JP2017038589A - 生物反応装置及びこの生物反応装置を用いた生物反応方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物反応装置及びこの生物反応装置を用いた生物反応方法において、マイクロナノバブルを含有する生物培養液をろ過器によりろ過液と微生物等濃縮液とに分離し、ろ過液を回収すると共に、微生物等濃縮液を培養槽に還流する。生物培養液にマイクロナノバブルを含有させるマイクロナノバブル発生装置は、生物培養液を培養槽から抜き出しろ過器に供給する経路以外の、1)培地又は反応原料を培養槽に供給する経路、2)培養槽、及び3)ろ過液を除いた生物培養液を培養槽に還流する管路の少なくとも1箇所に設ける。
【選択図】図1
Description
しかしながら、生物反応は、一般的に反応が温和で遅いという問題があった。すなわち、化学反応には、1時間以内の反応で十分な場合が多いのに対して、生物反応の場合は、数時間から長い場合は数日又は特に長い場合は数週間以上の反応時間を要する場合もある。このため、生物反応を効率的、経済的に行うことが求められている。
本発明の生物反応装置は、微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応(発酵・醸造)、微生物等の増殖若しくは濃縮(培養)を目的とする生物反応のいずれにも用いることができる。また、本発明の生物反応装置は、回分法(Batch法)、流加法(Fed-Batch法)、連続法のいずれにも用いることができるが、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持できる連続法において好適に用いることができる。
生物培養液中の栄養源としては、糖類、窒素源が含有されたものを用いる。糖類としては、通常、マルトース、スクロース、グルコース、フルクトース、これらの混合物等の糖類が用いられ、生物培養液における糖類の濃度は、特に限定されないものの、0.1〜10w/v%に設定するのが好ましい。また、窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又はコーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等が用いられ、0.1〜10w/v%に設定するのが好ましい。さらに、生物培養液には糖類、窒素源以外にも、必要に応じて、ビタミン、無機塩類等を添加することが好ましい。
本発明の第1の特徴点は、前述のように、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとするMNB発生装置を備えることである。
(1)培地又は反応原料、微生物等を含有する生物培養液を収容する培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとし、
(2)このMNBを含有する生物培養液を、ろ過器により、ろ過液と微生物等濃縮液とに分離し、
(3)このろ過液を回収すると共に、この微生物等濃縮液を培養槽に還流する
ことにより、
驚くべきことに、培養槽中の生物培養液が含有するMNBの量を高く維持でき、ろ過膜の目詰まりを抑制でき、さらに、微生物等が受けるストレス・ダメージを低減でき、これにより、微生物等を用いた生物反応を効率的かつ経済的に行うことができることを見出し、本発明を成したものである。
これにより、培養槽から抜き出す生物培養液の量を減少させ、生物培養液が含有するMNBの量を減少させても、MNB状態の、吸収されやすい高濃度の酸素を、培養槽中の微生物等に供給でき微生物等の活性を維持できる。さらに、培養槽から抜き出す生物培養液の量を減少させることにより、微生物等が受けるストレス・ダメージを低減できると共に、生物培養液の循環に要するエネルギーを減じることができる。さらに、生物培養液が含有するMNBの量を減少させることにより、MNB発生装置の駆動に要するエネルギーを減じることができる。
微生物等は、培養槽中で生物反応において有機酸等の副生物を生じるが、これにより培養槽中の生物培養液のpHが変化するような場合には、これを微生物等に適した範囲に調整する必要がある。
まず、図1を参照しながら、本発明の参考実施形態1について説明する。
参考実施形態1の生物反応装置は、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとする手段として、第1手段を用いたものである。
a)培養槽撹拌機7で撹拌しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。
b)上記a)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
c)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
e)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。
a)微生物等の増殖を行いながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
b)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
図2を参照しながら、本発明の参考実施形態2について説明する。
参考実施形態2の生物反応装置は、参考実施形態1の生物反応装置にろ過液を培養槽に還流する、バルブを備えた管路を設けたものである。この管路を通じて培養槽に還流するろ過液の量を調整することにより、培養槽中の培地又は反応原料及び微生物等の濃度を調整することができる。
通常は、バルブ10を閉、バルブ11を開とし、次のような工程により生物反応を行う。
a)培養槽撹拌機7で撹拌しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。
b)上記a)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
c)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
e)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。この第1段階では、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様に、バルブ10及びバルブ11の開閉を調整して培養槽2に還流するろ過液Bの量を調整することができる。
a)微生物等の増殖を行いながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
b)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
図3を参照しながら、本発明の参考実施形態3について説明する。
参考実施形態3の生物反応装置は、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとする手段として、第1手段と第2手段とを併用したものである。参考実施形態3も、参考実施形態1及び参考実施形態2と同様に、微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応(発酵・醸造)、微生物等の増殖若しくは濃縮(培養)を目的とする生物反応のいずれにも用いることができる。
通常は、バルブ10を閉、バルブ11を開とし、次のような工程により生物反応を行う。
a)培地又は反応原料1をMNB発生装置6bに供給して空気AのMNBを含有させ、この空気AのMNBを含有させた培地又は反応原料Dを培養槽2に供給する。
b)培養槽撹拌機7で撹拌しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。
c)上記b)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
d)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
e)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。この第1段階では、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様に、バルブ10及びバルブ11の開閉を調整して培養槽2に還流するろ過液Bの量を調整することができる。
a)微生物等の増殖を行いながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
b)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
図4を参照しながら、本発明の参考実施形態4について説明する。
参考実施形態4の生物反応装置は、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとする手段として、第1手段に第2手段及び第3手段を併用したものである。
通常は、バルブ10を閉、バルブ11を開とし、次のような工程により生物反応を行う。
a)培地又は反応原料1をMNB発生装置6bに供給して空気AのMNBを含有させ、この空気AのMNBを含有させた培地又は反応原料Dを培養槽2に供給する。
b)培養槽撹拌機7で撹拌し、MNB発生装置6cで空気AのMNBを含有させた生物培養液Eを培養槽2に供給しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。MNB発生装置6cへの生物培養液3の供給は、ポンプ9により培養槽2から生物培養液3を抜き出して行う。
c)上記b)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させる。
d)この空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
e)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。
a)増殖を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から生物培養液3を連続して抜き出し、MNB発生装置6aに供給して空気AのMNBを含有させた後、ろ過器4に供給する。
b)ろ過器4において、生物培養液を、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
図5を参照しながら本発明の第1実施形態について説明する。
第1実施形態の生物反応装置は、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとする手段として、第2手段を単独で用いたものである。
通常は、バルブ10を閉、バルブ11を開とし、次のような工程により生物反応を行う。
a)培地又は反応原料1をMNB発生装置6bに供給して空気AのMNBを含有させ、この空気AのMNBを含有する培地又は反応原料Dを培養槽2に供給する。
b)培養槽撹拌機7で撹拌しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。
c)上記b)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
e)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。
a)増殖を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から生物培養液3を連続して抜き出し、ろ過器4に供給する。
b)ろ過器4において、生物培養液を、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
図6を参照しながら本発明の第2実施形態について説明する。
第2実施形態の生物反応装置は、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとする手段として、第2手段及び第3手段を併用したものである。
通常は、バルブ10を閉、バルブ11を開とし、次のような工程により生物反応を行う。
a)培地又は反応原料1をMNB発生装置6bに供給して空気AのMNBを含有させ、この空気AのMNBを含有する培地又は反応原料Dを培養槽2に供給する。
b)培養槽撹拌機7で撹拌し、MNB発生装置6cで空気AのMNBを含有させた生物培養液Eを培養槽2に供給しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。MNB発生装置6cへの生物培養液3の供給は、ポンプ9により培養槽2から生物培養液3を抜き出して行う。
c)上記b)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出し、空気AのMNBを含有する生物培養液をろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
e)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。
a)増殖を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から生物培養液3を連続して抜き出し、ろ過器4に供給する。この際には、MNB発生装置6cにより、培養槽2中の生物培養液3に空気AのMNBを含有させる。
b)ろ過器4において、生物培養液を、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNBを含有する微生物等濃縮液Cを培養槽2に還流する。
図7を参照しながら本発明の第3実施形態について説明する。
第3実施形態の生物反応装置は、培養槽から抜き出されろ過器に供給される生物培養液を、MNBを含有するものとする手段として、第4手段を用いたものである。
通常は、バルブ10を閉、バルブ11を開とし、次のような工程により生物反応を行う。
a)培養槽撹拌機7で撹拌しながら、培養槽2に収納した、培地又は反応原料1及び微生物等を含有する生物培養液3において生物反応を行わせる。
b)上記a)の反応を行わせながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出して、ろ過器4に供給し、反応生成物を含むろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
c)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNB発生装置6dで空気AのMNBを含有させた微生物等濃縮液Fを培養槽2に還流する。
第1段階として、微生物等が適正量に増殖するまでの間は、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様の工程で操作を行う。ろ過液Bを分離・回収することにより、微生物等の生物反応により生じる有機酸等の副生物をろ過液Bと共に回収することができる。この第1段階では、上記微生物等による反応生成物の生成を目的とする生物反応と同様に、バルブ10及びバルブ11の開閉を調整して培養槽2に還流するろ過液Bの量を調整することができる。
a)微生物等の増殖を行いながら、ポンプ8を駆動して培養槽2から反応後の生物培養液3を連続して抜き出して、ろ過器4に供給し、ろ過液Bと微生物等濃縮液Cとに分離する。
b)ろ過液Bをろ過液貯槽5に回収すると共に、MNB発生装置6dで空気AのMNBを含有させた微生物等濃縮液Fを培養槽2に還流する。
図8を参照しながら、本発明の参考実施形態5について説明する。
参考実施形態5の生物反応装置は、本発明の参考実施形態2において、培養槽2に還流するろ過液BにpH調整剤12を添加する手段を設けたものである。pH調整剤12の添加量を調整することにより、培養槽2中の生物培養液3のpHを微生物等に適した範囲に調整することができる。
a)バルブ10を閉、バルブ11を開として生物反応が行われている状態から、バルブ10を開として、ろ過器4で分離されたろ過液Bの一部又は全部をpH調整剤混合槽13に供給する。
b)pH調整剤混合槽13中のろ過液Bに、培養槽2中の生物培養液3のpHを微生物等に適した範囲に調整するために必要な量のpH調整剤12(酸、アルカリ等)を添加する。
c)pH調整剤12が添加されたろ過液Bを、培養槽2に還流する。
図9を参照しながら、本発明の第4実施形態について説明する。
第4実施形態の生物反応装置は、本発明の第2実施形態において、培養槽2に還流するろ過液BにpH調整剤12を添加する手段を設けたものである。pH調整剤12の添加量を調整することにより、培養槽2中の生物培養液3のpHを微生物等に適した範囲に調整することができる。
a)バルブ10を閉、バルブ11を開として生物反応が行われている状態から、バルブ10を開として、ろ過器4で分離されたろ過液Bの一部又は全部をpH調整剤混合槽13に供給する。
b)pH調整剤混合槽13中のろ過液Bに、培養槽2中の生物培養液3のpHを微生物等に適した範囲に調整するために必要な量のpH調整剤12(酸、アルカリ等)を添加する。
c)pH調整剤12が添加されたろ過液Bを、培養槽2に還流する。
ろ過器として、多数の中空糸膜を束ねて筒状のカートリッジに収納したろ過器(旭化成社製、商品名「マイクローザMF USP−343」)を用い、このろ過器に培養液[微生物等としてコリネ型細菌(コリネバクテリウムグルタミカム)の標準株を濁度(OD660の値):60で含有]を供給し、このろ過器に供給する培養液の圧力及び流量を調整することにより、各中空糸膜の内部と外部との平均圧力差(以下、「膜間差圧」という。)、各中空糸膜の内部を流れる培養液の平均流速(以下、「循環流速」という。)を所定の値に調整して、ろ過器によるろ過速度を測定した。
膜間差圧が0.1Mpa、循環流速が0.19m/sとなるようにろ過器に培養液を供給したところ、MNB有ろ過速度は50.3L/m2/hであった。
実施例1と同じ膜間差圧及び循環流速でろ過器に培養液を供給したところ、MNB無ろ過速度は27.4L/m2/hであった。
膜間差圧が0.1Mpa、循環流速が0.33m/sとなるようにろ過器に培養液を供給したところ、MNB有ろ過速度は59.2L/m2/hであった。
実施例2と同じ膜間差圧及び循環流速でろ過器に培養液を供給したところ、MNB無ろ過速度は43.0L/m2/hであった。
膜間差圧が0.1Mpa、循環流速が0.51m/sとなるようにろ過器に培養液を供給したところ、MNB有ろ過速度は73.6L/m2/hであった。
実施例3と同じ膜間差圧及び循環流速でろ過器に培養液を供給したところ、MNB無ろ過速度は67.0L/m2/hであった。
膜間差圧が0.2Mpa、循環流速が0.33m/sとなるようにろ過器に培養液を供給したところ、MNB有ろ過速度は79.5L/m2/hであった。
実施例4と同じ膜間差圧及び循環流速でろ過器に培養液を供給したところ、MNB無ろ過速度は43.6L/m2/hであった。
膜間差圧が0.2Mpa、循環流速が0.51m/sとなるようにろ過器に培養液を供給したところ、MNB有ろ過速度は102.8L/m2/hであった。
実施例5と同じ膜間差圧及び循環流速でろ過器に培養液を供給したところ、MNB無ろ過速度は77.7L/m2/hであった。
2 培養槽
3 生物培養液
4 ろ過器
5 ろ過液貯槽
6a〜6d MNB発生装置
7 培養槽撹拌機
8、9 ポンプ
10、11 バルブ
12 pH調整剤
13 pH調整剤混合槽
A 空気
B ろ過液
C 微生物等濃縮液
D 空気AのMNBを含有させた培地又は反応原料
E 空気AのMNBを含有させた生物培養液
F 空気AのMNBを含有させた微生物等濃縮液
101 発酵反応槽
102 分離膜エレメント
111 発酵培養液循環ポンプ
112 膜分離槽
207 培養槽
210 菌体ろ過器
215 MNB発生槽
216 MNB発生機
304 原水供給ライン
306 水供給ポンプ
311 膜モジュール
317 原水及び/又は濃縮循環水ライン
Claims (11)
- 培地又は反応原料及び微生物又は細胞を含有する生物培養液を収容する培養槽、該培養槽から抜き出した生物培養液をろ過液とろ過液を除いた生物培養液とに分離するろ過器、該ろ過液を回収する管路、及び該ろ過液を除いた生物培養液を前記培養槽に還流する管路を備えた生物反応装置であって、
前記ろ過器に供給される生物培養液を、マイクロナノバブルを含有するものとするマイクロナノバブル発生装置を備える(ただし、前記生物培養液を前記培養槽から抜き出し前記ろ過器に供給する経路に設けられるものを除く)ことを特徴とする、微生物若しくは細胞による反応生成物の生成、又は、微生物若しくは細胞の増殖若しくは濃縮を行う生物反応装置。 - 前記生物反応装置が、さらに、前記ろ過液を前記培養槽に還流する管路を備えることを特徴とする、請求項1に記載の生物反応装置。
- 前記マイクロナノバブル発生装置が、前記培地又は反応原料を前記培養槽に供給する経路、前記培養槽、及び前記ろ過液を除いた生物培養液を前記培養槽に還流する管路の少なくとも1箇所に設けられることを特徴とする、請求項1又は2に記載の生物反応装置。
- 前記マイクロナノバブルが、酸素濃度を高めた空気から形成されたマイクロナノバブルであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の生物反応装置。
- 前記酸素濃度を高めた空気の酸素含有率が25〜40%であることを特徴とする、請求項4に記載の生物反応装置。
- 前記酸素濃度を高めた空気が、空気を酸素富化膜に通過させることにより得られたものであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の生物反応装置。
- 前記酸素濃度を高めた空気が、PSA法、VSA法及び化学吸着法のいずれかにより生成した酸素と、空気とをラインミキサー等で混合させることにより得られたものであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の生物反応装置。
- 前記培養槽から生物培養液を抜き出すためのポンプ等の微生物又は細胞を含有する生物培養液を搬送するポンプとして、ダイアフラムポンプ、スクリューポンプ、ロータリーポンプ等の容積式ポンプを用いることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の生物反応装置。
- 前記容積式ポンプがチューブポンプであることを特徴とする、請求項8に記載の生物反応装置。
- 前記ろ過液を前記培養槽に還流する管路に、pH調整剤を添加する手段を備えることを特徴とする、請求項2〜9のいずれかに記載の生物反応装置。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の生物反応装置により、微生物若しくは細胞による反応生成物の生成、又は、微生物若しくは細胞の増殖若しくは濃縮を行うことを特徴とする、生物反応方法。
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