JP2016531112A - 疎水性白金誘導体のナノエマルジョン - Google Patents
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Abstract
癌患者への疎水性白金化学療法薬の送達のために有用なナノエマルジョン製剤、ならびにその調製法および使用法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、2013年7月25日に出願した米国仮特許出願第61/858,376号の優先権および恩典を主張し、該出願の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本願は、2013年7月25日に出願した米国仮特許出願第61/858,376号の優先権および恩典を主張し、該出願の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明に至った研究の一部はNational Institutes of Health, Grants No. R01CA158881、U54CA151881およびR43CA144591の下で合衆国政府の支援を受けて行われた。したがって、合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明に至った研究の一部はNational Institutes of Health, Grants No. R01CA158881、U54CA151881およびR43CA144591の下で合衆国政府の支援を受けて行われた。したがって、合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本開示は、医学および薬理学、より具体的には癌療法に関する。
本開示は、医学および薬理学、より具体的には癌療法に関する。
背景
化学療法剤は、癌療法において広く使用されている。しかしながら、ほとんどの場合でそのような治療剤が病気を治癒することはない。効果的な療法のための1つの課題は、正常組織に対する薬物毒性から生じる重篤な副作用によってしばしば薬効が損なわれるということである。また、このような治療の失敗は、疾患部位において治療剤の濃度が不十分であるためおよび滞留時間が短いためであり得る。(Jain (2003) Nat. Med. 9(6):685-693(非特許文献1))。加えて、治療剤が非病変組織において蓄積するにつれ標的特異性の欠如が全身毒性の一因となる。
化学療法剤は、癌療法において広く使用されている。しかしながら、ほとんどの場合でそのような治療剤が病気を治癒することはない。効果的な療法のための1つの課題は、正常組織に対する薬物毒性から生じる重篤な副作用によってしばしば薬効が損なわれるということである。また、このような治療の失敗は、疾患部位において治療剤の濃度が不十分であるためおよび滞留時間が短いためであり得る。(Jain (2003) Nat. Med. 9(6):685-693(非特許文献1))。加えて、治療剤が非病変組織において蓄積するにつれ標的特異性の欠如が全身毒性の一因となる。
これらの問題に対処するために多数の送達システムが開発されてきた。例えば、部位特異的結合部分を有するナノデリバリーシステムが、程度の差はあるが首尾よく開発されている。腫瘍への薬物送達を改善するいくつかの送達ビヒクル、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)でコーティングしたリポソーム内にドキソルビシンを含むDoxil(Caelyxとしても知られている)が考案されている。別の例としては、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)(PCL)ナノ粒子がある。(Chawla et al. (2003) AAPS PharmSci. 5(1):28-34(非特許文献2))。当該ポリマーのアルキル構造は疎水性化合物を封入する。ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)(PEO-PPO-PEO)トリブロックコポリマーなどの物質でコロイド担体を表面改質するとナノ粒子の溶解性を改善することができる。しかしながら、正常組織に対する化学療法剤の重篤な副作用が、効果的な癌治療についての課題として依然として残っている。
効果的な癌療法には、腫瘍に対する特定の薬学的作用物質の送達に関する初期データ、ひいては有効性に関する初期データが無いという問題もある。多くの場合に患者は、付随する副作用および生活の質の低下に苦しみながら長期間にわたって一連の治療を続けて、特定の治療は効果がないことを見出すのみである。
薬学的作用物質の疎水性が癌治療向けの療法の範囲を制限している。米国薬局方(http://www.usp.org/)中の薬剤のほぼ3分の1が疎水性でありかつ不溶性または難溶性である。(Savic et al. (2006) J. Drug Target. 14(6):343-55(非特許文献3))。その結果、多くの有望な新規化学物質が難溶性のために開発の初期段階で除外される。
疎水性薬剤を投与するための手法は、共溶媒の使用、錯化剤または可溶化剤の組み込み、薬剤の化学修飾、ニオソーム(niosome)、リポソームなどのミセル送達システムの使用、および経口、非経口、経鼻、直腸または眼送達のための油性ビヒクルにおける薬剤の製剤化が挙げられる。しかしながら、これらの製剤の多くは、有毒な副作用ならびにたびたび安定性、無菌性および量産性の問題も伴う界面活性剤または共溶媒を使用している。
したがって、疾患部位に治療レベルの薬剤をより少ない副作用を伴ってまたは副作用無しで効率的に送達することができる送達システムに対する必要性が存在する。癌治療のために使用することができる治療剤の範囲を拡げる必要性もある。また、患者が特定の治療過程を継続すべきかどうかの迅速な判定を可能にする撮像性能に対する必要性も存在する。
Jain (2003) Nat. Med. 9(6):685-693
Chawla et al. (2003) AAPS PharmSci. 5(1):28-34
Savic et al. (2006) J. Drug Target. 14(6):343-55
概要
特定の白金(Pt(II))錯体を特定の含油ナノエマルジョンに配合すると化学療法薬の効能および効率を高められることが見出された。この知見を利用して、一局面では油相と、界面膜と、水相と、シスプラチンでもカルボプラチンでもない疎水性白金誘導体を含む化学療法剤とを含む製剤であって、該白金化学療法剤が該油相中に分散している製剤である本開示物を開発した。
特定の白金(Pt(II))錯体を特定の含油ナノエマルジョンに配合すると化学療法薬の効能および効率を高められることが見出された。この知見を利用して、一局面では油相と、界面膜と、水相と、シスプラチンでもカルボプラチンでもない疎水性白金誘導体を含む化学療法剤とを含む製剤であって、該白金化学療法剤が該油相中に分散している製剤である本開示物を開発した。
いくつかの態様では、ナノエマルジョン製剤の油相は、亜麻仁油、オメガ3多価不飽和魚油、オメガ6多価不飽和魚油、サフラワー油、オリーブ油、松果油、チェリーカーネル油、大豆油、カボチャ油、ザクロ油、サクラソウ油、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
ある態様では、ナノエマルジョン製剤の界面膜は、乳化剤、安定剤、またはこれらの組み合わせを含む。特定の態様では、ナノエマルジョン製剤の乳化剤相は、卵ホスファチジルコリン、大豆レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン、または水酸化ジミリストイルホスファチジルエチル-N-ジメチルプロピルアンモニウムを含む。いくつかの態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール誘導体、ホスファチド、モノオレイン酸ポリグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ある態様では、ポリエチレングリコール(PEG)誘導体は、PEG2000DSPE、PEG3400DSPE、PEG5000DSPE、またはこれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様では、ポリエチレングリコール誘導体中のポリエチレングリコールは、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または6kD〜20kDの分子量を有する。
いくつかの態様では、油相中に分散した疎水性白金誘導体は、白金(II)モノ脂肪酸錯体を含む。特定の態様では、白金(II)モノ脂肪酸錯体は、白金(II)モノミリスタート(Pt-MMA)、白金(II)モノパルミタート(Pt-MPA)または白金(II)モノステアラート(Pt-MSA)、またはこれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様では、疎水性白金誘導体は、ジアミノシクロヘキサン(DACH)白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)を含む。
いくつかの態様では、ナノエマルジョン製剤は、化学増強剤(chemopotentiator)をさらに含む。特定の態様では、化学増強剤は、セラミド(CER)またはその誘導体を含む。ある態様では、化学増強剤は、C6-セラミドを含む。別の態様では、化学増強剤はC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体はPt-MMAを含む。ある態様では、C6-セラミドおよびPt-MMAは、併用指数(combination index)が0.1〜0.9であるかまたは約0.3326である。いくつかの態様では、化学増強剤はC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体はPt-MPAを含む。ある態様では、C6-セラミドおよびPt-MPAは、併用指数が0.1〜0.9であるかまたは約0.5746である。
いくつかの態様では、ナノエマルジョン製剤は、標的指向性リガンドをさらに含む。ある態様では、標的指向性リガンドは、EGFR標的指向性リガンド、葉酸受容体標的指向性リガンド、またはこれらの組み合わせを含む。特定の態様では、標的指向性リガンドは、アミノ酸ペプチドY-H-W-Y-G-Y-T-P-Q-N-V-I(SEQ ID NO: 1)(ペプチド4)、抗EGFR免疫グロブリンもしくはそのEGFR結合フラグメント、EGa1-PEG、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ある態様では、標的指向性リガンドEGa1-PEG中のPEGは、分子量が1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDである。別の態様では、葉酸受容体標的指向性リガンドは、DSPE-PEG-システイン-葉酸、DSPE-PEG(2000)葉酸、DSPE-PEG(5000)葉酸、抗葉酸受容体免疫グロブリンもしくはその葉酸受容体結合フラグメント、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、ナノエマルジョン製剤は、造影剤をさらに含む。特定の態様では、造影剤は、MRIコントラスト部分である。ある態様では、MRIコントラスト部分は、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金もしくはマンガンまたはこれらの任意の組み合わせを含む。ある態様では、MRIコントラスト部分は、Gd-DTPA-PE、Gd-DOTA-PE、Gd-PAP-DOTA、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
別の局面では、本開示は、患者における癌を撮像する方法を提供する。該方法は、腫瘍を撮像するのに十分な量のナノエマルジョン製剤を該患者に投与することを含む。
さらに別の局面では、本開示は、癌細胞に対して毒性がある、および/または癌細胞の増殖を阻害するかもしくは癌細胞を死滅させる量の本明細書に係るナノエマルジョン製剤に癌細胞を接触させる工程を含む、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる方法を提供する。いくつかの態様では、癌細胞は哺乳動物中にあり、ナノエマルジョンは治療有効量で該哺乳動物に投与される。
本開示の上記および他の目的、その種々の特徴、ならびに本発明自体は、下の記載を添付の図面と共に読めばより十分に理解することができる。
説明
本出願の全体にわたって様々な特許、特許出願、および出版物を参照している。本明細書において記載し特許請求した発明の発明時に当業者に公知であった技術水準をより詳細に記載すべく、これらの特許、特許出願、および出版物の開示内容はその全体が参照により本出願に組み入れられる。これらの特許、特許出願、および出版物と本開示との間に何らかの矛盾がある場合には本開示が優先される。
本出願の全体にわたって様々な特許、特許出願、および出版物を参照している。本明細書において記載し特許請求した発明の発明時に当業者に公知であった技術水準をより詳細に記載すべく、これらの特許、特許出願、および出版物の開示内容はその全体が参照により本出願に組み入れられる。これらの特許、特許出願、および出版物と本開示との間に何らかの矛盾がある場合には本開示が優先される。
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において採用した特定の用語をここにまとめる。特に定義した場合を除いて、本明細書において使用した技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術分野における当業者によって通常解釈されるものと同じ意味を有する。特に示した場合を除いて、本明細書において規定する基または用語の最初の定義が、本明細書の全体にわたって個別にまたは別の基の一部としてその基または用語に適用される。
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において採用した特定の用語をここにまとめる。特に定義した場合を除いて、本明細書において使用した技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術分野における当業者によって通常解釈されるものと同じ意味を有する。特に示した場合を除いて、本明細書において規定する基または用語の最初の定義が、本明細書の全体にわたって個別にまたは別の基の一部としてその基または用語に適用される。
本明細書において用いる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(即ち、少なくとも1つ)を指す。例を挙げると、「元素(an element)」は、1つの元素または複数の元素を意味する。
「または」という用語は、文脈上そうではないことが明らかな場合を除いて、本明細書においては「および/または」という用語を意味するように使用され、また該用語と互換的に使用される。
「約」という用語は、本明細書においては、およそ、〜の領域で、大体、または〜の前後、を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用される場合は、示した数値の上下限を拡げることによりその範囲が変更される。概して、「約」または「およそ」という用語は、本明細書においては表示値の上下20%の幅で数値を変更するように使用される。
「少なくとも1つ」という表現は、本明細書においては1つまたは複数を意味するように使用され、よって個々の成分および混合物/組み合わせを含む。
「抗癌剤」または「化学療法剤」とは、悪性細胞の発生、成長または増殖を防止するかまたは阻害する剤である。
「癌」とは、異常細胞の制御されない増殖である。
「安定したPt含有製剤」とは、Pt含有化合物またはPt含有イオンを含有する製剤であって、該化合物またはイオンが治療的に有用となるのに十分な時間にわたり構造変化に対して安定した製剤である。
「安定剤」とは、Pt含有製剤中のPt含有化合物またはPt含有イオンの構造変化または不活性化を防止するかまたは遅延させる剤である。
「患者」とは、癌に対する治療が必要なヒトまたは動物である。
「DACH」シクロヘキサン-1,2-ジアミン
「Capryl」カプリル酸残基(OCOC7H15)
「Cap」カプリン酸残基(OCOC9H19)
「Lau」ラウリン酸残基(OCOC11H23)
「Myr」ミリスチン酸残基(OCOC13H27)
「Pal」パルミチン酸残基(OCOC15H31)
「Ste」ステアリン酸残基(OCOC17H35)
「Stol」ミリストレイン酸残基(OCOC13H25)
「Tol」パルミトレイン酸残基(OCOC15H29)
「Sap」サピエン酸残基(OCOC15H29)
「Oleic」オレイン酸残基(OCOC17H33)
「Ela」エライジン酸残基(OCOC17H33)
「Vac」バクセン酸残基(OCOC17H33)
「CDDP」シス-ジクロロジアンミンPt(II)
「DACHP」ジクロロシクロヘキサン-1,2-ジアミンPt(II)
「有機置換基」とは、水素と置換した炭素原子または炭素含有分子として定義される。
「二価有機基」とは、他の原子または分子と結合を2個形成することができる炭素原子または炭素含有分子として定義される。
双極性または付与性の共有結合としても知られる「配位結合」とは、2個の電子が同一の原子に由来する二中心二電子共有結合の1種である。
「併用指数」とは、細胞に対する併用剤の効果を検討するため、および薬剤の組み合わせが細胞に対して相加、相乗、または拮抗効果の形で有効性の向上をもたらしたかどうかを判断するためのアイソボログラム方程式として定義される。
本明細書において用いる「Pt化合物」または「Pt(II)錯体」は、抗癌Pt活性を有する塩を含むPt誘導体を包含する。1つの非限定的なPt化合物はシスプラチンである。
本明細書において用いる「安定剤」とは、Pt含有ナノエマルジョン製剤中のPt含有化合物またはPt含有イオンの構造変化または不活性化を防止するかまたは遅延させる薬剤を意味する。
本明細書において用いる「患者」とは、癌に対する治療が必要なヒトまたは動物を意味する。
本明細書において用いる「ナノエマルジョン製剤」とは、油相と、界面膜と、水相と、該油相中に分散したPt化合物とを含む新規なナノエマルジョン(NE)を意味する。
本明細書において用いる「ナノエマルジョン」とは、水相中のオメガ3、オメガ6またはオメガ9脂肪酸に富む油から構成され、かつ界面膜を構成する両親媒性界面活性剤によって熱力学的に安定化された、大抵は約80〜220nmの範囲内の液滴径を有する高せん断微流動化プロセスを用いて製造されたコロイド分散液を意味する。
本明細書において用いる「油相」または「脂質相」とは、Pt化合物が分散したナノエマルジョンの内部疎水性コアを意味し、コア内に存在する単一の純粋な油または異なる油の混合物のいずれかを指す。油相は、オメガ3、オメガ6またはオメガ9多価不飽和脂肪酸(PUFA)または一価不飽和脂肪酸に富む油から一般的に選択される、安全な等級であり非経口的に注射可能であると一般的にみなされる賦形剤から構成される。
「水相」は、注射用滅菌水中の等張性調節剤およびpH調整剤から構成され、油相が分散したナノエマルジョン製剤の外相を形成する。
本明細書において用いる「両親媒性分子または両親媒性化合物」とは、少なくとも1つの疎水性部分および少なくとも1つの親水性部分を含む双極性構造の任意の分子を意味する。疎水性部分は油相に分布し親水性部分は水相に分布して界面膜を形成し、水の表面張力を低減し(g<55 mN/m)かつ水と油相との間の界面張力を低減する特性を有する。両親媒性分子の同義語には、例えば、界面活性剤、表面活性剤および乳化剤がある。
本明細書において用いる「両親媒性剤(amphiphilic)または両親媒性物質」とは、極性の親水性部分および無極性の疎水性部分の両方を有する分子を意味する。
本明細書において用いる「主乳化剤」とは、ナノエマルジョン製剤の両親媒性界面活性剤の大部分の割合を構成する両親媒性界面活性剤を意味し、該両親媒性界面活性剤は、水中に分散した油滴のまわりに界面膜を形成することによって製剤を安定化し、かつ標的指向性リガンドおよび造影剤による表面改質をさらに可能にする。
本明細書において用いる「共乳化剤」とは、主乳化剤と共に使用する両親媒性界面活性剤を意味し、該両親媒性界面活性剤は、界面膜と会合して、油と水の間の界面張力を効果的に低下し、かつ安定したナノエマルジョン製剤の形成を補助する。
本明細書において用いる「安定剤」または「ステルス剤」とは、脂質化ポリエチレングリコール(PEG)を意味し、脂質尾部基がナノエマルジョン製剤の油相に分布し親水性PEG鎖が水相に分布して、血液が循環する間に単核食細胞系(MPS)の細胞取り込みに対して立体障害をもたらし、よって血液中でより長い滞留時間をもたらし、かつ種々の固形腫瘍に広く存在する血管透過性・滞留性亢進効果と呼ばれる現象である漏出性の腫瘍血管系を通じた腫瘍部位における蓄積の向上を可能にする。他の代表例は、ホスファチドおよびモノオレイン酸ポリグリセロールである。
本明細書において用いる「標的指向性剤」とは、ナノエマルジョン粒子を腫瘍細胞へ向けてまたはその近辺に誘導する分子である。このような標的指向性剤はインビボで腫瘍細胞との相互作用を可能にして、該腫瘍細胞によって取り込まれるリガンド-受容体複合体を形成する。
本明細書において用いる「造影剤」は、核磁気共鳴画像法(MRI)を用いて疾患部位を視覚化するコントラストをもたらす金属イオン(例えば、ガドリニウム、鉄およびマンガン)および疾患部位にて蛍光をもたらす近赤外線蛍光色素(例えば、DiR)を包含する。これらの剤は、脂質化キレート薬(例えば、DTPA-PEおよびDOTA-PE)に結合しかつナノエマルジョン製剤の界面膜においてナノエマルジョン製剤に組み込まれるか、または本開示に係るナノエマルジョン製剤の油性コアの内部に入れられる。
本明細書において用いる「等張性調節剤」とは、ナノエマルジョン製剤に重量オスモル濃度(285〜310 mOsm/kg)をもたらし、よって非経口注射のための等張性を維持する剤を意味する。
本明細書において用いる「pH調節剤」とは、ナノエマルジョン製剤のpHを約pH6〜7.4の値に調整し、よって保存時のリン脂質の加水分解を防止する緩衝剤を意味する。
本明細書において用いる「防腐剤」とは、約0.001〜005% w/vでナノエマルジョン製剤に加えられた場合に、ナノエマルジョン製剤の保存中の細菌増殖を防止する抗生剤を意味する。
本明細書において用いる「酸化防止剤」とは、脂肪酸から構成される油の酸化を阻止し、よって油相の酸敗およびナノエマルジョン製剤の不安定化を防止する剤を意味する。
本明細書において用いる「化学増強剤」とは、他の薬剤または化学療法剤と組み合わせて使用されて、該薬剤または化学療法剤の効果を向上するか、増加させるかまたは強める、一例を挙げるとIC50を低下させる、薬剤または化学療法剤を意味する。
1.ナノエマルジョン製剤
本開示は、癌治療ならびに腫瘍および癌細胞の撮像に有用である新規なナノエマルジョン製剤を提供する。この製剤は、油相と、界面膜と、水相と、シスプラチンでもカルボプラチンでもない疎水性白金誘導体を含む化学療法剤とを含み、該白金化学療法剤が該油相中に分散している。
本開示は、癌治療ならびに腫瘍および癌細胞の撮像に有用である新規なナノエマルジョン製剤を提供する。この製剤は、油相と、界面膜と、水相と、シスプラチンでもカルボプラチンでもない疎水性白金誘導体を含む化学療法剤とを含み、該白金化学療法剤が該油相中に分散している。
図1は本開示のナノエマルジョン製剤の非限定的な概略図である。この図において、4はナノエマルジョン製剤の油相5中に分散した疎水性白金誘導体を含む化学療法剤を表す。5は乳化剤8および安定剤3を含む界面膜7の内側に封入されている。界面膜の両親媒性物質の極性親水部分は水相9へ突出し、両親媒性物質の非極性疎水部分は油相5へ突出する。1は界面膜中の安定剤3に連結した標的指向性リガンドを表し、2は界面膜7中の乳化剤8に付加した造影剤を表し、6はナノエマルジョン製剤の油相5中に分散した化学増強剤を表す。
本開示のナノエマルジョン製剤は、共乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、pH調整剤、等張性調節剤、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
本開示のナノエマルジョン製剤の成分の様々な非限定的な例およびそれらの対応する割合を表Iに示しかつ下記で検討する。
A.化学療法剤
本開示に係る新規な医薬製剤は特定の白金(II)錯体を含む。1つの代表的な白金(II)錯体は、例えば、改善した親油性および安定性を有し、そのため本開示のナノエマルジョン製剤において治療的投与に有効である、脂溶性白金(II)モノ脂肪酸錯体である。他の有用な剤は、白金を含有する疎水性プロドラッグ、Ptポリマーコンジュゲート、および表面に標的指向性リガンドを有しかつ制御放出用に設計できる封入Pt(II)錯体ナノ担体製剤などの系を含む。本開示は、白金誘導体であるシスプラチンおよびカルボプラチンを除外する。
本開示に係る新規な医薬製剤は特定の白金(II)錯体を含む。1つの代表的な白金(II)錯体は、例えば、改善した親油性および安定性を有し、そのため本開示のナノエマルジョン製剤において治療的投与に有効である、脂溶性白金(II)モノ脂肪酸錯体である。他の有用な剤は、白金を含有する疎水性プロドラッグ、Ptポリマーコンジュゲート、および表面に標的指向性リガンドを有しかつ制御放出用に設計できる封入Pt(II)錯体ナノ担体製剤などの系を含む。本開示は、白金誘導体であるシスプラチンおよびカルボプラチンを除外する。
Pt(II)錯体は概して下記一般式(I):
を有し、式中、R1およびR2は、それぞれ、任意で有機置換基Aを有してもよいアンミン(NH3)であり(A-NH2)
R1およびR2は同一であってもまたは異なっていてもよく、配位結合を介して白金に結合しており、任意で二価の有機基Bを介して互いに結合していてもよい(NH2-B-NH2)。
を有し、式中、R1およびR2は、それぞれ、任意で有機置換基Aを有してもよいアンミン(NH3)であり(A-NH2)
R1およびR2は同一であってもまたは異なっていてもよく、配位結合を介して白金に結合しており、任意で二価の有機基Bを介して互いに結合していてもよい(NH2-B-NH2)。
一般式(I)における置換基R3は、炭素原子を8〜24個有する飽和または不飽和高級脂肪酸であってもよい。その非限定的な例は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸などの飽和脂肪酸、ならびにミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、およびバクセン酸などの炭素原子を8〜24個有する不飽和高級脂肪酸である。一般式(I)におけるR3およびClに換わる置換基は3,5-ジヨードサリチル酸であってもよい。
したがって、錯体の考えられる非限定的な構造的バリエーションは、有機置換基も、存在してもしなくてもよい二価の有機基も有さない錯体;R1に付加した有機置換基と存在してもしなくてもよい二価の有機基とを有する錯体;R2に付加した有機置換基と存在してもしなくてもよい二価の有機基とを有する錯体;ならびにR1およびR2の両方に付加した有機置換基と存在してもしなくてもよい二価の有機基とを有する錯体を含む。
錯体の非限定的な例は、有機置換基(A)が、イソプロピル基などの炭素原子を1〜5個有するアルキル基およびシクロヘキシル基などの炭素原子を3〜7個有するシクロアルキル基を含む群より選択される1種であるものを含む。
錯体の非限定的な例は、二価の有機基(B)が、シクロアルキレン基;炭素原子を1〜5個有するアルキル基で、炭素原子を2〜6個有するアルキレン基で、またはフェニル基で最終的に置換された、炭素原子を2個または3個有するアルキレン基;および炭素原子を1〜5個有するアルキルもしくはアルコキシルまたはハロゲン原子で最終的に置換された1,2-フェニレン基、を含む群より選択される1種であるものを含む。二価の有機基の他の非限定的な例は、1,2-シクロヘキシレン、2,2-ペンタメチレン-トリメチレン:
1,1-ペンタメチレン(エチレン):
1,2-テトラメチレン(トリメチレン):
1,2-ジフェニルエチレン、および1,2-フェニレンなどの基を含む。
1,1-ペンタメチレン(エチレン):
1,2-テトラメチレン(トリメチレン):
1,2-ジフェニルエチレン、および1,2-フェニレンなどの基を含む。
脂溶性Pt(II)錯体において、二価の有機基が1,2-シクロヘキシレンまたは他のそのような同様の基である場合には異体性、即ち、シス型およびトランス型が存在する。この点で、錯体はシスまたはトランスまたはこれらの混合物の形態であってもよい。
一般式(I)によって表される本開示の脂溶性Pt(II)錯体の調製の非限定的な例は図2に示してあり、例えば、下記実施例1〜4に記載のように様々な中間体および構成成分を用いて調製してもよい。この水性反応方法によれば、シス-ジクロロ-ジアンミンPt(II)錯体(A)(Connors et al. (1972) Chem. Biol. Interact. 5:415)は適切な試薬と1:1のモル比で処理されることにより一水和物または二水和物錯体中間体にまず変換され、次いで、得られた中間体(B)である一水和物または二水和物を飽和または不飽和高級脂肪酸の所望のアルカリ金属塩と1:1のモル比で反応させて、ジアンミン白金(II)の飽和または不飽和高級脂肪酸誘導体(I)が形成される。この反応の結果、モノおよびジ脂肪酸誘導体の両方が形成される。次いで、シスプラチンモノ脂肪酸は、モノ脂肪酸は可溶であるがジ脂肪酸誘導体は不溶であるクロロホルムに混合物を溶解させることにより分離される。反応の第一工程は、反応媒体に不溶であるハロゲン化物を形成すると考えられる硝酸銀(AgNO3)などの任意の適切な試薬を用いて行ってもよく、飽和または不飽和高級脂肪酸の塩に使用されるアルカリ金属は、非限定的にはナトリウムまたはカリウムであってもよい。
錯体(A)が白金(II)錯体の一水和物または二水和物中間体(B)に変換される反応は遮光条件下で行われ、反応はRTでおよそ3週間で起こる。反応媒体における溶解を促進するために、錯体(A)は第二試薬の添加に先立ちおよそ70℃まで加熱される。
反応(B)〜(I)も遮光条件下で行われ、完了するのにRTでおよそ3週間かかる。
このようにして得られたPt(II)錯体は脂溶性であり、よって癌細胞に対して特異性および選択性が高い抗癌剤としての使用に利用可能である。さらに、その脂溶性により、低速および定常的放出性ならびに持続性の薬物として有用となる。インビボにおいてさらに特異的に癌を標的とするために、錯体をエマルジョン、ナノエマルジョンまたはリポソームなどの担体と組み合わせてもよい。Pt(II)錯体は、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、および前立腺癌を含む広範な公知の癌に対して有効である。本開示のナノエマルジョン製剤における疎水性Pt(II)錯体の封入が、しばしばその使用に付随することが公知の望ましくない副作用を軽減することに役立つことが見出されている。
表IIおよび表IIIは、モノ脂肪酸白金錯体と比べたジ脂肪酸白金錯体の溶解性を示す。
示したように、本開示のPt(II)錯体の脂溶性は、特定の化合物に関しては有意に改善した親油性を有したことから、Pt(II)ジ脂肪酸錯体のそれと比較して改善されている。よって、Ptの封入がこれまで利用可能ではなかった、癌治療用脂質エマルジョン、ナノエマルジョン、リポソームまたは他の適切な安定したナノ担体の特定の製剤におけるPtの封入が可能になる。Pt(II)ジ脂肪酸錯体の溶解性は表IIに見ることができ、本開示のPt(II)錯体の特定の態様の溶解性は表IIIに見ることができる(表中、「+」は可溶であることを示し、「-」は不溶であることを示す)。
シスプラチンジ脂肪酸誘導体は、表IIに示すように親油性が低いことが分かった。相分離および薬剤の沈殿形成によって証明されたように、これらの化合物で作製した製剤は保存中に不安定化した。これらの化合物の親油性の低さは、過度な疎水性の原因となるジ脂肪酸構造の存在による。
対照的に、表IIIに見られるように、本開示のモノ脂肪酸構造を有するPt誘導体は良好な親油性を与えた。よってこれは、該Pt誘導体を、更なるタイプの脂質エマルジョン、ナノエマルジョン、リポソームまたは他の適切な安定したナノ担体内での投与に適したものにする。
これらの具体的な態様では、中心のPt原子は、R1位の1つのアンモニア基(NH3)と、R2位の1つのアンモニア基(NH3)と、図示した1つの塩素原子(Cl)と、R3位の1つのミリスチン脂肪酸鎖(CH3(CH2)12COOH)、1つのパルミチン脂肪酸鎖(CH3(CH2)14COOH)もしくは1つのステアリン脂肪酸鎖(CH3(CH2)16COOH)、またはClおよびR3と置き換わった1つのサリチル酸C6H4(OH)(I2)COOHとに結合し、よってPt(II)のモノ脂肪酸錯体またはモノサリチル酸錯体が作製される。図3〜図4に示すラマンスペクトルは、1個のPt-塩素結合および2個のPt-窒素結合の存在を裏付けている。ラマンスペクトルのピークAはPt-塩素結合に対応し、ピークBは2個のPt-窒素結合に対応する。図5〜図8におけるNMRスペクトルは、R3位におけるミリスチン脂肪酸鎖、パルミチン脂肪酸鎖、ステアリン脂肪酸鎖およびサリチル酸部分の構造をそれぞれ裏付けている。図5において、NMRスペクトルのピークAは、Pt-MMAのミリスチン酸鎖のCH2基に対応し、ピークBもCH2基に対応し、ピークCは(CH2)10基に対応し、ピークDはCH3基に対応する。図6において、NMRスペクトルのピークAは、Pt-MPAのパルミチン酸鎖のCH2基に対応し、ピークBもCH2基に対応し、ピークCは(CH2)10基に対応し、ピークDはCH3基に対応する。図7において、NMRスペクトルのピークAは、Pt-MSAのステアリン酸鎖のCH2基に対応し、ピークBもCH2基に対応し、ピークCは(CH2)10基に対応し、ピークDはCH3基に対応する。図8において、NMRスペクトルのピークAは、Pt-SAの3,5-ジヨードサリチル酸の芳香環のプロトンに対応し、ピークBおよびCは、シクロヘキシル環のCHプロトンに対応し、ピークD、EおよびFはCH2プロトンに対応する。
本開示のナノエマルジョン製剤は化学増強剤を含んでもよく、アポトーシス(プログラム細胞死)と化学療法剤が癌細胞を死滅させる能力とを向上するセラミド(CER)またはCER誘導体をさらに含む。C-6 CERの構造は次のとおりである。
CERレベルの調節には、いずれもCER、グルコシルセラミド、スフィンゴシン、およびスフィンゴミエリンの生成の原因であるCERシンターゼ、グルコシルセラミドシンターゼ(GCS)、ベータ-グルコシダーゼ、セラミダーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ、およびスフィンゴミエリナーゼを含む多くの酵素が関与している。GCSは、CERクリアランスのための主要経路をもたらす1つの酵素である。スフィンゴ糖脂質の合成における第一工程を触媒する酵素として、GCSはUDP-グルコースをCERに転移してグルコシルセラミドを形成する。
GCSの過剰発現は、多くの癌型におけるアポトーシスの割合の低下と関連している。CERの内部添加は化学療法のアポトーシス能を有意に向上し、よって有効性が改善する。(Shabbits et al. (2003) Biochim..Biophys. Acta, 1612:98-106.)。CERの補充が、Akt生存促進経路の阻害、ミトコンドリア機能障害、およびカスパーゼ活性の刺激を介してアポトーシスの誘発を誘導し、最終的にDNAの断片化に至る。
CERの化学増強剤としての特長とは化学療法剤の有効性を向上させることと見受けられるが、CERの送達には障害がある。まず、CERの効力は、水溶液中で投与された場合にはその疎水性および析出の可能性のために限定的である。加えて、第二の脂肪鎖の存在により細胞透過性が妨害される。また、遊離CERは、体循環における特定の酵素による代謝的不活性化の影響を受けやすい。したがって、これらの障害を回避する対策が有用である。この点で、本ナノエマルジョン製剤は、向上した可溶性、細胞透過性、および全身的な酵素分解からの保護をもたらすことによってCERの化学増強剤としての特長を活用するものである。
B.油相
本開示に係るナノエマルジョン製剤の1つの成分は、内部の疎水性または油性コアを表す、個々の油滴を含む油相または脂質相である。油相は単一物または混合物であってもよい。油相における油滴の平均的なサイズは約5nm〜500nmの範囲にわたる。
本開示に係るナノエマルジョン製剤の1つの成分は、内部の疎水性または油性コアを表す、個々の油滴を含む油相または脂質相である。油相は単一物または混合物であってもよい。油相における油滴の平均的なサイズは約5nm〜500nmの範囲にわたる。
種々の油およびそれらからナノエマルジョン製剤を形成する方法が薬物送達の技術分野において公知である。開示したナノエマルジョン製剤の油相は、少なくとも1つのPUFAに富む油、例えば、リノレン酸などの多価不飽和油を含有してもよい第1の油と、任意で、イコサン酸などの例えば飽和脂肪酸であってもよい油とを含んでもよい。
本発明にしたがって任意の油を使用することができる。油は天然または非天然(合成)の油でありうる。油は均質であるかあるいは、一価不飽和脂肪酸またはPUFAに富む油を2つまたは複数含む油でありうる。企図される油は、生体適合性および/または生分解性であってもよい。
生体適合性の油は、生体に挿入または注射した場合、有害な反応(非限定的には、著しい炎症および/または急性拒絶を伴う免疫反応など)を通常は誘導しない。したがって、本明細書において企図される治療用ナノエマルジョン製剤は非免疫原性でありうる。
生体適合性とは、免疫系の少なくとも一部による、物質の急性拒絶が無いことを通常は指す。対象に埋め込んだ非生体適合性物質は、適正に制御することができない免疫系による物質の拒絶を引き起こすほどに重篤となりえ、かつ多くの場合には該対象から物質を除去しなければならないほどの免疫反応を誘発する。
生体適合性を判断する1つの簡便なテストは、インビトロで細胞をナノエマルジョン製剤に曝露することである。ナノエマルジョン製剤における生体適合性の油は、典型的には、適度な濃度、例えば50μg/106細胞では有意な細胞死をもたらすことはない。例えば、この生体適合性の油を線維芽細胞または上皮細胞に曝露または取り込んだ場合、引き起こされる細胞死は約20%未満でありうる。本開示のナノエマルジョン製剤において有用な生体適合性の油の非限定的な例は、アルファリノレン酸、ピノレン酸、ガンマリノレン酸、リノール酸、オレイン酸、エイコセン酸(icosenoic acid)、パルミチン酸、ステアリン酸、イコサン酸、およびこれらの誘導体を含む。
生体適合性の油は生分解性、即ち、体内などの生理環境内で化学的および/または生物学的に分解可能であってもよい。本明細書において用いられるように、「生分解性」の油とは、細胞へ導入された場合に、細胞機構により(生物学的分解性)かつ/または加水分解など化学的プロセスにより(化学的分解性)、細胞に対して著しい毒性効果を伴わずに細胞が再利用するかまたは排除することができる成分まで分解されるものである。生分解性の油およびその分解産物はいずれも生体適合性でありうる。
有用な油は、アルファリノレン酸、リノール酸、およびオレイン酸の生体適合性および生分解性の油である亜麻仁油である。この油の有用な形態は、アルファリノレン酸:リノール酸:オレイン酸の比によって特徴づけることができる。亜麻仁油の分解速度は、アルファリノレン酸:リノール酸:オレイン酸の比を変更する、例えば、約65:5:30、約65:20:15、約55:15:30、または約55:20:25のモル比を有することにより調節することができる。
ナノエマルジョン製剤は、生体適合性および/または生分解性である飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、またはPUFAに富む油の油相を含む。
本開示に係るナノエマルジョン製剤の油相としての使用に適した油組成物は、植物源または動物源などの一価飽和または多価不飽和脂肪酸に富む任意の供給源からのものでありうる。化学的にもしくは酵素的に誘導体化されたかまたは完全に合成された一価不飽和または多価不飽和脂肪酸が、本開示のナノエマルジョン製剤の油相に適した成分の範囲内に含まれる。油相中の一価不飽和または多価不飽和脂肪酸の濃度は、約2%〜約100%(w/w)、約5%〜約100%(w/w)、または10%を超える約20%〜約80%(w/w)の範囲でありうる。ナノエマルジョン製剤中の油相の濃度は、約5%〜約40%(w/w)または約5%〜約30%(w/w)で変更してもよい。油相に可溶な疎水性化学療法剤の濃度は、約0.01%〜約90%(w/w)、約0.1%〜約45%(w/w)、または0.5%を超える、または約1%〜約30%(w/w)の範囲でありうる。例えば、油は、一価飽和または多価不飽和脂肪酸を高濃度で含有してもよく、例えばオメガ3、オメガ6またはオメガ9ファミリーの一価不飽和または多価不飽和脂肪酸の少なくとも1つを10%(w/w)以上の濃度で含有してもよい。有用な油は、Pt(II)錯体を含む高濃度の疎水性化学療法剤を溶解できるものである。例えば、有用な油はリノレン酸またはリノール酸を高濃度で含有するもの、例えば、亜麻仁油、クロフサスグリ油、松果油またはルリヂサ油、および真菌油、例えばスピルリナなどの単独のまたは組み合わせた油である。
C.水相
本開示に係るナノエマルジョン製剤の水相は、精製水および/または超純水である。この水相は、グリセリン、低分子量ポリエチレングリコール(PEG)、ソルビトール、キシリトール、またはデキストロースなどの等張性調節剤も非限定的に含有しうる。水相は、非限定的には水酸化ナトリウム、塩酸、遊離脂肪酸(オレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、パルミチン酸)ならびにこれらのナトリウム塩およびカリウム塩などのpH調整剤、非限定的にはメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどの防腐作用のあるパラベン;非限定的にはアスコルビン酸、α-トコフェロール、および/またはブチルヒドロキシアニソールなどの酸化防止剤を代替的にあるいはさらに含有しうる。本ナノエマルジョン製剤中の水相の濃度は、30%〜90%(w/w)で変更しうる。
本開示に係るナノエマルジョン製剤の水相は、精製水および/または超純水である。この水相は、グリセリン、低分子量ポリエチレングリコール(PEG)、ソルビトール、キシリトール、またはデキストロースなどの等張性調節剤も非限定的に含有しうる。水相は、非限定的には水酸化ナトリウム、塩酸、遊離脂肪酸(オレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、パルミチン酸)ならびにこれらのナトリウム塩およびカリウム塩などのpH調整剤、非限定的にはメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどの防腐作用のあるパラベン;非限定的にはアスコルビン酸、α-トコフェロール、および/またはブチルヒドロキシアニソールなどの酸化防止剤を代替的にあるいはさらに含有しうる。本ナノエマルジョン製剤中の水相の濃度は、30%〜90%(w/w)で変更しうる。
D.界面膜
本明細書において用いる「界面膜」という用語は、油相と水相との界面に適用され、単一の純粋な乳化剤または異なる乳化剤の混合物および/もしくは乳化剤とナノエマルジョン製剤の界面膜中に存在するステルス剤などの他の成分との混合物を指しうる。界面膜またはコロナは、中性、カチオン性および/またはアニオン性の側鎖を備えた分解性の脂質または乳化剤を含みうる。本明細書に記載のナノエマルジョン製剤上の界面膜コロナの平均表面積は、30,000nm2〜600,000nm2の範囲であってもよい。
本明細書において用いる「界面膜」という用語は、油相と水相との界面に適用され、単一の純粋な乳化剤または異なる乳化剤の混合物および/もしくは乳化剤とナノエマルジョン製剤の界面膜中に存在するステルス剤などの他の成分との混合物を指しうる。界面膜またはコロナは、中性、カチオン性および/またはアニオン性の側鎖を備えた分解性の脂質または乳化剤を含みうる。本明細書に記載のナノエマルジョン製剤上の界面膜コロナの平均表面積は、30,000nm2〜600,000nm2の範囲であってもよい。
界面は、乳化剤および/または安定剤(ステルス剤)を含んでもよい。
(1)乳化剤
乳化剤は、疎水性または油性のコアと水相との間の界面の一部を形成する。
乳化剤は、疎水性または油性のコアと水相との間の界面の一部を形成する。
乳化剤は、個別の両親媒性脂質および/または両親媒性ポリマーを含む。少なくとも1つの乳化剤が油相と水相との間の界面に存在する。乳化剤は、非イオン性およびイオン性の両親媒性分子などの両親媒性分子でありうる。例えば、乳化剤は、非限定的には大豆レシチン、卵レシチン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびカルジオリピンを含む天然リン脂質;ジミリストイルホスファチジルコリン、水酸化ジミリストイルホスファチジルエチル-N-ジメチルプロピルアンモニウム、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールおよびジパルミトイルホスファチジルコリンを含む合成リン脂質などの中性であるか、正電荷を持つか、または負電荷を持つ天然または合成リン脂質分子からなりえ;例えば天然源からの、水素化したかまたは部分的に水素化したレシチンおよびリン脂質などが使用される。ナノエマルジョン製剤中の両親媒性脂質の濃度は、約0.5%〜約15%(w/v)または約1%〜約10%(w/v)で変更しうる。
本開示のナノエマルジョン製剤の1つの非限定的な例は、油と、該油を取り囲むかまたはその内部に分散しかつ連続または不連続の単分子層を形成する界面膜の両親媒性化合物とを含む。界面膜は油相と水相との間の界面張力を下げ、これによって取り囲む水相中の分散した油滴の安定性が向上する。さらに、ナノエマルジョン製剤の界面膜は薬剤を局在化させ、これによって、所定の適正な時点で疎水性Pt錯体などの封入した化学療法薬を放出することによる治療上の利点をもたらす。
両親媒性化合物は、長い疎水性の尾部に付加した極性の頭部を有してもよい。極性部分は水に可溶である一方で、非極性部分は水に不溶である。また、極性部分は、形式上の正荷電または形式上の負電荷のいずれかを有してもよい。あるいは、極性部分は、形式上の正電荷および負電荷の両方を有してもよく、両性イオンまたは内塩であってもよい。例示的な両親媒性化合物は、例えば、次の1つまたは複数を含む:親水性および疎水性の両方の部分を有する天然由来の脂質、界面活性剤、または合成化合物。
代表的な乳化剤を構成する両親媒性化合物の具体例は、約0.5%〜約2.5%(脂質重量/油重量)、約1.0%〜約1.5%(脂質重量/油重量)の比で組み込まれた、1,2ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(DAPC)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(DBPC)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(DTPC)、およびジリグノセロイルホスファチジルコリン(DLPC)などのリン脂質を含む。使用してもよいリン脂質は、ホスファチジン酸、飽和および不飽和両方の脂質を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リソホスファチジル誘導体、カルジオリピン、およびβ-アシル-y-アルキルリン脂質を非限定的に含む。リン脂質の例は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(DAPC)、ジべヘノイルホスファチジルコリン(DBPC)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(DTPC)、ジリグノセロイルホスファチジルコリン(DLPC)などのホスファチジルコリン;ならびにジオレオイルホスファチジルエタノールアミンまたは1-ヘキサデシル-2-パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミンを非限定的に含む。非対称アシル鎖(例えば、炭素が6個のアシル鎖を1つおよび炭素が12個の別のアシル鎖を有する)を有する合成リン脂質を使用してもよい。
界面膜の両親媒性化合物は、レシチンまたはホスファチジルコリンを含んでもよい。
(2)安定剤
安定剤またはステルス剤は、界面膜の一部であってもよいしそうでなくてもよい。この膜の一部であれば、本開示のナノエマルジョン製剤を調製する場合に乳化剤と共に加えることができる。安定剤は両親媒性分子であってもよい。
安定剤またはステルス剤は、界面膜の一部であってもよいしそうでなくてもよい。この膜の一部であれば、本開示のナノエマルジョン製剤を調製する場合に乳化剤と共に加えることができる。安定剤は両親媒性分子であってもよい。
1つの代表的な安定剤はPEG化脂質である。いくつかの有用なリン脂質分子は、「PEG化」脂質または脂質化PEGと呼ぶこともできる、ポリエチレングリコール(PEG)繰り返し単位を含む天然のリン脂質である。このようなPEG化脂質は、ポリ(エチレングリコール)基、PEG化大豆レシチン、PEG化卵レシチン、PEG化ホスファチジルグリセロール、PEG化ホスファチジルイノシトール、PEG化ホスファチジルエタノールアミン、PEG化ホスファチジン酸、PEG化スフィンゴミエリン、PEG化ジホスファチジルグリセロール、PEG化ホスファチジルセリン、PEG化ホスファチジルコリンおよびPEG化カルジオリピン;PEG化ジミリストイルホスファチジルコリン、PEG化ジミリストイルホスファチジルグリセロール、PEG化ジステアロイルホスファチジルグリセロールおよびPEG化ジパルミトイルホスファチジルコリンを含む合成リン脂質;ならびに水素化または部分的に水素化されたPEG化レシチンおよびPEG化リン脂質の存在により、炎症および/もしくは免疫原性(即ち免疫反応を誘発する能力)を制御できかつ/または細網内皮系(RES)および/もしくは単核食細胞系(MPS)を介した循環系からのクリアランス速度を低下できる。このような両親媒性PEG化脂質は単独でまたは組み合わせて使用できる。ナノエマルジョン中の両親媒性PEG化脂質の濃度は、約0.01%〜15%(w/v)または約0.05%〜10%(w/v)で変更しうる。
PEG化脂質の一部となりうる例示的な脂質は、長鎖(例えばC8〜C50)炭化水素、置換炭化水素、または非置換炭化水素などの脂肪酸を非限定的に含む。脂肪酸基は、C10〜C20脂肪酸もしくはその塩、C15〜C20脂肪酸もしくはその塩でありうる、または脂肪酸は、不飽和、一価不飽和、または多価不飽和でありうる。例えば、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファ-リノレン酸、ガンマ-リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはエルカ酸のうちの1つまたは複数でありうる。
他の例示的な安定剤は、ホスファチド、モノオレイン酸ポリグリセロール、PEG2000DSPE、PEG3400DSPE、PEG5000DSPE、またはこれらの任意の組み合わせである。有用な安定剤は、PEG誘導体、ホスファチド、および/またはモノオレイン酸ポリグリセロールであり、有用な非限定的PEG誘導体は、PEG2000DSPE、PEG3400DSPE、PEG5000DSPEである。
PEG化密度は、血液中での長期間の循環を促進する必要に応じて変更してもよい(Perry et al. (2012) Nano. Lett. 12:5304-5310)。いくつかの場合では、PEG繰り返し単位を加えると、細胞によるトランスフェクション/取り込み効率を低下させる一方で、一例を挙げるとMPSによるナノエマルジョン製剤の取り込みを低下させることにより、ナノエマルジョン製剤の血漿半減期が延びる場合がある。当業者であれば、例えば、EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)およびNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)を使用することによって開環重合技術(ROMP)などによりナノエマルジョン製剤のコロナにあると考えられる脂質を末端がアミンであるPEG基に対して反応させることによる、脂質をPEG化するための方法および技術について認識しているであろう。
例えば、PEGがリガンドにコンジュゲートしていない場合、PEGは末端基を含んでもよい。例えば、PEGは、末端が水酸基、メトキシもしくは他のアルコキシル基、メチルもしくは他のアルキル基、アリール基、カルボン酸、アミン、アミド、アセチル基、グアニジノ基、またはイミダゾールであってもよい。他の企図される末端基は、アジド、アルキン、マレイミド、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルコキシアミン、またはチオール部分を含む。
ナノエマルジョン製剤の界面膜表面のPEGの分子量は、本明細書において開示するように効果的な治療のために最適化することができる。例えば、PEGの分子量は、粒子分解速度(生分解性PEGの分子量を調節することなど)、可溶性、水分取り込み、および薬物放出動態に影響する場合がある。例えば、治療を受けている対象において数時間から1〜2週間まで、3〜4週間まで、5〜6週間まで、7〜8週間までなどの範囲の期間内で粒子が生分解するようにPEGの分子量を調節することができる。1つの有用なナノエマルジョン製剤は脂質にコンジュゲートしたコポリマーPEGを含み、該PEGは約1kD〜約20kD、約5kD〜約20kD、または約10kD〜約20kDの分子量を有し、該脂質は約200Da〜約3kD、約500Da〜約2.5kD、または約700Da〜約1.5kDの分子量を有しうる。例示的なナノエマルジョン製剤は、一価不飽和もしくは多価不飽和脂肪酸に富む油を約5重量パーセント〜約30重量パーセント、または主乳化剤を約0.5重量パーセント〜約5重量パーセント、または共乳化剤を約0.1重量パーセント〜約1.0重量パーセント、またはPEG誘導体を約0.1〜約0.75重量パーセント含む。例示的な脂質-PEGコポリマーは、約1.5kD〜約25,000kDaまたは約2kD〜約20kDの数平均分子量を含みうる。
ナノエマルジョン製剤における油と乳化剤と安定剤の、例えば亜麻仁油と乳化剤とPEG化脂質安定剤の比は、サイズ、化学療法剤の放出、および/またはナノエマルジョン製剤の分解動態などの特定のパラメータを最適化すべく選択されてもよい。
代替的な安定剤は、ポリ(エステル-エーテル)を含有してもよい。例えば、ナノエマルジョン製剤の界面膜表面は、エステル結合(例えばR-C(O)-O-R'結合)およびエーテル結合(例えばR-O-R'結合)により繋がった繰り返し単位を有しうる。カルボン酸基を含有する加水分解可能な生体高分子などの、ナノエマルジョン製剤の界面膜表面の生分解性成分が、ポリ(エチレングリコール)繰り返し単位とコンジュゲートしてナノエマルジョン製剤の界面膜表面上にポリ(エステル-エーテル)のコーティングを形成してもよい。
E.標的指向性リガンド
本開示のナノエマルジョン製剤は、治療または撮像しようとする癌細胞上の受容体またはタンパク質または分子に特異的な標的指向性のリガンドまたは分子をさらに含んでもよい。このようにして、ナノエマルジョン製剤は、正常細胞上よりも癌細胞上に多量に見られる標的指向性リガンドの受容体などの標的を有する細胞まで、より正確に送達される。
本開示のナノエマルジョン製剤は、治療または撮像しようとする癌細胞上の受容体またはタンパク質または分子に特異的な標的指向性のリガンドまたは分子をさらに含んでもよい。このようにして、ナノエマルジョン製剤は、正常細胞上よりも癌細胞上に多量に見られる標的指向性リガンドの受容体などの標的を有する細胞まで、より正確に送達される。
そのような有用な標的の1つは、上皮増殖因子受容体(EGFR)である(例えば、Magadala et al. (2008) AAPS. J. 10:565-576を参照されたい)。EGFRは、受容体チロシンキナーゼのヒト上皮増殖因子受容体HER/erbファミリーのメンバーであり、細胞の増殖および分化の両方において重要な役割を果たす。EGFRの過剰発現は、肺癌、乳癌、膀胱癌、および卵巣癌を含む種々のヒト癌における無増悪生存期間および全生存期間と負の相関関係がある。その正のシグナル伝達は、増殖の増加、アポトーシスの減少、ならびに腫瘍細胞の運動性および血管形成の増強を引き起こす。
有用なEGFR標的指向性リガンドは、アミノ酸ペプチドY-H-W-Y-G-Y-T-P-Q-N-V-I(SEQ ID. NO:1、ペプチド4)または抗EGFR免疫グロブリン、例えば、EGa1-PEGなどのナノボディを非限定的に含む。
他の有用な標的は葉酸受容体である。葉酸受容体アルファ(FR-α)は、3つのアイソフォームであるα、β、およびγのうちの1つである。FR-αは、Kdが1nM未満である葉酸と結合する(かつそれを内部移行する)38kDグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型糖タンパク質であり、卵巣(>85%)、肺(>75%)、乳房(>60%)、腎細胞(>65%)、脳、頭部、および頸部を含む多数のヒト腫瘍において高度に発現している(Fisher et al. (2008) J. Nucl. Med. 49:899-906)。正常組織では、その発現ははるかに少なく、尿細管、頂細胞における肺上皮、脈絡叢、および胎盤に限定されている。FR-αの過剰発現は、卵巣癌および他の癌における全生存期間と負の相関関係がある。しかしながら、FR-αを発現する卵巣腫瘍の85%以上で、死と発現とを相関させるのは困難である。化学療法に対する応答率、完全または部分寛解の予測因子として、FR-αが中央値を超える患者は負の応答の可能性が15倍高かった。
有用な葉酸標的指向性リガンドは、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]-システイン-葉酸(DSPE-PEG-システイン-葉酸)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-3400]-葉酸、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[葉酸(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)(DSPE-PEG(2000)葉酸)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[葉酸(ポリエチレングリコール)-5000](アンモニウム塩)(DSPE-PEG(5000)葉酸)(Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, Alabama)、およびこれらの任意の組み合わせを非限定的に含む。
いくつかのナノエマルジョン製剤では、標的指向性部分はナノエマルジョン製剤の脂質成分に付加されている、例えば、共有結合している。1つの例示的なナノエマルジョン製剤は、Pt(II)錯体と、官能化および非官能化油を含む油性コアと、界面膜またはコロナと、低分子量標的指向性リガンドとを含み、標的指向性リガンドはナノエマルジョン製剤の界面膜の脂質成分に共有結合している。
F.造影部分
本開示のナノエマルジョン製剤は、造影剤またはコントラスト剤をさらに含みうる。本開示のナノエマルジョン製剤上での造影剤の使用により、疾患部位に実際に到達する化学療法剤の量を医師がリアルタイムで追跡することが可能になる。次いで、医師は特定の患者が治療を継続すべきかどうかを速やかに判断することができる。有用な造影剤は、ガドリニウム(Gd)、酸化鉄、鉄白金、およびマンガンなどの常磁性剤を含む。有用なガドリニウム誘導体は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレン-トリアミン五酢酸(Gd-DTPA-PE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(Gd-DOTA-PE)、および1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-パラアゾキシフェネトール-N-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(Gd-PAP-DOTA)(Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, Alabama)を含む。これらガドリニウム系MRIコントラスト部分は、本明細書において記載のように調製するかまたは取得することができ、かつナノエマルジョン製剤に組み込むことができる。有用な造影剤は、ガドリニウム、酸化鉄、鉄、白金、およびマンガンである。適切なガドリニウム造影剤の例は、Gd-DTPA-PE、Gd-DOTA-PE、Gd-PAP-DOTAである。
本開示のナノエマルジョン製剤は、造影剤またはコントラスト剤をさらに含みうる。本開示のナノエマルジョン製剤上での造影剤の使用により、疾患部位に実際に到達する化学療法剤の量を医師がリアルタイムで追跡することが可能になる。次いで、医師は特定の患者が治療を継続すべきかどうかを速やかに判断することができる。有用な造影剤は、ガドリニウム(Gd)、酸化鉄、鉄白金、およびマンガンなどの常磁性剤を含む。有用なガドリニウム誘導体は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレン-トリアミン五酢酸(Gd-DTPA-PE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(Gd-DOTA-PE)、および1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-パラアゾキシフェネトール-N-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(Gd-PAP-DOTA)(Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, Alabama)を含む。これらガドリニウム系MRIコントラスト部分は、本明細書において記載のように調製するかまたは取得することができ、かつナノエマルジョン製剤に組み込むことができる。有用な造影剤は、ガドリニウム、酸化鉄、鉄、白金、およびマンガンである。適切なガドリニウム造影剤の例は、Gd-DTPA-PE、Gd-DOTA-PE、Gd-PAP-DOTAである。
したがって、代表的なナノエマルジョン製剤は、ナノエマルジョン製剤の脂質成分に付加された、例えば、共有結合した造影部分を含む。1つの例示的なナノエマルジョン製剤は、治療用Pt(II)錯体と、官能化および非官能化油を含む油性コアと、界面膜またはコロナと、EGFR標的指向性リガンドと、造影剤とを含み、造影剤はナノエマルジョン製剤の界面膜の脂質成分に共有結合している。
別の例示的なナノエマルジョン製剤では、造影部分は油相に可溶である。例えば、ナノエマルジョン製剤は、化学療法用Pt(II)錯体と、官能化および非官能化油を含む油相と、界面膜と、EGFR標的指向性リガンドと、造影剤とを含み、造影剤は油相に可溶である。
2.ナノエマルジョン製剤の調製
本開示のナノエマルジョン製剤は、例えば、下記実施例5〜11に記載するように、様々な中間体および構成成分から調製することができ、マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp., Newton, MA)を用いて作製することができる。
本開示のナノエマルジョン製剤は、例えば、下記実施例5〜11に記載するように、様々な中間体および構成成分から調製することができ、マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp., Newton, MA)を用いて作製することができる。
図9は、本開示の1つの非限定的なEGFR標的化Gd標識ナノエマルジョン製剤の代表的な合成スキームを示す。この図では、1は白金モノ脂肪酸誘導体であり、ここでR1およびR2はNH3基であり、R3は炭素鎖長がC14、C16、またはC18である脂肪酸である。2はアポトーシス促進剤であるC6-セラミドである。3はクロロホルムに溶解し亜麻仁油に加えた化合物1および2を表す。クロロホルムは窒素を用いて除去されて油相が形成される。4は造影部分Gd-DTPA-PEである。5は標的指向性リガンドEGFRBP-PEG-DSPEである。6は、化合物4および5をグリセロール水溶液中の卵レシチンおよびPEG2000DSPEに加えて形成された水相を表す。7は、3の油相および6の水相を合わせ、混合し、60℃まで5分間加熱して形成した粗エマルジョンを示す。8は、7の粗エマルジョンの高圧ホモジナイザー(LV1マイクロフルイダイザー)を用いた25,000psiでの10サイクルの乳化を表し、サイズが150nm未満のナノエマルジョン製剤の液滴が得られる。9は得られた150nm未満のサイズを有する本開示の一態様のナノエマルジョン製剤である。10は個々の得られたナノエマルジョン製剤の代表的な描画である。
Pt-MMA、Pt-MPA、Pt-MSA、Pt-SAの濃度が5mg/mlまでのナノエマルジョン製剤を調製した。
3.ナノエマルジョン製剤の特性決定
本開示のナノエマルジョン製剤は実質的に球形を有してもよい。一例を挙げると、ナノエマルジョン製剤は概して球状、または非球状形態に見えるが、収縮すると非球状形態になってもよい。該ナノエマルジョン製剤は、約1μm未満の特性寸法を有してもよく、ここでナノエマルジョン製剤の特性寸法とは、ナノエマルジョン製剤と同じ体積を有する完全な球体の直径である。例えば、ナノエマルジョン製剤の特性寸法は、いくつかの場合では約300nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満、または約50nm未満でありうる。いくつかの開示したナノエマルジョン製剤は、直径が約50nm〜200nm、約50nm〜約180nm、約80nm〜約160nm、または約80nm〜約150nmであってもよい。
本開示のナノエマルジョン製剤は実質的に球形を有してもよい。一例を挙げると、ナノエマルジョン製剤は概して球状、または非球状形態に見えるが、収縮すると非球状形態になってもよい。該ナノエマルジョン製剤は、約1μm未満の特性寸法を有してもよく、ここでナノエマルジョン製剤の特性寸法とは、ナノエマルジョン製剤と同じ体積を有する完全な球体の直径である。例えば、ナノエマルジョン製剤の特性寸法は、いくつかの場合では約300nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満、または約50nm未満でありうる。いくつかの開示したナノエマルジョン製剤は、直径が約50nm〜200nm、約50nm〜約180nm、約80nm〜約160nm、または約80nm〜約150nmであってもよい。
ナノエマルジョン製剤における粒子のサイズは、動的光散乱法(DLS)(Zetasizer ZS, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, United Kingdom)(図10A)および透過型電子顕微鏡法(TEM)(図10B)により測定した。この代表的なナノエマルジョン製剤の粒径は直径で150nm未満であった。
対照ブランクナノエマルジョン製剤、EGFR標的化ブランクナノエマルジョン製剤およびEGFR標的化ナノエマルジョン製剤のナノエマルジョン製剤のサイズ分布およびゼータ電位値は、Zetasizer ZS(Malvern Instruments, Worcestershire, United Kingdom)を用いて測定した。結果を下記表IVに示す。
Pt(II)錯体もCERも標的指向性部分も含有していない対照ナノエマルジョン製剤の平均粒径は直径で200nm未満であった。ナノエマルジョン製剤にPt(II)錯体、CERおよび標的指向性部分を組み込んでも流体力学的な粒径は有意に変化せず、粒径は200nm未満のままであった。ナノエマルジョン製剤の平均表面電荷は-38mV〜-56mVの範囲内であった。
対照ブランクナノエマルジョン製剤およびEGFR標的化ナノエマルジョン製剤のナノエマルジョン製剤のサイズ分布は、Zetasizer ZS(Malvern Instruments, Worcestershire, United Kingdom)を用いて4℃および室温(RT)で最大3か月間測定した。結果を下記表Vに示す。
Pt(II)錯体、CERまたは標的指向性部分を含有していない対照ナノエマルジョン製剤の平均粒径は、最大3か月間直径が200nm未満のままであった。ナノエマルジョン製剤にPt(II)錯体、CERおよび標的指向性部分を組み込んでも流体力学的な粒径は有意に変化せず、最大3か月間粒径は200nm未満のままであり、ナノエマルジョン製剤が最大3か月間4℃およびRTの両方で安定していることが示された。
本開示のナノエマルジョン製剤は、内部および表面を有してもよく、ここで表面は内部とは組成が異なる、即ち、内部には存在するが表面には存在しない少なくとも1つの化合物があってもよく(またはその逆も同様)、かつ/または少なくとも1つの化合物が内部および表面で異なる濃度で存在する。例えば、本開示のポリマーコンジュゲートの標的指向性部分(即ち、低分子量リガンド、タンパク質、炭水化物、または核酸)などの化合物は、ナノエマルジョン製剤の内部および表面の両方に存在してもよいが、ナノエマルジョン製剤の内部よりも表面での濃度が高く、しかしながらいくつかの場合ではナノエマルジョン製剤の内部での濃度は実質的にゼロでなくてもよい、即ち、ナノエマルジョンの内部では検出可能量の化合物が存在する。
いくつかの場合では、ナノエマルジョン製剤の内部は、ナノエマルジョン製剤の表面よりも疎水性である。一例を挙げると、ナノエマルジョン製剤の内部はナノエマルジョン製剤の表面に対して比較的疎水性であってもよく、薬剤または他の含有物(payload)は疎水性であってもよくナノエマルジョン製剤の比較的疎水性の中心と容易に会合する。よって薬剤または他の含有物はナノエマルジョン製剤の内部に含有されることができ、これはナノエマルジョン製剤を取り囲む外部環境から薬剤または他の含有物をかくまうことができる(またはその逆も同様)。一例を挙げると、対象に投与されたナノエマルジョン製剤内に含有される薬剤または他の含有物は対象の身体から保護されると考えられ、また身体が少なくとも暫くの間は薬剤から実質的に隔離される場合もある。
例えば、例示的なナノエマルジョン製剤は、密度が約1.065g/cm3、または約1.01g/cm3〜約1.10g/cm3であるPEG誘導体コロナを有してもよい。
本開示のナノエマルジョン製剤は制御放出特性を有してもよく、例を挙げると、患者に例えば患者内の特定部位に長期間にわたって、例えば1日、1週間、またはそれ以上の期間にわたって一定量の活性剤を送達することが可能であってもよい。いくつかの開示のナノエマルジョン製剤は、例えば室温および/または37℃のリン酸緩衝食塩水中に入れた場合に、化学療法剤(例えば、Pt(II)錯体)を実質的に即時に(例えば、約1分〜約30分にわたって)放出するか、6時間で約2%未満、24時間で約4%未満、48時間で約7%未満、または72時間で約10%未満放出する。
4.治療の方法
本開示に係るナノエマルジョン製剤は、癌または腫瘍の症状または特徴の1つまたは複数を治療する、軽減する、緩和する、和らげる、その発症を遅延する、その進行を阻害する、その重症度を低減する、および/またはその発病率を低減するために使用してもよい。
本開示に係るナノエマルジョン製剤は、癌または腫瘍の症状または特徴の1つまたは複数を治療する、軽減する、緩和する、和らげる、その発症を遅延する、その進行を阻害する、その重症度を低減する、および/またはその発病率を低減するために使用してもよい。
「癌」という用語は、前悪性ならびに悪性の癌を含む。癌は、前立腺、胃癌、大腸癌、皮膚癌例えばメラノーマまたは基底細胞腫、肺癌、頭頸部癌、気管支癌、膵臓癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆管癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織癌などを非限定的に含む。「癌細胞」は、腫瘍の形態で、または対象内で単独で、存在しうる(例えば、白血病細胞)。
場合によっては、標的化ナノエマルジョン製剤は、癌細胞の表面上または卵巣もしくは非卵巣固形腫瘍の新生血管系を含む腫瘍の新生血管内にEGFRまたは葉酸を発現する任意の癌を治療するために使用されてもよい。EGFRまたは葉酸に関連する適応症の例は、乳癌、卵巣癌、食道癌、および口腔咽頭癌を非限定的に含む。
癌を治療する場合に、「治療有効量」の本開示のナノエマルジョン製剤が投与され、これは、癌の1つまたは複数の症状または特徴を治療する、軽減する、緩和する、和らげる、その発症を遅延する、その進行を阻害する、その重症度を低減する、および/またはその発病率を低減するために有効な量である。
当業者には理解されるであろうが、ナノエマルジョン製剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達しようとする薬剤、標的組織、投与経路などの要素に応じて異なってもよい。例えば、ナノエマルジョン製剤の有効量は、所望の期間にわたって腫瘍の大きさを所望の量だけ減少させる量である。考慮に入れられてもよいさらなる要素としては、病態の重篤度;治療している患者の年齢、体重および性別;食事、投与の時間および頻度;反応感度;ならびに療法に対する耐性/応答を含む。
本開示のナノエマルジョン製剤は、癌細胞、例えば、卵巣癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。本明細書において用いる「癌細胞の増殖を阻害する」または「癌細胞の増殖を阻害している」という用語は、未治療の対照癌細胞の観察されたかまたは予測された増殖速度と比較して癌細胞増殖の速度が低減するように癌細胞の増殖および/または移動の速度を遅延させること、癌細胞の増殖および/または移動を停止させること、あるいは癌細胞を死滅させることのいずれかを指す。「増殖を阻害する」という用語は、癌細胞または腫瘍の大きさの縮小または消失、およびその転移能の低減も指しうる。このような細胞レベルでの阻害が、患者における癌の大きさを縮小するか、増殖を抑止するか、侵襲性を低減するか、または転移を防止もしくは阻害する可能性がある。癌細胞の増殖が阻害されているかどうかは、各種の適切な指標のいずれかによって当業者が容易に判断することができる。
癌細胞増殖の阻害は、例えば、細胞周期の特定の期における癌細胞の停止、例えば細胞周期のG2/M期における停止により証明されてもよい。癌細胞増殖の阻害は、癌細胞または腫瘍の大きさの直接的または間接的な測定によって証明することもできる。ヒトの癌患者では、そのような測定は、概して、核磁気共鳴画像法、コンピューター体軸断層写真およびX線などの周知の撮像方法を用いて行われる。癌細胞増殖は、癌細胞増殖と相関する血中癌胎児性抗原、前立腺特異抗原または他の癌特異抗原のレベルを測定することなどにより、間接的に測定することもできる。癌増殖の阻害は、概して、対象の生存期間の延長ならびに/または健康および満足な生活状態の増進とも相関している。
本明細書においては、健常な個体(即ち、癌の症状を何も示さずかつ/または癌と診断されていない対象)に治療有効量の開示の治療ナノエマルジョン製剤を投与することを含む治療プロトコルも提供される。例えば、健常な個体は、癌の発症および/または癌の症状の発現に先立ち、ナノエマルジョン製剤などの本発明の標的化または非標的化粒子で「免疫化」されてもよく;危険性のある個体(例えば、癌の家族歴がある患者;癌の発症と関連した1つまたは複数の遺伝子変異を持つ患者;癌の発症と関連した遺伝子多型を有する患者;癌の発症と関連したウイルスに感染した患者;癌の発症と関連した習慣および/または生活様式がある患者;など)は癌の症状の発現と実質的に同時(例えば、その48時間以内、24時間以内、または12時間以内)に治療することができる。癌を有することが分かっている個体は、随時本発明の治療を受けてもよい。
本明細書において開示したナノエマルジョン製剤は、医薬組成物を形成すべく薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。当業者には理解されるであろうが、担体は、下に記載のような投与経路、標的組織の場所、送達されている薬剤、薬剤の送達の時間的推移などに基づいて選択してもよい。
注射可能な調合物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて公知の技術に従って製剤化されてもよい。無菌の注射可能な調合物はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈液または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョン、例えば1,3-ブタンジオール溶液であってもよい。採用してもよい許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液である。また、無菌の不揮発性油が溶媒または懸濁媒として慣例的に採用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油を採用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。
5.ナノエマルジョン製剤の投与方法
本開示のナノエマルジョン製剤は、経口および非経口経路を含む当技術分野で公知の任意の手段によって患者に投与することができる。本明細書において用いる「患者」という用語は、ヒトならびに、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含むヒト以外の動物も指す。非経口経路では消化管で見られる消化酵素との接触が回避されるため非経口経路が往々にして選択される。上記組成物は、注射によって(例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内注射)、経直腸的に、経膣的に、局所的に(粉末、クリーム、軟膏、または液滴によって)、または吸入によって(スプレーによって)投与されてもよい。
本開示のナノエマルジョン製剤は、経口および非経口経路を含む当技術分野で公知の任意の手段によって患者に投与することができる。本明細書において用いる「患者」という用語は、ヒトならびに、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含むヒト以外の動物も指す。非経口経路では消化管で見られる消化酵素との接触が回避されるため非経口経路が往々にして選択される。上記組成物は、注射によって(例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内注射)、経直腸的に、経膣的に、局所的に(粉末、クリーム、軟膏、または液滴によって)、または吸入によって(スプレーによって)投与されてもよい。
例えば、本開示のナノエマルジョン製剤は、これを必要とする対象に全身的に、例えば、静脈内の注入または注射によって投与してもよい。注射可能な調合物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて公知の技術に従って製剤化されてもよい。無菌の注入可能な調合物はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈液または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョン、例えば1,3-ブタンジオール溶液であってもよい。採用してもよい許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液である。また、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として慣例的に採用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発性油を採用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸が注入剤の調製に使用される。
また、ナノエマルジョン製剤は経口投与されてもよい。経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、および顆粒剤を含む。このような固体剤形において、封入または非封入コンジュゲートは、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも1つの不活性で薬学的に許容可能な賦形剤もしくは担体、ならびに/または(a)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤もしくは増量剤、(b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアラビアガムなどの結合剤、(c)グリセロールなどの保湿剤、(d)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、(e)パラフィンなどの溶解遅延剤(solution retarding agent)、(f)第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、(g)例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、(h)カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、ならびに(i)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの潤滑剤と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合には、剤形は緩衝剤を含んでもよい。
本開示のナノエマルジョン製剤の正確な投薬量は、治療すべき患者を考慮して個々の医師により選定され、一般的には、投薬量および用法は治療されている患者へ有効量のナノエマルジョン製剤を提供すべく調節されることが理解されるであろう。本明細書において用いるナノエマルジョン製剤の「有効量」とは、所望の生体応答をもたらす量を指す。当業者には理解されるであろうが、ナノエマルジョン製剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達しようとする薬剤、標的組織、投与経路などの要素に応じて異なってもよい。例えば、ナノエマルジョン製剤の有効量は、所望の期間にわたって腫瘍の大きさを所望の量だけ減少させる量である。考慮に入れられてもよいさらなる要素としては、病態の重篤度;治療している患者の年齢、体重および性別;食事、投与の時間および頻度;反応感度;ならびに療法に対する耐性/応答を含む。
本開示のナノエマルジョン製剤は、投与のしやすさおよび均一な投薬量のために投薬単位形態で処方されてもよい。本明細書において用いる「投薬単位形態」という表現は、治療すべき患者に適切な、ナノエマルジョン製剤の物理的に個別の単位を指す。しかしながら、本開示のナノエマルジョン製剤の1日当たりの総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決められることが理解されるであろう。任意のナノエマルジョン製剤については、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイにおいてかまたは動物モデル、大抵はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいてのいずれかでまずは推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するようにも使用される。次いで、このような情報はヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用することができる。ナノエマルジョン製剤の治療有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法、例えば、ED50(該用量は集団の50%において治療上有効である)およびLD50(該用量は集団の50%に対して致死的である)によって決定することができる。毒性効果対治療効果の用量比は治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。治療指数の大きいナノエマルジョン製剤がいくつかの態様において有用である場合がある。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。
例えば、ナノエマルジョン製剤は、白金化合物を約0.001%〜約2%(約0.01mg/ml〜約20mg/ml)の濃度で含有してもよい。注射によって投与される投薬量は、患者によっては、1〜4週間毎の一日目に約5mg〜約1000mgの範囲で白金を含有してもよい。ある者は体重が約40kg〜約100kgの患者に対して、1〜4週間毎の一日目に約50mg〜約400mgの投薬量を投与するかもしれない。そのような投薬量がこの範囲外の体重を有する患者にとって有用であることを示す場合がある。ナノエマルジョン製剤はまた、アポトーシス促進剤として作用するC6-セラミドを含有してもよく、癌細胞における白金の細胞毒性を向上する。組成物中のC6-セラミドの濃度は、約0.001%〜約2%(約0.01mg/ml〜約20mg/ml)である。
経口投与のためのエマルジョンは、注射のために使用される容量とほぼ同じ容量である。しかしながら、薬剤を経口的に投与する場合、注射により投与する場合よりも多い用量が使用されてもよい。例えば、白金を約10mg〜約1500mg含有する投薬量を1〜4週間毎の一日目に使用してもよい。そのような液体剤形を調製する際には、標準的な作製技術を採用してもよい。
6.撮像方法
本開示に係るナノエマルジョン製剤は、腫瘍または癌細胞を撮像するために使用されてもよい。このナノエマルジョン製剤は、微小な身体領域内まで移動するほど小さく、ガドリニウムイオン(Gd3+)、酸化鉄、鉄、白金、またはマンガンなどの常磁性元素と結合させた場合にはMRIにおける組織のコントラストを向上できる。ナノエマルジョン製剤が癌部位に到達すれば、その有効性が判定される。これはMRIなどのインビボ画像診断法を用いて行うことができる。ナノエマルジョン製剤を用いた画像誘導療法が、薬物送達と組織撮像とを結び付け、臨床医が化学療法剤を、薬剤の局在化および薬剤の生理的効果の可視化を同時に行いながら効率的に送達することが可能になる。
本開示に係るナノエマルジョン製剤は、腫瘍または癌細胞を撮像するために使用されてもよい。このナノエマルジョン製剤は、微小な身体領域内まで移動するほど小さく、ガドリニウムイオン(Gd3+)、酸化鉄、鉄、白金、またはマンガンなどの常磁性元素と結合させた場合にはMRIにおける組織のコントラストを向上できる。ナノエマルジョン製剤が癌部位に到達すれば、その有効性が判定される。これはMRIなどのインビボ画像診断法を用いて行うことができる。ナノエマルジョン製剤を用いた画像誘導療法が、薬物送達と組織撮像とを結び付け、臨床医が化学療法剤を、薬剤の局在化および薬剤の生理的効果の可視化を同時に行いながら効率的に送達することが可能になる。
適切な造影剤と組み合わせたナノエマルジョン製剤は、MRIコントラスト剤として作用して組織画像の解像度を向上できる。Gd3+などのコントラスト剤は、周囲の水分子と相互作用する不対電子を有しており、T1とも呼ばれるそのプロトンスピン時間を短縮する。緩和時間は、磁化パルスに続いてプロトンがその平衡位置まで戻るのにかかる期間として定義される。MRIは、試料の磁化を反転する磁界を生成し、次いでスピン方向が再び平衡位置に並ぶのに必要な時間を記録することによってT1を測ることができる。標的組織のT1緩和時間の短縮により、MRI機器が標的組織とその周囲の水性環境とをよりよく区別することが可能になる。
本開示に係るナノエマルジョン製剤は画像誘導治療の成功のために、MRIのコントラストを提示するだけでなく、封入したPt(II)錯体またはPt(II)錯体と化学増強剤とを標的組織まで運搬する、新規なGd3+キレート化EGFRまたは葉酸受容体標的化ナノエマルジョン製剤として機能することができる。該ナノエマルジョンのMRIコントラスト生成能を調べるべく、MRIを用いたインビボ試験を行った一方で、細胞取り込みおよび輸送ならびに有効性の試験を行ってナノエマルジョン製剤の薬物送達能を調べた。
撮像の方法は、撮像すべき患者または対象に診断有効量の本開示に係るナノエマルジョン製剤を投与することを含む。ナノエマルジョン製剤は、皮下的および静脈内的なものを含む様々な技術により投与することができる。該方法は、乳癌、卵巣癌、食道癌、および口腔咽頭癌などの癌、ならびにリンパ系または血管(血液)系によりアクセス可能な他の癌を撮像するために有効である。磁気共鳴撮像法のためには、本開示のナノエマルジョン製剤は常磁性金属イオン(例えば、Gd3+)を含む。
次の実施例は本発明の具体的で例示的な方法を提供するが、本発明をその内容に限定するものとして解釈すべきではない。
実施例1:シス-ジアミンPt(II)クロリドモノパルミチン酸(Pt-MPA)の合成
シスプラチン中間体を次のように調製した。蒸留水30mlにシス-ジクロロジアミンPt(II)(240mg、0.8mmol)(Sigma)を懸濁し、70℃まで加熱して錯体を溶解した。次いで溶液をRTまで冷却した。その後、硝酸銀水溶液(水10ml中(135.9mg、0.8mmol))を出発物質の溶液に撹拌しながら(400rpm)滴下した。該水溶液の添加後すぐに塩化銀の乳白色析出物の形成が開始した。混合液を遮光条件下3時間RTで撹拌した。得られた塩化銀の析出物をろ過し(Corning polystyrene Filter System, Corning(0.22μΜ))、水洗した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
シスプラチン中間体を次のように調製した。蒸留水30mlにシス-ジクロロジアミンPt(II)(240mg、0.8mmol)(Sigma)を懸濁し、70℃まで加熱して錯体を溶解した。次いで溶液をRTまで冷却した。その後、硝酸銀水溶液(水10ml中(135.9mg、0.8mmol))を出発物質の溶液に撹拌しながら(400rpm)滴下した。該水溶液の添加後すぐに塩化銀の乳白色析出物の形成が開始した。混合液を遮光条件下3時間RTで撹拌した。得られた塩化銀の析出物をろ過し(Corning polystyrene Filter System, Corning(0.22μΜ))、水洗した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
Pt(II)モノパルミチン酸錯体を次のように調製した。上で得られた水溶液にパルミチン酸ナトリウムの水溶液(水10ml中(223mg、0.8mmol)(Sigma))を加え、遮光条件下RTで3週間撹拌し、これらの間での反応を完了した。形成した乳白色の析出物をろ別し、少量のエーテルで洗浄し、真空デシケーター内で乾燥して粗生成物を得た。粗生成物は、モノおよびジ脂肪酸Pt誘導体の混合物を含有していた。モノ脂肪酸Pt誘導体はクロロホルムに可溶なため、混合物を精製するためにクロロホルムを使用した。円錐管内でクロロホルム25mlに粗生成物を懸濁し、5分間ボルテックス混合し、RTで24時間保持した。次いで管を遠心分離し(5000rpm、10分)(Beckman-Coulter, Inc., Brea, CA)、上清をガラスバイアルに移し、真空乾燥して、Pt(II)モノミリスチン酸錯体を得た(収率=22%)。
実施例2:シス-ジアミンPt(II)クロリドモノステアリン酸(Pt-MSA)の合成
シスプラチン中間体を次のように調製した。シス-ジクロロジアミンPt(II)(240mg、0.8mmol)(Sigma)を蒸留水30mlに懸濁し、70℃まで加熱して錯体を溶解した。次いで溶液をRTまで冷却した。その後、硝酸銀水溶液(水10ml中(135.9mg、0.8mmol))を出発物質の溶液に撹拌しながら(400rpm)滴下した。該水溶液の添加後すぐに塩化銀の乳白色析出物の形成が開始した。混合液を遮光条件下3時間RTで撹拌した。得られた塩化銀の析出物をろ別し(Corning polystyrene Filter System, Corning, Amsterdam, Netherlands)(0.22μΜ)、水洗した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
シスプラチン中間体を次のように調製した。シス-ジクロロジアミンPt(II)(240mg、0.8mmol)(Sigma)を蒸留水30mlに懸濁し、70℃まで加熱して錯体を溶解した。次いで溶液をRTまで冷却した。その後、硝酸銀水溶液(水10ml中(135.9mg、0.8mmol))を出発物質の溶液に撹拌しながら(400rpm)滴下した。該水溶液の添加後すぐに塩化銀の乳白色析出物の形成が開始した。混合液を遮光条件下3時間RTで撹拌した。得られた塩化銀の析出物をろ別し(Corning polystyrene Filter System, Corning, Amsterdam, Netherlands)(0.22μΜ)、水洗した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
Pt(II)モノステアリン酸錯体を次のように調製した。ステアリン酸ナトリウムの水溶液(水10ml中(245.15mg、0.8mmol)(Sigma))を上で得られた水溶液に加え、遮光条件下RTで3週間撹拌し、反応を完了した。形成した乳白色の析出物をろ別し、少量のエーテルで洗浄し、真空デシケーター内で乾燥して粗生成物を得た。
粗生成物はモノおよびジ脂肪酸Pt誘導体の混合物を含有し、かつモノ脂肪酸Pt誘導体はクロロホルムに可溶なため、混合物を精製するためにクロロホルムを使用した。円錐管内でクロロホルム25mlに粗生成物を懸濁し、5分間ボルテックス混合し、RTで24時間保持した。次いで管を遠心分離し(5000rpm、10分)(Beckman-Coulter, Inc.)、上清をガラスバイアルへ慎重に移し、真空乾燥してPt(II)モノステアリン酸錯体を得た(収率=6.08%)。
実施例3:シス-ジアミンPt(II)クロリドモノミリスチン酸(Pt-MMA)の合成
シスプラチン中間体を次のように調製した。シス-ジクロロジアミンPt(II)(Sigma, Louis, MO)(240mg、0.8mmol)を蒸留水30mlに懸濁し、70℃まで加熱して錯体を溶解した。次いで溶液をRTまで冷却した。その後、水10ml中の硝酸銀水溶液(Sigma)(135.9mg、0.8mmol)を出発物質の溶液に撹拌しながら(400rpm)滴下した。該水溶液の添加後すぐに塩化銀の乳白色析出物の形成が開始した。混合液を遮光条件下3時間RTで撹拌した。得られた塩化銀の析出物をろ別し(Corning polystyrene Filter System, Corning)(0.22μΜ)、水洗した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
シスプラチン中間体を次のように調製した。シス-ジクロロジアミンPt(II)(Sigma, Louis, MO)(240mg、0.8mmol)を蒸留水30mlに懸濁し、70℃まで加熱して錯体を溶解した。次いで溶液をRTまで冷却した。その後、水10ml中の硝酸銀水溶液(Sigma)(135.9mg、0.8mmol)を出発物質の溶液に撹拌しながら(400rpm)滴下した。該水溶液の添加後すぐに塩化銀の乳白色析出物の形成が開始した。混合液を遮光条件下3時間RTで撹拌した。得られた塩化銀の析出物をろ別し(Corning polystyrene Filter System, Corning)(0.22μΜ)、水洗した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
上で得られた水溶液に水10ml中のミリスチン酸ナトリウム(Sigma)(200mg、 0.8mmol)を加え、遮光条件下RTで3週間撹拌し、これらの間での反応を完了した。
形成した乳白色の析出物をろ別し、少量のエーテルで洗浄し、真空デシケーター内で乾燥して粗生成物を得た。粗生成物はモノおよびジ脂肪酸Pt誘導体の混合物からなっていた。モノ脂肪酸Pt誘導体はクロロホルムに可溶なため、混合物を精製するためにクロロホルムを使用した。円錐管内でクロロホルム25mlに粗生成物を懸濁し、5分間ボルテックス混合し、RTで24時間保持した。次いで管を遠心分離し(5000rpm、10分)、上清をガラスバイアルへ移し、真空乾燥して乾燥Pt(II)モノミリスチン酸錯体を得た(収率=24.8%)。
実施例4:ジアミノシクロヘキサン白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)の合成
図11に示すようにDACH-Pt中間体を調製した。テトラクロロ白金(II)酸カリウム(Sigma)(208mg、50mM)を蒸留水に溶解し、これに蒸留水1mlに溶解したヨウ化カリウム(Sigma)(830mg、0.5mM)を加え、5分間RTで撹拌した。次いで(1R,2R)-トランス-1,2-シクロヘキサンジアミン(DACH)(Sigma)(57mg、50mM)を上の溶液に加え、1時間撹拌した。得られた析出物をWhatman紙を用いてろ別し、水、エタノール、およびアセトンで洗浄した。試料を真空乾燥して、DACH-Ptの乾燥生成物(235mg)を得た。この生成物を蒸留水200mlに懸濁し、硝酸銀(Sigma)(115mg、3.37mM)を加え、RTで24時間撹拌した。得られた塩化銀の析出物をCorning polystyrene Filter System (Corning)(0.22μΜ)でろ別し、洗浄した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
図11に示すようにDACH-Pt中間体を調製した。テトラクロロ白金(II)酸カリウム(Sigma)(208mg、50mM)を蒸留水に溶解し、これに蒸留水1mlに溶解したヨウ化カリウム(Sigma)(830mg、0.5mM)を加え、5分間RTで撹拌した。次いで(1R,2R)-トランス-1,2-シクロヘキサンジアミン(DACH)(Sigma)(57mg、50mM)を上の溶液に加え、1時間撹拌した。得られた析出物をWhatman紙を用いてろ別し、水、エタノール、およびアセトンで洗浄した。試料を真空乾燥して、DACH-Ptの乾燥生成物(235mg)を得た。この生成物を蒸留水200mlに懸濁し、硝酸銀(Sigma)(115mg、3.37mM)を加え、RTで24時間撹拌した。得られた塩化銀の析出物をCorning polystyrene Filter System (Corning)(0.22μΜ)でろ別し、洗浄した。合わせたろ液をさらなる処理を行わずに次の工程で使用した。
Pt-SA錯体を次のように調製した。上記のろ液に3,5ジヨードジナトリウムサリチル酸(DISA)(Sigma)(182mg、2.10mM)を加え、1時間撹拌した。得られたPt-SA析出物をWhatman紙を用いてろ別し、水で洗浄した。最終生成物を真空下で乾燥させた。
実施例5:EGFR BP -PEG-DSPEの合成
EGFRBP-PEG-DSPEを図12に示すスキームにしたがって調製した。
EGFRBP-PEG-DSPEを図12に示すスキームにしたがって調製した。
簡潔に記載すると、リンカー配列G-G-G-G-C(SEQ ID NO:2)を有する合成EGFR標的指向性ペプチドY-H-W-Y-G-Y-T-P-Q-N-V-I(SEQ ID NO:1)を標準的なペプチド有機合成法により合成した。該ペプチドの末端システインのカルボキシル基をPEG2000-DSPE構築物のマレイミドと反応させた。この反応を達成するため、EGFR結合ペプチド
9.4mgを、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液(pH7.4)に溶解したMAL-PEG2000-DSPE(2942kd mol.wt.)14.7mgにモル比1:1で、窒素下4℃で24時間400rpm)で混合しながら加えた。
9.4mgを、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液(pH7.4)に溶解したMAL-PEG2000-DSPE(2942kd mol.wt.)14.7mgにモル比1:1で、窒素下4℃で24時間400rpm)で混合しながら加えた。
次いでカットオフ分子量が3500の膜(Spectrapore, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA)を用いてRTで脱イオン蒸留水に対する透析によりEGFRBPコンジュゲートを精製した。次いで精製した試料を管へ移し24時間凍結乾燥した。試料は使用時まで-20℃で保存した。
EGFRBP-PEG2000DSPEコンジュゲートの形成は核磁気共鳴分光(NMR)分析によって確認した。DMSO(ジメチルスルホキシド)1mlに試料を2mg溶解し、Varian 400AS分光計(400MHz, Varian Inc., Palo Alto, CA)を用いてNMRスペクトルを記録した。
実施例6:葉酸標的指向性リガンドDSPE-PEG-Cys-FAの合成
DSPE-PEG-Mal錯体を図13のスキームにしたがって調製した。HEPES緩衝液(25ml)中でDSPE-PEG-Mal(100mg、1.3596mM)をシステイン(8.24mg、2.72mM)にモル比1:2で加え、カップリング反応を窒素環境下4℃で一晩行った。翌日、過剰のシステインをカットオフ2000Daの透析袋を用いて24時間透析して除いた。外部水を2時間毎に交換して透析を促進した。
DSPE-PEG-Mal錯体を図13のスキームにしたがって調製した。HEPES緩衝液(25ml)中でDSPE-PEG-Mal(100mg、1.3596mM)をシステイン(8.24mg、2.72mM)にモル比1:2で加え、カップリング反応を窒素環境下4℃で一晩行った。翌日、過剰のシステインをカットオフ2000Daの透析袋を用いて24時間透析して除いた。外部水を2時間毎に交換して透析を促進した。
精製した試料を凍結乾燥し、NMRによって特性決定した。葉酸を13mg含有する無水DMSO 6mlにDSPE-PEG-Cysを51mg溶解した。溶液にピリジンを3ml加え、次にN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを16mg加えた。RTで4時間連続的に混合してカップリングを行った。試料をカットオフ2000Daの透析袋を用いて水中で透析した。外部水を2時間毎に24時間交換して透析を促進した。精製した試料を凍結乾燥し、NMRによって特性決定した。
実施例7:Gd +3 -DTPA-PEの合成
Gd+3-DTPA-PEキレート化合物を図14に示すスキームにしたがって調製した。クロロホルム4ml(超脱水)に溶解したトランスホスファチジル化L-a-ホスファチジルエタノールアミン(egg chicken)(841118C, Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL)100mgにトリエチルアミン(Sigma)を30μl加えた。次いでこの溶液をジメチルスルホキシド20ml中のジエチレントリアミン五酢酸二無水物(DTPA無水物)(Sigma)400mg(1mM)に滴下し、混合物を窒素雰囲気下RTで3時間撹拌した。次いで窒素を試料に吹き込みクロロホルムを除去した。
Gd+3-DTPA-PEキレート化合物を図14に示すスキームにしたがって調製した。クロロホルム4ml(超脱水)に溶解したトランスホスファチジル化L-a-ホスファチジルエタノールアミン(egg chicken)(841118C, Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL)100mgにトリエチルアミン(Sigma)を30μl加えた。次いでこの溶液をジメチルスルホキシド20ml中のジエチレントリアミン五酢酸二無水物(DTPA無水物)(Sigma)400mg(1mM)に滴下し、混合物を窒素雰囲気下RTで3時間撹拌した。次いで窒素を試料に吹き込みクロロホルムを除去した。
次いでカットオフ分子量が3000の膜(Spectrapore, Spectrum Laboratories)を用いてRTで脱イオン蒸留水に対する透析によってDTPA-PEコンジュゲートを精製した。次いで精製した試料を管へ移し48時間凍結乾燥した。クロロホルム:メタノール:水からなる移動相を3.25:1.25:0.5(v/v)の比で用いかつ視覚化試薬としてニンヒドリンを用いて、DTPA-PE複合体の形成および複合体の純度を薄層クロマトグラフィー(TLC)によりモニタリングした。これに関して、反応物(DTPA、PE)および複合体(DTPA-PE)をクロロホルムに溶解し、TLCプレートに置き、移動相内に展開した。次いでニンヒドリン溶液を噴霧し、複合体の形成があるかどうかを確認するためスポットとその保持時間とを比較した。
次いで、DMSO 20mlに溶解したDTPA-PE複合体100mgに、水0.1ml中の塩化ガドリニウム(III)六水和物(Sigma)18.5mg(10.0mM)を滴下し、反応混合物を1時間撹拌した(400rpm)。
Arsenazo IIIアッセイを使用して反応およびGd-DTPA-PE錯体の形成をモニタリングした。水中のArsenazo III(Pointe Scientific) 0.2mMに反応混合物を10μl加え、色の変化(桃色から青色)を観察した。溶液の色が変化しないということは、GdがDTPA-PEと錯化したことを示す(遊離GdはArsenazo III溶液を青色に変化させる)。
得られたGd+3-DTPA-PEコンジュゲートを、カットオフ分子量が3000の膜(Spectrapore, Spectrum Laboratories)を用いてRTで脱イオン蒸留水に対する透析により精製した。次いで、精製した試料を管へ移し48時間凍結乾燥した。コンジュゲートは使用時まで-20℃で保存した。
実施例8:Pt-MMAナノエマルジョン製剤の調製
この水中油型ナノエマルジョンの油相を次のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にPtモノミリスタート(Pt-MMA)を20.8mg溶解した。20.8mgのPt-MMAは、誘導結合プラズマ質量(ICP-MS)分析に基づきシスプラチン5mgに相当する。ICP-MSは質量分析法の一種であり、誘導結合プラズマで試料をイオン化し、次いで質量分析器を用いてイオンを分離および定量することにより金属およびいくつかの非金属を検出することが可能である。亜麻仁油(1g)をシンチレーションガラスバイアルに入れた。Pt-MMA溶液を加え試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの油相を次のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にPtモノミリスタート(Pt-MMA)を20.8mg溶解した。20.8mgのPt-MMAは、誘導結合プラズマ質量(ICP-MS)分析に基づきシスプラチン5mgに相当する。ICP-MSは質量分析法の一種であり、誘導結合プラズマで試料をイオン化し、次いで質量分析器を用いてイオンを分離および定量することにより金属およびいくつかの非金属を検出することが可能である。亜麻仁油(1g)をシンチレーションガラスバイアルに入れた。Pt-MMA溶液を加え試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの水相は次のように調製した。注射用水中で作製したガラスシンチレーションバイアル内の2.21% w/vグリセロール(Sigma)溶液4mlに、卵レシチン(Lipoid E 80, Lipoid GMBH, Ludwigshafen, Germany)を120mg、PEG2000DSPE(Genzyme, Cambridge, MA)を15mg加えた。混合物を1時間撹拌(400rpm)して、これら賦形剤の完全な溶解を達成した。
上の工程からの水相および油相を水浴中で60℃まで2分間加熱し、水相を油相に加え、1分間ボルテックス混合した。得られた混合物を25,000psiで10サイクルにわたってLV1マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp., Newton, MA)に通過させた。生成物は、注入漕(inlet reservoir)を経てマイクロフルイダイザーシステムに導入され、高圧ポンプによって動力を得て400m/sまでの速度で相互作用室(interaction chamber)に供給された。次いで、出力漕(output reservoir)内で効果的に冷却および採取された。
これらの工程により、安定したシス-ジアミンPt(II)クロリドモノミリスチン酸(Pt-MMA)ナノエマルジョン製剤またはナノエマルジョンが製造された。
実施例9:シス-ジアミンPt(II)クロリドモノパルミチン酸Pt-MPAナノエマルジョンの調製
この水中油型ナノエマルジョンの油相を以下のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にPtモノパルミチン酸(Pt-MPA)(20.8mg、ICP-MS分析に基づきシスプラチン5mgに相当)を溶解した。Pt-MPA溶液を加えたシンチレーションガラスバイアルに亜麻仁油(1g)を秤量して入れた。次いで試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの油相を以下のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にPtモノパルミチン酸(Pt-MPA)(20.8mg、ICP-MS分析に基づきシスプラチン5mgに相当)を溶解した。Pt-MPA溶液を加えたシンチレーションガラスバイアルに亜麻仁油(1g)を秤量して入れた。次いで試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの水相は次のように調製した。注射用水中で作製したガラスシンチレーションバイアル内の2.21% w/vグリセロール(Sigma)溶液4mlに、卵レシチン(Lipoid E 80, Lipoid GMBH)を120mgおよびPEG2000DSPE(Genzyme)を15mg加えた。混合物を1時間撹拌(400rpm、Corning Stirrer plate)して、これら賦形剤の完全な溶解を達成した。
上の工程からの水相および油相を水浴中で60℃まで2分間加熱し、次いで水相を油相に加え、1分間ボルテックス混合した。得られた混合物を25,000psiで10サイクルにわたってLV1マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp.)に通過させ、安定したシス-ジアミンPt(II)クロリドモノパルミチン酸Pt-MPAナノエマルジョンが製造された。
実施例10:シス-ジアミンPt(II)クロリドモノステアリン酸(Pt-MSA)ナノエマルジョンの調製
この水中油型ナノエマルジョンの油相を次のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にPtモノミリスタート(Pt-MSA)(20.8mg、ICP-MS分析に基づきシスプラチン5mgに相当)を溶解した。亜麻仁油(1g)をシンチレーションガラスバイアルに秤量して入れた。Pt-MSA溶液を亜麻仁油に加え、試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの油相を次のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にPtモノミリスタート(Pt-MSA)(20.8mg、ICP-MS分析に基づきシスプラチン5mgに相当)を溶解した。亜麻仁油(1g)をシンチレーションガラスバイアルに秤量して入れた。Pt-MSA溶液を亜麻仁油に加え、試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの水相は次のように調製した。注射用水中で作製したガラスシンチレーションバイアル内の2.21% w/vグリセロール(Sigma)溶液4mlに、卵レシチン(Lipoid E 80, Lipoid GMBH)を120mg、PEG2000DSPE(Genzyme)を15mg加えた。混合物を1時間撹拌(400rpm)して、これら賦形剤の完全な溶解を達成した。
上の工程からの水相および油相を水浴中で60℃まで2分間加熱し、次いで水相を油相に加え、1分間ボルテックス混合した。得られた混合物を25,000psiで10サイクルにわたってLV1マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp.)に通過させ、安定したシス-ジアミンPt(II)クロリドモノステアリン酸(Pt-MSA)ナノエマルジョンが製造された。
実施例11:ジアミノシクロヘキサン白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)ナノエマルジョンの調製
この水中油型ナノエマルジョンの油相を次のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にジアミノシクロヘキサン(DACH)白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)(10mg)を溶解した。亜麻仁油(1g)をシンチレーションガラスバイアルに秤量して入れた。Pt-SA溶液を亜麻仁油に加え、試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの油相を次のように調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム(超脱水)にジアミノシクロヘキサン(DACH)白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)(10mg)を溶解した。亜麻仁油(1g)をシンチレーションガラスバイアルに秤量して入れた。Pt-SA溶液を亜麻仁油に加え、試料に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを蒸発させ油相を形成した。
この水中油型ナノエマルジョンの水相は次のように調製した。注射用水中で作製したガラスシンチレーションバイアル内の2.21% w/vグリセロール(Sigma)溶液4mlに、卵レシチン(Lipoid E 80, Lipoid GMBH)を120mg、PEG2000DSPE(Genzyme)を15mg加えた。混合物を1時間撹拌(400rpm、Corning Stirrer plate)して、これら賦形剤の完全な溶解を達成した。
上の工程からの水相および油相を水浴上で60℃まで2分間加熱し、次いで水相を油相に加え、1分間ボルテックスした。得られた混合物を25,000psiで10サイクルにわたってLV1マイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp.)に通過させ、液滴のサイズが150nm未満であるPt-SA製剤が製造された。
実施例12:細胞取り込み試験
次のアッセイは、標的化ナノエマルジョン製剤が細胞の取り込みに対して有する効果を実証している。取り込みは蛍光を用いて卵巣SKOV3細胞において測定した。6ウェルプレートにおいてカバーグラス上で3000個/ウェルに増殖させたSKOV3細胞を、蛍光標識ナノエマルジョン製剤と共に5分間、15分間、および30分間培養した。培養期間の終わりに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄し、細胞のリソソームおよび核をそれぞれ染色するLyso TrackerおよびDAPIと共に10分間培養した。細胞をPBSでさらに洗浄し、上下を反転し、フルオロマウントG封入媒体を用いてスライドガラスにマウントした。
次のアッセイは、標的化ナノエマルジョン製剤が細胞の取り込みに対して有する効果を実証している。取り込みは蛍光を用いて卵巣SKOV3細胞において測定した。6ウェルプレートにおいてカバーグラス上で3000個/ウェルに増殖させたSKOV3細胞を、蛍光標識ナノエマルジョン製剤と共に5分間、15分間、および30分間培養した。培養期間の終わりに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄し、細胞のリソソームおよび核をそれぞれ染色するLyso TrackerおよびDAPIと共に10分間培養した。細胞をPBSでさらに洗浄し、上下を反転し、フルオロマウントG封入媒体を用いてスライドガラスにマウントした。
本開示に係るナノエマルジョン製剤で処理した蛍光標識SKOV3細胞のDIC/蛍光画像を、63倍油浸対物レンズを備えたConfocal Zeiss LSM 700顕微鏡を用いて30分間にわたって取得した。
図15A〜15Fは、非標的化ナノエマルジョン製剤(図15A〜15C)およびEGFR標的化ナノエマルジョン製剤(図15D〜15F)の細胞取り込みを示す。0.01% w/vの0.01%NBD-セラミドをすべての製剤中に組み込んだ。0.02%EGFRを標的化製剤内に組み込んだ。Lyso TrackerおよびDAPIを使用してSKOV3細胞におけるナノエマルジョン製剤の共局在化をモニタリングした。
これらの画像は、NBD-CER(矢印)がLyso Trackerと共に共局在化したことを示し、リソソーム内にNBD-CERが入ったことを表している。この試験は、本開示のナノエマルジョン製剤が薬剤分解性のリソソーム経路を回避でき、これによりインビトロで細胞中の薬剤濃度を向上させることを実証している。
実施例13:ナノエマルジョン製剤の有効性
本開示に係るナノエマルジョン製剤が細胞毒性効果を発揮するかどうかを判断するために、SKOV3細胞で次の実験を行った。
本開示に係るナノエマルジョン製剤が細胞毒性効果を発揮するかどうかを判断するために、SKOV3細胞で次の実験を行った。
テトラゾリウム(MTT)色素を不溶性フォルマザンまで還元する細胞酵素の活性を測定するMTTアッセイを実施した。下記表VIに示す対応する試験ナノエマルジョンまたは対照溶液でSKOV3細胞を処理した。細胞毒性についての陽性対照としてポリエチレンイミンを50μg/ml使用した。卵巣SKOV3細胞の生存能力に対するシス-Pt溶液、ナノエマルジョン製剤、および本開示のEGFR標的化ナノエマルジョン製剤の効果を72時間の処理後に試験および測定した。処理の完了後、MTT試薬(50μg/ウェル)と共に細胞を2時間培養した。得られたフォルマザン結晶をジメチルスルホキシド(150μg/ウェル)に溶解し、プレートリーダー(Synergy HT, Biotek Instruments, Winooski, VT)内で570nmで測定した。
増殖を50パーセント阻害する薬剤濃度は50%増殖阻害濃度(IC50)として公知である。用量反応曲線(図示せず)を用いてIC50値を算出し、表VIに示す。値は平均±SD、n=8として示す。IC50値はすべてGraphpad Prism 5科学データ解析ソフトウェアを用いてMTTアッセイ結果を分析することにより取得した。
本開示のナノエマルジョン製剤において組み合わせた複数の化学療法剤の至適濃度は、単一の薬剤の用量反応曲線から併用指数を算出することにより決定することができる(Chou (2006) Pharmacol. Rev. 58(3):621-681)。この方法は下記のアイソボログラム方程式を用いて併用指数(CI)を決定する:
CI=(a/A)+(b/B)
式中「a」は、濃度が「b」である第二治療剤と組み合せた第一治療剤のIC50である。「A」は第二治療剤を含まない第一治療剤のIC50であり;「B」は第一治療剤の非存在下での第二治療剤のIC50である。CIは、メカニズムにかかわらず2つの薬剤間の相互作用の度合いを表す。1.0未満のCI値は相乗作用を示す一方で、1.0を超えるCI値は薬剤が拮抗薬であることを示す。もし薬剤が相乗的であれば、同じ効果を得るのに必要とされる相対的な用量は減少し、これは「用量減少指数(dose reduction index)」(DRI)として理解される。DRIは、各薬剤単独での濃度と比較した相乗的組み合わせについての薬剤濃度の減少の指標である。
CI=(a/A)+(b/B)
式中「a」は、濃度が「b」である第二治療剤と組み合せた第一治療剤のIC50である。「A」は第二治療剤を含まない第一治療剤のIC50であり;「B」は第一治療剤の非存在下での第二治療剤のIC50である。CIは、メカニズムにかかわらず2つの薬剤間の相互作用の度合いを表す。1.0未満のCI値は相乗作用を示す一方で、1.0を超えるCI値は薬剤が拮抗薬であることを示す。もし薬剤が相乗的であれば、同じ効果を得るのに必要とされる相対的な用量は減少し、これは「用量減少指数(dose reduction index)」(DRI)として理解される。DRIは、各薬剤単独での濃度と比較した相乗的組み合わせについての薬剤濃度の減少の指標である。
本開示のナノエマルジョン製剤について、PtのIC50を減少できる比を特定するためにPt:CERの比を決定した。表VIIは、セラミドとPt-MMAまたはPt-MPAとの組み合わせについてのCIおよびDRIを示す。
表VII中のデータは、癌細胞を死滅させる際にMMA-PtおよびMPA-Ptの両方がCERと相乗的に作用することを証明している。算出したPt(II)錯体:CER比に関し、1:5であるのがインビトロ細胞毒性についておよび安定したPt/CERナノエマルジョン製剤の形成のために最も適していると決定した。
本開示に係るナノエマルジョン製剤がインビボで癌に対する治療効果をもたらすかどうかを判断するために、次の実験を行った。それぞれ体重がおよそ20gの雌Nu/Nuマウス(Charles River Laboratories, Cambridge, MA)30匹において同所性の腫瘍を発症させた。マウスにはリン酸緩衝生理食塩水100μl PBSに懸濁した4×106 SKOV3ヒト卵巣癌細胞(ATCC, Manassas, VA)を腹腔内(ip)注射した。マウス30匹を10匹ずつのマウスからなる3つの試験群に分けた。次いで各マウスに何も投与しない(対照群)かまたは2つの試験化合物のうちの1つを7日毎に5週間投薬した。第1の試験化合物(シスプラチン)は比較試料として5mg/kgの投薬量で投与した。第2の試験化合物(Pt-MMAおよびセラミドをモル比1:5で含有するEGFR標的化ナノエマルジョン製剤)は、5mg/kgの白金を3サイクルおよび7.5mg/kgの白金をさらに2サイクル投与した。動物に同等量のPtを与えられるようにPt-MMAの用量(21mg/kg)およびシスプラチンの用量(5mg/kg)を算出した。Graphpad Kaplan-Meyers生存率解析ソフトウェアを用いて、各マウスの観察された生存期間に基づいて各群のマウスの生存期間を決定しかつ生存期間(日)の中央値を算出した。結果を表VIIIおよび図16に示す。
これらの結果は、本開示のEGFR標的化ナノエマルジョン製剤で治療した群の生存率は、対照群および遊離シスプラチン群のそれと比較して、生存期間中央値が有意に改善したことを示す。標的化ナノエマルジョン製剤にPt-MMAおよびセラミドを封入することでこれらを正常細胞から隔離し治療に関連する全身毒性を減少させる一方で、Pt-MMAとセラミドとの組み合わせがなおも腫瘍における癌細胞の分裂を阻害することができる。よって、標的指向性リガンドが存在する本開示のナノエマルジョン製剤は抗癌送達システムとして有用である。癌細胞の分裂を阻害するように機能しつつ全身毒性を減少したこのナノエマルジョン製剤は、より効率的な化学療法剤送達システムを可能にする。
本開示に係るナノエマルジョン製剤の油性コアの一部としてのPt-MMAおよびセラミドの封入ならびにEGFRを標的とする修飾脂質の組み込みが、ナノエマルジョン製剤の界面膜の両親媒性物質に標的指向性部分を付加することを可能にした。
実施例14:ナノエマルジョン製剤のインビボ薬物動態試験
Gdで標識されPt(II)錯体を含有する本開示のナノエマルジョン製剤の薬物動態(PK)を確認するために次の試験を行った。
Gdで標識されPt(II)錯体を含有する本開示のナノエマルジョン製剤の薬物動態(PK)を確認するために次の試験を行った。
EGFR標的化Gd標識Pt-MMAまたは非標的化Gd標識Pt-MMAをPtが21mg/kgおよびGdが0.072mM/kgとなるようにiv投与経路で非腫瘍形成雌Nu/Nuマウスに投与した。血液試料を24時間にわたって採取し、有効性が検証されたICP-MS法を用いてPtおよびGdについて調査した。
図17は、血漿Pt薬物動態(PK)のレベルがシスプラチンのものと比べて顕著に向上したことを示す。GdおよびPt濃度対時間プロファイルは互いに近接した軌跡を描き、ナノエマルジョンが長期間無変化でありかつ機能的であり続けることを示している。
表IXは、iv投与後の非標的化(NT)ナノエマルジョン製剤対標的化(T)ナノエマルジョン製剤(Gd(0.072mmol/kgまたは11.322mg/kg)およびPt(5mg/kg))の非区画化薬物動態プロファイルを示す。この表ではivで送達および投与されたPt/GdのPKプロファイルの向上が際立っている。薬物動態パラメータは、Phoenix WinNonlin 6.2バージョンを用いた非区画化分析によって算出した。i.p.試験では、PtおよびGdのいずれについても血中濃度が3時間でピークを迎えかつi.v.治療マウスとほぼ同一の値で終了するという同様の結果を示した。すべてのパラメータが、NMI-300およびNMI-300(NT)はいずれも長期に循環しかつ無変化であり続けることを示唆している。シスプラチンの公表値(5.1時間)およびカルボプラチンの公表値(0.84時間)と比べてPtの半減期が有意に増加している。
実施例15:Gd標識ナノエマルジョン製剤を用いたインビボMRI試験
Gd系MRIコントラスト剤が本開示に係るナノエマルジョン製剤において有用であることを次のように証明した。
Gd系MRIコントラスト剤が本開示に係るナノエマルジョン製剤において有用であることを次のように証明した。
それぞれ体重がおよそ20gであり、およそ200mm〜300mmの大きさの皮下SKOV3腫瘍(ヒト卵巣癌細胞、American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA))を有する雌Nu/Nuマウス (Charles River Laboratories, Cambridge, MA)3匹を試験対象として用いた。1匹目のマウスに、ガドリニウム系MRIコントラスト剤Gd-DTPA-PE(マグネビスト(商標))を0.072mmol/kgの用量で含有するガドペンテト酸を静脈注射した。2匹目のマウスに、ガドリニウム系MRIコントラスト剤Gd-DTPA-PEを0.072mmol/kgの用量で含有する本開示の非標的化Gd標識ナノエマルジョン製剤を静脈注射した。3匹目のマウスに、ガドリニウム系MRIコントラスト剤Gd-DTPA-PEを0.072mmol/kgの用量で含有する本開示のEGFR標的化ナノエマルジョン製剤を静脈注射した。3匹のマウスはすべて24時間にわたりBruker Biospec 20/70 MRI機器を用いて全身を走査および撮像した。
マグネビスト(商標)(マグネビスト(商標))を注射したマウス、非標的化ナノエマルジョン製剤を注射したマウス(Non-Targeted)、およびEGFR標的化ナノエマルジョン製剤を注射したマウス(Targeted)の得られたMRI画像を図18に見ることができる。これらの写真は、皮下側面SKOV3腫瘍における対照造影剤マグネビスト(商標)のものと比べた本開示のGd含有ナノエマルジョン製剤の優先的な蓄積を示す。マグネビスト(商標)対照は2時間〜4時間の間腫瘍のコントラストの向上を示すが、本開示のGd標識した標的化および非標的化ナノエマルジョン製剤は、6時間〜24時間の間腫瘍のコントラストの向上を示すことが観察された。マグネビスト(商標)対照は開始1時間で腫瘍に速やかに蓄積されたが、その後排除され6時間後までに基準値近くまで分解された。対照的に、本開示のナノエマルジョン製剤は、より長期間にわたって腫瘍に蓄積および残留して腫瘍の画像の画質を向上し、これによって腫瘍の画像の画質が向上された。
この研究は、本開示のGd含有ナノエマルジョン製剤が有用なMRI剤であり、純粋な造影剤マグネビスト(商標)よりも長期間にわたって腫瘍の撮像に有効であることを示している。加えて、これらの腫瘍画像は腫瘍におけるPt錯体ナノエマルジョン製剤の蓄積を測定するために使用することができる。
均等物
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書において具体的に記載した特定の態様に対する多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されている。
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書において具体的に記載した特定の態様に対する多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されている。
さらに別の局面では、本開示は、癌細胞に対して毒性がある、および/または癌細胞の増殖を阻害するかもしくは癌細胞を死滅させる量の本明細書に係るナノエマルジョン製剤に癌細胞を接触させる工程を含む、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる方法を提供する。いくつかの態様では、癌細胞は哺乳動物中にあり、ナノエマルジョンは治療有効量で該哺乳動物に投与される。
[本発明1001]
油相と;
界面膜と;
水相と;
カルボプラチンでも、シスプラチンでも、白金のジ脂肪酸誘導体でもない疎水性白金誘導体を含み、該油相中に分散している化学療法剤と
を含む、ナノエマルジョン製剤。
[本発明1002]
油相が、亜麻仁油、オメガ3多価不飽和魚油、オメガ6多価不飽和魚油、サフラワー油、オリーブ油、松果油、チェリーカーネル油、大豆油、カボチャ油、ザクロ油、サクラソウ油、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1003]
界面膜相が、乳化剤および/または安定剤を含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1004]
乳化剤が、卵レシチン、卵ホスファチジルコリン、大豆レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン、水酸化ジミリストイルホスファチジルエチル-N-ジメチルプロピルアンモニウム、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1003のナノエマルジョン製剤。
[本発明1005]
安定剤が、ポリエチレングリコール誘導体、ホスファチド、モノオレイン酸ポリグリセロール、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1003のナノエマルジョン製剤。
[本発明1006]
ポリエチレングリコール誘導体が、PEG 2000 DSPE、PEG 5000 DSPE、またはこれらの組み合わせである、本発明1005のナノエマルジョン製剤。
[本発明1007]
ポリエチレングリコール誘導体中のポリエチレングリコールが、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDの分子量を有する、本発明1005のナノエマルジョン。
[本発明1008]
疎水性白金誘導体が、白金(II)モノ脂肪酸錯体を含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1009]
白金(II)モノ脂肪酸錯体が、Pt-MMA、Pt-MPA、Pt-MSA、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1008のナノエマルジョン製剤。
[本発明1010]
疎水性白金誘導体が、ジアミノシクロヘキサン(DACH)白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)を含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1011]
化学増強剤(chemopotentiator)をさらに含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1012]
化学増強剤が、セラミドまたはその誘導体を含む、本発明1011のナノエマルジョン製剤。
[本発明1013]
化学増強剤が、C6-セラミドを含む、本発明1012のナノエマルジョン製剤。
[本発明1014]
C6-セラミドをさらに含む、本発明1008のナノエマルジョン製剤。
[本発明1015]
化学増強剤がC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体がPt-MMAを含む、本発明1014のナノエマルジョン製剤。
[本発明1016]
C6-セラミドおよびPt-MMAが、0.1〜0.9の併用指数(combination index)を有する、本発明1015のナノエマルジョン製剤。
[本発明1017]
C6-セラミドおよびPt-MMAが、0.3326の併用指数を有する、本発明1015のナノエマルジョン製剤。
[本発明1018]
化学増強剤がC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体がPt-MPAを含む、本発明1014のナノエマルジョン製剤。
[本発明1019]
C6-セラミドおよびPt-MPAが、0.1〜0.9の併用指数を有する、本発明1018のナノエマルジョン製剤。
[本発明1020]
C6-セラミドおよびPt-MPAが、0.5746の併用指数を有する、本発明1019のナノエマルジョン製剤。
[本発明1021]
標的指向性リガンドをさらに含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1022]
標的指向性リガンドが、EGFR標的指向性リガンド、葉酸受容体標的指向性リガンド、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1021のナノエマルジョン製剤。
[本発明1023]
標的指向性リガンドが、ペプチド4、抗EGFR免疫グロブリンもしくはそのEGFR結合フラグメント、EGa1-PEG、またはこれらの組み合わせを含むEGFR標的指向性リガンドである、本発明1022のナノエマルジョン製剤。
[本発明1024]
標的指向性リガンドが、DSPE-PEG-システイン-葉酸、DSPE-PEG(2000)葉酸、DSPE-PEG(5000)葉酸、抗葉酸受容体免疫グロブリンもしくはその葉酸受容体結合フラグメント、またはこれらの組み合わせを含む葉酸標的指向性リガンドである、本発明1023のナノエマルジョン製剤。
[本発明1025]
標的指向性リガンドEGa1-PEG中のPEGが、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDの分子量を有する、本発明1023のナノエマルジョン製剤。
[本発明1026]
造影剤をさらに含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1027]
造影剤が、MRIコントラスト部分である、本発明1026のナノエマルジョン製剤。
[本発明1028]
MRIコントラスト部分が、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金、マンガン、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1027のナノエマルジョン製剤。
[本発明1029]
MRIコントラスト部分が、Gd-DTPA-PE、Gd-DOTA-PE、Gd-PAP-DOTA、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1028のナノエマルジョン製剤。
[本発明1030]
癌を有する患者に該癌を撮像するのに十分な量の本発明1026のナノエマルジョン製剤を投与する工程を含む、患者における癌を撮像する方法。
[本発明1031]
癌細胞に対して毒性があるかまたは癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる量の本発明1001のナノエマルジョン製剤に癌細胞を接触させる工程を含む、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる方法。
[本発明1032]
前記癌細胞が哺乳動物中にあり、前記接触させる工程が治療有効量の本発明1001のナノエマルジョン製剤を該哺乳動物に投与することを含む、本発明1031の方法。
[本発明1001]
油相と;
界面膜と;
水相と;
カルボプラチンでも、シスプラチンでも、白金のジ脂肪酸誘導体でもない疎水性白金誘導体を含み、該油相中に分散している化学療法剤と
を含む、ナノエマルジョン製剤。
[本発明1002]
油相が、亜麻仁油、オメガ3多価不飽和魚油、オメガ6多価不飽和魚油、サフラワー油、オリーブ油、松果油、チェリーカーネル油、大豆油、カボチャ油、ザクロ油、サクラソウ油、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1003]
界面膜相が、乳化剤および/または安定剤を含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1004]
乳化剤が、卵レシチン、卵ホスファチジルコリン、大豆レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン、水酸化ジミリストイルホスファチジルエチル-N-ジメチルプロピルアンモニウム、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1003のナノエマルジョン製剤。
[本発明1005]
安定剤が、ポリエチレングリコール誘導体、ホスファチド、モノオレイン酸ポリグリセロール、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1003のナノエマルジョン製剤。
[本発明1006]
ポリエチレングリコール誘導体が、PEG 2000 DSPE、PEG 5000 DSPE、またはこれらの組み合わせである、本発明1005のナノエマルジョン製剤。
[本発明1007]
ポリエチレングリコール誘導体中のポリエチレングリコールが、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDの分子量を有する、本発明1005のナノエマルジョン。
[本発明1008]
疎水性白金誘導体が、白金(II)モノ脂肪酸錯体を含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1009]
白金(II)モノ脂肪酸錯体が、Pt-MMA、Pt-MPA、Pt-MSA、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1008のナノエマルジョン製剤。
[本発明1010]
疎水性白金誘導体が、ジアミノシクロヘキサン(DACH)白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)を含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1011]
化学増強剤(chemopotentiator)をさらに含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1012]
化学増強剤が、セラミドまたはその誘導体を含む、本発明1011のナノエマルジョン製剤。
[本発明1013]
化学増強剤が、C6-セラミドを含む、本発明1012のナノエマルジョン製剤。
[本発明1014]
C6-セラミドをさらに含む、本発明1008のナノエマルジョン製剤。
[本発明1015]
化学増強剤がC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体がPt-MMAを含む、本発明1014のナノエマルジョン製剤。
[本発明1016]
C6-セラミドおよびPt-MMAが、0.1〜0.9の併用指数(combination index)を有する、本発明1015のナノエマルジョン製剤。
[本発明1017]
C6-セラミドおよびPt-MMAが、0.3326の併用指数を有する、本発明1015のナノエマルジョン製剤。
[本発明1018]
化学増強剤がC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体がPt-MPAを含む、本発明1014のナノエマルジョン製剤。
[本発明1019]
C6-セラミドおよびPt-MPAが、0.1〜0.9の併用指数を有する、本発明1018のナノエマルジョン製剤。
[本発明1020]
C6-セラミドおよびPt-MPAが、0.5746の併用指数を有する、本発明1019のナノエマルジョン製剤。
[本発明1021]
標的指向性リガンドをさらに含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1022]
標的指向性リガンドが、EGFR標的指向性リガンド、葉酸受容体標的指向性リガンド、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1021のナノエマルジョン製剤。
[本発明1023]
標的指向性リガンドが、ペプチド4、抗EGFR免疫グロブリンもしくはそのEGFR結合フラグメント、EGa1-PEG、またはこれらの組み合わせを含むEGFR標的指向性リガンドである、本発明1022のナノエマルジョン製剤。
[本発明1024]
標的指向性リガンドが、DSPE-PEG-システイン-葉酸、DSPE-PEG(2000)葉酸、DSPE-PEG(5000)葉酸、抗葉酸受容体免疫グロブリンもしくはその葉酸受容体結合フラグメント、またはこれらの組み合わせを含む葉酸標的指向性リガンドである、本発明1023のナノエマルジョン製剤。
[本発明1025]
標的指向性リガンドEGa1-PEG中のPEGが、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDの分子量を有する、本発明1023のナノエマルジョン製剤。
[本発明1026]
造影剤をさらに含む、本発明1001のナノエマルジョン製剤。
[本発明1027]
造影剤が、MRIコントラスト部分である、本発明1026のナノエマルジョン製剤。
[本発明1028]
MRIコントラスト部分が、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金、マンガン、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1027のナノエマルジョン製剤。
[本発明1029]
MRIコントラスト部分が、Gd-DTPA-PE、Gd-DOTA-PE、Gd-PAP-DOTA、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1028のナノエマルジョン製剤。
[本発明1030]
癌を有する患者に該癌を撮像するのに十分な量の本発明1026のナノエマルジョン製剤を投与する工程を含む、患者における癌を撮像する方法。
[本発明1031]
癌細胞に対して毒性があるかまたは癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる量の本発明1001のナノエマルジョン製剤に癌細胞を接触させる工程を含む、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる方法。
[本発明1032]
前記癌細胞が哺乳動物中にあり、前記接触させる工程が治療有効量の本発明1001のナノエマルジョン製剤を該哺乳動物に投与することを含む、本発明1031の方法。
Claims (32)
- 油相と;
界面膜と;
水相と;
カルボプラチンでも、シスプラチンでも、白金のジ脂肪酸誘導体でもない疎水性白金誘導体を含み、該油相中に分散している化学療法剤と
を含む、ナノエマルジョン製剤。 - 油相が、亜麻仁油、オメガ3多価不飽和魚油、オメガ6多価不飽和魚油、サフラワー油、オリーブ油、松果油、チェリーカーネル油、大豆油、カボチャ油、ザクロ油、サクラソウ油、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 界面膜相が、乳化剤および/または安定剤を含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 乳化剤が、卵レシチン、卵ホスファチジルコリン、大豆レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン、水酸化ジミリストイルホスファチジルエチル-N-ジメチルプロピルアンモニウム、またはこれらの組み合わせを含む、請求項3に記載のナノエマルジョン製剤。
- 安定剤が、ポリエチレングリコール誘導体、ホスファチド、モノオレイン酸ポリグリセロール、またはこれらの組み合わせを含む、請求項3に記載のナノエマルジョン製剤。
- ポリエチレングリコール誘導体が、PEG2000DSPE、PEG5000DSPE、またはこれらの組み合わせである、請求項5に記載のナノエマルジョン製剤。
- ポリエチレングリコール誘導体中のポリエチレングリコールが、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDの分子量を有する、請求項5に記載のナノエマルジョン。
- 疎水性白金誘導体が、白金(II)モノ脂肪酸錯体を含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 白金(II)モノ脂肪酸錯体が、Pt-MMA、Pt-MPA、Pt-MSA、またはこれらの組み合わせを含む、請求項8に記載のナノエマルジョン製剤。
- 疎水性白金誘導体が、ジアミノシクロヘキサン(DACH)白金-3,5ジヨードサリチラート(Pt-SA)を含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 化学増強剤(chemopotentiator)をさらに含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 化学増強剤が、セラミドまたはその誘導体を含む、請求項11に記載のナノエマルジョン製剤。
- 化学増強剤が、C6-セラミドを含む、請求項12に記載のナノエマルジョン製剤。
- C6-セラミドをさらに含む、請求項8に記載のナノエマルジョン製剤。
- 化学増強剤がC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体がPt-MMAを含む、請求項14に記載のナノエマルジョン製剤。
- C6-セラミドおよびPt-MMAが、0.1〜0.9の併用指数(combination index)を有する、請求項15に記載のナノエマルジョン製剤。
- C6-セラミドおよびPt-MMAが、0.3326の併用指数を有する、請求項15に記載のナノエマルジョン製剤。
- 化学増強剤がC6-セラミドを含み、かつ白金誘導体がPt-MPAを含む、請求項14に記載のナノエマルジョン製剤。
- C6-セラミドおよびPt-MPAが、0.1〜0.9の併用指数を有する、請求項18に記載のナノエマルジョン製剤。
- C6-セラミドおよびPt-MPAが、0.5746の併用指数を有する、請求項19に記載のナノエマルジョン製剤。
- 標的指向性リガンドをさらに含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 標的指向性リガンドが、EGFR標的指向性リガンド、葉酸受容体標的指向性リガンド、またはこれらの組み合わせを含む、請求項21に記載のナノエマルジョン製剤。
- 標的指向性リガンドが、ペプチド4、抗EGFR免疫グロブリンもしくはそのEGFR結合フラグメント、EGa1-PEG、またはこれらの組み合わせを含むEGFR標的指向性リガンドである、請求項22に記載のナノエマルジョン製剤。
- 標的指向性リガンドが、DSPE-PEG-システイン-葉酸、DSPE-PEG(2000)葉酸、DSPE-PEG(5000)葉酸、抗葉酸受容体免疫グロブリンもしくはその葉酸受容体結合フラグメント、またはこれらの組み合わせを含む葉酸標的指向性リガンドである、請求項23に記載のナノエマルジョン製剤。
- 標的指向性リガンドEGa1-PEG中のPEGが、1kD〜20kD、5kD〜20kD、または10kD〜20kDの分子量を有する、請求項23に記載のナノエマルジョン製剤。
- 造影剤をさらに含む、請求項1に記載のナノエマルジョン製剤。
- 造影剤が、MRIコントラスト部分である、請求項26に記載のナノエマルジョン製剤。
- MRIコントラスト部分が、ガドリニウム、酸化鉄、鉄白金、マンガン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項27に記載のナノエマルジョン製剤。
- MRIコントラスト部分が、Gd-DTPA-PE、Gd-DOTA-PE、Gd-PAP-DOTA、またはこれらの組み合わせを含む、請求項28に記載のナノエマルジョン製剤。
- 癌を有する患者に該癌を撮像するのに十分な量の請求項26に記載のナノエマルジョン製剤を投与する工程を含む、患者における癌を撮像する方法。
- 癌細胞に対して毒性があるかまたは癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる量の請求項1に記載のナノエマルジョン製剤に癌細胞を接触させる工程を含む、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を死滅させる方法。
- 前記癌細胞が哺乳動物中にあり、前記接触させる工程が治療有効量の請求項1に記載のナノエマルジョン製剤を該哺乳動物に投与することを含む、請求項31に記載の方法。
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2014
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