JP2016534719A - 人工補因子の合成のためのs−アデノシルメチオニン(sam)シンターゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
野生型バチルス・サブチリスSAMシンターゼの組換え発現
大腸菌における補因子S−アデノシル−L−メチオニン(SAM)の可用性の課題に対処するために、内因性SAM合成の増進を想定した。そのために、バチルス・サブチリス由来のSAMシンターゼ遺伝子をベクターpET28a(+)にクローニングして、大腸菌BL21(DE3)に導入した。精製酵素(図1、レーン1)を高収率(培養物1l当たり59mg)にて得ることができた。タンパク質がメチオニンのD−エナンチオマーにより阻害されないことから(図3A)、このアミノ酸の更に安価なラセミ混合物を基質として使用することができる。
SAMシンターゼ変異体の生成及び特性化
天然の補因子であるSAMの再生に加えて、組換えSAMシンターゼ変異体(図1、レーン2〜レーン7)を、人工アルキル鎖を有する補因子類似体の合成に適用した。
SAMシンターゼ変異体によるSAM誘導体の生成
基質スペクトルが広いことに起因して、変異体I317V及びI317Aを調製規模でのSAM誘導体であるS−アデノシルエチオニン、−プロピオニン、−ブチオニン及び−S−メチルビニルホモシステインの生成に使用した。それらの化合物は0.2mmolのD,L−アミノ酸から合成し、SP−Sephadex C−25上でのカチオン交換クロマトグラフィにより精製した。L型のアミノ酸に関連する収率は8%〜25%の範囲であった。カテコール−O−メチルトランスフェラーゼにより生成されるSAMの酵素変換で試験されるように、調製物は生物活性型の補因子を含んでいた(総SAMの80%〜92%)。
更なるSAMシンターゼ変異体の特性化
触媒回転及び基質スペクトルの決定における重要な役割に対する317位の影響を他のサイズの小さいアミノ酸残基及びサイズが中程度のアミノ酸残基の導入により更に確認した。脂肪族(I317G、I317P、I317L)又は極性(I317E、I317D、I317N)アミノ酸にて置換した酵素は活性の強い低減を示した(5.4nmol 分−1 mg−1以上)。他方、システインによる置換によって相当に活性のある酵素が生じ、該酵素が変異体I317Aと同様にメチオニン及びホモログを変換させた(5mM D,L−メチオニン、−エチオニン、−プロピオニン及び−ブチオニンの変換についてそれぞれ59.4±0.4nmol 分−1 mg−1、16.4±0.7nmol 分−1 mg−1、8.4±0.3nmol 分−1 mg−1及び6.0±0.3nmol 分−1 mg−1)。
二重突然変異型SAMシンターゼ変異体の特性化
基質認識における近接イソロイシン残基I105の役割を更に調べるために、変異体I105V/I317A及びI105A/I317Aを生成した。酵素の活性中心のサイズが大きくなるにつれて、天然基質であるメチオニンの変換(図3D、図3E)が徐々に低減する。その一方で変異体は長鎖基質を選好する。野生型酵素(図3A)と比べて、変異体I105A/I317A(図3E)の基質特異性は逆転している(S−n−プロピルホモシステイン>S−n−ブチルホモシステイン>エチオニン>>メチオニン)。そのため、立体効果はSAMS酵素による基質変換において主要な役割を果たし、いくつかの基質に対する選択性は2つのアミノ酸位置のみの置き換えにより操作することができる。
SAMシンターゼ変異体によるSAM誘導体の合成
野生型タンパク質、並びにSAM及び類似体の合成に適した基質特異性を有する変異体(I317V及びI317A)の適合性を高性能薄層クロマトグラフィにより評価した。酵素がアミノ酸基質のD−エナンチオマーにより阻害されなかったことから、メチオニン及びその誘導体をこれらの反応におけるその立体異性体のラセミ混合物として有益に適用することができた。野生型酵素によるSAM形成の時間経過を図4Aに示す。いくつかの他のSAMSタンパク質について記載されるように、この酵素は生成物であるSAMにより阻害され、それにより変換の停滞及び低収率が起こる。これとは対照的に、この生成物阻害は変異体I317Vでは完全になくなり(図4B)、突然変異型酵素I317Aの場合では顕著に低くなる(図4C)。したがって、調製合成反応におけるSAMS−I317Vによるメチオニン及びエチオニンの転換により、アミノ酸基質についての高い変換率がもたらされた。この合成は速度実験と同様ではあったが、より大規模に行った(200μmol)。生成物収率が最大に達するような長期のインキュベーション(18時間)後、L−アミノ酸の84%及び89%が変換された。変異体I317AによるSAMのn−プロピル−及びn−ブチル類似体の生成において、8時間の反応時間後、43%及び28%の変換を達成することができた。SP−Sephadex C−25上でのカチオン交換クロマトグラフィによる生成物の精製後、SAM及びそのホモログはそれぞれ25%、17%、8%及び11%の最終収率にて回収することができた。1H NMRにより証明されるように、酵素により生成されるSAMは大過剰(90%超)の生物学的に活性のある(S,S)−エピマーを含んでいた。興味深いことに、S−アデノシル−L−エチオニン、−プロピオニン及び−ブチオニンの調製物はキラルスルホニウム中心に対してラセミ体であり、これはカラム精製における強酸性条件下でのより迅速なラセミ化により引き起こされるものと考えられる。
S−アルキルホモシステインの変換についての動態パラメータ
表1に示されるようなバチルス・サブチリスSAMシンターゼ及びその変異体によるS−アルキルホモシステインの変換についての動態パラメータを、基質濃度に応じたメチオニン及び類似体の変換率から算出した(図2)。該変換率は当該技術分野で既知の標準SAMシンターゼアッセイにより、すなわち切断されたホスフェートの分光光度的な検出により求めた。
Claims (13)
- 野生型バチルス・サブチリスS−アデノシルメチオニン(SAM)シンターゼ又はその生物学的に活性のある断片から誘導される単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドは、該野生型バチルス・サブチリスSAMシンターゼ(配列番号1)又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換I317G、I317L、I317P、I317T、I317C、I317D、I317E、I317N、I317A及びI317Vからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
- 前記少なくとも1種のアミノ酸置換がアミノ酸置換I317A及びI317Vからなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- アミノ酸置換I105G、I105L、I105P、I105T、I105C、I105S、I105A及びI105Vからなる群から選択されるアミノ酸置換を更に含む、請求項1又は2に記載の単離ポリペプチド。
- 更なるアミノ酸置換がI105A及びI105Vからなる群から選択される、請求項3に記載の単離ポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離ポリペプチド。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離ポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の単離ポリペプチド。
- 配列番号5又は配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の単離ポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項9に記載の核酸又は請求項10に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 好適なS−アルキルホモシステイン、S−メチルビニルホモシステイン、又は他のホモシステイン誘導体と、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチドとを反応させる工程を含む、S−アデノシルメチオニン(SAM)、及び/又は人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−(CH2)n−OR、−(CH2)n−SR若しくは−(CH2)n−Hal(式中、nは1〜3であり、Rはアルキルであり、Halはハロゲンである)タイプの鎖を有するSAM類似体を生体触媒により生成する方法。
- S−アデノシルメチオニン(SAM)、及び/又は人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−(CH2)n−OR、−(CH2)n−SR若しくは−(CH2)n−Hal(式中、nは1〜3であり、Rはアルキルであり、Halはハロゲンである)タイプの鎖を有するSAM類似体の生成のための請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
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