BRPI0923047B1 - métodos para preparação de conjugados de proteínasoligossacarídeos - Google Patents

Abstract

CONJUGADOS DE PROTEÍNAS-OLIGOSSACARÍDEOS. A invenção refere-se a conjugados compreendendo uma proteína e um oligossacarídeo de uma das Fórmulas l-VI. A invenção também refere-se a composições farmacêuticas compreendendo tais conjugados. A invenção refere-se também a métodos de tratamento de um distúrbio de depósito lisossômico em um mamífero pela administração de um conjugado de glicoproteína oligossacarídeo.

Description

[001] Este pedido reivindica o beneffcio de prioridade do Pedido Provisorio N° U.S. 61/122,851, que e incorporado aqui por referenda integralmente.

[002] A invenção refere-se geralmente a conjugados de protei- nas-oligossacandeos compreendendo oligossacandeos especificos e a composigoes compreendendo tais conjugados. A invenção ainda se refere a metodos de tratamento de disturbios de armazenagem lisos- somal usando conjugados de enzimas lisossomais de oligossacari- deos.

[003] Disturbios de armazenagem lisossomal (LSDs) sao uma classe de disturbios metabolicos raros compreendendo mais de qua- renta doengas geneticas envolvendo uma deficiencia na atividade de hidrolases lisossomais. Uma caractenstica dos LSDs e o acumulo anormal de metabolitos lisossomais, que leva a formagao de grandes numeros de lisossomos distendidos.

[004] LSDs podem ser tratados pela administragao da versao ativa da enzima deficiente no individuo, um processo denominado terapia de substituigao de enzimas (ERT). A enzima de substituigao adminis- trada com uma manose-6-fosfato terminal (M6P) e retirada pelas celu- las-alvo atraves de endocitose mediada por receptor M6P (CI-MPR) independente de cations associados a superficie celular e direcionada ao lisossomo.

[005] No geral, as enzimas de substituigao insuficientemente fos- foriladas nao sao internalizadas de forma eficaz pelo receptor de M6P nas superficies celulares, e, portanto, nao podem ser direcionadas ao lisossomo onde funcionam. Consequentemente, um baixo grau de fos- forilagao de manose pode ter um efeito significativo e deleterio na efi- cacia terapeutica de uma enzima de substituigao.

[006] Foram desenvolvidos metodos para aumentar o teor de M6P de enzimas de substituigao. Por exemplo, as Patentes N°s U.S. 6.534.300; 6.670.165; e 6.861.242 descrevem a fosforilagao enzimatica de resfduos de manose terminals. Em outro exemplo, a Patente N° U.S. 7.001.994 descreve um metodo para acoplar oli- gossacarideos compreendendo M6P com glicoproteinas. Um con- jugado de a-glucosidase acido de enzima lisossomal (GAA) com um oligossacarideo bis-M6P preparado por aquele metodo foi considerado mais eficaz em reduzir glicogenio esqueletal e de musculos cardiacos do que GAA humano recombinante em um modelo murino de doen$a de Pompe, uma doen?a muscular re- cessiva autossomal resultante de uma deficiencia metabolica de GAA, e caracterizada pelo acumulo de glicogenio lisossomal. De forma semelhante, Zhu et al. descrevem acoplamento a um oligossacarideo bis-M6P sintetico (Formula A) com GAA. Zhu et al., Biochem. J. 389:619-628 (2005). A formula A foi designada a partir de estrutura de nucleo de Mang triantenario natural de glicanos ligados a N (Formula B) atraves da remoCao de uma ramifica^ao, encurtamento de outra ramifica^ao e fosforilaCao de residues de manose terminals.

Formula A

Formula B

[007] O conjugado resultante se ligou a CI-MPR com afinidade aumentada, foi internalizado de forma mais eficaz por mioblastos L6 e tinha atividade enzimatica aproximadamente normal. Apesar deste su- cesso, no entanto, continua sendo importante identificar novos oligossacandeos que possam resultar em melhora de afinidade para CI- MPR e/ou internal izagao celular mais eficiente quando conjugados a enzimas lisossomais, enquanto mantem atividade enzimatica normal ou quase normal. A melhora de absorgao sozinha, no entanto nao ne- cessariamente resulta em um resultado terapeutico melhor. Certas es- trategias de conjugagao e oligossacandeos resultam em conjugados com atividade enzimatica mais inferior. Portanto, e desejavel identificar oligossacandeos e conjugados que possam melhorar os resultados te- rapeuticos para individuos com LSDs.

[008] Alem disso, certos oligossacandeos como aqueles mostrados nas Formulas A e B podem ser dificeis e onerosos para sintetizar. Alem disso, fabricar sacandeos ligados a p de maneira estereosseleti- va tem sido um problema dificil na qufmica de carboidratos. Oligossacandeos substitutos e metodos de sintese podem ser mais praticos para uso em escala comercial. Existe necessidade adicional para oti- mizar metodos usados para preparar conjugados de proteinas- oligossacarfdeos. Especificamente, para fins terapeuticos, as prepara- goes de conjugados nao devem ser altamente heterogeneas, visto que isto pode resultar em fungao biologica inconsistente. Diversos aspec- tos dos conjugados podem afetar a eficacia terapeutica, inclusive os oligossacandeos e ligadores usados, metodos de conjugaCao, metodos de purificagao e formulagoes.

[009] Consequentemente, certas modalidades da invenção fornecem conjugados de proteinas-oligossacandeos que compreendem (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo da Formula I:

Formula Iem que:a = a1,2; a1,3; a1,4; ou a1,6;b = a1,2; a1,3; ou a1,4;c = a1,2; a1,3; a1,4; ou a1,6; e d = a, p, ou uma mistura de a e p.

[0010] Outras modalidades da invenCao fornecem conjugados de proteinas-oligossacandeos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo da Formula II:

Formula IIem que:e = a1,2; a1,3; a1,4; ou a1,6 e f = a, p, ou uma mistura de a e p, com a condipao de que f = a ou uma mistura de a e P quando e = a1,6.

[0011] Ainda outras modalidades da invenpao fornecem conjugados de proteinas-oligossacarfdeos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacarideo da Formula III:

Formula IIIem que:g = a1,2; a1,3; ou a1,4;h = a1,2; a1,3; a1,4; ou a1,6; ei = a, p, ou uma mistura de a e p.

[0012] Modalidades adicionais da invenpao fornecem conjugados de proteinas-oligossacandeos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacarideo da Formula IV:

Formula IVem que:j e a1,2;k e selecionada a partir de a, p, e uma mistura de a e P;x e 1, 2, ou 3; equando x e 2 ou 3, a ligapao entre cada manose e selecionada a partir de a1,2; a1,3; a1,4; e a1,6.

[0013] Outras modalidades fornecem conjugados de proteinas- oligossacandeos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo da Formula V:

Formula Vem que:I e selecionado a partir de a, 3, e uma mistura de a e 0.

[0014] Modalidades adicionais fornecem conjugados de proteinas- oligossacandeos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossa- carideo da Formula VI:

Formula VIem que:

[0015] Rx e Ry sao, cada um, independentemente escolhidos a partir de polietileno glicol e C1-C10 alquila opcionalmente substituida por oxo, nitro, halo, carboxila, ciano, ou alquila inferior e opcionalmente interrompida por um ou mais heteroatomos selecionados a partir de N, O, ou S;

[0016] z e selecionado a partir de 0, 1,2, 3, ou 4;

[0017] m e selecionado a partir de a, 0, e uma mistura de a e 0; e

[0018] quando y for 2, 3, ou 4, a ligagao entre cada manose seraselecionada a partir de a1,2; a1,3; a1,4; e a1,6.

[0019] Em modalidades adicionais, a invenção fornece conjugados de proteinas-oligossacarideos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo da Formula A.

[0020] Em certas modalidades, o conjugado compreende pelo menos 2, 3, 4, ou 5 mols do oligossacandeo da Formula A por mol da pro-teina.

[0021] Em algumas modalidades, os conjugados de proteinas- oligossacandeos da invenção compreendem um ligador entre o oligossacandeo e componentes de proteina do conjugado.

[0022] A invenção fornece composigoes farmaceuticas compreendendo conjugados de proteinas-oligossacandeos da Formula I, II, III, IV, V, ou VI e um preenchedor, agente volumoso, desintegrante, tampao, estabilizante ou excipiente. A invenção ainda fornece metodos para tratar um disturbio de armazenagem lisossomal como, por exemplo, aqueles divulgados na Tabela 1 infra, com um conjugado de prote- inas-oligossacandeos da Formula I, II, III, IV, V, ou VI, ou uma composigao farmaceutica compreendendo um conjugado de proteinas- oligossacandeos. O disturbio de armazenagem lisossomal pode ser escolhido a partir de, por exemplo, doenga de Fabry, doenga de Pompe, doenga de Niemann-Pick A, doenga de Niemann-Pick B e mucopo- lissacaridose I. Em outras modalidades, a invenção fornece o uso de um conjugado de proteinas-oligossacandeos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo da Formula I, II, III, IV, V, ou VI na fabricagao de um medicamento para tratar um disturbio de armazenagem lisossomal em um individuo que precise.

[0023] Modalidades adicionais da invenção sao discutidas neste pedido. Outros objetos, caracteristicas e vantagens da presente invenção ficarao evidentes a partir da seguinte descrigao detalhada. Qualquer modalidade discutida com relagao a um aspecto da invenção se aplica a outros aspectos da invenção e vice-versa. As modalidades na segao de Exemplos sao entendidas como modalidades da invenção que sao aplicaveis a todos os aspectos da invenção.

[0024] Deve ser entendido, no entanto, que a descrigao detalhada e os exemplos especificos, embora indiquem modalidades especificas da invenção, sao fornecidos por meio de ilustragao somente, uma vez que varies mudangas e modificagoes dentro da essencia e escopo da invenção ficarao evidentes para aqueles versados na tecnica a partir deste pedido.

Breve Descricao das Figuras

[0025] A Figura 1 descreve um esquema retrossintetico exemplar determinando as etapas para sintese do Oligossacarideo 82.

[0026] A Figura 2 descreve uma sintese exemplar de bloco de construgao de monossacandeos 2a que pode ser empregada na sintese de oligossacarfdeos descrita aqui.

[0027] A Figura 3 descreve sintese exemplar de blocos de cons- trugoes de monossacarideos 1, 2, 3, e 4 que pode ser empregada na sintese e oligossacandeos descrita aqui.

[0028] A Figura 4 descreve um esquema sintetico para a preparagao de um ligador de etileno.

[0029] A Figura 5 descreve um esquema sintetico para a monta- gem de um precursor de trissacandeos para o Oligossacarideo 82 usando os blocos de construgao 2, 3 e 4.

[0030] A Figura 6 descreve um esquema sintetico para a monta- gem de um heptassacandeo protegido a partir do precursor de trissacandeos descrito na Figura 4.

[0031] A Figura 7 descreve um esquema sintetico para desblo- quear o heptassacandeo protegido descrito na Figura 5 para fornecer o Oligossacarideo 82.

[0032] As Figuras 8A-E descrevem um esquema sintetico para preparar um hexassacandeo ligado a p da Formula A usando dibutil estanho para formar um intermediario estereosseletivo e uma forma alternativa com um grupo reagente de tiol.

[0033] A Figura 9 mostra o efeito do nivel de oxidagao sobre a conjugatabilidade de NeoGAA 0SAM6. A Figura 9A mostra a quantidade de oligossacandeos SAM2, SAM3, SAM4, SAM4 Linear, aSAM6, e PSAM6 conjugados com GAA em razoes molares variantes. A Figura 9B mostra a quantidade de hexassacarfdeo (glicano) conjugado com rhGAAs oxidado usando quantidades diferentes de periodato.

[0034] A Figura 10 mostra a oxidagao de acido sialico, fucose, galactose e manose com quantidades variantes de periodato. A Figura 10A mostra a oxidagao conforme monitorada por analise de composigao de monossacandeos (oxidagao inferida com base na redugao em quantidades de monossacandeos quantificados). A Figura 10B mostra detecgao de LTQ MS de oligossacarfdeos SAM6 marcados por AA em modo positivo. As Figuras 10C e 10D mostram um espectro de MS/MS correspondente a oligossacarfdeos oxidados marcados por AA. A Figura 10E mostra analise de monossacandeos de conjugado de GAM titulado com varias quantidades de GAO.

[0035] A Figura 11 mostra analise de HPLC de oligossacarfdeos liberados a partir de rhGAA e NeoGAA.

[0036] A Figura 12 mostra analise de LC/MS de mapeamento de peptideos de rhGAA tratado com 2-e 22,5 mM de periodato. Sao des- tacadas nas caixas as posigoes de eluigao do peptideo trfptico T13 nao oxidado, oxidado uma vez e oxidado duas vezes (contendo as me- tioninas 172 e 173).

[0037] A Figura 13 mostra analise de ligagao Biacore de NeoGAA e rhGAA para sCIMPR. Figura 13A Fases de sensograma mostrando associagao, dissociagao, eluigao de M6P, e regeneragao para cada injegao de amostra. Figura 13B Ajuste de 4 parametros representatives de dados de sensograma para amostras de NeoGAA e amostra controle de rhGAA. Figura 13C Afinidade de receptor de M6P de amostras de NeoGAA preparadas usando 2 mM vs. 7,5 mM de periodato, em nfveis de conjugagao diversos para cada preparagao.

[0038] A Figura 14 mostra a atividade especifica de varios conjugados de NeoGAA.

[0039] As Figuras 15A-E mostram a eluipao de conjugados de NeoGAA a partir de uma coluna receptora de M6P. A Figura 15F mostra Niveis de Glicogenio em Tecido em Camundongos GAAKO Apos a Administrapao de 4 doses semanais de conjugados de SAM6.

[0040] A Figura 16 mostra resultados de uma analise de absorpao de mioblasto L6, demonstrando internalizapao de diversos conjugados de NeoGAA.

[0041] A Figura 17 mostra liberapao de glicogenios a partir do co- rapao, quadriceps e triceps de camundongos de nocaute GAA apos tratamento com SAM2.

[0042] A Figura 18 mostra liberapao de glicogenios a partir do co- rapao e quadriceps de camundongos de nocaute GAA apos tratamento com SAM4.

[0043] A Figura 19 mostra liberapao de glicogenios a partir do co- rapao de quadriceps de camundongos de nocaute GAA apos tratamento com SAM6.

[0044] A Figura 20 mostra liberapao de glicogenios a partir do co- rapao e quadriceps de camundongos de nocaute GAA apos tratamento com SAM6 e GAM6.

DESCRICAO DAS MODALIDADES

[0045] Para auxiliar no entendimento da presente invenpao, certos termos sao definidos primeiro. Definipoes adicionais sao fornecidas neste pedido.

[0046] Conforme usado neste relatorio descritivo e reivindicapoes em anexo, as formas singulars "um" "uma" e "a" incluem referentes no plural exceto se o conteudo claramente indicar de outra forma. Assim, por exemplo, referenda a um metodo contendo "um composto" inclui uma mistura de dois ou mais compostos. O termo "ou" geralmente e empregado neste sentido incluindo "e/ou" a menos que o conteudo claramente indicar de outra forma.

I. Conjugados de Proteinas-Oligossacarideos

[0047] Em uma modalidade, a invenção fornece conjugados de proteinas-oligossacandeos que podem ainda compreender um ligador. Sao divulgados exemplos de oligossacandeos, proteinas, ligadores, metodos de conjugagao e conjugados.

A. Oligossacarideo

[0048] O oligossacarideo pode ser escolhido a partir de derivados de oligossacandeos biantenarios da Formula B ou Formula VI, como descrito acima, ou derivados de oligossacandeos lineares conforme mostrado nas Formulas IV e V. Oligossacandeos biantenarios, no ge- ral, tem dois residues de M6P terminals e podem, em algumas modalidades, ainda compreender um ou mais residues de M6P penultimos. Oligossacandeos lineares tem pelo menos um residuo de M6P e podem compreender um residuo de M6P terminal. No geral, os residues de M6P terminals podem ser conectados por uma ligagao a1,2. (Ver Distler et al., J. Biol. Chem. 266:21687-21692 (1991), observando uma ligagao a1,2 no M6P terminal resultou em ligagao maior a CI-MPR e MPR dependente de cations (CD-MPR) do que ambas as ligagbes a1,3 ou a1,6.) Em algumas modalidades, os residues de M6P terminals sao ligados, em suas respectivas extremidades redutoras, ao residuo adjacente por uma ligagao a1,2. Em algumas modalidades, dois residues de M6P terminals sao maiores do que 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, ou 40 A a parte, como determinado por, por exemplo, cristalografia de raio X, RMN e/ou modelagem molecular. Por exemplo, a modela- gem molecular pode ser realizada conforme descrito em Balaji et al., Glycobiology 4:497-515 (1994). Em algumas modalidades, o oligossacarideo e escolhido de modo que os residues de M6P terminals te- nham relativamente pouco impediment© esterico. Em algumas modalidades, os oligossacandeos em que os residues de M6P terminals sao livres se ligam a CI-MPR com maior afinidade do que os oligossacari-deos em que os residuos de M6P sao livres.

[0049] No geral, o oligossacandeo se ligara a CI-MPR. Por exemplo, o oligossacandeo pode se ligar a CI-MPR com uma constante de dissociagao menor do que, por exemplo, 500, 100, 50, 10, 5, 1, ou 0,1 nM, ou menor do que, por exemplo, 100, 50, 10, 5, 2, ou 1 pM. A estrutura de cristal dos dominios 1-3 de terminal-A/ de CI-MPR e conhecida, em ambas as formas ligadas por ligador e nao ligadas. Olson et aL, J. Biol. Chem. 279:34000-34009 (2004); Olson et aL, EMBO J. 23:2019- 2028 (2004). Alem disso, CD-MPR relacionado estruturalmente e co- nhecido tanto em formas ligadas por ligador como nao ligadas. Olson et aL, J. Biol. Chem. 274:29889-29886 (1999); Olson et aL J. Biol. Chem. 277:10156-10161 (2002). Consequentemente, aqueles versados na tecnica seriam capazes de usar informagoes estruturais de receptores para selecionar um oligossacandeo apropriado.

[0050] O oligossacandeo por ser escolhido, por exemplo, a partir de qualquer um dos oligossacandeos da Formula I, II, III, IV, V, ou VI, conforme descrito acima, inclusive os Oligossacandeos 1 a 127 descritos acima. Os oligossacandeos das Formulas I a III sao formalmente derivados da Formula B por remogao de uma ramificagao, remogao e/ou substituigao de um resfduo de monossacandeo, e/ou modificagao da ligagao (por exemplo, a1,2; a1,3; a1,4; ou a1,6) entre residuos de monossacandeos adjacentes. Em certas modalidades, o oligossacandeo pode ter, por exemplo, 1, 2, ou 3 residuos de manose adicionais em um ou ambos os bragos, ligados atraves de uma ligagao a1,2; a1,3; ou a1,6, relativa a qualquer das Formulas I a VL

[0051] O oligossacandeo pode ter, por exemplo, um, dois ou tres residuos de M6P. O oligossacandeo pode ter, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 residuos de monossacandeos em todos. Em outras modalidades, o oligossacandeo pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 residuos de manose, qualquer um destes podendo ser fosforilado ou defosforilado.

[0052] Em algumas modalidades, o oligossacandeo e escolhido a partir dos Oligossacarfdeos 1 a 96, que sao especies da Formula I:

Formula I

[0053] Em algumas modalidades, d e uma mistura de a e p (isto e, o oligossacarideo e uma mistura de, por exemplo, Oligossacandeos 1 e 2, 3 e 4, ou 95 e 96).

[0054] Em algumas modalidades, o oligossacandeo e escolhido a partir dos Oligossacandeos 97 a 103, que sao especies da Formula II:

Formula II

[0055] Em algumas modalidades, pH e uma mistura de a e p (isto e, o oligossacandeo e uma mistura de, por exemplo, Oligossacandeos 97 e 98, 99 e 100, ou 101 e 102).

[0056] Em algumas modalidades, o oligossacandeo e escolhido a partir dos Oligossacandeos 104 a 127, que sao especies da Formula III:

Formula III

[0057] Em algumas modalidades, i e uma mistura de a e p (isto e, o oligossacandeo e uma mistura de, por exemplo, Oligossacandeos104 e 105, 106 e 107, ou 126 e 127).

[0058] Em algumas modalidades, o oligossacarideo e escolhido a partir dos Oligossacandeos 128 a 133, que sao especies da Formula IV:

Formula IV

[0059] Em algumas modalidade, k e uma mistura de a e 0 (isto e, o oligossacarideo e uma mistura de, por exemplo, oligossacandeos 128 e 129, 130 e 131, ou 132 e 133).

[0060] Em algumas modalidades, o oligossacarideo e escolhido a partir dos Oligossacandeos 134 e 135, que sao especies da Formula V:

[0061] Em algumas modalidades, o oligossacarideo e uma mistura dos Oligossacandeos 134 e 135).

[0062] Em algumas modalidades, o oligossacarideo e Oligossaca- ndeo 136, que e uma especie da Formula VI:

[0063] Em algumas modalidades, o oligossacandeo pode ser iso- lado de uma fonte natural. Um oligossacandeo isolado de uma fonte natural pode ser homogeneo ou pode ser uma mistura heterogenea de oligossacandeos relacionados.

[0064] Em certas modalidades, o oligossacandeo e preparado por sintese quimica e/ou enzimatica. Em algumas modalidades, um oligossacandeo pode ser preparado por modificagao quimica ou enzimatica de um oligossacandeo isolado de uma fonte natural ("semissinte- se").

[0065] Oligossacandeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou enzimaticamente conforme instruido nas, por exemplo, Figuras 1 a 7, Osborn et al., Oligosaccharides: Their Synthesis and Biological Roles, Oxford University Press, 2000; Wang et al. (eds), Synthesis of Carbohydrates through Biotechnology, American Chemical Society, 2004; Seeberger, Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrato Libraries, Wiley-lnterscience, 2001; Driguez et al., Glycoscience: Synthesis of Oligosaccharides and Glycoconjugatos, Springer, 1999; Duffels et al., Chem. Eur. J. 6:1416-1430 (2000); Hojo et al., Current Prot. Peptide Sci. 1:23-48 (2000); Seeberger et a., Nature 446:1046-1051 (2007); Seeberger et aL, Nature Rev. Drug Discov. 4:751-763 (2005); Srivastana et al., Carbohydrato Res. 161:195-210 (1987); e Hagihara etal., Chem. Rec. 6:290-302 (2006), e nas Patentes N°s U.S. 5.324.663; 6.156.547; 6.573.337; 6.723.843; 7.019.131; 7.160.517.

[0066] Em algumas modalidades, um oligossacandeo pode ser sintetizado por adipao sequencial de monossacandeos. Em certas modalidades, os monossacandeos podem ser adicionados a uma posiCao especifica (por exemplo, 2-0, 3-0, 4-0, ou 6-0) de um sacandeo existente por protepao e desprotepao seletiva. Por exemplo, o oligossacandeo 82 pode ser sintetizado conforme descrito na analise retros- sintetica na Figura 1, e nos esquemas sinteticos estabelecidos nas Figuras 2 a 7. Em algumas modalidades, o bloco de construpao 2a pode ser substituido pelo bloco de construpao 2 nos esquemas sinteticos das Figuras 3, 5 e 6. Se o bloco de construpao 2a for usado, a remopao do grupo de benzilideno do bloco de construpao 2 no estagio de heptassacandeos podera ser evitada.

[0067] Os residuos de manose podem ser fosforilados enzimati- camente conforme instruido em, por exemplo, Patente N° U.S. 6.905.856. Em certas modalidades, 1, 2, ou 3 dos residuos de M6P podem ser substituidos por simuladores de M6P resistentes a hidro- lase como, por exemplo, eteres de malonila, malonatos e fosfonatos, conforme instruido por Berkowitz et al., Org. Lett. 6:4921-4924 (2004).

[0068] Em certas modalidades, um ligador pode ser ligado a um sacandeo atraves de uma ligapao a a ou [3. Em algumas modalidades, uma ligapao a p pode ser formada pelos metodos descritos em Crich et al., Tetrahedron, 54:8321-8348 (1998); Kim et al, J. Am. Chem. Soc., 130:8537-8547 (2008); Srivasta et aL, Tetrahedron Letters, 35:3269-3272 (1979); Hodosi et aL, J. Am. Chem. Soc., 119:2335- 2336 (1997); Nicolaou et aL, J. Am. Chem. Soc., 119:9057-9058 (1997). Em uma modalidade, uma ligapao a p pode ser formada usando um oxido de dibutil estanho para formar um intermediario que pode ser reagido com um ligador contendo um grupo de saida inativado.

[0069] Uma modalidade fornece um metodo para preparar um composto tendo a Formula VII:

 Formula VIIem que:

[0070] Ri e escolhido a partir de hidrogenio, hidroxila, alquila inferior opcionalmente substituida, fosfato, sulfato, -OR7, um grupo de protegao e um sacarideo;

[0071] R2, R3, R4, e R5 sao, cada um, independentemente escolhidos a partir de hidrogenio, sulfato, hidroxila, -ORs, um grupo de protegao e um sacarideo;

[0072] Re e escolhido a partir de hidrogenio, hidroxila, carboxila, alcoxicarbonila, amino, amida, alquilamino, aminoalquila, aminoxi, hi- drazida, hidrazina, alquenila opcionalmente substituida e C2-C6 alquila opcionalmente substituida;

[0073] R7 e Rs sao, cada um, independentemente substituidos a partir de acetila e alquila inferior opcionalmente substituida; e

[0074] n e um numero inteiro de 1 a 10;compreendendo:a) tratar um composto tendo a Formula VIII:

Formula VIIIem que:

[0075] Ri ate Rs sao conforme definidos acima; e

[0076] Rg e R10 sao escolhidos a partir de hidrogenio e hidroxila,de modo que quando um dentre Rg e R10 for hidroxila, o outro sera hi- drogenio;

[0077] com um composto tendo a Formula RnRi2(Sn=O) para formar um composto tendo a Formula IX:

Formula IXem que:

[0078] Ri ate Rs sao conforme definidos acima; e

[0079] Rn e R12 sao, cada um, independentemente escolhidos a partir de alquila nao-substituida ou Rn e R12, tornados juntos, sao escolhidos a partir de alquileno nao-substituido;eb) tratar o composto da Formula IX, opcionalmente na presenga de um haleto de metal, com um composto tendo a Formula R6-(CH2)n-L, em que:

[0080] Re e n sao como definidos acima; e

[0081] L e um halogenio; para formar o composto da Formula VII.

[0082] "Optional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstancia subsequentemente descrito pode ou nao ocorrer e que a descrigao inclui casos em que o evento ou circunstancia ocorre e cases em que nao ocorre. Por exemplo, "alquila opcionalmente substitui- da" compreende tanto "alquila" como "alquila substituida" como defini- do abaixo. Ficara entendido por aqueles versados na tecnica, com re- lagao a qualquer grupo contendo um ou mais substituintes, que tais grupos nao se destinam a introduzir qualquer substituigao ou padroes de substituigao que sejam estericamente impraticaveis, sinteticamente nao viaveis e/ou inerentemente instaveis.

[0083] "Alquila" compreende cadeia linear e cadeia ramificada ten- do o numero indicado de atomos de carbono, geralmente de 1 a 20 atomos de carbono, por exemplo, 1 a 8 atomos de carbono. Por exemplo, Ci-Ce alquila compreende alquila de cadeia linear e ramifica- da de 1 a 6 atomos de carbono. Exemplos de grupos alquila incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, sec-butila, tert-butila, pentila, 2-pentila, isopentila, neopentila, hexila, 2-hexila, 3-hexila, 3-metilpentila e semelhantes. Alquileno e outro subconjunto de alquila, se referindo aos mesmos residuos como alquila, mas tendo dois pontos de ligagao. Os grupos alquileno geralmente terao de 2 a 20 atomos de carbono, por exemplo, 2 a 8 atomos de carbono, como 2 a 6 atomos de carbono. Por exemplo, Co alquileno indica uma ligagao covalente e C1 alquileno e um grupo metileno. Quando um residuo de alquila tendo um numero especifico de carbonos e nomeado, todos os isomeros geome- tricos tendo tai numero de carbonos devem ser compreendidos; assim, por exemplo, "butila" deve incluir n-butila, sec-butila, isobutila e t-butila; "propila" inclui n-propila e isopropila. "Alquila inferior" se refere a grupos alquila tendo de 1 a 4 carbonos.

[0084] "Alquenila" indica grupo alquila de cadeia linear ou ramifi- cada insaturada tendo pelo menos uma ligagao dupla carbono-carbono originada pela remogao de uma molecula de hidrogenio de atomos de carbono adjacentes da alquila principal. O grupo pode ser na configuragao cis ou trans sobre as ligagoes duplas. Grupos alquenila tipicos incluem, mas nao sao limitados a, etenila; propenilas como prop-1-en- 1-ila, prop-1-en-2-ila, prop-2-en-1-ila (alila), prop-2-en-2-ila; butenilas como but-1-en-1-ila, but-1-en-2-ila, 2-metil-prop-1-en-1-ila, but-2-en-1- ila, but-2-en-1-ila, but-2-en-2-ila, buta-1,3-dien-1-ila, buta-1,3-dien-2- ila; e semelhantes. Em algumas modalidades, um grupo alquenila tem de 2 a 20 atomos de carbono e em outras modalidades, de 2 a 6 atomos de carbono.

[0085] O termo "substituido", conforme usado aqui, significa de qualquer um ou mais hidrogenios no atomo ou grupo designado sao substituidos por uma selepao a partir do grupo indicado, desde que a Valencia normal do atomo designado nao seja excedida. Quando um substituinte for oxo (isto e, =0), 2 hidrogenios no atomo sao substituidos. As combinapoes de substituintes e/ou variaveis sao permitidas somente se tais combinapoes resultarem em compostos estaveis ou intermediarios sinteticos uteis. Um composto estavel ou estrutura estavel significa implicar um composto que e suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento de uma mistura de reapao, e formulapao subsequente como um agente tendo pelo menos utilidade pratica. Ex- ceto se especificado de outra forma, os substituintes sao nomeados na estrutura central. Por exemplo, deve ser entendido que quando (ciclo- alquil)alquila for listada como um possivel substituinte, o ponto de ligapao deste substituinte a estrutura central esta na porpao alquila.

[0086] O termo "alquila substituida", a menos que definido expres- samente de forma diversa, se refere a alquila em que um ou mais atomos de hidrogenio sao substituidos por um substituinte independentemente escolhido a partir de:

[0087] -Ra, -ORb, -O(Ci-C2 alquil)O- (por exemplo, metilenodioxi-), -SRb, -NRbRc, halo, ciano, oxo, nitro, sulfato, fosfato, -CORb, -CO2Rb, -CONRbRc, -OCORb, -OCO2Ra, -OCONRbRc, -NRcCORb, -NRcCO2Ra, -NRcCONRbRc, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRbRc, -NRcSO2Ra, etileno glicol, e polietileno glicol (PEG).

[0088] onde Ra e escolhido a partir de Ci-Ce alquila opcionalmente substituida, arila opcionalmente substituida, e heteroarila opcionalmente substituida;

[0089] Rb e escolhido a partir de hidrogenio, -NH2, -NHRC, Ci-Ce alquila opcionalmente substituida, arila opcionalmente substitui- da e heteroarila opcionalmente substituida; e

[0090] Rc e escolhido a partir de hidrogenio e C1-C4 alquila opcio- nalmente substituida; ou

[0091] Rb e Rc, e o nitrogenio ao qual sao ligados, formam um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituido; e

[0092] em que cada grupo opcionalmente substituido pode ser nao-substitufdo ou independentemente substituido por um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir de C1-C4 alquila, arila, heteroarila, aril-Ci-C4 alquila-, hetero- aril-Ci-C4 alquila-, C1-C4 haloalquila-, -OC1-C4 alqui-la, -OC1-C4 alquilfenila, -C1-C4 alquil-OH, -OC1-C4 haloalquila, halo, -OH, -NH2, -C1-C4 alquil-NH2, -N(CI-C4 alquil)(Ci-C4 alquila),-NH(CI-C4 alquila), -N(CI-C4 alquil)(Ci-C4 alquilfenila),-NH(CI-C4 alquilfenila), ciano, nitro, oxo (como um substituinte para heteroarila), -CO2H, -C(O)OCi-C4 alquila,-CON(CI-C4 alquil)(Ci-C4 alquila), -CONH(CI-C4 alquila), -CONH2, -NHC(O) (C1-C4 alquila), -NHC(O)(fenila),-N(CI-C4 alquil)C(O)(Ci-C4 alquila), -N (C1-C4 alquil) C(O)(fenila), -C(O)Ci-C4 alquila, -C(O)Ci-C4 fenila, -C(O) C1-C4 haloalquila,-OC(O)Ci-C4 alquila, -SO2(Ci-C4 alquila), -SO2(fenila), SO2(Ci-C4 haloalquila), -SO2NH2, -SO2NH(CI-C4 alquila), -SO2NH(fenila), -NHSO2(CI-C4 alquila), -NHSO2(fenila), e -NHSO2(CI-C4 haloalquila).

[0093] Em algumas modalidades, R1 e escolhido a partir de hidro- genio, alquila inferior opcionalmente substituida, fosfato, sulfato, -OR7, um grupo de protegao e um sacandeo. Em modalidades adicionais, R2, R3, R4, e Rs sao, cada um, independentemente escolhidos a partir de hidrogenio, sulfato, hidroxila, -ORs, um grupo de protegao e um sacari- deo. Em certas modalidades, R7 e Rs sao, cada um, independentemente escolhidos a partir de acetila e alquila inferior opcionalmente substituida. Em algumas modalidades, todos ou quaisquer dentre R1, R2, R3, R4, e Rs podem ser escolhidos a partir de grupos de protegao que podem ser seletivamente removidos, incluindo benzila, silila e eteres tritila e esteres exceto acetato. Em algumas modalidades, dois dentre Ri ate R5 tornados juntos formam um grupo de protegao. Em uma modalidade, R1 e escolhido a partir de -O-benzila e -OCF3. Em outra modalidade, pelo menos um dentre R2 ate R5 e -O-benzila. Em algumas modalidades, R1, R2, e R4 sao, cada um, -O-benzila. Em outra modalidade, R1 e -OCF3 e R4 e -O-benzila. Em uma modalidade, R11 e R12, tornados juntos formam hexametileno. Em outra modalidade, Rn e R12 sao, cada um, isopropila. Ainda em outra modalidade, Rn e R12 sao ambos hexila.

[0094] Em modalidades adicionais, o composto da Formula VIII e selecionado a partir de manose, rhamnose, idose e altrose opcionalmente protegidas. Em uma modalidade, 0 composto da Formula VIII e manose opcionalmente protegida. Em certas circunstancias, a manose pode ser protegida em um ou mais das posigoes C-3, C-4, ou C-6. Em alguns casos, um grupo de protegao unico pode ser ligado a duas posigoes. Por exemplo, um grupo benzilideno pode ser usado para proteger ambas as posigoes C-4 e C-6.

[0095] Geralmente, qualquer grupo de protegao no agucar que nao e fortemente eletrofilico ou reagente cruzado com compostos da Formula IX pode ser usado. Grupos de protegao adequados incluem eteres como eter de benzila, eter de tritila, eter de allila ou eter de silila opcionalmente substituido; esteres como acetato, benzoato, cloroace- tato, pivalato ou levulinato opcionalmente substituido; e acetais incluindo benzilideno, isopropilideno, e butano diacetal, entre outros. Alem disso, os grupos de protegao podem ser selecionados a partir de car- bamatos e uretanos. Em algumas modalidades, os grupos de protegao podem ser seletivamente removidos, como por exemplo, eteres de benzila, silila e tritila e esteres exceto acetato. As posigoes e identida- des dos grupos de protegao podem variar dependendo dos produtos finals desejados. Os grupos de protegao adicionais conhecidos por aqueles versados na tecnica podem ser usados em conformidade com as modalidades descritas aqui.

[0096] Em uma modalidade, o composto da Formula VIII e tratado com um composto tendo a Formula RnRi2(Sn=O), em que Rn e R12 sao ambos independentemente escolhidos a partir de alquila nao- substituida ou Rn e Ri2, tornados juntos, sao escolhidos a partir de al- quileno nao-substituido. Em algumas modalidades, Rn e R12 sao buti- la. Em uma modalidade, o composto tendo a Formula RnRi2(Sn=O) reage com o composto da Formula VIII em um solvente como tolueno, benzeno, dimetilformamida, isopropanol, metanol, ou xileno. Em algumas modalidades, a reapao e realizada em temperatura elevada, opcionalmente sob refluxo, para formar 0 composto da Formula IX. Em algumas modalidades, a mistura da reapao e aquecida ate pelo menos 40, 50, 60, 70, ou 80 °C. Em modalidades adicionais, o composto tendo a Formula RnRi2(Sn=O) reage com o composto da Formula VIII por pelo menos 1, 2, 5, 10, 15, ou 20 horas.

[0097] Em uma modalidade, o composto da Formula IX e tratado com um composto tendo a Formula R6-(CH2)n-L, opcionalmente na presenpa de um haleto de metal. Em algumas modalidades, Re e escolhido a partir de hidrogenio, hidroxila, carboxila, alcoxicarbonila, amino, amida, alquilamino, aminoalquila, aminoxi, hidrazida, hidrazina, alquenila opcionalmente substituida e C2-C6 alquila opcionalmente substituida. Em modalidades adicionais, n e um numero inteiro de 1 a 10. Em certas modalidades, n e 2, 3, 4, 5, ou 6, e Re e uma C1-C4 alcoxicarbonila. Em uma modalidade, n e 3, e Re e metoxicarbonila. Em algumas modalidades, L e um grupo de saida que nao esta ativado. Exemplos de grupos de saida ativados incluem triflatos, sulfonatos, tosilatos e outros grupos semelhantes. Em algumas circunstancias, um grupo de saida menos reagente pode ser ativado por grupos proximos como grupos alila. Em certas modalidades, Re nao contem um substituinte que ativa o grupo de saida. Em algumas modalidades, L e brometo, cloreto ou iodeto. Em uma modalidade, L e brometo. Em modalidades adicionais, o composto da Formula Re-(CH2)n-L e 4-bromobutirato de metila.

[0098] Em uma modalidade, o composto da Formula Ville manose opcionalmente protegida, e o composto da Formula Re-(CH2)n-L e 4- bromobu-tirato de metila. Em outra modalidade, o composto da Formula VIII e selecionado a partir de 3,4,6-tri-O-benzil-D-manose e 3-O-alil- 6-O-tritil-D-manose.

[0099] Em algumas modalidades, o composto da Formula IX e tratado com um composto tendo a Formula Re-(CH2)n-L na presenga de um haleto de metal. Certas modalidades de haletos de metal incluem fluoretos de metal. Em algumas modalidades, o fluoreto de metal e selecionado a partir de fluoreto de cesio, fluoreto de sodio, fluoreto de calcio, fluoreto de magnesio, fluoreto de litio e fluoreto de potassio. Em uma modalidade, o fluoreto de metal e fluoreto de cesio. Em algumas modalidades, o tratamento do composto da Formula IX com o composto da Formula Re-(CH2)n-L ainda compreende a adigao de haleto de tetra-alquilamonio. Em alguns casos, o haleto de tetra-alquilamonio e iodeto de tetrabutilamonio. Em modalidades adicionais, um haleto de metal pode ser usado na reagao. Exemplos de haletos de metal incluem iodetos de metal alcali como iodeto de sodio.

[00100] Em uma modalidade, o composto da Formula IX pode ser combinado com o composto da Formula Re-(CH2)n-L em um solvente aprotico polar. Tais solventes incluem dimetilformamida, dimetilacetamida, dimetisulfoxido, nitrometano, hexametilfosforamida, N- metilpirrolidona, acetona, acetonitrila, acetato de etila e metil etil ceto- na, entre outros conhecidos por aqueles versados na tecnica.

[00101] Em certas modalidades, o composto da Formula IX pode ser combinado com o composto da Formula R6-(CH2)n-L em temperature ambiente. Em outras modalidades, os reagentes sao combinados e aquecidos ate pelo menos 50, 60, 70, ou 80 °C para formar um composto da Formula VII. Em outras modalidades, a mistura e aquecida por pelo menos 1,2, 5, 10, 15, ou 20 horas.

[00102] Em algumas modalidades, os metodos descritos aqui resul- tam em pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, ou 99% de produto estere- oespecifico. Em modalidades adicionais, o rendimento do produto es- tereoespecifico e pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 99% do rendimento maximo possivel. Em certas modalidades, razao de produto de ligaCao beta a alfa e de no minimo 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, ou 100:1.

[00103] Em uma modalidade, um composto da Formula VII pode ser preparado em larga escala. Em algumas modalidades, "larga esca- la" se refere ao uso de pelo menos 50, 100, 500, ou 1000 gramas de um material de partida, intermediario ou reagente. Em modalidades adicionais, "larga escala" inclui o uso de pelo menos 10, 25, 50, 100, 250, ou 500 kg de material de partida, intermediario ou reagente.

[00104] Um esquema sintetico exemplar para preparer um composto da Formula A usando um reagente de oxido de dibutil estanho e mostrado na Figura 8.

B.Proteina

[00105] Os conjugados de proteinas-oligossacandeos descritos aqui podem compreender qualquer proteina pure, proteina parcialmen- te purificada ou fragmento da mesma, incluindo proteinas isoladas e proteinas recombinantemente ou sinteticamente produzidas. Os ter- mos "pure", "purificada" e "isolada" se referem a uma molecula que e substancialmente livre de seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteina e substancialmente livre de material celular e/ou outras prote- inas da celula ou fonte de tecido da qual foi originada. O termo se refe- re a preparagoes que sao, por exemplo, no minimo, 70% a 80%, 80% a 90%, 90 a 95%; ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (w/w) puras.

[00106] Em outras modalidades, a proteina pode ser uma enzima que tern uma atividade ideal, conforme medida por uma analise de atividade, em um pH que varia de 1 a 7, como, por exemplo, 1-3, 2-5, 3-6, 4-5, 5-6, ou 4-6. Por exemplo, a enzima pode ter um pH ideal que varia de 4-6.

[00107] Em algumas modalidades, a proteina pode ter um ponto isoeletrico (pl), que varia de 1 a 8, como, por exemplo, de 1-3, 2-5, 3-8, 4-5, 5-6, 4-6, 5-8, 6-8, or 7-8. O pl de uma proteina pode ser medido usando, por exemplo, eletroforese de gel com foco isoeletrico.

[00108] Em certas modalidades, a propria proteina tern pelo menos um oligossacandeo (isto e, ela e uma glicoproteina). Em modalidades especificas, a proteina e uma glicoproteina terapeutica. Por exemplo, a glicoproteina terapeutica pode ser uma enzima lisossomal, inclusive uma enzima ERT como, por exemplo, uma dentre as hidrolases lisos- somais listadas na Tabela 1. Em certas modalidades, a enzima lisossomal e escolhida a partir de, por exemplo, a-glucosidase (GAA), a-galactosidase A, sfingomielinase acida e a-L-iduronidase. Em modalidades especificas, a enzima lisossomal e GAA.Tabela 1: Exemplos de LSDs e Hidrolases Lisossomais Correspon- dentes

[00109] Em algumas modalidades, a proteina pode ser uma glico-proteina tendo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou mais oligossacandeos liga- dos a N ou O. Em outras modalidades, a proteina pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou mais locals de consenso para glicosilapao ligada a AZ ou O, dos quais pelo menos um e glicosilado.

[00110] Em certas modalidades, a proteina pode ser um ligador para um receptor. Por exemplo, em algumas modalidades a proteina pode ser uma glicoproteina que se liga a um receptor que reconhece um agucar como, por exemplo, manose ou manose-6-fosfato. Em modalidades especificas, a glicoproteina pode se ligar a, por exemplo, o receptor de asialoglicoproteina, CI-MPR, CD-MPR, ou ao receptor de manose.

[00111] Sequencias de proteinas adequadas sao bem-conhecidas na tecnica. Aqueles versados na tecnica podem imediatamente identi- ficar regides conservadas e motivos funcionais comparando sequencias relacionadas, inclusive, por exemplo, sequencias de especies diferentes. Os aminoacidos conservados sao mais provaveis de serem importantes para atividade; da mesma forma, os aminoacidos que nao sao conservados indicam regioes do polipeptideo que sao mais provaveis de tolerar variagao. Seguindo estas orientagoes, aqueles versados na tecnica podem identificar variantes funcionais atraves de nao mais do que esforgo de rotina. Alem disso, onde a estrutura de cristal for conhecida, aqueles versados na tecnica podem examinar a estrutura de cristal e identificar aminoacidos provaveis de serem importantes para estrutura e/ou fungao, e assim menos tolerantes do que mutagao. Aqueles versados na tecnica tambem seriam capazes de identificar aminoacidos provaveis de tolerarem variagao. Alem disso, aqueles versados na tecnica podem avaliar possiveis mutagoes em vista de re- lagoes de estrutura-fungao conhecidas.

[00112] Por exemplo, a sequencia e a estrutura de a-galactosidase sao bem-conhecidas. Ver, por exemplo, Garman et al., J. Mol. Biol., 337:319-335 (2004); Garman et al., Mol. Genet. Metabol., 77:3-11 (2002); Matsuzawa et al., Hum. Genet. 117: 317-328 (2005). Ver tambem Acesso GenBank N° X05790. Em outro exemplo, a sequencia de GAA e bem-conhecida (ver, por exemplo, Martiniuk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9641-9644 (1986); Hoefsloot et al., Biochem. J. 272:493-497 (1990); Moreland et aL, J. Biol. Chem. 280:6780-6791 (2005). Ver tambem Acesso GenBank N° NM_000152. Alem disso, a estrutura de cristal de uma a-glycosidase homologa a partir de E. coli foi determinada e pode fornecer visoes estruturais em outras a-glycosidases. Ver Lovering et al., J. Biol. Chem. 280:2105-2115 (2005). Em um terceiro exemplo, a sequencia de sfingomielinase acida e bem-conhecida (ver, por exemplo, Lansmann et aL, Eur. J. Biochem. 270:1076-1088 (2003)), assim como caracteristicas importantes da sequencia e estrutura de sfingomielinase acida. Ver, por exemplo, Seto et al., Protein Sci. 13:3172-3186 (2004); Qiu et al., J. Biol. Chem. 278:32744-32752 (2003); Takahashi et al., Tokohu J. Exp. Med. 206:333-340 (2005). Ver tambem Acesso de GenBank N° AI587087. Ainda em outro exemplo, a sequencia de a-L-iduronidase e bem- conhecida (ver, por exemplo, Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9695-9699 (1991); Scott et aL, Genomics 13:1311-1313 (1992)), assim como caracteristicas importantes de a-L-iduronidase. Ver, por exemplo, Scott et aL, Hum. Mutat. 6:288-302 (1995); Rempel et aL, Mol. Genet. Metab. 85:28-37 (2005); Durand etaL, Glycobiology 7.277- 284 (1997); Beesley et aL, Hum. Genet. 109:503-511 (2001); Brooks et aL, Glycobiology 11:741-750 (2001); Nieman et aL, Biochemistry 42:8054-8065 (2003). Em outro exemplo, a sequencia de iduronato-2- sulfatase e bem-conhecida, assim como mutagoes causadoras de do- engas. Ver, por exemplo, Flomen et aL, Hum. Mol. Genet. 2:5-10 (1993); Roberts et aL, J. Med. Genet. 26:309-313 (1989); Wison et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8531-8535 (1990); Wison et aL, Genomics 17:773-775 (1993); Sukegwa-Hayasaka et al., J. Inherit. Metab. Dis 29:755-761 (2006) e referencias nestes. A estrutura de iduronato- 2-sulfatase foi modelada. Ver, por exemplo, Kim et aL, Hum. Mutat. 21:193-201 (2003). Em outro exemplo, a sequencia e estrutura de N- acetilgalactosamina-4-sulfatase (arisulfatase B) sao conhecidas, assim como mutagoes causadoras de doengas. Ver, por exemplo, Litjens et aL, Hum. Mut. 1:397-402 (1992); Peters et aL, J. Biol. Chem. 265:3374-3381 (1990); Schuchman et aL, Genomics 6:149-158 (1990); Bond et aL, Structure 15:277-289 (1997).

B.Ligador

[00113] Em certas modalidades, os conjugados de proteinas- oligossacandeos da invenção compreendem um ligador entre os com-ponentes de oligossacandeos e proteinas do conjugado. Em outras modalidades, os conjugados nao incluem um ligador. Em modalidades compreendendo um ligador, qualquer ligador adequado conhecido por aqueles versados na tecnica pode ser usado, desde que nao interfira na ligagao do oligossacandeo a CI-MPR e/ou bloqueie a atividade (inclusive, por exemplo, atividade enzimatica) da proteina. Por exemplo, o ligador pode ser um dos ligadores divulgados na Patente N°s U.S. 4.671.958; 4.867.973; 5.691.154; 5.846.728; 6.472.506; 6.541.669; 7.141.676; 7.176.185; ou 7.232.805 ou na Pub. de Pedido de Patente N° U.S. 2006/0228348. Em algumas modalidades, o ligador e escolhi- do a partir de ligadores divulgados em W02008/089403.Em algumas modalidades, o ligador pode ter a formula:

[00114] em que Z e escolhido a partir de alquila, alquenila, alquinila, arila, etileno glicol, polietileno glicol (PEG) heteroarila e heterociclila opcionalmente substituida e P e escolhido a partir de hidrogenio ou um grupo de protegao amino. Conforme usado aqui, qualquer grupo qui- mico no composto aminooxi (como, por exemplo, alquila, alquenila, al- quinila, arila, heteroarila, heterociclila, aciloxi, alcoxi, ariloxi e heteroci- cliloxi) pode ser substituido ou nao-substituido, e pode ser interrompi- do por um ou mais heteroatomos ou grupos qufmicos, a menos que estabelecido de forma diversa. Heteroatomos de interruppao incluem nitrogenio, oxigenio e enxofre. Grupos quimicos substituintes e inter- ruptores podem ser escolhidos a partir de, por exemplo, acila, acilami- no, aciloxi, alquenila, alcoxi, alquila, alquinila, amido, amino, arila, ariloxi, azido, carbamoila, carboalcoxi, carboxi, ciano, cicloalquila, formila, guanidino, halo, heteroarila, heterociclila, hidroxi, iminoamino, nitro, oxo, fosfonamino, sulfinila, sulfonamino, sulfonato, sulfonila, tio, tioaci- lamino, tioureido e ureido. Os substituintes podem ser eles proprios substituidos ou nao-substituidos e podem ser interrompidos ou termi- nados por um ou mais heteroatomos como, por exemplo nitrogenio, enxofre e oxigenio.

[00115] Em uma modalidade, o ligador pode ser formado pela rea- pao com:

[00116] Em modalidade adicionais, o ligador pode ter a formula: -Z-NH-P

[00117] em que Z e P sao como definidos acima.

[00118] Em outra modalidade, o ligador pode confer uma ligapao de dissulfeto. Os ligadores de dissulfeto podem ser usados para ligar oli-gossacandeos a uma estrutura principal da proteina, por exemplo, atraves de uma cisteina. Em uma modalidade, o ligador pode compreender ou ser formado a partir de reapao com:

[00119] No geral, o ligador pode ter um comprimento adequado de modo que evite impedimento esterico entre os componentes de oligossacandeos e proteinas do conjugado, e nao interfere na ligaCao do oligossacandeo a CI-MPR e/ou na atividade (incluindo, por exemplo, atividade enzimatica) da proteina. Por exemplo, o ligador pode compreender 1-100, 1-60, 5-60, 5-40, 2-50, 2-20, 5-10, ou 5-20 atomos lineares, em que ligador e ligado a proteina e ao oligossacandeo por meio de uma ligapao a ester, amida, hidrazona, oxima, semicarbazona, eter, tioeter, fosforotiotato, fosfonato, tioester e/ou dissulfeto. Os atomos lineares restantes no ligador sao, por exemplo, escolhidos a partir de carbono, oxigenio, nitrogenio e enxofre, qualquer um dos atomos opcionalmente pode ser incluido em um anel carbociclico, heterociclico, arila ou heteroarila. Os atomos de carbono lineares no ligador opcionalmente podem ser substituidos por um substituinte escolhido a partir de halo, hidroxi, nitro, haloalquila, alquila, alcarila, arila, aralquila, alcoxi, ariloxi, amino, acilamino, alquilcarbamoila, arilcarbamoila, aminoal- quila, alcoxicarbonila, carboxi, hidroxialquila, alcanossulfonila, arenos- sulfonila, alcanossulfonamido, arenossulfonamido, aralquisulfonamido, alquilcarbonila, aciloxi, ciano e urefdo. Um atomo de nitrogenio linear no ligador pode ser opcionalmente substituido por acila, sulfonila, alquila, alcarila, arila, aralquila, alcoxicarbonila. Um atomo de enxofre linear no ligador pode opcionalmente ser oxidado.

[00120] Em certas modalidades, o ligador pode ser clivavel, conforme divulgado na Pub. de Pedido de Patente N° U.S. 2006/0228348 e Patentes N°s U.S. 4.867.973; 7.176.185; 7.232.805. Em algumas modalidades, o ligador pode ser clivavel sob condigoes lisossomais.

B. Metodos para Preparagao de um Conjugado de Protei-nas-Oligossacarideos

[00121] Os conjugados da invenção, como, por exemplo, os conjugados compreendendo os oligossacandeos da Formula I, II, III, IV, V, ou VI podem ser preparados por qualquer um dos metodos conhecidos por aqueles versados na tecnica. Em qualquer um destes metodos, um ligador adequado pode estar presente em um dentre ou ambos o oli- gossacandeo e a proteina. Por exemplo, os conjugados podem ser preparados conforme descrito em, por exemplo, Zhu et aL, Biochem. J. 389:619-628 (2005); Zhu et aL, J. Biol. Chem. 279:50336-50341 (2004); Patentes N°s U.S. 5.153.312; 5.212.298; 5.280.113; 5.306.492; 5.521.290; 7.001.994; Pedido de Patente Provisorio N° U.S. 60/885.457, ou 60/885.471.

[00122] Em certas modalidades, o oligossacarideo pode ser conju- gado a um aminoacido de uma proteina, como cisteina ou lisina. Por exemplo, o sacandeo por ser conjugado atraves de uma lisina modifi- cando os residues de lisina na proteina com 4-formilbenzoato de suc- cinimidila. Alem disso, o sacarideo pode ser conjugado atraves de uma lisina por modificagao das lisinas com reagente de Traut ou ligadores incluindo dissulfetos como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) ou tiois protegidos como N-Succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA).

[00123] Em modalidades adicionais, o oligossacarideo pode ser conjugado a um glicano em uma glicoproteina. Em uma modalidade, o oligossacarideo pode ser conjugado a um residuo de acido sialico em um glicano. Em outras modalidades, o oligossacarideo pode ser conjugado a manose, fucose, galactose, e/ou residues de acido sialico em um glicano. Para conjugagao atraves de galactose, a glicoproteina pode ser primeira tratada com sialidase para remover residues de acidos sialicos, e em seguida tratada com oxidase de galactose antes da reagao com o oligossacarideo.

[00124] Por exemplo, o conjugado de proteinas-oligossacandeos pode ser preparado pela reagao de qualquer grupo funcional que pos- sa estar presente (inclusive, por exemplo, uma amina, um tiol, um acido carboxilico, uma hidroxila) e/ou introduzido em uma proteina com um segundo grupo funcional adequado em um oligossacandeo. Os metodos para a introdugao de grupos funcionais sao bem-conhecidos na tecnica. Por exemplo, uma glicoproteina tendo pelo menos um grupo carbonila pode ser obtida pela oxidagao de tal glicoproteina com, por exemplo, periodato (por exemplo, periodato de sodio) ou com oxidase de galactose. Em outro exemplo, um grupo carbonila pode ser introduzido pelo uso de um sistema de expressao tendo um codigo genetico expandido, como descrito em, por exemplo, Wang et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003). Ver tambem, por exemplo, Pub. de Pedido de Patente N° U.S. 2006/0228348, que descreve a introdugao de grupos reagentes em uma glicoproteina.

[00125] Em algumas modalidades, a glicoproteina e oxidada com periodato antes da conjugagao com um oligossacandeo modificado com um ligador contendo um grupo carbonila reagente. Exemplos de grupos carbonila reagentes incluem aminoxi, hidrazina, ou hidrazida, entre outros. Em certas modalidades, a glicoproteina e oxidada com cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, ou 22,5 mM de periodato. Em certas modalidades, a glicoproteina e oxidada sob condigoes suficientes para oxidar residues de acido sialico nos glicanos de glicoproteina e minimizar oxidagao de fucose e manose. Em modalidades exemplares, a concentragao de periodato usada e em menos de cerca de 2, 3, 4, ou 5 mM. Em uma modalidade, o periodato e periodato de sodio.

[00126] Em certas modalidades, os agregados de proteina forma- dos durante a conjugagao podem ser removidos usando varios metodos de cromatografia. Em uma modalidade, pode ser empregada cromatografia de interagao hidrofobica (HIC). Exemplos de colunas de HIC incluem Butil 650C e 650M, Hexil 650C, Fenil 6FF, Capto Octil e Capto Fenil. Em outras modalidades, os agregados podem ser removidos por cromatografia de quelagao de metal, como cobre, niquel, co- balto ou mercuric. Em uma modalidade, uma coluna de cobre pode ser usada em modo ligagao-e-eluto ou fluxo de passagem. Exemplos de tampdes de eluigao incluem glicina ou imidazol. Em algumas modalidades, a agregagao e reduzida em 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90%. Em modalidades adicionais, o conjugado contem menos de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, ou 3% de agregado.

B.Conjugados

[00127] Os componentes de oligossacandeo e protefna podem ser, por exemplo, qualquer oligossacandeo e proteina descritos aqui. Em certas modalidades, o conjugado de proteinas-oligossacarideos e um conjugado de glicoproteinas-oligossacandeos. Em algumas modalidades, o conjugado de proteinas-oligossacarideos e um conjugado de enzimas lisossomais de oligossacandeos.

[00128] Em algumas modalidades, o conjugado compreende um oligossacandeo escolhido a partir dos oligossacandeos das Formulas I a VI. Em certas modalidades, o conjugado compreende uma media de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or 1-2, 1-3, 1-4, 1-6, 2-4, 2-10, 2-12, 4-6, 3-8, 5-6, 5-10, 5-15, 5-20, 10-15, IQ- 20, 12-15, 12-18, ou 15-20 moleculas de oligossacandeo por glicopro- teina. Em algumas modalidades, o conjugado compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 moleculas de oligossacandeo por molecula de proteina. Em modalidades adicionais, o conjugado compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 mols de M6P por mol de proteina.

[00129] Em certas modalidades, o conjugado exibe atividade com- pleta (como atividade enzimatica), em comparagao a proteina nao con- jugada. Em outras modalidades, o conjugado pode exibir pelo menos, por exemplo, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de atividade relative a proteina nao conjugada. Analises para medir atividade, inclusive atividade enzimatica, sao bem-conhecidas na tecnica. Ver, por exemplo, Eisenthal et aL, Enzyme Assays: A Practical Approach, Oxford University Press: New York, 2002. Analises para medir atividade de enzimas lisossomais sao descritas em, por exemplo, Li et aL, Clin. Chem. 50:1785-1796 (2004); Civallero et aL, Clin. Chim. Acta 372:98-102 (2006). Uma analise exemplar para medir a atividade de GAA e descrita no Exemplo 6. Ver tambem van Diggelen et aL, J. Inherit. Metab. Dis. 28:733-741 (2005) (descrevendo uma analise para atividade de sfingomielinase acida); Downing et aL, Plant Bio- technol. 4:169-181 (2006) (descrevendo uma analise para a atividade de aDL-iduronidase); Voznyi et aL, J. Inherit. Metab. Dis. 24:675-80 (2001) (descrevendo uma analise para a atividade de iduronato-2- sulfatase); Murray et aL, Mol. Genet. Metab. 90:307-312 (2007) (descrevendo uma analise para a atividade de a-galactosidase A); Brooks et aL, J. Inher. Metab. Dis. 14:5-12 (1991) (descrevendo uma analise para a atividade de /V-acetilgalactosamina-4-sulfatase).

[00130] Em certas modalidades, o conjugado e internalizado mais eficientemente por uma celula-alvo (por exemplo, atraves de endocito- se mediada por CI-MPR) do que a proteina nao-conjugada correspon- dente. Por exemplo, o conjugado pode ser internalizado mais eficientemente do que a proteina nao-conjugada por, por exemplo, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, ou 200% (mol/mol) em um determinado periodo de tempo. Em outras modalidades, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, ou 1000 vezes (mol/mol) tanto quanto do conjugado pode ser internalizado por um tipo celular de interesse (como, por exemplo, celulas de mioblasto L6 ou celulas de fibroblasto Pompe hu- manas (NIGMS Repositorio Celular Genetico Humano, Cat. N° GM20005) relativas a proteina nao-conjugada, em um determinado periodo de tempo. O periodo de tempo de referencia pode ser, por exemplo, 10, 30, 45 minutos ou 1, 2, 3, 5, 6, 12, 24, 48, ou 72 horas ou mais. A absorpao in vitro nas celulas de mioblasto L6 pode ser determinada conforme descrito em, por exemplo, Exemplo 6 e Zhu et aL, J. Biol. Chem. 279:50336-50341 (2004).

[00131] Em certas modalidades, o conjugado exibe aumento de ligapao a CI-MPR relative a proteina nao-conjugada. Por exemplo, o conjugado pode exibir pelo menos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1.000 ou 10.000 vezes afinidade melhorada a CI-MPR, relativa a proteina nao conjugada, por exemplo, por comparapao das constantes de associapao ou dissociapao da proteina conjugada e nao conjugada. A ligapao a CI-MPR pode ser medida como descrito em, por exemplo, Exemplo 5 e Zhu et aL, J. Biol. Chem. 279:50336-50341 (2004).

[00132] Em certas modalidades, o conjugado pode exigir nenhum aumento na absorpao pelo receptor de manose relativa a proteina nao- conjugada, ou menos de 5, 10, 15, 20, 30, 40, ou 50% de absorpao pelo receptor de manose relativa a proteina nao conjugada. A absorpao pelo receptor de manose em celulas de macrofagos alveolares de rato pode ser determinada in vitro conforme descrito em, por exemplo, Zhu et aL, Biochem. J. 389:619-628 (2005).

[00133] Em certas modalidades, o conjugado pode exibir, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, ou 1000 vezes redupao nos niveis de um substrato acumulado de uma enzima meta- bolicamente defeituosa em um modelo animal adequado. Por exemplo, a redupao de niveis de glicogenio em um modelo de camundongo Pompe pode ser medida como descrito em, por exemplo, Zhu et aL, J. Biol. Chem. 279:50336-50341 (2004). Como alternativa, um modelo de codorna Pompe descrito em, por exemplo, Kikuchi et aL, J. Clin. Invest. 101:827-33 (1998), pode ser usado. Em outro exemplo, a redugao de glicosaminoglicanos armazenados no figado e bago pode ser determinada em um modelo felino de mucopolissacaridose I conforme descrito em Kakkis et aL, Mol. Genet. Metab. 72:199-208 (2001). Alem disso, a redugao de niveis de globotriaosilceramida pode ser determinada em um modelo de camundongo Fabry, conforme descrito em, por exemplo, loannou et aL, Am. J. Hum. Genet. 68:14-25 (2001). Ainda em outro exemplo, a redugao de niveis de sfingomielina pode ser determinada em modelo murino de doenga de Niemann-Pick dos tipos A e B, conforme descrito em, por exemplo, Horinouchi et aL, Nat. Genet. 10:288-293 (1995).

II. Composigdes Farmaceuticas

[00134] Em algumas modalidades, a invenção fornece o uso de um conjugado de proteinas-oligossacarideos compreendendo (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo de qualquer uma das Formulas I a VI na fabricagao de um medicamento para tratar um disturbio de armaze- nagem lisossomal em um individuo que necessite do mesmo.

[00135] Como as composigoes farmaceuticas descritas aqui compreendem um conjugado de proteinas-oligossacarideos, como descrito supra, e pelo menos um aditivo como um preenchedor, agente volu- moso, desintegrante, tampao, estabilizante ou excipiente. Em algumas modalidades, as composigoes farmaceuticas da invenção compreendem um conjugado compreendendo um oligossacandeo de quaisquer das Formulas I a VI e uma enzima lisossomal.

[00136] As tecnicas de formulagao farmaceutica padrao sao bem- conhecidas por aqueles versados na tecnica (ver, por exemplo, 2005 Fysicians’ Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Farmacy, 20th ed., Gennado et aL, Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000). Aditivos farmaceuticos adequados incluem, por exemplo, manitol, amido, glico- se, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, cal, silica-gel, es- tearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sodio, lei- te desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol e semelhan- tes. As composipoes podem tambem conter reagentes de tampona- gem de pH e agentes secantes ou emulsificantes. As composipoes podem ou nao conter conservantes.

[00137] Em algumas modalidades, composigoes farmaceuticas compreendendo conjugados de a-galactosidase A podem compreender um ou mais excipientes como, por exemplo, manitol, mono-hidrato monobascio de fosfato de sodio, e/ou hepta-hidrato dibasico de fosfato de sodio. Em algumas modalidades, as composipoes farmaceuticas compreendendo conjugados de a-glucosidase podem compreender um ou mais dentre: manitol, polissorbato 80, hepta-hidrato dibasico de fosfato de sodio e mono-hidrato monobasico de fosfato de sodio. Em outra modalidade, as composigoes farmaceuticas compreendendo conjugados de a-glucosidase podem compreender 10mM de Histidina de pH 6,5 com ate 2% de glicina, ate 2% de manitol e ate 0,01% de polissorbato 80.

[00138] A composipao farmaceutica pode compreender qualquer um dos conjugados descritos aqui como o composto ativo sozinho ou em combi napao com outro composto ou material biologico. Por exemplo, a composipao farmaceutica pode tambem compreender uma ou mais moleculas pequenas uteis para o tratamento de um LSD e/ou um efeito colateral associado a LSD. Em algumas modalidades, a composipao pode compreender miglustato e/ou um ou mais compostos descritos em, por exemplo, Pub. de Pedido de Patente N°s U.S. 2003/0050299, 2003/0153768; 2005/0222244; ou 2005/0267094. Em algumas modalidades, a composipao farmaceutica pode tambem compreender um ou mais imunossupressores.

[00139] A formulapao de composipoes farmaceuticas pode variar dependendo das vias de administrapao pretendidas e outros parametros (ver, por exemplo, Rowe et al., Handbook of Farmaceutica! Excipients, 4th ed., AFA Publications, 2003.) Em algumas modalidades, a composiCao pode ser um bolo ou po liofilizado branco a esbranquipado nao-pirogenico e esteril a ser administrado atraves de injepao intrave- nosa mediante reconstituipao com Agua Esteril para Injepao, USP. Em outras modalidades, a composipao pode ser uma solupao nao- pirogenica e esteril.

[00140] A administrapao de uma composipao farmaceutica descrita aqui nao e limitada a qualquer sistema de distribuipao especifica e pode incluir, sem limitapao, administrapao parenteral (inclusive injepao subcutanea, intravenosa, intracranial, intramedular, intra-articular, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal), transdermica ou oral (por exemplo, em capsulas, suspensoes ou comprimidos). A administrapao a um individuo pode ocorrer em uma dose unica ou em administrapoes repetidas, ou em qualquer variedade de formas de sais fisiologicamen- te aceitaveis, e/ou com um veiculo farmaceuticamente aceitavel e/ou aditivo como parte de uma composipao farmaceutica.

[00141] Sais farmaceuticamente aceitaveis incluem, por exemplo, anions de acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitarta- rato, brometo, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloreto, citrato, dicloridrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromidrato, cloridrato, hidroxinaftoato, iodeto, isetionato, lactato, lacto- bionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, brometo de metila, nitrate de metila, sulfato de metila, mucato, napsilato, nitrate, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/disfosfato, poligalacturonato, salicila- to, estearato, subacetato, succinate, sulfato, tanato, tartarato e teocla- to/trietiodeto; cations de benzatina, cloroprocaina, colina, dietanolami- na, etilenodiamina, meglumina, e procaina (organica); e cations de aluminio, calcio, litio, magnesio, potassio, sodio e zinco (metalico). Sais farmaceuticamente aceitaveis tambem incluem aqueles sais descritos em, por exemplo, Berge et aL, J. Farm. Sci. 66:1-19 (1977).

[00142] Os conjugados descritos aqui sao administrados em quantidades terapeuticamente eficazes. Geralmente, uma quantidade tera- peuticamente eficaz pode variar com a idade do individuo, condiCao geral e sexo, bem como a gravidade da condiCao medica no individuo. A dosagem pode ser determinada por um medico e ajustada, conforme necessario, para se adequar aos efeitos observados do tratamento. A toxicidade e eficacia terapeutica de tais compostos podem ser deter- minadas por procedimentos farmaceuticos padrao in vitro e/ou in vivo. A razao de dose entre os efeitos toxicos e terapeuticos e o indice terapeutico (ou razao terapeutica), e pode ser expressa como a razao LD50/ED50, em que LD50 e a dose letal para 50% da populaCao e ED50 e a dose terapeuticamente eficaz em 50% da populaCao. Os conjugados da invenCao podem exibir indices terapeuticos de pelo menos, por exemplo, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 20.

[00143] Os dados obtidos a partir de analise in vitro e estudos animais, por exemplo, podem ser usados na formulaCao de uma variaCao de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos fica, preferencialmente, em uma variaCao de concentraQoes circu- lantes que incluem ED50 com baixa, pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nesta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administraCao utilizada. A dose terapeuticamente eficaz de qualquer conjugado pode ser estimada inicialmente a partir de analises in vitro. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcanQar uma faixa de concentraCao de plasma circulante que inclui IC50 (isto e, a concentraCao do conjugado teste que alcanQa uma inibiCao meio-maxima de sintomas) como determinado em expe- rimentos in vitro. Os niveis em plasma podem ser medidos, por exem- plo, por cromatografia liquida de alto desempenho ou por uma analise de atividade enzimatica apropriada. Os efeitos de qualquer dosagem especifica podem ser monitorados por uma bioanalise de pontos finals.

[00144] A menos que indicado de outra forma, os conjugados podem ser administrados em uma dose de aproximadamente 1 pg/kg a 500 mg/kg, dependendo da gravidade dos sintomas e da progressao da doenga. Por exemplo, os conjugados podem ser administrados por infusao intravenosa lenta em um cenario de paciente ambulatorial a cada, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais dias ou por exemplo, administragao semanal, bissemanal, mensal ou bimensal. A dose terapeuticamente eficaz apropriada de um composto e selecionada por um clinico de tratamento e iria variar aproximadamente de 1 pg/kg a 500 mg/kg, del pg/kg a 10 mg/kg, de 1 pg/kg a 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 100 pg/kg, de 100 pg a 1 mg/kg, e de 500 pg/kg a 5 mg/kg. Em algumas modalidades, a dose terapeutica e escolhida a partir de, por exemplo, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, e 100 mg/kg.

[00145] Os conjugados compreendendo a-galactosidase A podem ser administrados por infusao intravenosa a uma dose de, por exemplo, 1,0 mg/kg de peso corporal a cada duas semanas ou quatro se- manas a uma taxa de infusao, por exemplo, inferior ou igual a 10, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 mg/hora). Em outro exemplo, os conjugados compreendendo a-glucosidase podem ser administrados por injegao intravenosa a uma dose de, por exemplo, 20 mg/kg ou 40 mg/kg a cada duas ou quatro semanas, por aproximadamente, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 horas. Em algumas modalidades, a taxa de administragao de a-glucosidase pode ser iniciada a, por exemplo, 1 mg/kg/hr e em se- guida elevada em, por exemplo, 2 mg/kg/hr a cada 30 minutos, apos estabelecer tolerancia do individuo a taxa de infusao, ate um maximode, por exemplo, 7 mg/kg/hr. Os conjugados compreendendo N- acetilgalactosamina-4-sulfatase podem ser administrados por infusao intravenosa a uma dose de, por exemplo, 1,0 mg/kg de peso corporal a cada semana por aproximadamente, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 horas. Alem disso, exemplos de dosagens especificas podem ser encontrados em Fysicians’ Desk Reference®.

III. Metodos para Tratar Disturbios de Armazenagem Lisossomal

[00146] Em algumas modalidades, a invenção fornece metodo de tratar disturbios de armazenagem lisossomal, como, por exemplo, aqueles divulgados na Tabela 1. Em algumas modalidades, a invenção ainda fornece metodos para alvejar proteinas ao lisossomo pela conjugagao com oligossacandeos compreendendo manose-6-fosfato.

[00147] Em certas modalidades, os metodos compreendem admi- nistrar a um individuo (onde um individuo inclui, por exemplo, um mamifero como ser humano, gato, cachorro, camundongo ou rato ou um passaro, por exemplo, uma codorna) tendo um disturbio de armazenagem lisossomal em um conjugado de proteinas-oligossacandeos da invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz. O conjugado de proteinas-oligossacandeos pode ser um conjugado de uma glicoproteina, como uma enzima lisossomal (por exemplo, uma enzima lisossomal listada na Tabela 1), com um oligossacandeo compreendendo manose-6-fosfato, como um oligossacandeo de qualquer uma das Formulas I a IV. Em uma modalidade, o metodo compreende ad- ministrar a um individuo que precise uma composigao farmaceutica que compreende pelo menos um dos conjugados da invenção.

[00148] Em certas modalidades, os metodos compreendem admi- nistrar conjugados que compreendem (1) uma proteina e (2) um oligossacandeo compreendendo manose-6-fosfato, como um oligossacandeo de qualquer uma das Formulas I a VI com uma ou mais outras terapias. Uma ou mais outras terapias podem ser administradas ao mesmo tempo (inclusive administragao simultanea como uma formulaCao combinada), antes ou apos a administragao dos conjugados.

[00149] Em algumas modalidades, os metodos compreendem tratar um individuo (antes, apos ou durante o tratamento com um conjugado descrito aqui) com um antipiretico, anti-histamina e/ou imunossupres- sor. Em algumas modalidades, um individuo pode ser tratado com um antipiretico, anti-histamina e/ou imunossupressor antes do tratamento com um conjugado de proteinas-oligossacarideos para diminuir ou im- pedir reagoes associadas a infusao. Por exemplo, os individuos podem ser pre-tratados com um ou mais dentre acetaminofeno, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, difenidramina, metotrexato, micofenola- to mofetila, esteroides orais ou rapamicina.

[00150] Em algumas modalidades, os metodos compreendem tratar os individuos com um ou mais dentre acetaminofeno, azatioprina, ci-clofosfamida, ciclosporina A, difenidramina, metotrexato, micofenolato mofetila, esteroides orais ou rapamicina a ou cerca de, por exemplo, t = 0 (o tempo de administragao do conjugado) e/ou t = 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, e 144 horas para, por exemplo, as primeiras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais incidencias de tratamento com um conjugado. Por exemplo, em algumas modalidades um individuo com doenga de Fabry ou doenga de Pompe pode ser tratado com metotrexato (por exemplo, com 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 mg/kg de metotrexato, ou mais) a ou cerca de, por exemplo, t = 0, 24 e 48 horas para, por exemplo, as primeiras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas de tratamento com um conjugado. Em algumas modalidades, a tolerancia imune para conjugados pode ser induzida em um individuo com um disturbio de arma- zenagem lisossomal como, por exemplo, mucopolissacaridose I, por tratamento com ciclosporina A e azatioprina. Por exemplo, o individuo pode ser tratado com ciclosporina A e azatioprina como descrito em Kakkis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:829-834 (2004).

[00151] Em algumas modalidades, os metodos compreendem tratar um indivfduo (antes, apos ou durante o tratamento com um conjugado) com terapia por moleculas pequenas e/ou terapia de genes, incluindo terapia por moleculas pequenas e terapia de genes direcionada ao tratamento de um disturbio de armazenagem lisossomal. A terapia por moleculas pequenas pode compreender a administrapao de miglustato e/ou mais compostos descritos em, por exemplo, Pub. de Pedido de Patente N°s U.S. 2003/0050299, 2003/0153768; 2005/0222244; e 2005/0267094. A terapia de genes pode ser realizada como descrito em, por exemplo, Patentes N°s U.S. 5.952.516; 6.066.626; 6.071.890; e 6.287.857; e Pub. de Pedido de Patente N° U.S.. 2003/0087868.

[00152] Os termos "tratamento", "metodo terapeutico" e seus cog- natos se referem a ambos tratamento terapeutico e medidas profilati- cas/preventivas. Assim, aqueles necessitando de tratamento podem incluir individuos ja tendo um disturbio de armazenagem lisossomal especifico bem como aqueles em risco da doenpa (isto e, aqueles que sao provaveis de acabar adquirindo a doenpa ou certos sintomas do disturbio).

[00153] Metodos terapeuticos resultan na prevenpao ou melhora de sintomas ou um outro resultado biologico desejado, e podem ser avali- ados por melhora de sinais clinicos ou infcio tardio da doenpa, aumen- to de atividade da enzima metabolicamente defeituosa, e/ou diminui- pao de niveis do substrate acumulado da enzima metabolicamente defeituosa.

[00154] Em algumas modalidades, os metodos compreendem ad- ministrar conjugados compreendendo (1) uma enzima lisossomal e (2) um oligossacarideo de qualquer Formula de I a VI a um individuo, au- mentando assim a atividade de enzima lisossomal deficiente no indivi- duo em, por exemplo, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%, relativa a atividade endo- gena. Em algumas modalidades, os metodos compreendem adminis- trar conjugados compreendendo (1) uma enzima lisossomal e (2) um oligossacandeo das Formulas I a VI a um individuo, aumentando assim a atividade enzimatica deficiente no individuo em, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, or 1000 vezes, relativa a atividade endogena. O aumento de atividade enzimatica pode ser determinado por, por exemplo, uma redugao nos sintomas clini- cos ou por uma analise clinica ou biologica apropriada.

[00155] Em algumas modalidades, os metodos compreendem ad- ministrar conjugados da invenção compreendendo GAA a um individuo, desta forma tratando a doenga de Pompe (tambem conhecida como deficiencia de a-glucosidase acida, deficiencia de maltase acida, doenga de armazenagem de glicogenios do tipo II, glicogenose II, e deficiencia de a-glucosidase lisossomal). Em certas modalidades, GAA (rhGAA) humano recombinante e preparado nas celulas de ovario de hamster chines (OHO). Em modalidades adicionais, rhGAA pode ser conjugado com um oligossacandeo a partir do Oligossacandeo 103; uma mistura de 103 e Formula A; Oligossacandeos 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou 136; e qualquer combinagao destes. Em uma modalidade, o oligossacandeo e escolhido a partir dos oligossacandeos 128 e 136. Em modalidades adicionais, um conjugado contendo pelo menos 5 mols da Formula A por mol de GAA e administrado a um paciente.

[00156] Em certas modalidades, o paciente e um adulto que foi di- agnosticado como tendo doenga de Pompe. Em outras modalidades, o paciente e um recem-nascido ou crianga.

[00157] O aumento de atividade de GAA pode ser determinado por observagao bioquimica (ver, por exemplo, Zhu et al., J. Biol. Chem.279: 50336-50341 (2004)) ou histologica de acumulo de glicogenios lisossomais reduzidos em, por exemplo, miocitos cardiacos, miocitos esqueletais, ou fibroblastos de pele. A atividade de GAA tambem pode ser analisada em, por exemplo, uma amostra de biopsia de musculo, em fibroblastos de pele cultivados, em linfocitos, e em manchas de sangue seco. Analises de manchas de sangue seco sao descritas em por exemplo, Umpathysivam et aL, Clin. Chem. 47:1378-1383 (2001) and Li et aL, Clin. Chem. 50:1785-1796 (2004). O tratamento da doenga de Pompe pode tambem ser analisado por, por exemplo, niveis se- ricos de quinase de creatinina, ganhos em fungao motora (por exemplo, conforme analisado pela Escala Motora Infantil de Alberta), mudangas no indice de massa ventricular esquerdo conforme medido por ecocardiograma e atividade eletrica cardiaca, conforme medido pelo eletrocardiograma. A administragao de conjugados de GAA tambem pode resultar em redugao em um ou mais sintomas da doenga de Pompe como cardiomegalia, cardiomiopatia, sonolencia diurnal, dis- pneia exercional, deficiencia no crescimento, dificuldades de alimenta- gao, "moleza", alteragoes no andar, dores de cabega, hipotonia, orga- nomegalia (por exemplo, o alargamento do coragao, lingua, figado), lordose, perda de equilibrio, dor lombar, dor de cabega matinal, fra- queza muscular, insuficiencia respiratoria, escapula alada, escoliose, diminuigao dos reflexos profundos, apneia do sono, suscetibilidade a infecgoes respiratorias e vbmito.

[00158] Em outras modalidades, os metodos compreendem admi- nistrar conjugados compreendendo a-galactosidase A a um individuo, tratando assim doenga de Fabry. Doenga de Fabry ou doenga de Anderson-Fabry e um disturbio de armazenagem lisossomal ligado a X, raro marcado por uma deficiencia de a-galactosidase A, e resulta em acumulo de globotriaosilceramida (GL3) e outros glicosfingolipideos neutros nos lisossomos de tecidos viscerais e endoteliais, periteliais e celulas musculares. O acumulo dos glicosfingolipideos neutros na vasculature resulta em estreitamento e dilatapao dos vasos sanguineos, e porfim em isquemia e infarto.

[00159] A administrapao de conjugados da invenpao compreendendo a-galactosidase A pode resultar em redupao em um ou mais sinto- mas clinicos de doenpa de Fabry, incluindo, e.g. por exemplo, acropa- restesia, angina, arritmia angioqueratoma, ataxia da marcha, queima- pao e/ou dor formigante nas maos e pes, catarata, intolerancia ao frio, disturbios de condupao, verticilo corneo, doenpa arterial coronariana, demencia, depressao, diarreia, camaras cardiacas dilatadas, to nt u res , cardiomegalia, miocardiopatia, diplopia, disartria, fadiga, febre, com taxa de sedimentapao de eritrocitos elevada, problemas de audipao, doenpas cardiacas, problemas nas valvulas cardiacas, intolerancia ao calor, hemiataxia, hemiparesia, hipo-hidrose, transpirapao diminuida, infarto, isquemia, dor nas articulapoes, doenpa renal, hipertrofia ventricular esquerda, anormalidades lenticulares, opacidade lenticular, lipi- duria, fraqueza muscular, infarto do miocardio, nauseas, nistagmo, dor (por exemplo, dor intensa que irradia por todo o corpo), polidipsia, proteinuria, dor pos-prandial, insuficiencia renal, disturbios da retina, zum- bido nos ouvidos, dor de estomago, mudanpas de ondas ST-T, o der- rame, uremia, doenpa valvular, vertigem, vomitos e fraqueza. A administrapao de conjugados de a-galactosidase A pode resultar em aumento de atividade de a-galactosidase A em, por exemplo, plasma, lagrimas, leucocitos, tecidos submetidos a biopsia ou fibroblastos de pe- le cultivados. A administrapao de conjugados de a-galactosidase A tambem pode resultar em uma descoberta histologica de uma redupao (por exemplo, de pelo menos 10%) ou falta de aumento de globulos de lipideos birrefringentes. Tambem pode resultar em diminuipao nos globules de lipideos em sedimento urinario, melhora de funpao renal como medido por niveis de creatinina serica ou liberapao de creatinina e proteinuria reduzida. A administrapao de conjugados de a-galactosidase A pode tambem resultar em uma redupao em inclu- soes de GL3 no endotelio capilar do rim, corapao e pele. Analises adicionais para medir a eficacia do tratamento para doenpa de Fabry podem ser encontradas em, por exemplo, MacDermott et aL, J. Med. Genet. 38:750-760 (2001).

[00160] Em outras modalidades, os metodos compreendem admi- nistrar conjugados da invenpao compreendendo sfingomielinase acida a um individuo, tratando assim doenpa de Niemann-Pick A ou Nie- mann-Pick B, ou deficiencia de sfingomielinase acida. A administrapao de conjugados de sfingomielinase acida pode resultar em um ou mais sintomas clinicos de doenpa de Niemann-Pick A ou Niemann-Pick B inclusive, por exemplo, niveis de colesterol anormais, niveis de lipi- deos anormais, ataxia, anormalidades sanguineas, manchas verme- Ihas no olho, infecpoes pulmonares frequentes, retardo no crescimen- to, hepatosplenomegalia, numero baixo de plaquetas, linfadenopatia, neuropatia periferica, problemas com funpao pulmonar, falta de ar, mudanpas na pigmentapao da pele ou xantomas. Em algumas modalidades, os conjugados podem ser administrados intracraniamente.

[00161] Em outras modalidades, os metodos compreendem admi- nistrar conjugados da invenpao compreendendo a-L-iduronidase a um individuo, tratando assim mucopolissacaridose I (inclusive, por exemplo, formas de Hurler e Hurler-Scheie de MPS I). A administrapao de conjugados de a-L-iduronidase pode resultar na redupao em um ou mais sintomas clinicos de MPS I incluindo, por exemplo, regurgitapao aortica, estenose aortica, sindrome do tunel do carpo, rinite cronica, perda auditiva condutiva, constipapao, opacificapao da cornea, atraso no desenvolvimento, diarreia, distensao abdominal, quifose dorsolom- bar, deformidade de gibosidade nas costas, hepatoesplenomegalia, hidrocefalo, hernia inguinal, quifose, retardo mental , insuficiencia mitral, estenose mitral, cegueira noturna, glaucoma de angulo aberto, fungao da mao insuficiente, artropatia progressiva, infecgoes respirato- rias recorrentes, insuficiencia respiratoria, degeneragao da retina, es- coliose, perda auditiva neurossensorial, dores nas costas, coriza, ap- neia do sono, compressao da medula espinhal, atrofia tenar, hernia umbilical e complicagoes das vias aereas superiores.

[00162] Ainda em outras modalidades, os metodos compreendem administrar conjugados da invenção compreendendo iduronato-2- sulfatase a um individuo, tratando assim mucopolissacaridose II (doenga de Hunter). A administragao de conjugados de iduronato-2- sulfatase pode resultar em redugao em um ou mais sintomas clmicos de MPS II incluindo, por exemplo, doenga valvular cardiaca, insuficiencia cardiopulmonar, sindrome de tunel do carpo, diarreia cronica, papi- ledema cronico, caracteristicas facials grosseiras, opacidades cornea- nas, estreitamento das arterias coronarias, surdez, dismorfismo, disos- tose, infecgoes de ouvido, deficiencia auditiva, hepatoesplenomegalia, hidrocefalo, hernias inguinais, rigidez articular, quifoscoliose, retardo mental, doenga miocardica, espessamento do miocardio, hipertensao pulmonar, disfungao da retina, anomalias esqueleticas, hernias umbili- cais, infecgoes do trato respiratorio, e disfungao valvular.

[00163] Ainda em outras modalidades, os metodos compreendem administrar conjugados da invenção compreendendo N- acetilgalactosamina-4-sulfatase (arisulfatase B) a um individuo, tratando assim mucopolissacaridose VI (sindrome de Maroteaux-Lamy). A administragao de conjugados de /V-acetilgalactosamina-4 pode resultar em redugao de um ou mais sintomas clmicos de MPS VI incluindo, por exemplo, cegueira, alteragoes cardiacas, doenga cardiopulmonar, caracteristicas facials grosseiras, opacificagao da cornea, infecgoes de ouvido, retardo de crescimento, hepatomegalia, hepatoesplenomegalia, deformidades articulares, smdromes de compressao nervosa, difi- culdades respiratorias, deformidades esqueleticas, compressao da medula espinhal, esplenomegalia, articulapoes rigidas, e superior obs- trupao das vias aereas.

[00164] A descripao anterior e a seguinte sao apenas para fins de exemplos e explicapdes e nao restringem a invenpao, conforme reivin- dicado.

EXEMPLOS Exemplo 1. Procedimentos Gerais em Sintese de Oligossacari- deos A.Glicosilacao:

[00165] As reapoes de glicosilapao foram realizadas usando metodos padrao combinando um sacandeo doador e um sacandeo receptor. Rapidamente, os compostos doador e receptor foram dissolvidos em DCM anidro sob nitrogenio seco na presenpa de peneiras molecu- lares 4A ativadas por calor a menos que indicado de outra forma. A solupao foi resfriada e mantida a 0 °C por ~30 min, seguida de adipao lenta de TMSOTf (1 eq). As reapoes foram verificadas por TLC (silica- gel) usando hexanos/EtOAc e extintas com TEA ou base de Hunig (1,05 eq). As misturas foram filtradas e concentradas ate formar xaro- pes e purificadas por cromatografia de coluna rapida usando gradien- tes de hexanos ZEtOAc a menos que indicado de outra forma.

B.Desacetilacao catalisada por acido:

[00166] Em certos exemplos, os compostos acetilados sao desace- tilados antes de glicosilapao ou outras modificapdes como fosforilapao. Nos exemplos fornecidos abaixo, o cloreto de hidrogenio foi gerado pela adipao de cloreto de acetila para metanol seco frio (0 °C). A solupao concentrada foi adicionada a uma solupao de 1:3 do composto acetilado em DCM/metanol. A concentrapao final foi 3% p/v com rela- pao ao componente de metanol da solupao. As reapoes de desacetila- pao foram feitas por: a) ~18 h para acetatos primaries e b) ~48-64 h para acetatos secundarios. As reagoes foram extintas com TEA ou base de Hunig seguida de uma extragao aquosa a partir de DCM ou EtOAc a menos que indicado de outra forma.

C.Fosforilacao:

[00167] Em alguns exemplos, os sacarfdeos sao submetidos a fos- forilagao de local especlfico. A uma solugao do sacarideo em acetonitrila seca em temperatura ambiente foi adicionado 5-metiltetrazol (3,4 eq), e a mistura foi agitada por 30 minutos sob nitrogenio. Dibenzildi- isopropilfosforamidita (1,7 eq por grupo de OH) foi adicionado e agita- do ate a reagao ficar completa (~60 min). As reagoes foram verificadas por TLC (sllica-gel) usando hexanos/EtOAc. A solugao foi resfriada em gelo/agua por 15 minutos e 30% p/v de peroxido de hidrogenio (2 eq) foram adicionados. Apos ~60 minutos, a reagao foi completa e tiossul- fato de sodio saturado em excesso foi adicionado. A mistura foi concentrada ate virar uma goma, dissolvida em EtOAc, lavada com salmoura semissaturada e seca em sulfato de sodio. O residuo foi purificado por cromatografia de coluna rapida usando gradientes de hexa- nos/EtOAc, a menos que indicado de outra forma.Exemplo 2: Sintese de dissacandeo amino-oxiacetamido 2-O-[6-O- fosforil-a-D-manosil]-a-D-manosideo de propila (17)

[00168] a-D-manosideo de alila foi preparado de acordo com o metodo descrito em Pekari et al,, J. Org. Chem. 66:7432 (2001). Ao a-D- manosldeo de alila (8,68 g, 39,4 mmols) em metanol anidro (100 mL) foram adicionados 2,3-butanodiona (3,63 mL, 86,1 mmols), ortoformia- to de trimetila (16 mL, 146 mmols) e 10-(+)-acido canforsulfonico (1,37 g, 5,9 mmols). A mistura foi aquecida sob refluxo por 9 horas sob nitrogenio seco. A mistura da reagao foi extinta com TEA (1 mL) e concentrada ate formar um xarope vermelho e purificada por cromatografia de coluna em sflica-gel usando EtOAc em hexanos 40 - 80%, fornecendo 3-O,4-O-[dimetoxibutan-2’,3’-diil]-a-D-manosfdeo de alila 1 como um solido branco (3,89 g, 29,4%).

[00169] O Composto 1 (2,65 g, 8 mmols) foi dissolvido em piridina seca (20 mL), a solugao foi resfriada em um banho de gelo/agua, e cloreto de t-butildifenisilila (2,28 mL, 8,7 mmols) foi adicionado. Apos 18 horas, piridina (20 mL) e anidrido acetico (1,6 mL, 16 mmols) foram adicionados e a solugao foi aquecida ate 50 °C por 16 horas, em seguida concentrada ate formar um xarope e extraida com tolueno. O residue foi dissolvido em EtOAc (60 mL) e lavado com 1M de HCI (2 x 50 mL), bircarbonato de sodio saturado (50 mL) e seco em sulfato de sodio. A mistura foi filtrada e concentrada sob vacuo e a solugao foi concentrada, fornecendo 2-O-acetil-6-O-t-butildifenisilil-3-O,4-O [dimetoxi- butan-2’,3’-diil]-a-D-manosideo de alila 2 como um xarope (5,0 g).

[00170] Cloreto de paladio (II) (0,425 g, 2,4 mmols) foi adicionado em uma solugao de 2 (5,0 g, 8 mmols) em metanol anidro (25 mL), com agitagao. Depois de aproximadamente 3 h a reagao foi interrom- pida com TEA (0,75 mL, 4,8 mmols). O metanol foi removido sob pressao reduzida e o resfduo foi purificado por cromatografia em coluna de silica usando EtOAc em hexanos 10 - 50%, produzindo 2-O-acetil-6- O-t-butildifenisilil-3-O,4-O [dimetoxibutan-2’,3’-diil]-a-D-mansfdeo 3 como uma espuma branca (2,72 g, 59,2%).

[00171] Tricloroacetonitrila (1,75 mL, 17,4 mmols) e DBU (0,05 mL, 0,35 mmol) foram adicionados em 3 (1,0 g 1,74 mmol) em DCM anidro (1 mL). Depois de aproximadamente 75 min, a solugao foi diretamente purificada por cromatografia em coluna de silica usando EtOAc em hexanos (0 ate 30%), rendendo 2-O-acetil-6-O-t-butildifenisilil-3-O,4-O [dimetoxibutan-2’,3’-diil]-a-D-manose tricloroacetimidato 4 como uma espuma branca (0,98 g, 78,2%). O doador 4 (0,98 g, 1,36 mmol) e o receptor 3-/V-benziloxicarbonilaminopropanol (0,284 g, 1,36 mmol) foram convertidos para o procedimento geral de glicosilapao do Exemplo 1, produzindo 2-O-acetil-6-O-f-butildifenisilil-3-O,4-O [dimetoxibutan- 2’,3’-diil]-a-D-manosideo de N-benziloxicarbonilaminopropila 5 como uma espuma branca (0,66 g, 64%).

[00172] Para uma solupao de 5 (0,66 g, 0,87 mmol) em metanol anidro (5 mL) foram adicionados 25% p/v metoxido de sodio em metanol (0,05 mL, 0,22 mmol). Depois de aproximadamente 1 h, a reapao foi interrompida com acido acetico glacial (0,025 mL) e concentrada ate um xarope. O produto foi dissolvido em DCM (10 mL), lavado com salmoura semissaturada (5 mL) e seca sobre sulfato de sodio para produzir uma espuma branca 6-O-t-butildifenisilil-3-O,4-O [dimetoxibu- tan-2’,3’-diil]-a-D-manosfdeo de /V-benziloxicarbonilaminopropila 6 (0,58 g, 92%).

[00173] a-D-manosideo de alila (3,15 g, 14,3 mmols) foi dissolvido em piridina anidro (20 mL) e resfriada em um banho de gelo/agua. Cloreto de t-Butildifenisilila (4,03 mL, 15,7 mmols) foi adicionado e a solupao foi deixada atingir a temperatura ambiente. Depois da agitapao por 18 h, foi adicionado cloreto de benzoila (5,93 mL, 51,5 mmols), e apos 24 horas a reapao foi extinta com agua (3 mL) e agitada por 30 minutos. A solupao foi concentrada sob vacuo e extraida com tolueno (3 x 50 mL). O residuo foi dissolvido em EtOAc (100 mL), lavado com 1M de HCI (50 mL) frio, salmoura semissaturada (50 mL), carbonato de hidrogenio de sodio semissaturado (50 mL), salmoura semissaturada (50 mL) seco em sulfato de sodio, filtrada e concentrada ate formar um xarope. Foi purificado por cromatografia de coluna em silica-gel usando EtOAc em hexanos 0 - 50%, fornecendo 2,3,4-tri-O-benzoil-6-O-t- butildifenisilil-a-D-manosfdeo de alila 7 como uma espuma branca (8,62 g, 78,2%).

[00174] Acido acetico glacial (11,1 mL, 18,26 mmols) e 1M de fluoreto de tetrabutilamonio (18,26 mL, 18,26 mmols) foram adicionados a uma solugao de 7 (12,77 g, 16,6 mmols) em THF seco (50 mL). Em 80 minutos, acido acetico glacial (0,15 mL, 2,5 mmols) e 1M de fluoreto de tetrabutilamonio (2,5 mL, 2,5 mmols) foram adicionados, e em 90 minutos mais acido acetico glacial (0,25 mL, 4,15 mmols) e 1M de fluoreto de tetrabutilamonio (4,15 mL, 4,15 mmols). Apos 2 horas a solugao foi concentrada ate metade do volume e dilufda com EtOAc (150 mL). A solugao foi lavada com salmoura semissaturada (2 x 150 mL) e bicarbonate de sodio semissaturado (200 ml), concentrada, e o residue foi purificado por cromatografia de coluna rapida em silica-gel com EtOAc em hexanos 10-50%, fornecendo 2,3,4-tri-O-benzoil-a-D- manosideo de alila 8 como uma espuma branca (6,75 g, 76,4%). O composto 8 (6,75 g, y mmol) foi convertido de acordo com o procedimento geral de fosforilagao fornecendo 2,3,4-tri-O-benzoil-6-O- dibenzilfosforil-a-D-9 manosideo de alila como uma espuma branca (9,52 g, 95%).

[00175] Cloreto de paladio (II) (0,638 g, 3,6 mmols) foi adicionado a uma solugao de 9 (9,52 g, 12,1 mmols) em metanol seco (50 mL). Depois de 5h ~ mais paladio (II) (0,145 g) foi adicionado e a mistura foi armazenada por 18h . A solugao foi filtrada, concentrada, e o resfduo foi purificado por coluna de cromatografia rapida de silica-gel com EtOAc em hexanos 20-70%, proporcionando 2,3,4-tri-O-benzoil-6-O- dibenzilfosforil-a-D- manose 10 como uma espuma branca (3,8 g, 42,5%). Tricloroacetonitrila (5,06 mL, 5,1 mmols) e DBU (0,15 mL, 1 mmol) foram adicionados a uma solupao de 10 (3,8 g) em DCM seco sob nitrogenio seco a 0 0 C. Apos aproximadamente 90 minutos, a soluCao foi diretamente purificada por cromatografia de coluna rapida em silica-gel com EtOAc em hexanos 10-60%, fornecendo tricloroacetimi- dato de 2,3,4-tri-O-benzoil-6-O-dibenzilfosforil-a-D-manosideo 11 como uma espuma branca (3,3 g, 72,1%).

[00176] O doador 6 (2,62 g, 2,97 mmols) e o receptor 11 (1,92 g, 2,7 mmols) foram convertidos de acordo com o processo de glicosila- pao geral do Exemplo 1, fornecendo N-2-O-[2,3,4-tri-O- ] benzoil-6-O- dibenzilfosforil-a-D-manosil-6-Ot-butildifenilsilil-3-O dimetoxibutan,4-O [2 ', 3'-diil]-a-D manosideo de benziloxicarbonilaminopropila 12 como uma espuma branca (1,27 g, 32,2%)

[00177] TFA/agua 19:01 v/v (8,4 mL) foi adicionada a uma solupao de 12 (2,1 g, 1,44 mmol) em DCM (8 mL) resfriado em um banho de gelo/ agua. Apos ~ 2 h o material de partida foi consumido como mostrado por TLC. O etanol (25 mL) foi adicionado a solupao, entao concentrada e extraida com etanol (3 x 25 mL). O residuo foi dissolvido em metanol seco (10 mL) e resfriado em banho de gelo/agua. Cloreto de acetila (0,4 mL) foi adicionado, proporcionando uma solupao a 3% p/v em HCI. A solupao foi permitida aquecer ate temperatura ambiente. Apos ~ 2 h o material de partida foi consumido como mostrado por TLC. A reapao foi extinta com trietilamina (1 mL), concentrada, e o residue foi purificado por cromatografia de coluna rapida em silica-gel com EtOAc em hexanos 3-10% para fornecer 13 como uma espuma branca (0,758 g, 47,9%). Para 13 (0,758g, 0,69 mmol) em metanol anidro (10 mL) foram adicionados 25% p/v de metoxido de sodio em metanol (0,15 mL). Apos ~ 1 h o material de partida foi consumido, conforme mostrado por TLC. A reapao foi extinta com 1M de HCI, fornecendo 14. Para a solupao foi adicionado acido acetico glacial (Pipetar 25), umedecido a 10% de Pd/C (0,1 g), e um balao de hidrogenio foi anexado. Apos 6 h de reapao do produto carbonizado com 5% de acido sulfurico/ EtOH mas nao era ativo a UV. A mistura foi filtrada e concentrada ate formar um oleo, em seguida, dissolvida em agua (10 mL) e liofilizada para fornecer 2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil]-a-D- ma- nosideo de 3-aminopropila 15 (0,300 g, 91,3% de 13).

[00178] Uma solupao de NaOH a 0,1 M (0,2 mL) foi adicionada a uma solupao de 15 (0,1 g, 0,21 mmol) em agua (8,5 mL), seguida de 2,3,5,6 N-t-butoxicarbonil-amino-oxiacetila - tetrafluorofenilato (0,14 g, 0,42 mmol) em THF (8,5 mL). Apos 18 h, a solupao foi ajustada para pH 4 com 2M de HCI , e a solupao foi extraida com DCM (3x10 mL). A fase aquosa foi liofilizada, fornecendo 2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil]- a-D-manosideo de N-t-butoxicarbonil-amino-oxiacetamidopropila 16 (0,12 g). O composto 16 (0,12 g) foi dissolvido em 1: 1 TFA/DCM (10 mL) e a solupao foi agitada por aproximadamente 30 minutos, depois concentrada ate formar um oleo. Foi dissolvida em agua (5 mL) e o produto liofilizado, fornecendo uma base solida (0,45g). O solido foi purificado usando Biogel ® P2 e eluido com agua para fornecer 17 (0,063 g).Exemplo 3: Sintese de trissacandeo (35)

[00179] tricloroacetimidato de 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzil-a-D- manose 18 foi preparado conforme descrito em Yamazaki et aL, Carb.Res. 201:31 (1990).

[00180] tricloroacetimidato de 6-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzoil-a-D- manose 19 foi preparado conforme descrito em Heng et aL, J. Carb.Chem. 20:285 (2001).

[00181] Doador 19 (5,0 g, 7,4 mmols) e receptor N-9- fluorenilmetilcarbonilamino propanol (2,41 g, 8,1 mmols) foram conver- tidos de acordo com o procedimento geral de glicosilaCao produzindo 6-O-acetil-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de N-9- fluorenilmetilcarbonilaminopropila 29 como uma espuma branca (4,0 g, 66,4%).

[00182] Composto 29 (4,0 g, 4,9 mmols) foi convertido de acordo com o procedimento geral para desacetilapao catalisada por acido de acetatos secundarios (b) produzindo 2,3,4-tri-O-benzoil-a-D- manosideo de A/-9-fluorenilmetilcarbonilaminopropila 30 como uma espuma branca (3,3 g, 87,3%). O Doador 18 (3,27 g, 5,16 mmols) e receptor 30 (3,3 g, 4,3 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilapao produzindo 6-O-[2-O-acetil-3,4,6-tri-O- benzilmanosil]-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de N-9- fluorenilmetilcarbonilaminopropila 31 como uma espuma branca (4,94 g, 92,7%).

[00183] Composto 31 (4,94 g, 3,96 mmols) foi convertido de acordo com o procedimento geral para desacetilapao catalisada por acido de acetatos secundarios (b) produzindo 6-O-[3,4,6-tri-O-benzilmanosil]- 2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de N-9-fluorenilmetilcarbonilaminopropila 32 como uma espuma branca (1,73 g, 36%). O Composto 11 foi preparado de acordo com o metodo do exemplo 2. O Doador 11 (3,37 g, 3,74 mmols) e receptor 32 (1,73 g, 1,44 mmol) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilapao produzindo 33 como uma espuma branca (1,2 g, 43,1%).

[00184] Para uma solugao de 33 (1,2 g, 0,62 mmol) em THF anidro (10 mL) foram adicionados dodeciltiol (1,48 mL, 6,2 mmols) e Diazabi- cicloundec-7-eno (DBU) (0,093 mL, 0,62 mmol). Depois de aproxima-damente 18 h o material de partida foi consumido conforme mostrado por tic. A solugao foi concentrada ate um xarope e purificada por cromatografia em coluna de silica-gel usando metanol em DCM 0 - 20% . Foram adicionados no produto metanol/agua 1:1 (20 mL) e acido acetico (25 pL) e Pd/C (0,1 g) e uma balao de hidrogenio foi anexado. Depois de 18 horas a solugao foi filtrada atraves de Celite e concentrada ate uma espuma branca. A espuma branca foi dissolvida em metanol anidro (10 mL) e 25% p/v metoxido de sodio em metanol (0,15 mL ) depois de 6 h a solugao foi concentrada e colocada em agua (10 mL) e lavada com DCM (10 mL). A fase aquosa foi liofilizada produzindo 6-O- ([a-D-manosil]-2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil])-a-D-manosideo de ami- nopropila 34 (0,27 g, 63,5% de 33) como o sal de dissodio.

[00185] Para uma solugao de 34 (0,17 g, 0,3 mmol) em agua/DMSO 1:1 (10 mL) entao 2,3,5,6-tetrafluorfenilato de /V-t-butoxicarbonilamino- oxiacetila (0,34 g, 1,14 mmol) em DMSO (2 mL) e 3-Hidr6xi-1,2,3- benzotriazin-4(3H)-ona (DHBT) (0,09 g, 0,6 mmol) em DMSO (1 mL) foram adicionados. Depois de 24 horas a solugao foi purificada em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas produzindo um solido. Este foi dis- solvido em TFA /DCM (8 mL) e foi agitado por 60 min e entao concentrado em um oleo. Agua (5 mL) foi adicionada e o produto foi purificado em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verifi- cadas em placas de silica-gel por carbonizapao e as frapoes selecio- nadas foram armazenadas e liofilizadas produzindo 35 (0,033 g, 16,4% de 34).Exemplo 4: Sintese de tetrassacarideosA.[2-Q-[6-Q-fosforil-a-D-manosil1-a-D-manosil] glutamato de amino-oxiacetamido 1,5-di-3-amidopropila (28)

[00186] Composto 19 foi preparado de acordo com o metodo descrito no Exemplo 3. O Doador 19 (15,49 g, 24,3 mmols) e o receptor 3- N-9-fluorenilmetoxicarbonilaminopropanol (8,7 g, 29,19 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilapao pro-duzindo 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosideo de N-9- fluorenilmetoxicarbonilaminopropila 20 como uma espuma branca (10,55 g, 55%).

[00187] Cloreto de acetila (4,8 mL, 63 mmols) foi adicionado gota a gota para uma solupao de 20 (10,5 g, y mmol) em DCM anidro (50 mL) e metanol anidro (100 mL) durante aproximadamente 30 min, produzindo uma solupao de 2,3% p/v de HCI em metanol. Depois de aproximadamente 18 h a reapao foi interrompida com a base de Hunig (9,81 mL, 63 mmols) e um adicional de 1,5 mL foi inclufdo. A solupao foi concentrada ate um xarope, extrafda com cloroformio (2 x 50 mL), dissolvida em DOM (100 mL) e lavada com solupao salina semissaturada (100 mL) e seca sobre sulfato de sodio. A solupao foi concentrada e purificada por cromatografia em coluna de silica-gel com EtOAc em hexanos 0 - 100% para produzir uma espuma branca 3,4,6-tri-O- benzil-o-D-manosideo de /V-9-fluorenilmetoxicarbonilaminopropila 21 (6,11 g, 61,2%). O Doador 21 (6,11 g, 13,4 mmols) e receptor 11 (7,1 g, 7,9 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilapao produzindo 2-O-[6-O-dibenzilfosforil-2,3,4-tri-O-benzoil- a-D-manosil]-3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosideo de N-9- fluorenilmetoxicarbonilaminopropila 22 como uma espuma branca (5,8 g, 50,1%).

[00188] Para uma solupao de 22 (5,8 g, 3,96 mmols) em THF anidro (75 mL) foram adicionados dodeciltiol (9,53 mL, 40 mmols) e DBU (0,6 mL, 4 mmols). Depois de aproximadamente 4 h a reapao foi interrompida com HCI metanolico (5,6 mL, 8 mmols) e concentrada ate um xarope. O produto foi triturado com dietil eter produzindo 2-O-[2,3,4-tri-O- benzoil-a-D-manosil]-3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manos(deo de cloridrato de 3-aminopropila 23 como uma goma (3,77 g, 74,5%).

[00189] Para uma solupao de 23 (3,77 g, 2,95 mmols) em acetonitri- la anidro (50 mL) foram incluidos acido N-benziloxicarbonil glutaminico (0,3661 g, 1,3 mmol), N-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0,4g, 2,95 mmols), DBU (4,6 mL, 4 mmols), e 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) (0,75 g, 8,85 mmols). Depois de 16 horas a base de Hunig (0,25 mL) foi inclufda seguida por mais EDC (0,75 g, 8,85 mmols). Depois de 21 horas a solugao foi concentrada ate um xarope e purificada por cromatografia em coluna de silica-gel usando 10% de 2-propanol em DCM contra DCM 0 - 50% produzindo 1,5-di-[3-amidopropil 2-O-[2,3,4- tri-O-benzoil-6-O-dibenzilfosforil-a-D-manosil]-3,4,6-tri-O-benzil-a-D- manosil] glutamato de /V-benziloxicarbonilamino 24 como uma espuma branca (0,97 g, 11,2%).

[00190] Para uma solugao de 24 (0,912 g, 0,33 mmol) em DCM anidro (20 mL) e metanol (25 mL) foram incluidos 25% p/v metoxido de sodio em metanol (0,09 mL, 0,41 mmol). Depois de aproximadamente 6,5 h a reagao foi interrompida com 1M de HCI ( 0,41 mL, 0,41 mmol) e concentrada ate um xarope e purificada por cromatografia em coluna de silica-gel usando 10% de 2-propanol em DCM contra DCM 0 - 100%, produzindo [2-O-[6-O-dibenzilfosforil-a-D-manosil]-3,4,6-tri-O- benzil-a-D-manosil] glutamato de /V-benziloxicarbonilamino 1,5-di-3- amidopropila 25 (0,306 g, 44,4%).

[00191] Para uma solugao agitada de 25 (0,3 g, 0,144 mmol) em THF/agua 2:1 v/v (75 mL), molhada com 10% de Pd/C (0,052 g) e um balao de hidrogenio foi anexado. Depois de 16 horas acido acetico glacial (25 pL) foi inclufdo, e um balao de hidrogenio fresco foi anexado. Depois de 6 horas mais 10% de Pd/C (0,04 g) foram incluidos e mais hidrogenio. Depois de 18 horas 5% de Pc/C (0,05g) fresco foram incluidos e mais hidrogenio. Depois de 24 horas o produto carbonizado com 5% de acido sulfurico/EtOH mas nao era ativo por UV. A mistura foi filtrada atraves de celite, e a almofada foi concentrada ate aproximadamente 30% para remover o THF, entao liofilizada para produzir [2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil]-a-D-manosil] glutamato de 1,5-di-3- amidopropila 26 (0,121 g, 77,9%).

[00192] 2,3,5,6-tetrafluorfenilato de /V-t-butoxicarbonilamino- oxiacetila (0,19 g, 0,57 mmol) em DMSO (1 mL) e 3,4-Di-hidro-3- hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (DHBT) (0,052 g, 0,3 mmol) em DMSO (1 mL) foram adicionados para uma solugao de 26 (0.16 g, 0,15 mmol) em agua/DMSO 1:1 (7,5 mL). Depois de 18 horas a solugao foi purificada em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas, produzindo [2-O- [6-O-fosforil-a-D-manosil]-a-D-manosil] glutamato de N-t- butoxicarbonilamino-oxiacetamido 1,5-di-3-amidopropila 27 (0,095 g, 42,1%). Para o composto 27 foi incluido TFA/DCM 1:1 (8 mL) e a mistura foi agitada ate dissolver (aproximadamente 60 min), entao concentrada ate um oleo. Agua (10 mL) foi incluida e o produto foi purificado em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas produzindo 28 (0,048 g, 54,2%).B.6-Q-([a-D-manosill-6-Q-[a-D-manosill-2-Q-[6-Q-fosforil-a-D- manosilD-a-D-manosideo de Amino-oxiacetamidopropila (47)

[00193] Composto 11 foi preparado conforme descrito no exemplo 2. O Doador 11 (5,0 g, 7,4 mmols) e receptor 3-N- benziloxicarbonilaminopropanol (1,93 g, 9,25 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilapao do exemplo 1, produzindo uma espuma branca. O produto foi convertido de acordo com o procedimento geral para desacetilapao catalisada por acido dos acetatos primaries, produzindo 2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosfdeo de /V-benziloxicarbonilaminopropila 36 como uma espuma branca.

[00194] Doador 19 (4,47 g, 6,6 mmols) e receptor 36 (3,6 g, 5,3 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilaCao do exemplo 1, produzindo 6-O-([6-O-acetil-2,3,4-tri-O- benzoil-a-D-manosil])-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de N- benziloxicarbonilaminopropila 37 como uma espuma branca (3,8 g, 63,3%). O Composto 37 (3,8 g, 3,17 mmols) foi convertido de acordo com o procedimento geral para desacetilapao catalisada por acido dos acetatos primarios, produzindo 6-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]- 2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de A/-benziloxicar-bonilaminopropila 38 como uma espuma branca (3,5 g, 95,3%).

[00195] Composto 18 foi preparado de acordo com o metodo descrito em Yamazaki et aL, Carb. Res. 201:31 (1990). O Doador 18 (2,41 g, 3,75 mmols) e receptor 38 (3,5 g, 3 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosilapao do exemplo 1, produzindo 6-O-([2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-6-O-[2-O-acetil-3,4,6-tri- O-benzil-a-D-manosil])-2,3, 4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de N- benziloxicarbonilaminopropila 39 como um oleo (5,63 g). Composto 39 (5,83 g) foi convertido de acordo com o procedimento geral para desa-cetilapao catalisada por acido de acetatos secundarios (ver Exemplo1), produzindo 6-O-([2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-6-O-[3,4, 6-tri-O- benzil-a-D-manosil])-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-mano-sideo de /V- benziloxicarbonil-aminopropila 40 como uma espuma branca (2,0 g, 41,9% de 38). O Doador 19 (1,07g , 1,63 mmol) e receptor 41 (2,0 g, 1,3 mmol) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de glicosila?ao, produzindo 6-O-([2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-6-O- [3,4, 6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[6-O-acetil-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D- manosil])-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de N-benziloxicarbonilaminopropila 42 como uma espuma branca (1,4 g, 50,8%). O Composto 42 (1,4 g, 0,066 mmol) foi convertido de acordo com o procedimento geral para desacetila^ao catalisada por acido dos acetatos primaries, produzindo 6-O-([2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]- 6-O-[3,4, 6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D- manosil])-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosideo de /V-benziloxicarbonil- aminopropila 43 como uma espuma branca (1,0 g, 80%). O Composto 43 (1,0 g, 0,048 mmol) foi convertido de acordo com o procedimento geral para fosforilaCao produzindo 6-O-([2,3,4-tri-O-benzoil-a-D- manosil]-6-O-[3,4, 6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[ 6-O- dibenzilfosforil-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil])-2,3,4-tri-O-benzoil-a- D-manosideo de N-benziloxicarbonilaminopropila 44 como uma espuma branca (0,9 g, 80,7%).

[00196] Para uma solugao de 44 (0,9 g, 0,039 mmol) em metanol anidro (20 mL) foram incluidos 25% p/v metoxido de sodio em metanol (0,09 mL, 0,4 mmol). Depois de aproximadamente 7 h, a reagao foi in- terrompida com 1M de HCI (0,5 mL), 10% de Pd/C (0,2 g), e agua (10 mL). A mistura foi mantida sob hidrogenio com um balao por 24 horas. A mistura foi filtrada atraves de celite e lavada com EtOAc (20 mL). A solugao foi liofilizada para produzir um solido branco 6-O-([a-D- manosil]-6-O-[3,4, 6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[6-O-dibenzil- fosforil-a-D-manosil])-a-D-manosideo de /V-benziloxicarbonil- aminopropila 45 (0,23 g, 74,7% de 44).

[00197] 2,3,5,6-tetrafluorfenilato de /V-t-butoxicarbonilamino- oxiacetila (0,375 g, 1,14 mmol) em DMSO (2 mL) e DHBT (0,1 g, 0,6 mmol) em DMSO (1 mL) foram adicionados para uma solugao de 45 (0,23 g, 0,3 mmol) em agua/DMSO 1:1 (10 mL). Depois de 24 horas a solugao foi purificada em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao, e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas. O produto foi reacilado em agua/DMSO 1:1 (10 mL) usando 2,3,5,6- tetrafluorfenilato de /V-t-butoxicarbonilamino-oxiacetila (0,375 g, 1,14 mmol) em DMSO (2 mL) e DHBT (0,1 g, 0,6 mmol) em DMSO (1 mL). Depois de 24 horas a solugao foi purificada em resina de exclusao por tamanho sephadex, e as fragoes foram armazenadas e liofilizadas, produzindo 6-O-([a-D-manosil]-6-O-[a-D-manosil]-2-O-[6-O-fosforil-a- D-mano-sil])-a-D-manosfdeo de /V-f-butoxicarbonilamino- oxiacetamidopropila 46 (0,11 g, 37,5%). O Composto 46 foi dissolvido em TFA/DCM (8 mL) foi incluido. A solugao foi agitada por 60 min e entao concentrada em um oleo. Agua (5 mL) foi adicionada e o produto foi purificado em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao, e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas, produzindo 47 (0,07 g, 70,7%).Exemplo 5: Sintese de hexassacandeo ligado em PA.3,4,6-tri-O-benzil-6-D-manosideo de Metilcrotonila (51)

[00198] 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manose foi preparado conforme descrito em Mayer et aL, Eur J. Org. Chem. 10:2563 (1999). 25% p/v metoxido de sodio em metanol (0,5 mL) foi incluido para uma solupao de 2-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manose (8,0 g, 23,3 mmols) em metanol anidro (50 mL). Depois de aproximadamente 2 ho- ras o material de partida foi consumido por cromatografia em pelicula fina (TLC). A reapao foi interrompida com Resina Amberlite IR120 (H+), filtrada, e concentrada ate um xarope para produzir 3,4,6-tri-O- benzil-a-D-manose 50 (6,67 g, 99%). Para o composto 50 foi incluido tolueno (150 mL) seguido por oxido de dibutilestanho (3,88 g, 16,28 mmols), e a mistura foi aquecida sob refluxo por 3 horas usando um condensador Dean-Stark. A solupao resultante foi resfriada, concentrada ate um xarope, e dissolvida em DMF anidro (50 mL). Fluoreto de Cesio (2,28 g, 12,1 mmols), iodeto de tetrabutilamonio (5,47 g, 14,8 mmols), e 4-bromocrotonato de metila (2,46 mL, 22,2 mmols, tech grade) foram adicionados em uma mistura e aquecidos ate aproximadamente 60 °C por 18 horas. A mistura foi deixada resfriar e o solido foi filtrado. Isso foi diluido com isopropil eter/EtOAc 3,7:1 (380 mL) e lava- da com tiossulfato de sodio semissaturado (240 mL). A fase aquosa foi extraida com isopropil eter/EtOAc 3,7:1 (2 x 190 mL) e as camadas or- ganicas armazenadas e concentradas. O xarope foi extraido com iso-propanol (2 x 25 mL), e purificado por cromatografia em coluna rapida usando EtOAc em hexanos 0 - 50% para produzir 51 como um xarope (4,58 g, 56,4%). 13c -RMN (100 MHz) 1JIC,IH (100 MHz),157Hz (3 <160Hz, a >170 Hz)B.3,4,6-tri-Q-benzil-B-D-manosideo de Metilbutirila (52)

[00199] Composto 50 foi preparado conforme descrito no exemplo 2. Para o composto 50 (9,4 g, 21 mmols) foi incluido tolueno (200 mL) seguido por oxido de dibutilestanho (5,49 g, 22 mmols), e a mistura foi aquecida sob refluxo por 23 h usando um condensador Dean-Stark. A soluCao resultante foi resfriada, concentrada ate um xarope e dissolvi- da em DMF anidro (100 mL). 4-bromobutirato de metila (4,23 mL mL, 32 mmols), iodeto de tetrabutilamonio (1,94 g, 5,25 mmols), e fluoreto de Cesio (3,91 g, 25,5 mmols) foram adicionados e a mistura foi aquecida ate 60 °C por 2 h, seguida por 18 h em temperatura ambiente. A mistura foi deixada resfriar e filtrada atraves de celite e lavada com EtOAc (50 mL). Isso foi concentrado ate virar goma, extraido com tolueno (3 x 40 mL), absorvido sobre silica e purificado por cromatografia em coluna rapido usando EtOAc em hexanos 0 - 70% para produzir 52 como um oleo (9,11 g, 78,6%). 13c -RMN (100 MHz) 1JIC,IH (100 MHz),157,2 Hz (3 <160 Hz, a >170 Hz). Nenhum produto ligado em a foi observado.

C.2-O-[6-O-fosforil-a-D-nnanosill-B-D-manosideo de Metilbutirila (57)

[00200] Composto 52 foi preparado conforme descrito no exemplo 2, e tricloroacetimidato de 6-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manose 19 de acordo com o metodo de Heng et aL, J. Carb. Chem. 20:285 (2001). O Doador 19 (4,29 g, 6,36 mmols) e receptor 52 (2,9 g, 5,3 mmols) foram convertidos de acordo com o procedimento geral de gli- cosila?ao do exemplo 1, produzindo 2-O-[6-O-acetil-2,3,4-tri-O-benzoil- a-D-manosil]-3,4,6-tri-O-benzil-0-D-manosideo de metilbutirila 53 como uma espuma branca (4,41 g, 78,5%). O Composto 53 (4,41 g, 4,1 mmols) foi convertido de acordo com o procedimento geral para desa- cetilapao catalisada por acido dos acetatos primarios descritos no Exemplo 1, produzindo 2-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-3,4,6-tri- O-benzil-P-D-manosfdeo de metilbutirila 54 como uma espuma branca (2,25 g, 53,7%). O Composto 54 (2,25 g, 2,2 mmols) foi convertido de acordo com o procedimento geral para fosforilapao do exemplo 1, pro-duzindo 2-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-6-O-dibenzilfosforil-a-D-manosil]- 3,4,6-tri-O-benzil-p-D-manosideo de metilbutirila 55 como uma espuma branca (2,2 g, 77,7%).

[00201] Para desproteger 55, 25% p/v metoxido de sodio em metanol (0,2 mL) foram incluidos para uma solupao de 55 (2,2 g, 1,7 mmol) em metanol anidro (20 mL). Depois de aproximadamente 24 h o material de partida foi consumido conforme mostrado por tic. A reapao foi interrompida com Amberlite IR120 (H+) e concentrada ate um xarope. A solupao foi concentrada e purificada por cromatografia em coluna de silica-gel para produzir 2-O-[6-O-dibenzilfosforil-a-D-manosil]-3,4,6-tri- O-benzil-p-D-manosfdeo de metilbutirila 56 como espuma branca (1,10 g, 67%).

[00202] Para uma solupao agitada de 56 (1,10 g, 1,15 mmol) em THF/agua (20 mL) foi incluido acido acetico glacial (25 pL), umedecido a 10% de Pd/C (0,1 g) e a balao de hidrogenio foi anexado. Depois de 24 horas de reapao o produto carbonizado com 5% de acido sulfuri- co/EtOH mas nao foi visto sob UV. A mistura foi filtrada atraves de celite e a camada foi lavada com agua (20 mL). A solupao foi concentrada e seca sob vacuo para produzir 2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil]-0-D- manosideo de metilbutirila 57 (0,6 g, 98%).

D.2-Q-[6-O-fosforil-a-D-manosil]-6-D-manosideo de amino- oxiacetamido-hidrazidobutila (60)

[00203] Hidrato de hidrazina (0,44 mL, 5,75 mmols) foi incluido em 57 (0,6g, 1,15 mmol) em metanol (20 mL), com agitagao. Depois de 30 min, agua (5 mL) foi adicionada e a solugao foi agitada por 18 h. Mais hidrazina (0,44 mL, 5,75 mmols) foi incluida e a mistura agitada por 120 h. A solugao foi concentrada ate aproximadamente 25% de volume, extraido com agua (2x10 mL), e o produto foi liofilizado, produzindo 2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil]-P-D-manosideo de hidrazidobutila 58 como um solido esbranquigado (0,6 g, 99%).

[00204] Para 58 (0,2 g, 0,38 mmol) em DMSO/agua 1:1 (10 mL) foi incluida uma solugao de 2,3,5,6-tetrafluorfenilato de /V-t- butoxicarbonilamino-oxiacetila (0,49 g, 1,52 mmol) em DMSO (2 mL) e DHBT (0,125 g, 0,76 mmol) em DMSO (2 mL). Depois de 18 h a solugao foi purificada em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao, e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas, produzindo 2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil]-0-D-manosideo de /V-t- butoxicarbonilamino-oxiacetamido-hidrazidobutila 59 como um solido esbranquigado (0,1 g, 37,8%). O Composto 59 foi dissolvido em TFA/DCM 1:1 (8 mL). A solugao foi agitada por aproximadamente 60 min e entao concentrada em um oleo. Agua (10 mL) foi incluida e o produto foi purificado em resina de exclusao por tamanho sephadex.As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizagao, e as fragoes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas, produzindo 60 como um solido esbranquigado (0,045 g, 52,5%).

E.Sintese em larga escala de 3-Q-alil-6-Q-tritil-B-D- manosideo de metilbutirila (64)

[00205] Uma solugao de 50,0 kg (128,09 mol) de penta-acetato de d-manose em 100 L de CH2CI2 foi tratada com 26,8 kg (243,2 mol, 1,90 eq.) tiofenol e 27,3 kg (192,3 mol, 1,50 eq.) trifluoreto dietileterato de boro e a solugao resultante foi agitada em 22 °C por 40 h, momento em que a solugao foi considerada completa pela analise HPLC. 115 L de NaOH a 5N aquoso foram entao cuidadosamente introduzidos no recipiente de reagao em agitagao, as fases foram separadas e a fase organica foi lavada mais uma vez com 46 L de NaOH a 5N. O CH2CI2 foi removido por destilagao sob pressao reduzida e o residuo foi dissolvido em 100 kg de isopropanol em 60 °C. Mediante o resfriamento ate 9 °C o produto F1 cristalizou e poderia ser isolado por filtragem seguida por lavagem com isopropanol para produzir 35,8 kg (63%).

[00206] 35,80 kg de F1 (88,28 mol) foi suspenso em 143 kg deMeOH em 22 °C e tratado com 0,73 kg a 30% de solugao de metoxido de sodio metanolico (4,05 mol, 0,046 eq.) de forma que uma solugao clara foi obtida. Depois que a reagao foi considerada completa por meio de analise de TLC, 0,49 kg de acido acetico (8,14 mol, 0,09 eq.) foi incluido e 0 solvente removido sob pressao reduzida. O residuo foi suspenso em tolueno, novamente concentrado sob pressao reduzida, e finalmente tratado com acetona de forma que o produto fenil-a-D- tiomanosideo foi cristalizado. Depois da filtragem, lavagem e secagem um rendimento de 19,65 kg (89%) foi obtido.

[00207] Fenil-a-D-tiomanosfdeo (19,25 kg, 70,69 mol) em piridina (43,8 kg) foi inclufdo para uma solugao de cloreto de trifenilmetila (19,7 kg, 70,66 mol) em tolueno (89 kg) em 40 °C e agitada por 22 h. Depois que a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, o solvente foi destilado sob pressao reduzida, o resfduo colocado em tolueno, e reconcentrado. Depois de diluigao com mais tolueno, a solugao foi lavada uma vez com agua. O produto foi precipitado pela adigao de uma solugao de tolueno em uma mistura de hexano (840 L) e di- isopropileter (250 L) para produzir, Depois da filtragem e secagem, 6- O-tritil-1-tio-a-D-manosfdeo de fenila 61 (32,30 kg, 89%).

[00208] A mistura de 61 (30,0 kg, 58,29 mol) e oxido de dibutilesta- nho (20,3 kg, 81,5 mol) em tolueno (500 kg) foi aquecida em refluxo por 2 horas ate que mais nenhuma agua separada do solvente con- densado evaporasse. A solugao foi resfriada ate 40 °C e DMF (34 kg) foi incluida. Aproximadamente metade do total de solvente foi destilada sob pressao reduzida, de forma que DMF (216 kg) foi incluida e a solugao foi novamente concentrada ate aproximadamente metade do seu volume. Mais DMF (250 kg) foi incluida, seguido por fluoreto de Cesio (8,9 kg, 58,59 mol), iodeto de tetrabutilamonio (23,6 kg, 63,89 mol) em DMF (65 kg), e brometo de alila (21,1 kg, 174,4 mol). A mistura resultante foi agitada em 50 °C por 15 horas. Depois que a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, os solidos foram removidos da mistura de reagao por filtragem e o filtrado foi tratado com a mistura de di-isopropileter (136 kg) e acetato de etila (30 kg) seguida por 10% p/p solugao aquosa de tiossulfato de sodio (300 kg). Depois da separagao das fases, a fase inferior foi reextraida 4 vezes com a mistura de di-isopropileter (136 kg) e acetato de etila (30 kg), e as fases superiores combinadas foram lavadas tres vezes com agua (150 kg). A fase superior foi concentrada sob pressao reduzida e o residuo dissolvido em etanol (160 kg) em 75 °C. Mediante o resfriamento ate 0 °C, o produto cristalizou e poderia ser isolado por filtragem. Depois de lavagem e secagem da torta de filtro, 3-O-alil-6-O-tritil-1-tio-a-D- manosideo de fenila 62 (15 kg, 46%) foi obtido.

[00209] Uma solugao de 62 (12,5 kg, 22,53 mol) em uma mistura de THF (63 kg) e piridina (18 kg, 227,5 mol) foi tratada com uma solugao de mono-hidrato de acido tolueno sulfonico (16,7 kg, 87,79 mol) em agua (10,7 kg), seguida por uma solugao de N-clorossuccinimida (9,6 kg, 71,89 mol) em uma mistura de agua (17 kg) e THF(83 kg) em 15 °C. A mistura resultante foi aquecida ate 22 °C e agitada por 3 h. Depois que a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, uma solugao de tiossulfato de sodio (4,6 kg, 29,11 mol) em agua (15 kg) foi incluida na mistura de reagao . As fases foram separadas, a fase superior concentrada sob pressao reduzida, e o residuo colocado em tolueno e novamente concentrado. O residuo foi dissolvido em acetato de etila, lavado com agua, e entao com 16% p/p solugao aquosa de cloreto de sodio. Depois da evaporagao do acetato de etila, o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre 52 kg de silica- gel, e elufdo com um gradiente de 3-10% v/v acetato de etila em tolueno para produzir 3-O-alil-6-O-tritil-a-D-manose 63 (7,7 kg, 73%).

[00210] A mistura de 63 (7,7 kg, 16,65 mol) e oxido de dibutilestanho (4,56 kg, 18,32 mol) em metanol (61 kg) foi reaquecida ate refluxo ate que uma solugao turva foi obtida, e entao por mais 1 h. A solugao foi resfriada ate 25 °C e aproximadamente metade do total de solvente foi destilada sob pressao reduzida, de forma que DMF (33 kg) foi incluida e a solugao foi novamente concentrada ate aproximadamente metade do seu volume. Mais DMF (15 kg) foi incluida seguido por fluoreto de Cesio (2,53 kg, 16,65 mol), iodeto de tetrabutilamonio (6,15 kg, 16,65 mol) em DMF (17 kg) e 4-bromobutirato de metila(4,52 kg, 24,97 mol). A mistura resultante foi agitada em 80 °C por 5 h. Os solidos foram removidos da mistura de reagao por filtragem, e o filtrado foi tratado com a mistura de di-isopropileter (41 kg), acetato de etila (14 kg), e 10% p/p solugao aquosa de tiossulfato de sodio (77 kg). Depois da separagao das fases, a fase inferior foi reextraida com a mistura de di-isopropileter (41 kg) e acetato de etila (51 kg), e as fases superiores combinadas foram lavadas com agua (39 kg). A fase superior foi concentrada sob pressao reduzida e o resfduo dissolvido em metanol (35 kg).

[00211] Para aumentar o rendimento de reagao, o processo de reagao de ligagao foi repetido. O resfduo dissolvido foi novamente concentrado sob pressao reduzida, entao diluido com metanol (122 kg). Metanol (60 L) foi novamente destilado, a solugao resultante foi tratada com oxido de dibutilestanho (2,28 kg, 9,16 mol), e a mistura foi aquecida ate refluxo por 2 h. A solugao foi resfriada ate 29 °C, e aproximadamente metade do total de solvente foi destilada sob pressao reduzida, de forma que DMF (37 kg) foi incluida e a solugao foi novamente concentrada ate aproximadamente metade do seu volume. Mais DMF (15 kg) foi in- cluida seguido por fluoreto de Cesio (1,26 kg, 8,29 mol), iodeto de tetrabutilamonio (3,7 kg, 10,02 mol) em DMF (17 kg), e 4-bromobutirato de metila(3,06 kg, 16,90 mol) e a mistura resultante foi agitada em 80 °C por 2 h. Depois que a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, os solidos foram removidos da mistura de reapao por filtragem, e o filtrado foi tratado com a mistura de di-isopropileter (25 kg), acetato de etila (32 kg) e 10% p/p solupao aquosa de tiossulfato de sodio (77 kg). Depois da separapao das fases, a fase inferior foi reextrafda com a mistura de di-isopropileter (25 kg) e acetato de etila (32 kg), e as fases su- periores combinadas foram lavadas com agua (39 kg). A solupao foi concentrada sob pressao reduzida e o residuo foi dissolvido em tolueno (43 kg), e finalmente concentrado ate um volume final de aproximadamente 30 L. O metil ester bruto de 64 foi entao purificado por cromatografia em coluna em 50 kg de silica-gel, e eluido com um gradiente de 5% - 30% v/v acetato de etila em tolueno.

[00212] Uma solupao de metil ester em metanol purificado (50 kg) foi tratada com a mistura de 30% p/p hidroxido de sodio aquoso (3,29 kg) e metanol (7,7 kg) e a solupao resultante agitada por 14 h. Depois que a reapao foi considerada completa pela analise HPLC, a mistura de reapao foi tratada com a mistura de di-isopropileter (41 kg) e acetato de etila (14 kg), seguida por agua (77 kg). A mistura bifasica foi pas- sada atraves de um cartucho de filtro de 1,2 pm e as fases foram se- paradas. A fase inferior foi tratada com a mistura de di-isopropileter (41 kg) e acetato de etila (14 kg), e o pH da fase inferior diminuiu ate 4,5-5 pela adipao de uma solupao aquosa 5% p/p de acido citrico (38 L). As fases foram separadas e a fase inferior foi extraida com uma mistura de di-isopropileter (41 kg) e acetato de etila (14 kg). As fases superio- res combinadas foram lavadas com agua (39 kg) e entao concentradas sob pressao reduzida. O residuo foi misturado com di-isopropileter (39 kg) e solvente parcialmente concentrado para produzir um volume final de aproximadamente 20 L, de forma que o produto cristalizou e pode- ria ser isolado por filtragem. Depois da lavagem da torta de filtro e se- cagem, acido (3-O-alil-6-O-tritil-0-D-manosil)-4-butanoico 64 (4,7 kg, 51,5%) foi obtido.

Sintese em larqa escala de intermediario de tetrassacari-deo (69)

[00213] Composto 64 foi preparado de acordo com os metodos da Parte E. Os grupos de protegao de 64 foram modificados antes de adicionais reagoes de glicosilagao. Uma solugao de 64 (4,25 kg, 7,75 mol) em THF (14 kg) foi lentamente agitada em uma pasta fluida agitada de 60% dispersao de hidreto de sodio (1,55 kg, 38,75 mol) em THF (45 kg) e a suspensao resultante foi agitada ate que a evolugao de hidrogenio acabasse. Uma suspensao de iodeto de tetrabutilamonio (0,29 kg, 0,78 mol) em THF (2 kg) foi introduzida no frasco de reagao seguida por brometo de benzila (9,2 kg, 53,79 mol). A mistura foi agitada em 22 °C por 46 h, entao em 30 °C por 12 h e em 35 °C por 48 h. Quando a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, a mistura foi resfriada ate 0°C e metanol anidro (0,7 kg, 21,87 mol) seguido por 30% p/p metoxido metanolico de sodio (2,1 kg , 11,66 mol) foram lentamente introduzidos. Acido acetico (1,4 kg) seguida por trietilamina (9,4 kg, 92,89 mol) foram entao adicionados e a mistura foi agitada por 18 h. Para uma suspensao resultante foi adicionada agua (31 kg) e as duas fases foram separadas. A fase superior foi concentrada sob pressao reduzida, o residuo colocado em tolueno e concentrado novamente ate o volume final de aproximadamente 20 L. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em 42 kg de silica-gel eluindo com um gradiente de 5-15% de acetato de etila em hexano para produzir 3-O-alil-2,4-di-O-benzil-6-O-tritil-p-D-manosideo de metilbutirila 65 (4,4 kg, 77%) como uma solugao em acetato de etila.

[00214] Para uma solugao de 65 (4,4 kg, 5,92 mol) em metanol (19 kg) em 37 °C foi incluida uma solupao de mono-hidrato de acido tolue- nossulfonico (0,9 kg , 4,73 mol) em metanol (6,3 kg) e a mistura resul- tante agitada por 1 h. Quando a reagao foi considerada completa para a analise HPLC, trietilamina (1,5 kg, 14,82 mol) foi colocada e a soluCao foi concentrada sob pressao reduzida. Tolueno (28 kg) foi entao adicionado e a solupao foi lavada com agua (32 kg). As fases foram separadas e a fase superior foi concentrada sob pressao reduzida. O produto bruto foi purificado por meio de cromatografia em silica-gel (32 kg), eluindo com um gradiente de 9%, entao 17%, entao 50% v/v acetato de etila em tolueno para produzir 3-O-alil-2,4-di-O-benzil-0-D- manosideo de metilbutirila 66 (2,67 kg, 90%) como uma solupao em tolueno.

[00215] 3,73 kg (5,49 mol, 1,10 eq.) 19 e 2,50 kg (4,99 mol) 66 foram dissolvidos em 34 kg de tolueno anidro a partir do que aproxima-damente 10 L foram evaporados sob pressao reduzida. A solupao foi entao resfriada ate 0 °C e tratada, gota a gota, com 22 g (0,099 mol, 0,02 eq.) TMSOTf de forma que a temperatura de reapao permaneceu < 5 °C, e agitada em 0 °C por 1 h depois do final da adipao. Quando a reapao foi considerada completa pela analise HPLC, a mistura foi neu- tralizada pela adipao de 30 g (0,296 mol, 0,06 eq.) EtaN. Hexano (22 L) foi incluido e a suspensao resultante foi filtrada e o filtrado foi lavado com 33 L de agua e concentrado sob pressao reduzida. O residuo foi colocado em 10 L de tolueno e novamente concentrado, e repetido mais duas vezes. Purificapao por cromatografia em coluna do produto bruto em 50 kg de silica-gel, e eluindo com um gradiente de 9-13% v/v EtOAc em hexano:tolueno 1:1 produziu 4,23 kg, 83%, composto 67 como uma solupao em tolueno.

[00216] Para uma solupao de 4,23 kg (4,16 mol) de 67 em 5,6 L de CH2CI2 e 40 L de MeOH foi incluido 0,72 kg a 10% de Pd/C seguida por uma solupao de 0,12 kg (0,63 mmol, 0,15 eq.) de mono-hidrato de acido tolueno sulfonico e a mistura foi agitada em 22 °C por 24 h. Quando a reapao foi considerada completa pela analise HPLC 0 pala- dio/carbono foi removido por filtragem e 0 filtrado foi usado sem purificapao adicional na seguinte etapa.

[00217] Para o filtrado foi incluida uma solupao de 2,97 kg (15,6 mol, 3,75 eq.) acido toluenossulfonico em 4 L de MeOH e a mistura resultante foi agitada por 16 h em 22 °C. Quando a reapao foi considerada completa pela analise HPLC, a mistura foi resfriada ate 0 °C e neu- tralizada pela adipao de 1,64 kg (16,2 mol, 3,89 eq.) de trietilamina. A solupao foi concentrada sob pressao reduzida e o residuo particionado entre 82 L de MTBE e 32 L de agua. A fase organica foi concentrada sob pressao reduzida, diluida com 10 L de tolueno e reconcentrada. Este procedimento foi repetido mais duas vezes. Purificapao por cromatografia em coluna do produto bruto em 38 kg de silica-gel, eluindo com um gradiente de 23-26% v/v EtOAc em hexano:tolueno 1:1 pro- duziu 2,59 kg de composto 68 (67% de 67) como uma solupao em tolueno.

[00218] Uma solupao de 2,90 kg (3,10 mol) de 68 e 5,24 kg (8,23 mol, 2,65 eq.) 18 em 30 kg de tolueno anidro em 0 °C foi tratada com 0,049 kg (0,185 mol, 0,06 eq.) de TBDMSOTf e agitada em 0 °C por 4 h. Quando a reapao foi considerada completa pela analise HPLC, 0,104 kg (1,03 mol, 0,128 eq.) de trietilamina foi incluido seguido por 33 L de hexano. A suspensao resultante foi filtrada e o filtrado lavado com 28 L de agua e entao com 28 L a 5% de Na2CO3 aquoso. A fase de tolueno foi concentrada sob pressao reduzida e o produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em 58 kg de silica-gel, eluindo com um gradiente de 9-20% v/v EtOAc em hexano:tolueno 1:1 produ- ziu 4,40 kg do intermediario de tetrassacandeo 69 (75%) como uma solugao em tolueno.

G.Sintese de Hexassacarideo protegido (73)

[00219] Intermediario de tetrassacandeo 69 foi preparado de acordo com os metodos descritos no Exemplo 7. Para uma solugao de 9,7 g (5,15 mmol) 69 em 60 ml de CH2CI2 foram incluidos 100 ml de MeOH seguido por, gota a gota, 27 ml de uma solugao de HCI a 5,7 N em 1,4- dioxano (0,154 mol, 30 eq.), de forma que a temperatura de uma mistura permaneceu abaixo de 30 °C. A mistura de reagao foi entao agitada em 22 °C por 40 h. Quando a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, 32 ml (22,9 mmol, 44,7 eq.) de trietilamina foram incluidos cuidadosamente de forma que a temperatura de uma mistura permaneceu abaixo de 25 °C. Agua (250 ml) e tolueno (200 ml) foram adicionados, a mistura foi agitada, e as fases foram separadas. A fase inferior foi reextraida com 50 ml de tolueno, as fases superiores combinadas foram lavadas com 50 ml de agua, e concentradas sob pressao reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em 100 g de silica-gel, eluindo com um gradiente de 30-50% v/v EtOAc em hexano para produzir 3-O-([3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosil])- (6-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-6-O-[3,4,6-tri-O-benzil-a-D- manosil])-2,4-di-O-benzil-p-D-manosideo69%).

[00220] Uma solupao de 1,0 g (0,56 mmol) de 70 e 0,95 g (1,40 mmol, 2,5 eq.) 19 em 9 ml de tolueno anidro em 0 °C foi tratada com 0,02 g (0,075 mmol, 0,14 eq.) de TBDMSOTf e agitada em 0 °C por 1 h. Quando a reagao foi considerada completa pela analise HPLC, 22 ml (0,158 mmol, 0,28 eq.) de trietilamina foram incluidos. A mistura resultante foi lavada duas vezes com 10 ml de agua concentrada sob pressao reduzida. Purificagao do produto bruto por cromatografia em coluna em 15 g de silica-gel, eluindo com um gradiente de 15-25% v/v EtOAc em hexano:tolueno 1:1 produziu 1,75 g de composto 3-O- ([3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[6-O-acetil-2,3,4-tri-O-benzoil-a- D-manosil])-(6-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-6-O-[3,4,6-tri-O- benzil-a-D-manosil]-2-O-[6-O-acetil-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil])- 2,4-di-O-benzoil-p-D-manosideo de metilbutirila 71 como um oleo contendo tolueno residual.

[00221] Uma solupao de 10,0 g (3,5 mmol) 71 em 40 ml de 1,4- dioxano foi tratada com 60 ml de MeOH, seguida por 3,25 g (14,0 mmol, 4 eq.) de (+)-acido canforsulfonico, e a solupao resultante foi agitada por 100 h em 22 °C. Quando a reapao foi considerada comple- ta pela analise HPLC, 3 ml (21,5 mmol, 6,2 eq.) de trietilamina foram incluidos e o solvente foi removido sob pressao reduzida. O residuo foi dissolvido em 200 ml de MTBE e agitado com 200 ml de H2O. As fases foram separadas e a fase superior foi concentrada sob pressao reduzida. A purificapao por cromatografia do produto bruto em 114 g de silica-gel, e eluindo com um gradiente de 14-25% v/v EtOAc em tolueno produziu 8,24 g de 3-O-([3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[2,3,4-tri- O-benzoil-a-D-manosil])-(6-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil]-6-O- [3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil])- 2,4-di-O-benzoil-p-D-manosideo de metilbutirila 72 como um oleo contendo tolueno residual.

[00222] Para uma solupao de 0,965 g (0,35 mmol) 72 em 4 g de acetonitrila anidro foram incluidos 0,083 g (0,70 mmol, 2 eq.) 4,5- dicianoimidazol seguido por 0,315 g (0,91 mmol, 2,6 eq.) de dibenzila di-isopropilfosforamidita, e a mistura foi agitada em 23 °C por 1 h. Quando a reagao foi considerada completa por meio de analise de TLC, 0,5 ml agua foi incluido e a solupao foi agitada por 15 min. Agua (9,5 ml) e 10 ml de MTBE foram incluidos e a mistura resultante foi agitada, as fases foram separadas, e a fase inferior foi agitada com 10 ml de MTBE. As fases superiores foram combinadas e concentradas sob pressao reduzida para produzir um oleo incolor. O residuo foi dissolvido em CH2CI2, resfriado ate -20 °C, e tratado com 0,247 g (1,13 mmol, 3,2 eq.) a 70% de acido 3-cloroperbenzoico. Depois que a reapao foi considerada completa por meio de analise de TLC, 10 ml de 10% de tiossulfato de sodio aquoso foram incluidos e a mistura foi aquecida ate 23 °C. A fase inferior foi separada, agitada com 10 ml de agua e concentrada sob pressao reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em 19 g de silica-gel, e eluindo com um gradiente de 25-50% v/v EtOAc em hexano, para produzir 0,83 g (72%) de 3-O-([3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[6-O- dibenzilfosforil-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil])-(6-O-[2,3,4-tri-O- benzoil-a-D-manosil]-6-O-[3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manosil]-2-O-[6-O- dibenzilfosforil-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manosil])-2,4-di-O-benzoil-P-D- manosideo de metilbutirila 73 como um oleo incolor.

H.Sintese de 3-Q-([a-D-manosill-2-Q-[6-Q-fosforil-a-D- manosil1)-(6-Q-[a-D-manosill-6-Q-[a-D-manosill-2-Q-[6-Q-fosforil-a-D- manosilD-B-D-manosideo de aminoxiacetamido-hidrazido (77)

[00223] Composto 73 foi preparado de acordo com os metodos descritos no Exemplo 8. Acido acetico glacial (100 pL) foi incluido em 73 (64 g, 19,6 mmol) em metanol/THF 1:1 (600 mL), e o produto foi hi- drogenado usando um H-cube® sobre 20% de Pd(OH)2/C em 50°C, pressao 5 MPa (50 bar) H2 e com uma taxa de fluxo de 6 mL/min com recirculapao sobre 0 catalisador. Depois de 20 h a reagao foi essenci- almente completa por TLC, e a solucao foi concentrada ate produzir 74 como uma espuma (39,88 g, 93%).

[00224] Metanol (180 mL) foi incluido em 74 (33,8 g, 15,5 mmol) com agitagao ate ser dissolvido, e a solugao foi resfriada em um banho de gelo/agua por 15 min. Para a solugao foram adicionados 64% de mono-hidrato de hidrazina (94 ml, 1,24 mol), com agitagao. Depois de 30 min, agua (120 mL) foi incluida e a solugao foi deixada atingir a temperatura ambiente e armazenada por 18 h. A solugao foi concentrada ate aproximadamente 100 mL e extraida com agua (2 x 100 mL), e a solugao final foi ajustada para aproximadamente180 mL com agua. A solugao foi extraida com DCM (2 x 100 mL) e entao 3 porgoes de 60 mL foram separadas em uma coluna de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes contendo o material mais puro foram armazena- das e liofilizadas produzindo 75 (15,5 g, 80%).

[00225] DMSO (20 mL) foi incluido lentamente em 75 (2,5 g, 2,0 mmol) em agua (30 mL), entao 2,3,5,6-tetrafluorfenilato de N-t- butoxicarbonilamino-oxiacetila (2,58 g, 7,6 mmol) em DMSO (6 mL) e DHBT (0,65 g, 4 mmol) em DMSO (4 mL) foram adicionados. Depois de 18 h a solugao foi purificada em resina de exclusao por tamanho sephadex. As fragoes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizapao, e as frapbes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas, produzindo 3-O-([a-D-manosil]-2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil])- (6-O-[a-D-manosil]-6-O-[a-D-manosil]-2-O-[6-O-fosforil-a-D-manosil])- p-D-manosideo de /V-t-butoxicarbonilamino-oxiacetamido-hidrazi- dobutirila 76 (2,57 g, 90%). DCM (30 mL), entao TFA (16 mL), foram adicionados Para o composto 76 (2,57 g, 1,8 mmol). A mistura foi agitada ate ser dissolvida (aproximada 60 min) e entao concentrada em um oleo. Agua (20 mL) foi incluida e o produto foi purificado em resina de exclusao por tamanho sephadex. As frapbes foram verificadas em placas de silica-gel por carbonizapao e as frapbes selecionadas foram armazenadas e liofilizadas, produzindo 77 (1,6 g, 67,1%).

Exemplo 6: Sintese de hexassacarideo com ligador de dissulfeto A.Preparapao de hexassacarideo em forma de acido livre

[00226] MeOH e adicionado no composto 73 seguido por NaOMe e incubado por 4 -18 h. A reapao e interrompida com acido acetico glacial e a solupao concentrada ate um xarope para produzir 78.

[00227] Composto 78 e dissolvido em THF/metanol 1:1 e Pd/C-H2 hidrogenado. A solugao e concentrada em um solido e dissolvida em agua, saponicada com NaOH aquoso, o pH ajustado ate aproximadamente 4 e purificado em Sephadex G-10 para produzir o acido livre 81.

B.Anexagao do ligador de dissulfeto

[00228] Uma fragao bruta do composto 81 prepreparada por um metodo diferente (obtido de Biomira) foi convertida em sal de trietilamina (TEA) pela mistura com excesso de TEA seguida por cromatografia em Superdex Peptide (GE Healthcare) usando 30% de acetoni- trila, 0,1% de Bicarbonato TEA como uma fase movel. As fragoes ar- mazenadas foram liofilizadas e conjugadas com NEA em uma reagao contendo glicano:NEA:EDAC:NHS:HOBt:TEA (1:1:1,5:1:1:1 mokmol) incubada durante a noite com uma agitagao suave. Uma porgao (0,5mg) do produto foi submetida a cromatografia em Superdex Peptide como antes e liofilizada para produzir 82 (0,28 mg).

Exemplo 7: Sintese de conjugados de a-glucosidase e otimizagao da oxidagaoA.Conjugagao

[00229] Oligossacandeos foram conjugados em acido recombinante humano a-glucosidase (rhGAA) para formar NeoGAAs. Conjugados com oligossacandeos primariamente anexados atraves de residues de acido sialico em rhGAA sao chamados "SAM", enquanto que aqueles anexados atraves de residues de galactose sao chamados "GAM."

[00230] NeoGAA 0SAM6 foi preparado essencialmente conforme descrito por Zhu et aL, Biochem J, 389(Pt 3): 619-628 (2005). A amos- tra de rhGAA usada para o experimento foi encontrada pela analise da composipao do monossacandeo tendo aproximadamente 5,2 mols de acido sialico /mol de proteina. Brevemente, rhGAA (Genzyme Corp.) em 5 mg/mL foi trocado com tampao em 100 mM de acetato de sodio pH 5,6, entao reagido com periodato de sodio (2, 7,5, ou 22,5 mM) em gelo no escuro por 30 minutos. A reapao foi interrompida com a adipao de glicerol ate 2% (vol/vol). O rhGAA oxidado foi trocado com tampao para remover produtos derivados de pequeno peso molecular da reapao de oxidapao, e conjugado com o Composto 77 (0-120-vezes a ra- zao molar vs. proteina, tai como mostrado na Figura 9) em 37 °C por 6 h. Todos os conjugados foram trocados com tampao em 25 mM de fosfato de sodio pH 6,25, contendo 2% de manitol e 0,005% de Tween-80.

[00231] Similares conjugados de NeoGAA foram preparados com SAM2 (Composto 17, Exemplo 2), SAM3 (Composto 35, Exemplo 3), SAM4 (Composto 28, Exemplo 4A), Linear SAM4 (Composto 47, Exemplo 4B), e aSAM6 (Oligossacarideo 103), usando 7,5mM periodato e variando as razoes molares de oligossacarideo ate rhGAA.

[00232] Metodos de conjugapao alternativos tambem foram realiza- dos. Especificamente, hexassacandeo tanto com um aminoxi, hidrazi- da ou ligador reativo a tiol foi anexado para rhGAA atraves de Cys374, lisinas, acidos cialicos, ou residuos de galactose.

[00233] A conjugapao de lisina foi realizada pela modificapao de re- siduos de lisina em rhGAA com 4-formilbenzoato de sucinimidila (SFB; Solulink Corp.), seguida por conjugapao com o oligossacarideo. Bre- vemente, o rhGAA foi inicialmente trocado com tampao em 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,2, contendo 150 mM de cloreto de sodio. O rhGAA tamponado foi entao tratado com um recem-preparado (SFB) em 20:1 razao molar de SFB para GAA. A mistura foi incubada em temperatura ambiente por 30 min antes de ser trocada com tampao em 100mM de acetato de sodio, pH 5,5, para conjugapao para o he- xassacarfdeo hidrazida em temperatura ambiente por 2 hrs, ou o GAA modificado com SFB foi trocado com tampao em 100 mM de acetato de sodio, pH 5,6, para conjugapao para hexassacandeo aminoxi em 37 °C por 6 hrs.

[00234] Conjugapao baseada em cisteina foi realizada pela reapao com o NEA-hexassacandeo tiol-reativo 82 (Exemplo 61). NEA- hexassacandeo modificado 82 foi reconstituido em agua e incubado com rhGAA (razao molar 15:1 de neoglicano para rhGAA) em 50mM de fosfato de sodio e 50mM de hidroxilamina pH7,2 por 2 hrs em 25°C. O pH foi ajustado ate 6,2 com 50mM de fosfato de sodio pH 4,1 e a in- cubapao continuou durante a noite. O produto foi purificado por diafil- trapao centrifuga contra 25mM de fosfato de sodio pH 6,2. Menos do que 1 mokmol M6P foi introduzido.

[00235] Enquanto a conjugapao direta atraves de Cys374 nao foi bem-sucedida, um reagente homobifuncional especifico para tiol, 1,4- di-(3’-[2-piridilditio]-propionamido) butano (DPDPB) com brapo espa- pador de 19,9A, foi testado para fornecer um grupo tiol na posipao 374 antes da conjugapao com o oligossacarideo. Um excesso molar de 60 vezes de DPDPB foi reagido com rhGAA na presenpa tanto de 10% de DMSO ou 10% de propanol como cossolventes. Isso elicitou uma forte ligapao conforme detectada por espalhamento de luz. A reapao na presenpa de 20% de acetonitrila tambem apresentou alguma agrega- pao, mas na absorpao em 344 nm de um ultrafiltrado de uma mistura de reapao consistente com a modificapao quantitativa de cisteina. Uma redupao na concentrapao de acetonitrila para 10% reduziu a quantidade de agregapao, mas rendeu uma extensao menor de modificapao.

[00236] Uma abordagem alternativa baseada em tiol foi realizada pela introdupao de grupos tiol nos residues de lisina. Os tiols protegi- dos foram introduzidos sobre os residuos de lisina pela reapao da enzima com um excesso molar de 100 vezes de SATA-dPEG4-NHS (Quanta Biodesign) em fosfato de sodio pH 6,2 por 4 hrs em 25 °C e purificado por dialise durante a noite contra o mesmo tampao. O produto purificado foi entao reagido com NEA-oligossacandeo 82 sob as condipoes descritas acima para a conjugapao baseada em cisteina para produzir um conjugado de lisina-tiol. Isso mostrou um aumento de aproximadamente 10 vezes no conteudo Man-6 P (aproximadamente 5 glicanos conjugados).

[00237] A estabilidade dos conjugados de lisina com hidrazina foi avaliada em 37 °C por ate 14 dias pela medipao do peso molecular da proteina Intacta e conteudo M6P. O conjugado nao e estavel, como mais do que 50% do neoglicano foram perdidos durante 14 dias. Os conjugados de aminoxi atraves de lisina foram preparados usando excesso molar de 0, 16,6, 25, 33, e 40 de hexassacarideo para rhGAA, como descrito acima. A conjugapao foi saturavel em excesso molar de 6,6 vezes, apesar de que apenas aproximadamente 31% (ou 5 neogli- canos conjugados) do total de lisinas foram conjugados. O alto nivel de agregapao tambem foi observado em varias preparapoes. Uma ver- sao PEGuilada de SFB foi testada, sem redupao na agregapao.

[00238] A conjugapao da Galactose (GAM) foi realizada inicialmente penetrando rhGAA com sialidase de Clostridium perfringens em 20 mU/mg em 37 °C por 6 hrs em 25 mM de fosfato de sodio, pH 6,25, contendo 2% de manitol e 0,005% de Tween-80. Depois de dissialisa- gao, a protefna foi tratada com galactose oxidase (GAO) em 1-10 pg/mg e catalase (Sigma) em 2 U/mg no mesmo tampao em 37 °C durante a noite antes da repurificagao usando cromatografia de Poros 50D (troca anionica) para remover neuraminidase e catalase. O produto tratado com ambas as enzimas foi diluido com volume igual de dhW, entao aplicado na coluna de Poros 50D, que foi pre-equilibrada com tampao 10mM de fosfato de sodio, pH 6,9. Depois a coluna foi lavada com tampao 10 mM de acetato de sodio, pH 5,0, o rhGAA foi elu- fdo com tampao 150 mM de acetato de sodio, pH 5,0, e conjugado com o aminoxi hexassacarideo em varias razoes molares em 37 °C por 6 hrs.

[00239] A conjugagao de GAM foi saturada em um excesso molar de 16,6 vezes de hexassacarideo para GAA, com aproximadamente 6- 7 glicanos conjugados. Os niveis de agregagao foram baixos. Nenhum acido sialico foi detectado depois da dissialisagao, enquanto pouca galactose foi encontrada depois do tratamento com galactose oxidase. Em alguns casos, 20-30% dos residuos de galactose foram superoxi- dizados, produzindo acido galacturdnico, que nao conjuga para oligossacandeos. GAO foi titulado mostrando que acima de 1 pg/mg, GAO diminuiu a conjugagao de glicano. Houve claro aumento na quantidade de produto da superoxidagao de acido galacturonico acima de 2 pg/mg de GAO. A quantidade maxima de conjugagao foi obtida em 1-2 pg de GAO por mg de rhGAA (Figura 10E - Monossacandeos, incluindo o conteudo de Man-6 P, Gal, GalA do conjugado de GAM depois de titulado com GAO. Alta conjugagao foi observada conforme o conteudo de Man-6 P na proteina quando 0,5 a 2ug GAO/mg GAA foram usados. Tanto a galactose inferior ou GalA superior foram geradas quando uma GAO maior ou menor foi usada.

[00240] A quantidade de bis-M6P hexassacarideo glicano conjuga- da para NeoGAA foi quantificada pela analise de conteudo M6P e MALDI-TOF. Para a quantificagao de M6P as amostras foram trocadas com tampao usando Amicon 4, unidades de filtros centrifuga 50,000 MWCO com 5 ciclos de filtragem para remover qualquer potencial de excesso de glicano. Oitenta microgramas de cada amostra de rhGAA ou NeoGAA foram hidrolisados em 6,75 M de TFA por 1,5 hora em 100 °C. As amostras foram resfriadas, secas em um Speed Vac e re- constituidas em 200 pL de agua destilada. As amostras resconstitui- das foram secas novamente em Speed Vac e reconstituidas com 200 pL a 50 mM de citrato pH 2,0. As amostras foram filtradas atraves de cartuchos S Mini H (Sartorius), que foram equilibrados em citrato de sodio pH 2,0, para remover as impurezas do hidrolisado. Ribose-5- fosfato foi incluido como um padrao externo para todas as amostras e padroes. 50 pL do hidrolisado foram injetados sobre um Dionex HPLC e analisados por cromatografia em troca anionica de alto pH com detecgao amperometrica pulsada (HPAEC-PAD). A quantificagao foi rea-lizada com uma curva padrao construida com os padroes hidrolisados de M6P. A extensao da conjugagao foi entao calculada com base na razao molar conhecida de 2 mols de M6P por mol de glicano.

[00241] A analise de MALDI-TOF MS foi realisada usando um es- pectrometro de massa Voyager DE-PRO em modo linear. A 1:5 dilui- gao em 0,1% de acido formico em agua foi realizada em todas as amostras padroes seguida por uma diluigao 1:1 em acido sinapfnico saturado em 50% Acetonitrila/ 0,1% de TFA. Um pL desta mistura foi aplicado no alvo. A amostra, referenda e controle de calibragem BSA foram analisados tres vezes. A calibragem em dois pontos foi realizada usando o (M+H)+ e ions dimeros de BSA. A extensao da conjugagao de cada amostra de NeoGAA foi estimada com base na diferenga nos pesos moleculares entre a amostra e um controle oxidizado rhGAA (nenhum glicano adicionado), devido um peso molecular medido de glicano de 1323 g/moL

[00242] Figura 9A mostra os resultados dos experimentos usando os conjugados de di-, tri-, tetra-, e hexassacarideo descritos acima.

[00243] Figura 9B fornece resultados de conjugados de 0SAM6 preparados com diferentes quantidades de periodato. Os niveis de oli- gossacarideo necessaries para atingir a saturagao da reagao de conjugate foram proporcioanais a quantidade de periodato usado durante a etapa de oxidagao (Figura 9B, painel superior). Com 2 mM de periodato, uma amostra de rhGAA com aproximadamente 5,2 mols de acido sialico atingiu a saturaCao em aproximadamente um excesso molar de 25 vezes de hexassacarideo vs. proteina (4,8 vezes o excesso molar vs. acido sialico). Com 7,5 mM de periodato, a saturagao foi obtida em 33 vezes de excesso molar de glicano. A saturagao foi aproximada, mas nao foi atingida para rhGAA oxidizado com 22,5 mM de periodato, com 120 vezes de excesso molar de glicano. Os niveis maximos de conjugagao atingidos tambem foram diferentes para amostras preparadas com diferentes niveis de periodato. Com 7,5 e 22,5 mM de periodato, aproximadamente 8,5 e 10,5 mols de glica- no/mol de proteina foram incorporados, respectivamente. Depois da oxidagao com 2 mM de periodato, o nivel de conjugagao atingivel foi de aproximadamente 5 mols de glicano/mol proteina, que e semelhan- te ao numero de residues de acido sialico no material de partida.

[00244] O experimento da titulagao de glicano foi repetido com 2 mM de periodato usando rhGAA com um nivel inicial de acido sialico de aprox. 7,2 mols/mol proteina (Figura 9B, painel inferior). Um nivel de conjugagao de aproximadamente 7 mols de glicano/mol proteina foi atingido em > 33 vezes do excesso molar de glicano para proteina ( aproximadamente 4,6 vezes o excesso molar comparado com acido sialico).

B.Reducao de Agregapao

[00245] Certos metodos de conjugagao resultam na agregagao de proteina. Dois metodos para redugao de agregagao em neoGAA foram desenvolvidos: 1) cromatografia por interagao hidrofobica (HIC) usando uma variedade de meios de cromatografias de HIC e 2) quelagao de metal.

[00246] Um lote de 3 g de NeoGAA foi preparado usando para ava- liar HIC e colunas de cobre para remogao da agregagao. As colunas de HIC avaliadas no modo de fluxo de passagem foram: Butil 650C e 650M, Hexil 650C, Fenil 6FF, Capto Octil e Capto Fenil. Hexil e Capto Fenil produziram resultados comparaveis com as recuperagoes de 87,5% e 90,4%, e redugao agregada de 3,2% (nivel incial) para 1,4%, e 3,9% (inicial) para 1,6%, respectivamente. Ver a Tabela 2.Table 2: Remogao de agregados dos conjugados GAA (3,2% agg) usando coluna de HIC (8°C)

[00247] Condigoes de operagao das colunas de cobre quelato (GE ou Tosoh) tambem foram estabelecidas no fluxo continue ou no modo de vincular-eluir. Uma coluna FF quelante de metal de 7 ml (ID, 7 ml) carregada de cobre foi inicialmente avaliada no modo de vincular-e- eluir com 10 mg/ml GAA conjugados carregados. 87% de NeoGAA fo-ram recuperados com 1,2% de agregados, quando a coluna e eluida com 175 mM de glicina, 100 mM de acetato, pH 5,5 como o tampao de eluigao em IR. Em 8 0 C, mais de 175 mM de glicina foram necessaries para eluir a coluna para uma recuperagao satisfatoria. No modo de vincular-e-eluir (Tabela 3), uma boa recuperagao de 92% foi alcangada com uma redugao de agregamento de 3,2 para 1,2% usando 175 mM de glicina, 100 mM de acetato, pH 5,5 como o tampao de eluigao.Tabela 3 Remogao de agregados de GAA conjugados (3,2% ag) usando coluna 6FF de cobre (RT, modo Ft)

[00248] Imidazol (7,5, 8 e 10 mM) tambem foi test tado como tampaode eluigao para a coluna 6FF quelante de metal. Cerca de 8 mM de imidazol foram necessaries para eluir a coluna. Por o imidazol nao eluir o cobre da coluna, nao foi necessario condicionar a coluna ou fazer um espago livre com EDTA no topo da coluna. A capacidade da coluna de 15 mg/ml de NeoGAA foi alcangada.

[00249] A coluna Toso AF-quelato de 650 M carregada de cobre tambem foi avaliada. No modo de vincular-e-eluir, a capacidade da coluna de 15 mg/ml foi atingida, com eluigao de 94,1% e 1,2% de agre- gado usando 8 mM de glicina. No modo atraves do fluxo, 33,6 mg/ml de capacidade foram atingidos. 90,6% de recuperagao com o agrega- do de 1,2% foram obtidos com 50 mM de glicina no tampao de eluigao. C.Analise dos oligossacandeos

[00250] De acordo com esses experimentos, o uso de >2mM de periodato resultou na incorporagao de glicana NeoGAA que ultrapassou o nivel inicial de acido sialico da proteina, indicando que moleculas de acido sialico nao estavam sendo oxidadas. Para determinar os niveis de oxidagao em outros locals de carboidratos por periodato, uma serie de experimentos de titulagao de periodato foi realizada, monitorando os niveis de outros residues de monossacandeos.

[00251] Por determinagao do teor de acido sialico, as amostras foram submetidas a hidrolise acida usando 0,5 M de acido formico a 800 C por uma hora. O acido sialico liberado foi analisado por cromatografia de troca anidnica com pH elevado em conjunto com deteegao am- perometrica pulsada (HPAEC-PAD) em uma coluna CarboPac Dionex PA1 usando um gradients de 50-180 mM de acetato de sodio em 100 mM de hidroxido de sodio durante 20 minutos. Os resultados sao expresses em mols de acido sialico (NANA ou NGNA)/mol de rhGAA ou NeoGAA, e foram determinados a partir de curvas padrao de padroes autenticos de normas de acido sialico comercialmente disponiveis.

[00252] Os niveis de monossacandeos neutros, incluindo a fucose, galactose, GIcNAc e manose, foram determinados por hidrolise de 100 mg de rhGAA ou NeoGAA em TFA 1 M a 110 ° C por 2 horas. Apos hidrolise, os tubos foram resfriados em gelo, centrifugados por 1 minuto a 10.000 rpm e evaporados para secar por Speed Vac. Os monossacandeos liberados foram ressuspendidos em 250 pL de agua, centrifugados e filtrados usando tubos de filtro Millipore Ultrafree-MC (10.000 MWCO). Os monossacandeos langados foram analisados por cromatografia de troca de anions de pH elevado usando deteegao de amperometricos pulsados (HPAEC-PAD) em uma coluna de CarboPac PA1. A quantificagao foi realizada usando curvas padrao de monossacandeos hidrolisados da mesma maneira.

[00253] Os resultados dos experimentos acima sao mostrados na Figura 10A. Os resultados sugerem que o acido sialico e o mais sensi- vel dos monossacandeos a oxidagao. Os baixos niveis de destruigao de fucose foram detectados em 2 mM de periodato, e os valores foram mais mensuraveis e reprodutfveis em > 5 mM. A ligeira oxidagao de manose foi detectada apenas em > 7,5 mM de periodato.

[00254] Para confirmar a presenga de acido sialico oxidado, fucose e manose, a espectrometria de massa de fragmentagao foi realizada em oligossacandeos liberados de rhGAA oxidado usando 7,5 mM de periodato. Os oligossacandeos ligados em N em rhGAA e NeoGAA foram liberados usando a digestao durante a noite com PNGase F em 50 mM de fosfato de sodio de pH 7,0 e 10 mM de B-mercaptoetanol. Os oligossacandeos liberados foram limpos por biodialise (MWCO 500 Da), com varias mudangas de agua. As amostras dialisadas foram se- cas em um concentrador de velocidade-vac e reconstituidas com 110 pL de 10 mM de formiato de amonio pH 4,0 em 50% de acetonitrila e 50% de agua. As amostras foram analisadas usando coluna TSK Gel Amide-80 (100 pL de injegao em um tamanho de particula de 2 x 100 pm, 5 mm) com a linha de detecgao MS (tempo de voo quadrupolo QStar, tempo de voo LOT Premier e instrumentos ion trap linear LTQ) em um gradiente de acetonitrila-agua e 10 mM de formiato de amonio de pH 4,0.

[00255] Para analise da estrutura de oligossacandeos, oligossacandeos foram secos e marcados fluorescentes usando acido antranflico (AA). Oligossacandeos marcados com AA foram resolvidos por fase normal HPLC em uma coluna TSK gel amide 80 com detecgao por flu- orescencia usando um gradiente de acetonitrila/agua. A analise de fragmentagao MS foi realizada em linha usando um espectrometro de massa de armadilha de ions lineares LTQ XL no modo ion positivo. Espectros foram digitalizados a partir de 400 a 2.000 m/z, com energia de colisao normalizada fixada em 35 (padrao, exceto se indicado no texto) e ativagao Q foi fixada em 0,25.

[00256] Acido sialico: Completa oxidagao do acido sialico (em am- bas as ligagoes C7,8 e C8, 9) resultaria em uma redupao de massa de 62 Dalton. Oxidagao de fucose e manose inicialmente iria levar a uma redugao Dalton 2 (oxidagao das ligagoes C2, 3 ou C3, 4), seguido de redugao 30 Dalton apos oxidagao das diois vicinais restantes. A ami- nagao redutiva de aldefdos de carboidratos com resultados de AA em uma perda de oxigenio, com uma adigao liquida de 121,1 Daltons de peso molecular por adigao de AA. Mudangas no peso molecular teori- cas e observadas de oligossacandeos rhGAA seguindo a oxidagao do acido sialico, fucose, manose sao mostradas na Tabela 4.Tabela 4. Resumo de lons-alvo de oligossacandeos SAM6 marcados por AA para analise MS2 e MS3 "1+" e "2+" corresponde a especie positiva de carga unica e carga dupla, respectivamente. "2 e "3 correspondem as especies negativsa com carga dupla e carga tripla, respectivamente

[00257] Varies ions correspondentes ao acido sialico oxidado e oxi-dado por deriavapao de AA, fucose, e especies de oligossacandeo manose foram observados. Alem da derivatizapao da redupao de Glc- NAc de todos os oligossacandeos liberados, AA foi derivatizado em proporpao ao numero de especies reativas de aldeido presentes, ou seja, na proporpao de 1:1 com o acido sialico oxidado e na proporpao de 2:1 por manose e fucose oxidados .

[00258] O espectro de massa da Figura 10B mostra a detecpao de 4 ions correspondentes a oligossacandeos rhGAA com oxidapao e derivapao de AA em C7 de acido sialico. Dois ions de interesse a oxidapao do acido sialico (m/z 1057 e 1130) foram selecionados para maiores analises de fragmentapao MS/MS. O padrao de fragmentapao de m/z 1057 e mostrado na Figura 10C, com cada ion anotado com a hipotese de identidades. A fragmentapao dos ions m/z 716, 1032, 1235, 1397, 1584 e 1747 foi selecionada para analise de MS3. O espectro MS3 combinado com a estrutura de oligossacandeos hipotizados que contem acido sialico oxidado e marcado com AA no termino de uma glicana biantenaria. Em especlfico, a liberapao de um fragmento de m/z 351 confirmou a ligapao de AA a forma C7 de acido sialico. Em todas as amostras analisa- das, apenas a forma C7 de acido sialico oxidado foi observada; nenhuma evidencia para a presenpa de acido sialico oxidado em C8 foi observada.

[00259] Oxidapao de fucose: A Tabela 5 lista as massas teoricas e observadas de A1F e A2F oxidados e derivados de AA.Tabela 5. Massas teoricas e observadas de A1F e A2F derivados de A1F e A2F, apos a oxidapao de 1 residuo de fucose com periodato. "2 +" corresponde a especies de ion positivo com carga dupla. As massas teoricas baseiam-se na conjugapao de 4 moleculas de AA por oli-gossacandeo A1F e 5 moleculas de AA por A2F

[00260] O padrao de fragmentagao de ion principal m/z 1250,4 e mostrado na Figura 10D, e e consistente com o que seria esperado de um oligossacandeo fucosilado de nucleo monoantenario monosialilado marcado com AA que contem acido sialico oxidado e fucose oxidado. Ions de maiores fragmentos m/z 716, 1397, 1621 e 1783 foram obser- vados. Esses ions foram selecionados para analise de MS 3 para confirmar a hipotese de identidades. Nos espectros de MS3 de m/z 1621 e 1783, os padroes de fragmentagao ionica foram observados com uma perda de 195 Daltons dos ions principals (para1426 e 1588 a partir de ions principals 1621 e 1783, respectivamente). Esta mudanga de peso molecular e compativel com a clivagem entre C1 e os atomos de oxigenio de fucose oxidado, resultando na perda do acido antranilico de- rivatizado anexado ao C4. Alem disso, uma maior fragmentagao e perda do segundo acido antranilico derivatizado anexado ao C3 foi obser- vada com uma perda de 386 Daltons dos ions principals (1235 e 1397 a partir de ions principals 1621 e 1783, respectivamente).

[00261] O padrao de fragmentagao de MS de oligossacandeo oxidado rhGAA A1F mostrou a derivatizagao de C3, 4 em fucose com acido antranilico, confirmando que a oxidagao de periodato ocorreu. Nao foram observadas evidencias para a oxidagao da ligagao C2-C3. A conjugagao de glicana hexasacariedeo Bis-M6P para rhGAA oxidado resultou em um acrescimo liquido de 1.305,3 Daltons durante a reagao de condensagao.

[00262] Para confirmar a identidade das estruturas de oligossacandeos conjugados, a alta precisao de massa de analise MS de oligos- sacarideos natives e liberados foi realizada. Oligossacandeos de rhGAA e SAM6 NeoGAA preparados com 2 e 7,5 mM de periodato foram liberados usando PNGase F, resolvidos por fase normal de HPLC (coluna TSK gel amide-80) em um gradiente de acetonitrila-agua, com 10 mM de formiato de amonio pH 4,0. A deteegao de espectrometria de massa de glicanas foi realizada em linha, no modo de ions negatives, usando espectrometros de massa de tempo de voo QStar ou LCT.

[00263] A tabela a seguir apresenta um resumo das identidades do pico de oligossacandeos ligados em N natives a partir de rhGAA oxidado com periodato de 2 e 7,5 mM, e em SAM6 preparado com 2 e 7,5 mM de periodato, com base em analise MS/TOF de alta precisao. "Ox" se refere ao numero de locals de oxidagao, "Conj" para o numero de glicanas Bis-M6P hexassacandeos conjugados. Massas teoricas sao calculadas a partir de pesos monoisotopicos moleculares de estruturas de oligossacarfdeos teoricos, e m/z teoricos e observados para os estados de carga sao mostrados.

[00264] A precisao da massa de >20 ppm foi observada para todas as especies de oligossacandeos. Os resultados MS foram consisten- tes com a analise de composiCao monossacarfdica, que mostraram que a oxidagao do acido sialico e completa em > 1mM de periodato. Alguma oxidagao de manose e fucose tambem foi aparente. Ions correspondentes a conjugagao de 1 e 2 mols de glicana por manose oxidado e/ou fucose foram observados, sugerindo que ambas as especies de cada aldeido sao reativas para glicano, como foi observado para o AA.

[00265] Algumas conjugagoes das estruturas de alta manose (oli- gomanose 5 e 6) foram detectadas em ambos os 2 e 7,5 mM de material tratado com periodato. No material conjugado com 2 mM de periodato, 0 ou 1 glicanas conjugados foram observadas na especie A1 (monossialilada), enquanto ions correspondentes a 0, 1, 2 e 3 glicanas conjugadas foram observados na especie A1 em 7,5 mM de SAM6. Este resultado implica que com 7,5 mM de periodato (mas nao 2 mM), alguma oxidagao e conjugagao do nucleo de manose e/ou residuos de galactose ocorreram em estruturas A1.

[00266] Para as especies A2 e A2F (bissialilada, biantenaria, ± fucose), especies mono e biconjugadas foram observadas em 2 e 7,5 mM de amostras de periodato. Evidencia de triconjugagao com manose oxidada foi observada apenas na amostra tratada com periodato de 7,5 mM, e nao no tratamento de 2mM, compatfvel com a conjugagao atraves de fucose na concentragao de periodato elevada.

[00267] Figura 11A mostra analise HPLC de oligossacandeos liberados a partir de rhGAA e NeoGAA. Para o controle rhGAA, a maioria das especies de oligossacandeos ligados em N eluidos entre 11-13 minutos, numa regiao correspondente a oligossacandeos sem fosfori- lagao ou conjugagao. Para os oligossacandeos NeoGAA, especies de oligossacandeo biconjugado diluido entre 19-20 minutos, as especies de oligossacandeos monoconjugados eluidos entre 15-18 minutos, e oligossacandeos oxidados/inalterados eluidos entre 10-13 minutos. Na amostra SAM6 feita com 7,5 mM de periodato, cerca de metade dos oligossacandeos foi descoberta como eluentes da regiao correspon- dente as especies bi-conjugadas, enquanto cerca de 1/3 de oligossacandeos a partir do 2mM de amostras tratadas com periodato eram biconjugadas. Os perfis de eluigao das amostras estao de acordo com seus niveis de conjugagao (~ 7 e 9 mols de glicana conjugada/mol NeoGAA para 2 e 7,5 mM de SAM6 gerado por periodato, respectivamen- te), como medido por analises de conteudo de MALDI-TOF e manose- 6-fosfato.

[00268] Para melhor visualizagao e comparagao qualitativa das estruturas de oligossacarfdeos presentes, oligossacandeos liberados foram analisados por cromatografia de troca anionica com pH elevado com deteegao amperometrica pulsada (HPAEC-PAD). As amostras foram analisadas por HPAEC-PAD em coluna Dionex CarboPac PA100 usando um gradients de acetato de sodio em 100 mM de hidroxido de sodio. Os picos de oligossacarfdeos foram confirmados pela coleta de fragoes off-line, dialise contra agua e analise por HPLC de fase normal com a linha de analise de MS.

[00269] Figura 11B mostra um perfil representative HPAEC-PAD com a identificagao dos picos (como determinado pela MS). Figura 11C mostra perfis de oligossacarfdeos por HPAEC-PAD de amostras rhGAA e NeoGAA SAM6 de 2 e 7,5 mM tratadas com periodato.

D.Analise de estrutura de proteina rhGAA apos o tratamento com periodato

[00270] Para a pesquisa do potencial de modificagao da estrutura da proteina de NeoGAA, o mapeamento de peptideo de LC/MS foi realizado. NeoGAA SAM6 produzidos usando 0, 2, 7,5 e 22,5 mM de periodato foi preparado usando tripsina e analisados por HPLC de fase reversa com um espectrometro de massa de tempo do voo LCT. As modificapoes de peptideo potenciais, como a oxidapao de cisteina, metionina, triptofano, tirosina e resfduos de histidina, bem como de- saminapao de asparagina, foram avaliados usando software BioPharmalynx. A unica alterapao significativa foi a detecpao de oxidapao da metionina em varios locals diferentes. Os niveis de oxidapao em pepti- deo T13 (que contem metionina 172 e 173) apos o tratamento com 0, 2, e 22,5 mM de periodato sao ilustrados na Figura 12.

[00271] Niveis significativos de oxidapao foram encontrados em residues de metionina 122, 172 e 173. Oxidapao a estes residues de metionina foi confirmada por analise LC/MS/MS. Um baixo nivel de oxidapao tambem foi observado a ocorrencia de uma maneira depen- dente de periodato em metionina 363. Na tentativa de minimizar a oxidapao de periodato, as concentrapdes de periodato foram tituladas para niveis entre 1 e 7,5 mM, com oxidapao no local mais sensivel (peptideo T13) monitorado por LC/MS. Niveis significativos de oxidapao da metionina foram observados em concentrapoes de periodato de mais de 1 mM, sugerindo que metioninas em rhGAA sao tao suscetiveis a oxidapao de residuos de acido sialico.

[00272] Durante a conjugapao do GAM, a oxidapao galactose pelo GAO resultou em oxidapao ~ 26% de Met172/173. Quando catalase foi incluida na reapao de oxidapao em unidades de 2 e 50/mg GAA, a oxidapao da metionina foi eliminada.Exemplo 8: Caracterizapao de Conjugados GAA In Vitro

[00273] NeoGAA SAM2 foi preparado conforme descrito no exemplo 7, usando Composto 17 do Exemplo 2 e 7,5 mM de periodato. Um GAM2 NeoGAA conjugado por galactose foi preparado por tratamento rhGAA com galactose oxidase antes da conjugapao com dissacarideo 17. Da mesma forma, NeoGAA SAM3 trissacarideo (Composto 35, Exemplo 3), NeoGAAs SAM4 tetrasacarideo (Composto 28, Exemplo 4A) e SAM4 Linear (Composto 47, Exemplo 4B) tambem foram preparados. Adicionalmente, NeoGAA pSAM6 hexassacarideo foi preparado com o Composto 77 como descrito no Exemplo 7, usando 2 e 7,5 mM de periodato. aSAM6 conjugados hexassacandeos adicionais (ligapao a, conjugado com os residuos de acido sialico) e GAM6 (conjugado com residuos de galactose) tambem foram preparados.

Atividade Especifica:

[00274] A analise das atividades foi realizada atraves do monitora- mento da taxa de hidrolise do substrato sintetico p-nitrofenil-D-a- glicopiranosideo (p-NP), como catalisado por rhGAA e NeoGAA. O cromoforo liberado e medido por absorbancia a 400 nm em meio alca- lino. Uma unidade de atividade e definida como a quantidade de enzima necessaria para hidrolisar um mol de p-nitrofenil-D-a- glicopiranosideo de p-nitrofenol por minuto a 37 0 C nas condipoes do ensaio definido.

[00275] As atividades especificas de NeoGAAs SAM2, SAM3, SAM4, SAM4 Linear, aSAM6 e £SAM6 sao mostradas na Figura 13. Alem disso, a atividade especifica de conjugados preparados usando o metodo SAM contra o metodo de GAM foi avaliada. Houve uma corre- lapao inversa (p <0,001) entre o numero de M6P por GAA e a atividade especifica de NeoGAA conjugados preparados em pequena escala e lare, e 16,6 vezes o excesso molar de oligossacandeo/GAA. A perda da atividade GAA tambem foi observada com o aumento da quantidade de conteudo de M6P em SAM ou GAM conjugados em experimen- tos separados em que as concentrapoes de NeoGAA foram tituladas na conjugapao (de 2,5 a 33 vezes o excesso molar de oligossacari- deos). Para SAM com 49-81% de atividade da GAA (em relapao ao controle), os varios NeoGAAs contidos em 6-8 moleculas de oligossacandeos por proteina. Conjugados GAM tinham 67-92% de atividade, e 4-6 oligossacandeos por protefna.

B.Liqacao ao receptor M6P:

[00276] Os efeitos funcionais de conjugapao foram avaliados atraves do monitoramento da ligapao do NeoGAA ao cation receptor soluvel de manose-6-fosfato independentes (sCIMPR) por Biacore e M6P afinidade coluna HPLC receptor, e absorpao em celulas mioblastos L6. sCIMPR, como purificada a partir de soro bovino, contem dominios ex- tracelulares AX, ao faltar a porpao transmembrana.

[00277] Para a analise Biacore, sCIMPR foi acoplada a amina a um chip CM-5, 10 pg/mL de amostra NeoGAA foram carregados para a superficie e eluida com concentrapoes crescentes de manose-6- fosfato. A afinidade foi quantificada como a concentrapao de M6P ne- cessaria para desIocar 50% do NeoGAA vinculado (EC50). O metodo foi utilizado para monitorar os efeitos de conjugapao e oxidapao da afinidade do receptor.

[00278] Figura 14 apresenta os resultados obtidos da analise Biacore. Injepao de 10 mg/mL NeoGAA em um chip Biacore imobilizado por sCIMPR conduziu a um aumento de resposta de ~ 250 EF, enquanto a mesma quantidade de rhGAA causou ~ 100 deflexao RU. Alem disso, aproximadamente 10 vezes mais de concentrapao M6P eram necessa- rias para eluir NeoGAA que rhGAA (valores EC50 de aproximadamente 0,1 x 1,0 mM para rhGAA e NeoGAA, respectivamente). Houve uma relapao linear (r-quadrado> 0,95) entre os valores de EC50 e o nivel de conjugapao de preparado NeoGAA usando 2 e 7,5 mM de periodato. Atraves dos niveis de conjugapao examinados (1,6-4,7 mols de gli- cana/mol de NeoGAA por 2 mM de preparapao de periodato, e 1,0-8,5 mols de glicana/mol de 7,5 mM de prepare de NalO4), o efeito do nivel de conjugapao de afinidades de ligapao foi semelhante para NeoGAA preparado com 2 e 7,5 mM de periodato.

[00279] A ligapao do receptor M6P foi avaliada por HPLC usando uma coluna de receptor M6P preparado imobilizando sCIMPR em uma resina Poros EP, que depois e embalada em uma coluna de HPLC analitica. rhGAA e NeoGAA foram eluidos usando 0,25, 0,85, 5 e 20 mM de M6P (Figuras 15 A e B). Em um experimento, SAM2 e GAM2 foram comparados com 0SAM6 e GAM6 (Figura 15C). SAM6 e GAM6 precisam de 20 mM de M6P antes que a maioria do material seja elui- do (> 95% do conjugado vinculado a coluna). SAM2 e GAM2 menos firmemente vinculados, com a maioria de eluipao de 5 mM de M6P (> 95% ligado a coluna).

[00280] Alem disso, NeoGAA conjugados SAM2, SAM3, SAM4, SAM4 Linear e aSAM6 foram avaliados para ligagao ao receptor MP6 (Figura 15 D). A maioria dos SAM3 SAM2, e as dois conjugados SAM4 eluidos com 5mM M6P, enquanto ambos conjugados SAM6 exigiram 20mM de M6P.

[00281] Conjugados NeoGAA com quantidades variaveis de conjugapao foram avaliados (Figura 15E). O percentual de NeoGAA na fra- pao ligada foi consistentemente> 95% para aqueles preparados com glicana> 2,0 mols por mol de NeoGAA conjugado. Nas poucas frapoes que tinham niveis mais baixos de conjugapao (1,0-1,7 mols de glica- na), a frapao ligada foi entre 75-90%. Perfis de coluna M6P para NeoGAA tambem apresentaram maiores quantidades de especies de alta afinidade que em rhGAA. Especificamente, a maioria dos rhGAA liga- dos foi eluida com 0,2 mM de M6P, enquanto 20 mM de M6P eram necessaries para eluir NeoGAA da coluna. Os efeitos globais do nivel de conjugapao do percentual de especies com alta afinidade foi seme- Ihante entre os tratamentos 2,0 e 7,5 mM de periodato.

[00282] Figura 15F mostra os efeitos da variapao da quantidade M6P. SAM6 conjugados continham a seguinte quantidade de M6P: SAM6-1 (4,9 mol M6P/mol rhGAA), SAM6-2 (7,4 mol M6P/mol rhGAA), SAM6-3 (10,5 mol M6P/mol rhGAA), SAM6-4 (11,2 mol M6P/mol rhGAA), e SAM6-5 (16,6 mol M6P/mol rhGAA). A significancia estatis- tica e indicada porA , * e *** e representa p <0,05 em comparapao com 100 mg/kg de rhGAA, SAM6-1 e SAM6-3, respectivamente.

C.Internalizacao por Mioblastos L6.

[00283] Um ensaio de absorpao de mioblastos L6 foi realizado conforme descrito em Zhu et al. J. Biol. Chem. 279:50336-50341 (2004), para demonstrar a orientapao dos rhGAA e NeoGAA para mioblastos atraves do cation receptor independente de via manose- 6-fosfato (CIMPR). No ensaio de absorpao de mioblastos L6, rhGAA e NeoGAA foram adicionados +/- 5mM de M6P aos meios de comunicapao nos popos contendo mioblastos L6 e incubados por um periodo predeterminado durante a noite. Apos a incubapao, as celulas foram lisadas e ensaiadas para atividade usando substrato glicosideo 4-MU, e a concentrapao de proteina atraves de um ensaio de micro-BCA, para gerar uma curva de resposta de dose de enzima.

[00284] Resultados do ensaio de absorpao de mioblastos L6 sao mostrados na Figura 16. Conjugados SAM2 e GAM2 mostraram cap- tapao significativamente superior a rhGAA inalterado, mas nao tao ele- vados como SAM6 bisfosforilado ou GAM6 conjugados (Figura 16, parte superior do painel). A absorpao de NeoGAAs SAM2, SAM3, SAM4, SAM4 Linear, e aSAM6 tambem foram testadas (Figura 16, parte inferior do painel). Em um experimento semelhante, o conjugado de lisina-tiol do Exemplo 7 ~ produziu um aumento de 8 vezes na cap- tapao.Exemplo 9: Efeitos de Conjugados GAA Novos In Vivo

[00285] Os efeitos in vivo de certos conjugados NeoGAA foram in- vestigados em um modelo de camundongo nocaute GAA descrito no Raben et al. J. Biol. Chem. 273 (30): 19086-92 (1998). Grupos de seis ratos cada foram tratados uma vez por semana durante quatro sema- nas como segue:

[00286] Foram coletadas amostras de coragao, quadriceps e triceps, e medido o conteudo de glicogenio tecidual. Os resultados para animais SAM2, SAM4 e SAM6 sao mostrados nas Figuras 17, 18 e 19, respectivamente. O experimento foi repetido com grupos de 12 animais usando SAM6 conjugados, confirmando que os SAM6 conjugados foram mais de cinco vezes mais potentes que rhGAA inalterado.

[00287] Conjugados hexassacandeos SAM e GAM tambem foram comparados usando grupos de seis camundongos que receberam veiculo, 20, 60 ou 100 mg/kg de rhGAA ou 4, 12 ou 20 mg/kg de SAM6 ou GAM6 uma vez por semana durante quatro semanas. Coragao, quadriceps, triceps diafragmas e psoas foram colhidos e analisados quanto ao teor de glicogenio. A Figura 20 mostra os resultados do presente estu- do. Estudos farmacocineticos e farmacodinamicos: Trinta camundongos nocaute GAA (15 machos e 15 femeas), de 3-6 meses de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Cada grupo de dose continha 5 machos e 5 femeas. Os animals foram agrupados alo- jados e mantidos a 25 0 C de umidade com uma luz de 12 horas/ciclo escuro. Todos os animals tiveram livre acesso aos alimentos (PicoLab® Rodent Diet 20) e agua. Os animals foram divididos aleatoriamente em tres grupos de dose de 5 machos e 5 femeas/grupo de um total de 10 ratos por grupo de dose. Grupos receberam uma unica administrapao intravenosa de rhGAA, GAM e conjugados SAM a 20 mg/kg. Amostras de sangue para analise farmacocinetica foram coletadas em 5, 15, 30, 60, 120, 240 e 480 minutos apos a administrapao atraves do plexo retro-orbital em ratos conscientes. Concentrapoes de rhGAA no soro foram determinadas usando o ensaio da atividade da GAA. Os resultados sao mostrados na Figura 20B.Exemplo 10: A sintese de um conjugado de acido esfingomieli- nase

[00288] A esfingomielinase acida humana recombinante (rhASM), expressa em um sistema de expressao de baculovirus, ou em celulas de ovario de hamster chines tem um terminal em Cde cisteina com um grupo tiol livre. Veja Lansmann et al. Eur. J. Biochem. 270:1076-1088 (2003); Qiu et al, J. Biol . Chem. 278:32744-32752 (2003). rhASM pode ser acoplado, atraves desse grupo tiol livre, com qualquer um dos oligossacandeos 1127, em que o oligossacarideo e composto por um ligador e um grupo reativo a tiol, de acordo com o Metodo descrito no pedido provisorio de patente US n0 60/885. 457 ou Exemplo 6.Exemplo 11: Sintese de um conjugado de a- L-iduronidase

[00289] a-L- iduronidase e acompanhado de qualquer dos oligossacandeos 1-127, em que o oligossacarideo compreende um ligante incluindo um grupo propionaldeido reativa, de acordo com a Metodo descrito em Lee et al. Pharm . Res. 20:818-825 (2003). a-L- iduroni- dase e oligossacandeos estao ligados, na presenga de cianoborohi- dreto de sodio como agente redutor, em temperatura ambiente, pH 5,5, por 1 dia. Pequenas moleculas sao entao removidas da mistura de reagao por dialise ou diafiltragao.

[00290] Todas as referencias citadas neste documento sao incorpo- radas por referencia, na sua totalidade. Para as publicagoes e paten- tes ou pedidos de patentes incorporadas por referencia contradizem a invenCao contidas no caderno de encargos, o relatorio descritivo subs- tituira qualquer material contraditorio.

[00291] Todos os numeros que expressam quantidades de ingredientes, condiQbes de reagao, e assim por diante utilizadas na descrigao e reivindicaQoes, devem ser entendidos como sendo modificados em todas as instancias do termo "sobre", onde cerca significa, por exemplo, ± 5%. Assim, salvo indicagao em contrario, os parametros numeri- cos estabelecidos no caderno de encargos e creditos inscritos sao aproximagbes que podem variar dependendo das propriedades dese- jadas que buscam ser obtidas pela presente invenCao. No minimo, sem qualquer intengao de limitar a aplicagao da doutrina de equivalen- tes ao alcance das reivindicaQoes, cada um dos parametros numericos deve ser interpretado a luz do numero de digitos significativos e arre- dondamento de abordagens comuns.

[00292] Muitas modificagbes e variagbes desta invenção podem ser feitas sem se afastar do seu espirito e alcance, como sera evidente para os que sao versados na tecnica. As modalidades especificas aqui descritas sao oferecidas apenas como exemplo e nao pretendem ser uma limitagao de qualquer forma. Pretende-se que o relatorio descritivo e os exemplos sejam considerados apenas como exemplo, com um verdadeiro alcance e espirito de invenção indicado pelas seguintes reivindicagbes.

Claims (24)

1. Metodo de preparar um composto que apresenta a Formula VII:

Formula VIIem que:Ri e escolhido de hidrogenio, hidroxila, um grupo alquila linear ou ramificado que apresenta de 1 a 4 carbonos, grupo alquila linear ou ramificado que apresenta 1 a 4 carbonos substituidos por halo, ciano, oxo, nitro, sulfato ou fosfato, fosfato, sulfato, -OR7, um grupo de protecao e um sacandeo;R2, R3, R4 e R5 sao, cada, escolhidos independentemente a partir de hidrogenio, sulfato, hidroxila, -ORs, um grupo de protecao e um sacandeo;Re e escolhido de hidroxila, carboxila, alcoxicarbonila, amino, amida, alquilamino C1-C20 linear ou ramificado, aminoalquila C1-C20 linear ou ramificado, aminoxi, hidrazida, hidrazina, alquenila C2-C20 linear ou ramificada, alquenila C2-C20 linear ou ramificado substituida por halo, ciano, oxo, nitro, sulfato ou fosfato, alquila C2-C6 linear ou ramificada e alquila C2-C6 linear ou ramificada substituida por halo, ciano, oxo, nitro, sulfato ou fosfato;R7 e Rs sao, cada, escolhidos independentemente a partir de acetila, um grupo alquila linear ou ramificado inferior que apresenta 1 a 4 carbonos e um grupo alquila linear ou ramificado inferior que apresenta de 1 a 4 carbonos substituido por halo, ciano, oxo, nitro, sulfato ou fosfato; en e um numero inteiro de 1 a 10;caracterizado pelo fato de que compreende:a) tratar um composto tendo a Formula VIII:

em que:Ri a Rs sao definidos como acima; eR9 e R10 sao escolhidos de hidrogenio e hidroxila, de modo que quando um R9 e R10 e hidroxila, o outra e hidrogenio; com um composto tendo a Formula RnRi2(Sn=O) para formar um composto com a Formula IX:

Formula IXem que:R1 a R5 sao definidos como acima; eR11 e R12 sao, cada, escolhidos independentemente a partir de alquila C1-C20 linear ou ramificada insubstituida, ou Rn e R12, tornados juntos, sao escolhidos a partir de alquileno C1-C20 linear ou ramificada insubstituido; eb) tratar um composto tendo a Formula IX, opcionalmente na presenga de um haleto de metal, com um composto tendo a Formula R6-(CH2)n-L, em que:Re e n sao definidos como acima; eL e um halogenio; para formar o composto da Formula VII.

2. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que Re e um alquil ester linear ou ramificado que apresenta 2 a 20 carbonos e n e 2, 3 ou 4.

3. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto da Formula Re-(CH2)n-L e 4-bromobutirato de metila.

4. Metodo, de acordo com a reinvindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto da Formula VIII e selecionado de manose, ramnose, idose, talose e altrose opcionalmente protegidas.

5. Metodo, de acordo com a reinvindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto da Formula VIII e manose opcionalmente protegida.

6. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o haleto de metal e um fluoreto de metal.

7. Metodo, de acordo com a reinvindicação 6, caracterizado pelo fato de que o fluoreto de metal e selecionado de fluoreto de cesio, fluoreto de sodio, fluoreto de calcio, fluoreto de magnesio, fluoreto de litio e fluoreto de potassio.

8. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b compreende ainda reagir o composto da Formula IX na presenga de um haleto de tetra-alquilamonio.

9. Metodo, de acordo com a reinvindicação 8, caracterizado pelo fato de que o haleto de tetra-alquilamonio e iodeto de tetra- alquilamonio.

10. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que Rn e R12 sao, cada, butila, Rn e Ri2sao, cada, hexila, ou R11 e R12, tornados juntos, formam hexametileno.

11. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto da Formula VIII e manose opcionalmente protegida e o composto da Formula Re-(CH2)n-L e 4-bromobutirato de metila.

12. Metodo, de acordo com a reinvindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que o composto da Formula VIII e selecionado de 3,4,6-tri-O-benzil-a-D-manose e 3-O-alil-6-O-tritil-a-D-manose.

13. Metodo, de acordo com a reinvindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que o composto da Formula VIII e 3-O-alil-6-O-tritil-a- D-manose.

14. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar sequencialmente pelo menos um monossacarideo opcionalmente protegido para o composto de Formula VII formar um oligossacarideo.

15. Metodo, de acordo com a reinvindicação 14, caracterizado pelo fato de que o oligossacarideo e um hexassacarideo.

16. Metodo, de acordo com a reinvindicação 15, caracterizado pelo fato de que o hexassacarideo e

17. Metodo, de acordo com a reinvindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto de Formula Re-(CH2)n-L e 4- bromobutirato de metila, e o metodo compreende ainda anexar um li- gante aminoxi ao hexassacarideo no butirato de metila.

18. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que Re e um alcoxicarbonil.

19. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que n e 2, 3, 4, 5 ou 6 e Re e um C1-C4alcoxicarbonil.

20. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que n e 3 e Re e metoxicarbonil.

21. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de Formula VII e:

22. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que Re e um aminoxi.

23. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de variar as posipoes e identidades dos grupos protetores no referido composto, incluindo a adipao de grupos protetores adicionais ao referido composto.

24. Metodo, de acordo com a reinvindicação 23, caracterizado pelo fato de que o produto do referido metodo e um composto da formula:

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