JP2016536293A - Ｆｘｓ及びａｓｄに対する動物モデル並びにｆｘｓ及びａｓｄと診断された個人におけるｅｒｋ１／２活性化を調節するためのアカンプロセートの使用 - Google Patents

Abstract

脆弱Ｘのマウスモデルでの研究及びヒト若年者における予備的研究は、ＥＲＫ１／２が、ＡＳＤと診断された人々の治療をモニターするのに有用なバイオマーカーであることを示す。本明細書において報告されている結果は、アカンプロセートが、ＡＳＤの症状の多くに関連するＥＲＫ１／２活性化のレベルを低下させる能力を有することを示す。したがって、ＥＲＫ１／２活性化レベルは、ＡＳＤの診断マーカーとしてのその有用性に加えて、アカンプロセートにより治療される患者をモニターするために使用できる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／８９０，７５６号の利益を主張し、それは、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。

政府の権利についてのステートメント
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられたＡＧ０１８３７９及びＲＲ０２５７６１の下で政府援助によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

発明の分野
本開示の態様は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、ＦＸＳ関連自閉症スペクトラム障害、及び特発性自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ、自閉症）からなる群から選択される特異的発達障害と診断された患者を治療するために、アカンプロセートなどの化合物の使用によって、末梢リンパ細胞の細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ１／２）活性化、分泌型アミロイド前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）；ｓＡＰＰα；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）からなる群から選択されるタンパク質の血清レベルを調節することに関する。

背景
神経発達障害の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ：自閉症）及び脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、社会的行動、コミュニケーションスキル、及び認知機能における著しい障害を生じ得る生涯に渡る小児期障害である。これらの神経発達障害を有すると認定された人によって示される症状の重症度は多岐に渡る。残念ながら、これらの障害に罹患している多くの人は、重い症状を示し、自分自身の世話をすることができない者もいれば、社会で正常な働きをするための能力の大きな低下を示す者もいる。ＦＸＳの原因は知られているが、これらの人の脳における特定の神経刺激性化合物のレベルがそうであるように、この状態によってさいなまれる様々な神経経路は知られていない。特発性自閉性障害に関しては、その障害の根源的な原因さえ、未知のままである。その障害を有すると診断された者にこれらの障害が及ぼす影響の故に、これらの状態の治療法を開発することにささげられた莫大な量の前臨床及び臨床研究が存在する。診断及び治療にささげられた努力にもかかわらず、依然として、これらの障害に罹患している人が、より快適で独立した生活を送る助けとなる新たな治療法が早急に求められている。本明細書に開示されている物質、方法、及びシステムは、これらの重要な要求に対処しようとするものである。

自閉症スペクトラム障害は、社会的行動及びコミュニケーションにおける著しい障害を引き起こす、生涯に渡る小児期発症神経発達障害である。米国保健福祉省（ＤＨＨＳ）によれば、上昇するＡＳＤ有病率は、現在、１１０人の子供に１人と見積もられ、ＡＳＤを、国家的な健康の危機的状態と見なす正当な理由となる。しばしば、ＡＳＤを有する人は、中でも特に、攻撃、自傷行為、衝動脅迫、注意欠陥、多動性、及び不安のような、さらなる支障のある症状も示す。社会に対するＡＳＤのコスト（米国では、年に９５０億ドルと見積もられる）は、大きく、ずっと増加している。自閉症の現れは、一様ではない。例えば、自閉症を有する人は、知的障害、発作、又は機能的発話を、有することも、有さないこともある。この不均質性は、ＡＳＤの原因への研究と有効な治療法の両方を難しくした。自閉症の原因の理解は、不明瞭な状態に留まり、事例の約１０％だけが、知られている遺伝的異常に関連付けられている。治療法に関しては、今日まで、どのような薬物も、ＡＳＤのコアの社会的及びコミュニケーション障害を治療するための大規模試験において有効であるとは示されなかった。自閉症の不均質性のために、試験のための適切なサブ群を特定する難しさにより、有望な多くの薬物治療が大規模試験に失敗するという結果になった。このような多様な現れを考えれば、自閉症の合理的な薬物開発は、薬物の利点が最大化される適切なサブ群を定めることに焦点を合わせることが必要であろう。自閉症のバイオマーカーの開発は、治療法の開発のこれらの難題に対処する類のない機会を与える。米国保健福祉省の省庁間自閉症調整委員会の２０１１戦略プランは、早期の疾患の検出、病気の重症度の評価、薬理学的反応の指標をもたらすバイオマーカーの可能性、及び、目標を定めた治療法の開発のために自閉症の中のサブ群を特定するためにバイオマーカーを利用できることを考え、自閉症のバイオマーカーの開発の必要性を強く強調した。

自閉症の不均質性を考えれば、自閉症の知られた原因は、薬理療法及びバイオマーカー開発のための最善の拠り所を与える。これらの知られている原因の中で、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）における最近の研究での発見は、最もよくある単一遺伝子原因自閉症としてのＦＸＳの地位と結び付いて、この障害を、自閉症の治療法開発戦略を練り上げるための重要視すべき候補にした。ＦＸＳは、４，０００人中の１人に影響を及ぼす、最もよくある、発達の遅れの遺伝形質である。ＦＸＳを有する３人に２人は、自閉症も患い、全体としてＦＸＳは、全ての自閉症の事例の５〜７％に相当する。

今日まで、自閉性障害のコアの社会性障害を減じるための如何なる薬物も、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されていない。社会性障害を標的とする、自閉症における多くの薬理療法試験は、一様に否定的な結果を生じた。したがって、これらの状態を治療するための物質及び方法が求められている。本開示のいくつかの態様は、特発性及び脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）関連自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）の試験、診断、及び治療のための物質及び方法を提供する。

発明の要旨
第１の実施形態は、ＡＳＤ又はＦＸＳと診断された患者からの第１の血漿試料を、ＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαに選択的に結合する少なくとも１種の試薬に接触させるステップ；血漿試料におけるＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルを決定するステップ；少なくとも１種の化合物を患者に投与するステップ；患者からの第２の血漿試料を、ＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１種に選択的に結合する前記少なくとも１種の試薬に結合させるステップ；患者の血漿における１種又は複数の次の化合物（flowing compounds）：ＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαのレベルに変化があるかどうかを決定するステップ；及び、患者の血漿試料で決定したＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαのレベルの少なくとも１つの変化に応じて、患者に投与される化合物の量を調節するステップを含む、患者を治療するための方法を含む。

第２の実施形態は、第１の試薬がＢＤＮＦ又はＥＲＫ１／２に選択的に結合する抗体である、第１の実施形態による方法を含む。第３の実施形態は、第２の試薬がｓＡＰＰに選択的に結合する抗体である、第１の実施形態による方法を含む。第４の実施形態は、前記試薬がｓＡＰＰαに選択的に結合する抗体である、第１の実施形態による方法を含む。

第５の実施形態は、投与するステップに応答してＢＤＮＦのレベルを上昇させるステップ；及び、投与するステップに応答してＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルを下げるステップを含む、第１の実施形態による方法を含む。

第６の実施形態は、前記化合物がアカンプロセート又は医薬的に許容されるアカンプロセートの塩である、第１から第５の実施形態による方法を含む。第７の実施形態は、アカンプロセートが約５００ｍｇ／日から約１，５００ｍｇ／日の範囲の用量（dose）で患者に投与される、第６の実施形態による方法を含む。

第８の実施形態は、ＢＤＮＦに選択的に結合する少なくとも１種の第１の抗体；ｓＡＰＰに選択的に結合する少なくとも１種の第２の抗体；ＥＲＫ１及び／又はＥＲＫ２に結合する少なくとも１種の抗体、並びに、ｓＡＰＰαに選択的に結合する少なくとも１種の抗体を含む、患者をモニターするためのシステムを含む。

第９の実施形態は、緩衝液、キレート剤、殺菌剤、殺真菌剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬をさらに含む、第８の実施形態によるシステムを含む。

第１０の実施形態は、特発性自閉症又はＦＸＳ関連ＡＳＤの治療に有用な化合物のスクリーニングのための方法であって、ＡＳＤ又はＦＸＳと診断された患者からの第１の血漿試料を、ＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１種に選択的に結合する少なくとも１種の試薬に接触させるステップ；血漿試料におけるＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルを決定するステップ：少なくとも１種の化合物を患者に投与するステップ；患者からの第２の血漿試料を、ＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１種に選択的に結合する前記少なくとも１種の試薬に結合させるステップ；患者の血漿におけるＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルに変化があるかどうかを決定するステップ；及び、その化合物が患者の血漿におけるＢＤＮＦ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルに変化を引き起こすかどうかで、化合物を選択するステップを含む、方法を含む。

第１１の実施形態は、第１の試薬がＢＤＮＦに選択的に結合する抗体である、第１０の実施形態による方法を含む。第１２の実施形態は、第２の試薬がｓＡＰＰに選択的に結合する抗体である、第１０の実施形態による方法を含む。第１３の実施形態は、前記試薬がｓＡＰＰαに選択的に結合する抗体である、第１０の実施形態による方法を含む。

第１２の実施形態は、前記化合物によって引き起こされる変化が、ＢＤＮＦのレベルの上昇、ｓＡＰＰのレベルの低下、ＥＲＫ１及び／又はＥＲＫ２、及びｓＡＰＰαのレベルの低下であるかどうかを評価する（accessing）ステップを含む、第１０の実施形態による方法を含む。第１３の実施形態は、患者に投与される前記化合物の量を変えるステップをさらに含む、第１０の実施形態による方法を含む。

第１３の実施形態は、化合物によって引き起こされる変化が、患者からの試料で測定されるＥＲＫ１／２活性の低下であるかどうかを評価する（accessing）ステップを含む、第１０の実施形態による方法を含む。

第１４の実施形態は、患者に投与される化合物の量を変えるステップをさらに含む、第１０の実施形態による方法を含む。

第１５の実施形態は、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を患者に投与するステップ；患者の末梢血液における少なくとも１種の次の：ＥＲＫ１又はＥＲＫ２、ＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルの変化について患者の末梢血液をモニターするステップ；及び、患者の末梢血液におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２、ＢＤＮＦ及びｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルが変化するように、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を調節するステップを含む、患者の治療方法を含む。第１６の実施形態は、前記化合物の量を変えるステップを含む、第１０の実施形態による方法を含む。

第１７の実施形態は、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を患者に投与するステップ；患者の末梢血液におけるＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαのレベルの変化について患者の末梢血液をモニターするステップ；及び、患者の末梢血液におけるＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及び／又はｓＡＰＰαのレベルが変化するように、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を調節するステップを含む、患者の治療方法を含む。

第１８の実施形態は、モニターするステップが、患者の末梢血液試料を、ＢＤＮＦに選択的に結合する抗体に接触させることを含む、第１６の実施形態による方法を含む。第１９の実施形態は、モニターするステップが、患者の末梢血液試料を、ｓＡＰＰに選択的に結合する抗体と共にインキュベートすることを含む、第１６の実施形態による方法を含む。第２０の実施形態は、モニターするステップが、患者の末梢血液試料を、ｓＡＰＰαに選択的に結合する抗体によりプローブすることを含む、第１６の実施形態による方法を含む。

第２１の実施形態は、調節するステップが、患者の末梢血液におけるＢＤＮＦのレベルが上昇し、かつ、患者の末梢血液におけるｓＡＰＰのレベル、及びＥＲＫ１／２活性、及びｓＡＰＰαレベルが低下するように、アカンプロセートの量を増やすステップを含む、第１６から１７の実施形態による方法を含む。第２３の実施形態は、アカンプロセートが約５００ｍｇ／日から約１，５００ｍｇ／日の範囲の用量で患者に投与される、第２０の実施形態による方法を含む。

いくつかの実施形態は、ＦＸＳを有すると診断された患者の血清ＢＤＮＦレベルを上昇させるステップを含む、患者の治療方法を含む。いくつかの実施形態において、上昇させるステップは、治療に有効なレベルのアカンプロセート又はアカンプロセートの医薬的に許容される塩を患者に投薬すること（dosing）を含む。

いくつかの実施形態は、ＦＸＳと診断された患者におけるＥＲＫ１／２の血清レベルを低下させるステップを含む、患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態において、低下させるステップは、治療に有効なレベルのアカンプロセート又はアカンプロセートの医薬的に許容される塩を患者に投薬することを含む。

いくつかの実施形態は、患者から採取される血漿試料を、ＢＤＮＦに選択的に結合する試薬と接触させるステップ；血漿試料におけるＢＤＮＦのレベルを決定するステップ；及び、少なくとも１種の化合物を、その化合物が、ＦＸＳを有すると診断された患者の血漿におけるＢＤＮＦのレベルを上昇させるように、前記患者に投与するステップを含む、患者の治療方法を含む。いくつかの実施形態では、試薬は、ＢＤＮＦに選択的に、又は少なくとも優先的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、患者の血清におけるＢＤＮＦのレベルを上昇させる化合物は、アカンプロセート又はアカンプロセートの医薬的に許容される塩である。

いくつかの実施形態は、患者からの血漿試料を、ＢＤＮＦに選択的に結合する少なくとも１種の試薬に接触させるステップを含む、患者のモニタリング方法を含む。いくつかの実施形態では、これらの方法は、患者に、少なくとも１回の、治療に有効な用量の化合物を投与するステップ；及び、投与するステップの後、患者から採取された血清を、ＢＤＮＦに選択的に結合する試薬に接触させることによって、患者からの血漿を検査するステップ；をさらに含む。さらに別の実施形態は、患者の血漿に存在するＢＤＮＦのレベルを変えるために、化合物の用量を調節するステップを含み得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＢＤＮＦに結合する試薬は、ＢＤＮＦに特異的に、又は少なくとも優先的に結合する抗体である。ある実施形態では、ＢＤＮＦのレベルを変える化合物は、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩である。

いくつかの実施形態は、血液を含む末梢体液における、分泌型全（トータル（total））アミロイドβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）、さらにはｓＡＰＰα（これは、α−セクレターゼ酵素による全ホロＡＰＰの切断後の、分泌型アミロイドβ前駆体タンパク質である）のレベルを測定するステップを含む、自閉症障害を診断するための方法を含む。全ｓＡＰＰは、ｓＡＰＰαを含めて、少なくとも３種を含む。若年者において測定される高レベルのｓＡＰＰは、自閉症障害を暗示しており、約１９ｎｇ／ｍＬを超える範囲の値は、臨床全般印象改善（ＣＧＩ−Ｉ）尺度において用いられるもののような行動症状の増加の徴候である。

ある実施形態は、自閉症スペクトラム障害の症状を軽減すると思われる化合物の治療目的の用量又は投薬計画（dosing regimen）による治療の前、その間、及び必要であれば、その後、全ｓＡＰＰ及び／又はｓＡＰＰαのレベルを測定するステップを含む、自閉症障害と診断された患者の治療方法を含む。いくつかの実施形態において、前記化合物は、アカンプロセートであり、若年者を治療するための治療用量は、患者の体重に比例し、６００〜１９９８ｍｇ／日の範囲であり得る。治療の間、用量は低いレベルから開始され得るが、徐々に、前記の範囲まで増やされる。患者の末梢血液で測定されたｓＡＰＰ及び／又はｓＡＰＰαのレベルは、患者に投与される治療化合物のレベルの増加又は減少を引き起こす。

いくつかの実施形態は、特発性又はＦＸＳ関連ＡＳＤを有する患者に対する治療選択肢の予言方法を含み、これらの方法は、特定の患者におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαの血漿レベルを測定するステップ、及び、正常より低いＢＤＮＦレベル、及び、正常より高いｓＡＰＰ及び／又はｓＡＰＰαのレベルを有する患者を、ＡＳＤと診断された一部の患者におけるＢＤＮＦレベルを上昇させ、ｓＡＰＰレベルを低下させるアカンプロセートなどの化合物により治療するステップを含む。

いくつかの実施形態は、ベースラインからエンドポイントまでの変化率の分析を含み、平均ｓＡＰＰ全レベル（mean sAPP total level）は、ベースラインでの３４．７（ｎｇ／ｍＬ）からエンドポイントでの１９．３まで減少し（ｐ＝０．０２）、平均ｓＡＰＰαレベルは、ベースラインでの７．８（ｎｇ／ｍＬ）からエンドポイントでの４．２まで減少した（ｐ＝０．０３）。

ＡＳＤと診断され、アカンプロセートで１０週間治療された患者の血液で測定されたｓＡＰＰα−ＣＰレベルの変化率の間の関係を例示するグラフである。 ＡＳＤと診断され、アカンプロセートで１０週間治療された患者の血液で測定された全ｓＡＰＰ（sAPP(total)）−ＣＰレベルの変化率の間の関係を例示するグラフである。 図３Ａ：ＰＤＬコート２４ウェルプレート上を占め（claimed）、１０ｍＭのタモキシフェン（ポジティブコントロール）で処理されたリンパ細胞の顕微鏡写真である。図３Ｂ：ＰＤＬコート２４ウェルプレート上を占め、１０ｍＭのタモキシフェンで処理され、ヘキスト染色によって核染色された、リンパ細胞の顕微鏡写真である。 図３Ｃ：ＥＲＫ／ＭＡＰＫ抗体により染色された、無処置患者からのリンパ細胞の顕微鏡写真である；抗体は、ＥＲＫ／ＭＡＰＫの細胞質ゾル移行を有する３つの細胞を示す。図３Ｄ：細胞の核を示す、図３Ｃによるリンパ細胞の顕微鏡写真である。 アカンプロセートで処置された、ＷＴ及びｆｍｒ１ＫＯマウスで測定されたｐＥＲＫ活性の棒グラフである。

説明
新規技術の原理の理解を促進する目的で、これから、その好ましい実施形態が参照され、それを説明するために特有の用語が用いられる。それにもかかわらず、新規技術の範囲の如何なる限定も、それによっては、意図されていないことが理解されるであろうし、新規技術が関係する当業者に普通に思い浮かぶと思われるような、想定される、変更、修正、及び新規技術の原理のさらなる適用は、本開示及び特許請求の範囲内にある。

アカンプロセートは、成人におけるアルコール依存症の治療に、ＦＤＡによって承認されている。アカンプロセートは、グルタミン酸とガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の両方による神経伝達に影響を及ぼす可能性のある新規分子である。アカンプロセートは、ＮＭＤＡ及び代謝型タイプ５グルタミン酸（ｍＧｌｕＲ５）受容体でアンタゴニストとして、またＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡ（Ａ））受容体でアゴニストとして作用すると仮定されている。過剰なグルタミン酸と不十分なＧＡＢＡ（Ａ）による神経伝達が、自閉性障害の病理生理学に関与することが示された。アカンプロセートの可能な薬力学的メカニズムは、自閉症の病理生理学に、よく合致している。この化合物についてのさらなる情報は、２０１１年８月１１に出願された米国特許出願第１３／２０１，０１４号に見出すことができ、この特許出願は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

アカンプロセートは、かなりの数の神経−受容体に、おそらく直接又は間接に影響を及ぼす特異な薬物である。ＦＸＳにおいて重要な可能性のあるバイオマーカーへのアカンプロセートの作用の評価は、このような作用の基本的な薬力学的メカニズムの理解が不完全であるにもかかわらず、アカンプロセートとこの障害の病理生理学との関わりを示す見込みがある。さらに、この報告に記されるソーシャルスキルの改善は、特発性ＡＳＤを有する若年者に本発明者等がアカンプロセートを初期に使用した時に記載された発見と一致している（Erickson, et al. 2011）。ＦＸＳとＡＳＤの間の重なりを考えると、将来、特発性ＡＳＤに関連するコアの社会性障害を標的とするアカンプロセートの効能を評価することは重要であろう。

本明細書で用いられる場合、特に断らなければ、又は明らかに別のことが意味されているのでなければ、用語「約」は、数値の±１０％の範囲を表し、例えば、約１．０は、０．９から１．１までを包含する。

本明細書で用いられる場合、特に断らなければ、又は明らかに別のことが意味されているのでなければ、用語「治療に有効な用量」、「治療有効量」などは、ヒト又は他の動物の健康及び良い生活状態に、正味の有効な（positive）作用を及ぼす化合物の一人前の分量を表す。治療効果は、寿命、生活の質などにおける改善を含み得る。これらの効果は、また、疾患に罹り難くすること、又は健康又は良い生活状態を悪化させ難くすることも含み得る。前記効果は、１回の投薬及び／又は治療の後、直ちに実現され得るか、或いは、それらは、一連の投薬及び／又は治療の後で、積み重なって実現され得る。

医薬的に許容される塩は、哺乳類に用いて安全で有効であり、また望まれる治療活性を有する、本発明での化合物の塩を含む。医薬的に許容される塩は、本発明での化合物に存在する酸性又は塩基性の基の塩を含む。医薬的に許容される酸付加塩には、これらに限らないが、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、硫酸水素、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、酢酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、酒石酸、パントテン酸、酒石酸水素、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸（glucaronate）、糖酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、及びパモ酸（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））の塩が含まれる。本発明での特定の化合物は、医薬的に許容される塩を、様々なアミノ酸と生成し得る。適切な塩基との塩には、これらに限らないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、及びジエタノールアミンの塩が含まれる。本発明を実施するために使用され得る医薬的に許容されるいくつかの塩についてのさらなる情報については、例えば、Berge, et al., 66 J. PHARM. SCI. 1-19 (1977)、Haynes, et al., J. Pharma. Sci., Vol. 94, No. 10, Oct. 2005, pgs. 2111-2120などを調べて下さい。

脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、最もよくある、発達障害の遺伝形質である。ＦＸＳの原因となる遺伝子変異は、脆弱Ｘ精神遅滞１遺伝子（ｆｍｒ１）内の不安定なシステイン−グアニン−グアニン（ＣＧＧ）トリヌクレオチド（trinucelotide）反復配列の伸長（２００個の繰返し単位を超える）である。ＦＸＳは、キャリア（５５〜２００個のＣＧＧ反復配列）の親、最も普通には母親から、トリプレットの伸長を通して受け継がれる。Ｘ連鎖（X-linked）症候群として、ＦＸＳは、男性で、よりよく起こり、障害に伴う症状は、男性で、より顕著である。ＦＸＳは、また、よくある単一遺伝子原因自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）である。ＦＸＳを有する３人の男性の内の２人は、同時に現れるＡＳＤの診断を有すると見積もられている。この破壊的な状態に利用できる治療法は、ほとんど存在せず、したがって、この疾患を治療するためのさらなる治療法が求められている。本発明の態様は、このような治療法、及び、それらをモニターし、実行するためのツールを提供しようとする。

ＦＸＳに付随するトリプレット反復配列伸長は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）を欠く結果となる、ｆｍｒ１遺伝子での転写サイレンシングを生じる。ＦＭＲＰは、樹状成熟及びシナプス可塑性に重要なｍＲＮＡ結合タンパク質である。マウスの脳において、ＦＭＲＰは、シナプス前及び後機能に重要な、何百ものｍＲＮＡ転写産物に結合することが示された。

いくつかの動物試験において、ＦＭＲＰの欠損は、過剰なグルタミン酸と不十分なガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）によるシグナル伝達によって特徴付けられる異常制御神経伝達に関連付けられた。詳細には、過剰な代謝型グルタミン酸受容体５（ｍＧｌｕＲ５）活性が、ＦＸＳにおける異常制御神経伝達の最もよく特徴付けられた要素である。ｆｍｒ１ノックアウトマウスモデルにおいて、海馬及び小脳の過剰な長期抑圧（ＬＴＤ）、過剰なＡＭＰＡ受容体インターナリゼーション、異常樹状形態、及び発作閾値の低下は、全て、群１の受容体、具体的には、ｍＧＬｕＲ５代謝型グルタミン酸受容体の過剰な活性化と一致している。ＦＸＳにおける過剰なｍＧｌｕＲ活性化の治療上の示唆は、ＦＸＳ動物モデルにおいて徹底的に試験され、ヒトでの試験において初期に探究された。マウスモデルにおいて、ＭＰＥＰ（２−メチル−６−（フェニルエチニル）−ピリジン）及び他のｍＧｌｕＲ５アンタゴニストによる処置による、ｍＧｌｕＲ５のダウンレギュレーションは、聴原発作、プレパルスインヒビション（ＰＰＩ）の変化、及びオープンフィールドでの多動性を含めて、表現型の特徴を完全に変えることが示された。さらに、ｆｍｒ１ノックアウトマウスをｍＧｌｕＲ５ヘテロ接合ノックアウトと交配することによって実施されたｍＧｌｕＲ５のダウンレギュレーションは、樹状突起変化及び過剰なタンパク質合成を含めて、いくつかのｆｍｒ１ノックアウト特性の逆転を生じた。

ＦＸＳでの選択的ｍＧｌｕＲ５アンタゴニストの使用についての、ヒトでの２つの試験が報告された。ＦＸＳを有する１２人の成人（男性６人、女性６人；平均年齢＝２３．９歳）が参加した単回投薬パイロット試験において、ｍＧｌｕＲ５アンタゴニストであるフェノバムは、変化に富んだ薬物動態学、及び、軽度の鎮静作用を経験した３人の被験者（２５％）によって示される良好な忍容性を示した。臨床的には、９人の被験者（７５％）は、報告によれば、フェノバンの単回投薬により、多動性及び不安の減少を含む臨床的利点を経験した。

興味深いことに、選択的ｍＧｌｕＲ５アンタゴニストであるＡＦＱ０５６の使用は、１８から３５歳のＦＸＳを有する３０人の男性での、二重盲検、プラセボ対照２期クロスオーバー試験において、有意な群治療効果に結び付けられなかった。完全なｆｍｒ１遺伝子メチル化によって特徴付けられる７人の被験者サブセットにおいて、プラセボに比べて顕著なＡＦＱ０５６への反応が、異常行動チェックリスト（ＡＢＣ）の常同症、多動性、並びに、奇異言動下位尺度及び全ＡＢＣスコア、臨床全般印象改善（ＣＧＩ−Ｉ）尺度、ビジュアルアナログ尺度、並びに反復的行動尺度−修正版を含む、いくつかの評価尺度で認められた。著者等は、ＡＦＱ０５６は、完全なｆｍｒ１遺伝子メチル化を有する人のサブ群において、ＦＸＳに関連する支障のある行動の治療に見込みがあり得ると仮定した。ＡＦＱ０５６は、現在、ＦＸＳにおける大規模第ＩＩＩ相臨床試験の対象である。

イオンチャンネル型Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体の異常なシグナル伝達が、ＦＸＳに関与することが示された。ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて６〜７週齢までに解消する違いを有する、生存２週間でのＮＭＤＡ型受容体アップレギュレーションが報告された。非競合的ＮＭＤＡアンタゴニストのメマンチンの使用が、ｆｍｒ１ノックアウトマウスからの培養小脳顆粒細胞における樹状突起成長及びシナプス形成の修正に結び付けられた。ＦＸＳ及び共存症ＡＳＤを有する６人（平均年齢＝１８．３±３．８歳；範囲１３〜２２歳）におけるメマンチン使用のあまり大きくない効果が報告された。この試験では、４人の被験者（６７％）が、「著明改善」、又は「中程度改善」というＣＧＩ−Ｉスコアによって決定された臨床反応を示した。２人の被験者は、メマンチン処置の間、治療を制限する過敏性を持つようになった。

ＧＡＢＡタイプＡ（ＧＡＢＡ（Ａ））及びＧＡＢＡタイプＢ（ＧＡＢＡ（Ｂ））神経伝達の両方の欠陥が、ＦＸＳの動物試験において認められた。ＦＭＲＰを欠くＦＸＳ ＫＯマウスにおいて認められるＧＡＢＡ（Ａ）受容体ｍＲＮＡの減少により、ＦＭＲＰは、ＧＡＢＡ（Ａ）受容体サブユニットのＲＮＡ発現を転写調節することが示された。ＧＡＢＡ（Ａ）受容体の発現は、ｆｍｒ１ＫＯマウスで、かなりの数の脳の領域において、著しくダウンレギュレーションされることが示された。ＦＸＳの動物モデルにおいて、ＧＡＢＡ（Ａ）アゴニズムは、薬理療法の標的として、かなり有望であることを示した。ＧＡＢＡ（Ａ）アゴニストのアルファキサロンは、ｆｍｒ１ＫＯマウスにおいて、不安の減少及び聴原発作の救援に結び付けられた。また、ＦＸＳ ＫＯマウスにおいて、ＧＡＢＡ（Ａ）アゴニストのガボキサドールは、扁桃体におけるニューロン興奮性の欠陥を回復させ、多動性を抑制し、ＰＰＩの欠陥を小さくした。記憶の獲得及び保持における改善は、ＧＡＢＡ（Ａ）アゴニストであるタウリンを与えられたＦＸＳ ＫＯマウスにおいて認められた。本発明者等は、ＦＸＳを有する人が参加する、選択的ＧＡＢＡ（Ａ）アゴニストについての公開された如何なる試験も知らない。

選択的ＧＡＢＡ（Ｂ）アゴニストのＳＴＸ２０９（アルバクロフェン、Ｒ−バクロフェン；バクロフェンの単一エナンチオマー）の使用が、ＦＸＳを有するヒト及びｆｍｒ１ノックアウトマウスの両方で試験された。ノックアウトマウスでは、ＳＴＸ２０９は、異常タンパク質合成と樹状突起異常の修正に関連付けられた。ＳＴＸ２０９は、ＦＳＸにおける公表された最大の二重盲検、プラセボ対照試験の対象であった。ＦＸＳを有する６３人の６から４０歳までの被験者での、併用向精神薬の一定の投薬にＳＴＸ２０９を付け加えるクロスオーバー試験において、ＳＴＸ２０９の使用は、主要アウトカム評価尺度であるＡＢＣ過敏性（ＡＢＣ−Ｉ）下位尺度での改善に結び付けられなかった。群全体に渡る効果もまた、ＣＧＩ−Ｉ及びＣＧＩ重症度（ＣＧＩ−Ｓ）尺度、ＡＢＣの他の伝統的下位尺度（社会的引きこもり、常同症、多動性、奇異言動）、又はビジュアルアナログ尺度（ＶＡＳ）を含む、全般的な評価尺度で、認められなかった。結局、ＳＴＸ２０９は、鎮静を報告した、わずか８％の被験者により、よく忍容された。事後（post-hoc）分析において、ＳＴＸ２０９の使用による群全体に渡る有意な改善が、社会的回避尺度（ＡＢＣ−ＳＡ）、ＦＸＳを有する人に用いられ得るように特に開発された、ＡＢＣの新たに関発された４項目下位尺度で、認められた。また、事後分析において、ＦＸＳを有し、またＡＢＣ社会的引きこもり（ＡＢＣ−ＳＷ）下位尺度で≧８のベースラインスコアを有する２７人の被験者サブセットに、ＡＢＣ−ＳＷ、及びＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）適応機能社会性評価尺度で、ＳＴＸ２０９に関連する有意な改善。この試験は、この薬物が、ＦＸＳを有する人の社会性欠陥を標的にする見込みがあると結論した。ＳＴＸ２０９のＦＸＳにおける大規模第ＩＩＩ相試験が現在行われている。

アカンプロセート（３−アセトアミドプロパン−１−スルホン酸、Ｎ−アセチルホモタウリンとしてもまた知られている）は、禁酒の維持のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された薬物である。それは、アルコール依存症を有する成人に用いられるために処方される。ＦＤＡが承認した成人における投薬量は、６６６ｍｇを１日３回（２つのピルを１日３回）である。アルコール依存症を有する人では：いくつかのホルモン：レプチン、ベータエンドルフィン、コルチゾールのレベルを低下させる。

科学文献は、この分子が、ｍＧｌｕＲ受容体のアンタゴニストの可能性があり得るという報告を含む。この分子は、慢性的にアルコールを摂取するラットにおける、動物モデル抗酸化作用における、ＧＡＢＡ（Ａ）受容体でアゴニストとして働き得るというのである。ラットでは、この薬物は、側坐核における細胞外ドーパミンレベルを上昇させる（グリシン受容体の活性化に応じて）。アカンプロセートの可能な作用には、スペルミジン感受性ＮＭＤＡ受容体の、低いグルタミン酸濃度での活性の向上、及び高いグルタミン酸濃度での阻害が含まれる。

アカンプロセートは、ｍＧｌｕＲアゴニストのｔｒａｎｓ−ＡＣＰＤの神経毒性作用を阻むと仮定する人がいる。報告では、３−（（２−メチル−４−チアゾリル）エチニル）ピリジン（ＭＴＥＰ）とアカンプロセートのどちらも、知らずに飲む（drinking-in-the-dark）マウスモデルにおけるアルコール摂取量を低下させた。ＭＴＥＰ及びアカンプロセートは、どちらも、動物におけるアルコール禁断症状に伴う不安作用を減らすと報告された。マウスにおけるアルコール禁断症状の鎮静作用の増大を伴う３−（（２−メチル−４−チアゾリル）エチニル）ピリジン（ＭＴＥＰ）の類似の作用もまた報告された。アカンプロセート及びＭＰＥＰは、ノックアウトマウスにおけるｍＧｌｕＲ５を遮断することもまた報告された。

アカンプロセートは、禁酒の維持のために成人に用いられる、ＦＤＡによって承認された薬物であり、少なくともグルタミン酸及びＧＡＢＡによる神経伝達に影響を及ぼす、多面発現作用の可能性を有する生物活性剤である。動物による試験で、アカンプロセートは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に結合し、アンタゴニストとして作用することが実証された。アカンプロセートのｍＧｌｕＲ５アンタゴニスト作用の可能性は、アルコール依存症及び鬱病の両方の動物モデルで実証された。さらに、アカンプロセートは、動物による試験で、ＧＡＢＡ（Ａ）アゴニズムを示す。ヒトにおけるアカンプロセートの正確な作用メカニズムは、特に、臨床的に妥当な濃度で、アカンプロセートとグルタミン酸又はＧＡＢＡ受容体サブタイプとの間の直接の結合がないことを示す、アフリカツメガエル卵母細胞モデルでの発見を考えると、依然として未知のままである。

アカンプロセート及びＦＸＳの病理生理学による試験が、初期の臨床経験を報告した（Erickson, Mullett et al. 2010）。この試験では、ＦＸＳと診断された３人の成人男性（平均年齢＝２０．９歳）が、アカンプロセートで治療された（平均用量＝１，２２１ｍｇ／日；平均期間＝２１．３週間）。この試験において、３人の全ての被験者が、ＣＧＩ−Ｉにより評価すると、有意な有効臨床反応を示し、改善は、主に、社会性障害及びコミュニケーション障害において認められた。２人の被験者は、治療を制限するものではない、胃腸の障害（嘔吐及び／又は吐き気）を経験した。次いで、ＦＸＳを有する若年者でのアカンプロセートの最初の系統的な前向き試験が、実施された。

ＦＸＳ研究における血液バイオマーカーの開発は、治療反応を予測し、薬物メカニズムと根本的な病理生理学的特徴の関わりの可能性を含む、薬力学的薬物メカニズムを明確にし、また可能性として定量的なアウトカム評価尺度として役立てるために、有望である可能性がある。これらの利点の価値は、被験者のサブ群において有効な反応を示す最近のＦＸＳ臨床試験報告書、及び、ＦＸＳ臨床研究における、親の報告する行動一覧又は臨床家が評価するアウトカム評価尺度に頼るという固有の主観的特質を考えると、増大し続けている。有効な治療計画に一旦関連付けられたこのようなマーカーは、モニターし、評価することが別の方法では困難である集団に、特に用いられる。

脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、既存のニューロンの生存、並びに新しいニューロン及びシナプスの成長と分化を支えるタンパク質である。動物での試験において、ＢＤＮＦは、ＦＭＲＰの発現を調節することが示された。ｆｍｒ１ノックアウトマウスからの海馬切片へＢＤＮＦを適用すると、長期増強（ＬＴＰ）欠陥を救うことが示された。ＢＤＮＦの発現は、同腹子の野生型に比べて、ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて低下していることが示された。ＢＤＮＦの末梢レベルは、ＦＸＳを有するヒトでは報告されておらず、ＢＤＮＦレベルへのアカンプロセート使用の影響は知られていない。

本明細書において報告されるように、それぞれの改善領域（社会的行動又は注意欠陥／多動性）は、複数の独立したアウトカム評価尺度を用いて捕えられ、こうして、それぞれの結果は強固にされる。試験の間、家族は、コミュニケーションスキルにおける改善、処置前及び後でのＶＡＢＳの探索的使用の間に認められる改善によって裏付けられる可能性のある発見について、頻繁にコメントした。アカンプロセートが、複数の障害領域に独立に作用したかどうか、又は、１つの領域（例えば、注意欠陥／多動性）における改善が、他の領域（例えば、社会的行動及びコミュニケーション）において付随する改善をもたらしたかどうかは、はっきりしないままである。患者の行動における明確に評価される改善、及び新たに特定された改善のバイオマーカーを除いて、メカニズムに関する試験結果は、試験中、ある患者には向精神剤の併用を認めたことによって、複雑になった。したがって、何人かの患者におけるアカンプロセートと併用投与された薬物との間の薬物−薬物相互作用が、試験に登録された患者が比較的少数であることを考えると、直ちに明らかではない仕方で、彼らの治療反応及び／又は忍容性に影響を及ぼし得た可能性がある。

忍容性に関して、被験者が、時々、溶腸性コーティングアカンプロセート錠剤を噛み砕くにもかかわらず、胃腸に関する限られた障害が認められた。アルコール依存症のヒトでの試験におけるアカンプロセート使用で認められた、またＦＸＳでのアカンプロセートの使用に関する本発明者等の最初の報告における、最も一般的な有害作用であることを考えると、胃腸での有害作用の割合が低いのは驚くべきである。この試験の新規性を考えれば、本発明者等は、薬物が１６歳まで下って投薬されたアルコール依存症の文献（Niederhofer and Staffen 2003）からのデータ以外に、投薬量の根拠を置く如何なる歴史的データも持たなかった。４人の被験者に認められた軽度の過敏性は、用量依存性であると思われ、用量の低下は、それぞれの場合に、この有害作用の素早い解消につながった。若年者において、一旦薬物への曝露の閾値が超えられると、ＦＸＳを有する幾人かの参加者において軽度の過敏性が現れ得ることはあり得る。結局、最終の平均用量は、成人のアルコール依存症を治療する使用に、ＦＤＡが承認した用量の約半分であった。

ＢＤＮＦの結果は、アカンプロセートの使用に一致して増加することを示した。ＢＤＮＦの結果におけるこの全体の変化は、海馬脳切片へのＢＤＮＦの適用による、ＬＴＰ欠陥の救済に関するｆｍｒ１ノックアウトマウスでの報告を考えると、ＦＸＳにおいて重要である可能性がある。このＢＤＮＦの結果は、また、末梢ＢＤＮＦを抗鬱様作用の生成に関連付ける細胞及び行動モデルを考えると（Uutela, Lindholm et al. 2012）、動物での試験において認められた、アカンプロセートの最新の抗鬱性に対する何らかの追加の説明を提供する可能性があり得る（Louhivuori, Vicario et al. 2011）。ＢＤＮＦは、治療反応の、あり得る予測因子と評価尺度の両方としての可能性を有し得る。

事後分析により認められるＢＤＮＦの変化と治療反応との間の相関がないのは、少ない参加者数（sample size）、及び、わずか１回の治療での無反応者が、治療前及び後の利用できるＢＤＮＦデータに含まれていたという事実に起因し得る。併用薬の使用は、ＢＤＮＦの説明を一層困難にする。この試験で用いられた、併用の選択的セロトニン再取込み阻害剤（ＳＳＲＩ）は、ＢＤＮＦを増加させたようであることが知られている（Balu, Hoshaw et al. 2008）。併用薬物使用での投薬量は、併用薬物によって導入される変動性を減らそうとするために、この試験の全体を通して一定に保たれた。

分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）は、いくつかの生物学的経路に関与する重要な細胞シグナル伝達分子である。ＭＡＰＫは、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ３８アイソフォームを含めて、いくつかのグループにさらに分けられる。ＥＲＫ１及びＥＲＫ２は、よく研究された調節キナーゼであり、様々な細胞シグナル伝達経路に関与する。ＥＲＫ１／２は、Ｔｙｒ^２０４及びＴｈｒ^２０２残基でリン酸化され、核に移行し、いくつかの遺伝子の転写を活性化する。活性化ＥＲＫ１／２の細胞内局在は、様々な細胞（又は細胞系）及び培養条件で変わることが、前に認められた。培養単核細胞（患者から分離された）において、本発明者らは、タモキシフェン処置（ポジティブコントロール）の後、ＥＲＫ１／２の細胞質局在を観察した。個々の患者及びコントロールで、本発明等は、ポジティブ細胞、すなわち、細胞質ゾル領域に局在するホスホ−ＥＲＫ１／２ ｖｓ．視野における全細胞数を数えた。Ebisuya, M., Kondoh, K. and Nishida, E. (2005) The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science, 118, 2997-3002。

分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのＥＲＫ１／２サブファミリーは、細胞質及び核のエフェクターへの細胞表面受容体からのシグナル伝達を媒介する。脳において、ＥＲＫ１／２は、他の細胞型に比べてニューロンにおいて最も発現される。いくつかの結果は、ＥＲＫ１／２の潜在的異常調節をＡＳＤの病理生理学に結び付ける。アイソフォーム２（ＥＲＫ１／２）コンディショナルノックアウトマウスは、社会的行動の低下、営巣における欠陥、及び記憶障害を含めて、ＡＳＤに関連するいくつかの特徴を示すことが示された。ヒトの遺伝学的研究において、染色体１６ｐ１１．２での欠失、及び染色体２２ｑ１１．２（ここにＥＲＫ２の遺伝子が位置する）での欠失は、どちらも、自閉症に関連付けられた。ＥＲＫ１／２シグナル伝達活性は、ヒトＡＳＤにおける自閉症のＢＴＢＲマウスモデルの死後研究において、アップレギュレーションされることが示された。

ＦＸＳと診断された患者におけるＢＤＮＦレベルへのアカンプロセートの作用
参加者
大学医療センターの治験審査委員会（ＩＲＢ）は、この試験を承認した。体重≧１５ｋｇで５から１７歳の１３人の男性及び女性外来患者を、この試験に採用した。書かれたインフォームドコンセントは、各参加者の法的保護者（この報告における全ての子供では、親）から得られ、被験者は、可能であれば、同意した。ＦＸＳの診断は、少なくとも部分的な遺伝子メチル化を有するｆｍｒ１遺伝子における２００個を超えるＣＧＧ反復配列伸長と合致する、サザンブロット及びＰＣＲの結果によって確認された。被験者は、医療を要する他の目立った医学的状態を有していてはならなかった。グルタミン酸神経伝達に影響を及ぼさないと考えられる向精神剤の併用は、患者がベースラインの前に少なくとも４週間一定の投薬を経たのであれば、許容された。被験者は、Stanford-Binet 5th Editionによって決定して、１８か月を超える精神年齢を有することが求められた。さらなる組入れ基準は、少なくとも４のＣＧＩ−Ｓ（Guy 1976）スコア（「軽度に悪い」）を含んでいた。Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Edition, Text Revision（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）による、精神病性障害、双極性障害、又は物質使用障害の診断を有する被験者は、試験から除外された。さらに、陽性の尿妊娠検査、＜３０のクレアチニンクリアランス、活動性発作障害、又は医療を要する他の目立った医学的状態を有する被験者は除外された。

試験デザイン
１０週の、前向き、非盲検試験デザインが、この集団での、あり得る将来の大規模、二重盲検、プラセボ対照試験のための、パイロットデータを収集するために、選択された。

手順
全ての被験者は、スクリーニング及びベースライン診察を受け、その後、１０週の非盲検試験期間の間、２週間ごとの追跡診察を受けた。１、３、及び５週の最後に、調査員は、薬物の忍容性を評価し、指示されたように用量調節を行うために、親を呼んだ。全ての被験者は、試験の第１週の間、３３３ｍｇ／日のアカンプロセートを与えられた。次いで、調査員は、最適な臨床反応（１「著明改善」に相当するＣＧＩ−Ｉ）が起こらず、耐えられない有害作用が生じていなかった場合、１，９９８ｍｇ／日（体重＞５０ｋｇ）又は１，３３２ｍｇ／日（体重＜５０ｋｇ）の最大値まで、試験の最初の６週間に渡って、投薬量を増やした。用量維持フェーズは、最適な投薬量で４週間続いた。

評価
ＣＧＩ−Ｓ評価は、上記の適格性基準の一部として、スクリーニング及びベースラインで行われた。この試験において、評価者は、これらに限らないが、注意欠陥／多動性、社会性障害、コミュニケーション障害、反復行動、過敏性、及び不安を含む、ＦＸＳにおいて広く認められる症状の重症度に関して、ＣＧＩ−Ｓスコアを与えた。ＣＧＩ−Ｓは、１から７（１＝正常、全く悪くない；２＝境界線上の悪さ；３＝軽度に悪い；４＝中程度に悪い；５＝顕著に悪い；６＝重度に悪い；７＝最も極端に悪いＦＸＳ患者）の尺度で評価された。Autism Diagnostic Observation Schedule（ＡＤＯＳ）（Lord, Rutter et al. 1989）が、相伴うＡＳＤ診断の可能性を評価するために、ベースラインで行われた。

主要アウトカム評価尺度は、ＣＧＩ−Ｉであった。ＣＧＩ−Ｉは、ベースラインからの全般的変化を評価するように考案された尺度である。ＣＧＩ−Ｉスコアは、１から７の範囲である（１＝著明（very much）改善）；２＝中程度（much）改善；３＝軽度（minimally）改善；４＝不変；５＝軽度悪化；６＝中等度悪化；７＝著明悪化）。治療反応は、１「著明改善」又は２「中程度改善」のＣＧＩ−Ｉスコアによって定められた。この試験では、ＣＧＩ−Ｉは、ＦＸＳに関連するどの特定の症状／行動が、アカンプロセートの使用により改善又は悪化すると期待され得るかということに関する不確かさを考えて、概括的で全般的な主要アウトカム評価尺度として用いられた。ＣＧＩ−Ｉは、ベースライン後、全ての診察で適用された。

副次的アウトカム評価尺度は、ＡＢＣの全ての下位尺度を含んでいた（過敏性、社会的引きこもり、常同症、多動性、及び奇異言動）。ＡＢＣは、因子構造、スコアの分布、及び発達障害を有する人における変化に対する敏感さに関して、確認された信頼性及び妥当性を有する、情報提供者（主保護者）が採点する評価尺度である（Aman, Singh et al. 1985）。さらに、ＡＢＣは、ＦＸＳに関する臨床研究において、良好な信頼性及び再現性を示した。さらなる副次的アウトカム評価尺度は、対人応答性（Social Responsiveness）尺度（ＳＲＳ）（Constantino, Davis et al. 2003）、広汎性発達障害（ＰＤＤ）のために修正された子供用エール−ブラウン強迫観念・強迫行為（Obsessive Compulsive）尺度（ＣＹ−ＢＯＣＳ−ＰＤＤ）（Scahill, McDougle et al. 2006）の衝動脅迫下位尺度、ＣＧＩ−Ｓ、及びＡＤＨＤ評価尺度第４版（ADHD Rating Scale 4th Edition）（ＡＤＨＤ−ＲＳ）（Zhang, Faries et al. 2005）を含んでいた。ＳＲＳは、互恵的社会行動のいくつかの側面を評価する、６５項目の、親が記入する尺度である。ＳＲＳは、互恵的社会行動における障害のレベルに比例する合計スコアを与える。ＣＹ−ＢＯＣＳ−ＰＤＤは、ＡＳＤを有する人に一層適しているわずかに修正されたアンカーポイントを用いる、ＣＹ−ＢＯＣＳからの５つの衝動脅迫重症度項目を用いる。ＡＤＨＤ−ＲＳは、ＡＤＨＤ薬物試験で広く用いられる、臨床家がスコアを付ける標準的評価尺度である。全ての副次的アウトカム評価尺度は、試験の全ての診察で適用された。

ベースライン及び１０週に適用された、さらなる探索的アウトカム評価尺度は、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）（Sparrow and Cicchetti 1985）、及び、言語の基礎の臨床評価第４版（Clinical Evaluation of Language Fundamentals, 4th Edition）（ＣＥＬＦ）（Muma 1984）を含んでいた。ＶＡＢＳは、治療による適応行動における、あり得る変化を検出するために利用された。ＰＰＶＴ及びＣＥＬＦは、コミュニケーション／言語における、あり得る変化を捕えるために、含められた。

安全性の評価及びモニタリングは、全ての被験者が、医療履歴、健康診断、及び完全な精神医学上の面接を調べられた時、スクリーニングで始まった。健康診断は、また、エンドポイントでも実施された。身長及び体重を含めて、バイタルサインが、試験の各診察で得られた。スクリーニングで、サザンブロット及びＰＣＲを用いる分子検査の記録が利用できなければ、ＦＸＳについての遺伝子検査が行われた。スクリーニング、６週、及びエンドポイントで、分画及び血小板を含むＣＢＣ、電解質パネル、肝臓関連酵素、脂質パネル、及び尿妊娠検査（女性）を含む、血液及び尿の試験室検査が行われた。心電図もまた、スクリーニング及びエンドポイントで得られた。

バイオマーカーの評価
ＢＤＮＦのための血液試料は、スクリーニングと試験の１０週で採取された。ＢＤＮＦの分析は、患者の指定を伏せて行われた（処置の前又は後）。約４ｍｌの血液を、ＥＤＴＡを入れた管に採取した。採取後の３０分以内に、血液を、２〜８℃、１０００ｇで１５分間遠心した。血漿を採取し、採取した血漿のさらなる遠心を、２〜８℃、１０００ｇで１０分間行って、試料から血小板を完全に除去した。全ての血漿試料を、−８０℃で保存した。ＢＤＮＦアッセイは、３連で、全ての試料で同時に行った。血漿ＢＤＮＦを決定するために、ヒト血漿中に存在するＢＤＮＦの検出で正当性を立証された（Grassi-Oliveira et al., 2008）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州；米国）によるヒトＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡキットを用いる、高感度ＥＬＩＳＡに基づく方法を用いた。血漿試料中に存在するＢＤＮＦの量（ｐｇ／ｍｌ）は、被験者の試料と同時に実施された、既知量の純粋なヒトＢＤＮＦを用いる標準曲線で得られたｐｇの値から決定された。

データ分析
全てのデータは、統計分析のために、ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌに記録された。用いられた全てのアウトカム評価尺度の治療前及び後の平均値のあり得る差は、対応のあるｔ−検定（paired t-test）を用い、計算された。データが正規性の仮定に反する場合には、ウィルコクソン（Wilcoxan）の符号順位検定を用いて、治療前及び後の平均値のあり得る変化を評価した。効果量（effect size）は、ベースラインからエンドポイントまでの平均変化を、ベースラインでの標準偏差で割ることによって計算した。

スクリーニングされた１３人の被験者の中で、１２人（９２％）が適格性基準を満たし、登録された。採用されたサンプルは、１０人の男性及び２人の女性からなっていた（年齢範囲、６〜１７歳；平均１１．９歳）。１０人の被験者（８３％）は、追加の自閉性障害診断のためのＡＤＯＳ基準を満たし、２人（１７％）は、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の基準を満たした。全検査（full scale）知能指数は、３６〜６１の範囲であり、平均スコアは４５であった。被験者は、１０５４ｍｇ／日のアカンプロセート平均最終用量を与えられた（範囲、６６６〜１，９９８ｍｇ／日）。１０人の被験者は、試験の間、最も一般的な非定型抗精神病薬（ｎ＝７；表１）及び興奮剤（ｎ＝４）を含む、併用向精神薬を用いた（平均２．３種の併用向精神薬）。

全ての被験者が、全試験を終えた。１２人の被験者の９人（７５％）は、１「著明改善」（ｎ＝５）又は２「中程度改善」（ｎ＝４）のＣＧＩ−Ｉスコアに基づいて、治療反応者（treatment responder）であると見なされた。エンドポイントでの平均ＣＧＩ−Ｉは、１．９であった。

さらなるアウトカム評価尺度の中で、有意な改善が、社会的行動及び注意欠陥／多動性において認められた。社会的行動に関して、ＡＢＣ−ＳＷ下位尺度での平均スコアは、ベースラインでの８．８からエンドポイントでの４．１まで５３％減少した（ｐ＝０．０４；効果量＝０．８１）。ＡＢＣ−ＳＡでの平均スコアは、ベースラインでの３．３からエンドポイントでの１．６まで５１％減少した（ｐ＝０．０１；効果量＝０．６４）。

社会的行動における変化に一致するＡＢＣでの結果に加えて、治療により認められたＳＲＳの変化は、社会性障害における減少と一致していた。平均の全ＳＲＳ生スコアは、ベースラインでの９１．３からエンドポイントでの７６．４まで、１６％減少した（ｐ＝０．００５；効果量０．５４）。ＳＲＳの治療下位尺度の中で、改善が、社会的認知（１９％の減少；ｐ＝０．０１）、社会的コミュニケーション（１４％の減少；ｐ＝０．０１）、及び社会的動機づけ（２８％の減少；ｐ＝０．００３）において認められた。改善は、ＳＲＳの社会的自覚及び自閉性常同運動の下位尺度では認めらなかった。

多動性における改善は、ＡＢＣ多動性下位尺度（ＡＢＣ−Ｈ）で認められ、平均スコアは、ベースラインでの１６．８からエンドポイントでの１１．０まで、３５％減少した（ｐ＝０．０１；効果量＝０．６４）。ＡＢＣ−Ｈ下位尺度での結果に一致して、ＡＤＨＤ−ＲＳでの平均スコアは、ベースラインでの２３．６からエンドポイントでの１６．７まで、２９％減少した（ｐ≦０．０００１；効果量＝０．６５）。

病気の全般的重症度は、４．２５（中程度と重度に悪いの間）からエンドポイントでの３．３３（軽度と中程度に悪いの間）への平均ＣＧＩ−Ｓ変化によって示されるように、改善された（ｐ≦０．０００１；効果量＝２．０）。ＡＢＣ及びＣＹ−ＢＯＣＳ−ＰＤＤの他の下位尺度は、治療の間に、それ程変わらなかった（表２）。

探索的アウトカム評価尺度の中で、ＰＰＶＴスコアは、治療により、それ程変わらなかった。ＣＥＬＦは、適用することが困難であることが分かり、わずか３人の被験者が妥当な処置前及び後スコアを与えた。ＶＡＢＳのドメインの中で、コミュニケーションドメイン平均標準スコアは、ベースラインでの６３．４からエンドポイントでの６６．６まで、５％改善した（ｐ＝０．０３；効果量＝０．３）。ＶＡＢＳサブドメイン内で、表出的（expressive）コミュニケーション平均スコアは、ベースラインでの６９．７からエンドポイントでの７８．９まで、１３％改善した（ｐ＝０．００３；効果量＝０．４）。治療により他の如何なる変化も、ＶＡＢＳでは認められなかった。

１０人の被験者（８３％）が、スクリーニング及び１０週での血漿ＢＤＮＦ試料採取に参加した。２人の被験者は、バイオマーカー試料採取のために、１０週で十分な血液を抜き取ることができなかった（安全性の試験室評価尺度が優先された）。全てのＢＤＮＦデータは、ウィルコクソンの符号順位検定を用い、分析された。全ての被験者は、スクリーニングから１０週までで、血漿ＢＤＮＦが増加していた。被験者の平均血漿ＢＤＮＦは、治療により、７９０．４±１３５０．４ｐｇ／ｍＬから１００７．６±１４９３．２ｐｇ／ｍＬまで増加した（ｐ＝０．０１）。ＢＤＮＦ変化と１０週(Wekk)ＣＧＩ−Ｉスコアのあり得る相関の事後分析が行われた。ＢＮＤＦデータが利用できる、ここでの１０人の被験者において、それらの９人は治療反応者であり、ＢＤＮＦレベルの変化と治療反応との間の相関はなかった（ｐ＝０．２；符号検定）。

安全対策及び有害作用
体重、脈拍、又は血圧における臨床的に有意な如何なる変化も認められなかった。ＱＴｃ間隔における変化のないことを含めて、臨床的に有意な如何なる変化もＥＣＧでは認められなかった。試験室評価尺度に関しては、脂質、電解質、肝機能検査、又は血球数測定において、臨床的に目立った又はわずかな如何なる変化も認められなかった。

アカンプロセートは、全般に、よく忍容され、重症の又は重篤な有害作用は、試験の間に全く記録されなかった。９人の被験者（７５％）は、試験の間に、軽度の有害事象を経験した。保護者によって報告された最も共通する軽度有害作用は、過敏性（ｎ＝４）及び反復行動の増加（ｎ＝２）を含んでいた。過敏性の全ての事例は、用量依存性であると思われ、過敏性は、それぞれの事例で、３３３ｍｇへの用量減少により和らいだ。どの事例の軽度の過敏性も、１０週の診察までには、治まっていた。胃腸での有害作用は、軽度の下痢（ｎ＝１）及び軽度の便秘（ｎ＝１）を含んでいた。

自閉症スペクトラム障害と診断された患者におけるｓＡＰＰ、ｓＡＰＰαレベルへのアカンプロセートの作用
概観
アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、シナプスの形成に重要であると思われるタンパク質である。アミロイド生成ＡＰＰ切断経路は、アルツハイマー病に関連する斑点（plaque）の主成分であるアミロイドベータペプチド（Ａβ）の産出に導く。非アミロイド生成経路は、神経栄養産物の分泌型ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）を生じる。自閉症を有する若年者において、血清全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαの増加によって特徴付けられる、非アミロイド生成経路の活性の増大の可能性が認められた。あたかも実際に、ｓＡＰＰが、自閉症スペクトラム障害を有する人を含む臨床試験における治療反応の、可能性があるマーカー及び予測因子として調べられたかのようである。

アカンプロセートは、グルタミン酸とガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の両方による神経伝達に影響を及ぼす可能性がある新規分子である。ＡＰＰはシナプス形成に重要である。アミロイド生成ＡＰＰ切断経路は、アルツハイマー病に関連する斑点の主成分であるアミロイドベータペプチド（Ａβ）の産出に導く。非アミロイド生成経路は、神経栄養産物の分泌型ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）を生じる。全血漿ＡＰＰ（全ｓＡＰＰ）及び血漿ｓＡＰＰαは、多数の研究において、ＡＳＤを有する若年者において、定型発達（neurotypical）コントロール被験者に比べて上昇していることが見出された２、３。これらの発見は、特発性ＡＳＤの病理生理学に寄与する脳の過剰成長の証拠と相まって、過剰のｓＡＰＰα活性がＡＳＤの病因に役割を果たし得るという仮説に導いた２。特にＦＸＳでは、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）は、ＡＰＰ翻訳を調節することが知られているので、その結果、ＦＭＲＰを欠くことが定められたＦＸＳにおいて、ＡＰＰの上昇が認められる４。結局、特発性及びＦＸＳ関連ＡＳＤにおいて、重要な薬力学的メカニズムの可能性として、ＡＰＰ、特にｓＡＰＰαの調節の探求を正当化する根拠がある。

自閉性障害の症状を示す若年者のアカンプロセート治療による初期の臨床経験において、アカンプロセートにより治療された６人（平均年齢＝９．５歳）の若年者の内の５人が、１０から３０週（平均継続期間＝２０週）渡る治療で、アカンプロセート（平均用量＝１，１１０ｍｇ／日）に対する治療反応者と判断された。アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、シナプスの形成にとって重要であると思われるタンパク質である。アミロイド生成ＡＰＰ切断経路は、アルツハイマー病に関連する斑点の主成分であるアミロイドベータペプチド（Ａβ）の産出に導く。非アミロイド生成経路は、神経栄養産物の分泌型ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）を生じる。自閉症を有する若年者において、血清全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαの増加によって特徴付けられる、非アミロイド生成経路の活性の増大の可能性が認められた。あたかも実際に、ｓＡＰＰが、自閉症スペクトラム障害を有する人を含む臨床試験における治療反応の、可能性のあるマーカー及び予測因子として調べられたかのようである。本明細書に開示されるように、血液中に見出されるｓＡＰＰは、自閉症スペクトラム障害に対する予想外に正確なバイオマーカーであることが見出された。

ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαのアッセイ
試験血漿試料は、採取後、すぐに測定される。必要である場合、血漿の試験試料は、凍結されたが、凍結／解凍サイクルの繰返しは行われなかった。試験試料は、使用直前に低温で解凍され、それらを完全に混合した。必要であれば、血漿試料は、ＥＩＡ緩衝液により適当に希釈されてもよく、アッセイは、試験試料及び標準について、２連の測定で実施され得る。中性ｐＨ範囲の試験試料が用いられ、有機溶媒による汚染を避けるためのステップが取られた。ｓＡＰＰαレベルの大きさを定めるための標準に関しては、０．７８ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬまでの、段階希釈によるＥＩＡ緩衝液中の一連のｓＡＰＰα標準が調製された。

ＥＬＩＳＡプレートは、抗−ヒトｓＡＰＰα（２Ｂ３）マウスＩｇＧ−モノクローナルアフィニティ精製（ＩＢＬ）により予めコーティングした。最初に、試薬ブランクのためのウェルを決定し、各１００μＬの「ＥＩＡ緩衝液」又は１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．５）緩衝液を、各ウェルに入れた。同様に、試験試料ブランク、試験試料及び希釈された標準のためのウェルを指定した。次に、各１００μＬの試験試料ブランク、試験試料、及び標準希釈液を、適切なウェルに入れた。試験試料は、ＥＩＡ緩衝液により１００μＬにした、各被験者からの血漿試料（５〜２５μｌで変わり得る）を含んでいた。予めコーティングされたプレートを、それをしっかりとプレートの蓋で覆った後、４℃で一夜インキュベートした。プレートは、穏やかに振盪しながらロッカー（rocker）上に保った。翌日、予めコーティングされたプレートの各ウェルを、リン酸緩衝液中に０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含む洗浄緩衝液で激しく洗浄した。これは、各ウェルを洗浄緩衝液で満たし、予めコーティングされたプレートを１５〜３０秒間置いておき、軽く叩くことによって洗浄緩衝液をプレートから完全に除去することによって行われた。この手順は５回繰り返された。プレートを紙タオル上に軽く叩きつけて、残っている液体を全てのウェルから完全に除去した後、１００μＬの標識抗体溶液を、試験試料、希釈された標準及び試験試料ブランクのウェルに加えた。ＩＢＬによるＨＲＰ−コンジュゲート標識抗−ヒトＡＰＰ（Ｒ１０１Ａ４）マウスＩｇＧを用いた。各プレートを、それをプレートの蓋で覆った後、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、プレートを、前記と同様に５回洗浄した。発色させるために、１００μＬの発色基質（ＴＭＢ溶液）を、ウェルに加え、暗所においてプレートを室温で３０分間インキュベートした。液体が青色に変わり始めたら（発色基質の添加によって）、１００μＬの停止液（１ＮのＨ_２ＳＯ_４）をウェルに加えた。液体を、プレートの横側を軽く叩くことによって混合し、液体は、停止液の添加によって黄色に変わった。プレートの裏面の如何なる塵又は水滴も除くように注意を払い、必ず液体の表面に泡が全くないようにした。プレートリーダーを用い、試薬ブランクと比較して、４５０ｎｍで測定を実施した。測定は一般に、停止液の添加後、３０分以内に行われた。発色基質は、十分な暗所に保管され、金属を含まない状態に保たれた。

ｓＡＰＰのＥＬＩＳＡ
ｓＡＰＰレベルのためには、試験血漿試料は、採取の後、すぐに測定されなければならない。試験試料を保存するために、血漿試料を凍結保存し、凍結／解凍サイクルを繰り返さなかった。アッセイの直前に、低温で試験試料を解凍し、それらを完全に混合した。血漿試料は、必要であれば、ＥＩＡ緩衝液により適当に希釈されるべきである。試験試料及び標準の２連での測定が推奨される。中性ｐＨ範囲の試験試料を用い、測定に影響を及ぼし得る有機溶媒の汚染を避けた。ｓＡＰＰレベルの大きさを定めるための標準に関しては、０．３９ｎｇ／ｍＬから２５ｎｇ／ｍＬまでの、段階希釈によるＥＩＡ緩衝液中の一連のｓＡＰＰ標準を調製した。

ＥＬＩＳＡプレートは、抗−ヒトＡＰＰ（Ｒ１２Ａ１）マウスＩｇＧ（ＩＢＬ）により予めコーティングした。最初に、試薬ブランクのためのウェルを決定し、各１００μＬの「ＥＩＡ緩衝液」又は１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液を、各ウェルに入れた。同様に、試験試料ブランク、試験試料及び希釈された標準のためのウェルを指定した。次に、各１００μＬの試験試料ブランク、試験試料、及び標準希釈液を、適切なウェルに入れた。試験試料は、ＥＩＡ緩衝液により１００μＬにした、各被験者からの血漿試料（５〜２５μｌで変わり得る）を含んでいた。予めコーティングされた各プレートを、それをしっかりとプレートの蓋で覆った後、４℃で一夜インキュベートした。プレートは、穏やかに振盪しながらロッカー上に保った。翌日、予めコーティングされたプレートの各ウェルを、リン酸緩衝液中に０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含む洗浄緩衝液で激しく洗浄した。これは、各ウェルを洗浄緩衝液で満たし、予めコーティングされたプレートを１５〜３０秒間置いておき、軽く叩くことによって洗浄緩衝液をプレートから完全に除去することによって行われた。この手順は５回繰り返した。プレートを紙タオル上に軽く叩きつけて、残っている液体を全てのウェルから完全に除去した後、１００μＬの標識抗体溶液を、試験試料、希釈された標準及び試験試料ブランクのウェルに加えた。ＩＢＬによるＨＲＰ標識抗−ヒトＡＰＰ（Ｒ１０１Ａ４）マウスＩｇＧを用いた。プレートを、それをプレートの蓋で覆った後、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、プレートを、前記と同様に５回洗浄した。発色させるために、１００μＬの発色基質（ＴＭＢ溶液）を、ウェルに加え、暗所においてプレートを室温で３０分間インキュベートした。

液体が青色に変わり始めたら（発色基質の添加によって）、１００μＬの停止液（１ＮのＨ_２ＳＯ_４）をウェルに加えた。液体を、プレートの横側を軽く叩くことによって混合し、液体は、停止液の添加によって黄色に変わった。プレートの裏面の如何なる塵又は水滴も除き、必ず液体の表面に泡が全くないように、全てのプレートをチェックした。プレートリーダーを用い、試薬ブランクと比較して、４５０ｎｍで測定を実施した。測定は一般に、停止液の添加後、３０分以内に行った。

臨床試験の要約
ＡＳＤを有する若年者におけるアカンプロセートの臨床試験を実施した。１つの研究は、特発性ＡＳＤを有する１２人の若年者を登録した。さらに別の試験は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）関連ＡＳＤを有する１２人の若年者を登録した。アカンプロセート前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαのレベルが、１５人の参加者（ＦＸＳを有する９人、特発性ＡＳＤを有する６人）から入手できた。被験者の平均ＩＱは５６（範囲は３６から９６）であった。被験者の最終アカンプロセート投薬量は、１，０５４ｍｇ／日であった。結局、全ｓＡＰＰは、アカンプロセートの使用により、治療前の平均３２．６±３８．３ｎｇ／ｍＬから、治療後の２１．４±３２．３ｎｇ／ｍＬまで低下した（ｐ＝０．０１）。ｓＡＰＰαは、アカンプロセートの使用により、治療前の平均８．４±７．９ｎｇ／ｍＬから、治療後の５．５±７．２ｎｇ／ｍＬまで低下した（ｐ＝０．００３）。アカンプロセートによる治療によって誘発された、末梢全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαの低下は、ＡＳＤの病理生理学を標的とするための、１つのメカニズムを指し示す。

１つの試験である、自閉性障害を有する１２人の若年者での、アカンプロセートの１２週の単盲検プラセボ対照試験が実施された。評価された主要アウトカムは、臨床全般印象改善（ＣＧＩ−Ｉ）尺度であり、いくつかの追加の行動に関する副次的アウトカム評価尺度が用いられた。この試験では、分泌型アミロイド前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）が、血液バイオマーカーとして、アカンプロセート治療の前及び後で測定された。アッセイの結果：１２人の被験者（平均年齢＝１０．４歳）が試験に入り、９人の被験者が２週間のプラセボリードインを終了し、実薬治療に入った（平均最終用量＝１，０７３ｍｇ／日）。アカンプロセートを与えられた９人の被験者の６人（６７％）が、１「著明改善」、又は２「中程度改善」のＣＧＩ−Ｉスコアを有し、治療反応者と判断された。結局、アカンプロセートの使用は、よく忍容され、薬物の中断又は試験室／バイタルサイン異常に至る有害作用は全く認められなかった。分析された副次的アウトカム評価尺度の中で、社会的行動及び多動性の評価尺度で、アカンプロセートに付随する有意な改善が認められた。アカンプロセートの使用は、また、ｓＡＰＰレベルの低下を伴っていた。これらの結果は、アカンプロセートが、いくらかの患者における、自閉症に関連する社会性欠陥を軽減できること、及び血液で測定されたｓＡＰＰが、疾患を診断し、障害のための薬理学的治療の効能をモニターするための有用なバイオマーカーであることを示している。

合計で２４人の若年者（平均年齢１１．１歳；範囲５〜１７歳）が、これら２つのパイロット臨床試験に参加した。１５人の被験者で、利用可能なアカンプロセート前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαアッセイデータを利用できた。治療後の血液試料は、ＦＸＳを有する３人の被験者から得ることができず、ＡＳＤを有する３人の被験者は、プラセボリードイン反応者と見なされ、アカンプロセートを与えられず、特発性ＡＳＤ試験においてアカンプロセートを与えられた３人の被験者は、実薬アカンプロセート治療の間に追跡調査できなくなり、治療後血液分析を終えなかった。臨床反応の予め指定された指標を用いると、ＦＸＳを有する１２人の若年者の９人、及び特発性ＡＳＤを有する９人の若年者の６人は、アカンプロセートの反応者と判断された。一般に、臨床改善は、社会的行動及び注意欠陥／多動性において認められた。集められた被験者の平均ＩＱは５６（範囲は３６から９６）であった。集められた被験者の最終アカンプロセート投薬量は、１，０５４ｍｇ／日であった。結局、全ｓＡＰＰは、アカンプロセートの使用により、治療前の平均３２．６±３８．３ｎｇ／ｍＬから、治療後の平均２１．４±３２．３ｎｇ／ｍＬに低下した（ｐ＝０．０１）。ｓＡＰＰαは、アカンプロセートの使用により、治療前の平均８．４±７．９ｎｇ／ｍＬから、治療後の５．５±７．２ｎｇ／ｍＬに低下した（ｐ＝０．００３）。全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαのどちらのレベルも、特発性ＡＳＤを有する１人の被験者（この場合、ｓＡＰＰαは治療後に変わらなかった）における以外は、試験されたどの試料においても治療により低下した。全ｓＡＰＰ又はｓＡＰＰαの変化パーセントと、ＡＢＣ−ＳＷでのスコアの変化パーセントとの間に、有意な相関は、集められた１５人の被験者試料において、認められなかった。ＦＸＳを有する者の９人の被験者サブセットの中では、全ｓＡＰＰの変化とＡＢＣ−ＳＷスコアとの間に、有意な相関が認められ、全ｓＡＰＰにおけるより多くの低下が、ＡＢＣ−ＳＷスコアにおけるより大きな改善と相関関係にあることを意味していた（スピアマンの相関係数＝０．８５３；ｐ＝０．００３）。

第１の企画は、アカンプロセートの１０週の非盲検試験において、脆弱Ｘ症候群及び共存症ＡＳＤを有する、５から１７歳の１２人の若年者を登録した。第２の企画は、アカンプロセートの１２週の単盲検プラセボリードイン試験において、特発性ＡＳＤと診断された５から１７歳の１２人の若年者を登録した。両方の企画において、向精神薬の併用投薬量は、試験の全体を通して、一定のままであった。それぞれの企画において、アカンプロセート治療の前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαの血漿レベルが得られた。全てのＡＰＰアッセイ試料は、採取され、冷却され、血液抜取りの２時間以内に、分析のために試験室へ運ばれた。血漿全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαは、Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＢＬ、群馬、日本）から入手されたＥＬＩＳＡキットを用い、血清中で別々に決定された。このＥＬＩＳＡキットは、ヒト試料におけるｓＡＰＰαのレベルを測定する正当性を実証されており、典型的な試料において、０．０９ｎｇ／ｍｌのように少ないｓＡＰＰαを検出でき、ｓＡＰＰβへのわずか０．３％の交叉反応性を有する。血漿中の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαのレベルは、ミリリットル当たりのナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）で報告された。アカンプロセート前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαレベルの統計的分析は、対応のあるＴ−検定を用い、実施された。最後に、全ｓＡＰＰ又はｓＡＰＰαの変化パーセントと、異常行動チェックリストの社会的引きこもり／無気力の下位尺度（ＡＢＣ−ＳＷ）でのスコアの変化パーセントとの間のあり得る相関の探索的な事後分析が実施された。ＡＢＣ−ＳＷは、ＡＳＤのコア症状ドメインである社会性障害を評価する。事後分析は、スピアマン相関計算により行われた。全てのデータは、ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２０で分析された。

１２人の若年者（平均年齢１０．４歳；範囲５〜１５歳）が、この試験に参加した。被験者の平均ＩＱは６７であった（範囲２５〜９６）。９人の被験者が、実薬治療相に入った（２週での診察を越えて）。１人の被験者は、プラセボ反応者と思われ、１人の被験者は、プラセボ処置の間に相当な過敏性を持つようになり、試験を去り、１人の被験者は、プラセボで相当な嘔吐及び下痢を経験し、試験を去った。アカンプロセートを与えられた９人の患者の間で、平均の最終薬物用量は、１，０７３ｍｇ／日（範囲６００〜１，９９８ｍｇ／日）であった。結局、アカンプロセートは、よく忍容され、薬物の中断に至る有害作用、及びバイタルサイン又は安全性の試験室評価の変化は全く認められなかった。アカンプロセート治療の間の有害作用は、軽度の一過性下痢（ｎ＝３）、用量減少により和らげられた、用量に関係する一過性過敏性（ｎ＝２）、軽度の一過性頭痛（ｎ＝２）、軽度の一過性疲労感（ｎ＝２）、軽度の一過性不眠症（ｎ＝２）、軽度の一過性の過剰な笑い（ｎ＝１）、及び軽度の一過性の多動性の高まり（ｎ＝１）を含んでいた。行動のアウトカム評価尺度に関して、今日までに、本発明者等は、ＣＧＩ−Ｉ、ＣＧＩ−Ｓ、ＡＢＣの全ての下位尺度、ＳＲＳ、及びＡＤＨＤ−ＲＳによるデータを分析した。全ての分析は、３人の被験者が１２週の前に追跡調査できなくなったので（それぞれ、６、８、１０週後に追跡できなくなった）、先に行われた最後の観察を用い、行われた。実薬治療相に入った９人の被験者の６人（６７％）は、１又は２（最後の診察での平均ＣＧＩ−Ｉ＝２）のＣＧＩ−Ｉスコアを有する、アカンプロセート反応者と判断された。

今日までに分析された副次的アウトカム評価尺度データの中で（対応のあるｔ−検定）、アカンプロセート使用による改善は、全ＳＲＳ生スコア（ベースラインでの１０７±２８からエンドポイントでの９１．４±３０までの平均変化；ｐ＝０．００２）、ＡＢＣ無気力／社会的引きこもり下位尺度（ＡＢＣ−ＳＷ；１４．１±８．５から１０．０±８．４；ｐ＝０．０１９）、ＡＤＨＤ−ＲＳ（２９．５±１０．４から２０．７５±９．７；ｐ＝０．００２）、ＡＢＣ多動性下位尺度（２５．４±１２．６から１６．６±１２．４；ｐ＝０．００５）、及びＣＧＩ−Ｓ（４．２２±０．４から３．７±０．５；ｐ＝０．０１３）で認められた。ｓＡＰＰ血液バイオマーカーデータに関しては、試験の最後までに、６人の被験者で、アカンプロセート前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαレベルを利用できる。ベースラインからエンドポイントまでの変化率の分析において、平均の全ｓＡＰＰレベルは、ベースラインでの３４．７（ｎｇ／ｍＬ）からエンドポイントでの１９．３まで減少し（ｐ＝０．０２）、平均のｓＡＰＰαレベルは、ベースラインでの７．８（ｎｇ／ｍＬ）からエンドポイントでの４．２まで減少した（ｐ＝０．０３）。

自閉症を有する若年者の社会性障害を標的とする、この初期のアカンプロセートのパイロットプラセボ対照試験は、この薬物が、よく忍容され、社会性欠陥及び多動性の低下に特異的な、効能の表れの可能性が認められることを示した。この試験は、アカンプロセートの使用が、自閉症における治療効果の薬力学的マーカーの可能性を指し示す、全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαの一様で有意な減少を伴っていたことを示している。

自閉性障害を有する５から１７歳の１２人の若年者の治療におけるアカンプロセートの効果に関する、１２週の単盲検プラセボ対照試験が実施された。パイロット試験を行うために、コアの社会性障害を標的とする、自閉症を有する若年者におけるアカンプロセートの使用が、実施された。全ての被験者及び彼らの家族構成員に、治療状況は伏せられていた。アカンプロセートによる１０週の治療の前の、２週のプラセボリードイン相に、全ての被験者が参加した。この企画では、腸溶性コーティングされた市販の３３３ｍｇアカンプロセートピルが、さらにカプセル化され、この企画のために、全く同じ外観のプラセボが製造された。２週での、１「著明改善」又は２「中程度改善」の臨床全般印象改善尺度（ＣＧＩ−Ｉ）スコア（コアの社会性欠陥に強く結びついた評価）によって特徴付けられるプラセボ反応者は、試験から去るように求められた。アカンプロセートによる実薬治療の間、投薬量は、実薬治療の最初の６週に渡り、１週当たり３３３ｍｇずつ、最大用量の１，３３２ｍｇ／日（体重＜５ ６０ｋｇ）又は１，９９８ｍｇ／日（体重＞６０ｋｇ）まで増やした。実薬治療の最後の４週の間、被験者は、一定の最大許容（最高限度）用量で維持された。主要アウトカム評価尺度は、臨床家によって評価される、社会性障害の症状に強く結び付いたＣＧＩ−Ｉであった。副次的アウトカム評価尺度は、ＣＧＩ−重症度尺度、異常行動チェックリスト（ＡＢＣ）、広汎性発達障害のために修正された子供用エール−ブラウン強迫観念−強迫行為尺度（ＣＹ−ＢＯＣＳ−ＰＤＤ）、ＡＤＨＤ評価尺度第４版（ＡＤＨＤ−ＲＳ）、対人応答性尺度（ＳＲＳ）、Ｖｉｎｅｌａｎｄコミュニケーション下位尺度、ピーボディ絵画語彙検査（ＰＰＶＴ）、神経心理学的状態の評価のための繰返し可能バッテリー（ＲＢＡＮＳ）、及び表出的言語サンプリングを含んでいた。各被験者は、スクリーニングで、スタンフォード・ビネー（第５版）を用いるＩＱ試験を終えた。さらに、ｓＡＰＰ試料がベースライン及び試験の最後に抜き取られた。安全性の試験室試験が、スクリーニング、６週、１２週に、集められた。健康診断がスクリーニング及び１２週で行われ、バイタルサインが、全ての試験診察で得られた。アカンプロセートのあり得る有害作用は、全ての試験診察、及び有害作用ログを用いる試験合間の医師による電話で聞き出された。

ＦＸＳ関連ＡＳＤと診断された患者におけるｓＡＰＰ、ｓＡＰＰαへのアカンプロセートの作用
５〜１７歳の１２人の若年者が、非盲検試験に登録された。１２人の全ての被験者は、サザンブロット及び／又はＰＣＲ分析によって、完全なＦＸＳ変異を有することが確認された。被験者は、さらに、ＩＱ（ＳＢ５又はＬｅｉｔｅｒ） ＡＤＩ−Ｒ、ＡＤＯＳ Ｖｉｎｅｌａｎｄでスクリーニングされた。

パイロット試験は１０週間、行われた。安全性試験室スクリーニングが、６及び１０週で実施された。安全性スクリーニングの間に測定された生理学的パラメータは、次の通りであった：バイタサイン、ＬＦＴ、電解質パネル、分画及び血小板を含むＣＢＣ、脂質パネル、グルコース、尿素分析、及びＥＣＧ。

本人への臨床診察は、２週間ごとに予定された。電話による評価が、１、３、及び５週に実施された。各被験者は、医師との対話の度に、有害作用について評価された。

柔軟な投薬計画が用いられた。腸溶性コーティングアカンプロセート（総量３３３ｍｇ）錠剤が用いられた。投薬量は、試験の最初の６週間、１週毎に３３３ｍｇずつ増やされた。５０ｋｇ未満の体重を有する被験者では、最大用量は１３３２ｍｇであった（１日２回又は３回に分割）。５０ｋｇを超える体重を有する被験者では、最大用量は１９９８ｍｇであった（１日２回又は３回に分割）。平均の最終用量は、１日当たり１０５４±４２２ｍｇであった。

１３人の被験者が、この試験のためにスクリーニングを受けた。被験者の１人は、ピルを飲みこむことができず、この試験から除外された。残りの被験者は、１０人の男性及び２人の女性を含んでいた。彼らの平均年齢は、１１．９歳で、範囲は６．２５から１７．７５歳であった。１２人の被験者の平均のＩＱは４４．６で、範囲は、３６から６１であった。被験者の１０人は、自閉性障害と診断され、２人は、広汎性発達障害ＮＯＳと診断された。

試験の最後までに、被験者の７５％（９／１２）が、反応者であると思われた。これらの９人の被験者は、１（著明改善）又は２（中程度改善）のＣＧＩ−Ｉスコアを有していた。１０週での反応者の平均のＣＧＩ−Ｉ値は、１．９２であった。

今日までに分析された副次的アウトカム評価データの中で（対応のあるｔ−検定）、アカンプロセートの使用による改善は、全ＳＲＳ生スコア（ベースラインでの１０７±２８からエンドポイントでの９１．４±３０への平均変化；ｐ＝０．００２）、ＡＢＣ無気力／社会的引きこもり下位尺度（ＡＢＣ−ＳＷ；１４．１±８．５から１０．０±８．４；ｐ＝０．０１９）、ＡＤＨＤ−ＲＳ（２９．５±１０．４から２０．７５±９．７；ｐ＝０．００２）、ＡＢＣ多動性下位尺度（２５．４±１２．６から１６．６±１２．４；ｐ＝０．００５）、及びＣＧＩ−Ｓ（４．２２±０．４から３．７±０．５；ｐ＝０．０１３）で認められた。ｓＡＰＰ血液バイオマーカーデータに関しては、試験の最後までに、６人の被験者で、アカンプロセート前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαレベルを利用できる。ベースラインからエンドポイントまでの変化率の分析において、平均の全ｓＡＰＰレベルは、ベースラインでの３４．７（ｎｇ／ｍＬ）からエンドポイントでの１９．３まで減少し（ｐ＝０．０２）、平均のｓＡＰＰαレベルは、ベースラインでの７．８（ｎｇ／ｍＬ）からエンドポイントでの４．２まで減少した（ｐ＝０．０３）。

ここで、図１及び２を参照する。非盲検アカンプロセート試験に参加した、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を有する６人の被験者から集められた表７及び８のデータのグラフ。末梢血液試料が、６人の個々のヒト患者から採取された。６人の患者の全てはＦＸＳと診断された。試料は、試料中の全ｓＡＰＰ−ＣＰ及びｓＡＰＰα−ＣＰの両方のレベルを測定するために、アカンプロセートによる治療の前、及びアカンプロセートによる治療の後で、抜き取られ、分析された。試料中の特定のタンパク質のレベルは、適切な抗体を用いるＥＬＩＳＡによって決定された。

これらのグラフに示されたデータは、アカンプロセートによる、ＦＸＳを有する患者の治療は、ＡＰＰレベルを正常化（低下）させることを伴っていることを例示する。このデータは、アカンプロセートが、ＦＸＳに関連する異常ニューロン活動（この場合、ＡＰＰの上昇）に直接関与し得ることを示す。ＦＸＳを有する患者におけるＡＰＰレベルは、治療反応の良好な臨床予測因子である。最も高いＡＰＰレベルを有する患者は、アカンプロセートにより治療されるべきである。アカンプロセートによる治療の間、又はその後で、ＡＰＰの減少を示す患者は、この化合物により治療され続けるべきである。ＡＰＰレベルは、また、ＦＸＳの治療に有効であり得る他の化合物の選抜手段として用いることができる。ＡＰＰレベルを低下させる化合物は、ＦＸＳの治療に有用であり得る。

ＦＸＳを有する患者の社会性障害を標的とする、この初期のアカンプロセートのパイロットプラセボ対照試験は、この薬物が、よく忍容され、社会性欠陥及び多動性の低下に特異的な、効能の表れの可能性が認められることを示している。この試験は、アカンプロセートの使用が、ＦＸＳの治療のための薬力学的マーカーの可能性を指し示す、全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαの一様で有意な減少を伴っていたことを示している。

全体で、２４人の若年者（平均年齢１１．１歳；範囲５〜１７歳）が、これらの２つのパイロット臨床試験に参加した。１５人の被験者で、利用可能なアカンプロセート前及び後の全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαアッセイデータを利用できた。治療後の血液試料は、ＦＸＳを有する３人の被験者から得ることができず、ＡＳＤを有する３人の被験者は、プラセボリードイン反応者と見なされ、アカンプロセートを与えられず、特発性ＡＳＤ試験においてアカンプロセートを与えられた３人の被験者は、実薬アカンプロセート治療の間に追跡調査できなくなり、治療後血液分析を終えなかった。臨床反応の予め指定された指標を用いると、ＦＸＳを有する１２人の若年者の９人、及び特発性ＡＳＤを有する９人の若年者の６人は、アカンプロセートの反応者と判断された。一般に、臨床改善は、社会的行動及び注意欠陥／多動性において認められた。集められた被験者の平均ＩＱは５６（範囲は３６から９６）であった。集められた被験者の最終アカンプロセート投薬量は、１，０５４ｍｇ／日であった。結局、全ｓＡＰＰは、アカンプロセートの使用により、治療前の平均３２．６±３８．３ｎｇ／ｍＬから、治療後の平均２１．４±３２．３ｎｇ／ｍＬに低下した（ｐ＝０．０１）。ｓＡＰＰαは、アカンプロセートの使用により、治療前の平均８．４±７．９ｎｇ／ｍＬから、治療後の５．５±７．２ｎｇ／ｍＬに低下した（ｐ＝０．００３）。全ｓＡＰＰ及びｓＡＰＰαのどちらのレベルも、特発性ＡＳＤを有する１人の被験者（この場合、ｓＡＰＰαは治療後に変わらなかった）における以外は、試験されたどの試料においても治療により低下した。全ｓＡＰＰ又はｓＡＰＰαの変化パーセントと、ＡＢＣ−ＳＷでのスコアの変化パーセントとの間に、有意な相関は、集められた１５人の被験者試料で、認められなかった。ＦＸＳを有する者の９人の被験者サブセットの中では、全ｓＡＰＰの変化とＡＢＣ−ＳＷスコアとの間に、有意な相関が認められ、全ｓＡＰＰにおけるより多くの低下が、ＡＢＣ−ＳＷスコアにおけるより大きな改善と相関関係にあることを意味していた（スピアマンの相関係数＝０．８５３；ｐ＝０．００３）。

マウスで測定されたＥＲＫ１／２活性
野生型及びｆｍｒ１（脆弱Ｘ遺伝子）ノックアウトマウスにおいて、ＥＲＫ活性レベルへのアカンプロセートの影響を評価するために、ＡＳＤに対するマウスモデルを用い、集められたデータの要約。

ここで、図４を参照。野生型及びｆｍｒ１（脆弱Ｘ遺伝子）ノックアウトマウスにおいて、ＥＲＫ活性レベルへのアカンプロセートの影響を評価するために、ＡＳＤのマウスモデルを用い、集められたデータの要約。

ウェスタンブロッティングによりヒトで評価されたＥＲＫ１／２活性
血液を抜き取り、単核細胞を分離したすぐ後、ウェスタンイムノブロッティングによる。全血試料は、Ｒｉｌｅｙ自閉症クリニックから得た。試料を、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ中、２８００ＲＰＭで２０分間遠心することによって、血液からリンパ細胞を分離した。遠心後、リンパ細胞層を、新しい１５ｍｌのコニカルチューブに移し、１３００ＲＰＭで１５分間遠心した。上澄みを吸い出し、ペレットを、１ｍｌの１×ＰＢＳに再懸濁させた。試料を、再び、１３００ＲＰＭで１０分間遠心した。上澄みを吸い出し、ペレットを、１０％のＦＢＳを含むＰＲＭＩ １６４０の５００μｌに、ゆっくりと再懸濁させた。プレートへの細胞を用いた後、残りの細胞を、エッペンドルフチューブに移し、４００×ｇで６分間遠心した。上澄みを取り除き、ペレットを、細胞溶解液を作るために用いた。

細胞溶解液からの全タンパク質を、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用い、測定した。体積は、１５レーンのゲルの各々のレーンに１０μｇをローディングするように計算した。Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー及び水を用いて、各試料の全量を３０μｌにした。試料を、サーモサイクラー（thermo cycler）を用い、９５℃で５分間、変性させた。ランニングバッファーをカセットに添加し、その後、試料をウェルにローディングした。タンパク質標準を、マーカーとして１つのレーンにローディングした。ヒト胎児ニューロン（ＨＦＮ）溶解液及びヒト脳溶解液もまた、コントロールとして使えるようにローディングした。ゲルは、２００Ｖで１時間、運転した。

転写は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔシステムを用いて行った。ドライ式転写を７分間行い、ＰＶＤＦブロットを、後でタンパク質の転写を見るために、１０分間、ポンソー染色した。染色後、ブロットをＴＢＳＴですすいで、ポンソー染色の酸性を中和した。ブロッキングは、１時間、ＴＢＳＴ中５％ミルクにより行った。それを捨て、ブロットを、ＴＢＳＴ中５％ミルクで希釈したホスホ−ＥＲＫ一次抗体により、４℃で一夜、プローブした。次の日、一次抗体を除去し、ブロットを、ＴＢＳＴ中で３回、各１０分間、洗った。ブロットを、ＴＢＳＴ中５％ミルクで希釈したヤギ抗ウサギ二次抗体に１時間入れた。次いで、ブロットを、ＴＢＳＴで３回、各数分間、すすいだ。

すすいだ後、１：１高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）試薬を、ＰＤＶＦ膜に添加し、室温で１分間、インキュベートした。フィルムを、１５分及び２５分で現像した。ブロットを、８分間ストリッピングし、次いで、ＴＢＳＴで５分間すすいだ。次に、ブロットを、ＴＢＳＴ中５％ミルクで１時間ブロッキングし、４℃で一夜、汎ＥＲＫ（１：１０００）一次抗体で再プローブした。この場合もまた、ヤギ抗ウサギを二次抗体として用いた。ブロットをすすぎ、フィルムを、先に記載されたようにして現像した。ゲルのデンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。ホスホＥＲＫと汎ＥＲＫの比を求め、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。

ＥＲＫ／ＭＡＰＫ活性のために固定された単核細胞のリンパ細胞及びＩＣＣ（抗−ホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４ＥＲＫ／ＭＡＰＫ）
リンパ細胞試料を、患者の血液から調製し、ＰＤＬコート２４ウェルプレートに蒔いた。細胞は、ＰＢ溶液中４％パラホルムアルデヒドを加えることによって固定した（ＲＴで）。過剰のパラホルムアルデヒド溶液は、吸い出した。固定した細胞は、冷ＤＰＢＳ（ダルベッコ改変リン酸緩衝生理食塩水）により、穏やかに３回洗った。次いで、０．１２％のトリトンＸ−１００（ＤＰＢＳで希釈）をＲＴで細胞に添加し、ＲＴで２０分間インキュベートした。過剰のトリトンＸ溶液を吸い出し、細胞を、冷やしたＤＰＢＳで３回（穏やかに）洗った。細胞を、ＲＴで２０分間、１０％のウマ血清（ＨＳ）（ＤＰＢＳで希釈）でブロッキングした。結合しなかったブロッキング剤は、洗って除いた。ＤＰＢＳ中１％ＨＳで希釈した一次抗体を添加した。通常、１：２５０の希釈を用いた。抗体は、ウサギで産生され、ＥＲＫ／ＭＡＰＫのホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４を認識し、これは、細胞質ゾル領域への活性化ＥＲＫ／ＭＡＰＫの移行を示す。

一次抗体とのインキュベーションは、４℃で一夜、行った。結合しなかった一次抗体は、洗って除き、この段階で、プレートは、４℃で保存できる。ＲＴで冷ＤＰＢＳにより３回洗う。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲートヤギ抗ウサギ（ＤＰＢＳで１：２００希釈）を添加し、ＲＴで１〜２時間インキュベートした。この試薬及びこのステップは、光に敏感である。最良の結果のために、試薬及び手順のこのステップは、光のない状態に保たれるべきである。部屋の明かりを消し、二次抗体を吸い出し、捨てた。再び、ＲＴで、ＤＰＢＳにより３回洗った。ＤＰＢＳを１５ｍＬチューブに取り、それにヘキスト染色（１：５００希釈）を添加した。希釈後のヘキスト染色含有溶液を、各ウェルに添加した。ヘキスト及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒに対する特殊なフィルターを用い、暗くして顕微鏡下で写真を撮った（カメラの記録時間は、手動で設定され、全ての画像に同じ記録時間を用いなければならない）。

ポジティブコントロール：細胞を、１０μＭのタモキシフェンで処理し、これは、ポジティブコントロールとして使えた。タモキシフェンは、ＥＲＫ活性化を誘導し、ＥＲＫ／ＭＡＰＫの移行は、細胞の細胞質ゾル領域で観察された。さらに、明るい核がヘキストによって染色された。

５〜１７歳で特発性ＡＳＤと診断された３７人の若年者（平均年齢１０．１歳）ｖｓ．年齢と性別が同等の１３人の定型発達（neurotypical）コントロール被験者（平均年齢１０．４歳）からの、末梢リンパ細胞におけるＥＲＫ／２基礎活性化データの解析。ＡＳＤを有する若年者は、７．１＋７．１％の平均ＥＲＫ１／２基礎活性化を有していたのに対して、コントロール被験者では２．８＋２．１％の活性化度を有していた（ｐ＝０．０１、コーエンのｄ＝０．８２）。ＡＳＤを有する若年者におけるＥＲＫ１／２活性化の増大は、また、ウェスタンブロット分析によっても示された（データは示されていない）。

グルタミン酸作動性剤のリルゾールは、ＦＸＳを有する成人におけるＥＲＫ１／２活性化率を変える。ｆｍｒ１動物による実験は、ｆｍｒ１ノックアウト動物におけるアカンプロセートの使用が、ＥＲＫ活性化の過剰なベースラインでの高さを治す、すなわち、アカンプロセートは、活性化ＥＲＫを野生型のレベルに戻すことを示す。これらの結果は、アカンプロセートが、ＦＸＳのマウスモデルにおいて、増大したＥＲＫ１／２活性化を、野生型のレベルに戻すことを示す。これらの結果は、ＥＲＫ１／２が、ＡＳＤ及び関連する神経障害と診断されたヒトにおける、薬物治療標的（drugable target）であることを示す。これらの結果はまた、ＥＲＫ活性化が、ヒトにおける脆弱Ｘ及び脆弱Ｘ様疾患を治療及び／又は研究するためのアカンプロセートの使用において、バイオマーカーとして使用できることも示す。ＥＲＫ１／２活性化の異常なレベルが、ＡＳＤを有する患者、及びこの状態のマウスモデルで観察される。ＦＸＳマウスモデルをアカンプロセートで処置すると、ＥＲＫ１／２活性化率が変わるという観察は、アカンプロセートが、ＡＳＤにおけるＥＲＫ１／２のレベルを、ＡＳＤを示さない同等の被験者におけるＡＳＤ活性のレベルに戻す助けとなり得ることを主張する。

新規技術が、図及び先の記述により、例示され詳細に説明されたが、これは例示であり、性質として限定的でないと見なされるべきであり、単に、好ましい実施形態が示され、説明されたにすぎないこと、及び新規技術の精神の範囲内に入る全ての変更及び修正は保護されることが要望されていることが理解される。同様に、新規技術は、具体例、理論的論拠、説明、及び例示を用いて示されたが、これらの例示及び付随する議論は、決して本技術を限定すると解釈されるべきではない。本出願において参照された全ての特許、特許出願、及び図書、科学専門書、出版物などへの参照は、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (24)

1. 患者の治療方法であって、
   ＡＳＤ又はＦＸＳと診断された患者からの第１の血漿試料を、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する第１の試薬に接触させるステップ；
   血漿試料におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２のレベルを決定するステップ；
   少なくとも１種の化合物を患者に投与するステップ；
   患者からの第２の血漿試料を、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する第１の試薬に結合させるステップ；
   患者の血漿におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２のレベルに変化があるかどうかを決定するステップ；
   患者の血漿試料で決定したＥＲＫ１又はＥＲＫ２の変化に応じて、患者に投与される化合物の量を調節するステップ
   を含む、方法。
2. ＡＳＤ又はＦＸＳと診断された患者からの前記第１の血漿試料を、ＢＤＮＦに選択的に結合する試薬、ｓＡＰＰに選択的に結合する試薬、及びｓＡＰＰαに結合する試薬からなる群から選択される１種又は複数の試薬に接触させるステップ；
   前記血漿試料におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルを決定するステップ；
   前記患者からの前記第２の血漿試料を、ＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαに選択的に結合する１種又は複数の試薬に結合させるステップ；
   前記患者の血漿におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルの１つ又は複数に変化があるかどうかを決定するステップ；及び
   前記患者の血漿試料で決定したＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαの１つ又は複数のレベルの変化に応じて、前記患者に投与される化合物の量を調節するステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する前記第１の試薬が、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
4. 前記選択される試薬がＢＤＮＦに選択的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
5. 前記選択される試薬がｓＡＰＰに選択的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
6. 前記選択される試薬がｓＡＰＰαに選択的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
7. 投与するステップに応答してＢＤＮＦのレベルを上昇させるステップ；及び
   投与するステップに応答してＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルを下げるステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記化合物がアカンプロセート又は医薬的に許容されるアカンプロセートの塩である、請求項１〜７に記載の方法。
9. アカンプロセートが約５００ｍｇ／日から約１，５００ｍｇ／日の範囲の用量で患者に投与される、請求項８に記載の方法。
10. 患者をモニターするためのシステムであって、
    ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する少なくとも１種の抗体；
    ＢＤＮＦに選択的に結合する少なくとも１種の抗体；
    ｓＡＰＰに選択的に結合する少なくとも１種の抗体；及び
    ｓＡＰＰαに選択的に結合する少なくとも１種の抗体
    を含む、システム。
11. 緩衝液、キレート剤、殺菌剤、殺真菌剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬
    をさらに含む、請求項１０に記載のシステム。
12. 特発性又はＦＸＳ関連ＡＳＤの治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、
    ＡＳＤ又はＦＸＳと診断された患者からの第１の血漿試料を、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する第１の試薬に接触させるステップ；
    血漿試料におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２のレベルを決定するステップ；
    少なくとも１種の化合物を患者に投与するステップ；
    患者からの第２の血漿試料を、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する第１の試薬に結合させるステップ；
    患者の血漿におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２のレベルに変化があるかどうかを決定するステップ；
    その化合物が患者の血漿におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２のレベルに変化を引き起こすかどうかで、化合物を選択するステップ
    を含む、方法。
13. ＡＳＤ又はＦＸＳと診断された患者からの前記第１の血漿試料を、ＢＤＮＦに選択的に結合する試薬、ｓＡＰＰに選択的に結合する試薬、及びｓＡＰＰαに結合する試薬からなる群から選択される１種又は複数の試薬に接触させるステップ；
    前記血漿試料におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルを決定するステップ；
    前記患者からの前記第２の血漿試料を、ＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαに選択的に結合する１種又は複数の試薬に結合させるステップ；
    前記患者の血漿におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルの１つ又は複数に変化があるかどうかを決定するステップ；及び
    その化合物が前記患者の血漿におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルに変化を引き起こすかどうかで、前記化合物を選択するステップ
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する前記第１の試薬が、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２に選択的に結合する抗体である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記選択される試薬がＢＤＮＦに選択的に結合する抗体である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記選択される試薬がｓＡＰＰに選択的に結合する抗体である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記選択される試薬がｓＡＰＰαに選択的に結合する抗体である、請求項１３に記載の方法。
18. 前記化合物によって引き起こされる変化が、ＢＤＮＦのレベルの増加、ｓＡＰＰのレベルの低下、ＥＲＫ１のレベルの低下、ＥＲＫ２のレベルの低下、及びｓＡＰＰαのレベルの低下からなる群から選択される少なくとも１つの変化を含むかどうかを評価する（access）ステップ
    をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
19. 患者に投与される前記化合物の量を変えるステップ
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
20. 患者の治療方法であって、
    アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を患者に投与するステップ；
    前記患者の末梢血液におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２のレベルの変化について前記患者の末梢血液をモニターするステップ；及び
    前記患者の末梢血液におけるＥＲＫ１又はＥＲＫ２の少なくとも１つのレベルが変化するように、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を調節するステップ
    を含む、方法。
21. 患者の末梢血液におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルの少なくとも１つの変化について患者の末梢血液をモニターするステップ；及び
    患者の末梢血液におけるＢＤＮＦ、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαの少なくとも１つのレベルが変化するように、アカンプロセート又は医薬的に許容されるその塩の治療有効量を調節するステップ
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. モニターするステップが、
    患者の末梢血液試料を、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、ｓＡＰＰα、及びＢＤＮＦの少なくとも１種に選択的に結合する少なくとも１種の抗体に接触させること
    を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 調節するステップが、
    患者の末梢血液におけるＢＤＮＦのレベルが上昇し、かつ、患者の末梢血液におけるＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｓＡＰＰ、及びｓＡＰＰαのレベルが低下するように、アカンプロセートの量を増やすステップ
    を含む、請求項２０〜２２に記載の方法。
24. アカンプロセートが約５００ｍｇ／日から約１，５００ｍｇ／日の範囲の用量で患者に投与される、請求項２０〜２３に記載の方法。