JP2016517861A - 亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物の獲得方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物の獲得方法において、前記オリゴ糖が一方では１５０００〜５００００Ｄａ、そして他方では５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来する高いモル質量を有している方法に関する。本発明は同様に、この方法を使用して得られるオリゴ糖混合物、ならびに、特に皮膚修復および皮膚の老化防止のための、この混合物の応用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、特に植物由来のオリゴ糖に関し、より詳細には、化粧品または皮膚科分野におけるこれらのオリゴ糖の使用に関する。

本発明は、より詳細には、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の化粧品または皮膚科向け使用、および例えば粘質物溶液の加水分解および分画後のこれらのオリゴ糖の獲得方法に関する。

詳細には、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖は、特に、皮膚組織の修復を促進するために使用可能であり、同様に、皮膚の老化作用を防止するためにも使用可能である。

皮膚の修復は、皮膚が受けた損傷または病変を修復し、損傷前の元の組織に近い組織を復元する目的で実施される一連のプロセスによって構成されている。

一方、皮膚の老化は、解剖学的および組織学的構造の変化、ならびに細胞機能の変化の原因となる。

皮膚の老化は、様々な因子、特に例えば酸化ストレスなどに起因する細胞の変化のみならず、外的因子、例えば汚染、タバコまたはアルコールの摂取、日光に対する過度の曝露などの結果としてもたらされる。

皮膚の老化は、シワ、および概して褐色の色素斑の出現、ならびに皮膚の緊張低下の形で現われる。

先行技術は、目に見える皮膚の老化の表れを防止することを目的とするいくつかの方策を提案している。これに関して、特に以下の技術を挙げることができる：
− 褐色斑および細かいシワなどの欠点を矯正するためのレーザー治療；
− ボツリヌス毒素、ヒアルロン酸さらにはコラーゲンの注入；
− 大量の表皮層の除去からなるピーリング；
− リフティング：
− その他。

しかしながら、現在の技術は、望ましくない一定数の副作用を示し、満足のいく結果がつねに得られるとはかぎらない。

したがって、数年来、皮膚の老化作用をより効果的かつより自然な形で防止する目的で、かつこのプロセスを減速させようとして、各研究機関により他の戦略が開始されている。病変の場合には、皮膚の組織修復を促進するための解決法を発見することもまた、必要だろう。

特に、近年になって皮膚の老化の兆候を減少させるための化粧品用組成物中のオリゴ糖の使用についての研究が進められている。実際、糖ベースの分子は、特にその保湿特性のため極めて有利である。

こうして、一部の特許出願が、オリゴ糖を含む化粧品用組成物に関するものとなっている。詳細には、国際公開第９９／２４００９号は、一部の化合物、すなわちプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの合成を増大させるためのキシロースを含むオリゴ糖の使用について特に記載している。ただし、この文書中では、使用されるキシロースは市販の製品であり、植物由来の自然製品ではない。

米国特許出願公開第２００７／０２９３４３３号明細書は同様に、市販製品からなるペクチンの酵素加水分解により得た複数のオリゴ糖を含む老化防止用組成物に関する。

さらに、米国特許出願公開第２００４／００９７４６４号明細書から、微生物が行なう加水分解により得られるオリゴ糖混合物、特にフコース混合物を含む組成物が公知である。ここで記載されているオリゴ糖混合物は、多数のステップを含む複雑な方法の実施を必要とし、これらのステップのいくつかは、化粧品利用分野向けの混合物からは必然的に除外されなければならない病原微生物の作用を必要とする。

その上、上述の文書中に記載されている組成物は、特に先行技術ではほとんど解決法の存在しない皮膚修復の刺激において、充分に有効な作用を示さない。

同様に、植物、特にＬｉｎａｃｅａｅ科に属する植物である亜麻（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に由来する有効成分を、老化の表れを防止するための用途に使用することも公知である。

こうして国際公開第２００８／０４３９４４号から、皮膚の老化を防止するための化粧品用組成物の調製向けの亜麻に由来する有効成分の使用、ならびにこれらの成分を獲得する方法が公知である。

国際公開第９９／２４００９号 米国特許出願公開第２００７／０２９３４３３号明細書 米国特許出願公開第２００４／００９７４６４号明細書 国際公開第２００８／０４３９４４号

しかしながら、この特許出願に記載されている方法によって得られる有効成分は、一定数の構成要素、すなわち大半を占める５０００Ｄａ未満の高濃度のモル質量のタンパク質、単糖類、ウロン酸、炭水化物などを含んでいる。

その結果、この構成要素の多様性のため、ターゲティングされた特異的作用が可能とならず、特にこのような成分の差異のため、皮膚が損傷を受けた場合に効果的に皮膚の修復を促進することができなくなる。

本発明の枠内で、出願人らは、亜麻の種子に由来する一部の特定のオリゴ糖が、特に皮膚組織修復プロセス中で起きる現象の有効な刺激を可能にすることを発見し、これらのオリゴ糖の抽出方法を開発した。

より詳細には、これは、高いモル質量を有する中性オリゴ糖であり、これらのオリゴ糖は、一方では５０００〜１５０００Ｄａ、他方では１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画によって得られる。

このように本発明は、亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖混合物の獲得方法において、前記オリゴ糖が高いモル質量を有し、
− 亜麻粘質物溶液の酸性ｐＨでの加水分解を実施するステップであって、この粘質物溶液が溶媒中の亜麻の種子の抽出により得られるステップと；
− 適量の塩基を添加することにより前記溶液を中和するステップと；
− 細孔度５００００Ｄａの膜を通した溶液の第一の限外濾過を実施して、第一の保持液および第一の透過液を得るステップと；
− 細孔度１５０００Ｄａの膜を通した前記第一の透過液の第二の限外濾過を実施して、第二の保持液および第二の透過液を得るステップと；
− 細孔度５０００Ｄａの膜を通した前記第二の透過液の第三の限外濾過を実施して、第三の保持液および第三の透過液を得るステップと；
− 第二の保持液と第三の保持液とを混合して前記オリゴ糖混合物を得るステップであって、前記第二の保持液が１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含み、かつ前記第三の保持液が、５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含んでいるステップと、
を含む方法に関する。

本方法の他の詳細な特徴によると、
− 亜麻の種子の抽出は、好ましくは水性溶媒中で実施される；
− 有利には、ｐＨ２および８０℃の温度で２４時間、粘質物溶液の加水分解を実施する；
− 好ましくは、少なくとも水酸化バリウムおよび水酸化ナトリウムを含む群から選択される強塩基を適量添加することによって、前記粘質物溶液を中和する。

本発明は同様に、一方では１５０００〜５００００Ｄａ、そして他方では５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含む、本発明に係る方法を使用することによって得られる亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物にも関する。

特に有利には、前記混合物は、少なくともフコースおよび／またはアラビノースおよび／またはガラクトースおよび／またはグルコースおよび／またはキシロースを含む糖鎖を有するオリゴ糖を含む。

有利には、前記混合物は、ラムノースを含む糖鎖を有する低比率オリゴ糖、および低比率のウロン酸を含んでいる。

亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物は有利には、皮膚の老化作用を防止する目的、または皮膚組織の修復を促進する目的で皮膚科または化粧品の用途に使用することができる。

好ましくは、前記混合物はまた、以下のものを刺激するために使用可能である：
− 線維芽細胞の増殖；
− 線維芽細胞の化学走性；
− 線維芽細胞の細胞移動；
− 線維芽細胞によるＩＩＩ型コラーゲン、および／またはＩＶ型コラーゲンの合成。

同様に、亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物は有利には、線維芽細胞によりルミカン合成を刺激すること、およびデコリン合成を阻害することも可能にする。

前記混合物は同様に、ケラチノサイトの分化を誘発するためにも使用可能である。

亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物はさらに、特に創傷の治癒を促進するために使用可能である。

本発明は同様に、本発明に係る中性オリゴ糖混合物と、化粧品または皮膚科的に許容できる少なくとも一つのビヒクルとを含む、皮膚科用または化粧品用組成物にも関する。

有利には、組成物中、中性オリゴ糖の濃度は０．１〜５ｍｇ／ｍＬである。

特定の一実施形態によると、本発明に係る亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物は同様に、医薬品として、詳細には特に慢性潰瘍におけるまたは外科手術後の組織の治癒を促進するためにも使用することができる。

本発明の他の特徴および利点は、添付図面を参照しながら本発明の非限定的な実施形態についての以下の詳細な説明から明白になるものである。

亜麻の種子の粘質物から得た試料Ｅ１〜Ｅ７の特徴をまとめた表からなる。特に有利である画分Ｅ４とＥ６は、表中において丸で囲まれている。 生きた細胞の数が比色分析によって評価されているヒストグラムを用いて、異なる濃度のオリゴ糖の存在下に置かれた線維芽細胞に対する亜麻の種子の中性オリゴ糖の細胞毒性の不在を示している。 異なるインキュベーション時間（２４、４８および７２時間）後の線維芽細胞の増殖に対する亜麻の種子の中性オリゴ糖の効果を表わしている。 亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖に曝露されたか否かに応じて、移動した細胞の数をヒストグラムによって示している。 同様に、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の異なる濃度に応じた、線維芽細胞の移動を示している。 オリゴ糖画分の存在下または不在下での線維芽細胞の軌道のグラフ表示である。 オリゴ糖の存在下での、２４時間（図７Ａ）または４８時間（図７Ｂ）にわたるＩＩＩ型コラーゲンの合成を、ヒストグラムの形でグラフ表示している。 亜麻の種子のオリゴ糖の存在下または不在下における、線維芽細胞中のＩＶ型コラーゲンの発現を示すウエスタンブロット膜の写真に対応する。 亜麻の種子のオリゴ糖の存在下または不在下における線維芽細胞中のデコリンおよびルミカンであるプロテオグリカンの遺伝子の発現を示すアガロースゲルの写真に対応する；ＧＡＰＤＨ遺伝子が、対照として使用されている。

本発明は、亜麻、特にＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ種の種子に由来する中性オリゴ糖の混合物を獲得する方法に関する。前記混合物は、有利には、溶媒中の亜麻の種子の抽出により得られる前記種子の粘質物溶液から、制御された加水分解、そして次に分画によって得られる。

以下の説明において、「オリゴ糖」とは、５００００Ｄａでの限外濾過を通して通過可能なモル質量を有する、粘質物の高温酸加水分解に由来する全てのオシド（ｏｓｉｄｉｃ）ポリマーまたはオリゴマーを意味する。

「中性オリゴ糖」とは、電荷を含まずＮ−アセチル残基を含まないオリゴ糖を意味する。

「粘質物」とは、オシドポリマー、特に、亜麻の種子をとりわけ包み込む多糖類で構成された植物性物質を意味する。

「粘質物溶液」とは、溶媒、特に、例えば水などの水性溶媒中に亜麻の種子を浸漬させた後に得られ、オシドポリマーによって大部分が構成されている溶液を意味する。

有利には、本発明に係る方法は、一方では１５０００〜５００００Ｄａ、そして他方では５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含む、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の混合物の獲得を可能にする。

本発明は同様に、本方法を用いることで得られる亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の混合物にも関する。

本発明はさらに、特に化粧品または皮膚科での用途を有し、かつ本方法により得られる亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物を含む組成物にも関する。これらのオリゴ糖以外に、前記組成物は同様に、化粧品または皮膚科的に許容できる少なくとも一つのビヒクルを有利にも含んでいる。

本発明に係る組成物は、クリーム、ジェル、ローション、セラム、ムースまたは軟膏のいずれかの形を呈することができる。

前記組成物はより詳細には、皮膚上、さらには身体表面成長部のレベルに用いることを目的としている。

皮膚は、身体を完全に覆う複雑な器官である。皮膚は、生体の生存に必要な複数の機能、特に、物理的であれ化学的であれさらには生物学的なものであれあらゆる外的攻撃から保護するという機能を果たす。

皮膚は、三つの主要な層、すなわち表面部分である表皮と、それに続くより厚みのある層である真皮、そして最も奥の層である皮下組織で構成されており、これらの層の内部で細胞が全体として相互に作用して、皮膚の複数の機能を果たしている。

表皮は、外部環境と直接接触する層である。表皮は、病原体の進入を妨げ水分と栄養素を内部に維持することによって生体を保護する。表皮の平均厚みは１００μｍであるが、この厚みは、体の領域、および角質化レベルに応じて著しく変動し得る。

表皮の主要な細胞は、ケラチノサイトである。これは、特に炎症性および免疫性の皮膚応答において多くの役割を有し、こうして保護バリアを構成する。

表皮は、ＩＶ型コラーゲンを主成分とする基底膜と呼ばれる膜により、真皮から分離されている。

真皮は、皮膚に柔軟性および強度を与える層である。その厚みは、解剖学的局在性に応じて著しく変動する。

真皮は主として、それに圧縮性および弾性を付与する結合組織で構成されている。これは、血管、体毛、神経終末、および皮脂腺、および汗腺などの、様々な皮膚付属器官のための支持体を構成している。

これらの付属器官は、大部分がＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンで構成されている線維で取り囲まれており、これらの線維が真皮の柔軟性と可撓性を確保している。

コラーゲンは、細胞外基質の主成分の一つである。それは、特に組織修復プロセスの際に合成されるタンパク質である。しかしながら、コラーゲン合成は、年令に応じて減少する。

線維芽細胞は、真皮の大部分を占める細胞である。これらは、あらゆるタイプの線維、特にコラーゲン線維、ならびに基底膜の他の成分を合成する。

真皮線維芽細胞は、皮膚の不可欠な構成要素である。これらは、真皮の細胞外基質を産生し組織し、他の細胞型に通じて、皮膚の生理機能の調節において重大な役割を果たす。

時間の経過につれて、皮膚は、外部と同様内部的にも多くの攻撃を受ける可能性がある。皮膚が損傷または病変をこうむった場合、この損傷を修復し、可能なかぎり元の組織に近い組織を復元するため、プロセス全体が実施される。

詳細には、老化は、皮膚の変化の主要な因子である。老化は、解剖学的および組織学的構造を変更し、細胞の機能を変化させる。こうして皮膚は、深いレベルでの再構成を受ける。

皮膚の老化は、複雑で密に結びついた様々な因子の結合から生じる。

詳細には、皮膚の老化は、テロメアの短縮、酸化ストレス、ＤＮＡ修復系の劣化などの多くの細胞変化の結果としてもたらされ、これらの変化に外部因子、例えば日光に対する曝露、汚染、気候的攻撃のみならずアルコールまたはタバコの摂取、さらには食生活などが加わる。

表皮の老化は、主としてその厚みの減少という形で現われる。この萎縮は、一方では老化したケラチノサイトの蓄積、そして他方では、表皮に特徴的な陥入の漸進的喪失の結果である。

基底ケラチノサイトは、サイズおよび形状の差異を示し、形態学的変化ならびにそれらの増幅能力の低下を示唆する。その上、外傷性障害後の表皮の再生能力は、加齢に伴って低下する。

その上、表皮の付着特性は、下接する基底膜に対する基底ケラチノサイトの付着に関与するベータ−１インテグリンの発現の減少と正比例して衰える。真皮−表皮接合部の凝集およびケラチノサイトの付着に役立つ基底膜のＩＶ型コラーゲンも同様に、老化につれて減少する。

最後に、老化はメラノサイトおよびランゲルハンス細胞の数の減少をひき起こして、攻撃に対する表皮の保護能力に影響を及ぼす。

皮膚の老化過程で、真皮は同様に、高密度でかつ含まれる脈管分布が少なく見える状態にある細胞外基質を伴う、深い組織崩壊の源でもある。その萎縮は主として、線維芽細胞の数およびサイズの減少、特にその合成能力の低下に起因する。

詳細には、コラーゲン小線維は、顆粒状の外観をとり、線維はより緻密になる。線維は解離し、真皮表面に対し平行な方向に向く傾向をもつ。コラーゲン線維ならびに弾性物質の変化、プロテオグリカンの内容の変化、およびコラーゲン束との直接的接触のない静止状態にある線維芽細胞の出現が、老化する真皮の主要な特徴である。

これらの組織学的および生物学的変化全てが、皮膚の特性に対する重大な機能的影響をもたらし、様々な外部攻撃に対する適応性の低い応答を引き起こす。

組織の修復は、組織が外部攻撃による損傷を受けた場合の自然な反応の例である。このプロセスは系統的に進行し、炎症、増殖および成熟という三段階で起こる。

組織修復の際の第一の事象は、炎症段階、脈管および細胞応答により、特徴づけされる。これらのうち、多くの内皮および脈管の炎症性細胞の到来が観察される。これは、化学誘引特性を有する因子の産生を介して行なわれる。

増殖段階の間、顆粒状組織の形成が重要事象である。炎症性細胞、線維芽細胞、細胞外基質の分子（フィブロネクチン、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカン）は、顆粒化組織を形成する。この組織は、攻撃から３〜５日後に形成され、炎症段階後に突然現われる。

上皮が損傷した場合、傷の周辺の表皮細胞は増加し、移動して健全な組織を覆う。このプロセスが完了すると、表皮細胞はその当初の形状および役割を取り戻す。この段階の間、線維増殖が起こり、線維芽細胞はこの段階において極めて重要な役割を果たす。線維芽細胞は、コラーゲン（そしてより詳細にはＩＩＩ型コラーゲン）、エラスチン、フィブロネクチンおよびグリコサミノグリカンの産生を担う。その上、線維芽細胞は移動し、増殖する。

第三段階は、真皮および表皮の修復が終結する成熟およびリモデリング段階である。

この段階の過程で、線維の成熟および細胞アポトーシスが発生し、この細胞アポトーシスは、当初の組織に近い組織の形成を導く。再編成は、特にコラーゲンのレベルで行なわれる。メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）と呼ばれるタンパク質によって、規則的で秩序立った線維を復元するためにコラーゲン合成が持続する一方で、プロセスの早期段階において無秩序に堆積するコラーゲンの量を制御することができる。これらのＭＭＰの阻害物質は、これらの酸素の活性を調節する。したがって、新しいコラーゲンの形成と古いコラーゲンの破壊の間に平衡が作り出される。当初堆積するコラーゲンＩＩＩは、大幅に減少して、コラーゲンＩに場所を空ける。

加齢に伴って、皮膚老化の過程で、組織修復の効率が悪化する。詳細には、線維芽細胞の増殖および移動が少なくなり、コラーゲンの合成は減少する。

出願人は、亜麻の種子（特にＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に由来する中性オリゴ糖混合物を得ることができるようにする方法を開発した。本発明に係る方法により得られる前記混合物は、その特殊なオリゴ糖組成によって、皮膚の老化の目に見える兆候の出現を遅延させることを促進しながら、組織修復の際に実施されるプロセスの効率を実質的に改善することができる。

行なわれてきた実験および研究は、一方では５０００〜１５０００Ｄａ、そして他方では１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を示す、本発明に係る方法によって得たオリゴ糖混合物が、皮膚の修復を改善するために極めて有利であることを明らかにしている。

有利にも、好ましくは複数のオリゴ糖を含むこのような混合物は、本発明に係る方法を使用することによって亜麻の種子の粘質物溶液から得られ、特に線維芽細胞およびケラチノサイトなどの組織修復の機序に介入する細胞に対する肯定的な作用を可能にする傑出した特性を有している。

好ましい実施形態によると、本発明に係る方法の実施による亜麻の種子由来の中性オリゴ糖混合物は、動物においてもヒトにおいても、創傷の治癒を促進するために使用可能である。

こうして、有利にも、このような混合物は、創傷のより迅速な治癒を可能にするような形で、任意の創傷のレベルに適用するようになっているパッチまたは包帯タイプの医療用装具に組込むことができる。

極めて有利なことに、本方法によって得られるオリゴ糖混合物は同様に、ヒト医療の分野または獣医学の分野のいずれにおいてであれ、医薬品として使用することも可能である。

詳細には、前記オリゴ糖混合物は有利にも、特に慢性潰瘍においてまたは外科手術後に、特に結合組織の線維芽細胞に対するその有益な作用によって、組織の治癒を促進することができる。

本発明に係る方法により得た亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の混合物の特性は、以下の実施例において、様々な添付図面に関連づけて展開され、例示される。

実施例１：オリゴ糖画分の調製方法
本発明に係る方法において、粘質物溶液は、溶媒中において、好ましくは高温、例えばおよそ８０℃の温度で、黄色亜麻の種子を抽出することによって得られる。前記亜麻の種子は、特にＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍに由来し、前記種子と溶媒、有利には水、との間の比は、好ましくはおよそ１／１０である。

この抽出ステップの後には、有利には遠心分離が続き、液体抽出物をエタノール媒質中で回収し沈殿させるが、このとき、前記抽出物とエタノールの間にはおよそ１／４の比が用いられる。

有利には、抽出物を、加水分解ステップのため再び２％溶液に戻す。この溶液を、好ましくは、硫酸Ｈ₂ＳＯ₄を添加することによりｐＨ２で加水分解する。加水分解反応は有利には、およそ８０℃の温度で２４時間にわたり実施される。

ただし、ｐＨおよび温度のパラメータ、ならびに加水分解の持続時間は、必要に応じて加減することができる。

加水分解ステップの後、溶液を、例えば、特に水酸化バリウムＢａ（ＯＨ）₂および水酸化ナトリウムＮａＯＨを含む群の中から選択される適量の強塩基を添加することによって中和する。

しかしながら、粘質物溶液の中和を可能にする他のあらゆる塩基を使用することも同様に可能である。

その後、溶液に一連の複数の限外濾過を行ない精製する。

溶液の第一の限外濾過は、５００００Ｄａの細孔度閾値を有する好ましくは無機質膜を通して行なう（Ｃａｒｂｏｓｅｐ、直径６ｍｍ、三ツ葉形、表面積６．８ｍ²）。好ましくは５〜７の体積濃縮係数で実施されるこの第一の限外濾過の後、５００００Ｄａのカットオフ閾値を通過しないモル質量を有する化合物および分子を含む第一の保持液と、この細孔度閾値を通過するモル質量の化合物が中に再び見出される第一の透過液とを得る。

このとき、この第一の透過液に、有利には４〜８の体積濃縮係数で実施される第二の限外濾過ステップ（好ましくは、無機質膜（１５０００Ｄａ、ＩｎｓｉｄｅＣｅｒａｍ、直径２０ｍｍ／１３チャネル、表面積０．８ｍ²）上）を行い、第二の保持液と第二の透過液を得る。

１５０００Ｄａ膜上での第二の限外濾過ステップの後に得られた第二の透過液に、さらに、例えば４〜８の体積濃縮係数で実施される限外濾過ステップ（好ましくは、無機質膜（５０００Ｄａ、ＩｎｓｉｄｅＣｅｒａｍ、２０ｍｍ／１３チャネル、表面積０．８ｍ²）上）を行なう。このとき、第三の保持液と第三の透過液を得る。

したがって、限外濾過の終了時点で、７種の試料または画分、すなわち、出発加水分解生成物（Ｅ１）、第一の保持液５００００Ｄａ（Ｅ２）、第一の透過液５００００Ｄａ（Ｅ３）、第二の保持液１５０００Ｄａ（Ｅ４）、第二の透過液１５０００Ｄａ（Ｅ５）、第三の保持液５０００Ｄａ（Ｅ６）、および第三の透過液５０００Ｄａ（Ｅ７）を得る。

より詳細には、対象となる試料は、番号Ｅ４（第二の保持液）とＥ６（第三の保持液）であり、それぞれ、一方ではＥ４の場合の１５０００〜５００００Ｄａ、そして他方ではＥ６の場合の５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来する高いモル質量を有するオリゴ糖を含んでいる。

これらの試料は、液体の形に残すか、または凍結乾燥させる。

第二および第三の保持液の混合物によって、対象となるオリゴ糖混合物を得ることが可能となる。

実施例２：オリゴ糖画分の特徴づけ
試料を、光散乱（ＭＡＬＳ：Ｍｕｌｔｉ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）と結合されたサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、および示差屈折率測定検出器（ＤＲＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ）で分析した。分析ラインは、脱気装置１基（ＤＧＵ−２０Ａ３ 島津製作所、日本）、吐出流量０．５ｍＬ／分のＨＰＬＣポンプ１基（ＬＣ１０Ａｉ、島津製作所、日本）、オートインジェクター１基（ＳＩＬ−２０Ａ、島津製作所、日本）、直列取付け式のＳｈｏｄｅｘカラム２基（ＯＨｐａｃｋ ＳＢ８０２．５およびＳＢ８０４）、５０μＬ入りセルＫ５ １基と測定用ダイオード１８基を備えた多角度光散乱検出器ＭＡＬＳ１基（Ｄａｗｎ ＥＯＳ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）、および示差屈折率検出器１基（ＲＩＤ １０Ａ、島津製作所、日本）で構成されている。Ｚｉｍｍ方法１次を使用して、ソフトウェアＡｓｔｒａ６（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、画分を特徴づけする。使用される屈折率（ｄｎ／ｄｃ）の増分は０．１５ｍＬ／ｇであり、これは、オリゴ糖または多糖の伝統的平均値である。

画分に応じて２、５、１０または２０ｇ／Ｌのオリゴ糖濃度を有する溶液は、凍結乾燥されたオリゴ糖混合物を０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液中で可溶化することによってか、または当初の溶液の乾燥抽出物を考慮に入れて液体形態の混合物を希釈することによって製造する。３０ｍＬの体積のこれらの溶液を採取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅブランドの０．４５μｍの細孔度の再生セルロース膜を用いて１０分間真空下で濾過して、過剰散乱する不溶性化合物を全て除去し、きれいな基線を得る。

屈折率測定ピークと光散乱ピークを統合することによって、１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来する第二の保持液（Ｅ４）について、１７０００ｇ／ｍｏｌという数平均モル質量と、３１０００ｇ／ｍｏｌという重量平均モル質量（測定誤差限界＋／− ２０００ｇ／ｍｏｌ）が得られる。

５０００〜１５０００ｇ／ｍｏｌのカットオフ閾値に由来する第三の保持液（Ｅ６）については、数平均および重量平均モル質量はそれぞれ、＋／− １０００ｇ／ｍｏｌの測定誤差限界で４０００ｇ／ｍｏｌと５０００ｇ／ｍｏｌである。

測定誤差限界は、モル質量が小さいことを理由とした小さい光散乱信号に起因するものである。

得られた他の結果は、図１の表中に列挙されている。

この表中、ＭＳは回収された乾燥質量に対応する。「灰分／ＭＳ」という用語は、試料の乾燥物質との関係における灰分含有量に対応する。

乾燥物質含有量を、以下の条件、すなわち１０３℃で最低１６時間にわたる恒温器による乾燥によって決定する。

灰分含有量は、以下の条件、すなわち温度勾配（１０３℃、５５０℃、７００℃）で２０時間、マッフル炉内で試料を処理することによって決定する。

「プロト」という用語は、Ｋｊｅｌｄａｈｌ方法によって決定されたタンパク質の百分率に関するものである。

「ウロン酸」の欄は、比色分析によって秤量された回収ウロン酸の量を示すことができる。

各試料のオリゴ糖百分率は、糖全体の百分率から遊離糖の百分率を減じることによって求めることができる。

特に、興味深い画分Ｅ４およびＥ６において、分析対象の試料中のウロン酸百分率が小さく、好ましくは１２％未満、より好ましくは５％未満であることは、注目に値する。

その上、異なる試料中のオリゴ糖プロファイルを分析すると（結果は示さず）、有利なオリゴ糖混合物を含む第二および第三の保持液中で、オリゴ糖鎖がほとんどラムノースを含まないことがわかる。

実際、ラムノースおよびウロン酸を含む電離したオシド鎖は、加水分解の影響をほとんど受けず、そのためオリゴ糖混合物はこれらの分子をほとんど含まない。

こうして、有利にも、最も活性の高い画分を構成するオリゴ糖の中性画分は、本発明に係る方法の加水分解ステップによる影響を最も強く受けるものである。

オリゴ糖プロファイルを同様に、試料中でも分析した。特に、各試料中のオリゴ糖百分率が、前記試料の合計重量との関係における質量％で４０〜８０％であることがわかった。

その上、試料中に存在するオリゴ糖鎖が、フコース、アラビノース、ガラクトース、グルコースおよびキシロースという単糖を特に含むことも明らかになった。

皮膚細胞に対するオリゴ糖画分の効果
様々な試料Ｅ１〜Ｅ７を試験して、詳細には特に皮膚修復プロセスに介入する細胞に対するそれらの効果を評価した。

実施例３：線維芽細胞およびケラチノサイト上で得た画分の細胞毒性の不在
成人の皮膚に由来する真皮線維芽細胞および表皮ケラチノサイト（外科手術の際に得た皮膚のフラグメントまたは市販の細胞培養（Ｌｏｎｚａ（登録商標）、スイス））を、インビトロで培養した。初代培養中の細胞について実験を行ない、インビボで存在する条件にできるかぎり近づくようにした。

これらの細胞培養について行なった研究により、およそ５ｍｇ／ｍＬのオリゴ糖濃度までは、亜麻の種子由来のオリゴ糖を含む試料が、真皮線維芽細胞または表皮ケラチノサイトタイプの細胞について細胞毒性をもたないことが明らかになった。

得られた結果は、添付図面２のヒストグラム上に見られる。この図は、生きた細胞が様々なオリゴ糖画分の存在下にある場合の、縦座標に４５０ｎｍの吸光度で表わしたこれらの細胞の数を示している。

より詳細には、試験した画分は、加水分解生成物Ｅ１（図２Ａ）、第二の保持液Ｅ４（図２Ｂ−１５０００〜５００００Ｄａの限外濾過カットオフ閾値間に含まれるモル質量を有するオリゴ糖を含む画分）と、保持液Ｅ６（図２Ｃ−５０００〜１５０００Ｄａの限外濾過カットオフ閾値間に含まれるモル質量を有するオリゴ糖を含む画分）である。

これらの画分を、インビトロで培養し、コンフルエンスに達した成人のヒト真皮線維芽細胞上において様々な濃度（０．５；１．０；２．０および５．０ｍｇ／ｍＬ）で試験した。対照は、培地単独の細胞毒性に対応し、細胞毒性対照は、フェノール（０．１％）中で培養された細胞に対応する。

細胞に対する様々な試料の細胞毒性を評価するために、ＷＳＴ−１試験を使用する。

結果は、試験した試料が、細胞に対して細胞毒性を示さず、一方では線維芽細胞上で、そして他方ではケラチノサイト上で（結果は示さず）、５ｍｇ／ｍＬのオリゴ糖濃度に至るまで損傷をひき起こさない、ということを示している。

さらに、行なった他の実験は、線維芽細胞およびケラチノサイトを１ｍｇ／ｍＬの濃度を有するオリゴ糖画分に４８時間曝露した後、有害な効果が存在しないことを示している（結果は示さず）。

実施例４：線維芽細胞の増殖に対するオリゴ糖画分の効果
細胞に対して細胞毒性効果を有さないことに加えて、亜麻の種子に由来し本発明の方法にしたがって得たオリゴ糖が、真皮線維芽細胞の増殖の効果的な刺激を可能にすることが実証された。

線維芽細胞に対する亜麻の種子の中性オリゴ糖の肯定的効果は、図３に示されている。細胞を、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有するオリゴ糖画分に曝露し、異なる曝露時間（２４、４８および７２時間）でＷＳＴ−１試験を実施することによって、線維芽細胞の増殖を測定する。

結果は、試験したオリゴ糖画分が、真皮線維芽細胞増殖の増加を誘発することを示している。増殖の刺激は、亜麻の種子に由来するオリゴ糖の存在下で細胞を４８時間または７２時間インキュベートした後、より一層顕著になる。

オリゴ糖画分の濃度に応じた線維芽細胞の増殖についての研究も同様に行なった。結果（図示せず）から、試料Ｅ４およびＥ６について、増殖の刺激が０．５ｍｇ／ｍＬ以降観察されるということを指摘することができる。

実施例５：化学走性に対する亜麻の種子の中性オリゴ糖の効果
さらに、本発明の方法により得た亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖が、線維芽細胞上で大きな化学走性活性を有するということも実証された。この効果は、組織修復にとって極めて有利である。

そのために、成人ヒト真皮線維芽細胞を、一つの膜を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート内でインビトロで培養したが、ここで前記線維芽細胞は、１ｍｇ／ｍＬの濃度の亜麻の種子に由来するオリゴ糖を含む異なる試料の存在下または不在下（対照）で２４時間インキュベートされている。

真皮線維芽細胞の化学走性は、インサートの膜を横断する細胞の数を計数することによって評価される。

図４に見られる結果は、本発明の方法によって得た亜麻の中性オリゴ糖が、真皮線維芽細胞の化学走性の増加を誘発することを明確に示している。行なった他の実験により、化学走性効果が、非常に低いオリゴ糖濃度（０．５ｍｇ／ｍＬ）でさえ視認でき、この化学走性効果はオリゴ糖の濃度の上昇につれて増大することを示すことができた。結果は、図５に示されている。

実施例６：細胞移動に対する亜麻の種子のオリゴ糖の効果
経時的な真皮線維芽細胞の細胞移動を、亜麻の種子に由来し本発明に係る方法で得た中性オリゴ糖の存在下および不在下で測定した。これらの化合物を、線維芽細胞上で試験し、これらの線維芽細胞の移動を経時的に追跡した。

結果は、図６に示されている。成人ヒト真皮線維芽細胞を、人工的な傷の条件を再現することのできるＩｂｉｄｉ（登録商標）インサート内においてインビトロで培養した。

線維芽細胞を、１ｍｇ／ｍＬのオリゴ糖濃度の存在下でインキュベートし、細胞移動をビデオマイクロスコープを用いて４８時間追跡する。こうして、細胞の軌跡を再構成する。

５０００〜１５０００Ｄａおよび１５，０００〜５０，０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有する中性オリゴ糖を有し、本発明に係る方法を実施して得たオリゴ糖画分が、大規模な細胞移動を可能にし、こうしてインビトロでの人工的傷のはるかに急速な閉鎖が誘発されることを、明確に視認することが可能である。

実施例７：ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンの合成に対する、亜麻の種子のオリゴ糖の効果
ここでは、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖を含む画分が、コラーゲンそして特に線維芽細胞による組織修復の際に最初に合成されるＩＩＩ型コラーゲンの合成の有意な増大をひき起こすということを実証した。

成人ヒト真皮線維芽細胞をインビトロで培養し、１ｍｇ／ｍＬの濃度を示す亜麻の種子に由来するオリゴ糖画分の存在下および不在下で、２４時間（図７Ａ）および４８時間（図７Ｂ）活性化させた。培養上清を回収し、ＩＩＩ型コラーゲンの数量を、市販のＥＬＩＳＡキットを用いた測定によって決定した。

ＩＩＩ型コラーゲン合成の結果は、図７に見られる。

この図は、本発明に係る方法によって得た、一方では５０００〜１５０００Ｄａ、他方では１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有する中性オリゴ糖を含む試料が、線維芽細胞によるＩＩＩ型コラーゲンの合成の有意な増大を可能にすることを、明確に示している。

行なった他の実験も同様に、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖が、線維芽細胞によるＩＶ型コラーゲンの合成の増大を可能にするということを明らかにすることができた。

より厳密に言うと、ヒト真皮線維芽細胞を、コンフルエンスに至るまでインビトロで培養し、その後、様々な試料、特に第二および第三の透過液に対応し本発明に係る方法を実施することで得たオリゴ糖画分と共に、２４時間細胞をインキュベートした。画分の濃度は１ｍｇ／ｍＬである。

その後、培養上清を回収し、コラーゲンＩＶを上清中および細胞層中で分析する。

図８に示された結果は、一方では１５０００〜５００００Ｄａ、そして他方では５０００〜１５００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するオリゴ糖画分が、コラーゲンＩＶの合成を活性化できることを示している。コラーゲンＩＶは基底膜の不可欠な構成要素の一つを構成しており、この構成要素の合成は老化時に減少する傾向をもつことから、このような効果は極めて有利である。

実施例８：スモールプロテオグリカンの合成に対する亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の効果
プロテオグリカンと呼ばれる化合物、特にＳＬＲＰ（スモールロイシンリッチプロテオグリカン）は、細胞活性の調節において、および皮膚の機能的特性の組織において重要な役割を果たす。

詳細には、デコリンおよびルミカンが、重要なプロテオグリカンである。デコリンは、成人の皮膚中に豊富に存在し、ホメオスタシスの調節において最も重要な役割を果たす。皮膚中のデコリンの数量は、年令と共に増大する。反対に、ルミカンの数量は、年令と共に減少する傾向をもつ。ルミカンは、皮膚の機能的特性を保つ上で一つの役割を果たす。

本方法により得られる亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の、これらのスモールプロテオグリカンの合成に対する影響を決定するために、実験を行なった。

１ｍｇ／ｍＬの濃度の亜麻に由来する中性オリゴ糖の存在下で、２４時間線維芽細胞を培養した。

その後、線維芽細胞からＲＮＡを抽出し、一連のＲＴ−ＰＣＲに着手して、デコリンおよびルミカンの合成についてコードする遺伝子の発現を評価した。

結果は、添付図９に示されている。これらの結果は、亜麻に由来する中性オリゴ糖が、真皮線維芽細胞によるデコリンの合成の減少を誘発することができ、一方、その反対にルミカンの発現は増大する、ということを示している。

したがって、５０００〜１５０００Ｄａまたは１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を特に有し本方法によって得られる中性オリゴ糖と、老化した皮膚とを接触させることにより、より若い皮膚の表現型に近づけることができる。

実施例９：ケラチノサイトに対する亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖の効果
光学顕微鏡により、亜麻の種子に由来する中性オリゴ糖を含む画分が、表皮ケラチノサイトに対する肯定的な効果を有することが観察された。

詳細には、中性オリゴ糖は、ケラチノサイトの分化を誘発し、この分化はより詳細には形態変化によって特徴づけされる。

顆粒層のマーカーであるインボルクリン、さらには表皮の角質層のマーカーであるフィラグリンおよびロリクリンなどの、異なる分化マーカーが使用された免疫細胞化学実験によって、顕微鏡下の観察事実を確認した（結果は示さず）。ケラチノサイト内でのこれらのマーカーの出現は、本発明に係る方法によって得られた中性オリゴ糖により、強く刺激される。

ケラチノサイトの分化の刺激は、外部攻撃に対するその保護を増大させることから、皮膚にとって有益である。

当然のことながら、本発明は、先に図示し説明した実施例に限定されず、これらの実施例は、本発明の枠から逸脱することなく変形形態および修正を呈示することができる。

Claims (19)

1. 亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖混合物の獲得方法であって、前記オリゴ糖が高いモル質量を有し、前記方法は、
   − 亜麻粘質物溶液の酸性ｐＨでの加水分解を実施するステップであって、この粘質物溶液が溶媒中での亜麻の種子の抽出により得られるステップと；
   − 適量の塩基を添加することにより前記溶液を中和するステップと；
   − 細孔度５００００Ｄａの膜を通した溶液の第一の限外濾過を実施して、第一の保持液および第一の透過液を得るステップと；
   − 細孔度１５０００Ｄａの膜を通した前記第一の透過液の第二の限外濾過を実施して、第二の保持液および第二の透過液を得るステップと；
   − 細孔度５０００Ｄａの膜を通した前記第二の透過液の第三の限外濾過を実施して、第三の保持液および第三の透過液を得るステップと；
   − 第二の保持液と第三の保持液とを混合して前記オリゴ糖混合物を得るステップであって、前記第二の保持液が１５０００〜５００００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含み、かつ前記第三の保持液が、５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含んでいるステップと、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 亜麻の種子の抽出が水性溶媒中で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ｐＨ２および８０℃の温度で２４時間粘質物溶液の加水分解を実施することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 少なくとも水酸化バリウムおよび水酸化ナトリウムを含む群から選択される強塩基を適量添加することによって、前記粘質物溶液を中和することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
5. 一方では１５０００〜５００００Ｄａ、そして他方では５０００〜１５０００Ｄａのカットオフ閾値での限外濾過による分画に由来するモル質量を有するオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法を使用することによって得られる亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
6. 少なくともフコース、および／またはアラビノース、および／またはガラクトース、および／またはグルコース、および／またはキシロースを含む糖鎖を有するオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
7. ラムノースを含む糖鎖を有する低比率オリゴ糖と、低比率のウロン酸とを含んでいることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
8. 皮膚の老化作用を防止する目的、または皮膚組織の修復を促進する目的で、皮膚科用または化粧品用に使用するための、請求項１〜７のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
9. 線維芽細胞の増殖を刺激するための、請求項１〜８のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
10. 線維芽細胞の化学走性を刺激するための、請求項１〜９のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
11. 線維芽細胞の細胞移動を刺激するための、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
12. 線維芽細胞によるＩＩＩ型コラーゲンおよび／またはＩＶ型コラーゲンの合成を刺激するための、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
13. 線維芽細胞によって、ルミカン合成を刺激しデコリン合成を阻害するための、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
14. ケラチノサイトの分化を誘発するための、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
15. 創傷の治癒を促進するための、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
16. 請求項１〜１５のいずれか一つに記載の中性オリゴ糖混合物と、化粧品としてまたは皮膚科的に許容できる少なくとも一つのビヒクルとを含む、皮膚科用または化粧品用組成物。
17. 中性オリゴ糖の濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍＬである、請求項１６に記載の化粧品用組成物。
18. 医薬品として使用するための、請求項１〜７のいずれか一つに記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。
19. 特に慢性潰瘍における、または外科手術後の、組織の治癒を促進するための、請求項１８に記載の亜麻の種子から抽出した中性オリゴ糖の混合物。

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