JP2016529256A - 疼痛を制御するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年8月14日出願の米国仮特許出願第61/865,962号の利益を主張し、この出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号NS080954のもとで、政府支援により行われたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
1次侵害受容器とは、通常の及び病理学的な疼痛を調節する複雑な疼痛処理系における1次ニューロンである。研究及び治療の目的でこれらのニューロンを興奮させる及び阻害する能力は、薬理学的及び電気的刺激の制約によって制限されてきた;従って、自由に移動している動物における侵害受容器の非侵襲的、空間的局在制御は、不可能であった。
Liske et al. (2013) Muscle & Nerve 47:916(非特許文献1);Llewellyn et al. (2010) Nature Med. 16:1161(非特許文献2);Ji et al. (2012) PLoS One 7:e32699(非特許文献3);Wang and Zylka (2009) J. Neurosci. 29:13020(非特許文献4);Daou et al. (2012) Soc. Neurosci. Conf. 575.06/II11(非特許文献5);Daou et al. (2013) J. Neurosci. 33:47(非特許文献6);Mourot et al. (2012) Nat. Methods 9:396(非特許文献7);Kokel et al. (2013) Nat. Chem. Biol. 9:257(非特許文献8);Mattis et al. (2012) Nat. Methods 9:159(非特許文献9);Williams and Denison (2013) Sci. Transl. Med. 5:177ps6(非特許文献10);Chow and Boyden (2013) Sci. Transl. Med. 5:177ps5(非特許文献11);Towne et al. (2010) Gene Ther. 17:141(非特許文献12);Towne et al. (2009) Mol. Pain 5:52(非特許文献13);Iyer et al. (2014) Nat. Biotech. 32:3(非特許文献14)。
本開示は、疼痛を制御するための組成物及び方法を提供する。本開示は、疼痛を制御する薬剤を同定する方法を提供する。
本開示は、個体における疼痛を制御する方法を特徴とし、この方法は、個体の侵害受容器へと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の過分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。場合によっては、光は、経皮的に送達される。場合によっては、オプシンは、SEQ ID NO:1、3、4、6、15、及び16のうち1つに対して少なくとも約75%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、疼痛は、神経障害性疼痛である。場合によっては、オプシンをコードするヌクレオチドを含む核酸は、神経への注射により、筋肉注射により、または静脈注射により個体に投与される。場合によっては、核酸は、処置部位(例えば、疼痛の部位)にまたはその近傍にて個体に投与される。場合によっては、核酸は組換え発現ベクターであり、例えば、組換え発現ベクターはウイルスベクターである。場合によっては、組換え発現ベクターがウイルスベクターである場合、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。場合によっては、AAVベクターは、AAV6ベクターまたはAAV8ベクターである。ヌクレオチド配列は、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結可能である。例えば、プロモーターは、シナプシン−Iプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、またはカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIIα(CAMKIIα)プロモーターであり得る。個体は、哺乳動物;例えばヒト、ラット、またはマウスであり得る。場合によっては、オプシンの活性化は、疼痛の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%の低減を提供する。場合によっては、オプシンの活性化は、疼痛の100%の低減を提供する、すなわち、個体は実質的に疼痛を感じなくなる。
本明細書で使用する場合、「個体」、「対象」、または「患者」は、動物、例えば、ヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物としては、有蹄動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ亜科動物、ヒツジ属、非ヒト霊長類、ウサギ目動物、並びにげっ歯類(例えば、マウス及びラット)が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、個体はヒトである。別の態様では、個体は非ヒト哺乳動物である。
本開示は、個体における疼痛を制御するための組成物及び方法を提供する。本開示は、疼痛を制御する薬剤を同定する方法を提供する。
本開示は、個体における疼痛を制御するための組成物及び方法を提供する。場合によっては、本開示による疼痛を制御する方法は概して、個体のニューロンへと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み;このような方法は、疼痛の軽減を提供する。核酸をニューロン(例えば、小径または大径1次求心性ニューロンなどの1次求心性ニューロン;例えば、侵害受容器)に導入すると、オプシンがニューロンで産生されて、オプシンは細胞膜へと挿入される。「オプシン」、「光応答性タンパク質」、「光応答性ポリペプチド」、「光活性化タンパク質」、及び「光活性化ポリペプチド」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。
上述のように、本開示による疼痛を制御する方法は概して、個体のニューロンへと、光活性化ポリペプチドを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供する光活性化ポリペプチド(オプシン)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。光活性化ポリペプチドは、該タンパク質が活性化波長の光で照射された時に1つ以上のイオンが標的細胞の原形質膜を通過するのを可能にする、ポリペプチドであり得る。光活性化タンパク質は、光の光子当たり、原形質膜を介した少数のイオンの通過を促進させるイオンポンプタンパク質として、またはチャネルが開いている時にイオン流を原形質膜を介して自由に流れさせるイオンチャネルタンパク質として特徴付けられる場合もある。疼痛を軽減する本方法にて使用するための好適な光活性化タンパク質は、過分極のための光活性化ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞にて発現する光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、ER搬出シグナル、膜輸送シグナル、及び/またはN末端ゴルジ搬出シグナルから成る群から選択される1つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合することができる。哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質輸送を増強する1つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光応答性タンパク質のN末端、C末端、またはN末端及びC末端の両方に融合することができる。場合によっては、哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質輸送を増強する1つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光活性化ポリペプチド内の内部に融合する。所望により、光応答性タンパク質及び1つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてよい。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、細胞原形質膜へのタンパク質の輸送を増強する輸送シグナル(ts)の付加によって修飾されることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1のアミノ酸配列に由来することができる。その他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
を含むことができる。
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
1)hChR2のシグナルペプチド
2)ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2サブユニットシグナルペプチド
;
3)ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
;及び
4)ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
。
などを含む。ER搬出配列は、約5アミノ酸〜約25アミノ酸、例えば、約5アミノ酸〜約10アミノ酸、約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、または約20アミノ酸〜約25アミノ酸の長さを有することができる。
いくつかの実施形態では、好適な光活性化タンパク質は、細胞が光で照射された時に細胞の原形質膜を越えて1つ以上のプロトンを輸送できる、アーキロドプシン(Archaerhodopsin)(Arch)プロトンポンプ(例えば、ハロラブラム・ソドメンセ(Halorubrum sodomense)に由来するプロトンポンプ)である。光は、約530〜約595nmの間の波長を有することができ、または約560nmの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Archタンパク質は、SEQ ID NO:1(Arch)に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。Archタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送するArchタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、Archタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含むArchタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
いくつかの実施形態では、好適な光活性化タンパク質は、細胞が光で照射された時に細胞の原形質膜を越えて1つ以上のプロトンを輸送できる、アーキロドプシン(ArchT)プロトンポンプ(例えば、ハロラブラム(Halorubrum)属TP009に由来するプロトンポンプ)である。光は、約530〜約595nmの間の波長を有することができ、または約560nmの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Archタンパク質は、SEQ ID NO:3(ArchT)に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ArchTタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送するArchTタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、ArchTタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含むArchTタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、青色光に応答することができ、ギラルディア・テータ(Guillardia theta)に由来することが可能で、このプロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光で照射された時に、細胞における過分極電流の媒介を可能にすることができる。光は、約450〜約495nmの間の波長を有することができ、または約490nmの波長を有することができる。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、SEQ ID NO:4(GtR3)に示した配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極化する能力を適切に保持する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、細胞が光で照射された時に細胞の原形質膜を越えて1つ以上のプロトンを輸送できる、オキシリス・マリーナ(Oxyrrhis marina)(Oxy)プロトンポンプである。光は、約500〜約560nmの間の波長を有することができ、または約530nmの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Oxyタンパク質は、SEQ ID NO:5に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。Oxyタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送するOxyタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、Oxyタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含むOxyタンパク質は、光に応答して標的細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答することができ、レプトスフェリア・マキュランス(Leptosphaeria maculans)に由来することが可能で、このプロトンポンプタンパク質は、細胞が520nm〜560nmの光で照射された時に、細胞膜を越えたプロトンの輸送を可能にすることができる。光は、約520nm〜約560nmの間の波長を有することができる。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7(Mac;Mac3.0)に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を越えてプロトンを送る能力を適切に保持する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
場合によっては、上記ニューロンの原形質膜上に発現した好適な光応答性クロライドポンプタンパク質は、ナトロノモナス・ファラオニス(Natronomonas pharaonis)に由来することができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、赤色光のみならず琥珀色光にも応答でき、光応答性クロライドポンプタンパク質が琥珀色光または赤色光で照射された時に、ニューロンにて過分極電流を媒介することができる。光応答性クロライドポンプを活性化することのできる光の波長は、約580〜630nmの間であり得る。いくつかの実施形態では、光は約589nmの波長であり得て、または光は約630nm超(例えば、約740nm未満)の波長を有することができる。別の実施形態では、光は、約630nmの波長を有する。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光の連続パルスに曝露される時、少なくとも約90分間神経膜を過分極化することができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、SEQ ID NO:16に示した配列と少なくとも約75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。更に、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性タンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有する。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含む光応答性タンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を過分極化する能力を適切に保持する。
を含むことができ、式中、Xは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、ER搬出シグナルは、アミノ酸配列
を含むことができ、式中、Xは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ER搬出シグナルは、アミノ酸配列
を含むことができる。
などが挙げられる。ER搬出配列は、約5アミノ酸〜約25アミノ酸、例えば、約5アミノ酸〜約10アミノ酸、約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、または約20アミノ酸〜約25アミノ酸の長さを有することができる。
を含むことができる。
を含む。別の実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、SEQ ID NO:17と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む。
を含み、式中、Xは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、ER搬出シグナルは、アミノ酸配列VXXSLを含み、式中、Xは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ER搬出シグナルは、アミノ酸配列
を含む。いくつかの実施形態では、NpHRオプシンタンパク質は、SEQ ID NO:16に示した配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列、ER搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。その他の実施形態では、NpHRオプシンタンパク質は、N末端からC末端まで、SEQ ID NO:16に示した配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列、ER搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。その他の実施形態では、NpHRオプシンタンパク質は、N末端からC末端まで、SEQ ID NO:16に示した配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びER搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
を含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーにより、SEQ ID NO:16に示した配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列に連結されている。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーを介してER搬出シグナルに連結されている。リンカーは、5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、または500アミノ酸の長さのいずれかを含んでよい。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、N末端シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、好適な光応答性イオンチャネルタンパク質は、470nm〜510nmの光に応答することができ、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)に由来することが可能で、このイオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞における過分極電流の媒介を可能にすることができる。光は、約470nm〜約510nmの間の波長を有することができ、または約490nmの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、SEQ ID NO:15に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性イオンチャネルタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性イオンチャネルタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含む光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
上述のように、本開示による疼痛を制御する方法は概して、個体のニューロン(例えば、侵害受容器)へと、オプシンを活性化させる波長の光に応答して細胞の過分極を提供するオプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。好適な核酸は、本明細書に記載された光活性化ポリペプチド(オプシン)(例えば、本明細書に記載されたような1つ以上の光活性化ポリペプチド)のうちの1つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは発現カセットを含み、この発現カセットは、標的細胞でポリヌクレオチドによってコードされる1つ以上のタンパク質を発現させるのに利用される複数の構成要素(例えば、コード配列;転写制御配列など)を含有する。
本開示の態様は、上記のポリヌクレオチド、ベクター、またはそれらの構成要素(を含む)医薬組成物を含む。本医薬組成物は、標的細胞が1つ以上の光活性化タンパク質を発現するよう、標的細胞の遺伝子を組換えるために対象に投与されてよい。本医薬組成物は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、限定されないが、脂質、ポリマーなどのトランスフェクション試薬またはそれらの成分を含む、本ポリヌクレオチドまたはベクターの、標的細胞への送達を促進させる成分を含んでよい。
場合によっては、送達デバイスが、光活性化ポリペプチドをコードする核酸、または光活性化ポリペプチドを含む医薬組成物を標的細胞へと送達するために使用される。送達デバイスは、1つ以上の標的細胞へと核酸または医薬組成物の常用、非常用、プログラムされた、または医師もしくは患者による投与量を提供し、標的細胞が、コードされた光活性化ポリペプチドを引き続き発現することを確実にしてよい。
疼痛を制御する本方法の実施において、光生成デバイスは、1つ以上の光活性化ポリペプチドを発現する標的細胞へと光を送達するために使用することができる。本開示の方法での使用に好適な光生成デバイスは一般に、デバイス上の1つ以上の光源から様々な異なる波長の光を生成することができる。いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、1つ以上の本タンパク質を発現する標的細胞の周囲または近傍に配置することができる光カフまたはスリーブを含んでよい。いくつかの実施形態では、光源の一部分または光源全体が、埋め込み可能であってよい。本光生成デバイスは、本明細書にて開示された光活性化タンパク質を刺激するための、任意の有用な構成であってよい。いくつかの実施形態では、例えば、光生成デバイスは、標的細胞または組織の限定照射を容易にする構成部品を含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、標的細胞、標的細胞の一部分、例えば、神経細胞の特定の軸索、または例えば、神経線維の束、標的組織、もしくは脊髄の一部分などの特定の解剖学的構造へと限定的に光を当ててよい。「限定的に光を当てる」とは、光生成デバイスが、特定の標的構造のみに光を送達し、その他の構造には照射しないことを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、光生成デバイスは、神経細胞の軸索には照射するが、神経細胞のその他部分には一切照射しないよう構成されてよい。このように、光生成デバイスからの光は、照射される特定の標的構造における光活性化タンパク質のみに影響を及ぼす。
場合によっては、光生成デバイスから照射される光量を制御、または調節できる制御デバイスが、本方法にて使用される。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、光生成デバイスから標的組織へと送達される光の波長及び/または強度を調節するよう構成されてよい。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、光生成デバイスから標的組織へと送達される光の周波数及び/または持続時間を調節するよう構成されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、制御デバイスは、光生成デバイスからの光のパルスを標的組織へと送達するよう構成されてよい。制御デバイスは、標的組織が、例えば、ユーザ入力などによる規則的または変則的レートにて光生成デバイスからの光で照射されるように、光パルスの周波数及び/または持続時間を調節することができる。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、約1ミリ秒以下から最大約1秒、最大約10秒、最大約20秒、最大約30秒、最大約40秒、最大約50秒、最大約60秒またはそれ以上までの持続時間を有する、光生成デバイスからの光パルスを生成することができる。いくつかの実施形態では、制御デバイスは、ミリ秒当たり1パルス、秒当たり最大約1パルス、分当たり最大約1パルス、10分当たり最大約1パルス、20分当たり最大約1パルス、30分当たり最大約1パルスの周波数を有する、光生成デバイスからの光パルスを生成することができる。
本開示は、侵害受容性疼痛の非ヒト動物モデルを提供し、この非ヒト動物は、動物のニューロン(例えば、小径または大径1次求心性ニューロンなどの1次求心性ニューロン;例えば、侵害受容器)にて、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する。非ヒト動物におけるニューロン(例えば、小径または大径1次求心性ニューロンなどの1次求心性ニューロン;例えば、侵害受容器)の膜に発現する、脱分極オプシンの照射によって、動物で疼痛を誘発する。
上述のように、疼痛の本非ヒト動物モデルは、動物のニューロン(例えば、小径または大径1次求心性ニューロンなどの1次求心性ニューロン;例えば、侵害受容器)にて、オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供するオプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する。
進化的により単純な生物に由来する構成要素を有する光応答性オプシンタンパク質は、哺乳類細胞によって発現や許容されない可能性があり、または哺乳類細胞にて高レベルで発現する場合、損なわれた細胞内局在を示してよい。結果として、いくつかの実施形態では、細胞にて発現する光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体(ER)搬出シグナル、膜輸送シグナル、及び/またはN末端ゴルジ搬出シグナルから成る群から選択される1つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合することができる。哺乳類細胞の原形質膜への光応答性タンパク質輸送を増強する1つ以上のアミノ酸配列モチーフは、a)光応答性タンパク質のN末端に;b)光応答性タンパク質のC末端に;c)光応答性タンパク質のN末端及びC末端の両方に;またはd)光応答性タンパク質内の内部に融合することができる。所望により、光応答性タンパク質及び1つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてよい。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
1)hChR2のシグナルペプチド
2)ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2サブユニットシグナルペプチド
;
3)ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
;及び
4)ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
。
などを含む。ER搬出配列は、約5アミノ酸〜約25アミノ酸、例えば、約5アミノ酸〜約10アミノ酸、約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、または約20アミノ酸〜約25アミノ酸の長さを有することができる。
いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、クラミドモナス・ラインハーディ(Chlamydomonas reinhardtii)に由来することが可能で、このカチオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射された時に、細胞膜を越えたカチオンの輸送を可能にすることができる。別の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、SEQ ID NO:8に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。クラミドモナス・ラインハーディに由来する光応答性カチオンチャネルタンパク質を活性化させるために使用される光は、約460〜約495nmの間の波長を有することができ、または約480nmの波長を有することができる。更に、約100Hzの時間周波数を有する光パルスを使用して、光応答性タンパク質を活性化することができる。いくつかの実施形態では、約100Hzの時間周波数を有する光パルスによる、クラミドモナス・ラインハーディに由来する光応答性カチオンチャネルの活性化によって、光応答性カチオンチャネルを発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性カチオンチャネルタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を越えてカチオンを輸送する能力を適切に保持する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
その他の実施形態では、光応答性ポリペプチドは、タンパク質のレチナール結合ポケットにおける重要な位置に特異的アミノ酸置換を有することができる階段関数オプシン(SFO)タンパク質または安定化階段関数オプシン(SSFO)タンパク質である。いくつかの実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:8のアミノ酸残基C128にて変異を有することができる。その他の実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:8にC128A変異を有する。その他の実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:8にC128S変異を有する。別の実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:8にC128T変異を有する。いくつかの実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:9に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸128にてアラニン、セリン、またはトレオニンを含む。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
その他の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ボルボックス・カルテリのVChR1タンパク質及びクラミドモナス・ラインハーディからのChR1タンパク質に由来するC1V1キメラタンパク質であり得て、このタンパク質は、ChR1の第1及び第2膜貫通ヘリックスによって置換された第1及び第2膜貫通ヘリックスを少なくとも有するVChR1のアミノ酸配列を含み;光に応答して;細胞が光で照射された時に、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態では、C1V1タンパク質は、光応答性キメラタンパク質の第2及び第3膜貫通ヘリックスの間に位置する細胞内ループドメイン内に更に置換を含むことができ、この細胞内ループドメインの少なくとも一部分は、ChR1からの対応する部分によって置換される。別の実施形態では、C1V1キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ChR1のアミノ酸残基A145まで広がるChR1からの対応する部分で置換することができる。その他の実施形態では、C1V1キメラタンパク質は、光応答性キメラタンパク質の第3膜貫通へリックス内に更に置換を含むことができ、この第3膜貫通へリックスの少なくとも一部分は、ChR1の対応する配列によって置換される。更に別の実施形態では、C1V1キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ChR1のアミノ酸残基W163まで広がるChR1からの対応する部分で置換することができる。その他の実施形態では、C1V1キメラタンパク質は、SEQ ID NO:11に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
いくつかの態様では、好適な光応答性ポリペプチドは、置換または変異したアミノ酸配列を含み、この変異体ポリペプチドは、前駆体C1V1キメラポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持するが、いくつかの特定の態様では、変化した特性を有してもよい。例えば、本明細書に記載された変異体光応答性C1V1キメラタンパク質は、動物細胞内もしくは動物細胞原形質膜上の両方で増加した発現レベル;光、特に赤色光の異なる波長に曝露された時の変化した応答性;及び/または形質の組み合わせを示すことができ、それによって、C1V1キメラポリペプチドが、低脱感作、急速な不活性化、その他の光応答性カチオンチャネルとの最低限のクロス活性化のための低紫色光活性化、及び/または動物細胞における強力な発現という特性を有する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
いくつかの実施形態では、好適な光応答性ポリペプチドは、ボルボックス・カルテリに由来するカチオンチャネル(VChR1)であり、約500nm〜約600nm、例えば、約525nm〜約550nm、例えば、545nmの波長の光で照射することによって活性化する。いくつかの実施形態では、光応答性イオンチャネルタンパク質は、SEQ ID NO:19に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができる。光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に対する感受性を増大もしくは減少させるために、特定の光の波長に対する感受性を増大もしくは減少させるために、及び/または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性イオンチャネルタンパク質の能力を増大もしくは減少させるために、天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を更に含むことができる。加えて、光応答性イオンチャネルタンパク質は、1つ以上の保存的アミノ酸置換及び/または1つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有することができる。天然のアミノ酸配列に導入される置換、欠失及び/または挿入を含む光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の原形質膜を越えてイオンを輸送する能力を適切に保持する。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
その他の実施形態では、光応答性ポリペプチドは、VChR1をベースにしたSFOまたはSSFOである。いくつかの実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:19のアミノ酸残基C123にて変異を有することができる。その他の実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:19にC123A変異を有する。その他の実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:19にC123S変異を有する。別の実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:19にC123T変異を有する。いくつかの実施形態では、SFOタンパク質は、SEQ ID NO:20に示した配列と少なくとも75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸123にてアラニン、セリン、またはトレオニンを含む。
を含むことができる。使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルKir2.1
の輸送配列のようなアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、ER搬出シグナルは、例えば、
などである。
本開示は、疼痛の制御における使用に好適な薬剤を同定する方法を提供する。
場合によっては、本方法は、a)侵害受容器などの1次求心性ニューロンにおいて脱分極のための光活性化ポリペプチドを発現する本開示の非ヒト動物(例えば、ラットまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物)を、試験薬剤と接触させること;及びb)脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって照射(活性化)される時の疼痛に対する試験薬剤の効果を、もしあれば決定することを含む。試験薬剤の非存在下で脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される疼痛レベルと比較して、非ヒト動物の疼痛を軽減する試験薬剤は、試験薬剤が疼痛を制御(軽減)するための候補薬剤であることを示す。場合によっては、非ヒト動物は、上記の通り、本非ヒト動物モデルである。
本開示は、疼痛を軽減する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、a)侵害受容器などの1次求心性ニューロンにおいて脱分極のための光活性化ポリペプチドを発現する本開示の非ヒト動物(例えば、ラットまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物)を、試験薬剤と接触させること;及びb)試験薬剤の投与後、疼痛を誘発するのに必要な最小光量に対する試験薬剤の、もしあればその効果を決定することを含む。
以下の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記述され、発明者が本発明と考えるものの範囲を限定することは意図せず、これらの実施例は、下記の実験が行われるすべての、または唯一の実験であることを表すことも意図しない。使用した数(例えば、量、温度など)に関して精度を保証するために努力したが、若干の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、及び圧力は大気圧またはその近傍である。標準的な略語、例えば、bp、塩基対;kb、キロベース;pl、ピコリットル;sまたはsec、秒;min、分;hまたはhr、時間;aa、アミノ酸;kb、キロベース;bp、塩基対;nt、ヌクレオチド;i.m.、筋肉内;i.p.、腹腔内;s.c.、皮下などを使用してよい。
光遺伝学を使用して、正常及び病理学的状態の両方で、急性疼痛を二方向に制御できることを本明細書で実証する。適応可能かつ臨床的に関連する遺伝子導入戦略を使用した。アデノ随伴ウイルス血清型6(AAV6)を使用した。AAV6は、多くの魅力的特徴を有する;AAV6は、非ヒト霊長類における遺伝子送達のために使用されてきた、ヒト臨床試験での今後の使用に対する有力な候補である15。AAV6は、逆行性輸送も可能で、神経内送達によって侵害受容器に特異的に形質導入することができ、危険を伴う後根神経節注入の必要性を排除する。
動物実験対象及び実験
すべての外科的及び行動的方法は、実験動物飼育に関するスタンフォード大学管理検討会(Stanford University Administrative Panel on Lab Animal Care)によって承認された。メスのC57BL/6マウス(1〜4か月齢)を、12時間ずつの明暗サイクル下にて1グループ5匹で飼育した。餌及び水は、自由に取れるようにした。
マウスを2〜2.5%イソフルランで麻酔し、37℃に維持した加熱パッド上に置いて、安定した麻酔水準まで反応させ、呼吸速度の検査及びつま先ピンチ(toe−pinch)試験によって定期的に検査した。体毛は、電気カミソリを使用し、注入に応じて、大腿骨の両側または片側から剃った。体毛除去クリーム(Nair)を使用し、切開部位から残りの毛をすべて除去した。次いで、切開部位は、エタノール及びベタダイン(Betadine)溶液を交互に塗布して消毒し、マウスの両脚を手術台にテープで留めた。1mg/mlリマダイル(Rimadyl)を100μl注入した。次いで、消毒した鉗子及びスプリング式のハサミ(spring scissors)を使用して、大腿骨の真上を2cm切開した。浅臀筋及び大腿二頭筋を特定し、それらの間の結合組織を切断して、坐骨神経腔を露出させた。開創器を使用して腔を開いたままにし、神経に直接到達できるようにした。神経は、先の丸いマイクロマニピュレーター及びスプリング式のハサミを使用して、下にある筋膜から慎重に取り除いた。切開部位に0.25%ブピバカインを100μl注入して、神経が乾燥するのを防止すると同時に、局所麻酔を導入した。35Gベベル針(Nanofil#NF35BV−2、World Precision Instruments社)を神経へと慎重に挿入し、Harvard社製PHDシリンジポンプ(Harvard Apparatus社)に接続した25μlシリンジ(Hamilton社)を使用して、2.5〜4μlのウイルス溶液を1μl/minにて注入した。可能な場合には、坐骨神経の総腓骨枝及び脛骨枝へと別々に2か所注入し、神経を均一に満たすのを確実にした。ChR2注入マウスには3×1010vg(UNC Vector Coreから)を注入し、一方でNpHR注入マウスには1×1011vgまたは3×1011vg(それぞれ、UNC Vector Core及びVirovek社から)のいずれかを注入した。マウスに応じて、この方法は、片側または両側のいずれかで実施した。次いで、切開部位は、5−0縫合糸を使用し、縫合して閉じた。
DRGの単離
後根神経節(DRG)の切除、培養及び電気生理学方法は、以前に報告されたプロトコール23に主に基づいた。神経内注入の3〜4週間後、マウスをイソフルラン5%で深く麻酔し、体毛を背中から剃った。次いで、マウスを4℃の滅菌リン酸緩衝生理食塩水で灌流した。以下の単離ステップを迅速に実施し、灌流後5分以内に完了させた。無菌方法を使用して背中から皮膚を除去した後、脊柱に沿って筋肉を切断し、骨鉗子を使用して、椎骨表面の全ての筋肉または腱を剥がした。骨鉗子を使用し、脊椎の底部で始めて、吻側に移動して脊髄背側の椎骨を直接剥離した。坐骨神経の分岐が目視で確認できるようになるまで脊髄側方の筋肉を剥がし、脊髄側方の骨を折って神経路を解放した。各神経枝は、小型のスプリング式のハサミを使用して切断し、後根神経節が目視で確認できるようになるまで鉗子で近位に引き、DRGの近位で切断した。次いで、DRGを、4℃の滅菌MEM−complete溶液(最小必須培地、MEMビタミン、抗生物質、及び10%ウシ胎児血清)内に置いた。3か所のDRGを、マウスの各発現面から切除した。
切除したDRGを脱鞘し、MEM−コラゲナーゼ溶液(最小必須培地、ビタミン、抗生物質、ウシ胎児血清無し、0.125%コラゲナーゼ)へと移した。組織は、水槽内で37℃にて45分間インキュベートし、次いで、2.5mlのTripleE Express(Invitrogen社)内で粉砕した。トリプシンは、80μg/mlのDNase I、ニワトリ卵白からの100μg/mlトリプシン阻害剤及び2.5mg/mlのMgSO4を加えた2.5mlのMEM−completeで抑制した。細胞を遠心分離し、細胞密度500,000細胞/mlにてMEM−complete内に再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を、マトリゲルコーティングしたカバーガラス上に気泡として慎重に置き、次いで、37℃、3%CO2、湿度90%にてインキュベートした。最初のインキュベーションの2時間後、培養したニューロンを1mlのMEM−completeで浸した。細胞は、電気生理学を実施するまで、必要に応じて取り替えた新鮮な培地での培養下にて2〜7日間維持した。
Spectra Xライトエンジン(Lumencor社)またはDG4キセノンランプ(Sutter Instruments社)を使用して、蛍光タンパク質の発現を同定し、オプシン活性化のための光パルスを送達した。475/28フィルタを使用して、ChR2に対して青色光を当て、586/20フィルタを使用して、NpHRに対して黄色光を当てた。顕微鏡対物レンズを介した光の出力密度は、パワーメータ(ThorLabs社)で測定した。ホールセル記録は、水平プラー(P−2000、Sutter Instruments社)を用いてホウケイ酸ガラス毛管(Sutter Instruments社)から引っ張ったパッチピペット(4〜6MΩ)で得た。外部記録溶液は以下を含有した(単位はmM):125NaCl、2KCl、2CaCl2、2MgCl2、30グルコース、25HEPES、及び、ピーク光電流測定値の逸脱スパイク(escape spike)を排除するのに必要な場合、1μMテトロドトキシン。内部記録溶液は、130K−グルコネート、10mM KCl、10HEPES、10EGTA、2MgCl2を含有した(単位はmM)。記録は、MultiClamp700B増幅器(Molecular Devices社)を使用して作成し、pClamp 10.3ソフトウェア(Molecular Devices社)を使用してデータを記録し、解析した。シグナルは、ベッセルフィルタを使用して4kHzにてフィルタリングし、Digidata 1440Aアナログ−デジタルインターフェース(Molecular Devices社)を用いて10kHzにてデジタル化した。ピーク及び定常状態光電流は、電位固定モードにて1s光パルスから測定し、細胞は−50mVで保持した。直列抵抗を慎重に監視し、直列抵抗が大幅に変化(20%超)または20MΩに到達した場合、記録は使用しなかった。
実験プロトコール:
神経内注入の約1〜5週間後、マウスを、薄く透明なプラスチックの床を備えたプラスチックケース内に置き、試験に先立って30分間試験装置に慣らした。レーザ(OEM Laser Systems社、473nm、1mW/mm2)に取り付けられたマルチモード光ファイバー(Thor Labs社、#AFS105/125Y)を、床を通してフットパッドへと向けた。試験を開始するために、動物は、(1)起きていて、(2)四足すべて床の上に置き、及び(3)静止していて歩き出そうとしない状態にしておく必要があった。潜時は、フットパッドが照射された時から足を引っ込めた時までを計算した。実験者バイアスを避けるため、主観的基準は潜時計算の終点には適用せず、すなわち、正常歩行が試験の終了であるとも考えられた。最大潜時を1分と設定し、データ収集の実用性を確保した。個々の試験は、各々少なくとも2分の間をおき、各マウスで5回試験を行い、合わせて平均化した。すべての試験は、秒当たり30フレームにて録画し、収集後のビデオ分析によって潜時を計算した。
一元配置分散分析(One−way ANOVA)を使用して、1〜5週目に、黄色光に対するChR2+マウスの応答と比較して、青色光に応答するChR2+マウスの潜時の変化を分析した。ダネットの事後多重比較検定を使用して、潜時が、黄色光対照とは有意に異なったことを決定した。効果量は、複数の群に対して、gψ、Hedgesのgの拡張を使用して計算した24。
2チャンバ場所嫌悪装置の構築
2つの10cm×12cmチャンバを繋げる入口通路を備えた、2チャンバ場所装置を組み立てた。各チャンバの床は、一方が赤、もう一方が青で、10×12アレイの発光ダイオード(青色LED:475nm、赤色LED:625nm、Cree社)で照射し、光の出力密度が各部屋で等しくなるように(0.15mW/mm2)鏡を向けた。
1匹のマウスに、LEDアレイ床の電源を切った状態で、試験に先立って10分間2チャンバ装置を探索させた。次いで、ビデオカメラを使用してマウスの位置を記録し、BIOBSERVE社製Viewerを使用して分析した2。マウスの位置を、ライトを切ったままで10分間記録し、次いで、ライトのスイッチを点けて、更に30分間位置を記録した。
対応のある両側スチューデントt検定を使用して、「ライトオフ」及び「ライトオン」条件間でのマウスの位置嗜好性の変化が、統計的に有意であったか否かを調べた。次いで、2つの条件間でのパーセンテージ変化を、ChR2+及びNpHR+マウス各々について計算した。次いで、これらのパーセンテージを、異分散集団に対する、対応のない両側スチューデントt検定を使用して比較した。効果量は、Hedgesのgを使用して計算した。
機械的異痛を、von Frey試験によって調査した。マウスを、試験に先立って1時間試験装置に慣らした。様々な強さの毛髪を、上げ下げ法25、26を使用して、約2秒間足の底部に当てた。
von Frey閾値の変化を、ノンパラメトリック両側ウィルコクソンの符号順位検定を使用して、統計的有意性について試験した。効果量は、Hedgesのgを使用して計算した。
改良したHargreaves足底試験装置を使用して、異なる種類の照射による熱感受性の変化を測定した。標準的なHargreaves試験のガラス板をわずかに上げて、赤外線放射体上にLEDリングを配置できるようにした。LEDリングは、0.15mW/mm2の青色光(475nm、Cree社)または黄色光(590nm、OSRAM Opto Semiconductors社)を放射するよう調節した。光誘起性の混同を考慮するために、マウスが関連スペクトル(on−spectrum)の照射(ChR2注入マウスには青色光、及びNpHR注入マウスには黄色光)を受けた時の赤外線加熱に対する逃避反応潜時を、非関連スペクトル(off−spectrum)の照射と比較した(逆もまた同様)。逃避反応潜時は、赤外光の開始から最初に足を逃避させるまでの間で自動的に測定した。赤外線強度は、すべての試験にわたり一定を維持し、実験者は、試験されるマウスがオプシンを発現したか否かを常に知らなかった。
熱逃避反応潜時の変化を、対応のある両側スチューデントt検定を使用して、関連スペクトルと非関連スペクトルの照射条件の間で比較した。効果量は、Hedgesのgを使用して計算した。
本明細書で使用された慢性絞扼損傷モデルは、既存のプロトコール27から抜粋した。動物をイソフルランで麻酔し、坐骨神経は、神経内注入に使用した坐骨神経露出方法と同様にして片側を露出させた。1本の7−0プロリーン(prolene)二重結び結紮糸で、結紮糸を神経に沿って滑らせて動かすことができるように神経の周りを縛り、縫合糸の自由端を短く切断した。非吸収性の5−0縫合糸を使用して、傷を閉じた。神経障害性疼痛の発現を促進させるために、術後鎮痛薬は投与しなかった。
免疫組織化学
マウスを100μlのBeuthanasia−Dで安楽死させ、10mlの4℃リン酸緩衝生理食塩水(1×PBS)及び10mlの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で経心腔的灌流を行った。骨鉗子、スプリング式のハサミ及び鉗子を使用して、マウスから坐骨神経、関連する後根神経節及び脊髄を合わせて慎重に切除した。両足は別々に切除した。すべの組織を、4%PFA内に一晩置き、4℃にて維持した。その後、サンプルを30%スクロース(1×PBS中)へと移し、異なる時間の長さ(最短1日にて)で維持した。サンプルは、顕微鏡誘導下にて後ほど解剖し、ティシュー・テック(Tissue−Tek)O.C.T中で個別に凍結した。サンプルは、クライオスタット(ライカCM3050S)を使用して20μmの厚さで切断し、スライド上に載せた。すべてのサンプルは、残留するOCTをすべて除去するために、1×PBS中で3×10分間すすいだ。次いで、ミエリン以外のすべての標的に対して、サンプルを、1時間1×PBS中に溶解させた0.3%トリトン(Triton)−X100、2%正常ロバ血清(NDS)でブロックした。次いで、サンプルを、1×PBS中に溶解させた0.3%トリトン−X100、5%NDSを用いた一次抗体溶液で、一晩インキュベートした。翌日、サンプルを1×PBSで3×10分間すすぎ、次いで1×PBS中に溶解させた二次抗体溶液で1時間インキュベートした。次いで、サンプルを1×PBS中で3×10分間すすぎ、PVA DABCOを用いてカバーガラスで覆った。使用した一次抗体は、ラット抗サブスタンスP(1:500、#556312、BD Pharmingen)、ビオチン−IB4(1:50、#B−1205、Vector Laboratories社)、ウサギ抗ソマトスタチン受容体2(1:250、#ab134152、Abcam社)及びウサギ抗VR1(TRPV1用、1:500、#ab31895、Abcam社)であった。使用した二次抗体は、Cy5ロバ抗ウサギ(1:500、#711−175−152、Jackson Laboratories社)、Cy3ロバ抗ラット(1:500、#711−165−152、Jackson Laboratories社)及びストレプトアビジン−テキサスレッド(Texas Red)(3:100、#SA−5006、Vector Laboratories社)であった。ミエリンに対しては、サンプルを、1×PBS中に溶解させた0.2%トリトン−X100を使用して1時間透過処理した。次いで、サンプルを、フルオロミエリンレッド(FluoroMyelin Red)(1:300、#F34652、Molecular Probes社)で20分間インキュベートした。その後、サンプルを1×PBS中で3×10分間すすぎ、PVA DABCOを用いてカバーガラスで覆った。
サンプルを、20倍油浸対物レンズを使用したライカTCS SP5共焦点走査型レーザ顕微鏡を使用してイメージングし、ライカLAS AFソフトウェアを使用して分析した。画像は、Fiji28を使用して後ほど処理し、Fijiを使用してzスタックを互いに合成し、画像輝度及びコントラストを補正して、色覚異常に対処するため色を修正した。
AAV6−ChR2を注入した3匹の異なるマウスからのDRGを、サブスタンスP、TRPV1、ソマトスタチン及びIB4の共発現について調べ、ミエリンの共発現については3匹の異なるマウスからの神経サンプルを調べた。各マーカーについて、YFP陽性であったマーカー発現ニューロン/軸索のパーセンテージ、及び所与のマーカーに対して陽性であったYFP陽性ニューロン/軸索のパーセンテージを定量化した。
AAV6−hSyn−ChR2(H134R)−eYFPを、マウスの坐骨神経に注入した(図1a)。注入の2〜4週間後、後根神経節内の単離されたChR2陽性ニューロンからの電気生理学的記録によって、ChR2が機能的であることが明らかとなり、発現細胞は、1mW/mm2、475nmの光で5〜10Hzにて刺激した場合、活動電位を発火することができた(図1b;図6)。加えて、ChR2は、脊髄後角への中枢投射の末端をなすニューロン全体にわたり発現し、より深層または上行の脊髄後索ではほとんど発現が見られず、これにより、形質導入ニューロンは、レクセドの層I/IIに投射する侵害受容器であったことを示唆した(図1c)。免疫組織化学は、ChR2の発現とIB4、サブスタンスP、TRPV1、及びソマトスタチンなどの侵害受容マーカーの間のかなりの重複を示した。ChR2とミエリンの間では重複が観察されず、自己受容体が坐骨神経内で形質導入されなかったことを示し;その代わり、無髄侵害受容器(推定C線維)に発現が限定された(表1、図9で提供される)。更に、形質導入した後根神経節ニューロンは、非形質導入ニューロンよりもより小径であり(図6)、C線維サイズに関する先の組織学的証拠と一致した17。
大径1次求心性ニューロンは、圧迫、振動、心地よい接触、及び有痛性接触を含む、多様な感覚プロセスの媒介に関与する。疼痛研究との関連において、これらのニューロンは、様々な慢性疼痛疾患で大幅に変化することが知られている。これらのニューロンでの自然(「異所性」)発火は、中枢性感作を誘発するそれらの中枢性疼痛経路の直接的な推進による、または脊髄回路の変化のいずれかによる、炎症性及び神経障害性疼痛発現の主な原因の1つであると考えられている。これら求心性ニューロンの光遺伝学的阻害によって、神経障害性疼痛の症状を軽減する。これら求心性ニューロンの光遺伝学的刺激はまた、「疼痛ゲート(pain gate)」の一部を形成する、脊髄での多段階回路プロセスによって、いくつかの条件にて疼痛を軽減するよう作用する場合もある。以下に示すデータは、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV8)が、触知覚を媒介する大径1次求心性ニューロンへと特異的に感染することができることを示す。
すべての外科的及び行動的方法は、実験動物飼育に関するスタンフォード大学管理検討会(Stanford University Administrative Panel on Lab Animal Care)によって承認された。麻酔下にて、C57BL/6マウス(6〜8週)の坐骨神経を露出させ;3〜5μlのAAV8−CMV−GFP(1−2E10ウイルスゲノム(vg))を、露出させた神経に注入した。注入の2〜4週間後、マウスを経心腔的灌流によって安楽死させた。マウスを解剖及び切断して、脊髄、神経及び足からの組織をイメージングした。
AAV8−CMV−GFPによる感染が成功した1次求心性ニューロンは、腰髄内の脊髄深層(図10A)に投射した。脊髄のより吻側領域において、発現は、脊髄後索の薄束で主に見られた(図10B)。この発現は、脳幹まで持続した。
神経障害性疼痛は三叉神経節で発生する可能性があり、これは、多くの場合、一時的な、刺すような、誘発性の、多くの場合ショック様の顔面痛によって特徴付けられる。疾患は、感染(例えば、ヘルペスウイルス)、顔面外傷、脳卒中または術後神経損傷から生じ得る。本実施例のデータによって、阻害オプシンであるeNpHR3.0の、ラットにおける三叉神経節の感覚ニューロンへの送達を実証する。本実施例に示すデータによって、光遺伝学を使用して、三叉神経節に関する疼痛を制御することができることを実証する。
麻酔下にて、10週齢のSprague Dawleyラットに、1×1011vgのAAV5−hSyn−eNpHR3.0を三叉神経節へと定位的に注入した。動物を4週間後に安楽死させ、三叉神経節を解剖、切断及び共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。
AAV5−eNpHR3.0−YFPの直接注入の4週間後、三叉神経節の感覚ニューロンにおいて、阻害タンパク質の強力な発現が観察された。これらの結果によって、脊髄後根神経節のニューロン以外の1次感覚ニューロンをオプシンの標的とすることができること、および、これらのニューロンによって伝達される疼痛を制御するために阻害することができることが実証される。データはまた、直接注入を使用したオプシン送達の実現可能性も実証する。データを図11に示す。
以下に示すデータにより、慢性絞扼損傷(CCI)及び疼痛の発現後、NpHRのAAV6送達によって疼痛を軽減することができることを実証する。
ナイーブC57Bl6マウスを、Von Frey機械的試験方法に慣れさせ、次いでベースライン機械的閾値を記録した。次いで、マウスをCCIに罹患させ;神経損傷の10日後に機械的閾値を記録し、神経障害性疼痛を発現したそれらの動物のみ(25%以上の機械的閾値の減少により決定した)を、この研究で維持した。ヒトシナプシンプロモーター(合計で5×1010vg)の制御下で、NpHRまたはYFPのいずれかを発現するAAV6をマウスの坐骨神経へと送達した。NpHRまたはYFP送達の30日後、標的とした足への黄色光照射の存在下または不存在下にて、機械的閾値を記録した。
AAV6送達の30日後、標的とした足への光照射によって、NpHRを発現する動物にて、機械的閾値レベルをCCI前のレベルへと有意に増加させたが、YFPを発現する動物では増加しなかったことを観察した。データを図12に示す。
[本発明1001]
個体における疼痛の制御方法であって、前記個体の1次求心性ニューロンへと、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して前記1次求心性ニューロンの過分極を提供する、前記方法。
[本発明1002]
前記1次求心性ニューロンが、侵害受容器である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記光が、経皮的に送達される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記オプシンが、SEQ ID NO:1、3、4、6、15、及び16のうち1つに対して少なくとも約75%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記疼痛が、神経障害性疼痛である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記導入が、神経への注射によるかまたは筋肉注射による、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記導入が、局所、皮内、静脈内、髄腔内、または胸腔内投与による、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記侵害受容器が、熱刺激、機械刺激、または化学刺激によって一般に活性化されるものである、本発明1002の方法。
[本発明1009]
前記核酸が、組換え発現ベクターである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、本発明1007の方法。
[本発明1011]
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記AAVベクターが、AAV6ベクターまたはAAV8ベクターである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記プロモーターが、シナプシン−Iプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、またはカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIIα(CAMKIIα)プロモーターである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記個体が、哺乳動物である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記個体が、ヒト、ラット、またはマウスである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記オプシンの活性化が、疼痛の少なくとも10%の低減を提供する、本発明1001の方法。
[本発明1018]
疼痛の非ヒト動物モデルであって、前記非ヒト動物が、前記動物の1次求心性ニューロンにおいて、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現し、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供する、前記非ヒト動物モデル。
[本発明1019]
前記1次求心性ニューロンが、侵害受容器である、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1020]
前記オプシンが、SEQ ID NO:8〜14及び19〜21のうち1つに対して少なくとも約75%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1021]
前記核酸が、組換え発現ベクターである、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1022]
前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1023]
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、本発明1022の非ヒト動物モデル。
[本発明1024]
前記AAVベクターが、AAV6ベクターまたはAAV8ベクターである、本発明1023の非ヒト動物モデル。
[本発明1025]
前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1026]
前記プロモーターが、シナプシン−Iプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、またはカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIIα(CAMKIIα)プロモーターである、本発明1025の非ヒト動物モデル。
[本発明1027]
前記動物が、ラットまたはマウスである、本発明1018の非ヒト動物モデル。
[本発明1028]
疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
a)本発明1018の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること;及び
b)脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって活性化される時の疼痛に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、試験薬剤の非存在下で前記脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される前記疼痛レベルと比較して前記非ヒト動物の疼痛を軽減する前記試験薬剤が、前記試験薬剤が疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す、前記方法。
[本発明1029]
疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
a)本発明1018の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること;及び
b)前記試験薬剤の投与後に疼痛を誘発するのに必要な光量に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、
疼痛を誘発するのに必要な前記光量を増加させる試験薬剤が、疼痛を軽減するための候補薬剤である、前記方法。
Claims (29)
- 個体における疼痛の制御方法であって、前記個体の1次求心性ニューロンへと、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して前記1次求心性ニューロンの過分極を提供する、前記方法。
- 前記1次求心性ニューロンが、侵害受容器である、請求項1に記載の方法。
- 前記光が、経皮的に送達される、請求項1に記載の方法。
- 前記オプシンが、SEQ ID NO:1、3、4、6、15、及び16のうち1つに対して少なくとも約75%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記疼痛が、神経障害性疼痛である、請求項1に記載の方法。
- 前記導入が、神経への注射によるかまたは筋肉注射による、請求項1に記載の方法。
- 前記導入が、局所、皮内、静脈内、髄腔内、または胸腔内投与による、請求項1に記載の方法。
- 前記侵害受容器が、熱刺激、機械刺激、または化学刺激によって一般に活性化されるものである、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸が、組換え発現ベクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項7に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項10に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、AAV6ベクターまたはAAV8ベクターである、請求項11に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記プロモーターが、シナプシン−Iプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、またはカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIIα(CAMKIIα)プロモーターである、請求項13に記載の方法。
- 前記個体が、哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
- 前記個体が、ヒト、ラット、またはマウスである、請求項15に記載の方法。
- 前記オプシンの活性化が、疼痛の少なくとも10%の低減を提供する、請求項1に記載の方法。
- 疼痛の非ヒト動物モデルであって、前記非ヒト動物が、前記動物の1次求心性ニューロンにおいて、オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現し、前記オプシンポリペプチドが、前記オプシンを活性化させる波長の光に応答して侵害受容器の脱分極を提供する、前記非ヒト動物モデル。
- 前記1次求心性ニューロンが、侵害受容器である、請求項18に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記オプシンが、SEQ ID NO:8〜14及び19〜21のうち1つに対して少なくとも約75%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記核酸が、組換え発現ベクターである、請求項18に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記組換え発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項18に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項22に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記AAVベクターが、AAV6ベクターまたはAAV8ベクターである、請求項23に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記ヌクレオチド配列が、ニューロンでの選択的発現を提供するプロモーターに機能的に連結されている、請求項18に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記プロモーターが、シナプシン−Iプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、またはカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIIα(CAMKIIα)プロモーターである、請求項25に記載の非ヒト動物モデル。
- 前記動物が、ラットまたはマウスである、請求項18に記載の非ヒト動物モデル。
- 疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
a)請求項18に記載の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること;及び
b)脱分極のための光活性化ポリペプチドが光によって活性化される時の疼痛に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、試験薬剤の非存在下で前記脱分極のための光活性化ポリペプチドの光活性化によって誘発される前記疼痛レベルと比較して前記非ヒト動物の疼痛を軽減する前記試験薬剤が、前記試験薬剤が疼痛を軽減するための候補薬剤であることを示す、前記方法。 - 疼痛を軽減する薬剤の同定方法であって、
a)請求項18に記載の非ヒト動物に試験薬剤を投与すること;及び
b)前記試験薬剤の投与後に疼痛を誘発するのに必要な光量に対する前記試験薬剤の効果を、もしあれば決定すること
を含み、
疼痛を誘発するのに必要な前記光量を増加させる試験薬剤が、疼痛を軽減するための候補薬剤である、前記方法。
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