JP2017111065A - 角質細胞の観察方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、前記3次元培養皮膚モデルに対し、紫外線を照射した後、メラニン量を確認することが行われている(特許文献1)。
また、本発明は、上皮再構築体に被験物質を適用した後、上皮再構築体の上面を除去して上皮再構築体を顕微鏡で観察することを含む、被験物質の評価又はスクリーニング方法を提供する。
また、前記角質細胞の観察方法、前記被験物質の評価若しくはスクリーニング方法、又は前記皮膚反応性の評価方法に用いる試料を、上皮再構築体の上面を除去することによって作製することを含む、上皮再構築体試料の作製方法を提供する。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
上皮再構築体とは、いわゆる3次元培養皮膚モデルを含む概念である。本発明では、重層上皮再構築体を用いることが好ましいが、これに限定されない。
一例として、重層上皮再構築体(皮膚モデル)の作製方法を以下に示す。
(1) 上皮細胞、例えばケラチノサイト(表皮角化細胞)を初期増殖する。ここで、上皮細胞は哺乳動物由来が好ましく、ヒト由来が特に好ましい。
3次元培養用容器は、例えば、細胞培養用インサートを用いることができる。インサートの膜は、例えばポリカーボネート製のものが挙げられる。また、細胞培養用インサートではなく、コラーゲンゲル上又は生体より摘出した真皮にガラス製リングを載せ、その中に上皮細胞を播種してもよい。
なお、当該(3)の工程は、必須ではなく、前記工程(2)から後述する工程(4)に移ることも可能だが、工程(3)を経ることが好ましい。
空気曝露後、12〜14日後程度で、ヒトと同様の構造の重層上皮再構築体が得られる。
以上の重層上皮再構築体の作製方法の概略を図1に示す。
なお、前記作製方法は、特開2011−120577号明細書を参考にすることができる。
重層上皮再構築体を顕微鏡で観察する前に、重層上皮再構築体の上面を除去する。重層上皮再構築体の最上層には、壊死した細胞や、空気曝露による急激な環境変化により不完全に角化したと思われる細胞の堆積物が見られる。これを、物理的に一部又は全部除去することにより、角質細胞を観察しやすくすることができる。
従来の重層上皮再構築体の目視観察又は顕微鏡観察では、重層上皮再構築体の上面は一見なだらかに見えていたため、そのまま上面を観察することしか行われておらず、重層上皮再構築体の上面を除去するという発想がなかった。
スライドグラスやテープを重層上皮再構築体の上面に押し当てるときの圧力を調節することにより、除去する面積を増減できる。
ここで、重層上皮再構築体の上面を除去する厚さ(深さ)は、上面から1μm以上が好ましく、角質細胞の観察に適したものとなる。
特に、テープストリッピングにおいては、1回の操作でテープの粘着性により剥離される角質細胞が、通常1層となるので、テープストリッピングの回数により除去できる角質細胞の深さを決めることができる。すなわち、この操作を複数回繰り返すことにより、角質を上層から内部(深さ)方向にかけて段階的に角質細胞を除去することができる。
今まで一般には、テープストリッピング等をした後は、テープの方を顕微鏡観察等に供し、テープに付着した角化細胞等を見ることが行われていた。
しかし、本発明では、テープではなく、重層上皮再構築体の方を顕微鏡観察に供することが特徴的である。
前記テープストリッピングは、共焦点レーザー顕微鏡で重層上皮再構築体の角質細胞を観察する場合、少なくとも1回、好ましくは2回、3回程度行えばよい。
具体的には、例えば、被験物質溶液を培養細胞インサート内に200μL程度入れることや、被験物質を直接塗布等して、一定時間静置する。被験物質溶液の場合は、静置後、溶液を取り除く。この操作を1日数回行う。
上皮再構築体の上面をテープストリッピング等で除去し、上皮再構築体を顕微鏡観察に供する。被験物質適用時、静置中、適用後、観察に供するまでは、例えば相対湿度を10%以上90%以下、30%以上70%以下、40%以上50%以下に調節してもよい。
なお、前記被験物質を上皮再構築体に適用して顕微鏡観察に供するまでの概略を図2に示す。
例えば、美肌効果が見込まれる被験物質を、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、髄腔内投与等と同じような適用方法になるように投与を行ってから、上皮再構築体の上面を除去し、顕微鏡観察に供してもよい。すなわち、生体の皮膚の内側から被験物質が作用する様子を再現するモデルとして、上皮再構築体の下側から被験物質が取り込まれるように適用することもできる。
また、本発明は、種々の被験物質を上皮再構築体に適用して観察することにより、所望の影響を皮膚に与える物質をスクリーニングすることに用いることもできる。
更に、本発明の観察方法は、特定の被験物質を、様々な種類の上皮再構築体、例えば異なる複数の哺乳動物由来の上皮再構築体に適用し、上皮再構築体の皮膚反応性の評価をすることに用いることもできる。
上皮再構築体の角質細胞を肉眼で観察することは困難であるので、顕微鏡を用いることが好ましい。顕微鏡は特に限定されないが、前述のように、共焦点レーザー顕微鏡、特に反射式共焦点レーザーが好ましい。共焦点レーザー顕微鏡を用いることにより、上皮再構築体の角質細胞の詳細な形状を固定などの特別な処理をすることなく、大気圧中で、短時間に観察することができる。
バリア能が健全な皮膚では、角質細胞の形は六角形に近いので、重層上皮再構築体の角質細胞が六角形に近いほど好ましく、例えば肌の見た目の美しさにも関係する。
また、角質細胞の配向は、整然とした配列を成していることが好ましい。
角質細胞の面積は、大きいほど好ましく、より成熟度の高い角質細胞であるといえる。
個々の角質細胞の面積のばらつきは、少ないほど好ましく、肌表面形状の均一性に関係していることが考えられる。
観察視野の単位面積当たりの細胞数は、被験物質の適用の前後で減少していることが好ましい。
本発明の適用の一態様として、角質細胞観察装置を提供することもできる。
角質細胞観察装置は、例えば、上皮再構築体の上面が除去された該上皮再構築体を入れる容器部と、該上皮再構築体の角層細胞を観察する顕微鏡部と、該顕微鏡部により取得された画像から、角質細胞の形、配向、面積、面積のばらつき及び観察視野の単位面積あたりの細胞数(細胞密度)からなる群から選択される観察要素を少なくとも1つ解析する画像解析部とを含む。
容器部は特に限定されないが、上皮再構築体の細胞がインタクトに保たれる観察用セルが好ましい。
顕微鏡部は、特に限定されないが、前述のように共焦点レーザー顕微鏡が特に好ましい。
画像解析部には、例えば、顕微鏡部により得られる像を撮像する画像取得部、画像記録部、画素の配列や画素数を分析する画素分析部、前記観察要素を画素数から数値化する計算部、観察視野の単位面積当たりの細胞を計数する細胞計数部等を含めることができる。
細胞の形は、例えば、特定の画像領域を構成する画素の配列に基づいて特定することが可能である。また、画像領域上の各位置における微分係数を演算して細胞の形を算出することもでき、パターンマッチング処理などを行ってもよい。細胞が六角形に近いかどうかを判断するには、例えば、六角形状のテンプレート画像との画像相関処理を行うことにより可能である。
細胞の配向は、例えば、画像領域を細線化してワイヤモデルを作成し、このワイヤモデルに基づいて求めることができる。
細胞の面積は、例えば、単位面積に含まれる画素数をカウントして単位面積画素数を取得しておくとともに、細胞領域内の画素数をカウントし、この画素数を単位面積画素数で除算することにより算出でき、通常の積分演算を行って面積を求めることも可能である。
細胞の面積のばらつきは、例えば、複数の細胞の面積を統計処理して算出することが可能である。
細胞密度は、観察視野の単位面積を特定し、その面積中の細胞数から算出すればよい。
これらの算出に用いられるソフトウェアは既知であり、それを適用すればよい。
第一の培養工程:
ケラチノサイト(表皮角化細胞)を、細胞増殖用培地にて1×104cells/mLの細胞懸濁液を調製し、100mmシャーレに10mL添加する。その後、二酸化炭素濃度5%、37℃、湿潤下にて、細胞が培養シャーレに対してサブコンフルエント若しくはコンフルエントになるまで7日間増殖させた。なお、培地は2日もしくは3日に一回交換した。
前記第一の培養工程で増殖した表皮角化細胞を酵素にてシャーレから剥がし、回収した。回収した細胞は細胞増殖用培地にて4×105cells/mLに調製し、3次元培養用のセルカルチャーインサート(フィルター直径:12mm、フィルター材質:ポリカーボネート)に500μL添加し、インサートの外側には細胞増殖用培地をインサート内の液面と同じ高さになるまで添加した。細胞を播種した後、インサート底面に対して細胞がコンフルエントになるまで細胞増殖培地にて1日間培養させた。
前記第二の培養工程で上皮細胞がコンフルエントになった後、培地を細胞分化用培地(Caイオン濃度1.2mM)に変えた。上皮細胞の分化誘導を行うため、細胞分化用培地で16時間浸漬培養した。
前記第三の培養工程の培地を取り除き、上皮細胞の表面を気相(空気)に曝露し、細胞底面は細胞分化用培地に触れている状態で更に培養した。気相に曝露することで細胞が積層化し、角質層が形成された。その過程を図3に示す。
12〜14日後にヒトの表皮と同様の構造を持つ重層上皮再構築体を得た。
相対湿度90%の条件下で、重層上皮再構築体を作製し、空気曝露12日後にインサート底面のフィルターを繰り抜いた。次に、重層上皮再構築体の上面にテープを載せ、軽くひとなでした後にテープを剥がした。この重層上皮再構築体を反射式共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
なお、テープには、ニチバン社製のセロテープ(登録商標)品番CT405AP−18、幅18mmのものを用いた。
前記被験物質を適用しなかった重層上皮再構築体のテープストリッピング前の反射式共焦点レーザー顕微鏡像を図4に、テープストリッピング後の像を図5に示す。
テープストリッピングをすることで、図5に見られるように、初めて角質細胞の六角形状の形を確認することができた。
被験物質として、保湿剤であるグリセリンを滅菌水で10質量%に調整したものを用いた。
相対湿度40%の条件下で、インサートで培養したままの状態で、重層上皮再構築体の表面約113mm2(インサートのフィルターの底面積と同等)に被験物質の溶液を200μL載せ、60分静置後、被験物質の溶液を取り除いた。この操作を1日2回、計3日間実施した。
図6と図7を比較すると、水を適用した重層上皮再構築体では、角質細胞の六角形がほとんど確認できず、細胞の配向、配列等も乱れていたのに対し、前記被験物質を適用した重層上皮再構築体では、角質細胞のきれいな六角形と整然とした配向、配列等を確認できた。
以上のことから、重層上皮再構築体の上面を除去し、角質細胞の形、配向、配列等を観察することにより、被験物質の効果を評価できることが明らかとなった。
Claims (6)
- 上皮再構築体の上面を除去し、上皮再構築体を顕微鏡で観察することを含む、角質細胞の観察方法。
- 前記上皮再構築体の上面の除去は、テープストリッピングで行う、請求項1に記載の角質細胞の観察方法。
- 前記顕微鏡は、共焦点レーザー顕微鏡である、請求項1又は2に記載の角質細胞の観察方法。
- 前記角質細胞の観察要素が、角質細胞の形、配向、面積、面積のばらつき及び観察視野の単位面積あたりの細胞数からなる群から少なくとも1つ選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の角質細胞の観察方法。
- 上皮再構築体に被験物質を適用した後、上皮再構築体の上面を除去して上皮再構築体を顕微鏡で観察することを含む、被験物質の評価又はスクリーニング方法。
- 上皮再構築体に被験物質を適用した後、上皮再構築体の上面を除去して上皮再構築体を顕微鏡で観察することを含む、被験物質の皮膚反応性の評価方法。
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