JP2017000136A - スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、皮膚の機能に大きく影響するセラミド合成促進剤を容易に見出すためのスクリーニング方法を得ることにある。【解決手段】本発明者らが鋭意検討した結果、Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を促進する物質がセラミドの合成を促進することがわかった。この方法であれば、多くの遺伝子発現を促進するか試験する必要はなく、容易にスクリーニングできる。【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子の発現を指標にした容易に実施可能なスクリーニング方法である。
スフィンゴ脂質の１つであるセラミドは、皮膚の最も外側の層である角層中に含まれる脂質の４０〜６０％を占めている。セラミドは、角層の下に位置する顆粒層が生成する層板顆粒に由来し、角層中において水分子と水素結合することで、層状構造（ラメラ構造）を構築し、角層中の水分保持（保湿）機能や、バリア機能に関与している。角層中のセラミドの量が減少すると、皮膚の保湿機能やバリア機能が低下し、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症、乾癬等の皮膚疾患を引き起こすと考えられている。
角層細胞間脂質中におけるセラミド量の減少は、バリア機能又は保湿機能の機能低下に深く関与することが知られているため、皮膚外用剤などの形態によりセラミドを直接的に補給する試みも行われている（特許文献１）
しかしながら、セラミドを直接的に補給しても効果の持続性が不十分であり、また、皮膚の状態によっては、皮膚への浸透性が不十分な場合があるなどの欠点があった。
以上のことより表皮細胞自身のセラミド合成を活発にする方法が有効である。
そこで各種の方法を用いてセラミド合成促進剤のスクリーニングを行っている。例えば、セラミド合成律速酵素(セリンパルミトリルトランスフェラーゼ (SPT))（特許文献２ ＷＯ２００８／０５３９６０）、セラミド合成酵素（β-グルコセレブロシダーゼ）（特許文献３）、ＬＡＳＳ３、ＬＡＳＳ４（特許文献４）、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤（特許文献５）、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用試験（特許文献６）等が挙げられる。
しかしながら、セラミド合成には多くの遺伝子が関わっており、１つの遺伝子の発現でセラミドの合成を促進するかは不明である。
また、Ｃｔｉｐ２（COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) - TF (transcription factor) - interaction protein 2）は、核内受容体の１種であり、心臓、血管、筋肉および手足を含む組織および器官の発達を制御する際に重要な役割を果たしていることは判明しているが具体的な関与は充分に解明されていない。
角層細胞間脂質中におけるセラミド量の減少は、バリア機能又は保湿機能の機能低下に深く関与することが知られているため、皮膚外用剤などの形態によりセラミドを直接的に補給する試みも行われている（特許文献１）
しかしながら、セラミドを直接的に補給しても効果の持続性が不十分であり、また、皮膚の状態によっては、皮膚への浸透性が不十分な場合があるなどの欠点があった。
以上のことより表皮細胞自身のセラミド合成を活発にする方法が有効である。
そこで各種の方法を用いてセラミド合成促進剤のスクリーニングを行っている。例えば、セラミド合成律速酵素(セリンパルミトリルトランスフェラーゼ (SPT))（特許文献２ ＷＯ２００８／０５３９６０）、セラミド合成酵素（β-グルコセレブロシダーゼ）（特許文献３）、ＬＡＳＳ３、ＬＡＳＳ４（特許文献４）、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤（特許文献５）、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用試験（特許文献６）等が挙げられる。
しかしながら、セラミド合成には多くの遺伝子が関わっており、１つの遺伝子の発現でセラミドの合成を促進するかは不明である。
また、Ｃｔｉｐ２（COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) - TF (transcription factor) - interaction protein 2）は、核内受容体の１種であり、心臓、血管、筋肉および手足を含む組織および器官の発達を制御する際に重要な役割を果たしていることは判明しているが具体的な関与は充分に解明されていない。
本発明の目的は皮膚の機能に大きく影響するセラミド合成促進剤を容易に見出すためのスクリーニング方法を検討した。
本発明者らが鋭意検討した結果、Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を促進する物質がセラミドの合成を促進することがわかった。
この方法であれば、多くの遺伝子発現を促進するか試験する必要はなく、容易にスクリーニングできる。
勿論、さらにスクリーニングでセラミド合成促進剤として有望な物質が抽出できれば、さらに様々な有効性、安全性の試験を実施して、セラミド合成促進剤としてより有効であるか確認する。
まず、使用する細胞は通常ヒトの表皮ケラチノサイトを用いる。
表皮ケラチノサイトとしては、いずれの部位の表皮細胞を用いてもよく、例えば新生児の包皮、成人女性の乳房などの表皮細胞を用いることができる。表皮細胞としては市販の表皮細胞を用いることもできる。このような市販の表皮細胞の例としては、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（クラボウ社製）などを挙げることができる。
これにスクリーニング対象の試料を加えて２４〜７２時間程度培養し、同時にスクリーニング対象の試料を加えず培養した細胞中からＲＮＡを抽出、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、適切なＰＣＲプライマーを設定しリアルタイムＰＣＲを用い、コントロールを１とした時の相対値として算出する。
この方法であれば、多くの遺伝子発現を促進するか試験する必要はなく、容易にスクリーニングできる。
勿論、さらにスクリーニングでセラミド合成促進剤として有望な物質が抽出できれば、さらに様々な有効性、安全性の試験を実施して、セラミド合成促進剤としてより有効であるか確認する。
まず、使用する細胞は通常ヒトの表皮ケラチノサイトを用いる。
表皮ケラチノサイトとしては、いずれの部位の表皮細胞を用いてもよく、例えば新生児の包皮、成人女性の乳房などの表皮細胞を用いることができる。表皮細胞としては市販の表皮細胞を用いることもできる。このような市販の表皮細胞の例としては、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（クラボウ社製）などを挙げることができる。
これにスクリーニング対象の試料を加えて２４〜７２時間程度培養し、同時にスクリーニング対象の試料を加えず培養した細胞中からＲＮＡを抽出、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、適切なＰＣＲプライマーを設定しリアルタイムＰＣＲを用い、コントロールを１とした時の相対値として算出する。
しかしながら上記の方法に拘らず、Ｃｔｉｐ２遺伝子の発現量を指標すれば類似の方法でもなんら問題はなく、スクリーニングの対象物がＣｔｉｐ２遺伝子の発現量を増加させるか確認できる方法であればなんら限定させるものではない。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、スクリーニング対象物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、スクリーニング対象物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
＜使用プライマー＞
Ｃｔｉｐ２：フォワードプライマーがＧＧＡＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット
Ｃｔｉｐ２：フォワードプライマーがＧＧＡＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット
この実施例に以下の試料を培地中に mg／mlになるように加え、試料を加えないで試験したものの遺伝子発現量を１として表した。
試料は以下のように作成した。
試料１
ヒバマタ(Fucus vesiculosus)（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料２
アルニカ属の植物（Arnica montana）（花、乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料３
サガラメ（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料４
シロバナイリス（Iris florentina）の根（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料５
大豆（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料１
ヒバマタ(Fucus vesiculosus)（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料２
アルニカ属の植物（Arnica montana）（花、乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料３
サガラメ（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料４
シロバナイリス（Iris florentina）の根（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
試料５
大豆（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
さらに抽出したＲＮＡに対して、以下の遺伝子に関しても同様にＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲを行い、それぞれの遺伝子発現量を測定した。
１．ＳＰＴＬＣ セリンパルミトイル転移酵素
２．Acid-ceramidase
３．Gal-ceramidase
４．ＳＧＭＳ１（sphingomyelinase）
５．ＳＭＰＤ スフィンゴミエリン分解酵素
１．ＳＰＴＬＣ セリンパルミトイル転移酵素
２．Acid-ceramidase
３．Gal-ceramidase
４．ＳＧＭＳ１（sphingomyelinase）
５．ＳＭＰＤ スフィンゴミエリン分解酵素
Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を促進する試料１〜３は、セラミド合成に関わるＳＰＴＬＣ、Acid-ceramidase、Gal-ceramidas、ＳＧＭＳ、ＳＭＰＤのすべての遺伝子の発現も促進した。
また、Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を抑制する試料４〜６は、ＳＰＴＬＣ、Gal-ceramidasの遺伝子の発現を抑制し、他の遺伝子も抑制するか、遺伝子の増減がほとんどない程度で、総合的に試料１〜３に比較して遺伝子発現量はかなり減少している。
このように、Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を試験すれば、セラミド合成に関わる遺伝子の増減も高い確率で推定でき、セラミド合成促進成分のスクリーニング方法して最適である。
また、Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を抑制する試料４〜６は、ＳＰＴＬＣ、Gal-ceramidasの遺伝子の発現を抑制し、他の遺伝子も抑制するか、遺伝子の増減がほとんどない程度で、総合的に試料１〜３に比較して遺伝子発現量はかなり減少している。
このように、Ｃｔｉｐ２の遺伝子発現を試験すれば、セラミド合成に関わる遺伝子の増減も高い確率で推定でき、セラミド合成促進成分のスクリーニング方法して最適である。
Claims (3)
- 細胞中のＣｔｉｐ２遺伝子の発現量を指標とするセラミド合成促進成分のスクリーニング方法。
- 細胞中のＣｔｉｐ２遺伝子の発現量を指標とするアトピー皮膚炎予防及び治療成分のスクリーニング方法。
- 細胞がヒト由来表皮細胞である請求項１乃至請求項２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015118222 | 2015-06-11 | ||
| JP2015118222 | 2015-06-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017000136A true JP2017000136A (ja) | 2017-01-05 |
Family
ID=57752387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016093531A Pending JP2017000136A (ja) | 2015-06-11 | 2016-05-09 | スクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2017000136A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022181438A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 国立大学法人神戸大学 | 被験試料の皮膚における異物応答反応の惹起性の評価方法、皮膚における異物応答反応の抑制性を有する物質の探索方法、及び、皮膚における異物応答反応を抑制する剤 |
-
2016
- 2016-05-09 JP JP2016093531A patent/JP2017000136A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. CELL SCI., vol. Vol.125, JPN6018033796, 2012, pages 5733 - 5744 * |
| J. INVEST. DERMATOL., vol. Vol.133, JPN6018033795, 2013, pages 668 - 676 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022181438A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 国立大学法人神戸大学 | 被験試料の皮膚における異物応答反応の惹起性の評価方法、皮膚における異物応答反応の抑制性を有する物質の探索方法、及び、皮膚における異物応答反応を抑制する剤 |
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