JP2016537011A - Lg12−系統群プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年9月12日出願の米国仮特許出願番号第61/877,087号に基づく優先権にかかる利益を主張するものであって、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えDNAにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書の上述の及び以降に記載されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用するとき、LG12−系統群の酵素には、酵素、ポリポリペプチド又はタンパク質、あるいはその活性断片が包含される。本酵素には、実施例、図9A、図9B、図10A、図10Bに示すアライメント、及び/又は図8の系統樹に記載の通りのLG12−系統群のメンバーが包含される。LG12−系統群のメンバーは、LG12sprCと相同性の近いスブチリシン分子を選択し、これらの配列と他のスブチリシンとの構造ベースのアライメントを生成し、すべてのLG12−系統群の酵素について保存されていた固有の配列領域を特定することにより特定される。いくつかの実施形態では、LG12酵素の系統群は、スブチリシンプロテアーゼを含む、親、野生型、及び/又は変異体配列は、次のアミノ酸モチーフ:Ser221、His64、及びAsp32を含む触媒三残基;位置55〜58のPro、Asp/Asn、Ala、Leuモチーフ;Thr103−Leu104モチーフ;Tyr86−Asn/Asp87モチーフ;Ala16−His17モチーフ;Val21−Thr22モチーフ、及び/又は位置267から始まるC末端モチーフ:Val、Ile、Asp/Asn、Val/Leu、Glu、X、Ala、Leu、Glnのうち1つ以上を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、残基番号はLG12sprC(配列番号3)に対応するものである。LG12野生型酵素の系統群の配列であれば、本発明のスブチリシン酵素変異体を生成するための親配列として使用することができる。いくつかの実施形態では、LG12酵素の系統群のスブチリシンプロテアーゼは、上記の通りのシグネチャモチーフのうちいずれか1つ以上を有し得る。LG12−系統群のメンバーは、近隣結合法を利用して作製した系統樹において同じ分岐点でクラスター化されることが確認されている(Saitou,N.and Nei,M.(1987)MolBiol.Evol.4:406〜425を参照されたい)。LG12−系統群の配列同一性は、LG12sprC配列(配列番号3)に対し少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である酵素を包含する。LG12−系統群のメンバーは:LG12sprC(配列番号3,AAC43580.1)、バチルス種(Bacillus sp.)m3−13スブチリシンE(1)(配列番号7,WP_010192403.1,旧称ZP_07707657.1)、バチルス種(Bacillus sp.)KSM−LD1,SB(BAD21128.1)、バチルス種(Bacillus sp.)m3−13スブチリシンE(2)(WP_10192405.1,旧称ZP_07707658.1)、バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM 8719,Bhon03321(配列番号10)、LG12sprD(AAC43581.1)、バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM_9711(配列番号13)、バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM_9712(配列番号16)、バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM_6951(配列番号19)、及びバチルス種(Bac sp)BAD21128(配列番号20)を含む。
本発明は、LG12−系統群の酵素、例えば、LG12sprCセリンプロテアーゼのアミノ酸位置であって、望ましく改変することで、クリーニング性能、洗剤組成物中での酵素の安定性、及び酵素の熱安定性について最低限の性能指数が得られ、かつこれらの特性のうちの少なくとも1つが、上記の例における配列番号3のLG12sprCなどのLG12−系統群の親酵素から改良される、アミノ酸位置を提供する。これらの改変は、本発明の好適な改変と考えられる。
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ。
9S、V203A、V203D、V203E、V203G、V203L、V203T、L233A、L233D、L233G、L233H、L233M、L233T、L250I、L250T、K012D、K012E、K012G、K012H、K012L、K012M、K012R、K012T、K012Y、D036A、D036E、D036W、V072A、V072D、V072E、V072F、V072K、V072P、V072Q、V072T、Y167A、Y167D、Y167E、Y167F、V180A、V180N、V180S、V180T、G080F、G080M、G080Y、S156A、S156D、S156H、S156I、S156L、S156M、S156N、S156Q、S156V、S172H、S172I、S172L、S172M、S172N、S172T、S172V、S172Y、S188G、S188H、S188T、S188Y、Y238A、Y238C、Y238D、Y238F、Y238G、Y238I、Y238K、Y238L、Y238M、Y238Q、Y238T、Y238V、Y238W、T255A、T255D、T255F、T255G、T255H、T255I、T255K、T255L、T255M、T255N、T255Q、T255S、T255W、T255Y、N256D、N256E、N256K、N256L、N256M、N256P、N256Q、N256R、N256V、N256W、I035A、I035F、I035G、I035L、I035M、I035T、V227F、V227S、V227T、V227Y、F262E、F262S、G106E、G106I、G106N、G106S、T133A、T133D、T133F、T133L、T133M、T133N、T133Q、T133V、N161D、N161E、N161F、N161M、N161Q、N161W、N161Y、R170K、R170L、R170M、A108C、A108I、A108L、S114G、S114T、G118E、G118H、G118Q、G118R、G118S、G118T、G118Y、G146Q、G146R、D060A、D060E、D060F、D060H、D060K、D060L、D060M、D060N、D060P、D060Q、D060S、D060T、D060V、D060Y、W113F、W113H、W113Y、A138E、A138S、N140D、N140F、N140G、N140I、N140L、N140M、N140Q、N140T、N140V、N140W、N140Y、V149A、V149D、V149E、V149F、V149G、V149H、V149I、V149L、V149N、V149P、V149Q、V149S、V149T、I150A、I150M、I150N、I150T、I150V、N212F、N212G、N212L、N212P、N212W、S216A、A228S、P239F、P239I、P239K、P239T、P239V、P239W、Q002E、Q002K、Q002P、Q002S、Q002W、Q002Y、S207T、S207V、F217D、F217E、F217H、F217I、F217R、F217T、F217V、H226D、H226E、H226F、H226G、H226L、H226Q、H226T、A230D、A230F、A230H、A230M、A230Q、A230Y、Q059I、Q059N、A016E、A016G、A016H、A016I、A016K、A016L、A016Q、A016T、A016W、G023A、A200S、P210D、P210E、P210F、P210I、P210L、P210Q、P210S、P210T、P210V、P210W、S159D、S159E、S159N、S159Q、S159T、G063A、G063D、G063E、G063F、G063H、G063L、G063M、G063N、G063P、G063R、G063S、G063T、G063V、G063W、G063Y、A098H、A098L、A098M、A098P、A098Q、A098S、A098T、A098V、Q109K、I122L、I122M、G128N、V198A、V198C、V198F、T209E、T209M、T209Q、T209R、T209S、T209V、T209W、N213A、N213D、N213E、N213F、N213G、N213M、A236C、A236F、A236G、A236L、A236N、A236Q、A236V、S240F、S240I、S240M、S240P、S240Q、S240V、S240W、T242A、T242E、T242G、T242H、T242I、T242K、T242L、T242P、T242Q、T242S、T242V、T242Y、P260C、P260I、P260L、P260M、P260N、P260S、P260V、G258D、Y263T、Y263W、N141G、N141T、S173A、S173D、S173N、S173T、Y214F、Y214G、Y214I、Y214M、Y214N、P009A、P009G、P009H、P009M、P009Q、P009R、P009T、P009V、H010A、H010L、L096H、L096I、S116F、S116M、G025A、V044A、V044I、V081G、V081L、V081M、V081P、V081Y、N269K、N269T、N269V、H039G、H039S、H039T、K235A、K235D、K235E、V267A、V267E、V267F、V267G、V267I、V267K、V267L、V267N、V267S、V267T、V267Y、A151H、A151I、A151Q、A151S、A151T、G160F、G160H、G160M、G160V、M222E、M222H、M222L、及びM222Yからなる群から選択される置換を含む。
本発明は、総じて「本発明のポリペプチド」として参照することのできる新規ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドには、単離されたLG12−系統群酵素ポリペプチド、LG12−系統群酵素ポリペプチドの組換体、実質的に純粋なLG12−系統群酵素ポリペプチド、又は非天然に生じかつ新規に発見されたLG12−系統群酵素ポリペプチドを含み、例えば、酵素活性(例えば、プロテアーゼ活性)を有するLG12sprC酵素変異体ポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、クリーニング用途に有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面(例えば、物品の表面)をクリーニングする方法に有用なクリーニング組成物中に組み込まれ得る。
本発明は、単離された、天然に由来するものではない、又は組み換え型の核酸(本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる)を提供し、これは集合的に本発明のポリペプチドをコードする「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。以下に記載のすべてのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生(例えば発現)に有用である。上述のように、ポリペプチドには、例えば、酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)を有する、LG12−系統群の変異体ポリペプチドなどの変異型プロテアーゼのポリペプチドが包含され、プロテアーゼ変異体ポリペプチドは、クリーニング用途、及びクリーニングする必要のある物品又は表面(例えば、物品の表面)をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている本発明の改変されたポリヌクレオチドを生成するのに好適であるものとして様々な方法が既知であり、例えば、部位飽和変異導入(site-saturation mutagenesis)、系統的変異導入、挿入変異導入、欠失変異導入、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、オリゴヌクレオチド合成法及びライゲーションによる合成遺伝子の構築、並びに定向進化、更にはその他の各種リコンビナトリアルなアプローチが挙げられるがこれらに限定されない。改変されたポリヌクレオチド及びタンパク質(例えば、プロテアーゼ変異体)の作製方法としては、DNAシャッフリング法、ITCHY(Ostermeier et al.,7:2139〜44[1999])、SCRACHY(Lutz et al.98:11248〜53[2001]を参照されたい)、SHIPREC(Sieber et al.,19:456〜60[2001]を参照されたい)、及びNRR(Bittker et al.,20:1024〜9[2001];Bittker et al.,101:7011〜6[2004]を参照されたい)などの遺伝子の非相同組み換えによる方法、並びにオリゴヌクレオチドを利用してランダムな及び標的とする変異、欠失及び/又は挿入を挿入する方法(Ness et al.,20:1251〜5[2002];Coco et al.,20:1246〜50[2002];Zha et al.,4:34〜9[2003];Glaser et al.,149:3903〜13[1992]を参照されたい)が挙げられる。
本発明は、本明細書に記載の少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載の本発明の変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド)を含む単離若しくは組み換え型のベクター、少なくとも1種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離若しくは組み換え型の発現ベクター又は発現カセット、少なくとも1種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えDNA構築物、少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチドを含む単離又は組み換え型細胞、少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物、少なくとも1種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、DNA構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を1種以上含む組成物を提供する。
例えば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体は真菌及び/又は細菌由来の宿主細胞で生産される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス種(Bacillus sp.)、ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)、エシェリキア種(Escherichia sp.)、又はアスペルギルス種(Aspergillus sp.)である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体は、バチルス種(Bacillus sp.)の宿主細胞により生産される。本発明のプロテアーゼ変異体の産生への使用が見出されるバチルス種(Bacillus sp.)宿主細胞の例としては、バチルス・リケニフォルミス(B. licheniformis)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・スブチリス(B. subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス(B. brevis)、バチルス・ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィラス(B. alkalophilus)、バチルス・コアギュランス(B. coagulans)、バチルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス・プミリス(B. pumilis)、バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、バチルス・クラウシイ(B. clausii)、及びバチルス・メガテリウム(B. megaterium)、並びにバチルス(Bacillus)属に属するその他の生物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、バチルス・スブチリス(B. subtilis)宿主細胞は、プロテアーゼ変異体の産生に使用される。米国特許第5,264,366号及び同第4,760,025号(再発行特許第34,606号)は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができる様々なバチルス属の宿主株を記述しているが、他の好適な株も使用することができる。
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルはすべて、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率(%)及び比率はすべて、特に断りのない限り、重量で計算している。すべての百分率(%)及び比率は、特に断りのない限り、総組成物に対し計算している。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に組成配合されて、配合者により選択された任意の好適なプロセスにより調製される(例えば、米国特許第5,879,584号、同第5,691,297号、同第5,574,005号、同第5,569,645号、同第5,565,422号、同第5,516,448号、同第5,489,392号、同第5,486,303号、同第4,515,705号、同第4,537,706号、同第4,515,707号、同第4,550,862号、同第4,561,998号、同第4,597,898号、同第4,968,451号、同第5,565,145号、同第5,929,022号、同第6,294,514号及び同第6,376,445号を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、表面(例えば、食器類))、洗濯物、硬質表面、コンタクトレンズなどのクリーニングにおける使用が見出される。いくつかの実施形態では、表面の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物の少なくとも一実施形態と接触させ、そしてその後、場合により、表面を洗浄及び/又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的洗浄が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、溶液中約500ppm〜約15,000ppmの濃度で使用される。洗浄溶媒が水であるいくつかの実施形態では、水温は、典型的には約5℃〜約90℃の範囲である。
本発明の更なる態様では、本発明のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドは、LG−12系統群のプロテアーゼ及びそれらの変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加剤、及び/又はペットフードの成分として使用することができる。更に、本発明は、1種類以上の動物飼料材料、及び/又は動物飼料添加物成分、及び/又はペットフード材料に、LG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドを混合することを含む、このような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物、及び/又はペットフードの調製方法に関する。更に、本発明は、動物飼料組成物、及び/又は動物飼料添加組成物、及び/又はペットフードの調製における、LG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドの使用に関する。
本発明のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドを用いて布地を処理する(例えば、布地を湯通しする)組成物及び方法も想到される。布地の処理方法は当該技術分野においてよく知られている(例えば、米国特許第6,077,316号を参照されたい)。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中のLG−12系統群のプロテアーゼと接触させる工程を含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
本明細書に記載のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドは、酵素により補助される製紙パルプ漂白への更なる使用が見出されており、例えば、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、機械パルプ又は亜硫酸塩法によリ調製されたパルプなどの漂白への更なる使用が見出されている。おおまかに言えば、製紙パルプの漂白に好適な条件下で製紙パルプを本発明のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドとインキュベートする。
本明細書に記載のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドは、羽毛、皮膚、毛髪、皮革、及び等価物などの動物由来のタンパク質の酵素による除去及びそれらの分解又は廃棄への使用が更に見出される。いくつかの例では、本発明のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドを含む溶液中に動物の死骸を浸漬することで、従来の熱湯消毒水への浸漬又は抜羽プロセスと比較して皮膚を損傷から保護するよう機能させることができる。一実施形態では、羽毛には、羽毛の消化又は分解の開始に好適な条件下で、本発明の単離したメタロプロテアーゼポリペプチドを噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本発明のLG−12系統群のプロテアーゼは、上記の通りに酸化剤と組み合わせて使用することができる。
本明細書に記載のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドは、酵素による組織の創傷清拭の補助への使用が更に見出されている。これには、例えば、創傷から、死組織又は損傷組織を除去して治癒を補助することが包含される。
本明細書に記載のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドには、組織培養への使用が更に見出される。特に、本発明のLG−12系統群のプロテアーゼは、細胞の回収プロセス中などに、細胞培養壁に接着している細胞を懸濁又は再懸濁するのに使用できる。本発明のLG−12系統群のプロテアーゼは、培養細胞とディッシュとのタンパク質結合部を切断して、細胞を溶液に懸濁させるのに使用できる。
本明細書に記載のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドには、食品添加物、消化助剤、又は食品加工助剤としての使用も更に見出される。
本明細書に記載のLG−12系統群のプロテアーゼポリペプチドは、動物の皮からの毛髪の除去、浸漬、脱脂、又はベーチングによるものなどの、レザーの製造中の非構造タンパク質の分解を包含する、皮革加工への使用が更に見出される。
アッセイ
以下のアッセイは、以下に記載の実施例に使用した標準アッセイ法である。場合により、特定のプロトコルは、これらの標準アッセイにあてはまらないこともある。この場合、以下のこれらの標準アッセイプロトコルから外れた部分については、実施例中で規定する。
酵素の性能指数(PI)は、同一のタンパク質濃度にて、変異体(測定値)の性能を親酵素(理論値又は測定値)の性能と比較する。親酵素の理論濃度は、親酵素の標準曲線をラングミュア式に当てはめ抽出したパラメーターを利用して算出可能である。1を超える性能指数(PI)(PI>1)は、変異により、親(例えば、配列番号3のLG12sprC成熟タンパク質)と比較して性能が向上していることを示し、一方、PIが1の場合(PI=1)は、変異体の性能が親と同じであることを示し、PIが1未満である場合(PI<1)は、変異体の性能が親よりも劣ることを示す。
96ウェルのマイクロタイタープレート(MTP)で増殖させた培養物の上清を使用し、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)法を用いタンパク質を定量して、タンパク質の発現レベルを求めた。Acquity UPLC BEH 125 SEC(Waters)分子ふるいカラムを装備したAgilent 1200又は1260 HPLCを使用した。250mM塩化ナトリウムを含有させた25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)を用い、カラムからサンプルを溶出させた。220nmで吸光度を測定し、ChemStationソフトウェア(Agilent Technologies)によりピークを積分した。精製した野生型タンパク質(LG12−系統群のスブチリシン親酵素、配列番号3のsprC)の標準曲線をもとにサンプルのタンパク質濃度を求めた。
発色基質N−suc−AAPF−pNAの加水分解を測定することにより、LG12sprCプロテアーゼ及びそれらの変異体のプロテアーゼ活性を試験した。次の試薬溶液:使用した試薬溶液は、以下のものであった:0.005%のTWEEN(登録商標)−80を含有している100mMのトリス/HCl(pH8.6)(トリス希釈緩衝液)、10mMのCaCl2及び0.005%のTWEEN(登録商標)−80を含有している100mMトリス緩衝液(pH8.6)(トリス/Ca緩衝液)、並びに160mMのsuc−AAPF−pNA/DMSO(suc−AAPF−pNA保存溶液)(Sigma:S−7388)。基質の希釈溶液を調製するために、1mLのsuc−AAPF−pNA原液を100mLのTris/Ca緩衝液に加え、ウェルをよく混合した。1mg/suc−AAPF−pNA希釈液を入れたMTPプレート(Greiner 781101)に酵素サンプルを加え、室温で、SpectraMaxプレートリーダーを動態モードで使用して、405nmで3分間活性をアッセイした。プロテアーゼ活性は、mOD/min−1で表した。
高温下でのインキュベート後に残存している活性を測定し、様々なストレス条件下(下表1に記載の通りの緩衝液および洗剤)での適性について変異体を試験した。高温は、残存活性が約30%になるよう設定した。希釈した酵素サンプルをストレッサーに混合し、ストレスを加えていないプロテアーゼ活性を測定した。ストレッサーに加えた希釈サンプルを高温でインキュベートし、インキュベート後に、ストレスを加えたプロテアーゼの活性を測定した。
洗濯物ベースの用途については、BMI(綿に血液/牛乳/インクを染みこませたもの)布見本小片(EMPA−116)で、及び食器ベースの用途については、卵黄(ポリアクリル布に卵黄を染みこませ、エージングし、カーボンブラック染料で着色したもの)布見本小片(PAS−38)で、変異体のクリーニング性能を野生型LG12sprCと比較して試験した。
バチルス種(Bacillus sp)LG12sprCプロテアーゼの部位評価ライブラリ(SEL)の作製
バチルス・スブチリス(B. subtilis)aprEプロモーター、ハイブリッドaprE−BPN’のシグナルペプチド、ハイブリッドBPN’−LG12sprCプロテアーゼのプロペプチド、成熟LG12sprCプロテアーゼ及びBPN’ターミネーターから構成される発現カセットを使用して、LG12sprCプロテアーゼをバチルス・スブチリス(B. subtilis)で産生させた。このカセットを、EcoRI−BamHI断片としてpHYT複製シャトルベクターにクローニングした。BstEII及びEcoRI認識部位を使用して、テトラサイクリン耐性遺伝子の後ろに転写終結部位を付加し、pHY300PLK(Takara)からpHYTベクターを誘導した(配列番号21、転写終結配列、GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATGCATCGATGGAATTC)。BamHI及びHindIII認識部位にクローニングされているリンカーを利用して、pHY300PLKのHindIII認識部位も除去した(配列番号22、新しいリンカー配列、GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)。
GCTCAAACAGTTCCTTGGGGCATCCCTCATATCAAAGCTGACAAAGCGCATGCTGCTGGAGTGACTGGAAGCGGTGTGAAGGTTGCCATCCTGGATACAGGAATTGACGCAAACCATGCCGATCTTAACGTAAAAGGCGGAGCAAGCTTTGTTTCTGGAGAGCCGAATGCTCTTCAAGACGGTAACGGCCATGGAACACACGTAGCTGGAACAGTTGCTGCGTTGAATAACACAACTGGTGTACTTGGTGTAGCTTACAATGCTGACCTGTATGCAGTAAAAGTACTTAGTGCTTCAGGTAGTGGTACGTTAAGTGGTATTGCTCAAGGTATTGAGTGGTCGATCTCAAATGGAATGAATGTCATCAATATGAGTCTTGGTGGAAGCTCTGGTTCAACTGCTTTACAACAAGCGTGTAATAATGCTTATAACAGAGGCATTGTCGTAATTGCTGCTGCTGGGAATTCAGGTTCTTCAGGCAATCGGAATACGATGGGTTATCCTGCGAGATATAGCTCTGTAATCGCAGTAGGAGCGGTTAGTAGCAATAATACTCGTGCATCATTCTCCAGTGTAGGAAGTGAACTGGAAGTAATGGCACCAGGTGTCAACATTTTGAGCACAACTCCTGGCAACAATTATGCTTCCTTCAATGGTACATCCATGGCAGCTCCTCATGTTGCAGGAGCTGCTGCATTAATCAAAGCGAAATACCCAAGCATGACAAATGTTCAAATTCGTGAACGTCTGAAAAATACGGCTACAAATCTAGGTGATCCTTTCTTCTACGGAAAAGGTGTCATCAATGTGGAAAGTGCTTTACAG
AQTVPWGIPHIKADKAHAAGVTGSGVKVAILDTGIDANHADLNVKGGASFVSGEPNALQDGNGHGTHVAGTVAALNNTTGVLGVAYNADLYAVKVLSASGSGTLSGIAQGIEWSISNGMNVINMSLGGSSGSTALQQACNNAYNRGIVVIAAAGNSGSSGNRNTMGYPARYSSVIAVGAVSSNNTRASFSSVGSELEVMAPGVNILSTTPGNNYASFNGTSMAAPHVAGAAALIKAKYPSMTNVQIRERLKNTATNLGDPFFYGKGVINVESALQ
生産的位置及び組み合わせ可能な変異
生産的位置は、改善された特徴を示すコンビナトリアル変異体を製造するのに最も有用な分子内位置として記載され、この位置では、少なくとも1種の組み合わせ可能な変異が生じ得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアルな変異体を作製するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせ可能な変異は、この分子の所望の特性のうち少なくとも1種を改善するが、発現、活性、又は安定性のいずれかを有意に低下させないものである。
発現、プロテアーゼ活性、1つ以上のクリーニング活性アッセイでの活性、並びに1つ以上の安定性アッセイについて、変異体の最小性能指数(PI)が、親LG12sprCのものと比較して、0.9以上であり、更には、これらの試験のうちのいずれか1つについて、PIが1.0以上である(A群)。
4、7、8、12、14、16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、81、83、84、88、94、104、109、111、114、120、122、125、128、132、138、141、143、146、151、163、165、167、175、176、195、203、204、205、206、211、212、215、220、224、227、230、232、238、250、260、262、268、273、及び274。
1、3、18、19、20、22、24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265、及び272。
2、9、15、38、45、48、52、59、62、75、97、99、103、117、118、119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271、及び275。
27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、242、245、及び251。
以下の通りの異なるアッセイ条件下での性能に基づき、SEL変異体を更に様々に分類した。この解析に関し、HPLC PI値が0.75未満のSEL変異体は除外した。更に、各解析に関し、対応するCV値が0未満又は100超である場合にはPI値を考慮しなかった。
1)Kirkland Ultra HDD(pH10.6)、又はOMO Color HDD(pH10.6)において、HDDのPI値が1.01以上である。
2)OMO Klein & Krachtig HDL(pH8.2)において、HDL(pH8)のPI値が1.01以上である。
3)Blue Moon(pH6.5)において、HDL(pH6)のPI値が1.01以上である。
4)洗濯洗剤及び緩衝液、51℃のOMO Klein & Krachtig HDL(pH8.2)又は52℃のLAS−EDTA緩衝液において、洗濯安定性のPI値が1.01以上である。
5)洗剤、GSM−B、GSM−B(pH9)、GSM−C、Sun All in One、又はFinish Quantum tabletにおいて、ADWのPI値が1.01以上である。
6)洗剤及び緩衝液、68.5℃のGSM−B、62℃のGSM−C、51℃のTris EDTA緩衝液、72.5℃のTris−カルシウム緩衝液において、ADW安定性のPI値が1.01以上である。
A029T、I030A、I030V、A040D、A040E、A040H、A040K、A040L、A040N、A040R、A040T、A040V、A040W、A040Y、S101R、T103D、T103E、T103G、T103K、T103R、S052D、S052F、S052N、S052R、N183E、V093T、L031T、N117E、N117F、N117S、N117T、M124S、L126D、L126G、L126I、L126K、L126Q、N123D、S125G、S129A、S129D、S129K、S129Q、S130E、S130F、S130H、S130L、S130N、S130Q、S130T、S130V、S130W、S130Y、G131D、G131E、G131R、Q137E、S099K、G102E、G102F、G102Y、I107H、I107Q、N120E、V121G、S182D、S182E、T003E、T003I、T003V、A224P、A224S、K015V、P225G、T185Q、K027E、K027L、K027M、K027S、K027T、N043A、N043D、N043E、N043F、N043L、N043W、Q136D、Q136H、Q136R、Q136W、N163D、E248C、E248D、A019M、T022D、T022E、R145N、R145T、R145W、S158D、L090P、G100A、G100E、G100F、I147A、I147H、I147S、V148N、V148S、Q245M、Q245T、Q245V、I246N、N243G、S024H、S024T、S024V、K045D、K045E、K045F、K045L、K045Q、K045R、K045S、K045W、Q275E、Q275N、A048D、A048E、A048G、A048H、A048Q、A048Y、T078A、T078D、T078E、T078F、T078G、T078H、T078K、T078L、T078S、T078W、N087S、Y091H、Y091N、M241Q、M241S、M241W、V244Y、N252E、K265D、K265S、S272M、S272Q、N038A、N038D、N038E、N038T、K251A、K251C、K251F、K251M、K251N、K251R、K251S、K251T、K251V、F050Q、F050R、F050Y、V051I、N076D、N076S、T079L、T079Q、L075G、G166A、G166C、G166D、G166E、G166F、G166H、G166L、G166M、G166N、G166Q、G166S、G166T、G166Y、G053D、G053E、G053Q、G053R、Y143D、Y143E、S181A、S181H、S181N、S181Q、G154F、G154H、G154I、G154K、G154T、S194K、S194P、S194R、K237A、K237N、A215D、A215E、Y171G、Y171Q、K012G、V072A、V072T、S156A、S156D、S156H、S156K、S156M、S156N、S156Q、T255D、N256D、N256E、N256P、N256W、F262E、G106E、T133D、T133F、T133M、T133N、T133V、N161D、N161E、R170K、R170L、A108C、A108I、S114G、S114T、G118D、G118E、G118Q、G118S、G118T、G146N、A138E、A138S、N140D、V149A、V149E、V149G、V149L、V149N、V149Q、V149S、I150A、I150N、I150S、I150T、I150V、A152P、A152V、S216I、S216T、A228S、P239A、P239C、P239D、P239E、P239F、P239G、P239H、P239M、P239N、P239T、P239W、F217R、T220G、S159D、S159E、S159N、S159Q、G128N、T209F、T209V、T209W、T209Y、A236C、A236D、A236E、A236N、A236Q、A236S、S240P、S240Q、T242E、S173D、P009A、P009I、P009M、P009Q、P009S、P009T、P009V、L096E、L096H、L096I、L096R、L096Y、S116E、V081M、K235D、K235E、K235F、K235G、V267F、V267I、V267R、V267S、V267T、V267Y、M222A、M222H、及びM222Q
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A029T、I030V、A040D、A040E、A040H、A040K、A040L、A040N、A040Y、T103D、T103E、T103G、S052D、S052F、S052N、N183E、V093T、L031T、N117E、N117F、N117S、N117T、M124S、L126G、L126I、L126Q、N123D、S129A、S129D、S129Q、S130E、S130L、S130N、S130Q、S130T、G131D、Q137E、G102E、I107Q、V121G、S182D、S182E、T003E、T003I、T003V、A224S、K015V、T185Q、K027E、K027L、K027M、K027S、K027T、N043A、N043D、N043E、N043F、N043L、N043W、Q136D、Q136H、N163D、A019M、T022E、R145N、R145T、S158D、L090P、G100A、G100E、I147A、I147H、I147S、V148S、Q245M、Q245T、S024H、S024T、S024V、K045D、K045L、K045Q、K045R、K045S、K045W、Q275N、A048D、A048E、A048G、A048H、A048Q、T078A、T078F、T078H、T078L、T078W、N087S、Y091H、Y091N、M241Q、M241S、K265S、S272M、S272Q、N038A、N038D、N038E、N038T、K251A、K251C、K251F、K251M、K251N、K251R、K251S、K251T、K251V、F050Q、F050Y、V051I、N076D、N076S、T079L、T079Q、L075G、G166A、G166C、G166D、G166E、G166F、G166H、G166M、G166N、G166Q、G166S、G166Y、G053D、G053E、G053Q、Y143E、S181A、K237N、A215D、A215E、K012G、V072A、V072T、S156A、S156D、S156H、S156M、S156N、S156Q、T255D、N256D、N256E、N256P、N256W、F262E、G106E、T133D、T133F、T133M、T133N、T133V、N161D、N161E、R170K、R170L、A108C、A108I、S114G、S114T、G118E、G118Q、G118S、G118T、A138E、A138S、N140D、V149A、V149E、V149G、V149L、V149N、V149Q、V149S、I150A、I150N、I150T、I150V、A228S、P239F、P239T、P239W、F217R、S159D、S159E、S159N、S159Q、G128N、T209V、T209W、A236C、A236N、A236Q、S240P、S240Q、T242E、S173D、P009A、P009M、P009Q、P009T、P009V、L096H、L096I、V081M、K235D、K235E、V267F、V267I、V267S、V267T、V267Y、及びM222H
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A001G、A001K、A001R、Q002F、Q002K、Q002P、Q002R、Q002S、Q002W、T003G、T003I、T003V、T003Y、G007N、P009A、P009G、P009H、P009I、P009M、P009Q、P009R、P009S、P009T、P009V、A018N、A019M、T022E、S024H、S024R、S024T、S024V、G025A、V026N、K027P、K027R、K027S、K027T、A029S、I030V、N038A、N038Q、N038T、A040D、A040E、A040H、A040K、A040L、A040N、A040R、A040T、A040V、N043A、N043D、N043E、N043F、N043H、N043K、N043L、N043M、N043S、K045D、K045Q、K045R、K045S、A048E、A048H、A048N、A048Q、A048W、F050A、F050Q、F050R、F050S、S052D、S052M、S052N、S052Q、G053D、G053E、G053N、G053Q、P055N、A057P、Q059I、H067A、H067G、V072A、V072G、V072T、A073G、L075F、L075G、L075R、N076Q、N076S、N077T、T078A、T078D、T078E、T078F、T078G、T078H、T078K、T078L、T078R、T078S、T078V、T079K、T079L、T079Q、G080M、V081M、Y086P、N087H、D089F、L090P、Y091I、Y091M、Y091V、L096N、S097N、A098N、A098Q、A098S、G100A、G100E、S101M、S101T、T103D、T103E、T103S、G106E、G106N、G106T、I107Q、I107V、W113H、S114G、S114T、S116E、S116F、S116M、N117S、N117T、G118D、G118E、G118H、G118Q、G118R、G118S、G118T、G118Y、M119Q、V121A、G128N、S129D、S130E、S130H、S130N、S130Q、S130T、S130V、G131H、T133A、T133D、T133F、T133L、T133V、Q136H、Q137E、Q137T、A138S、N140D、N144H、N144Y、R145W、G146N、G146R、I147A、I147H、I147S、V149A、V149E、V149G、V149L、V149N、V149P、V149Q、V149S、I150N、I150V、A151H、A152V、S156A、S156H、S156K、S156M、S156N、S158V、S159D、S159E、S159N、S159Q、N161M、N161R、M165V、G166A、G166D、G166E、G166F、G166H、G166I、G166L、G166M、G166N、G166Q、G166S、G166T、G166Y、S181A、S181H、S181N、S182A、S182E、S182M、S182R、T185M、T185Q、T185R、A187W、S188H、S194P、T209F、T209V、T209W、T209Y、N213K、S216F、S216I、S216T、F217R、M222L、A224S、A228S、I234V、A236C、A236D、A236E、A236N、A236Q、A236S、K237A、Y238F、P239A、P239E、P239F、P239G、P239H、P239K、P239N、P239R、P239S、P239W、S240F、S240M、S240P、M241W、T242S、N243G、V244F、Q245A、Q245N、Q245S、Q245T、I246N、L250I、L250M、K251R、N252E、T255I、N256E、N256K、N256P、N256Q、N256R、N256W、K265S、V267F、V267K、V267N、V267S、V267T、V267Y、E271W、S272F、S272K、S272N、S272Q、及びQ275E
LG12sprCプロテアーゼと関連する分子の比較
相同なプロテアーゼの同定
クエリー配列としてLG12sprCプロテアーゼ(配列番号3)の成熟タンパク質のアミノ酸配列を利用し、検索パラメーターはデフォルト値に設定して、BLAST検索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res,25:3389〜402,1997)により、NCBIの非冗長タンパク質データベース及びGenome Quest Patentデータベースで相同物を同定した。いずれの検索セットに関しても、同一率(PID)は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表中、「配列長」と記載される値は、掲載されている受け入れ番号により参照されるタンパク質の長さ(アミノ酸)に対応するものであるのに対し、「アライメント長」は、アライメント及びPIDの算出に使用した配列について参照するものである。表5には、NCBIの非冗長タンパク質データベースのLG12sprCに対する同一率(%)とともに配列一覧を提供し、表6には、Genome Quest Patentデータベースの配列一覧を提供する。
LG12sprC及びバチルス種(Bacillus sp.)m3−13、スブチリシンE(1)プロテアーゼの機能比較
バチルス種(Bacillus sp.)m3−13スブチリシンE(1)(受け入れ番号WP_010192403.1、旧称ZP_07707657.1)は、LG12sprCに対し同一率が92%であることが判明した(実施例4、表5)。特性をLG12sprCプロテアーゼの特性と比較するため、実施例2に記載のLG12sprCのクローニング工程後に、バチルス種(Bacillus sp.)m3−13スブチリシンE(1)タンパク質をコードしている合成遺伝子(配列番号5)を作成し、pHYTベクターにクローニングした。簡単に記載すると、タンパク質のプロ配列に対応させて、NheI−HindIII認識部位と隣りあわせた合成DNAを作製し、予めpHYTベクター内に存在していたAprEシグナル配列と融合させる。
GCTAGCGCAGCAGCTTCTGGTCCGAGTGCTAATGCCAAGAAAGAGTACTTAGTGGGATTTGCTAAAGGAAACAAAGCGAATGCTCAGTCTTCCAAAAATTTAATTACAGCTGCTGGTGGCGATATTCAACATACATTCCAGTACATGGATGTAGTGGAAGTGAGCTTGCCTGAAAAAGCGGCTGAAGCATTAGCGAAAAATCCTAACATTGCATTTGTAGAGGTAAACGCAGAAGTTCAAGCTACTGCACAAACAGTTCCTTGGGGAATTCCTCACATTAAAGCAGACAAAGCGCACGCTTCAGGTGTAACAGGAAGTGGAGTGAAAGTTGCGGTCCTTGATACAGGAATTGATGCAAACCATGCGGATTTGAATGTTAAAGGTGGAGCAAGCTTTGTTTCTGGTGAACCAAATGCCCTTCAAGATGGAAACGGGCACGGAACACACGTAGCAGGAACGGTTGCTGCATTGAATAATACGACAGGAGTGCTTGGTGTAGCTTATAATGCGGATCTTTATGCAGTTAAAGTTCTTAGTGCTTCCGGAAGCGGTACATTAAGTGGAATCGCACAAGGAATTGAGTGGTCCATTGCTAATGATATGGACGTTATCAATATGAGCCTTGGTGGTAGTACCGGTTCCACAGCACTTCAGCAAGCTTGTGACAATGCATATGCAAGTGGAATTGTAGTGGTTGCAGCTGCTGGAAACTCCGGTTCTAAAGGTAAGAGAAACACAATGGGTTACCCTGCTAGATACAGTTCTGTAATTGCAGTTGGTGCGGTCGACAGCAGTAACAACCGTGCATCTTTCTCAAGTGTTGGAAGTGAGCTTGAAGTAATGGCTCCAGGTGTAAGTATCCTTAGCACGACTCCTGGAAACAACTACTCTTCCTTCAATGGTACGTCTATGGCTTCTCCACATGTTGCAGGAGCAGCTGCATTAATCAAAGCAAAATATCCTAGCATGACGAATGTACAAATTCGTGAAAAACTAAAAAATACTGCCACTAACCTTGGCGATGCGTTCTATTATGGACATGGTGTAATTAACGTTGAAAGTGCTTTGCAATAAAAGCTT
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セリンプロテアーゼBhon03321の発見及び同定
バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM 8719(Leibniz−Institut DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHから入手)を工業用途に有用である可能性のある酵素供給源として選択した。DSM 8719による酵素産生及びこれらの酵素をコードする遺伝子を同定するため、合成(SBS)法によるIllumina(登録商標)配列決定法を利用してDSM8719の完全なゲノムを配列決定した。ゲノムの配列決定及び配列データのアセンブリはBaseClear(Leiden,The Netherlands)で実施した。コンティグはBioXpr(Namur,Belgium)により注釈付した。DSM 8719株においてこの方法により同定された遺伝子のうち1つが、様々なその他の細菌のセリンプロテアーゼに対し相同性を示すタンパク質をコードする。この遺伝子の配列、Bhon03321.nを配列番号8に示す。
TTGAAGAAGTGGATGAAGAGTTTTTCAGTTATACTTATTGCAATATTGGCTTTCTCGTTAGCTTTTGGAACTGCTCAGGCAGAGTCTTCTAATCCGAATGCTAGTGTAAAGAAAGAATACTTAATTGGGTTTGCAAAAGGAAACAAGGCAAGTGCACAGACCTCCCAAAATCTGGTTACAGCAGCAGGGGGAGAAGTTCAACACACATTCCAATACATGGATGTAGTGGAAGTTTCGTTACCTGAAAAAGCTGCAGAAGCATTGAAGAAGAATCCTAACATAGCATTCGTAGAGGAAAACGTAGAGGTTATGGCGACTGCCCAAACAGTACCTTGGGGCATCCCGCATATCAAAGCAGACAAAGCACATGCTGCCGGTGTGACAGGAAGCGGAGTGAAAGTGGCAATCCTTGATACAGGGATCGACGCCAATCATGCAGACTTAAATGTAAGAGGCGGAGCAAGTTTTGTGGCAGGTGAGCCGAATGCCCTTCAAGATGGAAATGGACACGGAACTCACGTGGCCGGTACGGTTGCCGCATTGAATAATTCAACTGGCGTTCTAGGGGTCGCTTACAACGCAGACCTTTATGCGGTAAAAGTTCTTAGCGCTTCAGGTAGTGGGACTTTAAGTGGCATCGCACAAGGTATTGAATGGTCCATTGCAAATGGAATGGATGTAATCAATATGAGTCTTGGTGGAAGCTCTGGGTCTACTGCACTCCAACAAGCTTGTAATAATGCCTACAATAGAGGCATTGTTGTAATTGCTGCTGCTGGGAATTCCGGCTCTTCAGGAAATCGCAACACTATCGGGTACCCTGCAAGATATAGTTCAGTAATCGCAGTGGGAGCAGTGGATTCCAATAACAACCGCGCTTCTTTCTCCAGTGTTGGAAATGAGCTGGAAGTAATGGCGCCGGGTGCTAATATCTTGAGCACGACTCCTGGTAATAACTATGCATCCTTCAACGGAACGTCCATGGCAGCTCCACATGTTGCAGGAGCAGCAGCATTGATAAAAGCAAAATATCCTAGCATGACAAATGTCCAAATTCGTGATCGTTTAAGAAATACGGCTACAAACCTTGGTGATCCTTTCTTTTATGGAAACGGAGTAATCAATGTAGAAAGTGCTTTACAA
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更なるバチルス・ホリコシィ(B. horikoshii)セリンプロテアーゼの発見及び同定
バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)DSM 9711、バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)DSM 9712及びバチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)DSM 6951も、LG12−系統群のスブチリシン及びその他の工業用途に有用な酵素に可能性のある供給源として選択した。これらの株は、Leibniz−Institut DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHから得た。これらの株及びこれらの酵素をコードしている遺伝子により産生された酵素を同定するため、Illumina(登録商標)配列決定を使用し、合成(SBS)法により全3種のバチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株を配列決定した。ゲノム配列決定、配列データのアセンブリ、及びコンティグの注釈付はBaseClear(Leiden,The Netherlands)で実施した。バチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)DSM 9711株においてこの方法で同定された遺伝子のうち1つが、LG12−系統群のスブチリシンに属するタンパク質をコード質している。この遺伝子の配列、DSM9711_sprCを配列番号11に示す。
TTGAAGAAGTGGATGAAAGGTTTTTCGGTCATACTTATTGCAATATTGGCTTTCTCGTTAGCATTTGGTACTGCGCAGGCAGAATCGTCCAGTCCCAATGCTAGTGCAAA
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バチルス・ホリコシィ(B. horikoshii)セリンプロテアーゼの異種発現
バチルス・スブチリス(B. subtilis)aprEプロモーターの下流のBhon03321、DSM9711_SprC、DSM9712_SprC及びDSM6951_SprCのプロ成熟配列、バチルス・スブチリス(B. subtilis)aprEシグナルペプチド配列、並びに末端のBPN転写終結配列、をコードしているDNA配列から構成された発現カセットを使用して、Bhon03321、DSM9711、DSM9712及びDSM6951プロテアーゼをバチルス・スブチリス(B. subtilis)で産生させた。4つの異なるカセットをpHYT複製シャトルベクターにクローニングし、適切なバチルス・スブチリス(B. subtilis)株に形質転換した。BstEII及びEcoRI認識部位を使用して、テトラサイクリン耐性遺伝子の後ろに転写終結部位を付加し、pHY300PLK(Takara)からpHYTベクターを誘導した(配列番号21、転写終結配列、GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATGCATCGATGGAATTC)。BamHI及びHindIII認識部位にクローニングされているリンカーを利用して、pHY300PLKのHindIII認識部位も除去した(配列番号22、新しいリンカー配列、GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)。
バチルス・ホリコシィ(B. horikoshii)セリンプロテアーゼのクリーニング性能
洗濯系用途に関してはBMI(綿に血液/牛乳/インクを染みこませたもの)布見本小片(EMPA−116、Center for Testmaterials、The Netherlands)、及び食器系の用途に関しては卵黄(ポリアクリル布に卵黄を染みこませ、エージングし、カーボンブラック染料で染色したもの)布見本小片(PAS−38、Center for Testmaterials、The Netherlands)に対し、バチルス・ホリコシィ(B. horikoshii)セリンプロテアーゼBhon03321、DSM6951_SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)、及びDSM9712_SprC(DSM_9712)のクリーニング性能を試験した。
LG12及び相同体の安定性
高温でのインキュベート後に残存している活性を測定することにより、Bhon03321、DSM6951_SprC(DSM_6951)、DSM9711_SprC(DSM_9711)、DSM9712_SprC(DSM_9712)、及びLG12SprCプロテアーゼの、40〜80℃の範囲の温度下、50mM Tris(pH9);2mM CaCl2中での安定性について試験した。希釈した酵素をストレッサーと混合し、かつストレスを加えていないプロテアーゼの活性を測定した。ストレッサーに加えた希釈サンプルを高温でインキュベートし、インキュベート後に、ストレスを加えたプロテアーゼの活性を測定した。非ストレス条件に関しては、酵素の活性はDMC法で直ちに評価した(下記の通り)。ストレス条件に関しては、PCRプレートをシールし、Eppendorf 384サーモサイクラーにより5分間高温でインキュベートした後、活性についてアッセイした。ストレス付加時及び未付加時の活性を、DMC法により評価した。
成熟型のLG12−系統群のスブチリシン及びその他のスブリシンの系統樹
近隣結合法(NJ)(Saitou,N.;及びNei,M.(1987).The neighbor−joining method:a new method for reconstructing Guide Trees.Mol Biol Evol 4,406〜425)を利用して、実施例4、表5に示すNCBIでの検索により同定された成熟配列のサブセット、並びに新しく発見されたバチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)セリンプロテアーゼ:Bhon03321(配列番号10)、DSM_9711(配列番号13)、DSM_9712(配列番号16)、及びDSM_6951(配列番号19)について、系統樹を作製した。NJ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。木構成は、以下のパラメーターを用い算出した:配列距離については木村の相関を用い、ギャップ位置は無視した。図8に示す木表示にはMEGA6プログラムを使用した。Bhon03321、DSM_9711、DSM_9712、及びDSM_6951の配列は、LG12−系統群を構成する10種のプロテアーゼのクラスターで見られる。今までのところ、LG12−系統群のメンバーは、LG12sprC(配列番号3)、DSM_9711(配列番号13)、DSM_9712(配列番号16)、DSM_6951(配列番号19)、Bhon03321(配列番号10)、バチルス種(Bac sp)WP_010192403.1、バチルス種(Bac sp)LG12SprD AAC43581、バチルス種(Bac sp)WP_010192405.1、及びバチルス種(Bac sp)BAD21128の組み合わせが同定されている。
相同体配列のアラインメント
LG12−系統群間で同定された成熟型スブチリシン配列のアミノ酸配列:LG12sprC(配列番号3)、DSM_9711(配列番号13)、DSM_9712(配列番号16)、DSM_6951(配列番号19)、Bhon03321(配列番号10)、バチルス種(Bac sp)BAD11988、バチルス種(Bac sp)WP_010192403.1、バチルス種(Bac sp)LG12SprD AAC43581、バチルス種(Bac sp)WP_010192405.1、バチルス種(Bac sp)BAD21128を互いに及び距離から言ってより関連性のあるバチルス・レンタス(B lentus)(P29600)のスブチリシンに対しアライメントした。CLUSTALWソフトウェア(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,22:4673〜4680,1994)をデフォルトパラメーターで使用し、LG12sprCの1〜275番目の残基の領域についてタンパク質配列のアライメントを実施した。これらの11種のプロテアーゼのアライメントを図9に示す。
LG12−系統群のスブチリシンにより共有される固有の配列の同定
LG12sprCプロテアーゼとその他のスブチリシンプロテアーゼとの構造ベースの配列アライメントを図10に示す。洗剤プロテアーゼのバチルス・レンタス(Bacillus lentus)(pdb code 1JEA)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)(pdb code 2ST1.A)、及びバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)(pdb code 3UNX.A)の成熟タンパク質の配列を、LG12sprC(配列番号3、AAC43580.1)及び相同体:バチルス種(Bacillus sp.)m3−13スブチリシンE(1)(配列番号7、WP_010192403.1、旧称ZP_07707657.1)、バチルス種(Bac sp)KSM−LD1、SA(BAD11988.2)、バチルス種(Bac sp)KSM−LD1、SB(BAD21128.1)、バチルス種(Bacillus sp.)m3−13スブチリシンE(2)(WP_10192405.1、旧称ZP_07707658.1)、Bhon03321(配列番号10)、DSM_9711、DSM_9712、DSM_6951及びLG12sprD(AAC43581.1)の配列とアライメントした。
Claims (79)
- LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、242、245、及び251からなる群から選択される、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、ここで、前記LG12−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すバチルス種(Bacillus sp.)LG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも50%が次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記生産的位置は、27、40、43、78、98、130、131、158、166、182、237、239、242、245、及び251からなる群から選択され、前記LG12−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すバチルス種(Bacillus sp.)LG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、2、9、15、38、45、48、52、59、62、75、97、99、103、117、118、119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271、及び275からなる群から選択される、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、ここで、前記LG12−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すバチルス種(Bacillus sp.)LG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも30%但し50%未満が次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記生産的位置は、2、9、15、38、45、48、52、59、62、75、97、99、103、117、118、119、123、129、133、145、148、149、156、159、161、181、209、236、240、248、256、267、271、及び275からなる群から選択され、前記LG12−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すバチルス種(Bacillus sp.)LG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、1、3、18、19、20、22、24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265、及び272からなる群から選択されるLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、ここで、前記LG12−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置が、配列番号3に示すバチルス種(Bacillus sp.)LG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも15%但し30%未満が次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記生産的位置は1、3、18、19、20、22、24、25、26、28、30、31、44、50、53、55、57、58、61、67、72、76、77、79、80、85、86、87、89、90、91、93、96、100、101、102、106、107、108、113、116、121、124、126、127、136、137、140、144、147、150、152、153、160、162、170、172、173、183、185、187、188、194、213、216、217、218、222、225、228、231、234、235、241、243、244、246、252、255、265、及び272からなる群から選択され、前記LG12−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すバチルス種(Bacillus sp.)LG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、4、7、8、12、14、16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、81、83、84、88、94、104、109、111、114、120、122、125、128、132、138、141、143、146、151、163、165、167、175、176、195、203、204、205、206、211、212、215、220、224、227、230、232、238、250、260、262、268、273、及び274からなる群から選択されるLG12−系統群の酵素変異体の生産的位置におけるものであり、ここで、前記LG12変異体のアミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- LG12−系統群の親酵素に対しアミノ酸の変更を含むLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも1つの変更、但し15%未満が、次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記生産的位置は、4、7、8、12、14、16、17、29、33、42、46、51、56、65、69、73、81、83、84、88、94、104、109、111、114、120、122、125、128、132、138、141、143、146、151、163、165、167、175、176、195、203、204、205、206、211、212、215、220、224、227、230、232、238、250、260、262、268、273、及び274からなる群から選択され、前記LG12変異体のアミノ酸の位置は、配列番号3で示されるLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列と対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親酵素に対しアミノ酸の変更を含むLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群の酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも60%が次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記変更は、残基27(K,H,N,A,D,E,G,L,P,Q,R,S,T,M),40(A,I,Q,L,T,W,D,E,H,K,M,N,R,V,Y),43(N,V,I,A,F,G,H,K,L,M,Q,S,W,Y,D,E),78(T,C,S,I,K,L,V,A,D,E,F,G,H,R,W),98(A,Y,V,D,F,K,N,W,H,M,Q,S,T),130(S,I,R,H,L,N,Q,T,W,E,F,V,Y),131(G,I,K,L,T,H,N,A,P,R,S,D,E),158(S,E,G,H,I,L,Q,K,A,D,M,T,V),166(G,K,W,C,F,I,L,A,D,E,H,M,N,Q,S,T,Y),182(S,C,Q,P,W,A,H,I,M,R,Y,D,E),237(K,L,M,T,Y,F,S,D,G,H,R,A,N,Q),239(P,Y,C,E,F,G,H,I,N,R,S,T,W,A,D,K,L,M,V),242(T,G,H,L,I,K,N,V,W,A,E,P,Q,S)、245(Q、C、A、F、H、M、N、R、T、W、D、S、Y)、及び251(K、C、G、H、Y、W、F、L、R、A、D、M、N、S、T、V)からなる群から選択され、前記LG12変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親酵素に対しアミノ酸の変更を含むLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも30%、但し50%未満が次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記変更は、残基2(Q,E,F,K,P,R,S,W,Y),9(P,Y,H,Q,A,G,I,M,R,S,T,V),15(K,M,Q,T,G,H,R,V,Y,A),38(N,H,Y,A,Q,T,D,E,K,S),45(K,L,D,E,F,Q,R,S,W,A),48(A,W,D,E,G,H,K,N,Q),52(S,E,T,V,D,H,L,M,N,Q,R,F),59(Q,F,M,H,N,W,T,I,V),62(N,E,I,V,A,F,K,L,P,W),75(L,A,N,H,K,F,Q,R,W,G),97(S,D,G,H,L,M,N,A,I),99(S,A,D,N,Q,R,S,I,K,L,V),103(T,E,A,Y,G,H,K,N,R,S,D),117(N,M,Q,H,K,R,E,G,S,T,Y),118(G,T,K,R,Y,D,E,H,Q,S),119(M,N,V,A,F,H,I,L,Q,S,T),123(N,I,S,A,D,E,G,H,Q),129(S,E,I,R,Y,K,Q,A,G,H,D),133(T,G,H,A,F,L,M,N,Q,V,D,I),145(R,D,F,G,L,V,M,W,Y,N),148(V,D,I,L,M,Q,N,G,S),149(V,A,P,S,E,G,L,N,Q),156(S,C,E,G,D,H,Q,A,M,K,N),159(S,C,F,T,M,N,Y,D,E,K,Q),161(N,F,K,W,M,S,D,E,R,Y),181(S,T,D,E,Q,A,H,K,N),209(T,I,K,M,V,F,H,W,Y),236(A,V,F,G,N,C,D,E,Q,S),240(S,H,Q,F,I,L,P,V,W,M),248(E,Q,K,L,N,T,W,D,C,H,M,Y),256(N,V,A,D,K,M,Q,W,E,P,R),267(V,H,N,A,F,I,K,S,T,Y)、271(E、D、L、M、Q、H、K、A、F、W、Y)、及び275(Q、L、T、Y、G、H、W、E、N、R)、からなる群から選択され、LG12−系統群の変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すLG12sprCのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親酵素に対しアミノ酸の変更を含むLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも15%、但し30%未満が次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記変更が、残基1(A,L,H,K,G,R),3(T,A,G,H,E,Y,I,V),18(A,D,F,S,Q,N,R,T),19(A,F,K,L,R,M,W),20(G,H,Q,E,N),22(T,D,S,E),24(S,G,F,T,H,I,R,V),24(S,G,F,T,H,I,R,V),26(V,E,R,N,S),28(V,N,S,E,T),30(I,T,A,E,V),31(L,I,M,Q,T),44(V,A,I,F),50(F,R,S,A,K,Q,Y),53(G,Y,H,A,D,N,R,E),55(P,I,K,N,R),57(A,G,W,P),58(L,F,D,K),58(L,F,D,K),67(A,G,A,I,P),72(V,M,A,G,S,T),76(N,F,P,A,Q,S,Y,D),77(N,Q,G,T),79(T,E,M,A,K,Q,I,L),80(G,C,P,F,H,M,Y),85(A,T,V,S),86(Y,A,P,F),87(N,Q,M,H,L,S),89(D,A,R,F),90(L,D,S,G,Q,E,N,P),91(Y,H,I,M,N,T,V,W),93(V,G,I,L,T),96(L,G,K,R,Y,I,E,H),100(G,F,K,V,Y,A,E),101(S,M,A,T,V,R),102(G,V,F,E,Y),106(G,A,I,E,N,S,T,V),107(I,H,Q,V,T),108(A,S,I,C),113(W,Y,F,H),116(S,E,F,M),121(V,T,S,A,I),124(M,R,S,Y,A),126(L,H,W,I,Q,G,K),127(G,E,H,N),136(Q,L,H,W,F,R,D),137(Q,M,V,I,H,T,E),140(N,I,F,Y,D,Q),144(N,D,F,H,M,V,W,Y),147(I,R,K,S,A,H,M),150(I,A,S,D,N,T,V),152(A,G,P,V),153(A,M,G,S),160(G,N,H,M),162(R,K,M,V),170(R,P,K,L),172(S,C,N,T,G,H),173(S,A,T,D),183(N,G,A,Q,D,E),185(T,C,W,Q,R,M),187(A,C,G,D,H,P,V,W),188(S,C,L,N,T,H,Y),194(S,M,T,F,K,P,R,D),213(N,V,W,G,M,R,K,Q),216(S,C,F,I,T,A),217(F,C,H,K,L,E,R),218(N,C,H,D),222(M,C,A,H,L,Q),225(P,A,G,V),228(A,C,R,S),231(A,C,G,S),234(I,M,Q,V),235(K,I,N,S,G,D,E,F),241(M,H,K,I,L,Q,S,W),243(N,A,T,G),244(V,A,E,Y),246(I,N,V,A,T),252(N,D,Q,F,E),252(N,D,Q,F,E)、265(K、R、D、S)、及び272(S、P、V、M、F、N、Q、K)、からなる群から選択され、LG12変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - LG12−系統群の親酵素に対しアミノ酸の変更を含むLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、前記変更が、前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の生産的位置におけるものであり、前記生産的位置において試験した前記変更のうち少なくとも1つの変更、但し15%未満が、次の基準a)〜c)のうち少なくとも1つを満たし:
a)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.9以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.0以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
b)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.8以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.2以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
c)次の1)〜4)の試験に関し、最小性能指数(PI)がLG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し0.5以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもPIが1.5以上である生産的位置:1)pH9又はpH10下でのPAS−38布見本小片のクリーニング;及びpH6、pH8、又はpH10下でのEMPA−116布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも1つのクリーニングアッセイ;2)suc−AAPF−pNAに対する活性;3)タンパク質発現;並びに4)洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも1つの安定性アッセイ;
ここで、前記変更が、残基4(V,C),7(G,N),8(I,L),12(K,G,R),14(D,L),16(A,G,V),17(H,A),29(A,T,S),33(T,D),42(L,D),46(G,N),51(V,I),56(N,E),65(G,T,V),69(A,G,T),73(A,G),81(V,H,M),83(G,S),84(V,A),88(A,C,G),94(K,G),104(L,Y,V),109(Q,K),111(I,V),114(S,T,G),120(N,H,E),122(I,M),125(S,G),128(G,E,N),132(S,A),138(A,E,S),141(N,G),143(Y,D,E),146(G,N,R),151(A,H),163(N,S,D),165(M,I,V),167(Y,G),167(Y,G),167(Y,G),195(E,Q),203(V,C),204(N,E),205(I,V),206(L,Y),211(G,C),211(G,C),215(A,D,E),220(T,A,G),224(A,S),224(A,S),230(A,S),232(A,S),238(Y,W,F),250(L,I,M),260(P,Y),260(P,Y),268(I,F)、273(A、S)、及び273(A、S)、からなる群から選択され、LG12変異体のアミノ酸位置は、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。 - 前記LG12−系統群のスブチリシン酵素変異体の汚れ除去が、前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素と比較して向上されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、図8又は9のLG12系統群の範囲に当てはまる任意のスブチリシン酵素である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Ser221、His64、及びAsp32を含む触媒三残機を含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜15のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、位置55〜58に由来するP、N/D、A、Lモチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜16のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Thr103−Leu104モチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜17のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Tyr86−Asn/Asp87モチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜18のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Ala16−His17モチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜19のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Val21−Thr22モチーフを含むものであり、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜20のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、位置267〜275のV、I、N/D、V/L、E、X、A、L、Qを含むものであり、ここで、Xは任意のアミノ酸を表し、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、前記請求項1〜21のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素がTyr86−Asn/Asp87モチーフ、及びVal21−Thr22モチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜22のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Tyr86−Asn/Asp87モチーフ、Ala16−His17モチーフ、Val21−Thr22モチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号3に示すLG12sprCプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項1〜23のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、Bacillus_sp_LG12sprC_AAC43500又はBacillus_sp_WP010192403である、請求項1〜24のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、配列番号3のBacillus_sp_LG12sprC_AAC43500である、請求項1〜25のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が配列番号7のバチルス属(Bacillus sp.)M3−13スブチリシン酵素E(1)である、請求項1〜26のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、配列番号10のバチルス属(Bacillus sp.)DSM 8719スブチリシン酵素Bhon03321である、請求項1〜27のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、配列番号13のバチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM_9711である、請求項1〜28のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、配列番号16のバチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM_9712である、請求項1〜29のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が、配列番号19のバチルス・ホリコシィ(Bacillus horikoshii)株DSM_6951である、請求項1〜30のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記LG12−系統群の親スブチリシン酵素が配列番号20のバチルス属(Bacillus sp.)KSM−LD1,SB(BAD21128.1)である、請求項1〜31のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 前記変異体が、LG12−系統群の親スブチリシン酵素に対し少なくとも60%同一性を有する、請求項1〜32のいずれか一項に記載のLG12−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片。
- 配列番号10に対し少なくとも70%同一性を有する、スブチリシン酵素。
- 配列番号10の配列を有する、請求項34に記載のスブチリシン酵素。
- 配列番号13に対し少なくとも70%同一性を有する、スブチリシン酵素。
- 配列番号13の配列を有する、請求項36に記載のスブチリシン酵素。
- 配列番号16に対し少なくとも70%同一性を有する、スブチリシン酵素。
- 配列番号16の配列を有する、請求項38に記載のスブチリシン酵素。
- 配列番号19に対し少なくとも70%同一性を有する、スブチリシン酵素。
- 配列番号19の配列を有する、請求項40に記載のスブチリシン酵素。
- 配列番号20に対し少なくとも70%同一性を有する、スブチリシン酵素。
- 配列番号20の配列を有する、請求項42に記載のスブチリシン酵素。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を少なくとも1種含む、組成物。
- 前記組成物が、クリーニング組成物である、請求項44に記載の組成物。
- 前記組成物が、洗剤組成物である、請求項45に記載の組成物。
- 前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、布地柔軟化洗剤、食器洗浄洗剤、及び硬質表面クリーニング洗剤からなる群から選択される、請求項46に記載の組成物。
- 前記組成物が、界面活性剤を更に含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項48に記載の組成物。
- 前記界面活性剤がイオン性界面活性剤である、請求項49に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である、請求項49に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1つの安定化剤を更に含む、請求項44〜51のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が、前記ポリペプチドを約0.001〜約10重量%含む、請求項44〜51のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1種の漂白剤を更に含む、請求項44〜53のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含まない、請求項44〜54のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記クリーニング組成物が、リン酸塩を含むものである、請求項44〜55のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1種の補助成分を更に含む、請求項44〜56のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、顆粒、粉末、固体、棒状物、液体、錠剤、ジェル、単位用量又はペースト組成物である、請求項44〜57のいずれか一項に記載の組成物。
- アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アシルエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ,カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1、4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、その他のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される1種以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含む、請求項44〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、pH約5.0〜約12.0で処方される、請求項44〜59のいずれか一項に記載の組成物。
- 表面又は物品を、請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を少なくとも1種含むクリーニング組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。
- 表面又は物品を、請求項44〜60のいずれか一項に記載のクリーニング組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。
- 前記表面又は物品をそれぞれ前記クリーニング組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぎ洗いする工程を更に含む、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記物品が食器である、請求項61〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物品が布地である、請求項61〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面又は物品をそれぞれ前記クリーニング組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぎ洗いする工程を更に含む、請求項61〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面又は物品をすすぎ洗いする前記工程の後に、前記表面又は物品を乾燥させる工程を更に含む、請求項66に記載の方法。
- 請求項44〜59のいずれか一項に記載のクリーニング組成物及びクリーニングが必要な表面又は物品を準備する工程と;前記クリーニング組成物と、前記クリーニングが必要な表面又は物品とを、前記表面又は物品の洗浄に適した条件下で接触させて、洗浄された表面又は物品を生じさせる工程とを含む、表面又は物品をクリーニングする方法。
- 前記洗浄された表面又は物品をすすぎ洗いしてすすぎ洗いされた表面又は物品を得る工程を更に含む、請求項68に記載の方法。
- 前記すすぎ洗いした表面又は物品を乾燥させる工程を更に含む、請求項68又は69に記載の方法。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、布地加工組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、動物飼料組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、皮革加工組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素又は組み換えポリぺプチドを含む、羽毛加工組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、穀物加工組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、セルロース由来エタノール加工組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、レンズクリーニング組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、組織創傷清拭組成物。
- 請求項1〜43のいずれか一項に記載のスブチリシン酵素を含む、組織細胞培養用添加剤組成物。
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