JP2016525370A - 小分子化合物を含む多能性幹細胞の染色体安定性維持用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献2:大韓民国登録特許10−1211624(2012.12.06)
特許文献3:大韓民国公開特許公報10−2010−0101764号(2010.09.20)
特許文献4:大韓民国公開特許公報10−2011−0094348号(2011.08.23)
特許文献5:大韓民国公開特許公報10−2012−0094488号(2012.08.24)
特許文献6:大韓民国公開特許公報10−2012−0121084号(2012.11.05)
非特許文献2:Li, W., Zhou, H., Abujarour, R., Zhu, S., Young Joo, J., Lin, T., Hao, E., Scholer, H.R., Hayek, A., and Ding, S. (2009b). Generation of human-induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2. Stem Cells 27, 2992-3000.
非特許文献3:Lin, T., Ambasudhan, R., Yuan, X., Li, W., Hilcove, S., Abujarour, R., Lin, X., Hahm, H.S., Hao, E., Hayek, A., et al. (2009). A chemical platform for improved induction of human iPSCs. Nat Methods 6, 805-808.
非特許文献4:Yuan, X., Wan, H., Zhao, X., Zhu, S., Zhou, Q., and Ding, S. (2011). Combined Chemical Treatment Enables Oct4-Induced Reprogramming from Mouse Embryonic Fibroblasts. Stem Cells.
非特許文献5:Zhu, S., Li, W., Zhou, H., Wei, W., Ambasudhan, R., Lin, T., Kim, J., Zhang, K., and Ding, S. (2010). Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell 7, 651-655.
4種類のリプログラミング因子Oct4、Klf4、Sox2、cMycの遺伝子を伝達できるレトロウイルスを作製するために、Addgene社のpMXsベクタープラスミドを購入して用いた。レトロウイルス作製用細胞株である293GPG細胞を100mm細胞シャーレに80%程度の密度で育つように培養して、invitrogen社のLipofectamin 2000製品を利用して同封された説明書を参考に293GPG細胞に該当プラスミドを導入した。48時間後から毎日5mLずつ細胞培養液の上澄み液として分泌されたレトロウイルスを2週間集めて−80℃で保管して用いた。レトロウイルスは、2〜4μg/mLのpolybreneが含まれた培地と混合して4〜5時間細胞と培養することで細胞を感染させて該当遺伝子を細胞内に伝達した。
2−1:小分子化合物の組み合わせ及び添加
小分子化合物を利用して人工多能性幹細胞を作製する場合、培地組成物にMEK抑制剤、ALK5抑制剤、ROCK抑制剤、抗酸化剤を添加して細胞を培養した。具体的には、小分子化合物は、MEK抑制剤PD0325901、ALK5抑制剤SB431542、ROCK抑制剤チアゾビビン(Thiazovivin)、抗酸化剤L−アスコルビン酸を組み合わせるか単独で用いた。各小分子化合物は、stemgent、cayman、sigmaのようなメーカーで粉末形態で販売される製品を購入して用いた。この時、MEK抑制剤PD0325901は、該当試薬粉末をDimethyl sulfoxide(DMSO)に0.5mMの濃度で溶かして1000倍濃縮液で−20℃の温度で保管して、ALK5抑制剤SB431542は、該当試薬粉末をDimethyl sulfoxide(DMSO)に2mMの濃度で溶かして1000倍濃縮液で−20℃の温度で保管した。ROCK抑制剤チアゾビビンは、該当試薬粉末をDimethyl sulfoxide(DMSO)に0.5mMの濃度で溶かして1000倍濃縮液で−20℃の温度で保管して、抗酸化剤L−アスコルビン酸は、該当試薬粉末を3次蒸溜水に200mMの濃度で溶かして1000倍濃縮液で−20℃の温度で保管した。各小分子化合物は、人工多能性幹細胞作製または維持培養時、培養液の添加成分として利用された。この時、培養液に含まれる小分子化合物の終濃度は、PD0325901の場合、0.5μM、SB431542の場合、2μM、チアゾビビンの場合、0.5μM、L−アスコルビン酸の場合、200μMにした。
マウス尻尾から抽出した線維芽細胞(mouse tail tip fibroblast)にレトロウイルスを利用してリプログラミング因子を注入して人工多能性幹細胞を得た。具体的には、passage2〜3程度のマウス線維芽細胞を100mm細胞シャーレに50,000個〜100,000個程度の細胞を培養しながら4種類のリプログラミング因子Oct4、Klf4、Sox2、cMycのプラスミドをそれぞれ含んでいるレトロウイルスをMOI2以上に感染させた。
約1週間の培養以後、支持細胞の上に胚性幹細胞と類似する形態の人工多能性幹細胞colonyが形成されるのを確認して(図1B)、形成された人工多能性幹細胞のcolonyが胚性幹細胞と類似する特徴を持つ細胞であるかを確認するために実施したAP染色で赤色に染色されて陽性反応を示す人工多能性幹細胞のcolonyを確認した(図1B)。AP染色のためには、stemgent社の実験キットと添付された説明書を利用してAP染色を実施した。また、本発明の小分子化合物を含む組成物が、リプログラミングの速度と効率を向上させることを確認した(図1C)。
RT−PCRのための人工多能性幹細胞を0.05%のTrypsin−EDTAで2〜3分処理してsingle cellsに分離した後、遠心分離機を利用してその沈殿物だけ1.5mLチューブに移して入れてRNAを抽出した。細胞のRNAは、TRI reagentを利用して分離した。3μgのRNAを逆転写酵素とoligo(dT)を利用してcDNAに変換して、該当cDNAを利用してそれぞれのprimerを利用してPCRで増幅させて電気泳動を介して該当遺伝子の発現程度を調べた。PCRを介して作製された人工多能性幹細胞株はいずれも、Oct4、Klf4、Sox2、Nanog、Rex1等の多能性遺伝子を発現することが確認された(図2A)。免疫蛍光染色のために、マルチウェルシャーレに培養中の細胞をPBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド溶液を利用して常温で1時間または4℃で一夜の間固定した。固定された細胞は、0.1%トリトン−X溶液を5分間処理して細胞膜に穴をあけて、10%正常ロバ血清でブロッキングをさせた後、1次抗体と反応させた。免疫蛍光染色結果、全ての人工多能性幹細胞株でOct4、Klf4、Sox2、cMyc、SSEA1等の多能性マーカーが発現することを確認した(図2B)。
4−1:人工多能性幹細胞の分化
作製された人工多能性幹細胞の分化能力を確認するために、全ての細胞株はTrypsin−EDTAを処理してsingle cellsに分離した後、embryonic body(EB)形成を誘導した。人工多能性幹細胞をembryonic body(EB)に分化させるために人工多能性幹細胞の分化を抑制させるLIFがない培養条件で浮遊状態で培養させる方法が利用された。具体的には、培養中の人工多能性幹細胞をPBSを利用して洗浄した後、0.05%のTrypsin−EDTAで2〜3分処理してsingle cellに分離した後、GIBCO社のDMEM high glucose培地に2mM L−グルタミン、10mMベータ−メルカプトエタノール、0.1mM MEM NEAA、10%牛胎児血清(FBS)、抗生剤であるPen/strepを添加した培地で細胞が付着しないバクテリア培養用シャーレを利用して浮遊状態で4日間培養して、浮遊状態のEBを確保した。
人工多能性幹細胞の生体内分化能力を確認するためには、免疫不全マウスを利用した奇形種生成法が利用された。すなわち、人工多能性幹細胞の移植を介して奇形種が生成されるかを確認するために、免疫不全SCIDマウス(BALB/c nu)の皮下に人工多能性幹細胞を移植する方法が利用された。具体的には、培養中の人工多能性幹細胞をPBSを利用して洗浄した後、Trypsin−EDTAを利用してsingle cellに分離した後、1,000,000個の細胞を0.1mLの培養液で希釈してBD Matrigel matrix 0.1mLと均等に混合した後、5〜10週齢のSCIDマウスのわき腹の皮下に注射して移植した。注射した後8〜10週ほどマウスを飼育して奇形種の形成の有無を観察して、生成された奇形種を摘出して、H&E染色を利用した組織学的分析法を介して三胚葉性の分化を顕微鏡で確認した。奇形種の組織学的分析結果、全ての人工多能性幹細胞株は正常に奇形種を生成して腫瘍の内部で外胚葉、内胚葉、中胚葉に該当する構造がいずれも発見された(図3B)。
実施例2で作製され培養された人工多能性幹細胞で小分子化合物を含む組成物の影響を確認するために、形態的な分析、増殖速度分析、遺伝子発現程度の分析が行われた。小分子化合物を含む組成物が人工多能性幹細胞の形態と目視的変化に及ぼす影響を確認するために組成物を用いなかった人工多能性幹細胞(miPSC(−))と、組成物を用いて作製された人工多能性幹細胞(miPSC(+))を支持細胞がある条件とない条件とで互いに比較した。
実施例2で作製され培養された人工多能性幹細胞の分化過程中、小分子化合物を含む組成物が人工多能性幹細胞の分化能力に及ぼす影響を調べるために、前記組成物を用いなかった人工多能性幹細胞と組成物を用いて作製された人工多能性幹細胞との間に三胚葉性分化の効率と、生成された奇形種の大きさ、及びEBの形成効率を各々比較した。
小分子化合物を含む組成物が人工多能性幹細胞誘導過程と、その後初期培養過程、長期間維持培養過程中にも遺伝的安定性を向上させるかを調べるために、前記組成物を用いなかった人工多能性幹細胞と組成物を用いた人工多能性幹細胞の核型分析を介して染色体突然変異有無と頻度を調べた。全ての細胞は自然に突然変異が生じることができるほど長期間培養されて、一般的な核型分析の過程を介して染色体を分析した。
小分子化合物を含む組成物が人工多能性幹細胞誘導過程と、その後初期培養過程、長期間維持培養過程中にも遺伝的安定性を向上させるのか調べるためのさらに他の分析でDNA損傷程度を分析した。
Claims (12)
- ROCK抑制剤、MEK抑制剤、ALK5抑制剤及び抗酸化剤で構成された群から選択された一つ以上の小分子化合物を有効成分として含有する人工多能性幹細胞の染色体安定性維持用組成物。
- 前記ROCK抑制剤は、チアゾビビン、Y−27632、ファスジル(HA−1077)、ヒドロキシファスジル(HA−1100)、H−1152、3−(4−ピリジル)−1H−インドール、N−(4−ピリジル)−N’−(2,4,6−トリクロロフェニル)ウレア、オーロチオグルコース及びLY29400で構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記MEK抑制剤は、PD0325901またはU0126(1,4−diamino−2,3−dicyano−1,4−bis[2−aminophenylthio]butadiene)であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記ALK5抑制剤は、A−83−01またはSB431542であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記抗酸化剤は、L−アスコルビン酸、ビタミンE、ビタミンA、ビタミンC、オキソチアゾリジン、N−アセチルシステイン、TEMPO、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ、酸素スカベンジャー、過酸化水素、リポオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、金属結合タンパク質、セレン、還元型グルタチオン、ベータカロチン、フラボノイド、セサモール、没食子酸誘導体、アジョワン、オリザノール、レズベラトロール、カテキン、レシチン、セファリン、sulfhydrls(SRH)、クエン酸、アスコルビン酸、カタラーゼ、BHA、BHT、PG、NDGA、ヒドロキノン、カテコール及びDPPD(N,Ndiphenyl−pp−phenylene−diamine)で構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記幹細胞は、Oct4、Klf4、Sox2及びcMycで構成された群から選択された一つ以上の遺伝子の導入によって誘導される人工多能性幹細胞であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 染色体の構造的、数的突然変異抑制またはDNA損傷抑制を介して染色体の安定性を維持させることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 請求項1から請求項7のいずれかに記載の組成物で人工多能性幹細胞を処理することを特徴とする人工多能性幹細胞の染色体安定性維持方法。
- 前記組成物は、体細胞のリプログラミングを誘導する工程に添加されることを特徴とする請求項8に記載の人工多能性幹細胞の染色体安定性維持方法。
- 前記組成物は、リプログラミング誘導後に添加されることを特徴とする請求項8に記載の人工多能性幹細胞の染色体安定性維持方法。
- 請求項1から請求項7のいずれかに記載の組成物の存在下で、人工多能性幹細胞を培養することを特徴とする人工多能性幹細胞の培養方法。
- 支持細胞無しの条件下で人工多能性幹細胞を培養する工程をさらに含むことを特徴とする請求項11に記載の人工多能性幹細胞の培養方法。
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