋９５％エアーの存在下、３７℃で７２時間培養した。培養液の一部に１ＭＮａＯＨを１ｍＬ添加して室温で一晩（４時間）、遮光保存した後、プレートリーダーの４０５ｎｍの吸収度から培養液中に生成されたメラニン量を求めた。また、上記培養液の残部にＭＴＴ染色液５０μＬ添加して、５％ＣＯ_２＋９５％エアーの存在下、３７℃で４時間放置後、ＨＣＬ－イソプロパノールを１ｍＬ添加して、室温で一晩（４時間）、遮光保存した後、プレートリーダーの５７０ｎｍの吸収度から細胞生存率を求めた。陽性対照として、上記アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の代わりにメラニン生成阻害活性を示すアルブチンを１００μｇ／ｍＬ添加して系でのメラニン生成量も測定した。

５０％ＢＧ、５０％エタノール、ホホバ油及びＤＭＳＯを添加したコントロールのメラニン生成量（吸光度）及び細胞生存率（吸光度）を１００とし、各試験系のメラニン産生比（％）及び細胞生存率（％）を求めた。結果を図６に示す。図中、折れ線は、１細胞当たりのメラニン生成量を示す。

図６から、濃度１００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬのアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物の添加により、陽性対照のアルブチンに匹敵するメラニン産生低下が認められた。したがって、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、メラニンの合成を阻害し、美白成分を促す成分が含まれていることが示唆された。

（７）ＡＧＥ形成阻害活性試験
ＡＧＥを形成させるｉｎｖｉｔｒｏ試験系にアルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物を共存させることにより、ＡＧＥが阻害されるかどうかを以下の手順で評価した。

（反応溶液の調製）
ＢＳＡをＰＢＳに溶解させて、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を調製した。グリセリルアルデヒドをＰＢＳに溶解させて、４５ｍｇ／ｍＬのグリセリルアルデヒド溶液を調製した。上記エタノール抽出物のＤＭＳＯ溶液を超純水中に５％（ｖ／ｖ）で混合した。陰性対照として５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ溶液、陽性対照として５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ溶液にアミノグアニジンを２．２ｍｇ／ｍＬとなるように混合させたものを用意した。

９６ウェルプレートの各ウェルに、ＢＳＡ溶液５０μＬ、上記グリセリルアルデヒド溶液１０μＬ、並びに陰性対照、陽性対照又はエタノール抽出物（濃度４００μｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、又は１６ｍｇ／ｍＬ）を４０μＬ添加して混合した。予め行った試験でＡＧＥ形成反応が十分に起こるのに要した１８時間の期間を反応時間とした。

（ＡＧＥ形成量の測定）
反応溶液中に形成したＡＧＥ量を、前記分光蛍光光度計を用いた反応溶液の蛍光強度（Ｅｘ：３６０ｎｍ、Ｅｍ：４６５ｎｍ）から測定した（ｎ＝３）。反応液における反応０時間目と１８時間後の蛍光強度をそれぞれ、陰性対照の反応０時間目の蛍光強度を１とした値で示した。結果を図７に示す。

図７に示すように、１８時間後、アルバローズ蒸留残渣エタノール抽出物には、顕著なＡＧＥ産生量の減少が濃度依存的に認められた。しかも、そのＡＧＥ産生量は、陽性対照のアミノグアニジンよりも顕著に少なかった。したがって、アルバローズ蒸留エタノール抽出物は、強力なＡＧＥ阻害活性があり、抗糖老化作用を示す美容組成物への適用が期待される。

Claims

アルバローズ水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物を有効成分として含む美容組成物。
前記親水性有機溶媒がエタノールである、請求項１に記載の美容組成物。
抗酸化活性、皮膚コラーゲン量産生、エラスターゼ阻害活性、及びＡＧＥ形成阻害活性の少なくとも一の機能を発揮させるための請求項１又は２に記載の美容組成物。
さらに、化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤を含む、請求項１～３のいずれかに記載の美容組成物。
請求項１～４のいずれかに記載の美容組成物の製造方法であって、
アルバローズを水蒸気蒸留に供して、アルバローズ水蒸気蒸留物及びアルバローズ水蒸気蒸留残渣を得る工程、及び
前記アルバローズ水蒸気蒸留残渣を親水性有機溶媒を用いた溶媒抽出にかけてアルバローズ水蒸気蒸留残渣の親水性有機溶媒抽出物を得る工程
を含む、前記美容組成物の製造方法。
前記親水性有機溶媒がエタノールである、請求項５に記載の美容組成物の製造方法。