JP2017096775A - 混合マトリックスを用いる質量分析法 - Google Patents

Abstract

【課題】親水性から疎水性までの広範囲のペプチドを、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる質量分析法を提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）（式中、Ｒは、炭素数３〜１２のアルキル基を表す。）で示される化合物と、式（Ｉ）で示される化合物（Ｒが、炭素数３のアルキル基のもの）よりも親水性である質量分析用マトリックス（II）とを混合マトリックスとして用いるＭＡＬＤＩ質量分析法。【選択図】なし

Description

本発明は、医療及び創薬分野において応用されうる質量分析法、特に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より詳しくは、本発明は、特定化合物を混合マトリックスとして用いる質量分析法に関する。

ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）や２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。上記特許文献１のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、ＭＡＬＤＩ質量分析法においてイオン化効率が低いという問題がある。

３−ＣＨＣＡ

３Ｈ４ＮＢＡ

上記問題を解決すべく、ＷＯ２０１４／１３６７７９号公報（特許文献２）には、特定の２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン（ＡＴＨＡＰ）［alkylated trihydroxyacetophenone］、例えば、1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)octan-1-oneをマトリックスとして用いる質量分析法が開示されている。上記特許文献２のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、疎水性ペプチドを高感度に検出することができる。この分析においては、親水性ペプチドのイオン化は抑制され、親水性ペプチドの分析は困難である。“Alkylated Trihydroxyacetophenone as a MALDI Matrix for Hydrophobic Peptides”, by Yuko Fukuyama et al., Anal.Chem. 2013, 85, 9444-9448（非特許文献１）も参照される。

ＡＴＨＡＰの例：1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)octan-1-one

特開２０１３−１９０２５０号公報（特許文献３）及びUS 2015/0276756号公報（特許文献４）には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）等の一般的マトリックスに、２，５−又は３，５−ジヒドロキシ安息香酸エステル（Alkylated dihydroxybenzoic acid；ＡＤＨＢ，例えば、octyl 2,5-dihydroxybenzoate）をマトリックス添加剤として用いる質量分析法が開示されている。上記特許文献３及び４のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、疎水性ペプチドを高感度に検出することができる。質量分析の際に、疎水性ペプチドは、質量分析プレート上において、試料／マトリックス混合結晶の外縁部に濃縮される。“Alkylated Dihydroxybenzoic Acid as a MALDI Matrix Additive for Hydrophobic Peptide Analysis”, by Yuko Fukushima et al., Anal. Chem. 2012, 84, 4237-4243（非特許文献２）； 及びその訂正版Anal. Chem. 2014, 86, 5187-5187（非特許文献３）も参照される。

ＡＤＨＢの例：octyl 2,5-dihydroxybenzoate

４−ＣＨＣＡ

US 2011/0217783号公報（特許文献５）及びUS 2006/0240562号公報（特許文献６）には、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）のヒドロキシル基にアルキルオキシメチル基を導入した２−シアノ−３−［４−［（ドデシルオキシ）メトキシ］フェニル］アクリル酸（１）、及び一般的マトリックスであるシナピン酸（ＳＡ）のヒドロキシル基にアルキルオキシメチル基を導入した３−（４−ドデシルオキシメチルオキシ−３，５−ジメチルオキシフェニル）アクリル酸（２）が開示され、これらは、難溶解性タンパク質に対する溶解剤（界面活性剤）として機能した後、酸性条件下で、リンカ−部からアルキル鎖部を切断することでマトリックスとして機能し、一連の工程として疎水性ペプチドの感度を向上する質量分析法が開示されている。Anal. Chem. 2005, 77, 5036-5040（非特許文献４）も参照される。

US 2009/0269855号公報（特許文献７）には、２−ヒドロキシ−５−オクチルオキシ安息香酸（2-hydroxy-5-octyloxybenzoic acid）をマトリックスとして用いて、dynorphinという疎水性ペプチドのＳ／Ｎ比を向上する質量分析法が開示されている。

特開２０１３−１６４３８２号公報（特許文献８）には、下記構造のケイ皮酸誘導体をマトリックス添加剤として用いて、疎水性ペプチドのイオン化効率を高める質量分析法が開示されている。式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。

特開２０１３−２１７６９５号公報（特許文献９）には、下記構造のp-ニトロアニリンのアミド化物をマトリックス添加剤として用いて、疎水性ペプチドのイオン化効率を高める質量分析法が開示されている。式中、Ｒは炭素数４〜１４のアルキル基を表す。

特開２０１３−１３４１０２号公報（特許文献１０）には、炭素数４〜１４のアルキルアルコールをマトリックス添加剤として用いて、疎水性ペプチドのイオン化効率を高める質量分析法が開示されている。

特開２０１４−１７４０１５号公報（特許文献１１）には、下記構造のジアルコキシ安息香酸誘導体（Ｉ）又は（II）をマトリックス添加剤として用いて、疎水性ペプチドのイオン化効率を高める質量分析法が開示されている。式（３）中、Ｍｅはメチル基を表し、Ｒ¹¹及びＲ¹²は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。また、式（４）中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、Ｒ²¹及びＲ²²は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。

US 2011/0207227号公報（特許文献１２）には、疎水性領域を有するＭＡＬＤＩ用サンプルプレートに予めマトリックスの微細結晶スポットを形成し、マトリックスの微細結晶スポット上にサンプルをアプライし、マトリックスの微細結晶スポット上のサンプルを洗浄し、サンプルをＭＳ測定により分析する、質量分析法が開示されている。

Org. Mass Spectrom. 28, 1476-1481, 1993（非特許文献５）には、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）と５−メトキシサリチル酸（5-methyoxysalicylic acid）との混合マトリックスsuper-ＤＨＢが開示されている。この混合マトリックスでは、ＤＨＢに対して、タンパク質及び糖鎖の感度が向上する。

特開２００５−３２６３９１号公報 ＷＯ２０１４／１３６７７９号公報 特開２０１３−１９０２５０号公報 US 2015/0276756号公報 US 2011/0217783号公報 US 2006/0240562号公報 US 2009/0269855号公報 特開２０１３−１６４３８２号公報 特開２０１３−２１７６９５号公報 特開２０１３−１３４１０２号公報 特開２０１４−１７４０１５号公報 US 2011/0207227号公報

Anal.Chem. 2013, 85, 9444-9448 Anal. Chem. 2012, 84, 4237-4243 Anal. Chem. 2014, 86, 5187-5187 Anal. Chem. 2005, 77, 5036-5040 Org. Mass Spectrom. 1993, 28, 1476-1481

上記のように、ＭＡＬＤＩ質量分析法において、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）や２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）を用いると疎水性ペプチドに対する感度が低いことを改良するために、種々の検討がなされてきた。しかしながら、上記特許文献２のように、２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン（ＡＴＨＡＰ）をマトリックスとして用いると、疎水性ペプチドを高感度に検出することができるが、一方、親水性ペプチドのイオン化は抑制され、親水性ペプチドの分析は困難である。

このように、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）のペプチドを分析できるマトリックスは見当たらないのが現状である。

また、例えば、特許文献３のように、質量分析の際に、疎水性ペプチドは、質量分析プレート上において、試料／マトリックス混合結晶の外縁部に濃縮される場合もある。このような場合には、混合物試料を質量分析する際に、混合結晶の外縁部にレーザ照射することにより、疎水性ペプチドのイオン化を起こさせ、疎水性ペプチドを感度よく分析することができる。しかしながら、疎水性ペプチドが試料／マトリックス混合結晶の外縁部に濃縮されないような場合には、レーザ照射の同一部位に試料中の複数の物質が存在し、いずれかの物質のイオン化が抑制され、それにより前記いずれかの物質の感度低下が生じることがある。

また、一般的マトリックス（ＤＨＢなど）を用いた場合において、スィ−トスポットが偏り、分析時間がかかるという問題もある。

本発明の目的は、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）のペプチドを、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる混合マトリックスを用いる質量分析法を提供することにある。

本発明者らは鋭意検討の結果、特定の２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン［alkylated trihydroxyacetophenone］と、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）や２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）等の一般的マトリックスとを混合マトリックスとして用いることにより、疎水性化合物のようなイオン化が難しい分子種をも効率よくイオン化できると共に、それよりも親水的な分子種をもイオン化できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下の発明を含む。
（１） 下記一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒは、炭素数３〜１２のアルキル基を表す。）
で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンと、
前記式（Ｉ）で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン（ここで、Ｒが、炭素数３のアルキル基のもの）よりも親水性である質量分析用マトリックス（II）とを混合マトリックスとして用いて、試料を分析するＭＡＬＤＩ質量分析法。

（２） 前記一般式（Ｉ）で示される化合物が、下記構造の１−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）オクタン−１−オンである、請求項１に記載の質量分析法。

（３） 前記質量分析用マトリックス（II）が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、及び２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）からなる群から選ばれる、上記（１）又は（２）に記載の質量分析法。

（４） 疎水性フォーカスプレートを用いる、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の質量分析法。

（５） 分析すべき試料が、ペプチド及びペプチド以外の他の化合物を含む混合試料である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の質量分析法。

（６） 分析すべき試料が、疎水性の異なるペプチドを含む混合試料である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の質量分析法。ペプチドにはタンパク質も含まれる。

（７） 分析すべき試料が、タンパク質消化物を含む混合試料である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の質量分析法。

特に、分析すべき試料が、膜タンパク質消化物を含む混合試料である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の質量分析法。

本発明において、炭素数３〜１２のアルキル基（一般式（Ｉ）おけるＲ）を有する２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンと、前記式（Ｉ）で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン（ここで、Ｒが、炭素数３のアルキル基のもの）よりも親水性である一般的な質量分析用マトリックス（II）とを、質量分析のマトリックスとして併用する。炭素数３〜１２のアルキル基Ｒを有する２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンを質量分析のマトリックスとして用いると、疎水性化合物、特に疎水性ペプチドのようなイオン化が難しい分子種のイオン化効率を向上させることができる。そして、より親水性である一般的な質量分析用マトリックス（II）を併用することにより、疎水性ペプチドのみならず、より親水的な分子種をもイオン化できる。それにより、本発明によれば、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）のペプチドやペプチド以外の化合物を容易に且つ効率よくイオン化させ、分析することができる。このように、本発明によれば、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）のペプチドの質量分析測定による検出感度が向上すると共に、各種試料の網羅性が向上する。

また、本発明において、疎水性フォーカスプレートを用いると、プレ−ト上で、親水性ペプチドと疎水性ペプチドのイオン検出部位が分離される。そのことにより、分析対象試料に含まれる化合物の疎水性度に応じて、レーザ照射部位を特定でき、迅速な分析が可能となる。

図１（ａ）は、実施例１におけるＣ８−ＡＴＨＡＰ及び４−ＣＨＣＡを混合マトリックスとして用いた場合の疎水性度の異なる１４種のペプチド混合物のマススペクトル結果を示す。図１（ｂ）は、比較例１におけるＣ８−ＡＴＨＡＰを単独マトリックスとして用いた場合の前記１４種のペプチド混合物のマススペクトル結果を示す。図１（ｃ）は、比較例１における４−ＣＨＣＡを単独マトリックスとして用いた場合の前記１４種のペプチド混合物のマススペクトル結果を示す。横軸は質量／電荷（ｍ／ｚ）、縦軸はイオンの相対強度（％Ｉｎｔ．）を表す。各図において、マスレンジｍ／ｚ：３０００〜５０００を示す。 図１（ａ），（ｂ），（ｃ）とそれぞれ同一測定のマススペクトル結果であるが、図２（ａ），（ｂ），（ｃ）は、マスレンジｍ／ｚ：１０００〜５０００を示す。 実施例1及び比較例１におけるＭＡＬＤＩプレ−ト上のウェル内の疎水性ペプチド NF-kB Inhibitor 及び親水性ペプチドAmyloid β 1-11の質量イメージング画像を示す。

［マトリックス］
本発明は、下記一般式（Ｉ）で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンと、前記式（Ｉ）で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン（ここで、Ｒが、炭素数３のアルキル基のもの）よりも親水性である質量分析用マトリックス（II）とを混合マトリックスとして用いて、試料を分析するＭＡＬＤＩ質量分析法である。

一般式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数３〜１２、例えば炭素数３〜１１のアルキル基を表す。すなわち、カルボニル基を含めたアシル基（−ＣＯ−Ｒ）の炭素数は４〜１３、例えば４〜１２である。本明細書において、一般式（Ｉ）で示される化合物（Ｒ＝炭素数Ｃ３〜１２のアルキル基）をＡＴＨＡＰ（Alkylated trihdroxyalkylyphenone）と表記することがある。例えば、カルボニル基を含めたアシル基（−ＣＯ−Ｒ）の炭素数がＣ８（アルキル基Ｒがヘプチル基）の場合、Ｃ８−ＡＴＨＡＰと表記する。また、一般式（Ｉ）の範囲外の化合物２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（Ｒ＝ＣＨ₃基）をＴＨＡＰと表記する。

一般式（Ｉ）においてＲが表す炭素数Ｃ３〜１２のアルキル基としては、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基が挙げられる。これらのアルキル基は直鎖状であってもよいし、又は分岐状であってもよい。分岐状のものとしては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、sec-ブチル基、２−エチルヘキシル基などが挙げられる。これらのうち、炭素数Ｃ５〜１１のアルキル基が好ましく、炭素数Ｃ５〜９のアルキル基がより好ましく、炭素数Ｃ７のアルキル基（カルボニル基を含めたアシル基としては、炭素数８のオクタン−１−オン基；すなわち、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ）が特に好ましい。分析対象が疎水性化合物である場合には、疎水性化合物のイオン化のために、Ｒが表すアルキル基がある程度の疎水性を有することが必要であると考えられる。

Ｃ８−ＡＴＨＡＰ

炭素数３〜１２、例えば炭素数３〜１１のアルキル基を有する２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンを質量分析のマトリックスとして用いると、疎水性化合物、特に疎水性ペプチドのようなイオン化が難しい分子種のイオン化効率を向上させることができる。

本発明において、前記一般式（Ｉ）のマトリックスＡＴＨＡＰ（Ｒ＝Ｃ３〜１２）と、前記式（Ｉ）において最も疎水性の低いＲが炭素数３のアルキル基のものよりも親水性である質量分析用マトリックス（II）とを混合マトリックスとして用いる。より親水的な質量分析用マトリックス（II）を用いることにより、疎水性ペプチドのみならず、より親水的な分子種をもイオン化できる。それにより、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）のペプチドやペプチド以外の化合物を容易に且つ効率よくイオン化させ、分析することができる。このようにして、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）のペプチドの質量分析測定による検出感度が向上すると共に、各種試料の網羅性が向上する。

前記質量分析用マトリックス（II）としては、公知のマトリックスの中から適宜選択することができる。例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）が挙げられる。

本発明において、一般式（Ｉ）で示されるマトリックスＡＴＨＡＰとマトリックス（II）とを含むマトリックス溶液の濃度については、例えば、次のようにすることができる。一般式（Ｉ）で示されるマトリックスＡＴＨＡＰの溶液濃度は、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ（飽和濃度）程度、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。マトリックス（II）の溶液濃度は、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ（飽和濃度）程度、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。

本発明において、上記濃度で作成したマトリックス溶液におけるマトリックスＡＴＨＡＰ（Ｉ）とマトリックス（II）との混合比率は、測定対象に応じて特に限定されないが、例えば、一般式（Ｉ）で示されるマトリックスＡＴＨＡＰの溶液に対するマトリックス（II）の溶液の体積比［（Ｉ）：（II）］で表して、例えば５０：１〜１：１０程度とするとよく、好ましくは１０：１〜１：１０程度とするとよく、より好ましくは１０：１程度とするとよい。

［質量分析対象］
本発明の混合マトリックスを用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が５００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００の分子（ペプチド、及びペプチド以外の分子を含む）でありうる。好ましくは、本発明のマトリックスは、疎水性物質及び親水性物質両者のイオン化を促進できるので、疎水性物質及び親水性物質両者の混合物の質量分析に好適に用いられる。すなわち、試料中には、分析対象としての疎水性物質以外に、他の物質（例えば親水性物質）が混在していてもよい。

本発明の混合マトリックスは、実施例で示すように、従来のマトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）単独を用いた場合と比べ、疎水性物質のイオン化を促進することができる。また、ＡＴＨＡＰ単独を用いた場合と比べ、親水性物質のイオン化を促進することができる。このため、試料中に疎水性物質と親水性物質とが混在していても、疎水性物質及び親水性物質両者を容易に分析することができる。この点から、本発明のマトリックスは、疎水性物質及び親水性物質両者の混合物の質量分析に好適に適用できる。もちろん、試料中に疎水性物質又は親水性物質のいずれかのみが含まれていても、それを容易に分析することができる。

疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは、例えば１０００以下、好ましくは−１０００以下でありうる。この場合、親水性物質の親水性の程度は、例えば１０００より大きい、好ましくは２０００より大きい値でありうる。

あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＨＰＬＣインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。ＨＰＬＣインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸（HFBA）を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相ＨＰＬＣ保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、ＨＰＬＣインデックスは、例えば４０以上、例えば４０〜１０，０００、好ましくは１００〜１，０００でありうる。この場合、親水性物質の親水性の程度は、例えば４０より小さい、好ましくは２０より小さい値でありうる。

さらに、本発明における疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙによって疎水性と判断しうる程度であればよい。ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、Oleg V. Krokhin によりAnalytical Biochemistry, 78, 7785-7795, 2006に報告されている。ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）の保持時間に対するペプチド配列特異的なアルゴリズムsequence-specific retention calculator (SSRCalc)に基づく疎水性指標である。ＨＰＬＣインデックスあるいはＢＢインデックスがアミノ酸組成情報のみを基に保持時間を推算するのに対し、ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙはペプチドの一次構造・二次構造までを含めて保持時間を推算する。本発明において、分析対象が、疎水性ペプチドである場合には、疎水性の程度は、ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙを指標とすることが適している。より具体的には、ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ（by the Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, available at http://hs2.proteome.ca/SSRCalc/SSRCalcX.html）は、例えば３０以上、好ましくは４０〜７０でありうる。この場合、親水性物質の親水性の程度は、例えば３０より小さい、好ましくは２５より小さい値でありうる。本発明において、広範囲の疎水性度合い（親水性から疎水性まで）、例えば、ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙが、０〜９０程度の物質の混合試料を分析することができる。

本発明においては、マトリックスＡＴＨＡＰ（Ｉ）により特に疎水性ペプチド（本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる）のイオン化能増強効果が高い。疎水性ペプチドであるか否かについては、ＢＢインデックス、ＨＰＬＣインデックス、又はＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ、好ましくはＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、疎水性度のより高いアミノ酸をより多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。疎水性ペプチドは、このようなペプチドの一次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相ＨＰＬＣカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。さらに、より親水的な質量分析用マトリックス（II）を用いることにより、疎水性ペプチドのみならず、より親水的な分子種をもイオン化できる。

［質量分析用結晶の作成］
質量分析用結晶は、分析対象とマトリックスとを溶媒中に少なくとも含む混合液の液滴を質量分析用ターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも分析対象、及びマトリックス）を残渣として得る工程とによって得ることができる。得られた残渣が、すなわち質量分析用結晶である。本明細書においては、質量分析用結晶と残渣とは同義である。

質量分析用ターゲットとしては、通常ＭＡＬＤＩ質量分析用として用いられる導電性を有する金属製プレートを使用することができる。具体的には、ステンレス製又は金製のプレートを用いることができる。疎水性フォーカスプレートを用いると、疎水性物質を該プレートのフォーカス部に濃縮できる。

前記混合液の液滴をターゲットプレート上に用意する具体的方法としては特に限定されない。例えば、まず、分析対象を含む試料溶液とマトリックス溶液とをそれぞれ別々に調製する。次に、それら溶液を混合させて混合液を得て、得られた混合液をターゲットプレート上に滴下する。又は、それら溶液をそれぞれターゲットプレート上の同じ位置に滴下することにより、ターゲットプレート上で混合させる（on-target mix法）。on-target mix法の場合、溶液の滴下順序は任意である。

前記混合液の溶媒としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ）及び水などからなる群から選ばれうる。より具体的には、混合液の溶媒としては、例えば、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、ＭｅＯＨ−ＴＦＡ、ＭｅＯＨ水溶液、ＥｔＯＨ−ＴＦＡ水溶液、ＥｔＯＨ水溶液、ＴＨＦ−ＴＦＡ水溶液、ＴＨＦ水溶液、ＤＭＳＯ−ＴＦＡ水溶液、ＤＭＳＯ水溶液などが用いられ、より好ましくは、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液やＡＣＮ水溶液を用いることができる。ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液におけるＡＣＮの濃度は例えば１０〜９０体積％、好ましくは２５〜７５体積％であり、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５〜１体積％、好ましくは０．０５〜０．１体積％でありうる。

前記混合液の液滴の体積としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液の液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、０．１μＬ〜２μＬ程度、例えば０．５μＬ程度の液滴を形成することができる。

次に、ターゲットプレート上の混合液の液滴から溶媒を除去する。溶媒の除去には溶媒の自然蒸発が含まれる。蒸発によって生じる残渣（すなわち質量分析用結晶）１個当たりに含まれるマトリックスの量は、例えば１ｐｍｏｌ〜１，０００ｎｍｏｌ、好ましくは１０ｐｍｏｌ〜１００ｎｍｏｌを目安にすることができる。分析対象の量は、例えば、マトリックス１０ｎｍｏｌに対し、試料１ａｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、又は１００ａｍｏｌ〜５０ｐｍｏｌの範囲で許容される。

残渣は、ターゲットプレートとの接触面において、略円の形状をなす。すなわち、残渣の外縁は略円の形状である。前記の略円の平均直径は、試料量、滴下量、マトリックス量及び溶媒組成等によって異なりうるが、例えば０．１〜３ｍｍ、好ましくは０．５〜２ｍｍである。なお、平均直径とは、１個の残渣において、前記の略円の重心を通る直線が残渣の外縁で切り取られた線分の長さの平均である。

質量分析用ターゲットとして通常の金属製プレートを用いた場合には、溶媒の除去によって得られる略円形の残渣において、分析対象物質は主に前記略円内に存在する。そのため、イオン化の際のレーザー照射位置を特定することなく、分析対象物質のイオン化を容易に行うことができる。一方、質量分析用ターゲットとして疎水性フォーカスプレートを用いた場合には、疎水性物質を該プレートのフォーカス部に濃縮しやすいので、前記フォーカス部へのレーザ照射により、疎水性物質を検出しやすくなる。

［質量分析装置］
本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。

［実施例１］
本実施例においては、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ（1-(2,4,6-trihydroxypheny)octane-1-one）、及び４−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を混合マトリックスとして用いた。

疎水性度の異なる１４種類のペプチドとして、
Ｎｏ．１：NF-kB Inhibitor (SSRCalc Hydrophobicity: 54.76)、
Ｎｏ．２：Melittin (SSRCalcHydrophobicity: 53.82)、
Ｎｏ．３：Amyloid β 1-42 (SSRCalc Hydrophobicity: 51.06)、
Ｎｏ．４：OVA-BIP hybrid peptide (SSRCalc Hydrophobicity: 50.23)、
Ｎｏ．５：Humanin (SSRCalcHydrophobicity: 49.95)、
Ｎｏ．６：[Gly14]-Humanin (SSRCalc Hydrophobicity: 49.51)、
Ｎｏ．７：Temporin A, amide (SSRCalc Hydrophobicity: 45.59)、
Ｎｏ．８：MPGΔNLS (SSRCalc Hydrophobicity: 45.15)、
Ｎｏ．９：Amyloid β 22-42 (SSRCalc Hydrophobicity: 42.37)、
Ｎｏ．１０：ACTH 18-39 (SSRCalc Hydrophobicity: 37.86)、
Ｎｏ．１１：Amyloid β 1-28 (SSRCalc Hydrophobicity: 36.31)、
Ｎｏ．１２：Amyloid β 1-11 (SSRCalc Hydrophobicity: 13.47)、
Ｎｏ．１３：GPHRSTPESRAAV (SSRCalc Hydrophobicity: 10.58)（配列番号１）、及び
Ｎｏ．１４：β-conglydnin 165-178 (SSRCalcHydrophobicity: 7.19)
を用いた。

（１）試料溶液として、上記１４種類のペプチド混合物(SSRCalc Hydrophobicity: 7.19〜54.76)の、0.02〜20 fmol/μL 50%ACN waterを作成した。
（２）マトリックス溶液として、Ｃ８−ＡＴＨＡＰの0.1mg/mL 75% ACN, 0.1% TFA waterを作成し、４−ＣＨＣＡの0.1mg/mL 75% ACN, 0.1% TFA waterを作成した。
（３）脱塩用添加剤として、methylenediphosphonic acid (MDPNA)を、0.02% MDPNA in water、あるいは、0.02% MDPNA in 75% ACN, 0.1% TFA waterで作成した。
（４）混合マトリックス溶液として、（２）のＣ８−ＡＴＨＡＰ溶液と４−ＣＨＣＡ溶液を１０：１ (v/v)で混合し、この溶液に、等量の（３）の0.02% MDPNA溶液のいずれかを加え、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ＋４−ＣＨＣＡ(10+1)溶液をそれぞれ作成した。
（５）hydrophobic μFocus 600 μm ＭＡＬＤＩplate (Hudson Surface Technology Inc., NJ, USA)上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（４）の混合マトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。
（６）溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS ［AXIMA Performance（登録商標）, Shimadzu/Kratos, UK］の、ポジティブイオンモード、リニアモ−ドで、ラスタ−分析により、計測した。

［比較例１］
本比較例においては、実施例１で用いたのと同じＣ８−ＡＴＨＡＰ（1-(2,4,6-trihydroxypheny)octane-1-one）、又は４−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を単独マトリックスとして用いた。

疎水性度の異なる１４種類のペプチドとして、実施例１で用いたのと同じものを用いた。

（１）試料溶液として、上記１４種類のペプチド混合物(SSRCalc Hydrophobicity: 7.19〜54.76)の、0.02〜20 fmol/μL 50%ACN waterを作成した。
（２）マトリックス溶液として、Ｃ８−ＡＴＨＡＰの0.1mg/mL 75% ACN, 0.1% TFA waterを作成し、４−ＣＨＣＡの0.1mg/mL 75% ACN, 0.1% TFA waterを作成した。
（３）脱塩用添加剤として、methylenediphosphonic acid (MDPNA)を、0.02% MDPNA in water、あるいは、0.02% MDPNA in 75% ACN, 0.1% TFA waterで作成した。
（４）単独マトリックス溶液として、（２）のＣ８−ＡＴＨＡＰ溶液に、等量の（３）の0.02% MDPNA溶液のいずれかを加え、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ単独マトリックス溶液をそれぞれ作成した。
同様に、（２）の４−ＣＨＣＡ溶液に、等量の（３）の0.02% MDPNA溶液のいずれかを加え、４−ＣＨＣＡ単独マトリックス溶液をそれぞれ作成した。
（５）hydrophobic μFocus 600 μm ＭＡＬＤＩplate (Hudson Surface Technology Inc., NJ, USA)上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（４）のＣ８−ＡＴＨＡＰ単独マトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。同様に、hydrophobic μFocus 600 μm ＭＡＬＤＩplate (Hudson Surface Technology Inc., NJ, USA)上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（４）の４−ＣＨＣＡ単独マトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。
（６）溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS ［AXIMA Performance（登録商標）, Shimadzu/Kratos, UK］の、ポジティブイオンモード、リニアモ−ドで、ラスタ−分析により、計測した。

図１〜３、及び表１に得られた結果を示す。

図１（ａ）は、実施例１におけるＣ８−ＡＴＨＡＰ及び４−ＣＨＣＡを混合マトリックスとして用いた場合（１ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ）のマススペクトル結果を示す。図１（ｂ）は、比較例１におけるＣ８−ＡＴＨＡＰを単独マトリックスとして用いた場合（１ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ）のマススペクトル結果を示す。図１（ｃ）は、比較例１における４−ＣＨＣＡを単独マトリックスとして用いた場合（１ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ）のマススペクトル結果を示す。いずれも、マスレンジｍ／ｚ：３０００〜５０００の部分が示されている。図２（ａ），（ｂ），（ｃ）は、図１（ａ），（ｂ），（ｃ）とそれぞれ同一測定のマススペクトル結果であるが、マスレンジｍ／ｚ：１０００〜５０００の部分が示されている。

図１によると、Ｃ８−ＡＴＨＡＰを単独マトリックスとして用いた場合、１ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌの試料濃度では、親水性ペプチド：Amyloid β 1-28 (SSRCalc Hydrophobicity: 36.31)、疎水性ペプチド：Amyloid β 1-42 (SSRCalcHydrophobicity: 51.06)のいずれも検出されなかった［図１（ｂ）］。４−ＣＨＣＡを単独マトリックスとして用いた場合、Amyloid β 1-28、及びAmyloid β1-42 の両者が検出されたが、Ｓ／Ｎは低く、疎水性ペプチド：Amyloid β 1-42の検出感度は低かった［図１（ｃ）］。Ｃ８−ＡＴＨＡＰ及び４−ＣＨＣＡを混合マトリックスとして用いた場合、Amyloid β 1-28、及びAmyloid β1-42 の両者が、Ｓ／Ｎが高く、感度も高く検出された［図１（ａ）］。

図２（ａ），（ｂ），（ｃ）によると、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ及び４−ＣＨＣＡを混合マトリックスとして用いた場合、広いマスレンジにおいて、親水性から疎水性に至る上記１４種のペプチドを、Ｓ／Ｎが高く、感度も高く検出されたことがわかる。図２（ａ），（ｂ），（ｃ）中のピーク上のＮｏ．は、上記１４種のペプチドＮｏ．に対応しており、各ペプチド由来のピークを示す。

表１において、ＡＴＨＡＰ（Ｃ８−ＡＴＨＡＰ）、ＡＴＨＡＰ＋ＣＨＣＡ（Ｃ８−ＡＴＨＡＰ＋４−ＣＨＣＡ）(10+1)、及びＣＨＣＡ（４−ＣＨＣＡ）を用いた１４種混合ペプチドの検出限界を、ペプチドの疎水性の高い順に示す。その結果、ＡＴＨＡＰ単独を用いた場合は親水性ペプチド数種が未検出（ＮＤ）、ＣＨＣＡ単独を用いた場合は疎水性ペプチド数種が未検出（ＮＤ）であった。これに対して、混合マトリックスＡＴＨＡＰ＋ＣＨＣＡ (10+1)を用いた場合は、疎水性から親水性まで全ペプチド試料Ｎｏ．1〜１４（SSRCalc Hydrophobicity: 7.19〜54.76）を検出した。さらに、ＡＴＨＡＰ＋ＣＨＣＡ (10+1)を用いることにより、ＡＴＨＡＰ単独あるいはＣＨＣＡ単独に比べ、全ペプチド試料の感度が、同程度あるいは１０〜１００倍以上向上した。なお、表１において、Ｓ／Ｎ＜２の場合には、未検出として“ＮＤ”と表記している。

図３は、ＡＴＨＡＰ、ＡＴＨＡＰ＋４−ＣＨＣＡ(10+1)、及び４−ＣＨＣＡをそれぞれ用いた場合の、比較的疎水性の高いペプチドであるNF-kB Inhibitor (SSRCalc Hydrophobicity: 54.76)と、比較的親水性のペプチドであるAmyloid β 1-11 (SSRCalc Hydrophobicity: 13.47)のＭＳイメ−ジングを示す。

その結果、混合マトリックスＡＴＨＡＰ＋４−ＣＨＣＡ(10+1)を用いた場合は、疎水性ペプチドのイオンは、結晶内部の全域で、親水性ペプチドのイオンがその外縁部で、検出されていることが確かめられた。これにより、疎水性ペプチドと親水性ペプチドの分離による試料の抑制効果あるいは濃縮効果が、網羅性や感度の向上に影響している可能性が考えられた。さらに、この分離効果により、レーザ照射位置の選定ができ、迅速な分析が可能となる。なお、図３において、Ｓ／Ｎ＜２の場合には、未検出として“ＮＤ”と表記している。

Claims (7)

1. 下記一般式（Ｉ）：
   （式中、Ｒは、炭素数３〜１２のアルキル基を表す。）
   で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンと、
   前記式（Ｉ）で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノン（ここで、Ｒが、炭素数３のアルキル基のもの）よりも親水性である質量分析用マトリックス（II）とを混合マトリックスとして用いて、試料を分析するＭＡＬＤＩ質量分析法。
2. 前記一般式（Ｉ）で示される化合物が、下記構造の１−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）オクタン−１−オンである、請求項１に記載の質量分析法。
   
3. 前記質量分析用マトリックス（II）が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、及び２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の質量分析法。
4. 疎水性フォーカスプレートを用いる、請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析法。
5. 分析すべき試料が、ペプチド及びペプチド以外の他の化合物を含む混合試料である、請求項１〜４のいずれかに記載の質量分析法。
6. 分析すべき試料が、疎水性の異なるペプチドを含む混合試料である、請求項１〜５のいずれかに記載の質量分析法。
7. 分析すべき試料が、タンパク質消化物を含む混合試料である、請求項１〜６のいずれかに記載の質量分析法。