KR20100097969A

KR20100097969A - 인간 대동맥 평활근 세포로부터 제조된 유도성 전능 줄기세포

Info

Publication number: KR20100097969A
Application number: KR1020090016887A
Authority: KR
Inventors: 이태희; 서원희
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2010-09-06

Abstract

본 발명은 인간 평활근 세포-유래 유도성 전능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간 평활근 세포로부터 유도성 전능줄기세포를 최초로 구축한 것이며, 본 발명의 유도성 전능줄기세포는 ES 세포와 거의 동일한 특성을 나타낸다. 본 발명은 다양한 인간세포로 분화될 수 있는 환자-맞춤형 면역적합성 줄기세포를 제공할 수 있도록 하며, 줄기세포 치료제의 응용성 및 실용성을 크게 향상시킨다.

iPS, 줄기세포, 평활근세포, 대동맥

Description

인간 대동맥 평활근 세포로부터 제조된 유도성 전능 줄기세포{Induced Pluripotent Stem Cells Prepared from Human Aortic Smooth Muscle Cells}

본 발명은 인간 대동맥 평활근 세포로부터 제조된 유도성 전능 줄기세포 및 유도성 전능 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포의 치료적 가능성은 자가 재생 및 분화를 통해 손상된 조직을 회복하거나 교체할 수 있는 ES 세포의 가능성에 기초한다(Byrne et al., 2007). ES 세포가 조직 재생 의약으로서 현실적인 약물 후보물질이 되기 위해서는 환자의 면역 체계와 조화를 이루어야 한다. 그러나, 과거에는 여러 가지 이유로 말미암아 환자-특이적 ES 세포를 만들어 내기가 상당히 어려웠다. 예를 들어, 인간 난모세포를 이용한 체세포 핵 전달(somatic cell nuclear transfer; SCNT) 실험은 극히 비효율적이고 윤리적인 문제를 수반하였으며, ES 세포와 체세포간 세포 융합을 유도하는 방법은 융합된 4배체 전분화능 줄기 세포(tetraploid pluripotent stem cell)로부터 ES 세포 염색체를 제거하는데 어려움 이 있었다(Cowan et al., 2005; Matsumura et al., 2007; Yu et al., 2006). 그러나, Yamanaka 및 그의 연구진은 최근 인간 및 마우스의 섬유아세포(fibroblast)로부터 소위 유도 전분화능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell; iPS)라고 불리는 ES 세포-유사 전분화능 세포(ES cell-like pluripotent cell)를 비교적 간단하고도 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하였다(Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006). 4가지의 전사인자(transcription factor; OCT4,SOX2, KLF4 및 c-MYC)를 이용한 레트로바이러스 형질도입으로 섬유아세포를 배아-유사 상태로 재프로그램화 시켰으며, 이렇게 재프로그램화된 세포는 인 비트로 및 인 비보에서 ES 세포와 형태학적, 유전자 발현 및 분화능 등에서 현저한 유사성을 보였다(Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006). 동시에, Thomson 및 그의 연구진은 Yamanaka 연구팀에서 이용한 것과 다른 종류의 유전자 조합(OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28)을 통하여 인간 섬유아세포로부터 iPS 세포를 생산할 수 있음을 보고 하였다(Yu et al., 2007). 추가적으로, 여러 다른 연구자들이 성체 체세포(주로, 섬유아세포)로부터 인간 iPS 세포를 생산할 수 있다는 보고를 하였는데, 이는 iPS 기술의 재현 가능성이 아주 높다는 것을 나타낸다(Kim et al., 2008; Lowry et al., 2008; Park et al., 2008).

iPS 기술은, SCNT와 세포융합과 같은 종래 기술의 심각한 한계를 성공적으로 극복 가능하였기에, 풍부한 전분화능 환자-특이 줄기세포를 공급하는 것은 환자-맞춤형 세포치료 개발을 진보시킬 것으로 기대된다. 또한, iPS 기술은, 환자로부터 징후성 세포를 분리 또는 유지하는데 어려운 인간의 유전질환을 연구하기 위한 세포-기반 모델 시스템을 구축하는데 이용될 수 있다. 상술한 두 영역에 iPS 기술을 성공적으로 응용하기 위해서는, 환자-유래 iPS 세포로부터 분화된 세포가 환자 자신의 체세포가 갖는 특성과 동등 또는 유사성을 보유한다는 가정에 의존하여야 한다. 때문에, iPS 세포로부터 분화된 세포와 동일 기원의 체세포의 분자적 및 생물학적 특성을 비교 분석하는 것이 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 인간 평활근 세포, 특히 인간 동맥 평활근 세포로부터 ES 세포와 같은 전능성을 가지는 줄기세포를 제조하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 특정의 트랜스유전자 조합으로 인간 평활근 세포를 형질도입(transduction)시키는 경우에는 인간 평활근 세포-유래 유도성 전능줄기세포가 안정되게 구축됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간 평활근 세포-유래 유도성 전능줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유도성 전능 줄기세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 평활근 세포-유래 유도성 전능줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 제공한다.

본 발명자들은 인간 평활근 세포, 특히 인간 동맥 평활근 세포로부터 ES 세 포와 같은 전능성을 가지는 줄기세포를 제조하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 특정의 트랜스유전자 조합으로 인간 평활근 세포를 형질도입(transduction)시키는 경우에는 인간 평활근 세포-유래 유도성 전능줄기세포가 안정되게 구축됨을 확인하였다.

본 발명의 유도성 전능줄기세포는 다양한 인간 평활근 세포로부터 유래될 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 대동맥 평활근 세포로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 동일한 핵형(karyotype), 즉 정상적인 핵형을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 UTF1, hTERT, LEFTB, TDGF1, GDF3, OCT4, SOX2 및 NANOG로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나, 보다 바람직하게는 최소 3개, 보다 더 바람직하게는 최소 6개, 가장 바람직하게는 8개 모두의 마커 유전자를 인간 평활근 세포와 비교하여 고발현한다. 상기 유전자를 언급하면서 사용되는 용어 “고발현”은 당업계에서 통상적으로 실시되는 유전자 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction) 방법으로 분석한 경우 인간 평활근 세포와 비교하여 특정 유전자를 보다 강하게 발현하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 알카라인 포스파타아제, SSEA4, NANOG 및 OCT4로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 마커, 보다 바람직하게는 최소 2개의 마커, 가장 바람직하게는 4개의 마커 모두에 대한 항체로 양성 염색된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 비교하여 다음의 유전자 중 최소 하나, 보다 바람직하게는 최소 3개, 보다 더 바람직하게는 최소 5개, 가장 바람직하게는 8개 유전자를 고발현한다: LIN28(lin-28 homolog), DPPA4(developmental pluripotency associated 4), DNMT3B[DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3β], SALL4(sal-like 4), POU5F1(Oct3/4), PROM1(prominin 1), ALPL(alkaline phosphatase) 및 ZFP42(zinc finger protein 42). 상기 유전자들의 고발현은 cDNA 마이크로어레이 방식으로 분석한 경우 인간 평활근 세포와 비교하여 최소 5배, 바람직하게는 최소 10배, 보다 더 바람직하게는 최소 30배, 가장 바람직하게는 최소 50배 강하게 발현하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 비교하여 다음의 유전자 중 최소 한 유전자를 저발현 한다: COL6A3(collagen type VI, alpha 3), ACTA2(actin alpha 2), FBLN5(fibulin 5) 및 COL1A2(collagen type I, alpha 2). 상기 유전자들의 저발현은 cDNA 마이크로어레이 방식으로 분석한 경우 인간 평활근 세포와 비교하여 최소 5배, 바람직하게는 최소 10배, 보다 바람직하게는 최소 20배, 가장 바람직하게는 최소 30배 약하게 발현하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 비교하여 배아줄기세포-특이 miR302-367 클러스트를 고발현 한 다. 상기 miRNAs의 고발현은 cDNA 마이크로어레이 방식으로 분석한 경우 인간 평활근 세포와 비교하여 최소 5배, 바람직하게는 최소 10배, 보다 더 바람직하게는 최소 30배, 가장 바람직하게는 최소 50배 강하게 발현하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도성 전능 줄기세포는 외래의 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 유전자가 도입된 것이고, 보다 바람직하게는 외래의 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 및 KLF4 유전자가 도입된 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 평활근 세포에 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 트랜스유전자의 조합을 도입시키는 단계를 포함하는 유도성 전능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 인간 평활근 세포로부터 유도성 전능 줄기세포를 구축함에 있어서, 트랜스유전자의 조합으로서 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28의 조합이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 트랜스유전자의 조합은 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 및 KLF4 유전자이다.

본 발명의 방법에서 유도성 전능 줄기세포의 근원세포(parental cells)로서 이용될 수 있는 인간 평활근 세포은, 바람직하게는 인간 대동맥 평활근 세포이다.

트랜스유전자의 조합을 인간 평활근 세포 도입시키는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있으며, 바람직하게는 트랜스유전자의 도입은 레트로바이러스에 의해 매개되는 방법으로 실시한다.

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외 래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 상기 트랜스유전자의 조합은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 상기 트랜스유전자의 조합, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 트랜스유전자의 도입은 렌티바이러스를 통하여 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 레트로바이러스는 인간세포에서 작동가능한(operable) 프로모터를 포함하고 상기 트랜스유전자는 상기 인간세포에서 작동가능한 프로모터의 조절 하에 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 인간세포에서 작동가능한 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 벡시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 AFP 프로모터 또는 알부민 프로모터이고, 가장 바람직하게는 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터이다.

인간 평활근 세포에 트랜스유전자의 조합을 도입시킨 다음, 세포를 적합한 배지에서 계대 배양하여 유도성 전능 줄기세포를 얻는다. 이 경우, 사용 가능한 배지는 줄기세포의 배양에 이용되는 통상적인 어떠한 배지도 포함한다. 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 배지들의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, WO 97/47734 및 WO 98/30679에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배양은 피더세포층 상에서 배양된다. 피더세포층은 다양한 동물, 예를 들면, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포-유사 세포, 닭 섬유아세포, 자궁 상피 세포, 지지세포(STO) 및 SI-m220 공급 세포, 및 BRL 세포에서 유래된 섬유아세포 및 상피 세포를 포함한다. 바람직하게는, 피더세포는 유사 분열적으로 비활성화, 예를 들면, 부수적으로 ES 세포 성장을 억제하는 미토마이신 C(mitomysin C)와 같은 항-유사 분열 시약 (anti-mitotic agent) 처리에 의해 비활성화된 세포이다.

상술한 과정을 통하여 전능줄기세포 특성을 갖는 세포가 생성된다. 전능성 줄기세포의 생성은 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP) 및 항-단계-특이적 배아 항원 (anti-stage-specific embryonic antigen: SSEA) 항체를 이용하는 마커 어세이 (marker assay)에 의해 측정할 수 있다. 또한, LIF 부재하에서의 배아체 형성능 및 테라토마 형성능을 평가하여 최종적으로 본 발명에 의해 제조된 전능성 줄기세포를 동정할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 인간 평활근 세포로부터 유도성 전능줄기세포를 최초로 구축한 것이다.

(b) 본 발명의 유도성 전능줄기세포는 ES 세포와 거의 동일한 특성을 나타낸다.

(c) 본 발명은 다양한 인간세포로 분화될 수 있는 환자-맞춤형 면역적합성 줄기세포를 제공하게 한다.

(d) 따라서, 본 발명은 줄기세포 치료제의 응용성 및 실용성을 크게 향상시킨다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

1. 시약의 준비

인간의 염기성 재조합 섬유아세포 성장인자(Human recombinant basic fibroblast growth factor; bFGF)는 R&D Systems(Minneapolis, MN)으로부터 구입하 였다. 본 실험에 사용한 일차 항체는 SSEA-4, NANOG, OCT4, AP(1:250 dilution, R&D Systems), a-SMA(1:300 dilution Dako Inc., Carpinteria, CA), 비멘틴(vimentin)(1:500 dilution Abcam, Cambridge, MA), AFP(1:100 dilution, R&D Systems) 및 베타Ⅲ-튜블린(βⅢ-tubulin)(1:100 dilution Chemicon International Inc., Temecula, CA) 이었다. GFR 마트리겔(Growth factor-reduced Matrigel)은 BD Biosciences Inc. (Palo Alto, CA)로부터 구입하였다.

2. 세포 배양

표준 인간 ES 세포 배지(standard human ES cell medium; ReproCell Inc., CITY, Japan)에 미토신 C-처리 MEF(mitomycin C-treated MEF)를 함유한 60 mm 디쉬(dish) 상에 인간 ES 세포(H9 Wicell Research Institute, Madison, WI) 및 iPS 세포를 배양하였다. 패시징을 위하여, 인간 iPS 세포를 ES 분해 용액(ES dissociation solution; ReproCell Inc.)으로 37℃에서 반응시켰다. 콜로니를 디쉬로부터 분리할 때, 분해 용액을 흡입하였다. 세포 클러스터를 ES 세포 배지로 세척하고 1.5 ㎖ 튜브에 수집하였다. 5분간 팰럿을 자발침전시킨 후, 배지를 세척하고 세포를 새로운 배지에 재현탁 시켰다. 그런 다음, 세포를 MEF 또는 STO 피더 세포(STO feeder cells)를 포함하는 새로운 디쉬에 옮기고 5 ng/㎖의 bFGF를 함유하는 ES 세포 배지에서 배양하였다. STO 세포는 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 배양하였다. HASMCs은 ScienCell Research Laboratories(Carlsbad, CA)로부터 구입하였으며, SMC-특이 배지 SMCM(SMC- specific medium SMCM; ScienCell Research Laboratories)에서 배양하였다. HUVECs은 Cambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)로부터 구입하였으며, 내피세포증식배지-2(Endothelial growth medium-2, EGM-2)에서 배양하였다.

3. 렌티바이러스를 이용한 형질도입 및 iPS 세포의 제조

OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 및 KLF4에 대한 인간의 전장 cDNA를 인간 연장 인자-1α 프로모터(human elongation factor-1α promoter)를 포함하는 변형 pLenti6/R4R2/V5-DEST 렌티 바이러스 벡터(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)에 서브클로닝하였다. 제조자(Invitrogen Inc.)의 프로토콜에 따라, 플라스미드를 다른 패키징 플라스미드(packaging plasmid)를 이용하여 293FT세포에 일시적으로 형질감염 시켰다. 바이러스의 준비 후, 렌티바이러스 상층액을 HASMC 디쉬에 SMCM과 1:1(v/v) 비율로 폴리브렌(polybrene) 존재(8 ㎎/㎖) 하에 12시간 동안 첨가하였다. 12시간 뒤에, 세포들을 렌티바이러스 상층액을 이용하여 추가적인 12시간동안 2차 감염을 시켰다. 그런 다음, 세포들을 연속하여 4일 동안 블라스트시딘(blastcidin; Invitrogen Inc.)을 함유한 새로운 SMCM에서 배양하였다. 트립신 처리 후에, 형질도입된 세포 5 x 10⁴를 미토신 C-처리 MEF를 함유한 100mm 디쉬(dish)에 옮겼다. 다음날, 배지를 인간 ES 배지로 갈아주고 그 뒤로 이틀에 한번씩 배지를 갈아주었다. 3주후에, ES 세포 형태를 갖는 콜로니를 수작업으로 선별하여 미토신 C-처리 MEF를 함유한 새로운 디쉬에 다음 배양을 위하여 옮겼다.

4. 동결보존(cryopreservation) 및 해동(thawing)

동결보존 작업은 제조자(ReproCell, Inc.)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 즉, 상기 프로토콜에 기술된 분해용액을 이용하여 H9 및 iPS 세포를 분해하였다. 자발침전 후에, 상층액을 제거하고 세포 팰럿을 250 ㎕의 동결보존액(freezing medium; ReproCell Inc.)에 천천히 재현탁시킨 후, 1.5 ㎖의 냉각된 크리오바이알(cryovial)에 옮기고, 신속하게 액체질소에 담갔다. 액체질소에 저장된 크리오바이알을 개봉하여 즉시 15 ㎖의 코니컬 튜브(conical tube)에 옮겼다. 냉동된 세포들을 5초 이내에 신속하게 해동시킨 후, 10 ㎖의 따뜻한 인간 ES 배지를 첨가하고 피펫팅(pipetting) 하였다. 자발침전 후에, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 새로운 인간 ES 배지에 천천히 재현탁시키고 미토신 C-처리 MEF를 함유한 디쉬에 옮겼다. 6개월간의 보관 후 동결보존된 세포 중 생존비율은 약 30%를 초과하였다.

5. 면역세포화학(Immunocytochemistry)

면역세포화학은 종래에 기술된 방법(Lee et al., 2007)으로 수행하였다. 즉, 세포를 커버글라스 위에서 성장 시키고, 4%의 파라포름알데히드로 고정하였다. PBST(0.1% Triton X-100 in PBS)를 이용하여 투과성을 부여하고, 블로킹 용액(Dako Inc.)과 반응 시킨 뒤, 블로킹 용액 내 일차항체와 밤새 반응시켰다. 그런 다음, 세포들을 세척하고, 블로킹 용액에 1:250(v/v) 비율로 희석한 알렉사 488 또는 알렉사 594-결합 이차 항체(Invitrogen Inc.)와 실온에서 1시간동안 반응시켰다. Zeiss LSM 500 공초점 현미경을 이용하여 가시화시켰다.

6. RT-PCR

전체 RNA는 트리졸 시약(Trizol reagent; Invitrogen Inc.)을 이용하여 추출하였다. 2 ㎎의 전체 RNA를 cDNA 합성에 사용하였으며, ExTaq(Takara Inc, Japan)를 이용하여 PCR을 수행하였다. OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 및 c-MYC의 발현정도를 측정하게 위하여, YBR green(Qiagen Inc.)을 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하고 실시간 PCR 시스템(real-time PCR system; Bioneer Inc, Korea)을 이용하여 분석하였다. PCR 프라이머는 표 1에 기재되어 있다. 렌티바이러스 백본의 3’ UTR 및 5’ UTR 시퀀스 및 각각의 유전자의 코딩부위를 인식할 수 있는, 내인성 유전자, 외인성 유전자 및 전체 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 및 KLF4 유전자에 특이적 PCR 프라이머를 디자인하였다.

프라이머	전방향(5' to 3')	역방향(5' to 3')
총 Oct4	CACACTGCAGCAGATCAGCC	ATGATCGATTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCC
총 Sox2	AGAACCCCAAGATGCACAACTCG	GGGCAGCGTGTACTTATCCTTC
총 Nanog	GTGGAGCAACCAGACCTGGA	ATGATCGATTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTT
총 Klf4	TCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCC	AGGGAGCCGTCGGAGGGGGAGCG
총 Lin28	AGGAAAGAGCATGCAGAAGCGC	GTAGGTTGGCTTTCCCTGTGCA
Exo Oct4	CGAATTCGACCCAAGTTTGT	CCTTGGAAGCTTAGCCAGGT
Exo Sox2	CGAATTCGACCCAAGTTTGT	GGGCTGTTTTTCTGGTTGC
Exo Nanog	CGAATTCGACCCAAGTTTGT	AGTCTCCGTGTGAGGCATCT
Exo Lin28	CGAATTCGACCCAAGTTTGT	CGCACGTTGAACCACTTACA
Endo Oct4	GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG	CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC
Endo Sox2	GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG	TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG
Endo Nanog	TTTGGAAGCTGCTGGGGAAG	GATGGGAGGAGGGGAGAGGA
FOXA2	TGGGAGCGGTGAAGATGGAAGGGCAC	TCATGCCAGCGCCCACGTACGACGAC
Brachyury	ACCCAGTTCATAGCGGTGAC	CCATTGGGAGTACCCAGGTT
PAX6	TGTCCAACGGATGTGTGAGT	TTTCCCAAGCAAAGATGGAC
CDX2	AGCCAAGTGAAAACCAGGAC	TTTCCTCTCCTTTGCTCTGC
SMA	AGAACATGGCATCATCACCA	TACATGGCTGGGACATTGAA
Calponin	AGGCTCCGTGAAGAAGATCA	CCACGTTCACCTTGTTTCCT
Caldesmon	GGAGGAGAGGGAACAAGGTT	GCAGCTGCTTTTTCTTCTGC
MyoD	AGAGATAAATACAGCCCCAG	CCAAATGTAGCAGGTGTAAC
Mogenin	GTGGGCGTGTAAGGTGTGTA	TGGTTGGGGTTGAGCAGGGT
CTNT	GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA	GAGGCACCAAGTTGGGCATGAACGA
CTNI	CTGCAGATTGCAAAGCAAGA	CAGATCTGCAATCTCCGTGA
CD31	AGGTGTTGGTGGAAGGAGTG	CGTGTAGTTGCCACTGTGCT
Tie2	CTGCCTAAAA GTCAGACCAC	GTGTTGACTC TAGCTCGGAC
TDGF1	CTG CTG CCT GAA TGG GGG AAC CTG C	GCC ACG AGG TGC TCA TCC ATC ACA AGG
LEFTB-1	CTT GGG GAC TAT GGA GCT CAG GGC GAC	CAT GGG CAG CGA GTC AGT CTC CGA GG
GDF3	CTT ATG CTA CGT AAA GGA GCT GGG	GTG CCA ACC CAG GTC CCG GAA GTT
OCT4 프로모터^A (-202 to +231)^D	ATAAAGTGAGATTTTGTTTTAAAAA	AACATAAAAAAATCCCCCACAC
OCT4 프로모터^A (-202 to +231)^D	GGGATTTGTATTGAGGTTTTGG	CCCACACCTCAAAACCTAAC
REX1 프로모터^B (-418 to -68)^D	GGTTTAAAAGGGTAAATGTGATTATATTTA	CAAACTACAACCACCCATCAAC
NANOG 프로모터^C (-334 to -163)^D	TTAATTTATTGGGATTATAGGGGTG	AACAACAAAACCTAAAAACAAACC

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^D위치는 전사개시 위치(+1)에서 상대적으로 표기됨.

7. cDNA 마이크로어레이(cDNA microarray)

16,283 유전자를 포함하는 cDNA 마이크로어레이는 제조자의 프로토콜에 따라 실시하였다(Illumina BeadStation 500 X). 즉, Illumina Amplification Kit (Illumina Inc.)를 이용하여 전체 RNA의 동일 양(100 ng)으로부터 바이오틴화 cDNA를 합성한 후, RNeasy Kit(Qiagen Inc.)를 이용하여 정제하였다. Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip에 cDNA 프로브를 혼성화 시킨 후, Illumina BeadArray Reader에서 BeadChip을 스캐닝하고, BeadStudio 프로그램을 이용하여 스캐닝된 이미지를 분석하였다. 검출 p-값 < 0.05를 나타내는 총 19554 프로브를 분석에 이용하였고, Quantile 정규화 방법에 따라 정규화 하였다. 통계적인 데이터 분석은 Arrayassist^TM (Stratagene, La Jolla, CA) 및 R(ver 2.5)을 이용하여 수행하였다.

8. miRNA 어레이(miRNA array)

735 miRNA를 포함하는 miRNA 어레이 분석은 제조자의 프로토콜(Illumina, Inc.)에 따라 실시하였다. 즉, 총 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen Inc.)을 이용하여 추출하였다. 총 RNA의 동일 양(200 ng)을 아데닐화 시키고, 바이오틴-표지 올리고 dT 프라이머를 이용하여 바이오틴화 cDNA를 합성하였다. 스트렙타비딘 비드를 함유한 고상에 cDNA를 부착시키고, DNA 중합효소로 프라이머 연장을 위한 miRNA-특이 올리고 풀(pool)에 혼성화시켰다. 연장된 산물을 용출하고 형광표지된 유니버셜 프라이머를 이용한 PCR 증폭반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 인간-miRNA-V1 BeadChip에 혼성화시킨 뒤, 상기 BeadChip을 Illumina BeadArray Reader를 이용하여 스캐닝하고, BeadStudio 프로그램을 이용하여 스캐닝된 이미지를 분석하였다. 검출 p-값 < 0.05를 나타내는 총 537 프로브를 분석에 이용하였고, Quantile 정규화 방법에 따라 정규화 하였다. 통계적인 데이터 분석은 Arrayassist(Stratagene, La Jolla, CA) 및 R(ver 2.5)을 이용하여 수행하였다.

9. 염색체 핵형분석(Karyotyping analysis)

6-웰 플레이트에서 배양한 세포를 37℃에서 3시간 동안 콜세미드(Colcemid; 150 ng/㎖) 처리하였다. 배지 흡입 후, 37℃에서 25분간 저장성(hypotonic) 용액(0.075 M KCl)에서 세포를 인큐베이션 하였다. 세포들을 천천히 피펫팅하여 15 ㎖의 튜브에 옮기고 원심분리 하였다. 펠렛을 고정액(fixative solution; 25% 아세트산이 첨가된 메탄올)에 녹이고 원심분리 하였다. 2차 고정 후에, 포천중문의과대학교의 Cytogenetics Core에서 염색체 G-밴딩(chromosomal G-banding) 분석을 수행하였다.

10. 인 비트로 분화 실험

EB 형성을 위하여, H9 및 iPS 세포를 분해용액을 이용하여 수확하고, 부유배양을 위하여 멸균된 디쉬로 옮긴 후, bFGF가 결핍된 인간 ES 배지에서 배양하였다. 7일간의 배양 후, 젤라틴이 코팅된 커버글라스에 EB를 부착시키고 다시 7일간 동일 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 상기에 기술된 방법에 따라 면역세포화학을 수행하였다.

11. 테라토마 형성

1

10⁶ iPS 세포를 DMEM/Matrigel 용액(BD Biosciences Inc.)에 1:1(v/v)의 비율로 재현탁 시킨 후, 세포/메트릭스 현탁액을 NOD/SCID 마우스(Charles River Laboratories, Yokohama, Japan)의 후외측(dorso-lateral) 부위에 피하 주사하였다. 6주 후에, 마우스에 케타민-자이라진(ketamine-xylazine; 각각 50 ㎎/㎏ 및 5 ㎎/㎏)을 복강내 주사(intraperitoneal injection) 하여 마취시켰다. 이종이식(xenograft) 덩어리를 수확한 후, 고정하고 파라핀에 포매(embed) 시킨 뒤 절편을 내었다. 조직 절편을 H&E, 오일-레드 또는 네스틴 및 사이토케라틴 17에 대한 항체(R&D Systems)를 이용하여 염색하였다. 상기 실험은 포천중문의과대학교의 동물실험위원회(The Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)가 재검토 및 승인하였으며, 모든 절차는 NIH(US National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals; NIH publication no. 85-23, revised 1996)에 따라 수행되었다.

12. 통계 분석

모든 데이터는 평균값± SEM으로 나타내었다. 본페로니 테스트(Bonferroni’s post hoc multiple comparison test)에 따른 일원배치분산분석 (one-way analysis of variance)을 이용하여 그룹 간 차이를 결정하였다. 0.05 미만의 p-값을 통계적으로 유의한 것으로 취급하였고 실험한 샘플의 수는 n으로 나타내었다.

실험결과

1. HASMC에서 재프로그래밍 전사인자의 발현

체세포 HASMC에서 iPS 세포를 생산하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 정량적 RT-PCR을 이용하여 HASMC에서 재프로그래밍 전사인자의 발현 정도를 조사하였다. 인간 ES 세포인 H9과 발현 수준을 비교하였을 때, HASMC에서 OCT4,SOX2, NANOG 및 LIN28의 발현 수준은 현저히 낮았으며, 반면에 KLF4의 발현수준은 조금 낮았다(도 1a). 게다가, c-MYC의 발현수준은 양 세포주에서 매우 낮았다(도 1a). 상기의 결과로부터, 본 발명자들은 강력한 발암유전자(oncogene)인 c-MYC(Adhikary and Eilers, 2005; Dalla-Favera et al., 1982)가 HASMC로부터 iPS 세포를 제조하는데 절대적으로 불필요하다는 것을 밝혀내었다. 본 연구에서는 HASMC에서 상대적으로 낮은 발현 수준을 나타낸 5개의 전사인자가 HASMC를 iPS 세포로 재프로그램하는데 이용되었다.

2. iPS 세포의 제조(Generation of iPS cells)

이어, 본 발명자들은 인간 OCT4,SOX2, KLF4, NANOG 및 LIN28을 함유한 렌티바이러스를 HASMC에 도입하였다. 형질도입된 HASMC를 블라스트시딘(blastcidin)으로 선별하고 MEF 피더 세포(mouse embryonic fibroblast feeder cell)에서 3주 동안 배양한 후, 일련의 섬유아세포-유사 덩어리(non-ES (NES) 세포) 및 일부 인간 ES 세포-유사 콜로니를 관찰하였다. 인간 ES 세포-유사 콜로니 및 두 섬유아세포-유사 세포 덩어리(음성 대조군)를 추려서 배양하고, MEF 피더 세포에서 성장시켰다. 처음 구축한 여섯 개의 iPS 세포주 중에 2개의 iPS 세포주(본 명세서에서 SES 세포라고 명명된 SES3 및 SES8 평활근 세포-유래 ES-유사 세포)를 30세대(passage) 이상 나타날 때까지 계속하여 배양하였다. SES-8 세포는 2009년 2월 19일자에 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에 기탁번호 KCLRF-BP-00205로 기탁하였다.

3. iPS 세포의 특성 규명

먼저, 본 발명자들은 구축한 iPS 세포에서 ES 세포 마커 유전자 및 렌티바이러스로 재프로그램한 트랜스유전자의 발현 특성을 규명하였다. RT-PCR분석은 6개의 세포주가 줄기성(stemness) 마커 유전자(UTF1, hTERT, LEFTB, TDGF1 및 GDF3)를 강하게 발현하고 전능성에 관련된 내생 유전자(OCT4, SOX2 및 NANOG)를 재활성화 시킨다는 것을 보여주었으나, 근원세포인 HASMC 및 NES는 그러하지 않았다(도 1b). 상기의 결과는 면역 형광 분석법을 통하여 SES 세포가 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase; AP), SSEA4, NANOG 및 OCT4와 같은 인간 ES 세포-특이 마커에 대하여 강하게 양성 염색 되는 것을 보여줌으로써 재차 확인되었다(도 1c). 유전자 특이 프라이머를 이용하여 렌티비이러스 형질전환 유전자의 발현 정도를 조사하였을 때, 두 SES 세포주(SES2 및 -8)는 단지 4가지의 형질전환 유전자를 발현한데 반하여, 네 개의 SES 세포주(SES3, -5, -9 및 -10)는 5가지의 형질전환 유전자를 모두 발현 하였다(도 1b). 특별히, SES8 세포는 외인성의 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 유전자를 포함하였으며, 이는 종래에 Thompson 및 그의 연구진에 의하여 사용된 것(Yu et al., 2007)과 동일한 유전자 조합이다. SES2 및 SES8 세포에서 유전자 발현이 부족한 것은 유전자-침묵 때문이 아니라 렌티바이러스 트랜즈유전자의 삽입 부재 때문인 것으로 지놈 PCR 분석결과 확인할 수 있었다. 다음으로, 염색체 핵형분석(Karyotyping analysis)을 통하여 SES8 세포가 HASMC와 같은 정상 염색체를 포함하고 있다는 것을 증명 하였으며(도 1d), 이는 재프로그램화 실험이 염색체 비정상화를 유도하지 않았다는 것을 나타낸다. 더욱이, 상기의 분석결과는 SES 세포가 웅성 기원(male origin)이며, 본 실험실에서 유일하게 인간 ES 세포로 이용되었던 자성 H9 세포의 오염으로부터 SES 세포가 유래되었을 가능성을 배제하는 것이다.

4. 인간 iPS 세포의 전체 유전자 발현 프로파일

SES8 세포와 H9 세포 간 및 SES8 세포 및 HASMCs 간의 전체 유전자 발현 패턴을 비교하기 위하여 cDNA 마이크로어레이를 이용하였다. 상기의 분석 결과 SES8 세포 및 HASMCs 간 발현 정도에 있어서는 분석된 16,283 유전자 중 972 유전자가 5배 이상의 차이를 나타낸 반면에, SES8 세포 및 H9 세포 간 발현 정도에 있어서는 단지 44 유전자가 5배 이상의 차이를 나타내었다. 상기의 데이터에서 스캐터 플롯(Scatter plots)은 SES8 세포를 유도한 HASMCs와 비교하여 SES8 세포와 H9 세포가 상당히 연관되어 있음을 나타내었다(도 1e). 주목할 만한 것은, SES8 세포가 H9 세포에서 관찰된 수준과 비슷하게 DPPA4(developmental pluripotency-associated 4), DNMT3B(DNA methyltransferase 3B), SALL4(sal-like 4) 및 REX1(reduced expression 1) 유전자를 강하게 유도하였으나, COL6A3(collagen type VI a3), COL1A2, ACTA2(smooth muscle actin a2) 및 FBLN5(Fibulin 5)를 포함하는 SMC-특이 유전자는 상당한 손실을 나타내었다(표 2).

HASMC 및 H9 세포와 비교하여 SES8 세포에서 선별된 유전자의 배수 변화(fold changes)

GenBank 접근번호	유전자 심볼 (정의)	변화 배수 (SES8/HASMC)	변화 배수 (SES8/H9)
NM_024674.3	LIN28 (lin-28 homolog)	439.57	2.05
NM_018189.2	DPPA4 (developmental pluripotency associated 4)	287.83	1.61
NM_006892.3	DNMT3B (DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3b)	165.24	1.22
NM_020436.2	SALL4 (sal-like 4)	116.56	1.23
NM_203289.2	POU5F1 (Oct3/4)	109.38	-1.55
NM_006017.1	PROM1 (prominin 1, AC133)	90.49	3.28
NM_000478.2	ALPL (alkaline phosphatase, liver/bone/kidney)	59.50	-1.17
NM_174900.2	ZFP42 (zinc finger protein 42, REX1)	59.08	1.32
NM_057164.2	COL6A3 (collagen, type VI, alpha 3)	-148.10	-2.11
NM_001613.1	ACTA2 (actin, alpha 2, smooth muscle, aorta)	-53.07	-3.89
NM_006329.2	FBLN5 (fibulin 5)	-52.31	-1.01
NM_000089.3	COL1A2 (collagen, type I, alpha 2)	-33.81	-2.53

논-코딩 작은 RNA(non-coding small RNA)인 miRNA(마이크로 RNA)는 세포증식 및 분화를 포함하는 많은 세포 프로세스뿐만 아니라 발달에 있어서 전사 후 단계를 조절하는데 관여한다(Bartel, 2004). 따라서, 본 발명자들은 재프로그램화 프로세스동안 miRNA 발현정도가 변화되는지 여부를 조사하였다. 도 2f에서 보는 바와 같이, 발현 패턴은 SES8 세포 및 HASMCs 간 보다 SES8 및 H9 세포 간에서 보다 높은 정도의 유사성을 보였다. 특히, 최근에 OCT4, NANOG 및 SOX2에서 조절된다고 보고(Barroso-delJesus et al., 2008; Laurent et al., 2008)된 ES 세포-특이 miR302-367 클러스터가 HASMCs에서 50-200배 더 낮은 수준으로 발현된 것과 대조적으로 SES8 및 H9세포 양쪽에서 높은 수준으로 발현 되었다. 상기의 데이터를 통하여 HASMCs으로부터 재프로그램화 된 SES8 세포가 원래의 HASMC-특이 특성을 잃고 mRNA 발현 패턴뿐만 아니라 miRNA 관점에서도 인간 ES 세포와 높은 유사성을 가진다는 것을 증명하였다.

5. iPS 세포의 인 비트로 분화 및 기형종 형성(In vitro differentiation and teratoma formation of the iPS cells)

인 비트로에서 인간 iPS 세포가 3 배엽층(germ layer)으로 분화할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 배아체(EB, embryoid body) 배양 시스템을 사용하였다. SES8 세포로부터 분화된 세포는 내배엽(α-fetoprotein AFP), 중배엽(α-SMA, vimentin) 및 외배엽(βIII-tubulin) 마커에 대하여 양성으로 염색되었다(도 2a). 상기의 면역형광법 데이터에 따라, RT-PCR 분석은 EB-중재 분화가 FOXA2(forkhead box A2, 내배엽), 브라티키어리(Brachyury, 중배엽) 및 PAX6(paired box 6, 외배엽)을 유의성 있게 상향조절(upregulate) 되었으나, SES8 및 H9 양자에서 OCT4, SOX2 및 NANOG의 내부 발현을 현저하게 감소시킨다는 것을 나타내었다. 게다가, 면역결핍성(immunodeficient) 마우스의 외측 등쪽 부위(lateral dorsal region)에 피하이식을 하여 인 비보상에서 SES8 세포의 전분화능을 확인하였다. 세포주입이 있은 후 6주가 지나서, 장-유사 상피(cytokeratin 17, 내배엽), 지방 조직(oil-red, 중배엽) 및 신경 조직(nestin, 외배엽)을 포함하는 모든 3 배엽층 유도체를 함유한 기형종을 관찰할 수 있었다(도 2c). 요컨대, 상기 데이터는 SES8세포가 인 비트로 및 인 비보 상에서 3배엽층으로 분화될 수 있다는 것을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1a-1f는 HAMSCs로부터 iPS 세포의 생성 및 iPS 세포의 특성을 보여주는 도면이다. 도 1a는 인간 ES 세포(H9, 검정막대) 및 HASMCs(회색막대)에서의 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4 및 c-MYC의 내인적 발현에 대한 실시간 RT-PCR 결과를 보여주는 그래프이다. n=3; 평균± SEM. 도 1b는 iPS 세포 클론에서 인간 ES 세포-마커 유전자, 내인적 유전자 및 렌티바이러스 트랜스유전자의 발현 프로파일링을 보여주는 이미지이다(NES, non-ES like cells; SES, 평활근 세포-유래 ES 유사세포; STO, 마우스 배아 섬유아세포주; endo, 내인적 유전자; exo, 렌티바이러스 트랜스유전자; total, endo + exo). 렌티바이러스 DNA에 대한 RT-PCR 분석은 iPS 세포에서 트랜스유전자 발현의 유무를 보여준다. GAPDH는 RT-PCR에서 로딩 대조군으로 이용되었다. 도 1c는 iPS 세포의 면역형광분석에 대한 대표적 이미지이다. ES 세포-특이 표면 항원(SSEA-4), OCT4, NANOG 및 AP의 명확한 발현이 관찰되었다. 핵을 DAPI로 염색하였다. 크기 막대는 100 ㎛이다. 도 1d는 SES-8 세포의 핵형 분석 결과이다. 도 1e-1f는 iPS 세포(SES8)와 H9, 그리고 SES8 세포와 선조 HASMCs 사이의 전체 mRNA(도 1e) 및 miRNA(도 1f) 발현 패턴을 비교한 스캐터 플롯팅이다. 적색선은 쌍을 이루는 세포 사이의 mRNA 또는 miRNA 발현 레벨에서 두 배의 변화를 나타낸다. 스캐터 플롯에서, 선택된 mRNA 및 miRNA의 위치는 화살표로 나타내었다.

도 2a-2c는 HASMC-유래 iPS 세포의 전능성을 보여주는 이미지이다. 도 2a는 iPS 세포(SES8)의 3배엽층으로의 인 비트로 EB-매개 분화를 보여주는 이미지이 다. EB를 젤라틴-코팅 플레이트 상에서 분화 배지에서 배양하고 AFP (내배엽), α-SMA(중배엽), 비멘틴(중배엽) 또는 β3-튜불린(외배엽)으로 염색하였다. 핵을 DAPI로 염색하였다. 크기 막대는 100 ㎛이다. 도 2b에서, 재프로그래밍 인자 및 다양한 분화 마커의 발현 레벨 변화를 미분화(U) 및 인 비트로-분화 세포(D)에서 RT-PCR로 평가하였다. 도 2c는 3배엽층을 포함하는 SES8 세포로 유래된 테라토마를 보여준다. SES8 세포를 NOD/SCID 면역결핍 마우스에 피하주사하고 6주 후에 테라토마를 수집하였고, 이의 섹션을 H & E, Oil-Red(지방세포, 중배엽), 그리고 네스틴(신경 로제트, 외배엽)과 사이토케라틴 17(거트-유사 표피, 내배엽)에 대한 항체로 염색하였다. 크기 막대는 200 ㎛이다.

Claims

인간 평활근 세포-유래 유도성 전능줄기세포(induced pluripotent stem cell).
제 1 항에 있어서, 상기 인간 평활근 세포는 대동맥 평활근 세포인 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 동일한 핵형(karyotype)을 가지는 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 UTF1, hTERT, LEFTB, TDGF1, GDF3, OCT4, SOX2 및 NANOG로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 마커 유전자를 인간 평활근 세포와 비교하여 고발현하는 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 알카라인 포스파타아제, SSEA4, NANOG 및 OCT4로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 양성 염색되는 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 비교하여 다음의 유전자 중 최소 한 유전자를 고발현하는 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포: LIN28(lin-28 homolog), DPPA4(developmental pluripotency associated 4), DNMT3B[DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3β], SALL4(sal-like 4), POU5F1(Oct3/4), PROM1(prominin 1), ALPL(alkaline phosphatase) 및 ZFP42(zinc finger protein 42).
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 비교하여 다음의 유전자 중 최소 한 유전자를 저발현하는 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포: COL6A3(collagen type VI, alpha 3), ACTA2(actin alpha 2), FBLN5(fibulin 5) 및 COL1A2(collagen type I, alpha 2).
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 인간 평활근 세포와 비교하 여 배아줄기세포-특이 miR302-367 클러스트를 고발현 하는 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 외래의 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 전능 줄기세포는 외래의 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 및 KLF4 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 유도성 전능 줄기세포.
인간 평활근 세포에 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 트랜스유전자의 조합을 도입시키는 단계를 포함하는 유도성 전능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 상기 인간 평활근 세포는 대동맥 평활근 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 트랜스유전자의 조합은 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 및 KLF4 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 트랜스유전자의 도입은 레트로바이러스에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 인간세포에서 작동가능한(operable) 프로모터를 포함하고 상기 트랜스유전자는 상기 인간세포에서 작동가능한 프로모터의 조절 하에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 인간세포에서 작동가능한 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 벡 시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 AFP 프로모터 또는 알부민 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 인간세포에서 작동가능한 프로모터는 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.