JP2017008098A - オリゴ糖−タンパク複合体 - Google Patents

Abstract

【課題】個々のオリゴ糖を含むオリゴ糖−タンパク複合体、かかる複合体を含む組成物、および、それを必要とする被験体のリソソーム蓄積症を治療する医薬の製造における、かかる複合体の使用の提供。【解決手段】タンパク質および式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体、かかる複合体を含む組成物、ならびに、それを必要とする被験体のリソソーム蓄積症を治療する医薬の製造における、（１）タンパク質、および（２）式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体の使用。【選択図】図１

Description

本願は、米国特許仮出願第６１／１２２，８５１号の優先権の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。

本発明は、一般に個々のオリゴ糖を含むオリゴ糖−タンパク複合体、およびかかる複合体を含む組成物に関する。本発明はさらに、オリゴ糖−リソソーム酵素複合体を用いた、リソソーム蓄積症の治療方法に関する。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム加水分解酵素の活性欠損に関与する、希少な代謝性疾患の１つであり、４０種を超える遺伝子疾患が含まれる。ＬＳＤの顕著な特徴は、リソソーム代謝産物の異常蓄積であり、多数の膨張したリソソーム形成を引き起こす。

ＬＳＤは、欠損酵素の活性化したものを患者に投与することにより治療することができ、当該方法は酵素補充療法（ＥＲＴ）と呼ばれる。末端にマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を有する補充酵素が投与されると、細胞表面結合型カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を介したエンドサイト−シスによって標的細胞に取り込まれ、リソソームに作用する。

一般に、リン酸化程度が低い補充酵素は、細胞表面のＭ６Ｐ受容体によって効果的に取り込まれず、したがって、機能するリソソームに作用することができない。そのため、マンノースのリン酸化程度が低いと、補充酵素の治療効果に深刻かつ有害な影響が及ぶ可能性がある。

補充酵素のＭ６Ｐ含有量を高める方法が開発されている。例えば、米国特許第６，５３４，３００号、第６，６７０，１６５号、および第６，８６１，２４２号には、末端マンノース残基の酵素的リン酸化が記述されている。別の例として、米国特許第７，００１，９９４号には、Ｍ６Ｐを含むオリゴ糖を、糖タンパク質と結合させる方法が記述されている。当該方法によって製造された、リソソーム酵素である酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）と、ビスＭ６Ｐオリゴ糖との複合体は、ポンペ病のマウスモデルにおいて、組換えヒトＧＡＡより、骨格筋および心筋のグリコーゲンを減少させるのにより効果的であることがわかった。ポンペ病は、ＧＡＡの代謝欠陥に起因する常染色体劣性型筋疾患であり、リソソームグリコーゲンの蓄積を特徴とする。同様に、Ｚｈｕらにより、合成ビスＭ６Ｐオリゴ糖（式Ａ）を、ＧＡＡと結合させることが記述されている（Ｚｈｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８９：６１９−６２８（２００５））。式Ａは、Ｎ−結合型グリカン（式Ｂ）の天然の三分岐鎖Ｍａｎ₉コア構造から、一分岐鎖を取り除き、別の一分岐鎖を短くし、末端のマンノース残基をリン酸化することで作られた。

得られた複合体は、ＣＩ−ＭＰＲに、より高い親和性で結合し、Ｌ６筋芽細胞に関して、より効果的に取り込まれ、ほぼ正常な酵素活性が得られた。しかし、このような成功があるとはいえ、リソソーム酵素と結合した際に、正常またはほぼ正常な酵素活性を有しつつ、ＣＩ−ＭＰＲとの親和性の改善、および／またはより効果的な細胞吸収を引き起こす、新規のオリゴ糖を同定することは、依然として重要である。しかしながら、取込みを改善するだけでは、必ずしもよりよい治療結果はもたらされない。ある種の結合方法およびオリゴ糖を用いると、得られる複合体の酵素活性は低い。したがって、ＬＳＤ患者の治療結果を改善することができる、オリゴ糖および複合体を同定することが望まれる。

さらに、式ＡおよびＢに示したようなある種のオリゴ糖は、合成が困難かつ高価であることがある。その上、立体選択的にβ−結合型糖鎖を作成することは、糖化学において、困難な問題であった。商用規模での使用に関しては、別のオリゴ糖および合成方法のほうが現実的である可能性がある。オリゴ糖−タンパク複合体を製造するのに使用する方法の最適化がさらに求められている。特に、治療目的に関しては、複合体製造は非常に不均一であってはならない。これは一貫性のない生物学的機能を生じる場合があるためである。使用するオリゴ糖およびリンカー、結合方法、精製方法、および処方などの複合体の様々な要素が、治療効果に影響を与え得る。

したがって、本発明のある種の実施形態は、（１）タンパク質、および（２）式Ｉ：

［式中、
ａ＝α１，２；α１，３；α１，４；またはα１，６であり；
ｂ＝α１，２；α１，３；またはα１，４であり；
ｃ＝α１，２；α１，３；α１，４；またはα１，６であり；および
ｄ＝α、β、またはαとβとの混合物である］
で表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

本発明の他の実施形態は、（１）タンパク質、および（２）式ＩＩ：

［式中、
ｅ＝α１，２；α１，３；α１，４；またはα１，６であり；および
ｆ＝α、β、またはαとβとの混合物であり；
ただしｅ＝α１，６のとき、ｆ＝αまたはαとβとの混合物である］
で表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

本発明のさらに他の実施形態は、（１）タンパク質、および（２）式ＩＩＩ：

［式中、
ｇ＝α１，２；α１，３；またはα１，４であり；
ｈ＝α１，２；α１，３；α１，４；またはα１，６であり；および
ｉ＝α、β、またはαとβとの混合物である］
で表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

本発明の追加の実施形態は、（１）タンパク質、および（２）式ＩＶ：

［式中、
ｊは、α１，２であり；
ｋは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
ｘは、１、２、または３であり；ならびに
ｘが２または３のとき、各マンノース間の結合は、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択される］
で表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

さらなる実施形態は、（１）タンパク質、および（２）式Ｖ：

［式中、
ｌは、α、β、およびαとβとの混合物から選択される］
で表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

追加の実施形態は、（１）タンパク質、および（２）式ＶＩ：

［式中、
Ｒ^xおよびＲ^yは、それぞれ独立に、ポリエチレングリコール、任意にオキソ、ニトロ、ハロ、カルボキシル、シアノ、または低級アルキルで置換された、且つ任意にＮ、Ｏ、またはＳから選択される１または２以上のヘテロ原子で中断されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキルから選択され；
ｚは、０、１、２、３、または４から選択され；
ｍは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
ｙが２、３、または４のとき、各マンノース間の結合は、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択される］
で表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

追加の実施形態において、本発明は（１）タンパク質、および（２）式Ａで表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体を提供する。

ある実施形態において、複合体は、タンパク質１モルにつき、式Ａのオリゴ糖を少なくとも２、３、４、または５モル含む。

いくつかの実施形態において、本発明のオリゴ糖−タンパク複合体は、この複合体のオリゴ糖およびタンパク質成分間にリンカーを含む。

本発明は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶもしくはＶＩで表されるオリゴ糖−タンパク複合体、および充填剤、膨張剤、崩壊剤、緩衝剤、安定剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩで表されるオリゴ糖−タンパク複合体、あるいはオリゴ糖−タンパク複合体などを含む医薬組成物を用いて、例えば下の表１に開示されるような、リソソーム蓄積症の治療方法を提供する。リソソーム蓄積症は、例えばファブリー病、ポンペ病、ニーマンピックＡ病、ニーマンピックＢ病、およびムコ多糖症Ｉ型から選択することができる。さらなる実施形態において、本発明は、それを必要とする被験体のリソソーム蓄積症を治療する医薬の製造に関して、（１）タンパク質、および（２）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩで表されるオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体の使用を提供する。

本発明の追加の実施形態は、この出願を通して検討される。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明により明らかとなる。本発明の１態様に関して検討されたいかなる実施形態も、本発明の別の態様に適用し、逆もまた同様である。実施例の項目の実施形態は、本発明のすべての態様に適用することができる、本発明の実施形態であると理解される。

しかしながら、本発明の範囲および趣旨内の様々な変化および修飾は、本願から当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体例が、本発明の具体的な実施形態に示されるが、例示のためのみに与えられることが理解されるべきである。

図１は、オリゴ糖８２の合成工程を明示する、例示的な逆合成スキームを示す。 図２は、本明細書に記載されたオリゴ糖合成で使用することができる、単糖のビルディングブロック２ａの例示的な合成を示す。 図３は、本明細書に記載されたオリゴ糖合成で使用することができる、単糖のビルディングブロック１、２、３、および４の例示的な合成を示す。 図４は、エチレンリンカーの製造に関する、合成スキームを示す。 図５は、ビルディングブロック２、３、および４を用いる、オリゴ糖８２の三糖前駆体の構築に関する合成スキームを示す。 図６は、図４に記載された三糖前駆体からの、保護された七糖の構築に関する合成スキームを示す。 図７は、図５に記載された保護された七糖を脱保護して、オリゴ糖８２を生成する、合成スキームを示す。 図８Ａは、立体選択的中間体であって且つチオール反応性基の代替形態を形成するため、ジブチルスズを利用し、式Ａのβ−結合型六糖を製造する合成スキームを示す。 図８Ｂは、立体選択的中間体であって且つチオール反応性基の代替形態を形成するため、ジブチルスズを利用し、式Ａのβ−結合型六糖を製造する合成スキームを示す。 図８Ｃは、立体選択的中間体であって且つチオール反応性基の代替形態を形成するため、ジブチルスズを利用し、式Ａのβ−結合型六糖を製造する合成スキームを示す。 図８Ｄは、立体選択的中間体であって且つチオール反応性基の代替形態を形成するため、ジブチルスズを利用し、式Ａのβ−結合型六糖を製造する合成スキームを示す。 図８Ｅは、立体選択的中間体であって且つチオール反応性基の代替形態を形成するため、ジブチルスズを利用し、式Ａのβ−結合型六糖を製造する合成スキームを示す。 ＮｅｏＧＡＡβ ＳＡＭ６の複合体化能における、酸化レベルの効果を示す。図９Ａは、様々なモル比における、ＧＡＡと複合体化した、ＳＡＭ２、ＳＡＭ３、ＳＡＭ４、線状ＳＡＭ４、αＳＡＭ６、およびβＳＡＭ６オリゴ糖の量を示す。 ＮｅｏＧＡＡβ ＳＡＭ６の複合化能における、酸化レベルの効果を示す。図９Ｂは、異なる量の過ヨウ素酸塩を用いて酸化した、ｒｈＧＡＡと複合体化した六糖（グリカン）の量を示す。 様々な量の過ヨウ素酸塩を用いた、シアル酸、フコース、ガラクトース、およびマンノースの酸化を示す。図１０Ａは、単糖組成物の分析（定量した単糖量の減少に基づいて推測した酸化）により、測定した酸化を示す。 様々な量の過ヨウ素酸塩を用いた、シアル酸、フコース、ガラクトース、およびマンノースの酸化を示す。図１０Ｂは、ポジティブモードにおける、ＡＡ−標識したＳＡＭ６オリゴ糖のＬＴＱ ＭＳ検出を示す。 様々な量の過ヨウ素酸塩を用いた、シアル酸、フコース、ガラクトース、およびマンノースの酸化を示す。図１０Ｃは、ＡＡ−標識した酸化オリゴ糖に対応するＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 様々な量の過ヨウ素酸塩を用いた、シアル酸、フコース、ガラクトース、およびマンノースの酸化を示す。図１０Ｄは、ＡＡ−標識した酸化オリゴ糖に対応するＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 様々な量の過ヨウ素酸塩を用いた、シアル酸、フコース、ガラクトース、およびマンノースの酸化を示す図。図１０Ｅは、異なる量のＧＡＯを用いて滴定したＧＡＭ複合体の単糖分析を示す。 図１１Ａは、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡから放出されたオリゴ糖のＨＰＬＣ分析を示す。 図１１Ｂは、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡから放出されたオリゴ糖のＨＰＬＣ分析を示す。 図１１Ｃは、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡから放出されたオリゴ糖のＨＰＬＣ分析を示す。 図１２は、２および２２．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で処理した、ｒｈＧＡＡのペプチドマッピングのＬＣ／ＭＳ分析を示す。非酸化、単一酸化、および二酸化したトリプシンペプチドＴ１３（メチオニン１７２および１７３を含む）の溶出位置を長方形で強調する。 ｓＣＩＭＰＲに対するＮｅｏＧＡＡおよびｒｈＧＡＡのＢｉａｃｏｒｅ結合分析を示す図である。図１３Ａは、各サンプルの注入に関する、結合、解離、Ｍ６Ｐ溶出、および再生段階を示すセンサーグラムである。 ｓＣＩＭＰＲに対するＮｅｏＧＡＡおよびｒｈＧＡＡのＢｉａｃｏｒｅ結合分析を示す図である。図１３Ｂは、ＮｅｏＧＡＡサンプルおよびｒｈＧＡＡコントロールサンプルに関する、センサーグラムデータの例示的な４パラメータフィットである。 ｓＣＩＭＰＲに対するＮｅｏＧＡＡおよびｒｈＧＡＡのＢｉａｃｏｒｅ結合分析を示す図である。図１３Ｃは、各製造の異なる結合レベル全体の、２ｍＭｖｓ．７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて製造されたＮｅｏＧＡＡサンプルのＭ６Ｐ受容体親和性である。 図１４は、様々なＮｅｏＧＡＡ複合体の特異的活性を示す。 図１５ＡＢは、Ｍ６Ｐ受容体カラムからのＮｅｏＧＡＡ複合体の溶出を示す。 図１５Ｃは、Ｍ６Ｐ受容体カラムからのＮｅｏＧＡＡ複合体の溶出を示す。 図１５Ｄは、Ｍ６Ｐ受容体カラムからのＮｅｏＧＡＡ複合体の溶出を示す。 図１５Ｅは、Ｍ６Ｐ受容体カラムからのＮｅｏＧＡＡ複合体の溶出を示す。 図１５Ｆは、ＳＡＭ６複合体の週１回投与を４回行った後のＧＡＡＫＯマウスにおける、組織グリコーゲンレベルを示す。 図１６は、様々なＮｅｏＧＡＡ複合体の吸収を明示する、Ｌ６筋芽細胞の取込アッセイの結果を示す。 図１７は、ＳＡＭ２処理後のＧＡＡノックアウトマウスにおける、心臓、大腿四頭筋、および三頭筋のグリコーゲンクリアランスを示す。 図１８は、ＳＡＭ４処理後のＧＡＡノックアウトマウスにおける、心臓および大腿四頭筋のグリコーゲンクリアランスを示す。 図１９は、ＳＡＭ６処理後のＧＡＡノックアウトマウスにおける、心臓および大腿四頭筋のグリコーゲンクリアランスを示す。 図２０は、ＳＡＭ６およびＧＡＭ６処理後のＧＡＡノックアウトマウスにおける、心臓および大腿四頭筋のグリコーゲンクリアランスを示す。 図２０Ｂは、ｒｈＧＡＡ、ＧＡＭおよびＳＡＭ複合体の投与後５、１５、３０、６０、１２０、２４０、および４８０分で回収された、マウス血清中のｒｈＧＡＡ濃度を示す。

発明の説明
本発明がよく理解されるよう、まず、いくつかの語が定義される。追加の定義は、本願を通して行われる。

本明細書および添付の請求項で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈で明らかに指示されない限り、複数の対象を含む。したがって、例えば、「１つの化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含む方法への引用は、２つまたはそれ以上の化合物の混合物を含む。「または」という語は、他に文脈で明らかに指示されない限り、一般に「および／または」を含む意味で使用される。

Ｉ．オリゴ糖−タンパク複合体
１つの実施形態において、本発明は、オリゴ糖−タンパク複合体を提供し、これはさらにリンカーを含むことができる。例示的なオリゴ糖、タンパク質、リンカー、複合体化方法、および複合体が開示されている。

Ａ．オリゴ糖
オリゴ糖は、上に示したような、式Ｂまたは式ＶＩで表される二分岐鎖のオリゴ糖誘導体、あるいは式ＩＶおよびＶに示されるような直鎖のオリゴ糖誘導体から選択することができる。一般に、二分岐鎖のオリゴ糖は、末端に２つのＭ６Ｐ残基を有し、いくつかの実施形態においては、末端から２番目から１または２以上のＭ６Ｐ残基をさらに含むことができる。直鎖のオリゴ糖は、少なくとも１つのＭ６Ｐ残基を有し、末端のＭ６Ｐ残基を含むことがある。一般に、末端のＭ６Ｐ残基は、α１，２結合で結合し得る（末端のＭ６Ｐのα１，２結合は、α１，３またはα１，６結合よりも、ＣＩ−ＭＰＲおよびカチオン依存性ＭＰＲ（ＣＤ−ＭＰＲ）に、より結合するということを観察した、Ｄｉｓｔｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１６８７−２１６９２（１９９１）を参照のこと）。いくつかの実施形態において、末端のＭ６Ｐ残基は、それぞれ還元末端で、α１，２結合によって隣り合う残基に結合している。いくつかの実施形態において、２つの末端Ｍ６Ｐ残基の間は、例えばＸ線結晶学、ＮＭＲ、および／または分子モデリングにより測定されたように、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０Åより離れている。例えば、分子モデリングは、Ｂａｌａｊｉら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：４９７−５１５（１９９４）に記載されたように実施することができる。いくつかの実施形態において、オリゴ糖は、末端のＭ６Ｐ残基が比較的立体障害のないように選択される。いくつかの実施形態において、末端のＭ６Ｐ残基に比較的障害がないオリゴ糖は、末端のＭ６Ｐ残基に障害のあるオリゴ糖より、高い親和性でＣＩ−ＭＰＲと結合する。

一般に、オリゴ糖はＣＩ−ＭＰＲに結合する。例えば、オリゴ糖は、例えば、５００、１００、５０、１０、５、１、または０．１ｎＭ未満、あるいは例えば、１００、５０、１０、５、２、または１μＭ未満の解離定数で、ＣＩ−ＭＰＲに結合することができる。ＣＩ−ＭＰＲのＮ−末端領域１〜３の結晶構造は、リガンド結合型および非結合型の両方が知られている（Ｏｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３４０００−３４００９（２００４）、Ｏｌｓｏｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．２３：２０１９−２０２８（２００４））。さらに、構造的に関連のあるＣＤ−ＭＰＲも、リガンド結合型および非結合型が知られている（Ｏｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９８８９−２９８８６（１９９９）、Ｏｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１０１５６−１０１６１（２００２））。したがって、当業者は、その受容体構造情報を使用して、適当なオリゴ糖を選択することができる。

オリゴ糖は、例えば、下記で示されるオリゴ糖１〜１２７を含む、上記で示された式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩで表されるオリゴ糖のいずれか１つから選択することができる。式Ｉ〜ＩＩＩで表されるオリゴ糖は、分岐鎖の除去、単糖残基の除去および／または置換、および／または隣接する単糖残基間の結合（α１，２、α１，３、α１，４、もしくはα１，６など）の修飾により、式Ｂから従来の方法で誘導される。ある種の実施形態において、オリゴ糖は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか一つに関して、α１，２、α１，３、またはα１，６結合によって結合した、１本または両方の分岐鎖に、例えば１、２、または３つのさらなるマンノース残基を有することがある。

オリゴ糖は、例えば１つ、２つまたは３つのＭ６Ｐ残基を有してよい。オリゴ糖は、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の単糖残基を有してよい。他の実施形態において、オリゴ糖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のマンノース残基を有してよく、このうちいずれもリン酸化または非リン酸化されてよい。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖はオリゴ糖１〜９６から選択され、これは式Ｉの種類である。

いくつかの実施形態において、ｄはαとβとの混合物である（すなわち、オリゴ糖は、例えば、オリゴ糖１および２、３および４、または９５および９６の混合物である）。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖はオリゴ糖９７〜１０３から選択され、これは式ＩＩの種類である。

いくつかの実施形態において、ｆはαとβとの混合物である（すなわち、オリゴ糖は、例えば、オリゴ糖９７および９８、９９および１００、または１０１および１０２の混合物である）。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖はオリゴ糖１０４〜１２７から選択され、これは式ＩＩＩの種類である。

いくつかの実施形態において、ｉはαとβとの混合物である（すなわち、オリゴ糖は、例えば、オリゴ糖１０４および１０５、１０６および１０７、または１２６および１２７の混合物である）。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖は、オリゴ糖１２８〜１３３から選択され、これは式ＩＶの種類である。

いくつかの実施形態において、ｋはαとβとの混合物である（すなわち、オリゴ糖は、例えば、オリゴ糖１２８および１２９、１３０および１３１、または１３２および１３３の混合物である）。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖はオリゴ糖１３４および１３５から選択され、これは式Ｖの種類である。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖はオリゴ糖１３４および１３５の混合物である。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖はオリゴ糖１３６であり、これは式ＶＩの種類である。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖は、天然の供給源から単離することができる。天然の供給源から単離されたオリゴ糖は、関連するオリゴ糖の同種の混合物または異種の混合物であってよい。

ある種の実施形態において、オリゴ糖は化学的および／または酵素的合成により製造される。いくつかの実施形態において、オリゴ糖は天然の供給源から単離されたオリゴ糖を、化学的または酵素的に修飾することで製造することができる（「半合成」）。

オリゴ糖は、例えば図１〜７、Ｏｂｓｏｒｎら，Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｔｈｅｉｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｏｌｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００、Ｗａｎｇら（ｅｄｓ），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００４、Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１、Ｄｒｉｇｕｅｚら，Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９９、Ｄｕｆｆｅｌｓら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．６：１４１６−１４３０（２０００）、Ｈｏｊｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．１：２３−４８（２０００）、Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４４６：１０４６−１０５１（２００７）、Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．４：７５１−７６３（２００５）、Ｓｒｉｖａｓｔａｎａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１６１：１９５−２１０（１９８７）、およびＨａｇｉｈａｒａら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｃ．６：２９０−３０２（２００６）と、米国特許第５，３２４，６６３号、第６，１５６，５４７号、第６，５７３，３３７号、第６，７２３，８４３号、第７，０１９，１３１号、および第７，１６０，５１７号で説明されたように、化学的および／または酵素的に合成することができる。

いくつかの実施形態において、オリゴ糖は連続して単糖を追加することで合成することができる。ある種の実施形態において、選択的保護および脱保護により、既存の糖の特定の位置（例えば２−Ｏ、３−Ｏ、４−Ｏ、または６−Ｏ）に、単糖を追加することができる。例えば、オリゴ糖８２を、図１の逆合成解析および図２〜７に記載の合成スキームに記述されたように、合成することができる。いくつかの実施形態において、ビルディングブロック２ａを、図３、５、および６の合成スキームのビルディングブロック２に置換することができる。ビルディングブロック２ａが使われていれば、七糖段階でビルディングブロック２のベンジリデン基の除去を避けることができる。

マンノース残基を、例えば米国特許第６，９０５，８５６号で説明されたように、酵素的にリン酸化することができる。ある種の実施形態において、１、２、または３つのＭ６Ｐ残基を、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６：４９２１−４９２４（２００４）で説明されたように、例えば、マロニルエーテル、マロン酸、およびリン酸など、加水分解酵素耐性Ｍ６Ｐ模倣体で置き換えることができる。

ある種の実施形態において、リンカーは、αまたはβ結合を介して糖に結合することができる。いくつかの実施形態において、β結合は、Ｃｒｉｃｈら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４：８３２１−８３４８（１９９８）、Ｋｉｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３０：８５３７−８５４７（２００８）、Ｓｒｉｖａｓｔａ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３５：３２６９−３２７２（１９７９）、Ｈｏｄｏｓｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２３３５−２３３６（１９９７）、Ｎｉｃｏｌａｏｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：９０５７−９０５８（１９９７）に記載された方法により形成することができる。１つの実施形態において、不活性の脱離基を含むリンカーと反応させることができる中間体を形成するため、ジブチルスズオキシドを用いて、β結合を形成することができる。

１つの実施形態は、式ＶＩＩ：

［式中、
Ｒ₁は、水素、ヒドロキシル、任意に置換された低級アルキル、ホスフェート、サルフェート、−ＯＲ₇、保護基、および糖から選択され；
Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は、それぞれ独立して、水素、サルフェート、ヒドロキシル、−ＯＲ₈、保護基、および糖から選択され；
Ｒ₆は、水素、ヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミノ、アミド、アルキアミノ（ａｌｋｙａｍｉｎｏ）、アミノアルキル、アミノキシ、ヒドラジド、ヒドラジン、任意に置換されたアルケニル、および任意に置換されたＣ₂−Ｃ₆アルキルから選択され；
Ｒ₇およびＲ₈は、それぞれ独立して、アセチルおよび任意に置換された低級アルキルから選択され；ならびに
ｎは、１〜１０の整数である］
で表される化合物を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）式ＶＩＩＩ：

［式中、
Ｒ₁からＲ₅は、上に定義された通りであり；ならびに、
Ｒ₉およびＲ₁₀は、Ｒ₉およびＲ₁₀のうちの１つが、ヒドロキシルのとき、もう一方が水素であるように、水素およびヒドロキシルから選択される］
で表される化合物を、式Ｒ₁₁Ｒ₁₂（Ｓｎ＝Ｏ）で表される化合物で処理して、式ＩＸ：

［式中、
Ｒ₁からＲ₅は、上で定義された通りであり；ならびに、
Ｒ₁₁およびＲ₁₂はそれぞれ独立に、非置換アルキルから選択され、またはＲ₁₁およびＲ₁₂は一緒になって、非置換アルキレンから選択される］
で表される化合物を形成し；
ｂ）式ＩＸの化合物を、任意に金属ハロゲン化物の存在下、式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌ：
［式中、
Ｒ₆およびｎは、上で定義された通りであり；ならびに、
Ｌはハロゲンである］
で表される化合物で処理して式ＶＩＩの化合物を形成すること
を含む、前記方法を提供する。

「任意の」または「任意に」は、引き続き記述される事象または状況が起こる場合がある、または起こらない場合があること、明細書が事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。例えば、「任意に置換されたアルキル」は、下記で定義されるような「アルキル」および「置換アルキル」の両方を含む。１または２以上の置換基を含むどんな基に関しても、かかる基が立体的に現実的でない、合成的に実行不可能である、および／または本質的に不安定な、いかなる置換または置換形式を取り込むことを意図しないことは、当業者により理解される。

「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖を含み、通常１〜２０個の炭素原子を有し、例えば１〜８個の炭素原子を有し、例えば１〜６個の炭素原子を有する。例えば、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルは、１〜６個の炭素原子の直鎖および分岐鎖の両方のアルキルを含む。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、３−メチルペンチルなどが挙げられる。アルキレンは、アルキルの別の集合であり、アルキルと同じ残基を表すが、２箇所の結合部を有する。アルキレン基は、通常２〜２０個の炭素原子、例えば２〜８個の炭素原子、例えば２〜６個の炭素原子を有する。例えば、Ｃ₀アルキレンは、１つの共有結合を示し、Ｃ₁アルキレンはメチレン基である。具体的な数の炭素を有するアルキル残基が指定されるとき、その数の炭素を有するすべての幾何異性体が含まれることを意図する。したがって、例えば、「ブチル」はｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、およびｔ−ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ−プロピルおよびイソプロピルを含む。「低級アルキル」は１〜４個の炭素を有するアルキル基を示す。

「アルケニル」は、親となるアルキルの隣り合う炭素原子から、１分子の水素分子が取り除かれることにより生成される、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の分岐または直鎖アルキルを示す。この基は、二重結合がシスまたはトランスのどちらの配置でもよい。例示的なアルキル基には、エテニル；プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル（アリル）、プロプ−２−エン−２−イルなどのプロペニル；ブト−１−エン−１−イル、ブト−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イルなどのブテニルなどを含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、アルケニル基は２〜２０個の炭素原子を有し、別の実施形態において、２〜６個の炭素原子を有する。

本明細書で使用される「置換」という語は、指定された原子または基の１または２以上の水素のいずれかが、指示された基から選ばれたもので置き換わり、ただし指定された原子の通常の原子価を超えないことを意味する。置換基がオキソ（すなわち、＝Ｏ）であるとき、原子の２つの水素が置き換わる。置換基および／または変数の組合せは、かかる組合せが安定した化合物または有用な合成中間物をもたらす場合に限り、許容される。安定した化合物または安定した構造は、反応混合物からの単離、および少なくとも実際の有用性を有する医薬としての、その後の処方でも存在するほど、十分強固である化合物を示唆するものである。他に断りが無い限り、置換基はそのコア構造に名付けられる。例えば、（シクロアルキル）アルキルが置換基の候補として列挙されるとき、この置換基のコア構造への結合位置は、アルキル部分にあることが、理解されるべきである。

他に明らかに定義されない限り、「置換アルキル」という語は、１または２以上の水素原子が、以下から独立に選択される置換基によって置換されるアルキルのことである：
−Ｒ^a、−ＯＲ^b、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）Ｏ−（例えば、メチレンジオキシ−）、−ＳＲ^b、−ＮＲ^bＲ^c、ハロ、シアノ、オキソ、ニトロ、サルフェート、ホスフェート、−ＣＯＲ^b、−ＣＯ₂Ｒ^b、−ＣＯＮＲ^bＲ^c、−ＯＣＯＲ^b、−ＯＣＯ₂Ｒ^a、−ＯＣＯＮＲ^bＲ^c、−ＮＲ^cＣＯＲ^b、−ＮＲ^cＣＯ₂Ｒ^a、−ＮＲ^cＣＯＮＲ^bＲ^c、−ＳＯＲ^a、−ＳＯ₂Ｒ^a、−ＳＯ₂ＮＲ^bＲ^c、−ＮＲ^cＳＯ₂Ｒ^a、エチレングリコール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
ここでＲ^aは、任意に置換されたＣ₁−Ｃ₆アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから選択され；
Ｒ^bは、水素、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ^c、任意に置換されたＣ₁−Ｃ₆アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールから選択され；
Ｒ^cは、水素および任意に置換されたＣ₁−Ｃ₄アルキルから選択され；または
Ｒ^bおよびＲ^c、並びにそれらが結合する窒素原子は、任意に置換されたヘテロシクロアルキル基を形成し；ならびに
各任意に置換された基は、非置換でよく、あるいは、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−、ヘテロアリール−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−、Ｃ₁−Ｃ₄ハロアルキル−、−ＯＣ₁−Ｃ₄アルキル、−ＯＣ₁−Ｃ₄アルキルフェニル、−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−ＯＨ、−ＯＣ₁−Ｃ₄ハロアルキル、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｃ₁−Ｃ₄アルキル−ＮＨ₂、−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）（Ｃ₁−Ｃ₄アルキルフェニル）、−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキルフェニル）、シアノ、ニトロ、オキソ（ヘテロアリールの置換基として）、−ＣＯ₂Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ₁−Ｃ₄アルキル、−ＣＯＮ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＣＯＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＣＯＮＨ₂、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル）、−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ₁−Ｃ₄フェニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ₁−Ｃ₄ハロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、−ＳＯ₂（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＳＯ₂（フェニル）、−ＳＯ₂（Ｃ₁−Ｃ₄ハロアルキル）、−ＳＯ₂ＮＨ₂、−ＳＯ₂ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＳＯ₂ＮＨ（フェニル）、−ＮＨＳＯ₂（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）、−ＮＨＳＯ₂（フェニル）、および−ＮＨＳＯ₂（Ｃ₁−Ｃ₄ハロアルキル）から独立して選択される、１または２以上の置換基で独立して置換されてよい。

いくつかの実施形態において、Ｒ₁は、水素、任意に置換された低級アルキル、ホスフェート、サルフェート、−ＯＲ₇、保護基、および糖から選択される。追加の実施形態において、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、およびＲ₅は、それぞれ独立に、水素、サルフェート、ヒドロキシル、−ＯＲ₈、保護基、および糖から選択される。ある種の実施形態において、Ｒ₇およびＲ₈はそれぞれ独立に、アセチルおよび任意に置換された低級アルキルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、およびＲ₅のいずれかまたはすべては、選択的に除去することができる保護基から選択することができ、ベンジル、シリル、およびトリチルエーテル、並びに酢酸以外のエステルが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｒ₁からＲ₅のうちの２つは、一緒になって、保護基を形成する。１つの実施形態において、Ｒ₁は、−Ｏ−ベンジルおよび−ＯＣＰｈ₃から選択される。別の実施形態において、Ｒ₂からＲ₅のうちの少なくとも１つは、−Ｏ−ベンジルである。いくつかの実施形態において、Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₄は、それぞれ−Ｏ−ベンジルである。さらなる実施形態において、Ｒ₁は−ＯＣＰｈ₃であり、Ｒ₄は−Ｏ−ベンジルである。１つの実施形態において、Ｒ₁₁およびＲ₁₂は、一緒になって、ヘキサメチレンを形成する。別の実施形態において、Ｒ₁₁およびＲ₁₂は、それぞれイソプロピルである。さらに別の実施形態において、Ｒ₁₁およびＲ₁₂は、それぞれヘキシルである。

追加の実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物は、任意に保護されたマンノース、ラムノース、イドース、およびアルトロースから選択される。１つの実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物は、任意に保護されたマンノースである。ある状況において、マンノースを、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−６位の１又は２以上を保護してもよい。いくつかの例において、単一の保護基は、２つの位置に結合することができる。例えば、ベンジリデン基は、Ｃ−４およびＣ−６位の両方を保護するために使用することができる。

一般に、式ＩＸの化合物と、強い求電子性または交差反応性でない糖のいかなる保護基も使用することができる。適当な保護基には、任意に置換されたベンジルエーテル、トリチルエーテル、アリルエーテル、またはシリルエーテルなどのエーテル；任意に置換された酢酸、安息香酸、クロロ酢酸、ピバル酸、またはレブリン酸などのエステル；ベンジリデン、イソプロピリデンおよびブタンジアセタールを含むアセタールなどが挙げられる。さらに、保護基を、カルバミン酸およびウレタンから選択することができる。いくつかの実施形態において、例えばベンジル、シリル、およびトリチルエーテル、ならびに酢酸以外のエステルなどの保護基を、選択的に除去することができる。保護基の位置および正体は、所望の最終生成物によって変えることができる。当業者に公知の追加の保護基を、本明細書で記述された実施形態に従って使用することができる。

１つの実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物は、式Ｒ₁₁Ｒ₁₂（Ｓｎ＝Ｏ）で表される化合物で処理され、式Ｒ₁₁およびＲ₁₂は、それぞれ独立に、非置換アルキルから選択され、またはＲ₁₁およびＲ₁₂は一緒になって、非置換アルキレンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ₁₁およびＲ₁₂はブチルである。１つの実施形態において、式Ｒ₁₁Ｒ₁₂（Ｓｎ＝Ｏ）で表される化合物を、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、イソプロパノール、メタノール、またはキシレンなどの溶媒中で、式ＶＩＩＩの化合物と反応させる。いくつかの実施形態において、昇温、任意に還流下で、反応を実施して、式ＩＸの化合物を形成する。いくつかの実施形態において、反応混合物を少なくとも４０、５０、６０、７０、または８０℃に加熱する。追加の実施形態において、式Ｒ₁₁Ｒ₁₂（Ｓｎ＝Ｏ）で表される化合物を、少なくとも１、２、５、１０、１５、または２０時間、式ＶＩＩＩの化合物と反応させる。

１つの実施形態において、式ＩＸの化合物を式Ｒ₆−（ＣＨ₂）−Ｌで表される化合物で、任意に金属ハロゲン化物の存在下で処理する。いくつかの実施形態において、Ｒ₆は水素、ヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミノ、アミド、アルキアミノ（ａｌｋｙａｍｉｎｏ）、アミノアルキル、アミノキシ、ヒドラジド、ヒドラジン、任意に置換されたアルケニル、および任意に置換されたＣ₂−Ｃ₆アルキルから選択される。追加の実施形態において、ｎは１〜１０の整数である。ある種の実施形態において、ｎは２、３、４、５、または６であり、Ｒ₆はＣ₁−Ｃ₄アルコキシカルボニルである。１つの実施形態において、ｎは３であり、Ｒ₆はメトキシカルボニルである。いくつかの実施形態において、Ｌは活性化されない脱離基である。活性化された脱離基の例としては、トリフレート、スルホネート、トシレート、および他の類似の基が挙げられる。いくつかの実施形態において、低い反応性の脱離基を、アリル基などの隣接基によって活性化することができる。ある種の実施形態において、Ｒ₆は脱離基を活性化する置換基を含まない。いくつかの実施形態において、Ｌはブロミド、クロリド、またはヨージドである。１つの実施形態において、Ｌはブロミドである。追加の実施形態において、式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌの化合物は、４−ブロモ酪酸メチルである。

１つの実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物は、任意に保護されたマンノースであり、式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌの化合物は、４−ブロモ酪酸メチルである。別の実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物は、３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−マンノースおよび３−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−Ｄ−マンノースから選択される。

いくつかの実施形態において、式ＩＸの化合物を式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌで表される化合物で、金属ハロゲン化物の存在下で処理する。金属ハロゲン化物のある種の実施形態は、金属フッ化物を含む。いくつかの実施形態において、金属フッ化物は、フッ化セシウム、フッ化ナトリウム、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、フッ化リチウム、およびフッ化カリウムから選択される。１つの実施形態において、金属ハロゲン化物はフッ化セシウムである。いくつかの実施形態において、式ＩＸの化合物を式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌの化合物で処理することは、テトラアルキルアンモニウムハライドの添加をさらに含む。いくつかの例において、テトラアルキルアンモニウムハライドは、テトラブチルアンモニウムヨージドである。追加の実施形態において、金属ハロゲン化物を反応に使用することができる。金属ハロゲン化物の例としては、ヨウ化ナトリウムなどのアルカリ金属ヨウ化物が挙げられる。

１つの実施形態において、極性非プロトン性溶媒中で、式ＩＸの化合物を、式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌの化合物と混合することができる。かかる溶媒には、当業者に公知の中でも、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ニトロメタン、ヘキサメチルリン酸アミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、およびメチルエチルケトンが挙げられる。

ある種の実施形態において、式ＩＸの化合物は、式Ｒ₆−（ＣＨ₂）_n−Ｌの化合物と、室温で混合することができる。他の実施形態において、反応物が組み合わされ、少なくとも５０、６０、７０、または８０℃に加熱されて、式ＶＩＩの化合物を形成する。さらなる実施形態において、混合物は少なくとも１、２、５、１０、１５、または２０時間加熱される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％で立体特異的生成物をもたらす。追加の実施形態において、立体特異的生成物の収率は、最大可能収率の少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％である。ある種の実施形態において、β−結合生成物とα−結合生成物との比率は、少なくとも１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、または１００：１である。

１つの実施形態において、式ＶＩＩの化合物を大規模に製造することができる。いくつかの実施形態において、「大規模」は、出発物質、中間体または試薬を少なくとも５０、１００、５００、または１０００グラム使用することを示す。追加の実施形態において、「大規模」は、出発物質、中間体または試薬を、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、または５００ｋｇ使用することを含む。

ジブチルスズオキシド試薬を使用して、式Ａの化合物を製造する例示的な合成スキームを図８に示す。

Ｂ．タンパク質
本明細書で記述されたオリゴ糖−タンパク複合体は、単離されたタンパク質、および組み換えられた、または合成的に生産されたタンパク質を含む、全ての純粋なタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、あるいはその断片を含み得る。「純粋な」、「精製された」、および「単離された」という語は、天然の環境中の実質的に遊離の分子を示す。例として、純粋なタンパク質は、由来する細胞または組織の供給源の、実質的に遊離の細胞物質および／または他のタンパク質である。この語は例えば、少なくとも７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、あるいは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物に関する。

他の実施形態において、タンパク質は、ｐＨ１〜７の範囲、例えば１〜３、２〜５、３〜６、４〜５、５〜６、または４〜６などで、活性アッセイによって測定された、最適な活性を有する酵素であってよい。例えば、酵素はｐＨ４〜６の範囲で、最適ｐＨを有し得る。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、１〜８の範囲、例えば１〜３、２〜５、３〜８、４〜５、５〜６、４〜６、５〜８、６〜８、または７〜８の範囲の等電点（ｐＩ）を有する酵素であり得る。タンパク質のｐＩを、例えばゲル等電点電気泳動を用いて測定することができる。

ある種の実施形態において、タンパク質自体は少なくとも１つのオリゴ糖を有する（すなわち、糖タンパク質である）。個々の実施形態において、タンパク質は、治療用糖タンパク質である。例えば、治療用糖タンパク質は、例えば表１に列挙されたリソソーム加水分解酵素のうちの１つなど、ＥＲＴ酵素を含むリソソーム酵素であってよい。ある種の実施形態において、リソソーム酵素は、例えばα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、およびα−Ｌ−イズロニダーゼから選択される。個々の実施形態において、リソソーム酵素はＧＡＡである。

いくつかの実施形態において、タンパク質は少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上のＮ−結合型またはＯ−結合型オリゴ糖を有する糖タンパク質であってよい。他の実施形態において、タンパク質は、Ｎ−結合型またはＯ−結合型糖鎖形成のための、１、２、３、４、５、またはそれ以上のコンセンサス部位を有することができ、そしてその少なくとも１つがグリコシル化される。

ある種の実施形態において、タンパク質は受容体のリガンドであってよい。例えばいくつかの実施形態において、タンパク質は、例えばマンノースまたはマンノース−６−リン酸などの糖を認識する受容体と結合する糖タンパク質であってよい。個々の実施形態において、糖タンパク質は、例えばアシアロ糖タンパク質受容体、ＣＩ−ＭＰＲ、ＣＤ−ＭＰＲ、またはマンノース受容体と結合することができる。

好適なタンパク質配列は当業者に周知である。当業者は、異なる種の配列などを含む関連配列を比較することにより、保存領域および重要な機能的モチーフを容易に同定することができる。保存されたアミノ酸は、活性のためにより重要である可能性が高く、反対に、保存されていないアミノ酸は、変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を許容する可能性の高いポリペプチド領域を示す。この指針に従って、当業者はただの通常業務によって機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）を容易に同定することができる。さらに、結晶構造が公知である場合に、当業者は結晶構造を分析して、構造および／または機能に重要であり、したがって変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）に対する許容性が低いと考えられるアミノ酸を同定することができる。当業者はまた、変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を許容し得るアミノ酸を同定することもできる。さらに当業者は，公知の構造−機能相関の観点で、可能性のある変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を評価することができる。

例えば、α−ガラクトシダーゼの配列および構造は周知である。例えば、Ｇａｒｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３７：３１９−３３５（２００４）、Ｇａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，７７：３−１１（２００２）、Ｍａｔｓｕｚａｗａら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１７：３１７−３２８（２００５）を参照のこと。また、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０５７９０も参照のこと。別の例において、ＧＡＡの配列は周知である（例えば、Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９６４１−９６４４（１９８６）、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７２：４９３−４９７（１９９０）、Ｍｏｒｅｌａｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：６７８０−６７９１（２００５）を参照のこと）。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００１５２も参照のこと。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉの対応するα−グリコシダーゼの結晶構造は決定されており、構造的見識を他のα−グリコシダーゼに提供することができる。Ｌｏｖｅｒｉｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２１０５−２１１５（２００５）を参照のこと。３つめの例において、酸性スフィンゴミエリナーゼの配列は、酸性スフィンゴミエリナーゼの配列および構造の重要な特徴であるとして周知である（例えば、Ｌａｎｓｍａｎｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０７６−１０８８（２００３）を参照のこと）。例えば、Ｓｅｔｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１３：３１７２−３１８６（２００４）、Ｑｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３２７４４−３２７５２（２００３）、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：３３３−３４０（２００５）を参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＩ５８７０８７も参照のこと。さらに別の例において、α−Ｌ−イズロニダーゼの配列は、α−Ｌ−イズロニダーゼの重要な特徴のため、周知である（例えば、Ｓｃｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：９６９５−９６９９（１９９１）、Ｓｃｏｔｔら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：１３１１−１３１３（１９９２）を参照のこと）。例えば、Ｓｃｏｔｔら，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．６：２８８−３０２（１９９５）、Ｒｅｍｐｅｌら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．８５：２８−３７（２００５）、Ｄｕｒａｎｄら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ７：２７７−２８４（１９９７）、Ｂｅｅｓｌｅｙら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０９：５０３−５１１（２００１）、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１：７４１−７５０（２００１）、Ｎｉｅｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：８０５４−８０６５（２００３）を参照のこと。さらなる例において、イズロン酸−２−スルファターゼの配列は、疾患を引き起こす変異体（ｍｕｔａｔｉｏｎ）であるとして周知である。例えば、Ｆｌｏｍｅｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：５−１０（１９９３）、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２６：３０９−３１３（１９８９）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５３１−８５３５（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７：７７３−７７５（１９９３）、Ｓｕｋｅｇｗａ−Ｈａｙａｓａｋａら，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ ２９：７５５−７６１（２００６）およびその中の参考文献を参考のこと。イズロン酸−２−スルファターゼの構造はモデル化されている。例えば、Ｋｉｍら，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２１：１９３−２０１（２００３）を参照のこと。別の例において、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（アリールスルファターゼＢ）の配列および構造は、疾患を引き起こす変異体（ｍｕｔａｔｉｏｎ）であるとして公知である。例えば、Ｌｉｔｊｅｎｓら，Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１：３９７−４０２（１９９２）、Ｐｅｔｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３３７４−３３８１（１９９０）、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６：１４９−１５８（１９９０）、Ｂｏｎｄら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５：２７７−２８９（１９９７）を参照のこと。

Ｃ．リンカー
ある種の実施形態において、本発明のオリゴ糖−タンパク複合体は、複合体のオリゴ糖成分およびタンパク質成分との間にリンカーを含む。他の実施形態において、複合体は、リンカーを含まない。リンカーを含む実施形態において、ＣＩ−ＭＰＲへのオリゴ糖の結合を妨げず、および／またはタンパク質の活性（例えば、酵素的活性を含む）を阻まない限り、当業者に公知の任意の適当なリンカーを使用することができる。例えば、リンカーは、米国特許第４，６７１，９５８号、第４，８６７，９７３号、第５，６９１，１５４号、第５，８４６，７２８号、第６，４７２，５０６号、第６，５４１，６６９号、第７，１４１，６７６号、第７，１７６，１８５号、第７，２３２，８０５号、または米国特許出願公開第２００６／０２２８３４８号で開示されたリンカーの１つであってよい。いくつかの実施形態において、リンカーは国際公開２００８／０８９４０３号で開示されたリンカーから選択される。

いくつかの実施形態において、リンカーは次式を有することができる。

［式中、
Ｚは、任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから選択され、Ｐは、水素またはアミノ保護基から選択される］。

本明細書で使用される、アミノオキシ化合物（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アシルオキシ、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロシクリルオキシなど）のいかなる化学基も、他に述べられない限り、置換または非置換でよく、１または２以上のヘテロ原子、または化学基により中断される場合がある。中断するヘテロ原子には、窒素、酸素、および硫黄が含まれる。置換基または中断する化学基を、例えば、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルケニル、アルコキシ、アルキル、アルキニル、アミド、アミノ、アリール、アリールオキシ、アジド、カルバモイル、カルボアルコキシ、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、ホルミル、グアニジノ、ハロ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、イミノアミノ、ニトロ、オキソ、ホスホンアミノ、スルフィニル、スルホンアミノ、スルホナート、スルホニル、チオ、チオアシルアミノ、チオウレイド、およびウレイドから選択することができる。置換基それ自体は、置換または非置換でよく、例えば、窒素、硫黄、および酸素など、１または２以上のヘテロ原子で中断されているかまたは終結している場合がある。

１つの実施形態において、リンカーは：

との反応により形成され得る。

追加の実施形態において、リンカーは次式を有することができる

［式中、ＺおよびＰは、上で定義される通りである］。

別の実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含むことができる。ジスルフィドリンカーを、例えばシステインを介して、タンパク質骨格にオリゴ糖を結合させるのに使用することができる。１つの実施形態において、リンカーは

を含む、またはこれとの反応から形成することができる。

一般に、複合体のオリゴ糖成分およびタンパク質成分間の立体障害を避けるよう、ＣＩ−ＭＰＲへのオリゴ糖の結合、および／またはタンパク質の活性（例えば、酵素的活性を含む）を妨げないようにリンカーを適当な長さにすることができ。例えば、リンカーは１〜１００、１〜６０、５〜６０、５〜４０、２〜５０、２〜２０、５〜１０、または５〜２０個の直鎖の原子を含むことができ、このリンカーは、エステル、アミド、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、エーテル、チオエーテル、ホスホロチオ酸、ホスホン酸、チオエステル、および／またはジスルフィド結合により、タンパク質およびオリゴ糖に結合する。リンカーの残りの直鎖原子は、例えば、炭素、酸素、窒素、および硫黄から選択され、この原子のうちのいずれも、任意に炭素環、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環に含まれていてよい。リンカーの直鎖炭素原子は、任意にハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノおよびウレイドから選択される置換基で置換されていてよい。リンカーの直鎖窒素原子は、任意にアシル、スルホニル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシカルボニルで置換されていてよい。リンカーの直鎖硫黄原子は、任意に酸化されていてよい。

ある種の実施形態において、例えば米国特許出願公開第２００６／０２２８３４８号および米国特許第４，８６７，９７３号、第７，１７６，１８５号、第７，２３２，８０５号に開示されたように、リンカーを切断することができる。いくつかの実施形態において、リソソーム条件下で、リンカーを切断することができる。

Ｄ．オリゴ糖−タンパク複合体の製造方法
例えば、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩのオリゴ糖を含む複合体など、本発明の複合体は、当業者に公知のいずれかの方法により製造することができる。これら方法のいずれかにおいて、適当なリンカーは、オリゴ糖またはタンパク質のどちらか、あるいはオリゴ糖およびタンパク質の両方に存在することができる。例えば、複合体を、例えばＺｈｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８９：６１９−６２８（２００５）、Ｚｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０３３６−５０３４１（２００４）、米国特許第５，１５３，３１２号、第５，２１２，２９８号、第５，２８０，１１３号、第５，３０６，４９２号、第５，５２１，２９０号、第７，００１，９９４号、米国特許仮出願第６０／８８５，４５７号、または第６０／８８５，４７１号に記述されたように製造することができる。

ある種の実施形態において、オリゴ糖はシステインまたはリシンなど、タンパク質のアミノ酸に結合することができる。例えば、糖はスクシンイミジル４−ホルミル安息香酸で、タンパク質のリシン残基を修飾することで、リシンを介して結合することができる。さらに、糖はトラウト試薬またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）などのジスルフィド、もしくはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ）などの保護チオ−ルを含むリンカーで、リシンを修飾することにより、リシンを介して結合することができる。

追加の実施形態において、オリゴ糖は糖タンパク質のグリカンに結合することができる。１つの実施形態において、オリゴ糖はグリカンのシアル酸残基に結合することができる。他の実施形態において、オリゴ糖は、グリカンのマンノース、フコース、ガラクトース、および／またはシアル酸残基に結合することができる。ガラクトースを介した結合について、まず、糖タンパク質をシアリダーゼで処理して、シアル酸残基を取り除き、その後オリゴ糖と反応させる前にガラクトースオキシダーゼで処理することができる。

例えば、オリゴ糖−タンパク複合体は、（例えば、アミン、チオール、カルボン酸、ヒドロキシルを含む）タンパク質に存在し得るいずれかの官能基、および／または、タンパク質へ導入され得るいずれかの官能基を、オリゴ糖上の好適な第二の官能基と反応させることによって製造され得る。官能基の導入方法は、当技術分野で周知である。例えば、少なくとも１つのカルボニル基を有する糖タンパク質は、例えば、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）またはガラクトースオキシダーゼで、糖タンパク質を酸化することにより得られる。別の例において、カルボニル基は、例えばＷａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５６−６１（２００３）に記載されるように、拡張遺伝暗号を有する発現系を使用して導入され得る。また、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３４８号には、糖タンパク質への反応基の導入について記述されており、参照のこと。

いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、カルボニル−反応基を含むリンカーで修飾されたオリゴ糖と結合する前に、過ヨウ素酸塩で酸化される。カルボニル−反応基の例としては、アミノオキシ、ヒドラジン、またはヒドラジドなどが挙げられる。ある種の実施形態において、糖タンパク質は、約１、２、３、４、５、７．５、１０、または２２．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で酸化される。ある種の実施形態において、糖タンパク質は、糖タンパク質グリカンのシアル酸残基を酸化し、フコースおよびマンノースの酸化を最小限にするのに十分な条件下で酸化される。例示的実施形態において、過ヨウ素酸塩の濃度は、約２、３、４、または５ｍＭ未満とした。１つの実施形態において、過ヨウ素酸塩は過ヨウ素酸ナトリウムである。

ある種の実施形態において、結合の間に形成されるタンパク凝集体は、様々なクロマトグラフィー法を用いて、取り除くことができる。１つの実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いることができる。ＨＩＣカラムの例としては、Ｂｕｔｙｌ６５０Ｃおよび６５０Ｍ、Ｈｅｘｙｌ６５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ６ＦＦ、Ｃａｐｔｏ ＯｃｔｙｌおよびＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌが挙げられる。他の実施形態としては、凝集体を銅、ニッケル、コバルト、または水銀などの金属キレートクロマトグラフィーにより取り除くことができる。１つの実施形態において、銅カラムを、結合・溶出モード（ｂｉｎｄ−ａｎｄ−ｅｌｕｔｅ）またはフロースルーモードで使用することができる。例示的な溶出緩衝液として、グリシンまたはイミダゾールが挙げられる。いくつかの実施形態において、凝集体は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％減少する。追加の実施形態において、複合体は０．５、１、１．５、２、２．５、または３％未満の凝集体を含む。

Ｅ．複合体
複合体のオリゴ糖およびタンパク質成分は、例えば、本明細書で記述されるオリゴ糖およびタンパク質のいずれかであってよい。ある種の実施形態において、オリゴ糖−タンパク複合体は、オリゴ糖−糖タンパク複合体である。いくつかの実施形態において、オリゴ糖−タンパク複合体は、オリゴ糖−リソソーム酵素複合体である。

いくつかの実施形態において、複合体は、式Ｉ〜ＶＩのオリゴ糖から選択されるオリゴ糖を含む。ある種の実施形態において、複合体は糖タンパク質１につき、オリゴ糖を平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜６、２〜４、２〜１０、２〜１２、４〜６、３〜８、５〜６、５〜１０、５〜１５、５〜２０、１０〜１５、１０〜２０、１２〜１５、１２〜１８、または１５〜２０分子含む。いくつかの実施形態において、複合体はタンパク質１分子につき、オリゴ糖を少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０分子含む。追加の実施形態において、複合体はタンパク質１モルにつき、Ｍ６Ｐを少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０モル含む。

ある種の実施形態において、複合体は複合体化されていないタンパク質と比較して、完全な活性（酵素活性など）を示す。他の実施形態において、複合体は複合体化されていないタンパク質と比較して、少なくとも例えば、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の活性を示す場合がある。酵素活性を含む活性を測定するアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ｅｉｓｅｎｔｈａｌら，Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２を参照のこと。リソソーム酵素の活性を測定するアッセイは、例えば、Ｌｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１７８５−１７９６（２００４）、Ｃｉｖａｌｌｅｒｏら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ３７２：９８−１０２（２００６）に記述されている。ＧＡＡの活性を測定する例示的なアッセイは、実施例６に記述されている。ｖａｎ Ｄｉｇｇｅｌｅｎら，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２８：７３３−７４１（２００５）（酸性スフィンゴミエリナーゼの活性のアッセイを記述）、Ｄｏｗｎｉｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：１６９−１８１（２００６）（α−Ｌ−イズロニダーゼの活性のアッセイを記述）、Ｖｏｚｎｙｉら，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２４：６７５−８０（２００１）（イズロン酸−２−スルファターゼ活性のアッセイを記述）、Ｍｕｒｒａｙら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９０：３０７−３１２（２００７）（α−ガラクトシダーゼＡ活性のアッセイを記述）、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．１４：５−１２（１９９１）（Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ活性のアッセイを記述）も参照のこと。

ある種の実施形態において、複合体は、対応する複合体化されていないタンパク質より、標的細胞（例えば、ＣＩ−ＭＰＲを介するエンドサイト−シス）によって、より効果的に取り込まれる。例えば、複合体は複合体化されていないタンパク質より、所与の期間に、例えば少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または２００％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、より効果的に取り込まれる場合がある。他の実施形態において、所与の期間に、非結合タンパク質と比較して、目的とする細胞型（例えば、Ｌ６筋芽細胞またはヒトポンペ病線維芽細胞（ＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＭ２０００５））により、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または１０００倍（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の複合体が取り込まれることがある。基準とされる期間は、例えば、１０分、３０分、４５分、または１、２、３、５、６、１２、２４、４８、または７２時間、もしくはそれ以上でよい。Ｌ６筋芽細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの取り込みは、例えば、実施例６およびＺｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０３３６−５０３４１（２００４）に記述された通りに測定することができる。

ある種の実施形態において、複合体化されていないタンパク質と比較して、複合体のＣＩ−ＭＰＲへの結合の増加が示される。例えば、複合体化されたタンパク質及び複合体化されていないタンパク質の結合定数または解離定数を比較することにより測定されるとおり、例えば、複合体化されたタンパク質は、複合体化されていないタンパク質と比較して、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１，０００、または１０，０００倍、ＣＩ−ＭＰＲへの親和性の改善を示し得る。ＣＩ−ＭＰＲへの結合は、例えば、実施例５およびＺｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０３３６−５０３４１（２００４）に記述された通りに測定することができる。

ある種の実施形態において、複合体は、複合体化されていないタンパク質と比較して、マンノース受容体による取り込みの増加を示さない。あるいは、複合体化されていないタンパク質と比較して、マンノース受容体による取り込みが、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０％未満である。ラット肺胞マクロファージ細胞のマンノース受容体による取り込みは、例えば、Ｚｈｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８９：６１９−６２８（２００５）に記述されたように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。

ある種の実施形態において、好適な動物モデルにおける、代謝的に欠損した酵素の蓄積した基質レベルに関して、複合体は、例えば少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または１０００倍の減少を示す場合がある。例えば、ポンペ病のマウスモデルにおけるグリコーゲンレベルの減少は、例えばＺｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０３３６−５０３４１（２００４）に記述されたように測定することができる。あるいは、例えばＫｉｋｕｃｈｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：８２７−３３（１９９８）に記述された、ポンペ病のウズラモデルを使用することができる。別の例として、肝臓および脾臓中に蓄積されたグリコサミノグリカンの減少を、Ｋａｋｋｉｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７２：１９９−２０８（２００１）に記述されたように、ムコ多糖症Ｉ型のネコモデルで測定することができる。さらに、グロボトリアオシルセラミドレベルの減少を、例えば、Ｉｏａｎｎｏｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１４−２５（２００１）に記述されたように、ファブリー病のマウスモデルで測定することができる。さらに別の例において、スフィンゴミエリンレベルの減少を、例えば、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２８８−２９３（１９９５）に記述されたように、ニーマンピック病のＡ型およびＢ型のマウスモデルで測定することができる。

ＩＩ．医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要とする被験体のリソソーム蓄積症を治療する医薬の製造における、（１）タンパク質、および（２）式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体の使用を提供する。

本明細書で記述された医薬組成物は、上記で記述されたようなオリゴ糖−タンパク複合体、および充填剤、膨張剤、崩壊剤、緩衝剤、安定剤、または賦形剤など、少なくとも１つの添加剤を含む。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つののオリゴ糖、およびリソソーム酵素を含む、複合体を含む。

標準の医薬処方技術は、当技術者に周知である（例えば、２００５Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標），Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｄｏら，Ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００を参照のこと）。好適な医薬添加剤には、例えば、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石灰、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬、および湿潤剤または乳化剤を含んでもよい。この組成物は、保存剤を含んでも含まなくてもよい。

いくつかの実施形態において、α−ガラクトシダーゼＡ複合体を含む医薬組成物は、例えば、マンニトール、リン酸一ナトリウム一水和物、および／またはリン酸水素二ナトリウム七水和物など、１または２以上の賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、α−グルコシダーゼの複合体を含む医薬組成物は、マンニトール、ポリソルベート８０、リン酸水素二ナトリウム七水和物、およびリン酸一ナトリウム一水和物の内、１または２以上のものを含むことができる。別の実施形態において、α−グルコシダーゼの複合体を含む医薬組成物は、グリシン２％まで、マンニトール２％まで、ポリソルベート８０を０．０１％までを備えた１０ｍＭヒスチジンｐＨ６．５を含むことができる。

医薬組成物は、単独の活性化合物として、または他の化合物、組成物、もしくは生物学的物質との組合せでも、本明細書に記述された複合体のいずれかを含むことができる。例えば、医薬組成物は、ＬＳＤおよび／またはＬＳＤに関連する副作用の治療に有用な、１または２以上の小分子も含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物はミグルスタット（ｍｉｇｌｕｓｔａｔ）、および／または例えば米国特許出願公開第２００３／００５０２９９号、第２００３／０１５３７６８号、第２００５／０２２２２４４号、または第２００５／０２６７０９４号に記述される１又は２以上の化合物を含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１又は２以上の免疫抑制剤も含むことができる。

医薬組成物の処方は、目的とする投与方法およびその他の要因に応じて変更してもよい（例えば、Ｒｏｗｅら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ ｅｄ．，ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、組成物を、滅菌注射用蒸留水（米国薬局方）と再構成して、静脈注射による投与のため、滅菌した非発熱性のオフ−ホワイトの凍結乾燥した固形または粉末であってよい。他の実施形態において、組成物を滅菌した非発熱性の溶液であってよい。

本明細書で記述された医薬組成物の投与は、いかなる個々の送達システムに限定されず、非経口（皮下、静脈内、頭蓋内、髄内、関節内、筋内、くも膜下、もしくは腹腔内注射を含む）、経皮、または経口（例えば、カプセル、懸濁剤、または錠剤）を挙げることができるがそれには限定されない。個体へは、単回投与または反復投与、様々な生理学的に許容される塩形態のいずれか、および／または医薬組成物の一部として、許容される医薬担体および／または添加剤と共に投与することができる。

医薬的に許容される塩には、例えば、酢酸アニオン、ベンゼンスルホン酸アニオン、安息香酸アニオン、重炭酸アニオン、重酒石酸アニオン、ブロミドアニオン、カルシウムエデテート（ｃａｌｃｉｕｍ ｅｄｅｔａｔｅ）アニオン、カンシル酸アニオン、炭酸アニオン、クロリドアニオン、クエン酸アニオン、二塩酸、エデト酸アニオン、エジシル酸アニオン、エストル酸（ｅｓｔｏｌａｔｅ）アニオン、エシル酸アニオン、フマル酸アニオン、グルセプチン酸アニオン、グルコン酸アニオン、グルタミン酸アニオン、グリコリルアルサニレート（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキシルレソルシネート（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）アニオン、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎ）、臭化水素、塩酸、ヒドロキシナフトエート（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈｏａｔｅ）アニオン、ヨージドアニオン、イセチオン酸アニオン、乳酸アニオン、ラクトビオン酸酸アニオン、リンゴ酸アニオン、マレイン酸アニオン、マンデル酸アニオン、メシル酸アニオン、メチル臭化物、メチル硝酸アニオン、メチル硫酸アニオン、ムチン酸アニオン、ナプシル酸アニオン、硝酸アニオン、パモン酸アニオン（エンボネート（ｅｍｂｏｎａｔｅ））、パントテン酸アニオン、リン酸アニオン／二リン酸アニオン、ポリガラクツロ酸アニオン、サリチル酸アニオン、ステアリン酸アニオン、塩基性酢酸アニオン、コハク酸アニオン、硫酸アニオン、タンニン酸アニオン、酒石酸アニオン、およびテオクル酸アニオン／トリエチオダイドアニオン；ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、およびプロカインの（有機）カチオン；並びにアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛の（金属）カチオンが挙げられる。医薬的に許容される塩には、例えばＢｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９（１９７７）に記述された塩も含まれる。

本明細書に記述される複合体は、治療有効量で投与される。一般に治療有効量は、被験体の年齢、全体的な状態、および性別、ならびに被験体の病状の重症度に応じて変更され得る。用量は医師により決定され、治療の実際の効果に合わせて、必要であれば調節することができる。この化合物の毒性および治療効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで標準的な医薬的手順により決定することができる。毒性および治療効果の用量比率は、治療指数（または治療可能比）であり、比率ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀として表すことができ、ＬＤ₅₀は全個体の５０％致死量であり、ＥＤ₅₀は全個体の５０％に治療効果がある用量である。本発明の複合体は、例えば、少なくとも１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および２０の治療指数を示す場合がある。

ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび動物試験により得られたデータを、例えば、ヒトにおける用量範囲を決めるのに使用することができる。この化合物の用量は、好ましくは、低い毒性、わずかな毒性、または無毒でＥＤ₅₀を含む循環する濃度の範囲内である。使用する剤形および利用する投与経路によって、用量を変えることができる。どの複合体の治療有効量も、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから、最初に推定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で測定された、ＩＣ₅₀値（すなわち、最大数の半数の症状を阻害する試験複合体の濃度）を含む、循環する血漿濃度範囲を実現するため、動物モデルにおいて、用量を決めることができる。血漿中の程度を、例えば、高速液体クロマトグラフィーまたは適当な酵素活性アッセイにより測定することができる。どの特定用量の効果も適当な評価項目のバイオアッセイにより、測定できる。

他で指示されない限り、症状の重症度および疾患の進行により、ほぼ１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの用量で、複合体を投与することができる。例えば、外来診療で、例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の日数おきに、あるいは例えば週１回、週２回、月１回、または１カ月２回の投与でゆっくりした静脈注射により、複合体を投与してよい。化合物の適当な治療有効用量は、治療する臨床医によって選択され、おおよそ１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態において、適当な治療用量は、例えば０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、および１００ｍｇ／ｋｇから選択される。

α−ガラクトシダーゼＡを含む複合体を、例えば、２週間に１回または４週間に１回、１．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、１０、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３ｍｇ／時未満あるいは等しい注入速度で、静脈注射により投与することができる。別の例において、α−グルコシダーゼを含む複合体を、例えば、２週間または４週間に１回、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇの用量で、おおよそ例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間にわたって、静脈注射により投与することができる。いくつかの実施形態において、α−グルコシダーゼの投与速度は、例えば１ｍｇ／ｋｇ／時で始め、それから例えば３０分ごとに２ｍｇ／ｋｇ／時にし、注入速度に対する被験体の耐性を確立した後、例えば７ｍｇ／ｋｇ／時である最大まで増やすことができる。Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む複合体を、例えば、毎１．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、毎週、おおよそ例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間にわたって、静脈注入により投与することができる。さらに具体的な用量の例としては、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）に記載されている。

ＩＩＩ．リソソーム蓄積症の治療方法
いくつかの実施形態において、本発明は例えば表１に開示されたリソソーム蓄積症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明はさらに、マンノース−６−リン酸を含むオリゴ糖と結合することにより、タンパク質をリソソームに向ける方法を提供する。

ある種の実施形態において、当該方法は、治療有効量で本発明のオリゴ糖−タンパク複合体を、リソソーム蓄積症である被験体（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、またはラットなどの哺乳動物、あるいは例えばウズラなどの鳥類を含む）に、投与することを含む。オリゴ糖−タンパク複合体は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかのオリゴ糖など、マンノース−６−リン酸を含むオリゴ糖と、リソソーム酵素（例えば、表１に列挙したリソソーム酵素）などの糖タンパク質との複合体であり得る。１つの実施形態において、当該方法は、本発明の複合体の少なくとも１つを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。

ある種の実施形態において、当該方法は、（１）タンパク質、および（２）式Ｉ〜ＶＩのいずれかのオリゴ糖など、マンノース−６−リン酸を含むオリゴ糖を含む複合体を、１または２以上の他の治療剤（ｔｈｅｒａｐｙ）と投与することを含む。１または２以上の他の治療剤は、当該複合体の投与と同時に（混合された製剤としての同時投与を含む）、投与前に、または投与後に投与され得る。

いくつかの実施形態において、当該方法は、解熱剤、抗ヒスタミン剤、および／または免疫抑制剤で、（本明細書で記述された複合体での治療前、治療後、または治療中に）被験体を治療することを含む。いくつかの実施形態において、注入に付随する反応を減少、または防止するために、被験体は、オリゴ糖−糖タンパク複合体で治療される前に、解熱剤、抗ヒスタミン剤、および／または免疫抑制剤で治療され得る。例えば、被験体は、アセトアミノフェン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ジフェンヒドラミン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、経口ステロイド、またはラパマイシンのうちの１または２以上で前治療され得る。

いくつかの実施形態において、当該方法はアセトアミノフェン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ジフェンヒドラミン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、経口ステロイド、またはラパマイシンのうちの１または２以上で、例えば、ｔ＝０（複合体を投与する時間）および／またはｔ＝１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０および１４４時間で、あるいはおおよそこの時間で、例えば最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上での複合体治療回数で、被験体を治療することを含む。例えば、いくつかの実施例において、ファブリー病またはポンペ病である被験体は、メトトレキサート（例えば、１ｋｇあたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０ｍｇまたはそれ以上のメトトレキサート）で、例えばｔ＝０、２４、および４８時間で、またはおおよそこの時間で、例えば最初の１、２、３、４、５、６、７、８週間での複合体の治療で、治療され得る。いくつかの実施形態において、複合体への免疫寛容が、シクロスポリンＡおよびアザチオプリンでの治療によって、例えばムコ多糖症Ｉ型などのリソソーム蓄積症である被験体に誘導されることがある。例えば、Ｋａｋｋｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：８２９−８３４（２００４）に記述されたように、被験体はシクロスポリンＡおよびアザチオプリンで治療されてもよい。

いくつかの実施形態において、当該方法は、リソソーム蓄積症の治療のために行われる小分子治療および遺伝子治療を含む、小分子治療および／または遺伝子治療で、（複合体での治療前、治療後、または治療中に）被験体を治療することを含む。小分子治療は、ミグルスタットおよび／または例えば、米国特許出願公開第２００３／００５０２９９号、第２００３／０１５３７６８号、第２００５／０２２２２４４号、および第２００５／０２６７０９４号に記述された１または２以上の化合物の投与を含んでよい。遺伝子治療は、例えば米国特許第５，９５２，５１６号、第６，０６６，６２６号、第６，０７１，８９０号、第６，２８７，８５７号、および米国特許出願公開第２００３／００８７８６８号に記述されたように実施することができる。

「治療」、「治療方法」という語、およびその同族語は、治療処置および予防／防止対策の両方を示す。したがって、治療を必要とする人として、すでに特定のリソソーム蓄積症を有する個体、および疾患の危険性がある人（すなわち、最終的にその疾患にかかる、または疾患のある種の症状に陥りそうな人）を含んでよい。

治療方法は、症状の予防もしくは緩和、または他の所望の生物学的成果をもたらし、臨床兆候の改善もしくは発症遅延、代謝的欠損酵素の活性増加、および／または代謝的欠損酵素の基質の蓄積が減少したレベルにより、評価することができる。

いくつかの実施形態において、当該方法は、（１）リソソーム酵素、および（２）式Ｉ〜ＶＩのいずれかのオリゴ糖を含む複合体を被験体に投与することを含み、これにより、内在性活性と比べて、例えば少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、被験体内の欠損したリソソーム酵素活性が増加する。いくつかの実施形態において、当該方法は、（１）リソソーム酵素、および（２）式Ｉ〜ＶＩのいずれかのオリゴ糖を含む複合体を被験体に投与することを含み、これにより内在性活性と比べて、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または１０００倍、被験体内の欠損した酵素活性が増加する。増加した酵素活性を、例えば臨床症状の縮小、または適当な臨床的もしくは生物学的アッセイによって、測定することができる。

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＧＡＡを含む本発明の複合体を被験体に投与することを含み、これによって、ポンペ病（酸性α−グルコシダーゼ欠損症、酸性マルターゼ欠損症、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型、糖原病ＩＩ型、およびリソソーマルα−グルコシダーゼ欠損症としても知られる）を治療する。ある種の実施形態において、組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて製造される。追加の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、オリゴ糖１０３；１０３および式Ａの混合物；オリゴ糖１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３６；並びにそれらの任意の組合せから選択されるオリゴ糖と複合体化され得る。１つの実施形態において、オリゴ糖は、オリゴ糖１２８および１３６から選択される。追加の実施形態において、ＧＡＡ１モルにつき、少なくとも５モルの式Ａを含む複合体が患者に投与される。

ある種の実施形態において、患者は、ポンペ病と診断されている成人である。他の実施形態において、患者は幼児または子供である。

ＧＡＡ活性の増加は、例えば心筋細胞、骨格筋細胞、または皮膚線維芽細胞におけるリソソームグリコーゲンの蓄積の減少を、生化学的（例えば、Ｚｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０３３６−５０３４１（２００４）を参照のこと）または組織学的に観察することにより測定され得る。ＧＡＡ活性はまた、例えば筋生検サンプル、培養皮膚線維芽細胞、リンパ球、乾燥血斑で測定され得る。乾燥血斑アッセイは、例えば、Ｕｍｐａｔｈｙｓｉｖａｍら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１３７８−１３８３（２００１）およびＬｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１７８５−１７９６（２００４）に記述されている。ポンペ病の治療は、例えばクレアチニンキナーゼの血清レベル、運動機能の増幅率（例えば、アルバータ乳幼児運動発達検査法によって評価される）、エコー図で測定される左室心筋重量係数の変化、および心電図で測定される心臓電気活性によって、評価することもできる。ＧＡＡ複合体の投与はまた、心肥大、心筋症、日中の眠気、労作性呼吸困難、成長障害、摂食困難、「筋緊張低下（ｆｌｏｐｐｉｎｅｓｓ）」、歩行障害、頭痛、低血圧、臓器肥大症（心臓、舌、肝臓の肥大など）、脊柱前弯症、平衡感覚障害、腰痛、朝の頭痛、筋力低下、呼吸不全、翼状肩甲、脊柱側弯症、深部腱反射の低下、睡眠時無呼吸、呼吸器感染症に対する感受性、および嘔吐など、ポンペ病の１または２以上の症状の縮小をもたらし得る。

他の実施形態において、当該方法は、α−ガラクトシダーゼＡを含む複合体を、被験体に投与することでファブリー病を治療することを含む。ファブリー病、またはアンダーソン−ファブリー病は、α−ガラクトシダーゼＡの欠損を特徴とする、希少でＸ連鎖性のリソソーム蓄積症であり、内臓組織と、内皮、外皮および筋細胞のリソソームに、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ３）およびその他の中性スフィンゴ糖脂質の蓄積を引き起こす。血管系への中性スフィンゴ糖脂質の蓄積は、血管の狭窄および拡張、最終的には虚血および梗塞を引き起こす。

α−ガラクトシダーゼＡを含む本発明の複合体の投与は、例えば、肢端感覚異常、狭心症、角化血管腫、不整脈、歩行失調、四肢の灼熱痛ならびに／ヒリヒリする痛み、白内障、寒冷不耐症、伝導異常、角膜渦濁（ｃｏｒｎｅａｌ ｗｈｏｒｌｉｎｇ）、冠動脈疾患、認知症、うつ病、下痢、心室拡張、めまい、心肥大、心筋症、複視、構音障害、疲労、赤血球沈降速度の上昇を伴う発熱、聴覚問題、心疾患、心臓弁疾患、高熱不耐性、片側運動失調、片側不全麻痺、発汗減少症、発汗不全、梗塞、虚血、関節痛、腎疾患、左室肥大、水晶体異常、レンズ混濁、脂肪尿、筋力低下、心筋梗塞、嘔気、眼振、痛み（例えば、全身に広がる激痛）、多渇症、タンパク尿、食後痛、腎不全、網膜異常、耳鳴り、胃痛、ＳＴ−Ｔ変化、脳卒中、尿毒症、弁膜症、めまい、嘔吐および虚弱を含む、１または２以上のファブリー病の臨床症状の縮小をもたらし得る。α−ガラクトシダーゼＡ複合体の投与はまた、例えば、血漿、涙液、白血球、生検組織、または培養皮膚線維芽細胞で、α−ガラクトシダーゼＡ活性の増加をもたらし得る。α−ガラクトシダーゼＡ複合体の投与はまた、複屈折性の脂肪球の増加の減少（例えば、少なくとも１０％減少）または消失という、組織学的所見をもたらし得る。それはまた、尿沈渣の脂肪球減少、血清クレアチニンレベルまたはクレアチニンクリアランスによって測定した腎機能の改善、およびタンパク尿の減少をもたらし得る。α−ガラクトシダーゼＡ複合体の投与はまた、腎臓、心臓、および皮膚の毛細血管内皮のＧＬ３含有物の減少をもたらし得る。ファブリー病治療の効果を測定する追加のアッセイは、例えば、ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３８：７５０−７６０（２００１）に記載されている。

他の実施形態において、当該方法は、酸性スフィンゴミエリナーゼを含む本発明の複合体を、被験体に投与することを含み、これにより、ニーマンピックＡ病またはニーマンピックＢ病、あるいは酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症を治療する。酸性スフィンゴミエリナーゼ複合体の投与は、例えば、異常コレステロールレベル、異常脂質レベル、運動失調、血液異常、眼内のさくらんぼ赤色斑、頻繁な肺感染、成長遅延、肝脾腫大症、血小板数低下、リンパ節腫脹症、末梢神経障害、肺機能の問題、息切れ、皮膚色素変化、または黄色腫症を含む、１または２以上のニーマンピックＡ病またはニーマンピックＢ病に関する、臨床症状の減少をもたらし得る。いくつかの実施形態において、複合体を頭蓋内に投与することができる。

他の実施形態において、当該方法は、α−Ｌ−イズロニダーゼを含む、本発明の複合体を、被験体に投与することを含み、これによりムコ多糖症Ｉ型（例えば、ＭＰＳＩ型のハーラーおよびハーラー−シャイエ型を含む）を治療する。α−Ｌ−イズロニダーゼ複合体の投与は、例えば、大動脈弁逆流、大動脈弁狭窄症、毛根管症候群、慢性鼻炎、伝音難聴、便秘、角膜混濁、発育遅延、下痢、腹部膨張、腰椎後弯症、突背、肝脾腫大症、水頭症、鼠径ヘルニア、脊柱後弯症、精神遅滞、僧帽弁逆流、僧帽弁狭窄症、夜盲症、開放隅角線内症、手の機能低下、進行性関節症、反復呼吸感染、呼吸不全、網膜変性、脊柱側弯症、感音難聴、激しい背中の痛み、鼻漏、睡眠時無呼吸、脊髄圧迫、母指球の萎縮、へそヘルニア、上気道の合併症など、１種または複数のＭＰＳＩ型の臨床症状の減少をもたらし得る。

さらに別の実施形態において、当該方法は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む本発明の複合体を、被験体に投与することを含み、これにより、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター病）を治療する。イズロン酸−２−スルファターゼ複合体の投与は、例えば、腎臓弁膜症、心肺機能不全、毛根管症候群、慢性下痢、慢性の乳頭浮腫、特徴的顔貌、角膜混濁、冠状動脈狭窄、難聴、異形症、異骨症、耳感染、聴覚障害、肝脾腫大症、水頭症、鼠径ヘルニア、関節硬直、後側弯症、精神遅滞、心筋症、心筋肥厚、肺高血圧、網膜機能不全、骨格異常、へそヘルニア、上気道感染、弁機能不全を含む、１または２以上のＭＰＳＩＩ型の臨床症状の減少をもたらし得る。

さらに他の実施形態において、当該方法はＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（アリールスルファターゼＢ）を含む、本発明の複合体を被験体に投与することを含み、これによりムコ多糖症ＶＩ型（マロトー−ラミー症候群）を治療する。Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ複合体の投与は、例えば、失明、心臓異常、心肺疾患、特徴的顔貌、角膜混濁、耳感染、成長遅延、肝腫大、肝脾腫大症、関節変形、神経絞やく症候群、呼吸困難、骨格変形、脊髄圧迫、脾腫、関節の硬直、上気道閉塞を含む、１種または複数のＭＰＳＶＩ型の臨床症状の減少をもたらし得る。

前述および以下の説明は、例示および説明のためのみであり、特許請求されている本発明を限定しない。

実施例１．オリゴ糖合成の一般的手順
Ａ．グリコシル化
グリコシル化反応を、ドナーである糖およびアクセプターである糖を結合させることによる、標準的な方法を用いて実施した。簡潔に言えば、他に指示されない限り、乾燥窒素下、加熱して活性化したモレキュラーシーブ４Ａの存在下で、無水ＤＣＭにドナーおよびアクセプター化合物を溶解させた。この溶液を冷却し、０℃で〜３０分間保存し、続いてＴＭＳＯＴｆ（１ｅｑ）をゆっくり添加した。反応をヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いて、ＴＬＣ（シリカゲル）で確認し、ＴＥＡまたはヒューニッヒ塩基（１．０５ｅｑ）を用いて停止した。混合物をろ過し、シロップになるまで濃縮し、指示されない限り、ヘキサン／ＥｔＯＡｃグラジエントを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。

Ｂ．酸触媒脱アセチル化
ある種の実施形態において、アセチル化化合物は、グリコシル化または他の修飾、例えばリン酸化の前に、脱アセチル化される。以下の実施例において、塩化アセチルを冷（０℃）乾燥メタノールへ加えることによって、塩化水素が生成させた。濃縮した溶液を、ＤＣＭ／メタノール中のアセチル化化合物の１：３溶液に加えた。溶液のメタノール成分に関して、最終濃度は３％ｗ／ｖであった。脱アセチル化反応は、１級のアセテートについては、ａ）約１８時間、２級のアセテートについては、ｂ）約４８から６４時間で行った。反応を、ＴＥＡまたはヒューニッヒ塩基で停止し、指示されない限り、続いてＤＣＭまたはＥｔＯＡｃを水で抽出した。

Ｃ．リン酸化
いくつかの例において、糖は部位特異的なリン酸化を受ける。室温で乾燥アセトニトリルの糖溶液に、５−メチルテトラゾール（３．４ｅｑ）を加え、この混合物を３０分間、乾燥窒素下で撹拌した。ジベンジルジイソプロピルホスホルアミダイト（１個のＯＨ基につき１．７ｅｑ）を加え、反応が完了するまで（約６０分）撹拌した。反応をヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いて、ＴＬＣ（シリカゲル）により確認した。溶液を氷／水で１５分冷却し、３０％ｗ／ｖ過酸化水素（２ｅｑ）を加えた。約６０分後、反応が完結し、過剰の飽和チオ硫酸ナトリウムを加えた。混合物をガム状になるまで濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶解させ、半飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。他で指示されない限り、残渣をヘキサン／ＥｔＯＡｃグラジエントを用いて、フラッシュクロマトグラフィーで精製した。

実施例２．二糖アミノオキシアセトアミドプロピル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−α−Ｄ−マンノシドの合成（１７）

アリルα−Ｄ−マンノシドをＰｅｋａｒｉら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：７４３２（２００１）に記述されている方法にしたがって製造した。無水メタノール（１００ｍＬ）中のアリル−α−Ｄ−マンノシド（８．６８ｇ、３９．４ｍｍｏｌ）に、２，３−ブタンジオン（３．６３ｍＬ、８６．１ｍｍｏｌ）、トリメチルオルトホルメート（１６ｍＬ、１４６ｍｍｏｌ）、および１０−（＋）−カンファースルホン酸（１．３７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を還流下で、９時間、乾燥窒素下で加熱した。反応混合物をＴＥＡ（１ｍＬ）で停止し、赤いシロップ状になるまで濃縮し、４０〜８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、アリル３−Ｏ，４−Ｏ−［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノシド１を白色固体として得た（３．８９ｇ、２９．４％）。

化合物１（２．６５ｇ、８ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２０ｍＬ）へ溶解し、その溶液を氷／水槽で冷却し、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（２．２８ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、ピリジン（２０ｍＬ）および無水酢酸（１．６ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を５０℃まで１６時間加熱し、その後、シロップ状になるまで濃縮し、トルエンと共に留去した。残渣をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）に溶解させ、１Ｍ ＨＣｌ（２ｘ５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。混合物をろ過し、真空下で濃縮し、溶液を濃縮し、アリル２−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ，４−Ｏ［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノシド２をシロップとして得た（５．０ｇ）。

塩化パラジウム（ＩＩ）（０．４２５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、２（５．０ｇ、８ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２５ｍＬ）溶液に撹拌しながら加えた。約３時間後、反応をＴＥＡ（０．７５ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）で停止した。メタノールを減圧下で取り除き、残渣を１０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、２−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ，４−Ｏ［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノシド３を、白色泡状物質として得た（２．７２ｇ、５９．２％）。

トリクロロアセトニトリル（１．７５ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（０．０５ｍＬ，０．３５ｍｍｏｌ）を３（１．０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）溶液に添加した。約７５分後、溶液をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（０〜３０％）を用いて、シリカゲルカラムフラッシュカラムクロマトグラフィーで直接精製し、２−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ，４−Ｏ［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノーストリクロロアセトイミデート４を、白色泡状物質として得た（０．９８ｇ、７８．２％）。ドナーである４（０．９８ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）およびアクセプターである３−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロパノール（０．２８４ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を、実施例１の一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル２−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ，４−Ｏ［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノシド５を、白色泡状物質として得た（０．６６ｇ、６４％）。

無水メタノール（５ｍＬ）中の５（０．６６ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、メタノール（０．０５ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）中の２５％ｗ／ｖナトリウムメトキシドの溶液を加えた。約１時間後、反応を氷酢酸（０．０２５ｍＬ）で停止し、シロップ状にまるまで濃縮した。生成物をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、半飽和食塩水（５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、白色泡状物質であるＮ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ，４−Ｏ［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノシド６を得た（０．５８ｇ、９２％）。

アリルα−Ｄ−マンノシド（３．１５ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２０ｍＬ）に溶解させ、氷／水槽で冷却した。ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（４．０３ｍＬ、１５．７ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を室温になるまで放置した。１８時間撹拌し、ベンゾイルクロリド（５．９３ｍＬ、５１．５ｍｍｏｌ）を加え、２４時間後、反応を水（３ｍＬ）で停止し、３０分撹拌した。溶液を真空下で濃縮し、トルエンで分離した（３ｘ５０ｍＬ）。残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解させ、冷却した１Ｍ ＨＣｌ（５０ｍＬ）、半飽和食塩水（５０ｍＬ）、半飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）、半飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、シロップ状になるまで濃縮した。０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、アリル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−α−Ｄ−マンノシド７を、白色泡状物質として得た（８．６２ｇ、７８．２％）。

氷酢酸（１１．１ｍＬ、１８．２６ｍｍｏｌ）および１Ｍ テトラブチルアンモニウムフルオリド（１８．２６ｍＬ、１８．２６ｍｍｏｌ）を７（１２．７７ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に加えた。８０分で、氷酢酸（０．１５ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）および１Ｍ テトラブチルアンモニウムフルオリド（２．５ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）を加え、９０分で追加の氷酢酸（０．２５ｍＬ、４．１５ｍｍｏｌ）および１Ｍ テトラブチルアンモニウムフルオリド（４．１５ｍＬ、４．１５ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、溶液を半分の容量まで濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈した。溶液を半飽和食塩水（２ｘ１５０ｍＬ）および半飽和重炭酸ナトリウム（２００ｍＬ）で洗浄し、濃縮し、残渣を１０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、アリル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド８を、白色泡状物質として得た（６．７５ｇ、７６．４％）。化合物８（６．７５ｇ、ｙｍｍｏｌ）を、一般的なリン酸化手順に従って変換し、アリル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシド９を、白色泡状物質として得た（９．５２ｇ、９５％）。

塩化パラジウム（ＩＩ）（０．６３８ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を９（９．５２ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）の乾燥メタノール（５０ｍＬ）溶液に加えた。約５時間後、さらにパラジウム（ＩＩ）（０．１４５ｇ）を加えて、混合物を１８時間保存した。この溶液をろ過し、濃縮し、残渣を２０〜７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノース１０を、白色泡状物質として得た（３．８ｇ、４２，５％）。

トリクロロアセトニトリル（５．０６ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（０．１５ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を１０（３．８ｇ）の乾燥ＤＣＭ溶液に、乾燥窒素下、０℃で加えた。約９０分後、溶液を１０〜６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより直接精製し、２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシドトリクロロアセトイミデート１１を、白色泡状物質として得た（３．３ｇ、７２．１％）。

ドナーである６（２．６２ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）およびアクセプターである１１（１．９２ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を、実施例１の一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ，４−Ｏ［ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル］−α−Ｄ−マンノシド１２を、白色泡状物質として得た（１．２７ｇ、３２．２％）。

ＴＦＡ／水 １９：１ ｖ／ｖ（８．４ｍＬ）を、ＤＣＭ（８ｍＬ）中の１２（２．１ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の氷／水槽で冷却した溶液に加えた。約２時間後、出発物質はＴＬＣによって示されたように消費された。エタノール（２５ｍＬ）をこの溶液に加え、その後濃縮し、エタノール（３ｘ２５ｍＬ）と共に留去した。残渣を乾燥メタノール（１０ｍＬ）に溶解させ、氷／水槽で冷却した。塩化アセチル（０．４ｍＬ）を加えて、３％ｗ／ｖのＨＣｌ溶液を得た。この溶液を室温まで放置して温めた。約２時間後、出発物質はＴＬＣに示されたように消費された。反応をトリエチルアミン（１ｍＬ）で停止し、濃縮し、残渣を３０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色泡状物質として１３を得た（０．７５８ｇ、４７．９％）。無水メタノール（１０ｍＬ）中の１３（０．７５８ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、２５％ ｗ／ｖ ナトリウムメトキシドのメタノール（０．１５ｍＬ）溶液を加えた。約１時間後、出発物質はｔｌｃに示されたように消費された。反応を１Ｍ ＨＣｌで停止し、１４を得た。この溶液に氷酢酸（２５μＬ）、湿１０％ Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加え、水素バルーンを取り付けた。６時間反応させたあと、生成物を５％硫酸／ＥｔＯＨで炭化させたが、ＵＶ活性はなかった。混合物をろ過し、油状物になるまで濃縮し、その後水（１０ｍＬ）に溶解させ、凍結乾燥して、３−アミノプロピル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−α−Ｄ−マンノシド１５を得た（０．３００ｇ、１３から９１．３％）。

０．１ＭのＮａＯＨ溶液（２ｍＬ）を水（８．５ｍＬ）中の１５（０．１ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に加え、その後、ＴＨＦ（８．５ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−アミノオキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（０．１４ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、この溶液を２ＭのＨＣｌでｐＨ４に調節し、この溶液をＤＣＭ（３ｘ１０ｍＬ）で抽出した。水層を凍結乾燥して、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−アミノオキシアセトアミドプロピル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−α−Ｄ−マンノシド１６を得た（０．１２ｇ）。化合物１６（０．１２ｇ）をＴＦＡ／ＤＣＭ１：１（１０ｍＬ）に溶解し、その溶液を約３０分間攪拌し、その後油状物になるまで濃縮した。これを水（５ｍＬ）に溶解させ、生成物を凍結乾燥して、固体（０．４５ｇ）を得た。この固体をＢｉｏｇｅｌ（登録商標）Ｐ２を用いて精製し、水で溶出させて、１７を得た（０．０６３ｇ）。

実施例３．三糖（３５）の合成

２−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノーストリクロロアセトアミデート１８を、Ｙａｍａｚａｋｉら，Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．２０１：３１（１９９０）に記述されたように製造した。

６−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノーストリクロロアセトイミデート１９を、Ｈｅｎｇら，Ｊ．Ｃａｒｂ．Ｃｈｅｍ．２０：２８５（２００１）に記述されたように製造した。

ドナー１９（５．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）およびアクセプターＮ−９−フルオレニルメチルカルボニルアミノプロパノール（２．４１ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を一般的なグリコシル化手順に従って変換し、白色泡状物質であるＮ−９−フルオレニルメチルカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド２９を得た（４．０ｇ、６６．４％）。

化合物２９（４．０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を、２級アセテートの酸触媒脱アセチル化の一般的な手順（ｂ）に従って変換し、Ｎ−９−フルオレニルメチルカルボニルアミノプロピル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３０を、白色泡状物質として得た（３．３ｇ、８７．３％）。ドナー１８（３．２７ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）およびアクセプター３０（３．３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を、一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−９−フルオレニルメチルカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−［２−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジルマンノシル］−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３１を白色泡状物質として得た（４．９４ｇ、９２．７％）。

化合物３１（４．９４ｇ、３．９６ｍｍｏｌ）を、２級アセテートの酸触媒脱アセチル化の一般的な手順（ｂ）に従って変換し、Ｎ−９−フルオレニルメチルカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジルマンノシル］−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３２を白色泡状物質として得た（１．７３ｇ、３６％）。化合物１１を、実施例２の方法に従って製造した。ドナー１１（３．３７ｇ、３．７４ｍｍｏｌ）およびアクセプター３２（１．７３ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を、一般的なグリコシル化手順に従って変換し、白色泡状物質として３３を得た（１．２ｇ、４３．１％）。

無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の３３（１．２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、ドデシルチオ−ル（１．４８ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）およびジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）（０．０９３ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ）を加えた。約１８時間後、出発物質はｔｌｃに示されたように消費された。この溶液をシロップ状になるまで濃縮し、０〜２０％メタノール／ＤＣＭを用いて、シリカゲルフレッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物に、メタノール／水 １：１（２０ｍＬ）および酢酸（２５μＬ）を加え、Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）および水素のバルーンを取り付けた。１８時間後、この溶液をセライトでろ過し、白色泡状物質になるまで濃縮した。この泡状物質を乾燥メタノール（１０ｍＬ）、およびメタノール（０．１５ｍＬ）の２５％ｗ／ｖナトリウムメトキシドの溶液に溶解させ、６時間後、この溶液を濃縮して、水（１０ｍＬ）に入れ、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄した。水層を凍結乾燥して、アミノプロピル６−Ｏ−（［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−α−Ｄ−マンノシド３４を、二ナトリウム塩として得た（０．２７ｇ、３３から６３．５％）。

水／ＤＭＳＯ １：１溶液（１０ｍＬ）中の３４（０．１７ｇ、０．３ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−オキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（０．３４ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の溶液およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＨＢＴ）（０．０９ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。２４時間後、この溶液を，ｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂を用いて精製した。画分をシリカゲルプレート上で炭化させることで確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して固体を得た。ＴＦＡ／ＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解させ、６０分撹拌し、その後油状物になるまで濃縮した。水（５ｍＬ）を加え、生成物をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して３５を得た（０．０３３ｇ、３４から１６．４％）。

実施例４：四糖の合成
Ａ．アミノオキシアセトアミド１，５−ジ−３−アミドプロピル［２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−α−Ｄ−マンノシル］グルタミン酸（２８）

化合物１９を、実施例３に記述された方法に従って製造した。ドナー１９（１５．４９ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）およびアクセプターである３−Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノプロパノール（８．７ｇ、２９．１９ｍｍｏｌ）を、一般のグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノプロピル２−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシド２０を、白色泡状物質として得た（１０．５５ｇ、５５％）。

乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）および無水メタノール（１００ｍＬ）中の２０（１０．５ｇ、ｙｍｍｏｌ）の溶液に、約３０分の間、塩化アセチル（４．８ｍＬ、６３ｍｍｏｌ）を滴加し、２．３％ｗ／ｖＨＣｌのメタノール溶液を得た。約１８時間後、反応をヒューニッヒ塩基（９．８１ｍＬ、６３ｍｍｏｌ）で停止し、さらに１．５ｍＬ加えた。この溶液をシロップ状になるまで濃縮し、クロロホルム（２ｘ５０ｍＬ）と共に留去し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解させ、半飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶液を濃縮し、０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色泡状物質である、Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノプロピル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシド２１を得た（６．１１ｇ、６１．２％）。ドナー２１（６．１１ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）およびアクセプター１１（７．１ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノプロピル２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシド２２を白色泡状物質として得た（５．８ｇ、５０．１％）。

無水ＴＨＦ溶液（７５ｍＬ）中の２２（５．８ｇ、３．９６ｍｍｏｌ）に、ドデシルチオ−ル（９．５３ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（０．６ｍＬ、４ｍｍｏｌ）を加えた。約４時間後、反応をメタノール塩酸（５．６ｍＬ、８ｍｍｏｌ）で停止し、シロップ状になるまで濃縮した。生成物をジエチルエーテル中で粉砕し、３−アミノプロピル２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシド塩酸塩２３をゴム状物質（ｇｕｍ）として得た（３．７７ｇ、７４．５％）。

乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）中の２３（３．７７ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグルタミン酸（０．３６６１ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．４ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）、ＤＢＵ（４．６ｍＬ、４ｍｍｏｌ）、および１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）（０．７５ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）を加えた。１６時間後、ヒューニッヒ塩基（０．２５ｍＬ）を加え、続いてさらにＥＤＣ（０．７５ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）を加えた。２１時間後、この溶液をシロップ状になるまで濃縮し、０〜５０％ＤＣＭに対して、１０％２−プロパノール／ＤＣＭを用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ１，５−ジ−［３−アミドプロピル２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］グルタミン酸２４を白色泡状物質として得た（０．９７ｇ、１１．２％）。

無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）およびメタノール（２５ｍＬ）中の２４（０．９１２ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、２５％ｗ／ｖナトリウムメトキシドのメタノール（０．０９ｍＬ、０．４１ｍｍｏｌ）溶液を加えた。約６時間半後、反応を１Ｍ ＨＣｌ（０．４１ｍＬ、０．４１ｍｍｏｌ）で停止し、シロップ状になるまで濃縮し、０〜１００％ＤＣＭに対して１０％２−プロパノール／ＤＣＭを用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ１，５−ジ−３−アミノプロピル［２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］グルタミン酸２５を得た（０．３０６ｇ、４４．４％）。

ＴＨＦ／水 ２：１ ｖ／ｖ（７５ｍＬ）中の２５（０．３ｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１０％湿Ｐｄ／Ｃ（０．０５２ｇ）および水素バルーンを取り付けた。１６時間後、氷酢酸（２５μＬ）を加え、新鮮な水素バルーンを取り付けた。６時間後、さらに１０％Ｐｄ／Ｃ（０．０４ｇ）を追加し、さらに水素を追加した。１８時間後、新鮮な５％Ｐｄ／Ｃ（０．０５ｇ）を追加し、さらに水素を追加した。２４時間後、生成物を５％硫酸／ＥｔＯＨで炭化したが、ＵＶ活性はなかった。混合物を、セライトを通してろ過し、パッドを洗浄し、約３０％まで濃縮して、ＴＨＦを除去した。その後凍結乾燥して１，５−ジ−３−アミドプロピル［２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−α−Ｄ−マンノシル］グルタミン酸２６（０．１２１ｇ、７７．９％）を得た。

ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（０．１９ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＤＨＢＴ）（０．０５２ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液を、水／ＤＭＳＯ １：１（７．５ｍＬ）中の２６（０．１６ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。１８時間後、この溶液をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲル上で炭化させることにより画分を確認し、選択された画分をまとめ、凍結乾燥してＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセトアミド１，５−ジ−３−アミドプロピル［２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−α−Ｄ−マンノシル］グルタミン酸２７を得た（０．０９５ｇ、４２．１％）。化合物２７に、ＴＦＡ／ＤＣＭ １：１（８ｍＬ）を加え、混合物を溶解するまで（約６０分）撹拌し、その後油状物になるまで濃縮した。水（１０ｍＬ）を加えて、生成物をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して２８を得た（０．０４８ｇ、５４．２％）。

Ｂ．アミノオキシアセトアミドプロピル６−Ｏ−（［α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−α−Ｄ−マンノシド（４７）

化合物１１を実施例２に記述された通りに製造した。ドナー１１（５．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）およびアクセプターである３−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロパノール（１．９３ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）を実施例１の一般的なグリコシル化手順に従って変換し、白色泡状物質を得た。生成物を、１級アセテートを酸性触媒脱アセチル化する一般的な手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３６を白色泡状物質として得た。

ドナー１９（４．４７ｇ、６．６ｍｍｏｌ）およびアクセプター３６（３．６ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、実施例１の一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−（［６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３７を白色泡状物質として得た（３．８ｇ、６３．３％）。化合物３７（３．８ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）を、１級アセテートを酸触媒脱アセチル化する一般的な手順に従って変換して、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３８を白色泡状物質として得た（３．５ｇ、９５．３％）。

化合物１８を、Ｙａｍａｚａｋｉら，Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．２０１：３１（１９９０）に記述された方法に従って製造した。ドナー１８（２．４１ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）およびアクセプター３８（３．５ｇ、３ｍｍｏｌ）を、実施例１の一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−（［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［２−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド３９が油状物として得られた（５．６３ｇ）。化合物３９（５．８３ｇ）を、２級アセテート（実施例１を参照のこと）を酸触媒脱アセチル化する一般的な手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アミノプロピル６−Ｏ−（［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド４０を白色泡状物質として得た（２．０ｇ、３８から４１．９％）。ドナー１９（１．０７ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）およびアクセプター４１（２．０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、一般的なグリコシル化手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−（［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド４２を白色泡状物質として得た（１．４ｇ、５０．８％）。化合物４２（１．４ｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を、１級アセテートを酸触媒脱アセチル化する一般的な手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アミノプロピル６−Ｏ−（［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド４３を白色泡状物質として得た（１．０ｇ、８０％）。化合物４３（１．０ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を一般的なリン酸化手順に従って変換し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル６−Ｏ−（［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシド４４を白色泡状物質として得た（０．９ｇ、８０．７％）。

無水メタノール（２０ｍＬ）中の４４（０．９ｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）の溶液に、メタノール（０．０９ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）中の２５％ ｗ／ｖ ナトリウムメトキシドの溶液を加えた。約７時間後、反応を１Ｍ ＨＣｌ（０．５ｍＬ）、１０％のＰｄ／Ｃ（０．２ｇ）、および水（１０ｍＬ）で停止した。混合物を２４時間、水素バルーン下で保持した。この混合物をセライトでろ過し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で洗浄した。溶液を凍結乾燥して、白色固体であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−アミノプロピル６−Ｏ−（［α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジル−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−α―Ｄ−マンノシド４５を得た（０．２３ｇ、４４から７４．７％）。

ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（０．３７５ｇ，１．１４ｍｍｏｌ）の溶液およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のＤＨＢＴ（０．１ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を水／ＤＭＳＯ１：１（１０ｍＬ）中の４５（０．２３ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。２４時間後、溶液をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択された画分をまとめ、凍結乾燥した。生成物を、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（０．３７５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の溶液およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のＤＨＢＴ（０．１ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を用いて、水／ＤＭＳＯ １：１（１０ｍＬ）中で再アシル化した。２４時間後、この溶液をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製し、画分をまとめ、凍結乾燥して、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセトアミドプロピル６−Ｏ−（［α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−α−Ｄ−マンノシド４６を得た（０．１１ｇ、３７．５％）。化合物４６をＴＦＡ／ＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解させ、追加した。この溶液を６０分間撹拌し、その後油状物になるまで濃縮した。水（５ｍＬ）を加え、生成物をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択された画分をまとめ、凍結乾燥して、４７を得た（０．０７ｇ、７０．７％）。

実施例５：β−結合型六糖の合成
Ａ．メチルクロトニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド（５１）

２−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノースを、Ｍａｙｅｒら，Ｅｕｒ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１０：２５６３（１９９９）に記述の通りに製造した。メタノール（０．５ｍＬ）中の２５％ｗ／ｖナトリウムメトキシドを無水メタノール（５０ｍＬ）中の２−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノース（８．０ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。約２時間後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で示されたように、出発物質が消費された。この反応を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０（Ｈ＋）樹脂で停止し、ろ過し、シロップ状になるまで濃縮して、３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノース５０を得た（６．６７ｇ、９９％）。化合物５０にトルエン（１５０ｍＬ）、続いてジブチルスズオキシド（３．８８ｇ、１６．２８ｍｍｏｌ）を加え、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋコンデンサを用いながら混合物を還流下で３時間加熱した。得られた溶液を冷却し、シロップ状になるまで濃縮し、乾燥ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。フッ化セシウム（２．２８ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムヨージド（５．４７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）、および４−ブロモクロトン酸メチル（２．４６ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ、工業用グレード）を、混合物に加え、約６０℃で１８時間加熱した。混合物を放冷し、ろ過して固体を取り除いた。イソプロピルエーテル／ＥｔＯＡｃ ３．７：１（３８０ｍＬ）で希釈し、半飽和のチオ硫酸ナトリウム（２４０ｍＬ）で洗浄した。水相をイソプロピルエーテル／ＥｔＯＡｃ ３．７：１（２ｘ１９０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて濃縮した。シロップをイソプロパノール（２ｘ２５ｍＬ）と共に留去し、０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、５１をシロップ状として得た（４．５８ｇ、５６．４％）。１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）¹Ｊ_1C,1H（１００ＭＨｚ）、１５７Ｈｚ（β＜１６０Ｈｚ、α＞１７０Ｈｚ）

Ｂ．メチルブチリル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド（５２）
化合物５０を実施例２に記載の通りに製造した。化合物５０（９．４ｇ、２１ｍｍｏｌ）にトルエン（２００ｍＬ）、続いてジブチルスズオキシド（５．４９ｇ、２２ｍｍｏｌ）を添加し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋコンデンサを用いながら、混合物を還流下で２３時間加熱した。得られた溶液を冷却し、シロップ状になるまで濃縮し、乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。４−ブロモ酪酸メチル（４．２３ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムヨージド（１．９４ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）、フッ化セシウム（３．９１ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６０℃で２時間加熱し、その後１８時間常温とした。混合物を放冷し、セライトでろ過し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で洗浄した。ゴム状物質になるまで濃縮し、トルエン（３ｘ４０ｍＬ）と共に留去し、シリカに吸着させ、０〜７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、５２を油状物として得た（９．１１ｇ、７８．６％）。１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）¹Ｊ_1C,1H（１００ＭＨｚ）、１５７．２Ｈｚ（β＜１６０Ｈｚ、α＞１７０Ｈｚ）。α−結合の生成物は観察されなかった。

Ｃ．メチルブチリル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−β−Ｄ−マンノシド（５７）
化合物５２を実施例２に記述の通りに製造し、６−Ｏ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノーストリクロロアセトイミデート１９を、Ｈｅｎｇら，Ｊ．Ｃａｒｂ．Ｃｈｅｍ．２０：２８５（２００１）の方法に従って製造した。ドナー１９（４．２９ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）およびアクセプター５２（２．９ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、実施例１の一般的なグリコシル化手順に従って変換して、メチルブチリル２−Ｏ−［６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド５３を白色泡状物質として得た（４．４１ｇ、７８．５％）。化合物５３（４．４１ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を実施例１に記述された、１級アセテートを酸触媒脱アセチル化する一般的な手順に従って変換して、メチルブチリル２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド５４を白色泡状物質として得た（２．２５ｇ、５３．７％）。化合物５４（２．２５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を実施例１の一般的なリン酸化手順に従って変換して、メチルブチリル２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−６−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド５５を白色泡状物質として得た（２．２ｇ、７７．７％）。

５５を脱保護するため、メタノール（０．２ｍＬ）中の２５％ ｗ／ｖ ナトリウムメトキシドの溶液を、無水メタノール（２０ｍＬ）中の５５（２．２ｇ、１．７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。約２４時間後、出発物質が消費されたことをＴＬＣが示した。反応をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０（Ｈ＋）で停止し、シロップ状になるまで濃縮した。溶液を濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、メチルブチリル２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド５６を白色泡状物質として得た（１．１０ｇ、６７％）。

ＴＨＦ／水（２０ｍＬ）中の５６（１．１０ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、氷酢酸（２５μＬ）を加え、１０％湿Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）および水素バルーンを取り付けた。２４時間反応後、生成物を５％硫酸／ＥｔＯＨで炭化したが、ＵＶ下では見えなかった。混合物をセライトでろ過し、パッドを水（２０ｍＬ）で洗浄した。溶液を濃縮し、真空下で乾燥して、メチルブチリル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−β−Ｄ−マンノシド５７を得た（０．６ｇ、９８％）。

Ｄ．アミノオキシアセトアミドヒドラジドブチル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−β−Ｄ−マンノシド（６０）
ヒドラジン一水和物（０．４４ｍＬ、５．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）中の５７（０．６ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら加えた。３０分後、水（５ｍＬ）を加え、この溶液を１８時間撹拌した。さらにヒドラジン（０．４４ｍＬ、５．７５ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を１２０時間撹拌した。この溶液を約２５％の容積まで濃縮し、水（２ｘ１０ｍＬ）と共に留去し、生成物を凍結乾燥して、ヒドラジドブチル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−β−Ｄ−マンノシド５８を、オフ−ホワイトの固体として得た（０．６ｇ、９９％）。

ＤＭＳＯ／水 １：１（１０ｍＬ）中の５８（０．２ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（０．４９ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）の溶液およびＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のＤＨＢＴ（０．１２５ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１８時間後、この溶液をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−オキシアセトアミドヒドラジドブチル２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］−β−Ｄ−マンノシド５９をオフ−ホワイトの固体として得た（０．１ｇ、３７．８％）。化合物５９をＴＦＡ／ＤＣＭ１：１（８ｍＬ）に溶解させた。この溶液を約６０分間撹拌し、その後油状物になるまで濃縮した。水（１０ｍＬ）を加えて、生成物をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して、６０をオフ−ホワイトの固体として得た（０．０４５ｇ、５２．５％）。

Ｅ．メチルブチリル３−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−マンノシド（６４）の大規模合成
１００Ｌ ＣＨ₂Ｃｌ₂中の５０．０ｋｇ（１２８．０９ｍｏｌ）ｄ−マンノースペンタアセテートの溶液を２６．８ｋｇ（２４３．２ｍｏｌ、１．９０ｅｑ．）チオフェノールおよび２７．３ｋｇ（１９２．３ｍｏｌ、１．５０ｅｑ．）三フッ化ホウ素ジエチルエーテルで処理し、得られた溶液を２２℃で４０時間撹拌し、ＨＰＬＣ分析によって、反応が完了したことを判断した。その後１１５Ｌの５Ｎ ＮａＯＨ水を、撹拌した反応容器に注意深く入れ、分離した層および有機層を４６Ｌの５Ｎ ＮａＯＨでもう一度洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂を蒸留により減圧下で除去し、残渣を６０℃で１００ｋｇのイソプロパノールに再溶解させた。９℃まで冷却し、生成物Ｆ１が結晶化し、それをろ過して単離し、続いてイソプロパノールで洗浄して、３５．８ｋｇを得た（６３％）。

３５．８０ｋｇのＦ１（８８．２８ｍｏｌ）を、１４３ｋｇのＭｅＯＨに２２℃で懸濁し、０．７３ｋｇの、３０％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（４．０５ｍｏｌ、０．０４６ｅｑ．）で処理し、透明な溶液を得た。ＴＬＣ分析により、反応が完了したことを判断されたのち、０．４９ｋｇの酢酸（８．１４ｍｏｌ、０．０９ｅｑ．）を加え、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンに懸濁し、再び減圧下で濃縮し、最後にアセトンで処理し、生成物であるフェニル−α−Ｄ−チオマンノシドを結晶化した。ろ過後、洗浄および乾燥すると、１９．６５ｋｇの収量（８９％）で得られた。

ピリジン（４３．８ｋｇ）中のフェニル−α−Ｄ−チオマンノシド（１９．２５ｋｇ、７０．６９ｍｏｌ）の溶液をトルエン（８９ｋｇ）中のトリフェニルメチルクロリド（１９．７ｋｇ、７０．６６ｍｏｌ）の溶液に４０℃で加え、２２時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了したことが判断された後、溶媒を減圧下で取り除き、残渣をトルエンに溶解させ、再濃縮した。さらにトルエンで希釈した後、溶液を水で１度洗浄した。ヘキサン（８４０Ｌ）およびジイソプロピルエーテル（２５０Ｌ）の混合物にこのトルエン溶液を加えて、生成物を沈殿させ、ろ過および乾燥すると、フェニル６−Ｏ−トリチル−１−チオ−α−Ｄ−マンノシド６１が得られた（３２．３０ｋｇ、８９％）。

トルエン（５００ｋｇ）中の６１（３０．０ｋｇ、５８．２９ｍｏｌ）およびジブチルスズオキシド（２０．３ｋｇ、８１．５ｍｏｌ）の混合物を還流下で、２時間、濃縮した溶媒の蒸気から水が分離しなくなるまで加熱した。この溶液を４０℃に冷却し、ＤＭＦ（３４ｋｇ）を加えた。全溶媒のほぼ半分を減圧下で除去し、ＤＭＦ（２１６ｋｇ）を加え、この溶液をほぼ半分の容量になるまで再び濃縮した。さらにＤＭＦ（２５０ｋｇ）を加え、続いて、フッ化セシウム（８．９ｋｇ、５８．５９ｍｏｌ）、ＤＭＦ（６５ｋｇ）中のテトラブチルアンモニウムヨージド（２３．６ｋｇ、６３．８９ｍｏｌ）の溶液、およびアリルブロミド（２１．１ｋｇ、１７４．４ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を５０℃で１５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、反応が完了したことが判断された後、ろ過によって反応混合物から固体を取り除き、ろ液をジイソプロピルエーテル（１３６ｋｇ）および酢酸エチル（３０ｋｇ）の混合物、続いて、１０％ ｗ／ｗ チオ硫酸ナトリウム水溶液（３００ｋｇ）で処理した。相を分離した後、下相を４回ジイソプロピルエーテル（１３６ｋｇ）および酢酸エチル（３０ｋｇ）の混合物で再抽出し、まとめた上相を水（１５０ｋｇ）で３回洗浄した。上相を減圧下で濃縮し、残渣を７５℃でエタノール（１６０ｋｇ）に溶解させた。０℃に冷却すると、生成物は結晶化し、ろ過で単離することができた。フィルターの固形物を洗浄し、乾燥させた後、フェニル３−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−１−チオ−α−Ｄ−マンノシド６２を得た（１５ｋｇ、４６％）。

ＴＨＦ（６３ｋｇ）およびピリジン（１８ｋｇ、２２７．５ｍｏｌ）の混合物中の６２（１２．５ｋｇ、２２．５３ｍｏｌ）の溶液を、水（１０．７ｋｇ）中のトルエンスルホン酸一水和物（１６．７ｋｇ、８７．７９ｍｏｌ）で処理し、続いてＮ−クロロスクシンイミド（９．６ｋｇ、７１．８９ｍｏｌ）の水（１７ｋｇ）およびＴＨＦ（８３ｋｇ）の混合物溶液で、１５℃で処理した。得られた混合物を２２℃に温め、３時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、反応が完了したことが判断された後、水（１５ｋｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（４．６ｋｇ、２９．１１ｍｏｌ）の溶液を、反応混合物に加えた。相を分離し、上相を減圧下で濃縮し、残渣をトルエンに溶解させ、再び濃縮した。残渣を酢酸エチルに再溶解させ、水、その後１６％ ｗ／ｗ 塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。酢酸エチルを留去後、粗生成物を５２ｋｇ超のシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、３〜１０％ ｖ／ｖ 酢酸エチル／トルエンのグラジエントで溶出して、３−Ｏ−アリル−６−トリチル−α−Ｄ−マンノース６３を得た（７．７ｋｇ、７３％）。

メタノール（６１ｋｇ）中の６３（７．７ｋｇ、１６．６５ｍｏｌ）およびジブチルスズオキシド（４．５６ｋｇ、１８．３２ｍｏｌ）の混合物を、濁った溶液が得られるまで、還流下で加熱し、その後さらに１時間加熱した。この溶液を２５℃に冷却し、全溶媒のほぼ半分を減圧下で除去し、ＤＭＦ（３３ｋｇ）を加え、この溶液をほぼ半分の容量まで再び濃縮した。さらにＤＭＦ（１５ｋｇ）を加え、続いてフッ化セシウム（２．５３ｋｇ、１６．６５ｍｏｌ）、ＤＭＦ（１７ｋｇ）中のテトラブチルアンモニウムヨージド（６．１５ｋｇ、１６．６５ｍｏｌ）、および４−ブロモ酪酸メチル（４．５２ｋｇ、２４．９７ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８０℃で５時間撹拌した。固体を反応混合物からろ過で除去し、ろ液をジイソプロピルエーテル（４１ｋｇ）、酢酸エチル（１４ｋｇ）、１０％ ｗ／ｗ チオ硫酸ナトリウム水溶液（７７ｋｇ）の混合物で処理した。相の分離後、下相をジイソプロピルエーテル（４１ｋｇ）および酢酸エチル（５１ｋｇ）の混合物で再抽出し、まとめた上相を水（３９ｋｇ）で洗浄した。上相を減圧下で濃縮して、残渣をメタノール（３５ｋｇ）に溶解させた。

反応収率を改善するため、結合反応のプロセスを繰り返した。溶解した残渣を再び減圧下で濃縮し、その後メタノール（１２２ｋｇ）で希釈した。メタノール（６０Ｌ）を再び留去し、得られた溶液をジブチルスズオキシド（２．２８ｋｇ、９．１６ｍｏｌ）で処理し、混合物を２時間、還流下で加熱した。溶液を２９℃に冷却し、全溶媒のほぼ半分を減圧下で留去し、ＤＭＦ（３７ｋｇ）を加えて、溶液を再び容量のおよそ半分まで濃縮した。さらにＤＭＦ（１５ｋｇ）を加え、続いてフッ化セシウム（１．２６ｋｇ、８．２９ｍｏｌ）、ＤＭＦ（１７ｋｇ）中のテトラブチルアンモニウムヨージド（３．７ｋｇ、１０．０２ｍｏｌ）の溶液、および４−ブロモ酪酸メチル（３．０６ｋｇ、１６．９０ｍｏｌ）を加えて、得られた混合物を８０℃で２時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了したことを判断した後、固体をろ過によって反応混合物から除去し、ろ液をジイソプロピルエーテル（２５ｋｇ）、酢酸エチル（３２ｋｇ）、および１０％ ｗ／ｗ チオ硫酸ナトリウム水溶液（７７ｋｇ）の混合物で処理した。相の分離後、下相をジイソプロピルエーテル（２５ｋｇ）および酢酸エチル（３２ｋｇ）の混合物で再抽出し、まとめた上相を水（３９ｋｇ）で洗浄した。溶液を減圧下で濃縮し、残渣をトルエン（４３ｋｇ）に再溶解し、最終的にほぼ３０Ｌの容量まで濃縮した。その後、６４の粗メチルエステルを、５０ｋｇのシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、５〜３０％ ｖ／ｖ 酢酸エチル／トルエンのグラジエントで溶出した。

精製したメチルエステルのメタノール溶液（５０ｋｇ）を、３０％ ｗ／ｗ 水酸化ナトリウム水溶液（３．２９ｋｇ）およびメタノール（７．７ｋｇ）の混合物で処理し、得られた溶液を１４時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、反応が完了していることを判断し、反応混合物をジイソプロピルエーテル（４１ｋｇ）および酢酸エチル（１４ｋｇ）の混合物、続いて水（７７ｋｇ）で処理した。二相混合物を１．２μｍのフィルターカートリッジに通し、相を分離した。下相をジイソプロピルエーテル（４１ｋｇ）および酢酸エチル（１４ｋｇ）の混合物で処理し、下相のｐＨを、５％ ｗ／ｗ クエン酸水溶液（３８Ｌ）を添加して４．５〜５まで下げた。相を分離し、下相をジイソプロピルエーテル（４１ｋｇ）および酢酸エチル（１４ｋｇ）の混合物で抽出した。まとめた上相を水（３９ｋｇ）で洗浄し、その後減圧下で濃縮した。残渣をジイソプロピルエーテル（３９ｋｇ）と混合し、溶媒を部分的に濃縮して、約２０Ｌの最終容量が得られ、生成物を結晶化し、ろ過により単離することができた。フィルターの固形物を洗浄し、乾燥した後、（３−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−マンノシル）−４−ブタン酸６４が得られた（４．７ｋｇ、５１．５％）。

Ｆ．四糖中間体（６９）の大規模合成
化合物６４をパートＥの方法に従って製造した。６４の保護基をさらなるグリコシル化反応の前に修飾した。ＴＨＦ（１４ｋｇ）中の６４（４．２５ｋｇ、７．７５ｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（４５ｋｇ）中の６０％水素化ナトリウム分散体（１．５５ｋｇ、３８．７５ｍｏｌ）の撹拌スラリーに注意深く加え、得られた懸濁液を水素が発生しなくなるまで撹拌した。ＴＨＦ（２ｋｇ）中のテトラブチルアンモニウムヨージド（０．２９ｇ、０．７８ｍｏｌ）の懸濁液、続いてベンジルブロミド（９．２ｋｇ、５３．７９ｍｏｌ）を、反応容器に入れた。混合物を２２℃で４６時間撹拌し、その後３０℃、１２時間、および３５℃、４８時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了したことを確認した後、混合物を０℃に冷却し、無水メタノール（０．７ｋｇ、２１．８７ｍｏｌ）、続いて３０％ ｗ／ｗの、ナトリウムメトキシド（２．１ｋｇ、１１．６６ｍｏｌ）のメタノール溶液を注意深く入れた。その後、酢酸（１．４ｋｇ）、続いてトリエチルアミン（９．４ｋｇ、９２．８９ｍｏｌ）を加え、混合物を１８時間撹拌した。得られた懸濁液に、水（３１ｋｇ）を加え、２相に分離した。上相を減圧下で濃縮し、残渣をトルエンに溶かし、再び最終容量が約２０Ｌになるまで濃縮した。粗生成物を４２ｋｇのシリカゲルでカラムクロマトグラフィーにより精製し、５〜１５％の酢酸エチル／ヘキサンのグラジエントで溶出して、メチルブチリル３−Ｏ−アリル−２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−マンノシド６５を、酢酸エチル溶液として得た（４．４ｋｇ、７７％）。

３７℃のメタノール（１９ｋｇ）中の６５（４．４ｋｇ、５．９２ｍｏｌ）の溶液に、メタノール（６．３ｋｇ）中のトルエンスルホン酸一水和物（０．９ｋｇ、４．７３ｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、反応が完了したことを判断した後、トリエチルアミン（１．５ｋｇ、１４．８２ｍｏｌ）を入れ、この溶液を減圧下で濃縮した。その後、トルエン（２８ｋｇ）を加え、溶液を水（３２ｋｇ）で洗浄した。相を分離し、上相を減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル（３２ｋｇ）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで、９％、その後１７％、その後５０％ ｖ／ｖ 酢酸エチル／トルエンのグラジエントで溶出させて精製し、メチルブチリル３−Ｏ−アリル−２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド６６を、トルエン溶液として得た（２．６７ｋｇ、９０％）。

３．７３ｋｇ（５．４９ｍｏｌ、１．１０ｅｑ．）の１９および２．５０ｋｇ（４．９９ｍｏｌ）の６６を３４ｋｇの乾燥トルエンに溶解させた。そのうち、約１０Ｌを減圧下留去した。その後、溶液を０℃に冷却し、反応温度を＜５℃に維持しつつ、２２ｇ（０．０９９ｍｏｌ、０．０２ｅｑ．）のＴＭＳＯＴｆを滴加処理した。添加終了後、０℃で１時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了したことを判断した後、混合物に３０ｇ（０．２９６ｍｏｌ、０．０６ｅｑ．）のＥｔ₃Ｎを加えて中和した。ヘキサン（２２Ｌ）を追加し、得られた懸濁液をろ過し、ろ液を３３Ｌの水で洗浄し、減圧下で濃縮した。この残渣を１０Ｌのトルエンに溶解させ、再度濃縮した。このプロセスを２回以上繰り返した。粗生成物のカラムクロマトグラフィー精製は、５０ｋｇシリカゲルで行い、９〜１３％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：トルエン１：１のグラジエントで溶出して、４．２３ｋｇ、８３％である化合物６７を、トルエン溶液として得た。

４．２３ｋｇ（４．１６ｍｏｌ）の６７の、５．６ＬのＣＨ₂Ｃｌ₂および４０ＬのＭｅＯＨ溶液に、０．７２ｋｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加え、続いて０．１２ｋｇ（０．６３ｍｍｏｌ、０．１５ｅｑ．）のトルエンスルホン酸一水和物溶液を加え、混合物を２２℃で２４時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了したことを判断した後、パラジウム／炭素をろ過により除去し、さらに精製することなく、ろ液を次の工程で使用した。

ろ液に４Ｌ ＭｅＯＨ中の２．９７ｋｇ（１５．６ｍｏｌ、３．７５ｅｑ．）トルエンスルホン酸の溶液を加え、得られた混合物を１６時間、２２℃で撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、反応が完了したことを判断した後、混合物を０℃に冷却し、１．６４ｋｇ（１６．２ｍｏｌ、３．８９ｅｑ．）のトリエチルアミンを加えて中和した。この溶液を減圧下で濃縮し、残渣を８２ＬのＭＴＢＥおよび３２Ｌの水に分配した。有機相を減圧下で濃縮し、１０Ｌのトルエンで希釈し、再濃縮した。この手順を２回以上繰り返した。粗生成物のカラムクロマトグラフィー精製を、３８ｋｇシリカゲルで行い、２３〜２６％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：トルエン１：１のグラジエントで溶出して、２．５９ｋｇの化合物６８をトルエン溶液として得た。（６７から６７％）。

２．９０ｋｇ（３．１０ｍｏｌ）の６８および５．２４ｋｇ（８．２３ｍｏｌ、２．６５ｅｑ．）の１８の、３０ｋｇ乾燥トルエン溶液を、０℃で、０．０４９ｋｇ（０．１８５ｍｏｌ、０．０６ｅｑ．）のＴＢＤＭＳＯＴｆで処理し、０℃で４時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了していることを判断した後、０．１０４ｋｇ（１．０３ｍｏｌ、０．１２８ｅｑ．）のトリエチルアミン、続いて３３Ｌのヘキサンを加えた。得られた懸濁液をろ過し、ろ液を２８Ｌの水、その後２８Ｌの５％Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液で洗浄した。トルエン相を減圧下で濃縮し、粗生成物を５８ｋｇシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製し、９〜２０％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：トルエン１：１のグラジエントで溶出して、４．４０ｋｇの四糖中間体６９をトルエン溶液として得た（７５％）。

Ｇ．保護六糖（７３）の合成
四糖中間体６９を、実施例７に記述された方法に従って製造した。９．７ｇ（５．１５ｍｍｏｌ）の６９の、６０ｍｌ ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液に、１００ｍｌのＭｅＯＨを加え、続いて、混合物の温度を３０℃未満に抑えながら、５．７Ｎ ＨＣｌの１，４−ジオキサン溶液を２７ｍｌ（０．１５４ｍｏｌ、３０ｅｑ．）滴加した。その後、反応混合物を２２℃で４０時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により反応が完了したことを判断した後、混合物の温度が２５℃未満に維持されるように、３２ｍｌ（２２．９ｍｍｏｌ、４４．７ｅｑ．）のトリエチルアミンを慎重に加えた。水（２５０ｍｌ）およびトルエン（２００ｍｌ）を加え、混合物を振とうし、相を分離した。下相を５０ｍｌトルエンで再抽出し、まとめた上相を５０ｍｌの水で洗浄し、減圧下で濃縮した。粗生成物を１００ｇのシリカゲルを用いてカラムクロマトグラフィー精製し、３０〜５０％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンのグラジエントで溶出して、メチルブチリル３−Ｏ−（［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］）−（６−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノシド７０を得た（６．３５ｇ、６９％）。

１．０ｇ（０．５６ｍｍｏｌ）の７０および０．９５ｇ（１．４０ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ．）の１９の、９ｍｌ乾燥トルエン溶液を、０℃で、０．０２ｇ（０．０７５ｍｍｏｌ、０．１４ｅｑ．）のＴＢＤＭＳＯＴｆで処理し、０℃で１時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析で反応が完了したことを判断した後、２２ｍｌ（０．１５８ｍｍｏｌ、０．２８ｅｑ．）のトリエチルアミンを加えた。得られた混合物を、１０ｍｌの水で２度洗浄し、減圧下で濃縮した。１５ｇシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより、粗生成物の精製を行い、１５〜２５％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：トルエン １：１のグラジエントで溶出して、１．７５ｇの化合物メチルブチリル３−Ｏ−（［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−（６−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−アセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノシド７１を、残留トルエンを含む油状物として得た。

１０．０ｇ（３．５ｍｍｏｌ）の７１の、４０ｍＬ １，４−ジオキサン溶液を、６０ｍｌのＭｅＯＨで処理し、その後３．２５ｇ（１４．０ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）の（＋）−カンファースルホン酸で処理し、得られた溶液を１００時間、２２℃で撹拌した。反応の終了をＨＰＬＣ分析で判断した後、３ｍｌ（２１．５ｍｍｏｌ、６．２ｅｑ．）のトリエチルアミンを加え、溶媒を減圧下で除去した。残渣を２００ｍｌのＭＴＢＥに溶解させ、２００ｍｌのＨ₂Ｏと共に振とうした。相を分離し、上相を減圧下で濃縮した。粗生成物のクロマトグラフィー精製は、１１４ｇのシリカゲルを用い、１４〜２５％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／トルエンのグラジエントで溶出して、８．２４ｇのメチルブチリル３−Ｏ−（［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−（６−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノシド７２を、残留トルエンを含む油状物として得た。

０．９６５ｇ（０．３５ｍｍｏｌ）の７２の、４ｇ乾燥アセトニトリル溶液に、０．０８３ｇ（０．７０ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）の４，５−ジシアノイミダゾールを加え、続いて０．３１５ｇ（０．９１ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ．）のジベンジルジイソプロピルホスホルアミダイトを加え、混合物を２３℃で１時間撹拌した。反応の終了をＴＬＣ分析で判断した後、０．５ｍｌの水を加え、この溶液を１５分撹拌した。水（９．５ｍｌ）および１０ｍｌのＭＴＢＥを加え、得られた混合物を振とうし、相を分離し、下相を１０ｍｌのＭＴＢＥと振とうした。上相をまとめて、減圧下で濃縮して、無色の油状物を得た。この残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、−２０℃に冷却し、０．２４７ｇ（１．１３ｍｍｏｌ、３．２ｅｑ．）の７０％ ３−クロロ過安息香酸で処理した。ＴＬＣ分析で反応の終了を判断した後、１０ｍｌの１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、混合物を２３℃まで昇温した。下相を分離し、１０ｍｌの水と振とうし、減圧下で濃縮した。粗生成物を１９ｇのシリカゲルでカラムクロマトグラフィーにより精製し、２５〜５０％ ｖ／ｖ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンのグラジエントで溶出して、０．８３ｇ（７２％）のメチルブチリル３−Ｏ−（［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−（６−Ｏ−［２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ジベンジルホスホリル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−マンノシル］）−２，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノシド７３を、無色の油状物として得た。

Ｈ． アミノオキシアセトアミドヒドラジド ３−Ｏ−（［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−（６−Ｏ−［α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−β−Ｄ−マンノシド（７７）の合成
化合物７３を、実施例８に記述された方法に従って製造した。氷酢酸（１００μＬ）をメタノール／ＴＨＦ １：１（６００ｍＬ）中の７３（６４ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）に加え、生成物をＨ−ｃｕｂｅ（登録商標）を用いて、２０％Ｐｄ（ＯＨ）₂／Ｃを使用し、５０℃、Ｈ₂圧５０ｂａｒ、および流速６ｍＬ／分で触媒上を再循環させて水素化した。２０時間後に反応の完了をＴＬＣで確認し、この溶液を濃縮して、７４を泡状物質として得た（３９．８８ｇ、９３％）。

メタノール（１８０ｍＬ）を７４（３３．８ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）に、溶解するまで撹拌しながら加え、この溶液を氷／水槽で１５分間冷却した。この溶液に６４％ヒドラジン一水和物（９４ｍｌ、１．２４ｍｏｌ）を、撹拌しながら加えた。３０分後、水（１２０ｍＬ）を加え、この溶液を室温になるまで放置し、１８時間保存した。この溶液を約１００ｍＬまで濃縮し、水と共に留去し（２ｘ１００ｍＬ）、最終溶液を水で約１８０ｍＬに調節した。この溶液をＤＣＭ（２ｘ１００ｍＬ）で抽出し、その後３分割した６０ｍＬをｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除カラムで分離した。もっとも純粋な物質を含む画分をまとめ、凍結乾燥して、７５を得た（１５．５ｇ、８０％）。

ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）を水（３０ｍＬ）中の７５（２．５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）にゆっくり加え、その後ＤＭＳＯ（６ｍＬ）中のＮ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチル２，３，５，６−テトラフルオロフェニレート（２．５８ｇ、７．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（４ｍＬ）中のＤＨＢＴ（０．６５ｇ、４ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、溶液をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセトアミドヒドラジドブチリル３−Ｏ−（［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−（６−Ｏ−［α−Ｄ−マンノシル］−６−Ｏ−［α−Ｄ−マンノシル］−２−Ｏ−［６−Ｏ−ホスホリル−α−Ｄ−マンノシル］）−β−Ｄ−マンノシド７６（２．５７ｇ、９０％）を得た。ＤＣＭ（３０ｍＬ）、次にＴＦＡ（１６ｍＬ）を化合物７６（２．５７ｇ、１．８ｍｍｏｌ）に加えた。混合物が溶解するまで（約６０分）撹拌し、その後油状物になるまで濃縮した。水（２０ｍＬ）を加え、生成物をｓｅｐｈａｄｅｘサイズ排除樹脂で精製した。シリカゲルプレート上で炭化させることにより画分を確認し、選択した画分をまとめ、凍結乾燥して、７７を得た（１．６ｇ、６７．１％）。

実施例６：ジスルフィドリンカーを有する六糖の合成
Ａ．遊離酸形態の六糖の製造
無水ＭｅＯＨを化合物７３に加え、続いてＮａＯＭｅを加え、４〜１８時間インキュベートした。反応を氷酢酸で停止し、この溶液をシロップ状になるまで濃縮して、７８を得た。

化合物７８をＴＨＦ／メタノール１：１に溶解し、Ｐｄ／Ｃ−Ｈ₂で水素化した。溶液を固体になるまで濃縮し、水に溶解させ、ＮａＯＨ水溶液でけん化した。ｐＨを約４に調整し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０で精製して、遊離酸８１を得た。

Ｂ．ジスルフィドリンカーの結合
異なる方法で製造された（Ｂｉｏｍｉｒａから入手された）化合物８１の粗画分を、過剰なトリエチルアミン（ＴＥＡ）と混合することで、ＴＥＡ塩に変換し、続いて、移動相として３０％アセトニトリル、０．１％ジカルボン酸ＴＥＡを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア）でクロマトグラフィーを行った。まとめた画分を凍結乾燥し、グリカン：ＮＥＡ：ＥＤＡＣ：ＮＨＳ：ＨＯＢｔ：ＴＥＡ（１：１：１．５：１：１：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）を含む反応中で、ＮＥＡと結合させ、軽く撹拌しながら一晩インキュベートした。一部の生成物（０．５ｍｇ）を、前回のようにＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅでクロマトグラフィーを行い、凍結乾燥して８２を得た（０．２８ｍｇ）。

実施例７：α−グルコシダーゼ複合体の合成および酸化の最適化
Ａ．複合体化
オリゴ糖を組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）と結合させて、ＮｅｏＧＡＡを形成した。主にｒ＾ｈＧＡＡのシアル酸残基を介して結合したオリゴ糖との複合体を「ＳＡＭ」とし、ガラクトース残基を介して結合したものを「ＧＡＭ」とする。

ＮｅｏＧＡＡβＳＡＭ６を、Ｚｈｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３８９（Ｐｔ３）：６１９−６２８（２００５）に記述されたように、基本的に製造した。この実験で使用するｒｈＧＡＡのサンプルを、タンパク質１モルにつき、シアル酸を約５．２モル有するように、単糖組成物分析により見出した。簡潔に述べると、５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＡＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）を１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．６ｄｅ緩衝液交換し、その後過ヨウ素酸ナトリウム（２、７．５、または２２．５ｍＭ）と、氷上で、遮光で３０分反応させた。反応を２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように、グリセロールを添加することで停止した。酸化反応から小さい分子量の副生物を取り除くため、酸化ｒｈＧＡＡを緩衝液交換し、化合物７７（図９に示されるように、タンパク質に対して０〜１２０倍のモル比）と３７℃で６時間複合体化させた。すべての複合体を２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．２５に緩衝液交換した。これは２％のマンニトールおよび０．００５％のＴｗｅｅｎ−８０を含む。

類似のＮｅｏＧＡＡ複合体を、ＳＡＭ２（化合物１７、実施例２）、ＳＡＭ３（化合物３５、実施例３）、ＳＡＭ４（化合物２８、実施例４Ａ）、直鎖ＳＡＭ４（化合物４７、実施例４Ｂ）、およびαＳＡＭ６（オリゴ糖１０３）を用いて、７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩を使用し、オリゴ糖とｒｈＧＡＡのモル比を変えることで製造した。

別の複合体化方法も実施した。具体的には、アミノキシ、ヒドラジドまたはチオ−ル反応性リンカーのいずれかを有する六糖を、Ｃｙｓ３７４、リシン、シアル酸、またはガラクトース残基を介して、ｒｈＧＡＡに結合させた。

ｒｈＧＡＡのリシン残基を４−ホルミル安息香酸スクシンイミジル（ＳＦＢ；Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｃｏｒｐ．）で修飾し、続いてオリゴ糖と複合体化させることにより、リシンの複合体化を実施した。簡潔に述べれば、ｒｈＧＡＡをまず、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２に緩衝液交換した。その後、ＳＦＢとＧＡＡとのモル比を２０：１として新たに製造された（ＳＦＢ）で、緩衝化されたｒｈＧＡＡを処理した。当該混合物を室温で３０分インキュベートし、それを１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．５に緩衝液交換し、室温、２時間でヒドラジド六糖へと複合体化させたか、またはＳＦＢで修飾されたＧＡＡを、１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．６に緩衝液交換し、３７℃、６時間で、アミノキシ六糖へ複合体化させた。

システイン系の複合体化を、チオール反応性ＮＥＡ−六糖８２（実施例６Ｉ）と反応させることで実施した。ＮＥＡ−修飾された六糖８２を、水中で再構成し、５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭヒドロキシアミンｐＨ７．２中で、２時間２５℃で、ｒｈＧＡＡと（ｒｈＧＡＡに対するネオグリカンのモル比１５：１）インキュベートした。５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ４．１で、ｐＨを６．２に調整し、インキュベーションを一晩続けた。生成物を２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．２に対する遠心ダイアフィルトレーション（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製した。１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ未満のＭ６Ｐが導入された。

Ｃｙｓ３７４を介する直接的な複合体化は成功しなかったが、ホモ二官能基性のチオ−ル特異的試薬である、１９．９Åのスペーサーアームを有する１，４−ジ−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）が試験され、オリゴ糖との複合体化の前に、溶媒接近がより可能な３７４位のチオ−ル基を提供した。６０倍モル過剰のＤＰＤＰＢを、共溶媒として１０％ＤＭＳＯまたは１０％プロパノールのいずれかの存在下で、ｒｈＧＡＡと反応させた。これは、光散乱によって検出されるように、強い凝集を引き起こした。２０％アセトニトリルの存在下での反応はまた、凝集を示したが、反応混合物の限外ろ過液の３４４ｎｍにおける吸光度は、システインの定量的修飾と一致した。１０％までのアセトニトリル濃度の減少は、凝集量を減少させたが、修飾の程度は低かった。

別のチオ−ルに基づいた方法を、リシン残基のチオ−ル基の導入により実施した。４時間２５℃、リン酸ナトリウムｐＨ６．２中で１００倍モル過剰のＳＡＴＡ−ｄＰＥＧ４−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）と酵素反応させることにより、リシン残基に保護チオ−ルが導入された。そしてそれを、同じ緩衝液に対する一晩の透析により精製した。次に、精製された生成物を、システインを基にした複合体に関して、上記で記述された条件下で、ＮＥＡ−オリゴ糖８２と反応させて、リシン−チオ−ル複合体を得た。これは、Ｍａｎ−６Ｐ含有量の約１０倍の増加を示した（約５個のグリカンが複合体化された）。

ヒドラジドとのリシン複合体の安定性は、無傷のタンパク分子量およびＭ６Ｐ含有量を測定することで、３７℃、１４日まで評価された。５０％を超えるネオグリカンが１４日間で消失したように、この複合体は安定ではない。リシンを介したアミノキシ複合体を、上記のように、ｒｈＧＡＡに対して０、１６．６、２５、３３および４０モル過剰の六糖を用いて製造した。全リシンの約３１％だけが複合体化（または５個のネオグリカンが複合体化）されたが、当該複合体化は、１６．６倍モル過剰で飽和した。高い凝集レベルが、数種の調製物においても観察された。ＰＥＧ化されたＳＦＢを試験したが、凝集の減少は見られなかった。

２％マンニトールおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２５中で、３７℃で６時間、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のシアリダーゼ２０ｍＵ／ｍｇで、ｒｈＧＡＡをまず前処理することにより、ガラクトース複合体化（ＧＡＭ）を実施した。ジシアリル化後、タンパク質を同一緩衝液中、３７℃で一晩、１〜１０μｇ／ｍｇのガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）および２Ｕ／ｍｇのカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。その後、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ（陰イオン交換）クロマトグラフィーを用いて再精製して、ノイラミニダーゼおよびカタラーゼを除去した。両方の酵素で処理した生成物を、等量のｄＨ₂Ｏで希釈し、その後、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．９で事前に平衡状態にあるＰｏｒｏｓ５０Ｄカラムにアプライした。カラムを１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄し、ｒｈＧＡＡを１５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０で溶出させ、そして３７℃で６時間、様々なモル比でアミノキシ六糖と複合体化させた。

ＧＡＭ複合体化は、ＧＡＡに対して１６．６倍モル過剰の六糖で飽和し、約６〜７個のグリカンが複合体化された。凝集レベルは低かった。脱シアリル化の後、シアル酸は検出されなかった。一方、ガラクトースオキシダーゼ処理後にガラクトースもほとんど検出されなかった。いくつかの実例において、２０〜３０％のガラクトース残基が過剰酸化され、オリゴ糖に結合していないガラクツロン酸を生成した。ＧＡＯを滴定すると、１μｇ／ｍｇ超でＧＡＯはグリカン複合体を減少させることを示した。ＧＡＯが２μｇ／ｍｇＧＡＯより多いと、ガラクツロン酸の過剰酸化産物量の明らかな増加がみられた。複合体の最大量は、ｒｈＧＡＡ１ｍｇにつき、１〜２μｇＧＡＯで実現した（図１０Ｅ−ＧＡＯの滴定後における、ＧＡＭ複合体の、Ｍａｎ−６Ｐ、Ｇａｌ、ＧａｌＡを含む単糖の含有量）。ＧＡＡ １ｍｇにつき、ＧＡＯを０．５〜２μｇ使用すると、多くの複合体化が、タンパクのＭａｎ−６Ｐ含有量として観察された。より少ないまたはより多くのＧＡＯを使用すると、より少ないガラクトース、またはより多いＧａｌＡのいずれかが生じた。

ＮｅｏＧＡＡに複合体化したビス−Ｍ６Ｐ六糖グリカンの量を、Ｍ６Ｐ含有量分析およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより定量した。Ｍ６Ｐの定量に関して、サンプルをＡｍｉｃｏｎ４、５０，０００ＭＷＣＯ遠心式フィルターユニットを用いて、５回ろ過を行って、緩衝液交換し、潜在的に過剰のグリカンを除去した。各８０マイクログラムのｒｈＧＡＡまたはＮｅｏＧＡＡサンプルを、６．７５ＭのＴＦＡで１時間半、１００℃で加水分解した。サンプルを冷却し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥させ、２００μＬの蒸留水で再構成した。再構成したサンプルを再び、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥させ、２００μＬの５０ｍＭクエン酸ｐＨ２．０で再構成した。サンプルをＳ Ｍｉｎｉ Ｈカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過し、これをクエン酸ナトリウムｐＨ２．０で平衡化して、加水分解物から不純物を除去した。リボース−５−リン酸を、内部標準として、すべてのサンプルおよび標準に追加した。５０μＬの加水分解物をＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣに注入し、パルスアンペロメトリック検出機付き高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）によって分析した。加水分解した標準のＭ６Ｐで構築した、検量線を用いて定量を行った。その後、複合体化の程度を、グリカン１モルあたり、Ｍ６Ｐ ２モルの公知のモル比を基に計算した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を、直列モードでＶｏｙａｇｅｒＤＥ−ＰＲＯ質量分析計を用いて実施した。０．１％ギ酸水溶液に１：５で希釈し、すべてのサンプルおよび標準で実施し、続いて飽和シナピン酸の５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液に１：１で希釈して行った。この混合物の１μＬを標的に利用した。サンプル、レファレンス、ＢＳＡ補正コントロールの３通りで分析した。二点校正を（Ｍ＋Ｈ）＋およびＢＳＡの二量体イオンを用いて行った。各ＮｅｏＧＡＡサンプルの複合体化の程度は、測定されたグリカン分子量が１３２３ｇ／モルであることを考慮して、サンプルおよび酸化ｒｈＧＡＡコントロール（グリカンは追加されていない）間の分子量の違いを基に計算した。

図９Ａは、上記の二糖、三糖、四糖、および六糖複合体を用いた実験の結果を示す。

図９Ｂは、異なる量の過ヨウ素酸塩で製造されたβＳＡＭ６複合体の結果を提供する。複合体化反応の飽和を実現するのに必要なオリゴ糖レベルは、酸化工程中に使用される過ヨウ素酸塩の量に比例した（図９Ｂ、上のパネル）。２ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて、シアル酸約５．２モルを有するｒｈＧＡＡのサンプルは、タンパク質に対してほぼ２５倍モル過剰の六糖で（シアル酸に対して４．８倍モル過剰で）飽和に達した。７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩を用いて、グリカンの３３倍モル過剰で飽和に達した。グリカンの１２０倍モル過剰では、飽和に達したが、２２．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で酸化したｒｈＧＡＡでは実現しなかった。実現した複合体化の最大レベルは、異なるレベルの過ヨウ素酸塩で製造したサンプルでも異なった。７．５および２２．５ｍＭの過ヨウ素酸塩を用いて、タンパク質１モルにつき、それぞれ約８．５および１０．５モルのグリカンが組み込まれた。２ｍＭ過ヨウ素酸塩での酸化の後、実現可能な複合体化レベルは、タンパク質１モルにつき約５モルのグリカンであり、これは出発物質中のシアル酸残基の数に近い。

グリカンの滴定実験を、タンパク質１モルにつき、最初のシアル酸レベルが約７．２モルであるｒｈＧＡＡを用いて、２ｍＭ過ヨウ素酸塩で繰り返した（図９Ｂ、下のパネル）。タンパク質１モルにつき、約７モルのグリカンの複合体化レベルは、タンパク質に対して３３倍モル過剰以上のグリカンで達成された（シアル酸と比較して、約４．６倍モル過剰）。

Ｂ．凝集の減少
特定の複合体化方法は、タンパク質の凝集を引き起こす。ｎｅｏＧＡＡにおいて、凝集を減少させるための２つの方法が開発された。１）様々なＨＩＣクロマトグラフィー担体を用いた、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、および２）金属キレート化である。

ＮｅｏＧＡＡの３ｇのバッチを調製し、凝集除去に関して、ＨＩＣおよび銅カラムを評価するために使用した。フロースルーモードで評価したＨＩＣカラムは：Ｂｕｔｙｌ６５０Ｃおよび６５０Ｍ、Ｈｅｘｙｌ６５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ６ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、及びＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌであった。ＨｅｘｙｌおよびＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌで、８７．５％および９０．４％の回収率、並びにそれぞれ３．２％（初期レベル）から１．４％、および３．９％（初期レベル）から１．６％までの凝集減少という同等の結果を示した。表２を参照のこと。

銅キレートカラム（ＧＥまたはＴｏｓｏｈ）の操作条件も、フロースルーまたは結合−溶出モードのどちらかで確立した。銅を充填した７ｍｌの金属キレートＦＦカラム（Ｉ．Ｄ．、７ｍｌ）にまず、１０ｍｇ／ｍｌの複合体化したＧＡＡをロードして、結合・溶出モードで評価した。室温で、溶出緩衝液として１７５ｍＭグリシン、１００ｍＭ酢酸、ｐＨ５．５でカラムから溶出されたとき、８７％のＮｅｏＧＡＡが回収され、凝集体は１．２％であった。満足な回収率でカラムから溶出されるために、８℃にて１７５ｍＭより高いグリシンが必要であった。フロースルーモードにおいては（表３）、溶出緩衝液として、１５０ｍＭグリシン、１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５を用いて、９２％の優れた回収率が実現され、凝集体は３．２から１．２％に減少した。

イミダゾール（７．５、８および１０ｍＭ）も、金属キレート６ＦＦカラムの溶出緩衝液として試された。カラムを溶出するためには、イミダゾールが約８ｍＭ必要であった。イミダゾールはカラムから銅を溶出しないため、カラムをコンディショニングする、またはカラムの上方にＥＤＴＡで空きスペースを作る必要がなかった。ＮｅｏＧＡＡ １ｍｌにつき１５ｍｇのカラム容量を達成した。

銅を充填したＴｏｓｏＡＦ−キレート６５０Ｍカラムも評価した。結合・溶出モードにおいて、１５ｍｇ／ｍｌのカラム容量が達成され、８ｍＭのグリシンを用いて、９４．１％の溶出および１．２％の凝集体であった。フロースルーモードにおいて、３３．６ｍｇ／ｍｌの容量を実現した。この溶出緩衝液において、５０ｍＭのグリシンで９０．６％の回収率、１．２％の凝集体であった。

Ｃ．オリゴ糖の分析
これらの実験によれば、＞２ｍＭの過ヨウ素酸塩の使用で、タンパク質中の出発時レベルのシアル酸レベルを超えたＮｅｏＧＡＡグリカンの取り込みが起こり、これは非シアル酸部分が酸化されたことを示す。過ヨウ素酸塩による、他の炭水化物部位での酸化レベルを測定するため、一連の過ヨウ素酸塩の滴定実験を実施し、他の単糖残基のレベルを観察した。

シアル酸含有量を測定するため、サンプルを０．５Ｍのギ酸を用いて、８０℃で１時間、酸加水分解させた。放出されたシアル酸を５０〜１８０ｍＭ酢酸ナトリウムグラジエントを用いて、１００ｍＭ水酸化ナトリウム中で、２０分以上、Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムで、パルスアンペロメトリック検出付きの、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）によって分析した。結果を、ｒｈＧＡＡまたはＮｅｏＧＡＡ １モルにつき、シアル酸（ＮＡＮＡまたはＮＧＮＡ）のモルとして表し、真正の商用シアル酸標準物の検量線から測定した。

フコース、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、およびマンノースを含む、中性単糖のレベルを、１１０℃で２時間、１ＭのＴＦＡ中で、１００μｇのｒｈＧＡＡまたはＮｅｏＧＡＡを加水分解することで測定した。加水分解に続いて、チューブを氷上で冷却し、１分１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃにより蒸発乾固した。放出された単糖を２５０μＬの水に再懸濁させ、ボルテックスし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターチューブを用いてろ過した（１０，０００ＭＷＣＯ）。放出された単糖を、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムで、パルスアンペロメトリック検出付きの高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分析した。定量は、加水分解した単糖の検量線を用いて、同様の方法で行った。

上記の実験結果を図１０Ａに示す。結果から、シアル酸が最も酸化を受けやすい単糖であると示唆された。低レベルのフコース破壊は２ｍＭの過ヨウ素酸塩で検出することができ、その量は５ｍＭ以上で測定および再現することができた。マンノースのわずかな酸化は、７．５ｍＭ以上の過ヨウ素酸塩でだけ検出することができた。

酸化シアル酸、フコース、およびマンノースの存在を確認するため、フラグメンテーション質量分析を、７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて酸化したｒｈＧＡＡから放出されたオリゴ糖に関して実施した。ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡ中のＮ−結合型オリゴ糖を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０および１０ｍＭＢ−メルカプトエタノール中で、ＰＮＧａｓｅＦを用いて、一晩かけて分解させて、放出させた。放出されたオリゴ糖を、水を変更しながら、生物的透析（ＭＷＣＯ５００Ｄａ）により不要なものを取り除いた。透析したサンプルをｓｐｅｅｄ−ｖａｃ濃縮機で乾燥し、１０ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．０の５０％アセトニトリルおよび５０％水の溶液の１１０μＬで再構成した。サンプルをアセトニトリル−水グラジエントおよび１０ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．０で、インラインＭＳ検出器（ＱＳｔａｒ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ飛行時間型、ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ飛行時間型、およびＬＴＱ直線イオントラップ機）を用いた、ＴＳＫＧｅｌＡｍｉｄｅ−８０カラム（２ｘ１００ｍｍへ１００μＬ注入、５μｍ粒子サイズ）を使って分析した。

オリゴ糖構造を分析するため、オリゴ糖を乾燥し、アントラニル酸（ＡＡ）で蛍光標識した。ＡＡ標識したオリゴ糖を、アセトニトリル／水グラジエントを用いて、蛍光検出機を使用し、ＴＳＫゲルアミド８０カラムで、順相ＨＰＬＣにより分離した。ＭＳフラグメンテーション分析を、陽イオンモードで、ＬＴＱ ＸＬ直線イオントラップマススペクトロメータを用いて、インラインで行った。スペクトルを４００〜２，０００ｍ／ｚでスキャンし、衝突エネルギーは３５に（初期設定値、本文に示されない限り）、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎＱは０．２５に合わせた。

シアル酸：シアル酸の完全酸化（Ｃ７，８およびＣ８，９結合の両方で）は、質量で６２ダルトンの減少をもたらす。フコースおよびマンノースの酸化は、最初に２ダルトン減少（Ｃ２，３またはＣ３，４結合の酸化）させ、続いて残りのビシナル・ジオールの酸化で、３０ダルトン減少する。ＡＡを有する炭酸水素アルデヒドの還元的アミノ化は、酸素の消失を招き、１ＡＡを追加するにたびに、正味１２１．１ダルトンの分子量の増加が引き起こされる。シアル酸、フコース、およびマンノースを酸化後の、ｒｈＧＡＡオリゴ糖における、理論的な分子量および観察された分子量の変化を表４に示す。

酸化およびＡＡ−誘導型酸化シアル酸、フコース、およびマンノースオリゴ糖種に対応する様々なイオンが観測された。放出されたすべてのオリゴ糖の還元末端のＧｌｃＮＡｃでの誘導化に加えて、ＡＡは存在する反応性アルデヒド種の数と比例して、つまり、酸化シアル酸とでは１：１、酸化マンノースおよびフコースでは２：１で誘導された。

図１０Ｂの質量スペクトルは、シアル酸のＣ７位の酸化およびＡＡ誘導を有するｒｈＧＡＡオリゴ糖に対応する４つのイオンの検出を示す。シアル酸の酸化に関する２つのイオン（ｍ／ｚ１０５７および１１３０）を、さらなるＭＳ／ＭＳフラグメンテーション分析のために選択した。ｍ／ｚ １０５７のフラグメーションパターンを図１０Ｃに示し、各イオンは仮定された物質が注釈されている。フラグメンテーションイオンｍ／ｚ ７１６、１０３２、１２３５、１３９７、１５８４、および１７４７は、ＭＳ３分析から選択された。ＭＳ³スペクトルは、二分岐鎖グリカンの末端の酸化およびＡＡ標識シアル酸を含む、仮定されたオリゴ糖構造と一致した。特に、ｍ／ｚ ３５１のフラグメントの放出により、シアル酸のC７型へのＡＡの結合を確認した。全サンプルの分析において、Ｃ７型の酸化されたシアル酸だけが観察された。Ｃ８位で酸化されたシアル酸の存在に関する証拠は観察されなかった。

フコース酸化：表５にＡＡ−誘導化、酸化Ａ１ＦおよびＡ２Ｆの理論質量および観測質量を列挙する。

ｍ／ｚ１２５０．４の親イオンのフラグメンテーションパターンを図１０Ｄに示し、酸化シアル酸および酸化フコースを有する、ＡＡ標識、一シアル酸、一本鎖、フコシル化コアオリゴ糖で予測されたものと一致する。主なフラグメントイオンはｍ／ｚ ７１６、１３９７、１６２１、および１７８３で観測された。これらのイオンは仮定された物質を確認するため、ＭＳ³分析のために選択された。ｍ／ｚ １６２１および１７８３のＭＳ³スペクトルにおいて、イオンフラグメンテーションパターンから、親イオンから１９５ダルトンが消失していることを確認した（それぞれ、親イオン１６２１および１７８３から１４２６および１５８８まで）。この分子量の変化は、酸化フコースのＣ１および酸素原子間の切断と一致し、これはＣ４に結合した誘導体化されたアントラニル酸の消失をもたらす。加えて、さらなるフラグメンテーション、およびＣ３に結合した別の誘導体化アントラニル酸の消失が、親イオンから３８６ダルトンの消失として観測した（それぞれ、親イオン１６２１および１７８３由来で、１２３５および１３９７ｍ／ｚ）。

酸化ｒｈＧＡＡオリゴ糖Ａ１ＦのＭＳフラグメンテーションパターンは、アントラニル酸が結合したフコースのＣ３、４の誘導体化を示し、これにより過ヨウ素酸塩による酸化が起こることを確認した。Ｃ２−Ｃ３結合の酸化の証拠は観察されなかった。ビス−Ｍ６Ｐ六糖グリカンの酸化ｒｈＧＡＡへの結合は、縮合反応の間に、正味１３０５．３ダルトンの増加をもたらした。

複合体化したオリゴ糖構造の一体性を確認するため、放出された天然オリゴ糖の高精度ＭＳ分析を実施した。２および７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で製造したｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡ ＳＡＭ６由来のオリゴ糖を、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して放出し、１０ｍＭのギ酸アンモニウムｐＨ４．０を有するアセトニトリル−水グラジエントで、順相ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲルアミド−８０カラム）により放出した。グリカンの質量分析検出を、インライン、陰イオンモード、ＱＳｔａｒまたはＬＣＴ飛行時間型質量分析装置を用いて実施した。

次の表に、高性能ＭＳ／ＴＯＦ分析を基に、２および７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で酸化したｒｈＧＡＡ由来の天然Ｎ−結合型オリゴ糖ピークの同定、並びに２および７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で製造されたＳＡＭ６における天然Ｎ−結合型オリゴ糖ピークの同定の概要を示す。「Ｏｘ」は、酸化の部位数を、「Ｃｏｎｊ」は複合体化されたビス−Ｍ６Ｐ六糖グリカンの数を示す。理論質量は理論のオリゴ糖構造のモノアイソトピック分子量から計算され、対応する電荷状態の理論ｍ／ｚおよび観察ｍ／ｚを示す。

２０ｐｐｍ超の質量精度がすべてのオリゴ糖種に関して観測された。ＭＳの結果は、シアル酸の酸化が１ｍＭ以上の過ヨウ素酸塩で完了することを示す単糖組成物分析と一致した。マンノースおよびフコースの一部の酸化も明らかであった。酸化マンノースおよび／またはフコースにつき、１および２モルのグリカンの結合に相当するイオンが観測され、これはＡＡで観測されたように、それぞれの両方のアルデヒド種がグリカンに対して反応性であることを示唆する。

高マンノース構造（オリゴマンノース５および６）のいくつかの結合を、２および７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩で処理した物質で検出した。２ｍＭの過ヨウ素酸塩で結合した物質において、０または１個複合体化されたグリカンがＡ１（モノシアル化）種で観測され、０、１、２、および３個複合体化されたグリカンに相当するイオンが、７．５ｍＭ ＳＡＭ６のＡ１種で観測された。この結果から、７．５ｍＭ（２ｍＭではなく）過ヨウ素酸塩を用いて、コア・マンノースおよび／またはガラクトース残基の幾らかの酸化および複合体化が、Ａ１構造で起こることが示唆される。

Ａ２およびＡ２Ｆ種（二シアル酸、二分岐鎖、±フコース）について、モノ−およびビ−複合体化種が、２および７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩サンプルで観察された。酸化マンノースとのトリ−複合体化の証拠は、７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩処理サンプルでのみ観察され、２ｍＭ処理では観察されず、高い過ヨウ素酸塩濃度のフコースを介した複合体化と一致した。

図１１Ａは、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡから放出されたオリゴ糖のＨＰＬＣ分析を示す。ｒｈＧＡＡコントロールに関して、Ｎ−結合型オリゴ糖種の大部分は、１１〜１３分に溶出し、これはリン酸化も複合体化もされないオリゴ糖に相当する領域である。ＮｅｏＧＡＡオリゴ糖について、ビ−複合体化（ｂｉ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）オリゴ糖種は１９〜２０分、モノ−複合体化（ｍｏｎｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）オリゴ糖種は１５〜１８分、および酸化／無修飾オリゴ糖は１０〜１３分で溶出した。７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩で生成されたＳＡＭ６サンプルについて、そのオリゴ糖のほぼ半分がビ−複合体化種に相当する領域で溶出し、２ｍＭ過ヨウ素酸塩処理したサンプルのオリゴ糖のおおよそ３分の１はビ−複合体であった。これらのサンプルの溶出分析結果は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびマンノース−６−リン酸含有量分析によって測定された複合体化レベル（ＳＡＭ６を生成する２および７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩に関して、ＮｅｏＧＡＡ１モルあたり、複合体化されたグリカンそれぞれ約７および９モル）に一致した。

存在するオリゴ糖構造のより優れた、可視化および定性比較を提供するため、放出されたオリゴ糖を、パルスアンペロメトリック検出付きの高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーに（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）より分析した。サンプルを酢酸ナトリウム／１００ｍＭ水酸化ナトリウムグラジエントを用いて、Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラムで、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。オリゴ糖ピーク物質を、オフラインフラクションコレクション、透析ｖｓ．水、およびインラインＭＳ分析を用いた順相ＨＰＬＣによる分析によって確認した。

図１１Ｂは、（ＭＳで測定された）ピーク物質を含む代表的なＨＰＡＥＣ−ＰＡＤデータを示す。図１１Ｃは、２および７．５ｍＭの過ヨウ素酸塩処理したｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡＳＡＭ６サンプルのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによるオリゴ糖のプロファイリングを示す。

Ｄ．過ヨウ素酸塩処理後のｒｈＧＡＡタンパク質骨格の分析
ＮｅｏＧＡＡのタンパク質骨格のタンパク質修飾を調べるため、ペプチドマッピングＬＣ／ＭＳを実施した。０、２、７．５および２２．５ｍＭの過ヨウ素酸塩を用いて製造したＮｅｏＧＡＡＳＡＭ６は、トリプシンを用いて調製され、ＬＣＴ飛行時間型質量分析器を用いて逆相ＨＰＬＣにより分析した。システイン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、およびヒスチジン残基の酸化、ならびにアスパラギンの脱アミドなど、可能性のあるペプチド修飾を、ＢｉｏＰｈａｒｍａｌｙｎｘソフトウェアを使用して評価した。検出された有意な修飾は、いくつかの異なる部位のメチオニン酸化のみであった。０、２、および２２．５ｍＭ過ヨウ素酸塩処理後の、ペプチドＴ１３（メチオニン１７２および１７３を含む）の酸化レベルを図１２に示す。

有意なレベルの酸化が、メチオニン残基１２２、１７２および１７３で見出された。これらのメチオニン残基の酸化を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により確認した。低レベルの酸化も、メチオニン３６３で、過ヨウ素酸塩に依存した方法により起こることが観察された。過ヨウ素酸塩の酸化を最小限にする試みにおいて、過ヨウ素酸塩の濃度は、１〜７．５ｍＭのレベルで滴定され、ＬＣ／ＭＳによりモニターされた最も感受性の高い部位（ペプチドＴ１３）で酸化した。有意なレベルのメチオニン酸化は、１ｍＭより高い過ヨウ素酸塩濃度で観測され、これによりｒｈＧＡＡのメチオニンがシアル酸残基と同じくらい酸化に対する感受性が高いことが示された。

ＧＡＭ複合体化の間に、ＧＡＯによるガラクトース酸化は、Ｍｅｔ１７２／１７３の約２６％の酸化をもたらした。カタラーゼが２および５０ユニット／ｍｇＧＡＡで酸化反応中に含まれた場合、メチオニン酸化は排除された。

実施例８：ＧＡＡ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価
ＮｅｏＧＡＡ ＳＡＭ２を、実施例２の化合物１７および７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて、実施例７に記述されたように製造した。ガラクトース結合ＮｅｏＧＡＡ ＧＡＭ２を二糖１７と結合させる前に、ガラクトースオキシダーゼでｒｈＧＡＡを処理することで製造した。同様に、三糖ＮｅｏＧＡＡ ＳＡＭ３（化合物３５、実施例３）、四糖ＮｅｏＧＡＡｓ ＳＡＭ４（化合物２８、実施例４Ａ）、および直鎖ＳＡＭ４（化合物４７、実施例４Ｂ）も製造した。さらに、六糖ＮｅｏＧＡＡβ ＳＡＭ６を、実施例７に記述されたように、２および７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて、化合物７７を用いて製造した。追加の六糖複合体αＳＡＭ６（α結合、シアル酸残基を介して複合体化されている）およびＧＡＭ６（ガラクトース残基を介して複合体化されている）が同様に製造された。

Ａ．特異的活性：
活性分析を、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡによって触媒される、合成基質ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−α−グルコピラノシド（ｐ−ＮＰ）の加水分解の比率をモニターすることで実施した。放出される発色団を、アルカリ条件下で、４００ｎｍの吸光度で測定した。１単位の活性を、３７℃、定義されたアッセイ条件下で、１分あたり、１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニル−Ｄ−α−グルコピラノシドをｐ−ニトロフェノールに加水分解するのに必要な酵素量として定義する。

ＮｅｏＧＡＡ ＳＡＭ２、ＳＡＭ３、ＳＡＭ４、直鎖ＳＡＭ４、αＳＡＭ６、およびβＳＡＭ６の特異的活性を、図１３に示す。さらに、ＳＡＭ法 ｖｓ．ＧＡＭ法を用いて製造した複合体の特異的活性を評価した。ＧＡＡに対するＭ６Ｐの数と、小規模および大規模で製造されたＮｅｏＧＡＡ複合体の特異的活性との間には逆相関（ｐ＜０．００１）があり、ＧＡＡあたり１６．６倍モル過剰のオリゴ糖であった。複合体化（２．５〜３３倍モル過剰のオリゴ糖）の間にＮｅｏＧＡＡ濃度が滴定される別の実験において、ＧＡＡ活性の消失がまた、ＳＡＭまたはＧＡＭ複合体におけるＭ６Ｐ含量の増大と共に観察された。４９〜８１％のＧＡＡ活性を有するＳＡＭ（コントロールと比較）について、様々なＮｅｏＧＡＡが１タンパク質につきオリゴ糖を６〜８分子含有した。ＧＡＭ複合体は６７〜９２％活性を有し、１タンパク質あたり４〜６個のオリゴ糖を含有した。

Ｂ．Ｍ６Ｐ受容体結合：
複合体の機能的効果は、ＢｉａｃｏｒｅおよびＭ６Ｐ受容体アフィニティ−カラムＨＰＬＣによって、ＮｅｏＧＡＡの可溶性カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ｓＣＩＭＰＲ）への結合をモニターすること、およびＬ６筋芽細胞における取り込みによって評価した。ウシ血清から精製した、ｓＣＩＭＰＲは、Ａ〜Ｘの細胞外ドメインを含み、膜透過部分を欠いている。

Ｂｉａｃｏｒｅ分析に関して、ｓＣＩＭＰＲをＣＭ−５チップにアミン結合させ、ＮｅｏＧＡＡサンプルの１０μｇ／ｍＬを表面に固定し、マンノース−６−リン酸の濃度を増加させて溶出した。結合したＮｅｏＧＡＡの５０％を置き換えるのに必要なＭ６Ｐの濃度として、親和性を定量した（ＥＣ５０）。当該方法を、受容体親和性の結合および酸化の効果をモニターするのに使用した。

図１４にＢｉａｃｏｒｅ分析の結果を示す。ｓＣＩＭＰＲを固定化したＢｉａｃｏｒｅチップ上に１０μｇ／ｍＬのＮｅｏＧＡＡを注入すると、約２５０ＲＵのレスポンスの増加を引き起こし、同じ量のｒｈＧＡＡでは、約１００ＲＵの偏差を引き起こした。さらに、ｒｈＧＡＡよりＮｅｏＧＡＡを溶出するのに、ほぼ１０倍高いＭ６Ｐ濃度が必要であった（ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡについて、それぞれほぼ０．１ｖｓ．１．０ｍＭのＥＣ５０値）。ＥＣ５０値と、２および７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて製造したＮｅｏＧＡＡの結合レベルには、直線的な関係が見られた（Ｒ−２乗＞０．９５）。調査した結合範囲において（１．６〜４．７モルのグリカン／モル、ＮｅｏＧＡＡ、２ｍＭの過ヨウ素酸塩で製造、および１．０〜８．５モルのグリカン／モル、７．５ｍＭのＮａＩＯ₄で製造）、結合親和性に関する複合化レベルの効果は、２および７．５ｍＭ過ヨウ素酸塩で製造されたＮｅｏＧＡＡに類似していた。

ＰｏｒｏｓＥＰ樹脂にｓＣＩＭＰＲを固定化し、その後分析用ＨＰＬＣカラムにパッキングすることで調製された、Ｍ６Ｐ受容体カラムを使用して、Ｍ６Ｐ受容体結合をＨＰＬＣにより評価した。ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡを、０．２５、０．８５、５、および２０ｍＭのＭ６Ｐを用いて溶出した（図１５ＡおよびＢ）。１つの実験において、ＳＡＭ２およびＧＡＭ２を、βＳＡＭ６およびＧＡＭ６と比較した（図１５Ｃ）。ＳＡＭ６およびＧＡＭ６では、物質の大部分が溶出される前に（＞９５％の、カラムに結合した複合体）、２０ｍＭのＭ６Ｐが必要であった。ＳＡＭ２およびＧＡＭ２は強固には結合せず、５ｍＭのＭ６Ｐで大部分が溶出した（＞９５％がカラムに結合）。

さらに、ＮｅｏＧＡＡ複合体ＳＡＭ２、ＳＡＭ３、ＳＡＭ４、直鎖ＳＡＭ４、およびαＳＡＭ６を、Ｍ６Ｐ受容体結合に関して評価した（図１５Ｄ）。ＳＡＭ２、ＳＡＭ３、および両方のＳＡＭ４複合体の大部分が、５ｍＭのＭ６Ｐで溶出したが、両方のＳＡＭ６複合体は２０ｍＭのＭ６Ｐが必要であった。

種々の量が複合を有する、ＮｅｏＧＡＡ複合体を評価した（図１５Ｅ）。結合画分のＮｅｏＧＡＡの割合は、複合体化されたＮｅｏＧＡＡ１モルあたり、＞２．０モルのグリカンを有する製造物に関して、一定して＞９５％だった。複合体化レベルの低いわずかな画分において（１．０〜１．７モルのグリカン）、結合画分は７５〜９０％であった。ＮｅｏＧＡＡに関するＭ６Ｐカラム分析データも、ｒｈＧＡＡより高親和性種の量が高いことを示した。具体的には、結合ｒｈＧＡＡの大部分は、０．２ｍＭのＭ６Ｐで溶出され、カラムからＮｅｏＧＡＡを溶出するには、２０ｍＭのＭ６Ｐが必要であった。高親和性種の割合に関して、複合化レベルの全体的な効果は、２．０〜７．５ｍＭ過ヨウ化酸塩処理に類似していた。

図１５Ｆは、さまざまな量のＭ６Ｐの効果を示す。ＳＡＭ６複合体は、以下のＭ６Ｐ量、ＳＡＭ６−１（ｒｈＧＡＡ １モルにつき、Ｍ６Ｐ ４．９モル）、ＳＡＭ６−２（ＧＡＡ １モルにつき、Ｍ６Ｐ ７．４モル）、ＳＡＭ６−３（ｒｈＧＡＡ １モルにつき、Ｍ６Ｐ １０．５モル）、ＳＡＭ６−４（ｒｈＧＡＡ １モルにつき、Ｍ６Ｐ １１．２モル）およびＳＡＭ６−５（ｒｈＧＡＡ １モルにつき、Ｍ６Ｐ １６．６モル）を含有した。統計的有意性を^、＊および＊＊＊で示し、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ、ＳＡＭ６−１、ＳＡＭ６−３と比較したｐ＜０．０５を表す。

Ｃ．Ｌ６筋芽細胞による細胞内移行
Ｌ６筋芽細胞の取込みアッセイを、Ｚｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０３３６−５０３４１（２００４）に記述の通りに実施し、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）経路を介して、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡが筋芽細胞を標的とすることが明らかにされた。Ｌ６筋芽細胞の取込みアッセイにおいて、ｒｈＧＡＡおよびＮｅｏＧＡＡを、Ｌ６筋芽細胞を含むウェル中の＋／−５ｍＭ Ｍ６Ｐの培地に加え、あらかじめ決定された一晩にてインキュベートした。インキュベート後、細胞を溶解し、４−ＭＵグルコシド基質を用いた活性、およびマイクロＢＣＡアッセイによるタンパク質濃度を分析して、酵素の用量反応曲線を作成した。

Ｌ６筋芽細胞の取込みアッセイの結果を、図１６に示す。ＳＡＭ２およびＧＡＭ２複合体は、無修飾のｒｈＧＡＡより優位に高い取込みを示したが、二リン酸化されたＳＡＭ６またはＧＡＭ６複合体ほど高くはなかった（図１６、上図）。ＮｅｏＧＡＡのＳＡＭ２、ＳＡＭ３、ＳＡＭ４、直鎖ＳＡＭ４、およびαＳＡＭ６の取込み試験も行った（図１６、下図）。同様の実験において、実施例７のリシン−チオ−ル複合体は、約８倍の取込み増加を引き起こした。

実施例９：新規ＧＡＡ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ある種のＮｅｏＧＡＡ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を、Ｒａｂｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３０）：１９０８６−９２（１９９８）に記述された、ＧＡＡノックアウトマウスモデルを用いて調査した。以下の通り、それぞれ６匹のマウス群を４週間にわたり１週間に１回処置した。

サンプルを心臓、大腿四頭筋、および上腕三頭筋から集め、組織のグリコーゲン含有量を測定した。ＳＡＭ２、ＳＡＭ４およびＳＡＭ６動物の結果を、それぞれ図１７、図１８、および図１９に示す。ＳＡＭ６複合体を用いて１２匹の動物群で、実験を繰り返し、ＳＡＭ６複合体が、未修飾のｒｈＧＡＡより５倍強力であることを確認した。

ＳＡＭおよびＧＡＭ六糖複合体を、溶媒、２０、６０、または１００ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ、あるいは４、１２、または２０ｍｇ／ｋｇのＳＡＭ６またはＧＡＭ６を４週間、１週間に１回摂取した６匹のマウス群を用いて比較した。心臓、大腿四頭筋、上腕三頭筋、隔膜、および腰筋を摘出し、グリコーゲン含有量を分析した。図２０に、この試験結果を示す。薬物動態および薬力学試験については、３〜６カ月齢の３０匹のＧＡＡノックアウトマウス（オス１５匹、メス１５匹）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン、ＭＡから入手した。各用量群にはオス５匹、メス５匹が含まれる。動物をグループにして飼育し、恒湿２５℃、１２時間の明暗周期を維持した。すべての動物は、飼料（ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ２０）および水を自由に摂取することができるようにした。各用量につき計１０匹のマウスとするため、動物を１グループにつきオス５匹、メス５匹の３用量グループに無作為に分けた。各グループには、２０ｍｇ／ｋｇで、ｒｈＧＡＡ、ＧＡＭおよびＳＡＭ複合体の単回静脈内投与を行った。薬物動態分析用の血液サンプルを、意識のあるマウスの後眼窩静脈叢を介して、投与後、５、１５、３０、６０、１２０、２４０、および４８０分で回収した。血清中のｒｈＧＡＡ濃度を、ＧＡＡ活性アッセイを用いて測定した。結果を図２０Ｂに示す。

実施例１０：酸性スフィンゴミエリナーゼ複合体の合成
バキュロウイルス発現系またはチャイニーズハムスター卵巣細胞で発現した組換えヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｒｈＡＳＭ）は、遊離チオ−ル基を有するＣ−末端システインを有する。Ｌａｎｓｍａｎｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０７６−１０８８（２００３）およびＱｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３２７４４−３２７５２（２００３）を参照のこと。ｒｈＡＳＭは、遊離チオ−ル基を介して、オリゴ糖１〜１２７のいずれかと結合することができ、このオリゴ糖は、米国特許仮出願第６０／８８５，４５７号、または実施例６に記載された方法によると、リンカーおよびチオ−ル反応性基を含む。

実施例１１：α−Ｌ−イズロニダーゼ複合体の合成
α−Ｌ−イズロニダーゼは、オリゴ糖１〜１２７のいずれかと結合し、このオリゴ糖は、Ｌｅｅら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：８１８−８２５（２００３）に記載された方法によると、プロピオンアルデヒド反応性基を含むリンカーを含む。α−Ｌ−イズロニダーゼおよびオリゴ糖は、室温、ｐＨ５．５、１日間で、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で結合する。その後、小分子が透析または膜分離により、反応混合物から除去される。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる参考文献および特許または特許出願が、本明細書に含まれる発明に相反する場合、本明細書があらゆる相反する構成要素に取って代わる。

本明細書および請求項で使用される成分、反応条件などの量を表す全数字は、「約」という語により、すべての場合で修飾されるものとして理解されるべきであり、約は例えば±５％を意味する。したがって、反対に指示されない限り、明細書および添付請求項に明記される数値パラメーターは、本明細書によって試みられた所望の特性によって変化する概数である。最低限でも、請求の範囲に相当する原理の応用を限定するいかなる意図は無く、各数値パラメーターは、有効数字の数および概数で表す方法の観点で解釈されるべきである。

本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかな、本発明の多くの修飾および変形を行うことができる。本明細書で記載された具体的な実施形態は、例示のためにのみ記載するものであり、いかなる方法でも限定されるものではない。本明細書および実施例は、例示としてのみの目的であり、本発明の本来の範囲および趣旨は以下の請求項により示される。

Claims (18)

1. （１）タンパク質、および（２）式Ｉ〜ＶＩ：
   

   

   

   ［式中、
   ａは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
   ｂは、α１，２；α１，３；およびα１，４から選択され；
   ｃは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
   ｄは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
   ｅは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され、
   ｆは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
   ｇは、α１，２；α１，３；およびα１，４から選択され；
   ｈは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
   ｉは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
   ｊは、α１，２であり；
   ｋは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
   ｘは、１、２、または３であり；
   ｌは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
   ｍは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
   Ｒ^xおよびＲ^yは、それぞれ独立に、ポリエチレングリコール、および、オキソ、ニトロ、ハロ、カルボキシル、シアノ、または低級アルキルで任意に置換され、且つＮ、Ｏ、またはＳから選択される１または２以上のヘテロ原子で任意に中断されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキルから選択され；
   ｚは、０、１、２、３、または４であり；並びに、
   ｘが２もしくは３であり、またはｙが２、３、もしくは４であるとき、式ＩＶまたは式ＶＩの各マンノース間の結合は、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
   ただし、ｅがα１，６であるとき、ｆはα、およびαとβとの混合物から選択される］
   のいずれか１つのオリゴ糖を含む、オリゴ糖−タンパク複合体。
2. 前記オリゴ糖が２個のマンノース−６−リン酸残基を有する、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
3. 前記オリゴ糖が３個のマンノース−６−リン酸残基を有する、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
4. 前記オリゴ糖がオリゴ糖８２である、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
5. 前記オリゴ糖がオリゴ糖１２８、オリゴ糖１２９、またはそれらの混合物である、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
6. 前記オリゴ糖がオリゴ糖１３０、オリゴ糖１３１、またはそれらの混合物である、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
7. 前記オリゴ糖がオリゴ糖１３２、オリゴ糖１３３、またはそれらの混合物である、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
8. 前記オリゴ糖がオリゴ糖１３６である、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
9. 前記タンパク質が糖タンパク質である、請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
10. 前記糖タンパク質がリソソーム酵素である、請求項９に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
11. 前記リソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、またはＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼである、請求項１０に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
12. 前記リソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼである、請求項１０に記載のオリゴ糖−タンパク複合体。
13. 請求項１に記載のオリゴ糖−タンパク複合体および賦形剤を含む、医薬組成物。
14. それを必要とする被験体のリソソーム蓄積症を治療するための医薬の製造における、請求項１に記載の複合体の使用。
15. リソソーム蓄積症の治療方法であって、（１）リソソーム酵素、および（２）式Ｉ〜ＶＩ：
    

    

    

    ［式中、
    ａは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
    ｂは、α１，２；α１，３；およびα１，４から選択され；
    ｃは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
    ｄは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
    ｅは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
    ｆは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
    ｇは、α１，２；α１，３；およびα１，４から選択され；
    ｈは、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
    ｉは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
    ｊは、α１，２であり；
    ｋは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
    ｘは、１、２、または３であり；
    ｌは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
    ｍは、α、β、およびαとβとの混合物から選択され；
    Ｒ^xおよびＲ^yは、それぞれ独立に、ポリエチレングリコール、および、オキソ、ニトロ、ハロ、カルボキシル、シアノ、または低級アルキルで任意に置換され、且つＮ、Ｏ、またはＳから選択される１または２以上のヘテロ原子で任意に中断されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキルから選択され；
    ｚは、０、１、２、３、または４であり；並びに、
    ｘが２もしくは３であり、またはｙが２、３、もしくは４であるとき、式ＩＶまたは式ＶＩの各マンノース間の結合は、α１，２；α１，３；α１，４；およびα１，６から選択され；
    ただし、ｅがα１，６であるとき、ｆはα、およびαとβとの混合物から選択される］
    のいずれか１つのオリゴ糖を含む、オリゴ糖−糖タンパク複合体を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
16. 前記リソソーム蓄積症が、ファブリー病、ポンペ病、ニーマン−ピックＡ病、ニーマン−ピックＢ病、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、およびムコ多糖症ＶＩ型から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記リソソーム蓄積症がポンペ病である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記オリゴ糖−糖タンパク複合体で処理する前、処理後、または処理中に前記哺乳動物へ、メトトレキサートを投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

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