JP2017083462A - 電気化学測定デバイス - Google Patents

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Abstract

【課題】生体試料の周囲における酸素濃度などの物理化学的な状態変化を生体試料の周囲に配置した複数の作用電極により測定する電気化学測定デバイスにおいて、取出し配線数の少ない電気化学測定デバイスを提供する。
【解決手段】電気化学測定デバイス２０は、基板１と、基板１に設けられ生体試料を載置する試料載置部１８と、基板１に設けられ試料載置部１８を囲む第１の電極３と、第１の電極３を覆う第１の絶縁層４と、を備える。第１の絶縁層４は、複数の開口を有し、第１の電極３は、第１の絶縁層４の開口から第１の電極３の一部が露出した複数の第１の電極露出部５を有する。
【選択図】図１

Description

本開示は、受精卵等の細胞や組織などの生体試料の活動状態の検査、解析に用いられる生体試料の電気化学測定デバイスに関する。
受精卵等の細胞や組織などの生体試料は、その内部と外部の間に様々な物質を輸送して活動を行っている。たとえば、心筋細胞はＫイオン、Ｎａイオン、Ｃａイオン等の輸送を行うことで電気信号や化合物による情報伝達を行い、心臓の脈動を制御している。また、受精卵は周辺の酸素を呼吸によって細胞内部に取り込み、取り込んだ酸素を消費しながら卵胞内部で分割を行っている。このような生体試料の活動状況を測定するための手段として、これら生体試料を電気化学測定デバイスに保持し、生体試料の周辺で発生する物理化学的な状態変化を電気的に測定する方法が知られている。これらは、モデル細胞による新薬候補化合物の薬理テストや、受精卵の活性を検査する方法として用いられている。
受精卵の呼吸活性を測定する方法としては、例えば、マイクロマニピュレータやマイクロピペットで受精卵を捕捉し、受精卵の近傍の酸素濃度を、作用電極を用いて電気化学測定を行う方法がある。この方法を用いることにより、受精卵の呼吸活性を定量できる。
上記の電気化学測定方法は、操作型電気化学顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＣＭ）を基に構成されているため、プローブの作用電極を生体試料、例えば、受精卵近傍に近づける操作を行う必要がある。しかし、この作用電極の操作は手動により行う必要があるため操作性に問題があり、作業者の技術によりばらつきが生じるという課題があった。
一方で、操作性を向上させる手段として、基板上に微小な作用電極を設置した従来のプレーナー型の受精卵の呼吸活性測定装置が知られている。
受精卵の呼吸活性測定装置は、基板上に電極を配置して形成されている。基板の全体は二酸化珪素で覆われ絶縁されている。一部の二酸化珪素は除去され、電極が露出している。電極は３本配置されている。また、胚位置規定補助のためのウェルを基板上に作製し、逆円錐型のＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）ウェルが基板に接着されている。
なお、本開示に関する先行技術文献としては、例えば、特許文献１や特許文献２が知られている。
特開２００２−１２２５６８号公報 特開２０１０−１２１９４８号公報
細胞等の生体試料は、活動により周囲に物理化学的な変化を生じさせる。しかしながら、活動により生体試料の周囲に及ぼす変化は、均一ではなく特定の方向に偏りをもつ場合がある。例えば、受精卵は、発生段階の進行と共に呼吸活性に極性を持つため、受精卵の周囲の酸素の消費量に偏りが生じる。つまり、受精卵からの方向によって、同一の受精卵でも呼吸量が変化する場合がある。そのため、従来の呼吸活性測定装置は、生体試料の電気化学測定を行う場合の生体試料の活動による周囲の物理化学的な変化の偏りを考慮し、生体試料に対して周囲に複数の作用電極を配置している。そして、呼吸活性測定装置は、それぞれの作用電極からの測定値を測定し、平均値または総和を算出することにより、生体試料の平均的な活動状態を電気化学測定により測定することができる。しかしながら、従来の呼吸活性測定装置は、測定に使用する作用電極と同数の取出し配線が必要となる。そのため、呼吸活性測定装置は、作用電極が多くなるにつれ取出し配線が多くなるという課題がある。
本開示は、上記の課題を解決するものであり、生体試料の周囲における酸素濃度などの物理化学的な状態変化を生体試料の周囲に配置した複数の作用電極により測定する電気化学測定デバイスにおいて、取出し配線数の少ない電気化学測定デバイスを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために本開示における生体試料の電気化学測定デバイスは、基板と、基板に設けられ生体試料を載置する試料載置部と、基板に設けられ試料載置部を囲む第１の電極と、第１の電極を覆う第１の絶縁層とを備える。
第１の絶縁層は、複数の開口を有し、第１の電極は、第１の絶縁層の開口から第１の電極の一部が露出した複数の第１の電極露出部を有する。
本開示における生体試料の電気化学測定デバイスは、基板に設けられた電極上に、絶縁層から露出し、試料載置部から等距離の位置に設けられた複数の第１の電極露出部を有する。このような構成とすることにより、電気化学測定デバイスは、複数の電極露出部に接続されるそれぞれの取り出し電極を必要としない、つまり取出し配線数の少ない電気化学測定デバイスを実現できる。
図１は、実施の形態１における生体試料の電気化学測定デバイスの上面図である。 図２は、実施の形態１における生体試料の電気化学測定デバイスの断面図である。 図３は、実施の形態１における生体試料の電気化学測定デバイスの他の例を示す断面図である。 図４は、実施の形態１における生体試料の電気化学測定デバイスの他の例を示す断面図である。 図５は、実施の形態１における生体試料の電気化学測定デバイスの他の例を示す上面図である。 図６は、実施の形態１における生体試料の電気化学測定デバイスの動作を模式的に示す断面図である。 図７は、実施の形態２における生体試料の電気化学測定デバイスの上面図である。
以下では、本開示の実施の形態に係る電気化学測定デバイスについて、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置及び接続形態などは、一例であり、本開示を限定する趣旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
また、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。各図において、実質的に同一の構造については同一の符号を付しており、重複する説明は省略または簡略化している。
（実施の形態１）
図１は、本実施の形態における生体試料の電気化学測定デバイス２０を模式的に示した上面図である。図２は、図１に示す生体試料の電気化学測定デバイス２０の２−２線における断面図である。
生体試料の電気化学測定デバイス２０は、基板１と、基板１上に設けられた生体試料を載置する試料載置部１８と、基板１上に設けられ試料載置部１８を囲む第１の電極３と、第１の電極３を覆う第１の絶縁層４とからなる。
第１の絶縁層４は、複数の開口を有し、第１の電極３は、第１の絶縁層４の複数の開口から第１の電極３の一部が露出した複数の第１の電極露出部５を有する。
このような構成とすることにより、電気化学測定デバイスは、複数の電極露出部に接続されるそれぞれの取り出し電極を必要としない、つまり取出し配線数の少なくすることができる。
基板１は、例えば、ガラスや、樹脂や、シリコンや、セラミックなどで形成される。
試料載置部１８は、例えば、基板１の上面に設けられる有底の孔、つまり凹部である。試料載置部１８は、例えば、円柱状や、多角柱状の孔である。本実施の形態において、試料載置部１８の径は、例えば、２００μｍである。試料載置部１８の径は、生体試料の大きさに応じて決定される値である。また、試料載置部１８の深さは、例えば８０μｍである。試料載置部１８の深さは、生体試料の高さの半分以下であることが好ましい。試料載置部１８の深さを生体試料の高さの半分以下とすることにより、生体試料が試料載置部１８から露出し、第１の電極露出部５による酸素濃度などの物理化学的な状態変化を検出しやすくなる。ただし、試料載置部１８の深さは生体試料の大きさに応じて自由に予め設定することができ、生体試料の高さの半分以下に限定されるものではない。
また、試料載置部１８の壁面１８Ａと試料載置部１８の底面１８Ｂは親水処理されることが好ましい。試料載置部１８の壁面１８Ａと底面１８Ｂが親水性を有することにより、試料載置部１８の内部には溶液が容易に注入され、気泡等の残留を抑制することができる。壁面１８Ａと底面１８Ｂの親水処理は、例えばアッシング処理などにより行うことができる。
なお、試料載置部１８は、図３に示すように、生体試料を確実に固定できるように、試料載置部１８の壁面１８Ａが試料載置部の底面１８Ｂに対して、９０°より大きく、かつ１８０°より小さい角度を有するテーパ形状であることが望ましい。また、図４に示すように、試料載置部１８は、生体試料を確実に固定できるように、円錐状、多角錐の孔を有していてもよい。
第１の電極３は基板１上に試料載置部１８を囲むように形成される。第１の電極３は、例えば、楕円形や円形のリング形状、または、多角形の形状等とすることができる。第１の電極３は、リング形状であることが好ましい。さらには、第１の電極３は試料載置部１８を中心とした同心円状であることが好ましい。第１の電極３は、例えば白金や、金や、銀などの貴金属で構成される。また、第１の電極３は、炭素や、コバルト酸リチウムなどの、電池の電極材料として一般的に使用される材料で構成されていてもよい。第１の電極３の材料は、測定時の培養液の組成や必要な電圧、電流等を考慮して選べばよい。なお、第１の電極３は、電極の一部が途切れた構成であるが、つながっていてもよい。
第１の絶縁層４は第１の電極３を覆うように、基板１上に設けられる。第１の絶縁層４の厚みは、例えば、０．５μｍである。第１の絶縁層４は第１の電極３と培養液を絶縁できるよう、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、有機物等で構成される。
第１の絶縁層４は、第１の電極３上に開口を有する。そのため、第１の電極３は、第１の絶縁層４の開口において、第１の電極露出部５を有する。第１の電極３は、第１の電極露出部５で培養液と接触する。第１の絶縁層４の開口は、例えば、円形や多角形等で形成される。第１の電極露出部５の径は、例えば、５μｍである。
このように、第１の電極３を第１の絶縁層４で覆い、第１の電極露出部５のみで培養液と接触する構成とすることにより、以下の理由で、ノイズを低減することができ正確に電気化学測定を行うことができる。
第１の電極３を第１の絶縁層４で覆わずに、第１の電極３全体を培養液と接触させて電気化学測定を行う場合、電極面積拡大にともないノイズとなる非ファラデー電流の増大が生じ、正確な電気化学測定を行うことができない場合がある。また、例えば、受精卵の呼吸活性に伴う培養液の溶存酸素を測定する際、電極面積拡大にともない電気化学反応に伴う酸素消費量の増大し、受精卵近傍の酸素濃度に影響を及ぼし、正確に呼吸活性測定を行うことができない場合がある。
したがって、第１の電極露出部５の面積は、測定ノイズである非ファラデー電流が小さくなるよう、また電気化学反応に伴う酸素消費による受精卵近傍の酸素濃度の影響を小さくするように、５００μｍ２以下であることが好ましい。
さらに、第１の電極３から引き出される配線６は、絶縁層７で被覆されている。このような構成とすることで、不要な位置での電気化学反応による電流検出を低減できる。ただし、配線６は、絶縁層７で被覆されていなくてもよい。この場合、配線６は培養液に接触する。
また、第１の電極露出部５は生体試料の周囲の複数の位置で測定を行うため、第１の電極３上に複数配置される。複数の第１の電極露出部５は、等間隔に配置されることが好ましい。例えば、第１の電極３上に第１の電極露出部５を４つ設ける場合、試料載置部１８を中心として９０度ごとに等間隔に配置されることが望ましい。また、例えば、第１の電極３上に第１の電極露出部５を８つ設ける場合、図５に示すように試料載置部１８を中心として４５度ごとに等間隔に配置されることが望ましい。言い換えると、複数の第１の電極露出部５は、試料載置部１８の中心に対して点対象となるように設けられることが好ましい。
第１の電極露出部５は、それぞれの近傍で拡散層を形成する。ここで、拡散層は、第１の電極露出部５の表面付近の化学種の濃度分布が不均一な領域である。受精卵の呼吸活性に伴う培養液の溶存酸素を測定する場合、化学種は酸素である。そのため、第１の電極露出部５は、形成する拡散層が他の第１の電極露出部５の電気化学測定に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、複数の第１の電極露出部５において、隣り合う２つの第１の電極露出部５間の距離は、第１の電極露出部５の径の５倍以上であることが好ましい。このような構成とすることで、第１の電極露出部５が形成する拡散層が隣の第１の電極露出部５が形成する拡散層へ及ぼす影響を小さくできる。その結果、生体試料の呼吸活性による電流値変化を正確に計測できる。より好ましくは、複数の第１の電極露出部５において、隣り合う２つの第１の電極露出部５間の距離は、第１の電極露出部５の径の６．５倍以上である。このような構成とすることで、第１の電極露出部５が形成する拡散層が隣の第１の電極露出部５が形成する拡散層へ及ぼす影響をほとんど無くすことができる。ここで、隣り合う位置関係とは、例えば、距離的に最も近い位置関係を意味する。
なお、第１の電極露出部５の径とは、第１の電極露出部５を内部に含む最小の円の直径である。例えば、第１の電極露出部５が円であるとき、第１の電極露出部５の径は、直径である。また、第１の電極露出部５が長方形であるとき、第１の電極露出部５の径は、対角線の長さである。
また、複数の第１の電極露出部５は、試料載置部１８の中心から略等距離の位置に配置されることが好ましい。複数の第１の電極露出部５は、第１の電極３により電気的に接続されている。試料載置部１８から等距離に複数の第１の電極露出部５を設けることにより、生体試料の周囲における酸素濃度などの物理化学的な状態変化を、第１の電極３を介して電流値の平均または総和として測定することができる。そのため、生体試料活動に偏りが生じていても、電気化学測定デバイス２０は、生体試料の周囲の酸素濃度を電気化学測定により平均的に測定できる。
電気化学測定デバイス２０は、生体試料の活動に影響されない基準値を測定するために、基板１上にブランク電極８を設けてもよい。ブランク電極８は、開口を有する絶縁層９で覆われており、開口から表面が露出するブランク電極露出部１０を有する。絶縁層９は、第３の絶縁層に相当する。ブランク電極８は第１の電極３と同じ素材により構成される。ブランク電極露出部１０は、１つでも複数でもよい。ただし、ブランク電極露出部１０の総面積は、第１の電極露出部５の総面積と同じであることが好ましい。より好ましくは、ブランク電極露出部１０の数と大きさは、第１の電極露出部５の数や大きさと同じである。ブランク電極露出部１０と第１の電極露出部５の構成を同じにすることで、基準値を計算することなく測定することができる。ブランク電極露出部１０の径は、例えば、５μｍである。
また、ブランク電極露出部１０は生体試料周辺の物理化学的な変化がブランク電極露出部１０で生じる電気化学反応に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、最も近いブランク電極露出部１０の端部と試料載置部１８の端部との距離は４００μｍ以上であることが好ましい。
また、ブランク電極露出部１０は、ブランク電極露出部１０が形成する拡散層または、第１の電極露出部５が形成する拡散層が重なり、第１の電極露出部５及びブランク電極露出部１０で生じる電気化学反応に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、ブランク電極露出部１０の端部と、第１の電極露出部５の端部との最も近い距離は、第１の電極露出部５の径の５倍以上であることが望ましい。より好ましくは、ブランク電極露出部１０の端部と、第１の電極露出部５の端部との最も近い距離は、第１の電極露出部５の径の６．５倍以上である。また、ブランク電極露出部１０が複数個存在する場合は、複数のブランク電極露出部１０のそれぞれと、第１の電極露出部５との距離が上記の関係を満たすとよい。なお、ブランク電極露出部１０の径と第１の電極露出部５の径が大きく異なる場合、ブランク電極露出部１０の端部と、第１の電極露出部５の端部との最も近い距離を、第１の電極露出部５の径の半分とブランク電極露出部１０の径の半分の和の５倍以上としてもよい。
隣り合うブランク電極露出部１０の端部間の距離は、ブランク電極露出部１０の径の５倍以上であることが好ましい。より好ましくは、隣り合うブランク電極露出部１０の端部間の距離は、ブランク電極露出部１０の径の６．５倍以上である。
なお、ブランク電極露出部１０の径とは、ブランク電極露出部１０を内部に含む最小の円の直径である。例えば、ブランク電極露出部１０が円であるとき、ブランク電極露出部１０の径は、直径である。また、ブランク電極露出部１０が長方形であるとき、ブランク電極露出部１０の径は、対角線の長さである。
また、電気化学測定デバイス２０は、基板１上に対向電極１１を設けてもよい。対向電極１１は、第１の電極露出部５における電気化学反応を持続的に生じさせるため、第１の電極露出部５における電気化学反応と逆の反応を生じさせる。つまり、対向電極１１は、作用電極である第１の電極と対になる電極である。電気化学測定デバイス２０において、対向電極１１は、目的対象の電気化学反応を起こさせる作用電極である第１の電極露出部５と対になる電極である。例えば、受精卵の呼吸活性に伴う培養液の溶存酸素を測定する場合、対向電極１１は、第１の電極露出部５における酸素の還元反応において必要な電子を供給するため、酸化反応を生じさせる。
対向電極１１は、開口を有する絶縁層１２で覆われている。対向電極１１は、開口から表面が露出する対向電極露出部１３を有する。絶縁層１２は、第４の絶縁層に相当する。対向電極１１は基板１上に第１の電極３、及び、試料載置部１８を囲むように形成される。対向電極１１は、例えば、楕円形や円形のリング形状、または、多角形の形状等とすることができる。対向電極１１は、リング形状であることが好ましい。さらには、対向電極１１は試料載置部１８を中心とした同心円状であることが好ましい。対向電極１１は、例えば白金や、金や、銀などの貴金属で構成される。また、対向電極１１は、炭素や、コバルト酸リチウムなどの、電池の電極材料として一般的に使用される材料で構成されていてもよい。対向電極１１の材料は、測定時の培養液の組成、必要な電圧、電流等を考慮して選べばよい。なお、絶縁層１２は設けなくてもよい。
対向電極露出部１３は生体試料周辺の物理化学的な変化が対向電極露出部１３で生じる電気化学反応に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、対向電極露出部１３の端部と試料載置部１８の端部との距離は４００μｍ以上であることが好ましい。また、対向電極露出部１３は、対向電極露出部１３が形成する拡散層と、電極露出部５、１０が形成する拡散層が重なり、電極露出部５、１０、１３で生じる電気化学反応に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、対向電極露出部１３の端部と電極露出部５、１０の端部との距離は４００μｍ以上であることが好ましい。また、対向電極露出部１３の面積は、第１の電極露出部５の総面積以上であることが好ましい。同様にして、対向電極露出部１３の面積は、ブランク電極露出部１０の総面積以上であることが好ましい。
対向電極１１は必ずしも基板１上に形成される必要はない。基板１上に設けない場合は、対向電極１１として白金や、金、銀などの貴金属や、炭素や、コバルト酸リチウムなどの、電池の電極材料として一般的に使用される材料で構成されたバルク体を培養液中に挿入して測定してもよい。また、対向電極１１は必ずしも必要ではなく、存在しなくてもよい。
なお、第１の絶縁層４やブランク電極８上の絶縁層９、対向電極１１上の絶縁層１２は、同一の絶縁層で構成してもよい。つまり、第１の電極３やブランク電極８、対向電極１１の間には、絶縁体が設けられていてもよい。このように、同一の絶縁層で構成することにより、製造プロセスにおいて工数を削減することができる。
参照電極（図６の参照電極１７）は、培養液中に挿入される。参照電極の材料は、白金または金等が使用される。また、参照電極の他の材料として、銀と塩化銀とを含む材料を用いてもよい。参照電極は、参照電極が形成する拡散層と、各電極露出部５、１０、１３が形成する拡散層が重なり、電極露出部５、１０、１３で生じる電気化学反応に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、参照電極の端部と電極露出部５、１０、１３の端部との距離は４００μｍ以上であることが好ましい。なお、参照電極は基板１上に形成されていてもよい。
第１の電極３とブランク電極８はそれぞれ個別に計測アンプに接続される。第１の電極３やブランク電極８と参照電極との間の電位差や、第１の電極３やブランク電極８において検出される電気化学反応による電流は個別に計測される。
なお、基板１が導体あるいは半導体の場合、基板１と第１の電極３との間には絶縁層（図示せず）を設けることが好ましい。また基板１上に対向電極１１もしくは参照電極を設置する場合、基板１と、対向電極１１や参照電極との間には絶縁層を設けることが好ましい。絶縁層は二酸化ケイ素、窒化ケイ素、有機物等で構成される。
また基板１の外周または、周縁部は、壁によって囲まれていても良い。壁を形成することにより、壁内部にウェルが形成される。壁は例えば、ガラスや、樹脂や、シリコンや、セラミックや、シリコーンゴム等により形成される。
次に生体試料の電気化学測定デバイス２０の動作を説明する。図６は、本実施の形態における生体試料の電気化学測定デバイス２０の動作を模式的に示す断面図である。
生体試料は、例えば、細胞や、組織や、受精卵などである。生体試料からの活性酸素や代謝物などは、放射状に濃度勾配が形成される。ここで、生体試料１４は受精卵として説明する。
電気化学測定デバイス２０は周縁部に壁１５が設けられている。そのため、基板１と壁１５に囲まれた領域内に、培養液を導入するウェル１６が形成される。
まず、ウェル１６内に、受精卵を含む培養液を注入し、受精卵を試料載置部１８に載置する。
その後、参照電極１７を培養液内に挿入する。参照電極１７が基板１上に設けられている場合は、挿入する必要はない。また、対向電極１１が基板１に設けられていない場合は、対向電極を培養液内に挿入する。
そして、参照電極１７の電位を基準とし、第１の電極３に電位を印加し、第１の電極３において検出される電気化学反応による電流値を計測する。第１の電極露出部５付近では、培養液中の酸素の還元反応が生じる。第１の電極露出部５付近で還元される酸素量は、培養液中の酸素量に応じて変化する。そして、第１の電極３には、酸素の還元反応に応じた電流が流れる。したがって、電流値を計測することにより、培養液内の溶存酸素量が測定できる。溶存酸素量は受精卵等の生体試料１４が活動した結果として消費された酸素量と関係している。そのため、溶存酸素量を測定することにより、受精卵等の生体試料１４の活動状態がわかる。また、作用電極である第１の電極３に流れる電流を測定する際、対向電極１１には、第１の電極露出部５の酸素の還元反応に必要な電子を供給するため、作用電極とは逆の電位をかける。このように、対向電極１１から電子を供給することで、電気化学測定デバイス２０は、第１の電極露出部５における酸素の還元反応を持続させ、継続した測定を行うことができる。なお、対向電極１１は必ずしも必要なく、培養液内に挿入しなくてもよい。
また、ブランク電極８は、生体試料に影響されない培養液中の溶存酸素の基準値を測定するために用いられる。ブランク電極８に第１の電極と同様の電位を印加し、流れる電流値を測定する。ブランク電極８による基準値の測定は、第１の電極３による測定の前後、または、同時に行う。なお、ブランク電極８を設けない構成であってもよい。この場合、生体試料がない状態で、第１の電極３に電位を印加して電流を測定することにより、基準値を測定することができる。
（実施の形態２）
以下、実施の形態２における生体試料の電気化学測定デバイスついて図面を参照しながら説明する。実施の形態２において、実施の形態１と同様の構成については同一符号を付し、その詳細な説明は省略する。
図７は、本実施の形態における生体試料の電気化学測定デバイス３０の上面図である。
実施の形態２と実施の形態１との相違点は、生体試料の電気化学測定デバイス３０の基板１上に、第１の電極３を囲むように、第２の絶縁層３１で覆われた第２の電極３２が設けられている点である。そのため、第２の電極露出部３３と試料載置部１８との距離は、第１の電極露出部５と試料載置部１８との距離よりも大きい。
このように、第１の電極３の外側に第２の電極３２を設けることにより、試料載置部１８から異なる距離で生体試料の電気化学測定を行うことができる。そのため、生体試料からの距離に依存した生体試料の活動状況をモニタリングすることができる。
第２の電極３２は、例えば、楕円形や円形のリング形状、または、多角形の形状等とすることができる。第２の電極３２は、リング形状であることが好ましい。さらには、第２の電極３２は試料載置部１８を中心とした同心円状であることが好ましい。
第２の電極３２は、第１の電極３と同じ材料で構成することができる。第２の電極３２は、例えば、白金や、金、銀などの貴金属で構成される。また、第２の電極３２は、炭素や、コバルト酸リチウムなどの、電池の電極材料として一般的に使用される材料で構成されていてもよい。第２の電極３２の材料は、測定時の培養液の組成や必要な電圧、電流等を考慮して選べばよい。
第２の電極３２は、第２の絶縁層３１で覆われている。第２の絶縁層３１の厚みは、例えば、０．５μｍである。第２の絶縁層３１は第２の電極３２と培養液を絶縁できるよう、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、有機物等で構成される。
また、第２の絶縁層３１は、第２の電極３２上に複数の開口を有する。そのため、第２の電極３２は、第２の絶縁層３１の複数の開口において、第２の電極露出部３３を有する。第２の電極３２は、第２の電極露出部３３で培養液と接触する。第２の絶縁層３１の開口は、円形や多角形等で形成される。第２の電極露出部３３の径は、例えば、５μｍである。
このように、第２の電極３２を第２の絶縁層３１で覆い、第２の電極露出部３３のみで培養液と接触する構成とすることにより、以下の理由で、ノイズを低減することができ正確に電気化学測定を行うことができる。
第２の電極３２を第２の絶縁層３１で覆わずに、第２の電極３２全体を培養液と接触させて電気化学測定を行う場合、電極面積拡大にともないノイズとなる非ファラデー電流の増大が生じ、正確な電気化学測定を行うことができない場合がある。また、例えば、受精卵の呼吸活性に伴う培養液の溶存酸素を測定する際、電極面積拡大にともない電気化学反応に伴う酸素消費量の増大し、受精卵近傍の酸素濃度に影響を及ぼし、正確に呼吸活性測定を行うことができない場合がある。
したがって、第２の電極露出部３３の面積は、測定ノイズである非ファラデー電流が小さくなるよう、また電気化学反応に伴う酸素消費による受精卵近傍の酸素濃度の影響を小さくするように、５００μｍ２以下であることが好ましい。
さらに、第２の電極３２から引き出される配線３４は、絶縁層３５で被覆されている。このような構成とすることで、意図しない位置での電気化学反応による電流検出を低減できる。ただし、配線３４は、絶縁層３５で被覆されていなくてもよい。この場合、配線３４は培養液に接触する。
なお、第１の電極３を覆う第１の絶縁層４と第２の電極３２を覆う第２の絶縁層３１は、同一の絶縁層で形成してもよい。一層の同じ絶縁層で形成することにより、製造プロセスの工数を削減することができる。
また、第２の電極露出部３３は生体試料の周囲の複数の位置で測定を行うため、第２の電極３２上に複数配置されることが好ましい。複数の第２の電極露出部３３は、等間隔に配置されることが好ましい。例えば、第２の電極３２上に第２の電極露出部３３を４つ設ける場合、試料載置部１８を中心として９０度ごとに等間隔に配置されることが望ましい。また、例えば、第２の電極３２上に第２の電極露出部３３を８つ設ける場合、試料載置部１８を中心として４５度ごとに等間隔に配置されることが望ましい。
第２の電極露出部３３は、それぞれの近傍で拡散層を形成する。そのため、第２の電極露出部３３は、形成する拡散層が第１の電極露出部５および他の第２の電極露出部３３の電気化学測定に影響を及ぼさないように配置されることが好ましい。例えば、第２の電極露出部３３は、隣り合う第１の電極露出部５または第２の電極露出部３３との間の距離が、第２の電極露出部３３の径の５倍以上であることが好ましい。ここで、隣り合う位置関係とは、例えば、距離的に最も近い位置関係を意味する。
このような構成とすることで、第２の電極露出部３３が形成する拡散層が隣の第１の電極露出部５または第２の電極露出部３３が形成する拡散層へ及ぼす影響を小さくできる。その結果、生体試料の呼吸活性による電流値変化を正確に計測できる。より好ましくは、第２の電極露出部３３は、隣り合う第１の電極露出部５または第２の電極露出部３３との間の距離が、第２の電極露出部３３の径の６．５倍以上である。このような構成とすることで、第２の電極露出部３３が形成する拡散層が隣の第２の電極露出部３３が形成する拡散層へ及ぼす影響をほとんど無くすことができる。
また、第２の電極３２の第２の電極露出部３３は、試料載置部１８から見て第１の電極３の隣り合う２つの第１の電極露出部５の間に設けることが好ましい。つまり、第２の電極露出部３３は、隣接する２つの第１の電極露出部５の中間点と試料載置部１８の中心とを結ぶ線上に設けられることが好ましい。この構成により、第１の電極３と第２の電極３２との距離を近づけた状態で、第１の電極露出部５と第２の電極露出部３３とを最も離間させることができる。
なお、第２の電極３２の第２の電極露出部３３は、ブランク電極露出部１０との距離が、第２の電極露出部３３の径の半分とブランク電極露出部１０の径の半分との和の６．５倍以上離れて設置されることが好ましく、対向電極露出部１３、参照電極との距離が４００μｍ以上離れて配置されることが好ましい。ここで、第２の電極露出部３３の径とは、第２の電極露出部３３を内部に含む最小の円の直径である。例えば、第２の電極露出部３３が円であるとき、第２の電極露出部３３の径は、直径である。また、第２の電極露出部３３が長方形であるとき、第２の電極露出部３３の径は、対角線の長さである。
また、複数の第２の電極露出部３３は、試料載置部１８の中心から略等距離の位置に配置されることが好ましい。複数の第２の電極露出部３３は、第２の電極３２により電気的に接続されている。試料載置部１８から等距離に複数の第２の電極露出部３３を設けることにより、生体試料の周囲における酸素濃度などの物理化学的な状態変化を、第２の電極３２を介して電流値の平均または総和として測定することができる。そのため、生体試料活動に偏りが生じていても、電気化学測定デバイス３０は、周囲の酸素濃度を電気化学測定により平均的に測定できる。
第２の電極３２の第２の電極露出部３３の個数、総面積は、第１の電極３の第１の電極露出部５の個数、総面積と同じであることが好ましい。
第１の電極露出部５の面積はそれぞれ同じ大きさである。第２の電極露出部３３の面積はそれぞれ同じ大きさである。さらに、第１の電極露出部５の一つの面積と第２の電極露出部３３の一つの面積は同じ大きさである。
なお、第２の電極３２は、電極の一部が途切れた構成であるが、つながっていてもよい。ただし、第１の電極３の配線６を基板１の表面に設ける場合、第２の電極３２は、電極の一部が途切れた構成であることが好ましい。この場合、第１の電極３の配線６は、第２の電極３２の途切れた部分に設けることができる。同様に、対向電極１１も電極の一部が途切れた構成とすることができる。
なお、第２の電極３２の外側に、さらに１つまたは複数の電極を設けた構成としてもよい。試料載置部１８から異なる距離に電極露出部を設けることにより、より詳細に、生体試料からの距離に応じた電気化学測定を行うことができる。
第１の電極３、及び、第２の電極３２は、それぞれ計測アンプに接続され、それぞれの電流を同時に計測できる。これにより、生体試料の周辺で発生する物理化学的変化である溶存酸素量等を同時に計測できる。また、スイッチやリレーを用いて一つの計測アンプに第１の電極３と第２の電極３２をつなげ、時間を分割（時分割）して計測してもよい。スイッチやリレーからなるスイッチング回路を用いて、複数の電極を一つの計測アンプに接続することにより、装置を小型化することができる。ただし、スイッチング回路を用いる場合、スイッチやリレーは、高速に動作するものであることが望ましい。高速に動作できるスイッチ等を用いることで、溶存酸素量等の時間変化に対して正確に生体試料の周囲の電気化学測定を行うことができる。
本開示の生体試料の電気化学測定デバイスは、試料載置部から等距離の位置に設置された複数の第１の電極露出部を有する。このような構成とすることにより、生体試料近傍の複数方向の、例えば酸素濃度などの、物理化学的状態変化の合計値を検出でき、生体試料の周辺の物理化学的状態変化を平均的に測定することができる。
第１の電極露出部は、第１の絶縁層に覆われた第１の電極の一部が露出したものであるため、複数の第１の電極露出部は、第１の電極により電気的に接続されている。このため、複数方向の生体試料の例えば酸素濃度など物理化学的状態変化の合計値の情報を１本の配線から取得することが可能である。
また、第１の電極の外側に複数の第２の電極を有する。このような構成とすることにより、生体試料との距離が異なる第１の電極または第２の電極と参照電極の間を流れる電流から、溶存酸素量の濃度勾配が測定できる。その結果、生体試料の周辺を空間的に分解した物理化学的変化を容易に計測できる。
なお、本開示において、上面等の方向を示す用語は電気化学測定デバイスの構成要素の相対的な位置関係にのみ依存する相対的な方向を示し、鉛直方向等の絶対的な方向を示すものではない。
以上、一つまたは複数の態様に係る電気化学測定デバイスについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、一つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
本開示は、受精卵等の細胞や組織などの生体試料の活動状態を、電気化学的に測定する電気化学測定デバイス等に利用することができる。
１ 基板
３ 第１の電極
４ 第１の絶縁層
５ 第１の電極露出部
６、３４ 配線
７、９、１２、３５ 絶縁層
８ ブランク電極
１０ ブランク電極露出部
１１ 対向電極
１３ 対向電極露出部
１４ 生体試料
１５ 壁
１６ ウェル
１７ 参照電極
１８ 試料載置部
１８Ａ 壁面
１８Ｂ 底面
２０、３０ 電気化学測定デバイス
３１ 第２の絶縁層
３２ 第２の電極
３３ 第２の電極露出部

Claims (18)

  1. 基板と、
    前記基板に設けられ生体試料を載置するための試料載置部と、
    前記基板に設けられ前記試料載置部を囲む１つの第１の電極と、
    前記第１の電極を覆う第１の絶縁層と、を備え、
    前記第１の絶縁層は、前記第１の電極上に複数の開口を有し、
    前記第１の電極は、前記第１の絶縁層の前記複数の開口から前記第１の電極の一部が露出した複数の第１の電極露出部を有する、
    電気化学測定デバイス。
  2. 前記複数の第１の電極露出部は、前記試料載置部から等距離の位置に設けられる、
    請求項１に記載の電気化学測定デバイス。
  3. 前記複数の第１の電極露出部は、等間隔に配置される、
    請求項１または２に記載の電気化学測定デバイス。
  4. 前記第１の電極は、リング形状である、
    請求項１〜３の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  5. 前記複数の第１の電極露出部のうち隣り合う２つの第１の電極露出部の距離は、前記２つの第１の電極露出部のうちの１つの径の５倍以上である、
    請求項１〜４の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  6. 前記基板上に設けられ前記第１の電極を囲む第２の電極と、
    前記第２の電極を覆う第２の絶縁層と、を備え、
    前記第２の絶縁層は、前記第２の電極上に複数の開口を有し、
    前記第２の電極は、前記第２の絶縁層の前記複数の開口から前記第２の電極の一部が露出した複数の第２の電極露出部を有する、
    請求項１〜５の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  7. 前記複数の第２の電極露出部は、前記試料載置部から等距離の位置に設けられる、
    請求項６に記載の電気化学測定デバイス。
  8. 前記複数の第２の電極露出部は、等間隔に配置される、
    請求項６または７に記載の電気化学測定デバイス。
  9. 前記複数の第２の電極露出部は、前記複数の第１の電極露出部のうち隣り合う２つの第１の電極露出部の中間点と前記試料載置部の中心とを結ぶ線上に設けられる、
    請求項６〜８の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  10. 前記第２の電極は、リング形状である、
    請求項６〜９の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  11. 前記複数の第１の電極露出部のうち隣り合う２つの第１の電極露出部の距離は、前記２つの第１の電極露出部のうちの１つの径の５倍以上であり、
    前記複数の第２の電極露出部のうち隣り合う２つの第２の電極露出部の距離は、前記２つの第２の電極露出部のうちの１つの径の５倍以上であり、
    前記複数の第１の電極露出部と前記複数の第２の電極露出部とにおいて、最も近い第１の電極露出部と第２の電極露出部との間の距離は、前記複数の第２の電極露出部のうちの１つの径の５倍以上である、
    請求項６〜１０の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  12. 前記試料載置部は、柱状、もしくは錐状の有底の孔である、
    請求項１〜１１の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  13. 前記電気化学測定デバイスは、さらに、
    前記基板上に前記生体試料の活動に影響されない基準値を測定するためのブランク電極と、
    前記ブランク電極を覆う第３の絶縁層と、を備え、
    前記第３の絶縁層は、前記ブランク電極上に複数の開口を有し、
    前記ブランク電極は、前記第３の絶縁層の前記複数の開口から前記ブランク電極の一部が露出した複数のブランク電極露出部を有する、
    請求項１〜１２の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  14. 前記複数のブランク電極露出部の総面積は、前記複数の第１の電極露出部の総面積と同じであり、
    前記複数のブランク電極露出部のそれぞれは、前記複数の第１の電極露出部のうち当該ブランク電極露出部に最も近い第１の電極露出部から当該第１の電極露出部の径の５倍以上離れた位置に設けられている、
    請求項１３に記載の電気化学測定デバイス。
  15. 前記電気化学測定デバイスは、さらに、
    前記基板上に前記第１の電極と対になる対向電極を備え、
    前記対向電極は、表面が露出する対向電極露出部を有し、
    前記対向電極露出部の面積は、前記複数の第１の電極露出部の総面積よりも大きく、
    前記対向電極露出部は、前記複数の第１の電極露出部のそれぞれから４００μｍ以上離れた位置に設けられる、
    請求項１〜１４の何れか１項に記載の電気化学測定デバイス。
  16. 前記対向電極を覆う第４の絶縁層を、さらに備え、
    前記第４の絶縁層は、前記対向電極上に開口を有し、
    前記対向電極露出部は、前記第４の絶縁層の前記開口から露出する、
    請求項１５に記載の電気化学測定デバイス。
  17. 測定対象の前記生体試料は、受精卵であり、
    前記複数のブランク電極露出部のそれぞれは、前記試料載置部から４００μｍ以上離れた位置に設けられている、
    請求項１３または１４に記載の電気化学測定デバイス。
  18. 測定対象の前記生体試料は受精卵であり、
    前記対向電極露出部は、前記試料載置部から４００μｍ以上離れた位置に設けられている、
    請求項１５または１６に記載の電気化学測定デバイス。
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