JP2016516415A - 植物におけるインフルエンザウイルス様粒子の生成 - Google Patents

植物におけるインフルエンザウイルス様粒子の生成 Download PDF

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Abstract

改変赤血球凝集素を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生成する方法が提供される。この方法は、植物において活性であって、改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節領域を含む核酸を、植物または植物の一部分に導入するステップを含み、改変ＨＡタンパク質は、改変タンパク質分解性ループを含む。その後、核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部分をインキュベートすることによってＶＬＰを生成する。改変タンパク質分解性ループは、プロテアーゼによる切断の低減または消滅を示す、１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含み得る。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｂ ＨＡ、Ｃ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群から選択され得る。

Description

発明の分野
本発明は、植物においてウイルス様粒子を生成することに関する。
発明の背景
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスによって引き起こされる。これらのウイルスには３つの型が存在し、これらは、３つの異なる型のインフルエンザ：Ａ型、Ｂ型およびＣ型を引き起こす。インフルエンザウイルスＡ型ウイルスは、哺乳動物（ヒト、ブタ、フェレット、ウマ）および鳥類に感染する。これは、世界的パンデミックを引き起こしたウイルスの型であるので、人類にとって非常に重要である。インフルエンザウイルスＢ型（単にインフルエンザＢとしても公知）は、ヒトのみに感染する。これは、インフルエンザの局所的大流行を時折引き起こす。インフルエンザＣウイルスもまた、ヒトのみに感染する。これらは人々が若い場合にほとんどの人々に感染し、重篤な病気を引き起こすことは稀である。
ワクチン接種は、感染前に防御を開始するように被験体を仕向けることによって、類似の要因によって引き起こされる疾患に対する保護を提供する。従来、これは、免疫原としての感染性要因の生弱毒化形態または全不活化形態の使用を介して達成されてきた。全ウイルス（例えば、死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルス）をワクチンとして使用することの危険を回避するために、組換えウイルスタンパク質、例えばサブユニットが、ワクチンとして追及されてきた。ペプチドワクチンおよびサブユニットワクチンの両方は、いくつかの潜在的な制限を受ける。サブユニットワクチンは、不正確な折り畳みまたは乏しい抗原提示のおかげで、乏しい免疫原性を示し得る。主要な問題は、操作されたタンパク質のコンフォメーションがその天然の環境にある抗原のコンフォメーションを模倣することを確実にすることの困難さである。適切なアジュバント、およびペプチドの場合には担体タンパク質が、免疫応答をブーストするために使用されなければならない。さらに、これらのワクチンは、体液性応答を主に惹起し、従って、有効な免疫を誘起できない可能性がある。サブユニットワクチンは、全不活化ウイルスが保護を提供することを実証できる疾患に対して、有効でない場合が多い。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、免疫原性組成物中に含めるための潜在的な候補である。ＶＬＰは、成熟ビリオンと密接に類似しているが、ウイルスゲノム材料を含まない。従って、ＶＬＰは、性質が非複製的であり、そのためにワクチンとしての投与に安全なものとなっている。さらに、ＶＬＰは、ＶＬＰの表面上にウイルス糖タンパク質を発現するように操作され得、これは、ＶＬＰの最も天然の生理学的立体配置である。さらに、ＶＬＰはインタクトなビリオンと類似しており、多価粒子状構造であるので、ＶＬＰは、可溶性外被タンパク質抗原よりも糖タンパク質に対する中和抗体を誘発する際により有効であり得る。
ＶＬＰは、植物において（国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号；国際公開第２０１０／００３２３５号；国際公開第２０１１／０３５２２号；国際公開第２０１０／１４８５１１号；これらは、参照によって本明細書中に組み込まれる）、ならびに昆虫および哺乳動物の系において（Noad, R.およびRoy, P.、２００３年、Trends Microbiol １１巻:４３８〜４４頁；Neumannら、２０００年、J. Virol.、７４巻、５４７〜５５１頁）、生成されてきた。LathamおよびGalarza（２００１年、J. Virol.、７５巻、６１５４〜６１６５頁）は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（neuramindase）（ＮＡ）、Ｍ１およびＭ２遺伝子を同時発現する組換えバキュロウイルスが感染した昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。この研究は、インフルエンザビリオンタンパク質が真核生物細胞における同時発現の際に自己アセンブルすること、およびＭ１マトリックスタンパク質がＶＬＰ生成に必要であったことを実証した。Gomez-Puertasら、（１９９９年、J. Gen. Virol、８０巻、１６３５〜１６４５頁）は、Ｍ２の過剰発現が、ＭＤＣＫ培養物に対するＣＡＴ ＲＮＡ伝達を完全に遮断したことを示した。
インフルエンザウイルスのスパイク糖タンパク質赤血球凝集素（ＨＡ）は、宿主細胞によるウイルス粒子の取り込みにとって非常に重要なものである。これは、シアル酸含有細胞受容体へのインフルエンザウイルスの付着を担い、ウイルス外被と細胞膜との融合を介したウイルス侵入に関与する。融合活性および結果としてウイルス感染性は、ＨＡ前駆体分子ＨＡ０の、ジスルフィド結合したポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２への切断に依存する。切断に引き続くｐＨ依存的コンフォメーション変化が、膜融合を媒介する、膜貫通ポリペプチドＨＡ２のアミノ末.端における高度に保存された疎水性ペプチドの曝露および再配置を生じる。
ＨＡは、前駆体タンパク質ＨＡ０として合成され、これは、タンパク質分解性プロセシングを受けて、ジスルフィド架橋によって一緒に連結された２つのサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）になる。２つの構造的特徴が、ＨＡ切断性に関与すると考えられている：限定的な切断性のＨＡでは、リンカーは通常、単一のアルギニンからなり、一方で、広範な異なる細胞型において切断可能なＨＡは、主要な酵素認識モチーフＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇによる、この位置における一連の複数の塩基性残基の挿入を有し、ここで、Ｘは非塩基性アミノ酸である。複数の塩基性切断部位を有するＨＡは、細胞外空間中で、またはＷＳＮ株について示されたようにウイルス侵入の段階でのいずれかでウイルス粒子上で活性化される一塩基リンカーを有するＨＡとは対照的に、細胞表面上の出芽部位に到達する前に、エキソサイトーシス輸送経路上で切断される。ＨＡ切断の第２の決定基は、切断部位のすぐ近傍に存在し、プロテアーゼの接近可能性を妨害する炭水化物側鎖であるようである。この炭水化物の喪失は、増強されたＨＡ切断性およびウイルス病原性を生じた。
哺乳動物インフルエンザウイルス株および非病原性トリインフルエンザウイルス株は、ＨＡ０前駆体を細胞外で切断できるプロテアーゼを分泌する限定された範囲の細胞の結果として、解剖学的に限局化された感染を引き起こす（Chen Jら、1998年、Cell.９５巻:４０９〜４１７頁）。ヒトのインフルエンザ感染におけるＨＡ０の切断を担うプロテアーゼは、気道の細胞によって、または同時感染する細菌もしくはマイコプラズマによって分泌されるか、あるいは感染に対する炎症応答において生成され得る。主要なプロテアーゼ候補は、細気管支上皮のＣｌａｒａ細胞によって生成される、限定的な組織分布（上部気道）を有するトリプターゼＣｌａｒａである。このプロテアーゼは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ６の切断部位において見出される一塩基配列Ｑ／Ｅ−Ｘ−Ｒに特異的である。Ｈ９株およびＢ株由来のＨＡは、それぞれＳＳＲ配列およびＫＥＲ配列を有する、僅かに異なる一塩基切断部位を示す。水生鳥類において見られる腸管感染および呼吸器感染を引き起こすインフルエンザウイルスの大部分について、プロテアーゼは同定されていない。ほとんどの細胞株は、外因性プロテアーゼ（通常はトリプシン）が添加されない限り、多サイクルの複製を支持しない。
しかし、高度に病原性のトリ株においては、ＨＡ０は、より広範な細胞内プロテアーゼのファミリーによって切断され、全身インフルエンザ感染を生じる。病原性におけるこの差異は、ＨＡ０切断部位における構造的差異と相関する。病原性株は、一塩基部位内に、または一塩基部位の隣に、多塩基アミノ酸の挿入を有する。この場合における切断は細胞内で生じ、関与するプロテアーゼは、ゴルジにおいて見出される、ホルモンおよび増殖因子前駆体の翻訳後プロセシングに関与するフューリンおよび他のスブチリシン様酵素として同定されている。フューリン認識配列Ｒ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−Ｒは、Ｈ５およびＨ７のＨＡ０切断部位における頻出の挿入アミノ酸である。この酵素の広い組織分布および細胞内切断の効率は、これらのウイルスによって引き起こされる広範で毒性の全身感染に寄与する。
ＨＡ切断部位は、ウイルス弱毒化のための標的であるが、これは、宿主プロテアーゼによるＨＡ１断片およびＨＡ２断片へのＨＡ０前駆体の活性化切断が、全てのインフルエンザＡおよびＢウイルス株の複製サイクル中のステップであるからである。切断されたＨＡのみが、エンドソーム膜とビリオン膜との間の融合を媒介するためにＨＡ２断片の疎水性Ｎ末端を曝露させるように、受容体媒介性エンドサイトーシス後に、エンドソームの酸性環境におけるコンフォメーション変化を受け得る。
Horimoto Tら（２００６年、Vaccine、２４巻:３６６９〜３６７６頁）は、Ｈ５におけるＨ５の多塩基切断部位（ＲＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇ）の消滅を記載している。最初の４つの荷電アミノ酸（ＲＥＲＲ）の欠失および多塩基切断部位を不活化するための（ＴＥＴＲによるＲＫＫＲの）改変を有する変異体を含む、選択された変異体が、マウスにおける免疫原性研究に供された。切断部位の消滅は、変異体Ｈ５の免疫原性特性に影響を与えなかった。変異体ＮＩＢＳＣ ０５／２４０ ＮＩＢＳＣインフルエンザ参照ウイルスＮＩＢＧ−２３を生成するための多塩基部位の消滅（ＲＥＴＲによって置き換えられたＧＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇ）もまた、報告されている。Hoffmanら（２００２年、２００２、Vaccine、２０巻:３１６５〜３１７０頁）は、卵における発現をブーストするために、Ｈ６の一塩基部位で、Ｈ５ ＨＡの多塩基切断部位を置き換えた。最初の４残基を欠失させ、多塩基部位の最後の４つのアミノ酸をＩＥＴＲによって置き換えた（ＩＥＴＲ↓ＧによるＲＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇの置き換え）。この変異体Ｈ５は、宿主細胞におけるウイルス複製および生成に必要とされる高い発現レベル、潜在的なタンパク質分解および低いｐＨでのコンフォメーション変化を示したが、免疫原性データは報告されなかった。これらの研究は、切断部位の改変が、ウイルス粒子の毒性を減退させるために使用され得、（真のウイルスが複製される場合）宿主卵を殺すことなくウイルスが複製するのを可能にすることを示している。かかる変異がない場合、ウイルスは、高い力価に達する前に卵を殺してしまう。
Ｓｉｒｋｏらによる国際公開第２０１３０４３０６７号は、ＨＡサブユニット間のタンパク質分解性切断部位が欠失した改変Ｈ５赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する、ニワトリ用のＤＮＡワクチンを記載している。Ｓｉｒｋｏらは、これが、ワクチンのより高い安全性および長いプロセシングされていないポリペプチドの形態での「スーパー抗原」の発現を提供すると述べている。Ｓｉｒｋｏらはさらに、ＨＡのコード領域が、鳥類細胞におけるタンパク質生成が最大の収量を達成するように改変されると述べている。主要な改変は、ニワトリのためのコドン最適化およびＨＡのタンパク質分解感受性領域の欠失である。
国際公開第２０１３／０４４３９０号は、改変赤血球凝集素（ＨＡ）を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生成する方法を記載しており、ここで、改変ＨＡタンパク質は、改変タンパク質分解性ループを含む。改変ＨＡは、調節領域ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＨＴおよびマメ黄化萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来のジェミニウイルス増幅エレメントの存在下で発現される。
Ｙａｎｇらによる米国特許出願公開第２００８／００６９８２１号は、ワクチンとしてのインフルエンザウイルスの生成における使用のためのインフルエンザＨＡのポリペプチドバリアントおよびポリヌクレオチドバリアントを開示している。リアソータントインフルエンザウイルスは、インフルエンザＨＡのバリアントから誘導された相補的セグメントと組み合わせて、マスターインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するベクターのサブセットを導入することによって、得られる。典型的には、これらのマスター株は、ワクチン投与に適切な所望の特性に基づいて選択される。例えば、ワクチン生成のため、例えば、生弱毒化ワクチンの生成のために、マスタードナーウイルス株は、弱毒化表現型、低温適応および／または温度感受性に関して選択され得る。
国際公開第２００９／００９８７６号 国際公開第２００９／０７６７７８号 国際公開第２０１０／００３２２５号 国際公開第２０１０／００３２３５号 国際公開第２０１１／０３５２２号 国際公開第２０１０／１４８５１１号 国際公開第２０１３／０４３０６７号 国際公開第２０１３／０４４３９０号 米国特許出願公開第２００８／００６９８２１号明細書
Noad, R.およびRoy, P.、２００３年、Trends Microbiol １１巻:４３８〜４４頁 Neumannら、２０００年、J. Virol.、７４巻、５４７〜５５１頁 LathamおよびGalarza（２００１年、J. Virol.、７５巻、６１５４〜６１６５頁） Gomez-Puertasら、（１９９９年、J. Gen. Virol、８０巻、１６３５〜１６４５頁 Chen Jら、1998年、Cell.９５巻:４０９〜４１７頁 Horimoto Tら（２００６年、Vaccine、２４巻:３６６９〜３６７６頁） Hoffmanら（２００２年、２００２、Vaccine、２０巻:３１６５〜３１７０頁）
本発明は、植物においてウイルス様粒子および改変ＨＡタンパク質を生成することに関する。
植物におけるウイルス様粒子およびＨＡタンパク質の改善された生成を提供することが、本発明の目的である。
植物において活性であり、改変タンパク質分解性ループを含む改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現エンハンサーを含む核酸が、本明細書に記載される。
植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法（Ａ）が、本明細書にさらに記載され、この方法は、
ａ）植物において活性であり、改変タンパク質分解性ループを含む改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現エンハンサーを含む核酸を、植物または植物の一部分に導入するステップ；
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部分をインキュベートすることによってＶＬＰを生成するステップ
を含む。
さらに、植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法（Ｂ）が、本明細書に記載され、この方法は、
ａ）植物において活性であり、改変タンパク質分解性ループを含む改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現エンハンサーを含む核酸を含む植物または植物の一部分を準備するステップ、および
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部分をインキュベートすることによってＶＬＰを生成するステップ
を含む。
植物において切断の低減または消滅を示す１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質分解性ループを含む改変ＨＡタンパク質を生成する方法（Ｃ）が、本明細書にさらに記載され、この方法は、
ａ）植物において活性であり、改変タンパク質分解性ループを含む改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現エンハンサーを含む核酸を、植物または植物の一部分に導入するステップ；
ｂ）ＨＡタンパク質の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部分をインキュベートすることによって改変ＨＡタンパク質を生成するステップ、
ｃ）植物を収穫し、改変ＨＡタンパク質を精製するステップ
を含む。
上記方法（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）は、
ｃ）植物を収穫するステップ、および
ｄ）ＶＬＰを精製するステップであって、ＶＬＰが、８０〜３００ｎｍのサイズ範囲である、ステップ
をさらに含み得る。
さらに、植物におけるＨＡタンパク質の生成物収量を増加させる方法（Ｄ）が本明細書に記載され、この方法は、
ａ）植物において活性であり、改変タンパク質分解性ループを含む改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現エンハンサーを含む核酸を、植物または植物の一部分に導入するステップ；
ｂ）ＨＡタンパク質の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部分をインキュベートすることによって改変ＨＡタンパク質を生成するステップ、
ｃ）植物を収穫し、ＨＡタンパク質を精製するステップ
を含む。
発現エンハンサーは、ＣＰＭＶＸ、ＣＰＭＶＸ＋またはＣＰＭＶ−ＨＴ＋であり得る。さらに、ヌクレオチド酸は、ジェミニウイルス増幅エレメントを含まなくてもよい。したがって、ヌクレオチド酸は、マメ黄化萎縮ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＬＩＲ）およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＳＩＲ）を含まなくてもよい。改変タンパク質分解性ループは、プロテアーゼによる切断の低減または消滅を示す１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含み得る。プロテアーゼは、Ｃｌａｒａ様またはＦｕｒｉｎ様であり得る。さらに、改変タンパク質分解性ループは、リンカー配列を含み得、リンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧ、ＴＥＴＱまたはＴＥＴＲを有し得る。改変ＨＡは、ネイティブまたは非ネイティブのシグナルペプチドを含み得る。さらに、改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列は、順番に、改変タンパク質分解性ループを含む改変ＨＡ外部ドメイン、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールをコードするキメラヌクレオチド配列を含み得、改変ＨＡ外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、膜貫通ドメインおよび細胞質テールは、第２のインフルエンザ株由来である。
改変タンパク質分解性ループは、プロテアーゼによる切断の低減または消滅を示す１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含み得る。さらに、ＨＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｂ ＨＡ、Ｃ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群から選択される。方法（Ａ）によって生成されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本明細書に記載される。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変Ｎ−グリカンを含み得る。
本開示は、免疫応答を誘発するための有効用量のＶＬＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物もまた提供する。
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた本明細書に記載され、ヌクレオチド配列は、植物において活性である調節領域に作動可能に連結しており、ＨＡは、改変タンパク質分解性ループ配列を含む。核酸は、改変タンパク質分解性ループを含むＨＡをコードし得、タンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）活性を有する。核酸を含む植物もまた提供される。植物において生成されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた含まれ、ＶＬＰは、核酸によってコードされるインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）および植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質を含む。
本発明の概要は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載しているわけではない。
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面について言及する以下の説明からより明らかとなろう。
図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（配列番号２）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｂは、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（配列番号３）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｃは、構築物１１９１の模式的表示を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｄは、構築物１１９１（配列番号４）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｅは、発現カセット番号４８９（配列番号５）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｆは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。 図１は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号４８９）を調製するために使用した成分を示す。図１Ｇは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
図２は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）を調製するために使用した成分を示す。図２Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（配列番号７）を示す。 図２は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）を調製するために使用した成分を示す。図２Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（配列番号８）を示す。 図２は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）を調製するために使用した成分を示す。図２Ｃは、合成されたＭ２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ５０８８６０由来の７１５〜９８２に接続されたｎｔ１〜２６に対応する）（配列番号９）を示す。 図２は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）を調製するために使用した成分を示す。図２Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１２６１を示す。インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１０）。 図２は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）を調製するために使用した成分を示す。図２Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１２６１を示す。インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１０）。 図２は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）を調製するために使用した成分を示す。図２Ｅは、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
図３は、Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／ＮＯＳ（構築物番号８５９）を調製するために使用した成分を示す。図３Ａは、合成されたＭ２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ４６７８２４由来のｎｔ７４０〜１００７に接続されたｎｔ２６〜５１に対応する）（配列番号１２）を示す。 図３は、Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／ＮＯＳ（構築物番号８５９）を調製するために使用した成分を示す。図３Ｂは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号８５９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１３）。 図３は、Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／ＮＯＳ（構築物番号８５９）を調製するために使用した成分を示す。図３Ｂは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号８５９を示す。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２に下線を付す（配列番号１３）。 図３は、Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／ＮＯＳ（構築物番号８５９）を調製するために使用した成分を示す。図３Ｃは、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ａは、構築物１１９４の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｂは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｂは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｂは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｂは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１１９４を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（配列番号３１）。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。 図４は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）を調製するために使用した成分を示す。図４Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１００８を示す。インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡに下線を付す（配列番号３２）。
図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ａは、プライマー１０３９＋１０５９．ｒ（配列番号３８）を示す。 図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ｂは、プライマー１０３９＋１０５９．ｃ（配列番号３９）を示す。 図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０５９を示す。 図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０５９を示す。 図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶの左ＬＩＲからＢｅＹＤＶの右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０５９を示す。 図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。 図５は、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０５９）を調製するために使用した成分を示す。図５Ｅは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのヌクレオチド配列（配列番号４３）を示す。
図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ａは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（配列番号４９）を示す。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（配列番号５０）を示す。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｃは、合成されたＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｄは、構築物１９３の模式的表示を示す。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｅは、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの構築物１９３を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有するＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（配列番号５２）。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６２のヌクレオチド配列を示す。インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５３）。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｇは、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。 図６は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）を調製するために使用した成分を示す。図６Ｈは、構築物１４６２の模式的表示を示す。
図７は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６７）を調製するために使用した成分を示す。図７Ａは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｒ（配列番号５５）を示す。 図７は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６７）を調製するために使用した成分を示す。図７Ｂは、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｃ（配列番号５６）を示す。 図７は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６７）を調製するために使用した成分を示す。図７Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６７のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５７）。 図７は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６７）を調製するために使用した成分を示す。図７Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１４６７のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに下線を付す（配列番号５７）。 図７は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６７）を調製するために使用した成分を示す。図７Ｄは、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０のアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。 図７は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６７）を調製するために使用した成分を示す。図７Ｅは、構築物１４６７の模式的表示を示す。
図８は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０３９）を調製するために使用した成分を示す。図８Ａは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０３９のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに下線を付す（配列番号１５）。 図８は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０３９）を調製するために使用した成分を示す。図８Ａは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０３９のヌクレオチド配列を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに下線を付す（配列番号１５）。 図８は、Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０３９）を調製するために使用した成分を示す。図８Ｂは、構築物１０３９の模式的表示を示す。
図９は、構築物番号１００８のプラスミドマップを示す。構築物番号１００８は、インフルエンザ株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現を指向する。この構築物は、ＤＮＡ増幅のためのＢｅＹＤＶ由来エレメントを含む。
図１０は、構築物番号１０５９のプラスミドマップを示す。構築物番号１０５９は、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザ株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現を指向する。この構築物は、ＤＮＡ増幅のためのＢｅＹＤＶ由来のエレメントを含む。
図１１は、構築物番号１２６１のプラスミドマップを示す。構築物番号１２６１は、インフルエンザ株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型Ｍ２の発現を指向する。
図１２は、構築物番号８５９のプラスミドマップを示す。構築物番号８５９は、インフルエンザ株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型Ｍ２の発現を指向する。
図１３Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。「１００８」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１００８＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。３つの別個の浸潤由来の植物を分析した（Ａ、ＢおよびＣ）。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。図１３Ｂは、ＨＡ生成植物由来の粗製タンパク質抽出物の赤血球凝集能の比較を示す。 図１３Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。「１００８」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１００８＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。３つの別個の浸潤由来の植物を分析した（Ａ、ＢおよびＣ）。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。図１３Ｂは、ＨＡ生成植物由来の粗製タンパク質抽出物の赤血球凝集能の比較を示す。
図１４は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。「１０５９＋８５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来のＭ２との同時発現。３つの別個の浸潤由来の植物を分析した（Ａ、ＢおよびＣ）。比は、同時発現実験において使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物の割合を示す。
図１５は、以下のいくつかの株のインフルエンザ由来のＨＡのリンカーを取り囲む領域のアミノ酸配列アラインメントを示す：Ｈ１ Ｎｅｗ Ｃａｌ（配列番号２２）； Ｈ１ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（配列番号２３）；Ｈ１ Ｓｏｌ Ｉｓｌａｎｄｓ（配列番号２４）；Ｈ２Ａ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（配列番号２５）；Ｈ３Ａ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（配列番号２６）；Ｈ３Ａ ＷＣＮ（配列番号２７）；Ｈ５ Ａｎｈｕｉ（配列番号２８）；Ｈ５ Ｉｎｄｏ（配列番号２９）；Ｈ５ Ｖｉｅｔｎａｍ（配列番号３０）；Ｈ６ Ｔｅａｌ ＨＫ（配列番号３３）；Ｈ７ Ｅｑ Ｐｒａｇｕｅ（配列番号３４）；Ｈ９Ａ ＨＫ（配列番号３５）；Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ（配列番号３６）；Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ（配列番号３７）。前駆体ＨＡ０の切断部位を矢印で示す。
図１６Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡを、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２と同時発現させる。１レーン当たり１０マイクログラムのタンパク質抽出物をロードした。「Ｃ＋」：陽性対照、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ由来の半精製されたＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０ウイルス；「１４６２」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の野生型ＨＡの発現；「１４６７」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の変異体ＨＡの発現；「１４６２＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の野生型ＨＡの、Ｍ２との同時発現；「１４６７＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来の変異体ＨＡの、Ｍ２との同時発現。比は、発現実験および同時発現実験において使用した各Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物についての光学密度を示す。 図１６Ｂは、ＡＧＬ１／１４６２、ＡＧＬ１／１４６７、ＡＧＬ１／１４６２＋ＡＧＬ１／１２６１およびＡＧＬ１／１４６７＋ＡＧＬ１／１２６１で形質転換した植物由来の粗製タンパク質抽出物の赤血球凝集能の比較を示す。
図１７Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。「１００８」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１００８＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；「１０３９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の非存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現。「１０３９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の非存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ。「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。 図１７Ｂは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。「１００８」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの発現；「１００８＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の野生型ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；「１０３９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の非存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現。「１０３９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の非存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ。「１０５９」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下での、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの発現；「１０５９＋１２６１」：増幅エレメント（ＢｅＹＤＶ）の存在下でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来の変異体ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。 図１８Ａは、Ｃｌａｒａ様および／またはＦｕｒｉｎ様プロテアーゼによる、ＨＡ１およびＨＡ２へのＨＡ０の切断の模式的表示を示す。 図１８Ｂは、以下のいくつかの株のインフルエンザ由来のＨＡの配列アラインメントを示す：Ｈ１ Ｎｅｗ Ｃａｌ（配列番号２２）；Ｈ１ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（配列番号２３）；Ｈ１ Ｓｏｌ Ｉｓｌａｎｄｓ（配列番号２４）；Ｈ２Ａ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（配列番号２５）；Ｈ３Ａ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（配列番号２６）；Ｈ３Ａ ＷＣＮ（配列番号２７）；Ｈ５ Ａｎｈｕｉ（配列番号２８）；Ｈ５ Ｉｎｄｏ（配列番号２９）；Ｈ５ Ｖｉｅｔｎａｍ（配列番号３０）；Ｈ６ Ｔｅａｌ ＨＫ（配列番号３３）；Ｈ７ Ｅｑ Ｐｒａｇｕｅ（配列番号３４）；Ｈ９Ａ ＨＫ（配列番号３５）；Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ（配列番号３６）；Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ（配列番号３７）。 図１８Ｃは、Ｈ５株、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）配列番号６９、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）配列番号７０、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）配列番号７１、ならびにＢ型株、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６ 配列番号７２およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ 配列番号７３における切断部位の一部の欠失を示す。
図１９は、Ｈ５／Ｉｎｄｏ中の切断部位の変異を示す。ネイティブ配列（配列番号４４）；ＴＥＴＲを含むＨ５／Ｉｎｄｏ改変切断部位（配列番号４５）；ＴＥＴＱを含むＨ５／Ｉｎｄｏ改変切断部位（配列番号４６）。
図２０は、タンパク質分解性ループ内に変異を含む異なる改変Ｈ５／Ｉｎｄｏ ＨＡの酵素抽出後の初期バイオマスにおいて見出される力価を示す。Ｈ５／Ｉｎｄｏ対照（構築物４８９）；ＧＧリンカーによって置き換えられたＨ５／Ｉｎｄｏタンパク質分解性ループ（構築物９２８）；ＴＥＴＲリンカーによって置き換えられたＨ５／Ｉｎｄｏタンパク質分解性ループ（構築物６７６）；ＴＥＴＱリンカーによって置き換えられたＨ５／Ｉｎｄｏタンパク質分解性ループ（構築物７６６）。
図２１は、Ｂ型ＨＡのタンパク質分解性ループを改変するための種々のアプローチを示す。図２１Ａは、ネイティブＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。下線部分は、タンパク質分解性ループおよびＨＡ２ドメインである。 図２１は、Ｂ型ＨＡのタンパク質分解性ループを改変するための種々のアプローチを示す。図２１Ｂは、改変されたタンパク質分解性ループを有するＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のアミノ酸配列（配列番号１７）を示し、ここで、配列ＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＧを含む１９アミノ酸残基は、ＧＧリンカー（イタリック）によって置き換えられている。 図２１は、Ｂ型ＨＡのタンパク質分解性ループを改変するための種々のアプローチを示す。図２１Ｃは、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のアミノ酸配列（配列番号１８）を示し、ここで、配列ＰＰＡＫＬＬＫＥＲを含む９アミノ酸は、−ＧＳＳＳＧＳＳＳＧ−リンカー（イタリック）によって置き換えられている。 図２１は、Ｂ型ＨＡのタンパク質分解性ループを改変するための種々のアプローチを示す。図２１Ｄは、ネイティブＨ３ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。 図２１は、Ｂ型ＨＡのタンパク質分解性ループを改変するための種々のアプローチを示す。図２１Ｅは、配列ＲＮＶＰＥＫＱＴＲＧＩＦを含む１２アミノ酸残基がＧＳリンカー（イタリック）によって置き換えられた、Ｈ３ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。 図２１は、Ｂ型ＨＡのタンパク質分解性ループを改変するための種々のアプローチを示す。図２１Ｆは、配列ＲＮＶＰＥＫＱＴＲを含む９アミノ酸残基がＧＳＳＧＳＳＧＳＳ−リンカー（イタリック）によって置き換えられた、Ｈ３ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
図２２は、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＡタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。Ｈ５／Ｉｎｄｏ由来のＨＡ。上パネル、各レーンにおいてロードした成分の列挙；下パネル、ウエスタンブロット。Ｃ：組換えＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ Ｓ−ＳＴＤ−０００２；一次抗体：抗ＨＡ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５ ＣＢＥＲ番号Ｓ−ＢＩＯ−０００３ １／５０ ０００；ブロット。レーン１および２：Ｈ５／Ｉｎｄｏ対照（構築物４８９）；レーン３および４：ＧＧリンカーによって置き換えられたＨ５／Ｉｎｄｏタンパク質分解性ループ（構築物９２８）；レーン５および６：ＴＥＴＲリンカーによって置き換えられたＨ５／Ｉｎｄｏタンパク質分解性ループ（構築物６７６）；レーン７および８：ＴＥＴＱリンカーによって置き換えられたＨ５／Ｉｎｄｏタンパク質分解性ループ（構築物７６６）；レーン９：ＭＷマーカー；レーン１０：Ｈ５対照。
図２３は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）を調製するために使用した成分を示す。図２３Ａは、プライマー配列ＭｕｔＣｌｅａｖａｇｅ−Ｈ５（Ｉｎｄｏ）．ｒ（配列番号７４）を示す。 図２３は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）を調製するために使用した成分を示す。図２３Ｂは、プライマー配列ＭｕｔＣｌｅａｖａｇｅ−Ｈ５（Ｉｎｄｏ）．ｃ（配列番号７５）を示す。 図２３は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）を調製するために使用した成分を示す。図２３Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット６７６についてのヌクレオチド配列（配列番号７６）を示す。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＴＥＴＲ切断部位変異体由来のＨ５に下線を付す。 図２３は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）を調製するために使用した成分を示す。図２３Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット６７６についてのヌクレオチド配列（配列番号７６）を示す。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＴＥＴＲ切断部位変異体由来のＨ５に下線を付す。 図２３は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）を調製するために使用した成分を示す。図２３Ｄは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のＴＥＴＲ切断部位変異体のアミノ酸配列（配列番号７７）を示す。 図２３は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）を調製するために使用した成分を示す。図２３Ｅは、構築物番号６７６の模式的表示を示す。
図２４は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）を調製するために使用した成分を示す。図２４Ａは、プライマー配列Ｈ５Ｉ５０５＿ＴＥＴＱ．ｒ（配列番号７８）を示す。 図２４は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）を調製するために使用した成分を示す。図２４Ｂは、プライマー配列Ｈ５Ｉ５０５＿ＴＥＴＱ．ｃ（配列番号７９）を示す。 図２４は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）を調製するために使用した成分を示す。図２４Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット７６６についてのヌクレオチド配列（配列番号８０）を示す。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＴＥＴＱ切断部位変異体由来のＨ５に下線を付す。 図２４は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）を調製するために使用した成分を示す。図２４Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット７６６についてのヌクレオチド配列（配列番号８０）を示す。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ＴＥＴＱ切断部位変異体由来のＨ５に下線を付す。 図２４は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）を調製するために使用した成分を示す。図２４Ｄは、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５のＴＥＴＱ切断部位変異体のアミノ酸配列（配列番号８１）を示す。 図２４は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）を調製するために使用した成分を示す。図２４Ｅは、構築物番号７６６の模式的表示を示す。
図２５は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）を調製するために使用した成分を示す。図２５Ａは、プライマー配列Ｈ５Ｉ５０５（ＰｒＬ−）．ｒ（配列番号８２）を示す。 図２５は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）を調製するために使用した成分を示す。図２５Ｂは、プライマー配列Ｈ５Ｉ５０５（ＰｒＬ−）．ｃ（配列番号８３）を示す。 図２５は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）を調製するために使用した成分を示す。図２５Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット９２８についてのヌクレオチド配列（配列番号８４）を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５に下線を付す。 図２５は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）を調製するために使用した成分を示す。図２５Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット９２８についてのヌクレオチド配列（配列番号８４）を示す。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５に下線を付す。 図２５は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）を調製するために使用した成分を示す。図２５Ｄは、タンパク質分解性ループの欠失を含むインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨ５の変異体のアミノ酸配列（配列番号８５）を示す。 図２５は、Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）を調製するために使用した成分を示す。図２５Ｅは、構築物番号９２８の模式的表示を示す。
図２６Ａは、本明細書に記載されるような、いくつかのエンハンサー配列、ＣＰＭＶＸおよびＣＰＭＶＸ＋（ＣＰＭＶＸおよびスタッファー断片を含み、スタッファー断片は、この非限定的な例では、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含む）の一例の一般的模式図を示す。ＣＰＭＣＸおよびＣＰＭＶＸ＋は各々、それらの５’末端において植物調節領域に作動可能に連結し、それらの３’末端において、順番に、対象のヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始部位および終止部位を含む）、３’ＵＴＲおよびターミネーター配列に作動可能に連結しているとして示されている。本明細書に記載される構築物ＣＰＭＶＸの一例は、ＣＰＭＶ１６０である。本明細書に記載される構築物ＣＰＭＶＸ＋の一例は、ＣＰＭＶ１６０＋である。 図２６Ｂは、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現構築物を含む植物およびＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現構築物を含む植物において生成された改変ＨＡタンパク質の粗製タンパク質抽出物における相対的赤血球凝集力価（ＨＭＧ）を示す。タンパク質分解性ループが欠失し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（構築物番号１０３９、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１９３７、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例５．７を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、Ｈ１のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する、Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１Ｔｍ、タンパク質分解性ループが欠失し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２ ２０１２（構築物番号２０７２、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号２０５０、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例５．１４を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号２０７４、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号２０６０、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例５．１５を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、ネイティブシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（構築物番号１４４５、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１９７５、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例５．１６を参照のこと）、ならびにタンパク質分解性ループが欠失し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有し、ネイティブシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号１４５４、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ ＨＴ；および構築物番号１８９３、５’ＵＴＲ：ＣＭＰＶ１６０＋；実施例５．１８を参照のこと）の発現に関するデータが示される。
図２７Ａは、対象のヌクレオチド配列に融合したＣＰＭＶ ＨＴおよびＣＰＭＶ ＨＴ＋のエンハンサー配列の一般的模式図を示す。この図中に示された全てのエレメントがエンハンサー配列内で必要とされ得るわけではない。コモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、プラストシアニン３’ＵＴＲ、またはコモウイルス３’ＵＴＲおよびプラストシアニン３’ＵＴＲの組合せをコードする配列を含むさらなるエレメントが、対象のヌクレオチド配列の３’末端において含まれ得る（示さず）。 図２７Ｂは、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結したＣＰＭＶ−ＨＴ発現構築物を含む植物および対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結したＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの発現構築物を含む植物において生成されたタンパク質の粗製タンパク質抽出物における相対的赤血球凝集力価（ＨＭＧ）を示す。タンパク質分解性ループが欠失し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（構築物番号１０３９：ＣＰＭＶ ＨＴ；実施例５．７を参照のこと、および構築物番号１８２９：ＣＰＭＶ ＨＴ＋；実施例５．１２を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１ＴＭ（構築物番号１０６７：ＣＰＭＶ ＨＴ；実施例５．１４を参照のこと、および構築物番号１８７５：ＣＰＭＶ ＨＴ＋；実施例５．１９を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２（構築物番号２０７２：ＣＭＰＶ ＨＴ；実施例５．１５を参照のこと、および構築物番号２０５２：ＣＭＰＶ ＨＴ＋；実施例５．２０を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有し、ＰＤＩシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号２０７４：ＣＭＰＶ ＨＴ；実施例５．１６を参照のこと、および構築物番号２０６２：ＣＭＰＶ ＨＴ＋；実施例５．２１を参照のこと）、タンパク質分解性ループが欠失し、ネイティブシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（構築物番号１４４５：ＣＭＰＶ ＨＴ；実施例５．１７を参照のこと、および構築物番号１８３９：ＣＭＰＶ ＨＴ＋；実施例５．２２を参照のこと）、ならびにタンパク質分解性ループが欠失し、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有し、ネイティブシグナルペプチドを有する、Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号１４５４：ＣＭＰＶ ＨＴ；実施例５．１８を参照のこと、および構築物番号１８６０：ＣＭＰＶ ＨＴ＋；実施例５．２３を参照のこと）の発現に関するデータが示される。
図２８Ａは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨ３ Ｐｅｒｔｈタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：（２０１９＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＨ３ Ｐｅｒｔｈ−１６−０９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン２：（２１３９＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＨ３ Ｐｅｒｔｈ−１６−０９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン３（２０３９＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の存在下でのＨ３ Ｐｅｒｔｈ−１６−０９由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン４：（２１５９＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＨ３ Ｐｅｒｔｈ−１６−０９由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。
図２８Ｂは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＢ Ｍａｌａｙｓｉａタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン２：（２０１３＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−１６０＋）の存在下でのＢ Ｍａｌａｙｓｉａ ２５０６−０４由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン２：（２０１４＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＢ Ｍａｌａｙｓｉａ ２５０６−０４由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。
図２８Ｃは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：（１６１０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ）の存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン２：（１６３０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）および増幅エレメントＢＥＹＤＶの存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン３：（２２４４＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン４：（２２２６＋１２６１）：発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン６：（２２４６＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−１６０＋）および増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン７：（２２２５＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン８：（２２４５＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ＋）および増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン９：（２２２７＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン１０：（２２４７＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）および増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ−１０３７−９９由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。
図２８Ｄは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：（２０７０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ）の存在下でのＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−２−１２由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン２：（２０８０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−２−１２由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン３：（２０９０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−１６０＋）の存在下でのＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−２−１２由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン４：（２０７２＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ）の存在下でのＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−２−１２由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン５：（２０５２＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の存在下でのＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−２−１２由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン６：（２０５０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−２−１２由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との、同時発現。
図２８Ｅは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨ２ Ｓｉｎタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：（２２２０＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−１−５７由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン２：（２２２２＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−１−５７由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン３：（２２２１＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−１−５７由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン４：（２２２３＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ １６０＋）の存在下でのＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−１−５７由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。
図２８Ｆは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＢ／Ｆｏｒｉｄａタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン１：（１００４＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ）の存在下でのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン２：（１００３＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ）および増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来のネイティブ（野生型）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン３：（２１０２＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋）の存在下でのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現；レーン４：（２１０４＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ＋）および増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン５：（２１０６＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の存在下でのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。レーン６：（２１０８＋１２６１）発現エンハンサー（ＣＰＭＶ ＨＴ＋）および増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ由来の変異体（改変）ＨＡの、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現。
図２９Ａは、エンハンサーエレメントＣＰＭＶ ＨＴ、ＣＰＭＶ ＨＴ＋またはＣＰＭＶ １６０＋の存在下で発現させた種々のインフルエンザ株由来の改変ＨＡの相対的ＨＡ力価を示す。活性は、同じエンハンサーエレメントを用いて発現させたネイティブＨＡタンパク質と比較される。Ｈ３ Ａ Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（Ｈ３ Ｐｅｒ１６０９）、Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１（Ｈ３ Ｖｉｃ２６１１１）、Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ ６０／２００８（ＨＢ Ｂｒｉｓ６０００８）、Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ ２５０６／０４（ＨＢ Ｍａｌ ２５０６０４）およびＢ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ２／１２（Ｍａ２１２）を、インフルエンザＭ２タンパク質と同時発現させた。
図３０Ａは、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ Ｂｒｉｓ．ｃ（配列番号８６）を示す。 図３０Ｂは、プライマーＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ Ｂｒｉｓ．ｒ（配列番号８７）を示す。 図３０Ｃは、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号８８）を示す。 図３０Ｃは、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（配列番号８８）を示す。 図３０Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに下線を付す（配列番号８９）。 図３０Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０２９のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに下線を付す（配列番号８９）。 図３０Ｅは、ＰＤＩＳＰ／インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９０）を示す。 図３０Ｆは、構築物１０２９の模式的表示を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、この表示上に注釈を付す。
図３１は、構築物番号１０３９および１８２９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０３９は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３１Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号９１）を示す。 図３１は、構築物番号１０３９および１８２９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０３９は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３１Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列；配列番号９２）を示す。図３１Ｃは、構築物番号１８２９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。 図３１は、構築物番号１０３９および１８２９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０３９は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３１Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列；配列番号９２）を示す。図３１Ｃは、構築物番号１８２９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。 図３１は、構築物番号１０３９および１８２９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０３９は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３１Ｃは、構築物番号１８２９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。
図３２は、構築物番号１０３９および１９３７（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０３９は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１９３７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３２Ａは、構築物番号１９３７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図３３は、構築物番号１０６７および１９７７（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１９７７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３３Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号９５）を示す。 図３３は、構築物番号１０６７および１９７７（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１９７７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３３Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号９６）を示す。 図３３は、構築物番号１０６７および１９７７（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１９７７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３３Ｃは、構築物番号１０６７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の模式的表示を示す。 図３３は、構築物番号１０６７および１９７７（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１９７７は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３３Ｄは、構築物番号１９７７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図３４は、構築物番号２０７２および２０５０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３４Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号９７）を示す。 図３４は、構築物番号２０７２および２０５０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３４Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号９８）を示す。 図３４は、構築物番号２０７２および２０５０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３４Ｃは、構築物番号２０７２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の模式的表示を示す。 図３４は、構築物番号２０７２および２０５０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．１５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３４Ｄは、構築物番号２０５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図３５は、構築物番号２０７４および２０６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１６を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３５Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号９９）を示す。 図３５は、構築物番号２０７４および２０６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１６を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３５Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号１００）を示す。 図３５は、構築物番号２０７４および２０６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１６を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３５Ｃは、構築物番号２０７４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の模式的表示を示す。 図３５は、構築物番号２０７４および２０６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１６を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３５Ｄは、構築物番号２０６０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図３６は、構築物番号１４４５、１８２０および１９７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例１５．１７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１９７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、スタッファー断片（マルチクローニング部位）も植物ｋｏｚａｋ配列も含まず（この構築物もまた、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、「ＣＰＭＶ１６０」（ＣＰＭＶＸ）ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図３６Ａは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号１０１）を示す。 図３６は、構築物番号１４４５、１８２０および１９７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例１５．１７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１９７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、スタッファー断片（マルチクローニング部位）も植物ｋｏｚａｋ配列も含まず（この構築物もまた、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、「ＣＰＭＶ１６０」（ＣＰＭＶＸ）ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図３６Ｂは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す。 図３６は、構築物番号１４４５、１８２０および１９７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例１５．１７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１９７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、スタッファー断片（マルチクローニング部位）も植物ｋｏｚａｋ配列も含まず（この構築物もまた、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、「ＣＰＭＶ１６０」（ＣＰＭＶＸ）ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図３６Ｃは、構築物番号１４４５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の模式的表示を示す。 図３６は、構築物番号１４４５、１８２０および１９７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例１５．１７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１９７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、スタッファー断片（マルチクローニング部位）も植物ｋｏｚａｋ配列も含まず（この構築物もまた、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、「ＣＰＭＶ１６０」（ＣＰＭＶＸ）ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図３６Ｄは、構築物番号１８２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物）の模式的表示を示す。 図３６は、構築物番号１４４５、１８２０および１９７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例１５．１７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８２０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。構築物番号１９７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲを含み、スタッファー断片（マルチクローニング部位）も植物ｋｏｚａｋ配列も含まず（この構築物もまた、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、「ＣＰＭＶ１６０」（ＣＰＭＶＸ）ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図３６Ｅは、構築物番号１９７５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０；ＣＰＭＶＸベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図３７は、構築物番号１４５４および１８９３（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８９３は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３７Ａは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１０３）を示す。 図３７は、構築物番号１４５４および１８９３（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８９３は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３７Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号１０４）を示す。 図３７は、構築物番号１４５４および１８９３（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８９３は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３７Ｃは、構築物番号１４５４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の模式的表示を示す。 図３７は、構築物番号１４５４および１８９３（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８９３は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３７Ｄは、構築物番号１８９３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図３８は、構築物番号１０６７および１８７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３８Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１０５）を示す。 図３８は、構築物番号１０６７および１８７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３８Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号１０６）を示す。 図３８は、構築物番号１０６７および１８７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（Ｐｒｌ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．１９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１０６７は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図３８Ｃは、構築物番号１８７５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋）の模式的表示を示す。
図３９は、構築物番号２０７２および２０５２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．２０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３９Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号１０７）を示す。 図３９は、構築物番号２０７２および２０５２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．２０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３９Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号１０８）を示す。 図３９は、構築物番号２０７２および２０５２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．２０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７２は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０５２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ。図３９Ｃは、構築物番号２０５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。
図４０は、構築物番号２０７４および２０６２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．２１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図４０Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１０９）を示す。 図４０は、構築物番号２０７４および２０６２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．２１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図４０Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。 図４０は、構築物番号２０７４および２０６２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．２１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号２０７４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号２０６２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図４０Ｃは、構築物番号２０６２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。
図４１は、構築物番号１４４５および１８３９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．２２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８３９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４１Ａは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号１１１）を示す。 図４１は、構築物番号１４４５および１８３９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．２２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８３９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４１Ｂは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号１１２）を示す。 図４１は、構築物番号１４４５および１８３９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）ＮＯＳ；実施例５．２２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４４５は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８３９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４１Ｃは、構築物番号１８３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。
図４２は、構築物番号１４５４および１８６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．２３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図４２Ａは、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１１３）を示す。 図４２は、構築物番号１４５４および１８６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．２３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図４２Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号１１４）を示す。 図４２は、構築物番号１４５４および１８６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ ＮＯＳ；実施例５．２３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１４５４は、先行技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。構築物番号１８６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位および植物ｋｏｚａｋ配列を含むスタッファー断片を含み、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失したタンパク質分解性ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質テール。図４２Ｃは、構築物番号１８９３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋）の模式的表示を示す。
図４３は、構築物番号４８９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＯＳ、実施例５．２４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号４８９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。図４３Ａは、ネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのヌクレオチド配列（配列番号１１５）を示す。 図４３は、構築物番号４８９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＯＳ、実施例５．２４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号４８９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。図４３Ｂは、ネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのアミノ酸配列（配列番号１１６）を示す。 図４３は、構築物番号４８９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＮＯＳ、実施例５．２４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号４８９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全Ｍタンパク質をコードする配列に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ）を組み込み、５’ＵＴＲと対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間に異種ｋｏｚａｋ配列を含まない。図４３Ｃは、構築物番号４８９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ；参照構築物）の模式的表示を示す。
図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ａは、プライマー配列ＩＦ＊＊（ＳａｃＩＩ）−ＰＤＩ．ｓ１＋４ｃ（配列番号１１７）を示す。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｂは、プライマー配列ＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号１１８）を示す。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｃは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａの配列（配列番号１１９）を示す。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｄは、構築物２１７１の模式的表示を示す（プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位が示される）。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｅは、構築物２１７１、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセット、Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ膜貫通細胞質テールおよびＣＰＭＶ３’ＵＴＲを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ（配列番号１２０）を示す。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｅは、構築物２１７１、左のｔ−ＤＮＡ境界（下線）から右のｔ−ＤＮＡ境界（下線）までの、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセット、Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ膜貫通細胞質テールおよびＣＰＭＶ３’ＵＴＲを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ（配列番号１２０）を示す。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１８００を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線を付す；５’ＵＴＲは太字で示される；植物ｋｏｚａｋ配列は二重下線で示される；１６塩基対のスタッファー断片（マルチクローニング部位）は、５’ＵＴＲと植物ｋｏｚａｋ配列との間に位置付けられる（配列番号１２１）。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｇは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａのアミノ酸配列（配列番号１２２）を示す。 図４４は、構築物番号１８００（Ａ−２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ１６０＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ；実施例５．２５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８００は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ ５’ＵＴＲ、スタッファー断片（マルチクローニング部位）および植物ｋｏｚａｋ配列を含み（この構築物は、不完全Ｍタンパク質をコードする配列を含まない）、ＣＰＭＶ１６０＋（ＣＰＭＶＸ＋、ここで、Ｘ＝１６０）ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４４Ｈは、構築物番号１８００（ＣＰＭＶＸ＋ベースの構築物、ここで、Ｘ＝１６０）の模式的表示を示す。
図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ａは、プライマー配列ＩＦ（ＳａｃＩＩ）−Ｋｏｚａｃ＿ＰＤＩ．ｃ（配列番号１２３）を示す。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｂは、プライマー配列ＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号１２４）を示す。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｃは、構築物２１８１の模式的表示を示す。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｄは、構築物２１８１の配列（下線を付した左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界まで；プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ；配列番号１２６）を示す。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｄは、構築物２１８１の配列（下線を付した左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界まで；プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ；配列番号１２６）を示す。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｅは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１８１９を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１２７）。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｅは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１８１９を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１２７）。 図４５は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全Ｍタンパク質、マルチクローニング部位をコードするスタッファー断片に融合した、１６１位において変異した開始コドンを有するＣＭＰＶ ５’ＵＴＲを組み込み、マルチクローニング部位と対象のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に植物ｋｏｚａｋ配列を含む。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図４５Ｆは、構築物１８１９の模式的表示を示す。
図４６Ａは、Ｍ２と同時発現させた場合の、ネイティブＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡおよびタンパク質分解性ループが欠失した改変Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡの相対的赤血球凝集活性を示す。ネイティブおよび改変Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡ（構築物番号２１４２および２１５２、実施例５．３３および５．３４を参照のこと）を、Ｍ２（構築物番号１２６１、実施例５．１を参照のこと）の存在下で発現させ、植物から精製した。 図４６Ｂは、ネイティブＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡ（構築物番号２１４２）およびタンパク質分解性ループが欠失した改変Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡ（構築物番号２１５２）のタンパク質収量を示す。 図４６Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン２は、精製された、タンパク質分解性ループが除去された改変Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡ（構築物番号２１５２）を示し、レーン３は、精製されたネイティブＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡ（構築物番号２１４２）を示す。各レーンについて、２μｇの総タンパク質をゲル上にロードした。タンパク質プロファイルの純度は、両方の構築物について類似である。
図４７Ａは、ネイティブＨＡタンパク質と、タンパク質分解性ループがＧＧリンカーによって置き換えられた改変ＨＡ（ｐｒｌ−）、タンパク質分解性ループがＴＥＴＱリンカーによって置き換えられた改変ＨＡ（ＴＥＴＱ）およびタンパク質分解性ループがＴＥＴＲリンカーによって置き換えられた改変ＨＡ（ＴＥＴＲ）との間の、トリプシン耐性を示す。ネイティブ（番号４８９）、ＰＲＬ−（番号９２８）、ＴＥＴＱ（番号７６６）およびＴＥＴＲ（番号６７６）Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＨＡ ＶＬＰ構築物を精製した。各ロットについて、ＨＡ ＶＬＰの２つの試料を、１５０μｇ／ｍＬの標的濃度で、ｐＨ７．４の緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ／ＫＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴＷＥＥＮ ８０）中に再懸濁した。トリプシンを、１つの再懸濁試料に、１：１００のタンパク質比で添加した。試料を、室温で３０分間、６０分間および１２０分間、インキュベートした。３０μＬの非消化抽出物（対照）および３０μＬの消化抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、クマシーブルーで染色した。 図４７Ｂは、２用量後のマウスにおけるネイティブＨ５ ＶＬＰおよびその変異体対応物（ｐｒｌ−、ＴＥＴＱおよびＴＥＴＲ）の免疫原性（ＨＩ力価）を示す。バーは、各Ｈ５変異体ＶＬＰとネイティブＨ５ ＶＬＰとの相対的（％）ＨＩ力価比較を示す。
図４８は、構築物番号２２２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４８Ａは、プライマーＩＦ＊＊−Ｈ２Ｓ１５７．ｓ１−６ｒのヌクレオチド配列（配列番号１２７）を示す。 図４８は、構築物番号２２２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４８Ｂは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅのヌクレオチド配列（配列番号１２８）を示す。 図４８は、構築物番号２２２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４８Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２０のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅヌクレオチド配列に下線を付す。 図４８は、構築物番号２２２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４８Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２０のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅヌクレオチド配列に下線を付す。 図４８は、構築物番号２２２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４８Ｄは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅのアミノ酸配列を示す。 図４８は、構築物番号２２２０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２７を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４８Ｅは、構築物番号２２２０の模式的表示を示す。
図４９は、構築物番号２２２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４９Ａは、プライマーＨ２Ｓ１５７（Ｐｒｌ−）．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１３１）を示す。 図４９は、構築物番号２２２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４９Ｂは、プライマーＨ２Ｓ１５７（Ｐｒｌ−）．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１３２）を示す。 図４９は、構築物番号２２２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４９Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２１のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１３３）。 図４９は、構築物番号２２２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４９Ｃは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２１のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１３３）。 図４９は、構築物番号２２２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４９Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅのアミノ酸配列（配列番号１３４）を示す。 図４９は、構築物番号２２２１（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ、実施例５．２８を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図４９Ｅは、構築物番号２２２１の模式的表示を示す。
図５０は、構築物番号２２２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）および２２２３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ）、実施例５．２９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５０Ａは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２２のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１３５）。 図５０は、構築物番号２２２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）および２２２３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ）、実施例５．２９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５０Ａは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２２のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１３５）。 図５０は、構築物番号２２２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）および２２２３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ）、実施例５．２９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５０Ｂは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２３のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅのヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１３６）。 図５０は、構築物番号２２２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）および２２２３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ）、実施例５．２９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５０Ｂは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号２２２３のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅのヌクレオチド配列に下線を付す（配列番号１３６）。 図５０は、構築物番号２２２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）および２２２３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ）、実施例５．２９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５０Ｃ、構築物番号２２２２の模式的表示。 図５０は、構築物番号２２２２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）および２２２３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ）、実施例５．２９を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５０Ｄ、構築物番号２２２３の模式的表示。
図５１は、構築物番号２２１９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５１Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈのヌクレオチド配列（配列番号１３７）を示す。 図５１は、構築物番号２２１９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５１Ｂは、プライマーＩＦ＊＊−Ｈ３Ｐ１６０９．Ｓ１−６ｒのヌクレオチド配列（配列番号１３８）を示す。 図５１は、構築物番号２２１９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５１Ｃは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈのアミノ酸配列（配列番号１３９）を示す。 図５１は、構築物番号２２１９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５１Ｄは、構築物番号２２１９の模式的表示を示す。 図５１は、構築物番号２２１９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３０を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５１Ｅは、構築物番号２１３９の模式的表示を示す。
図５２は、構築物番号２０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１５９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５２Ａは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈのヌクレオチド配列（配列番号１４０）を示す。 図５２は、構築物番号２０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１５９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５２Ｂは、プライマーＨ３Ｐ１６０９（Ｐｒｌ−）＃２．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１４１）を示す。 図５２は、構築物番号２０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１５９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５２Ｃは、プライマーＨ３Ｐ１６０９（Ｐｒｌ−）＃２．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１４２）を示す。 図５２は、構築物番号２０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１５９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５２Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈのアミノ酸配列（配列番号１４３）を示す。 図５２は、構築物番号２０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１５９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５２Ｅは、構築物番号２０３９の模式的表示を示す。 図５２は、構築物番号２０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）および２１５９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）、実施例５．３１を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５２Ｆは、構築物番号２１５９の模式的表示を示す。
図５３は、構築物番号２２３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）および２２５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、実施例５．３２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ａは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａのヌクレオチド配列のヌクレオチド配列（配列番号１４４）を示す。 図５３は、構築物番号２２３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）および２２５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、実施例５．３２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｂは、プライマーＨ３Ｖ３６１１１（Ｐｒｌ−）．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１４５）を示す。 図５３は、構築物番号２２３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）および２２５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、実施例５．３２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｃは、プライマーＨ３Ｖ３６１１１（Ｐｒｌ−）．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１４６）を示す。 図５３は、構築物番号２２３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）および２２５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、実施例５．３２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａのアミノ酸配列（配列番号１４７）を示す。 図５３は、構築物番号２２３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）および２２５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、実施例５．３２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｅは、構築物番号２２３０の模式的表示を示す。 図５３は、構築物番号２２３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）および２２５０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、実施例５．３２を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｆは、構築物番号２２５０の模式的表示を示す。
図５４は、構築物番号２１４２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５４Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのヌクレオチド配列（配列番号１４８）を示す。 図５４は、構築物番号２１４２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５４Ｂは、プライマーＩＦ＊−Ｈ７Ｈ１１３．ｓ１−６ｒのヌクレオチド配列（配列番号１４９）を示す。 図５４は、構築物番号２１４２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５４Ｃは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのアミノ酸配列（配列番号１５０）を示す。 図５４は、構築物番号２１４２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３３を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｄは、構築物番号２１４２の模式的表示を示す。
図５５は、構築物番号２１５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５５Ａは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのヌクレオチド配列（配列番号１５１）を示す。 図５５は、構築物番号２１５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５５Ｂは、プライマーＨ７Ｈ１１３（ＰｒＬ−）．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１５２）を示す。 図５５は、構築物番号２１５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５５Ｃは、プライマーＨ７Ｈ１１３（ＰｒＬ−）．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１５３）を示す。 図５５は、構築物番号２１５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。。図５５Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのアミノ酸配列（配列番号１５４）を示す。 図５５は、構築物番号２１５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ）、実施例５．３４を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５３Ｅは、構築物番号２１５２の模式的表示を示す。
図５６は、構築物番号２２２４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）、実施例５．３５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５６Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇのヌクレオチド配列（配列番号１５５）を示す。 図５６は、構築物番号２２２４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）、実施例５．３５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５６Ｂは、プライマーＩＦ＊＊−Ｈ９ＨＫ１０７３９９．Ｓ１−６ｒのヌクレオチド配列（配列番号１５６）を示す。 図５６は、構築物番号２２２４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）、実施例５．３５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５６Ｃは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇのアミノ酸配列（配列番号１５７）を示す。 図５６は、構築物番号２２２４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）、実施例５．３５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５６Ｄは、構築物番号２２２４の模式的表示を示す。 図５６は、構築物番号２２２４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）、実施例５．３５を参照のこと）を調製するために使用した配列成分を示す。図５６Ｅは、構築物番号２２２６の模式的表示を示す。
図５７は、構築物番号２２２５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３６を参照のこと。図５７Ａは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇのヌクレオチド配列（配列番号１５８）を示す。 図５７は、構築物番号２２２５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３６を参照のこと。図５７Ｂは、プライマーＨ９ＨＫ１０７３９９（Ｐｒｌ−）．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１５９）を示す。 図５７は、構築物番号２２２５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３６を参照のこと。図５７Ｃは、プライマーＨ９ＨＫ１０７３９９（Ｐｒｌ−）．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１６０）を示す。 図５７は、構築物番号２２２５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３６を参照のこと。図５７Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇのアミノ酸配列（配列番号１６１）を示す。 図５７は、構築物番号２２２５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３６を参照のこと。図５７Ｅは、構築物番号２２２５の模式的表示を示す。 図５７は、構築物番号２２２５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）および２２２７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３６を参照のこと。図５７Ｆは、構築物番号２２２７の模式的表示を示す。
図５８は、構築物番号２０１３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３７を参照のこと。図５８Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（配列番号１６２）を示す。 図５８は、構築物番号２０１３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３７を参照のこと。図５８Ｂは、プライマーＩＦ＊＊−ＨＢＭ２５０６０４．Ｓ１−６ｒのヌクレオチド配列（配列番号１６３）を示す。 図５８は、構築物番号２０１３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３７を参照のこと。図５８Ｃは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａのアミノ酸配列（配列番号１６４）を示す。 図５８は、構築物番号２０１３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３７を参照のこと。図５８Ｄは、構築物番号２０１３の模式的表示を示す。
図５９は、構築物番号２０１４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３８を参照のこと。図５９Ａは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａのヌクレオチド配列（配列番号１６５）を示す。 図５９は、構築物番号２０１４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３８を参照のこと。図５９Ｂは、プライマーＨＢＭ２５０６０４（ＰｒＬ−）．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１６６）を示す。 図５９は、構築物番号２０１４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３８を参照のこと。図５９Ｃは、プライマーＨＢＭ２５０６０４（ＰｒＬ−）．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１６７）を示す。 図５９は、構築物番号２０１４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３８を参照のこと。図５９Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａのアミノ酸配列（配列番号１６８）を示す。 図５９は、構築物番号２０１４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３８を参照のこと。図５９Ｅは、構築物番号２０１４の模式的表示を示す。
図６０は、構築物番号２０７０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および２０９０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３９を参照のこと。図６０Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのヌクレオチド配列（配列番号１６９）を示す。 図６０は、構築物番号２０７０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および２０９０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３９を参照のこと。図６０Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのヌクレオチド配列（配列番号１６９）を示す。 図６０は、構築物番号２０７０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および２０９０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３９を参照のこと。図６０Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのアミノ酸配列（配列番号１７０）を示す。 図６０は、構築物番号２０７０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および２０９０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３９を参照のこと。図６０Ｃは、構築物番号２０７０の模式的表示を示す。 図６０は、構築物番号２０７０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および２０９０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３９を参照のこと。図６０Ｄは、構築物番号２０８０の模式的表示を示す。 図６０は、構築物番号２０７０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０８０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および２０９０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．３９を参照のこと。図６０Ｅは、構築物番号２０９０の模式的表示を示す。
図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ａは、プライマーＨＢＦ４０６（ＰｒＬ−）．ｒのヌクレオチド配列（配列番号１９０）を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｂは、プライマーＨＢＦ４０６（ＰｒＬ−）．ｃのヌクレオチド配列（配列番号１９１）を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｃは、プライマーＩＦ＊−ＨＢＦ４０６．ｓ１−６ｒのヌクレオチド配列（配列番号１９２）を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｄは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａのヌクレオチド配列を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｅは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａのアミノ酸配列を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｅは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａのアミノ酸配列を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｆは、発現カセット番号２１０２のヌクレオチド配列を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｇは、構築物番号２１０２の模式的表示を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｈは、発現カセット番号２１０４のヌクレオチド配列を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｈは、発現カセット番号２１０４のヌクレオチド配列を示す。 図６１は、構築物番号２１０２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）および２１０４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４０を参照のこと。図６１Ｉは、構築物番号２１０４の模式的表示を示す。
図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ａは、プライマーＩＦ−Ｈ１ｃＴＭＣＴ．Ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列（配列番号１９７）を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｂは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１Ｃａｌ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１９８）を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｂは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１Ｃａｌ ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号１９８）を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｃは、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１Ｃａｌ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｄは、発現カセット番号２１０６のヌクレオチド配列を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｄは、発現カセット番号２１０６のヌクレオチド配列を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｅは、構築物番号２１０６の模式的表示を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｆは、発現カセット番号２１０８のヌクレオチド配列を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｆは、発現カセット番号２１０８のヌクレオチド配列を示す。 図６２は、構築物番号２１０６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）および２１０８（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＢｅＹＤＶ／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ／ＮＯＳ）を調製するために使用した配列成分を示す、実施例５．４１を参照のこと。図６２Ｇは、構築物番号２１０８の模式的表示を示す。
詳細な説明
以下の記載は、好ましい実施形態の記載である。
本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびに植物においてＶＬＰを生成する方法ならびにＶＬＰの収量、蓄積および生成を増加させる方法に関する。
本発明は、植物または植物の一部分においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法を一部提供する。この方法は、核酸を、植物または植物の一部分に導入するステップを含む。核酸は、植物において活性であり、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節領域を含む。ＨＡは、改変されたタンパク質分解性ループまたは切断部位を含む。植物または植物の一部分は、核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートされ、それによってＶＬＰを生成する。所望の場合、植物または植物の一部分が収穫され得、ＶＬＰが精製され得る。
本発明は、この方法によって生成されたＶＬＰもまた提供する。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質を含み得る。
このＶＬＰは、免疫応答を誘発するための有効用量のＶＬＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物を調製するために使用され得る。
タンパク質分解性ループまたは切断部位が改変されている、改変赤血球凝集素もまた本明細書に提供される。
本発明は、上記の核酸を発現させることによって生成されたＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する際に使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
本発明のＶＬＰは、上記の核酸を含む植物または植物の一部分を準備し、この核酸の発現を可能にする条件下でこの植物または植物の一部分をインキュベートすることによってＶＬＰを生成することによっても、生成され得る。このＶＬＰは、植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質を含み得る。このＶＬＰは、免疫応答を誘発するための有効用量のＶＬＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物を調製するために使用され得る。本発明は、第１の核酸および第２の核酸を発現させることによって生成されたＶＬＰを含む植物物質もまた提供する。この植物物質は、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する際に使用され得る。この植物物質は、栄養補助食品としても混合され得る。
本発明のＶＬＰは、１つまたは複数の改変されたインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）を含む。この改変されたＨＡは、任意のＨＡ、例えば、国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号；国際公開第２０１０／００３２３５号；国際公開第２０１１／０３５２２号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるような、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型ＨＡから誘導され得る。
本発明は、インフルエンザ株のＨＡ配列を含むＶＬＰを含み、ＨＡ配列は、例えば、本明細書に記載されるような改変を含む、改変された多塩基切断部位を含む。
ＨＡタンパク質
用語「赤血球凝集素」または「ＨＡ」は、本明細書中で使用する場合、インフルエンザウイルス粒子の外側で見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、シグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、ならびにＣ末端における膜貫通アンカー部位および小さい細胞質テールを含むＨＡ２ドメインを一般に含む、ホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質である。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知であり、入手可能である−例えば、ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｂａｓｅ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照のこと）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（URL:ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）、これらは共に、参照により本明細書中に組み込まれる、を参照のこと。ＨＡは、任意のＨＡ、例えば、例えば、国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号；国際公開第２０１０／００３２３５号；国際公開第２０１１／０３５２２号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるような、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型ＨＡを含み得る。さらに、ＨＡは、１つまたは複数の新興のインフルエンザウイルスまたは新たに同定されたインフルエンザウイルスから単離された赤血球凝集素の配列に基づき得る。本発明は、１つまたは１つより多いインフルエンザサブタイプから得られた改変ＨＡを含むＶＬＰもまた含む。
ＨＡ一量体は、３つの機能的ドメイン−ステムドメインまたはステムドメインクラスター（ＳＤＣ）、球状ヘッドドメインまたはヘッドドメインクラスター（ＨＤＣ）および膜貫通ドメインクラスター（ＴＤＣ）に下位分割され得る。ＳＤＣおよびＨＤＣは、「外部ドメイン」として総称され得る。Haら、２００２年による刊行物（EMBO J. ２１巻：８６５〜８７５頁；これは参照により本明細書に組み込まれる）は、Ｘ線結晶学的構造に基づいて、いくつかのインフルエンザサブタイプにおけるＳＤＣおよびＨＤＣの種々のサブドメインの相対的な配向を示している。
ＨＡタンパク質は、表面において伸長した三量体タンパク質へとアセンブルする、約７５ｋＤａの前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成される。
この前駆体タンパク質は、保存された活性化切断部位において、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）へと切断される。図１５は、いくつかのＨＡについてのリンカー領域のアミノ酸配列の非限定的な例を提供する。
用語「ホモ三量体（「homotrimer」または「homotrimeric」）」は、オリゴマーが３つのＨＡタンパク質分子によって形成されていることを示す。理論に束縛されることは望まないが、ＨＡタンパク質は、表面において伸長した三量体タンパク質へとアセンブルする、約７５ｋＤａの一量体前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成される。三量体化が起こる前に、この前駆体タンパク質は、保存された活性化切断部位（融合ペプチドともいう）において、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）へと切断される。このＨＡ１セグメントは３２８アミノ酸長であり得、このＨＡ２セグメントは２２１アミノ酸長であり得る。この切断はウイルスの感染性にとって重要であり得るが、タンパク質の三量体化または免疫原性には必須でない可能性がある。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内のＨＡの挿入、シグナルペプチドの切断およびタンパク質のグリコシル化は、同時翻訳事象である。ＨＡの正確な再折り畳みには、タンパク質のグリコシル化および５〜６つの鎖内ジスルフィド結合の形成が必要である。ＨＡ三量体は、シスゴルジ複合体およびトランスゴルジ複合体内でアセンブルし、その膜貫通ドメインが、三量体化プロセスにおいて役割を果たす。ブロメライン処理した、膜貫通ドメインを欠くＨＡタンパク質の結晶構造は、インフルエンザ株間で高度に保存された構造を示している。前駆体ＨＡ０が２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２へと切断されることを必要とする感染プロセスの間に、ＨＡが主要なコンフォメーション変化を受けることもまた、確立されている。ＨＡタンパク質は、プロセシングされていてもよく（即ち、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含む）か、プロセシングされていなくてもよい（即ち、ＨＡ０ドメインを含む）。ＨＡのプロセシングされていない前駆体タンパク質は、表面において伸長した三量体タンパク質へとアセンブルする、約７５ｋＤａの前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成される。前駆体タンパク質は、保存された切断部位（タンパク質分解性ループとしても公知）において、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）へと切断される。
本明細書に記載されるＨＡタンパク質は、さらに、改変ＨＡ（「変異体ＨＡ」とも呼ばれる）タンパク質、例えば、タンパク質分解性ループまたは切断部位が改変されている、改変された前駆体タンパク質（ＨＡ０）であり得る。
改変されたＨＡ／切断部位
ＨＡ０の切断後、ＨＡは、ｐＨに対して感受性になり、エンドソームのｐＨ（＜ｐＨ６．０）において不可逆的なコンフォメーション変化を受ける。前駆体ＨＡ０のコンフォメーションは、低いｐＨで安定であるが、切断されたＨＡ１−ＨＡ２形態は準安定である（Bullough PAら、１９９４年、Nature.３７１巻:３７〜４３頁）。異なるＨＡにおいてコンフォメーション変化を誘発するｐＨ閾値は、Ｂ株についてはおよそｐＨ５．８〜５．９であるが、Ａ型ＨＡについてはより酸性（ｐＨ５．１〜５．８）である（Beyer WEPら、１９８６年、Archives Virol、９０巻:１７３頁）。切断後、ＨＡ２のアミノ末端は、２３アミノ酸の非極性配列であり、これは次いで、宿主細胞膜にまたがる膜貫通ドメインになる（融合ペプチドと呼ばれる；図１５）。ＨＡの切断部位は、ＨＡの表面において突出するループ上に位置し、この部位は、プロテアーゼにより接近可能である。
卵におけるワクチンの生成を最適化し、活性ではあるが弱毒化されたウイルスを維持するために、Ｈ５の多塩基切断部位（ＲＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇ）の改変が研究されてきた（Horimoto Tら、２００６年、Vaccine、２４巻：３６６９〜３６７６頁）。対象の変異体は、多塩基切断部位を不活化する最初の４つの荷電アミノ酸（ＲＥＲＲ）の欠失およびＴＥＴＲによるアミノ酸ＲＫＫＲの置き換えを含有したが、ＴＥＴＲモチーフのアルギニン残基を介してＨＡ０をＨＡ１−ＨＡ２にプロセシングする可能性は維持した（図１９を参照のこと）。弱毒化ウイルスを生成するための類似の戦略は、多塩基部位を消滅させるためにＮＩＢＳＣによって使用され、卵を殺すことなしに高い収量でＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５ Ｈ５Ｎ１株を生成することを可能にする。多塩基部位配列（ＧＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇ）が、それらの変異体（ＮＩＢＳＣ ０５／２４０ ＮＩＢＳＣインフルエンザ参照ウイルスＮＩＢＧ−２３）において、ＲＥＴＲによって置き換えられている。Ｈ５ ＨＡの多塩基切断部位は、卵における発現のために、Ｈ６の一塩基部位によっても置き換えられている。この例では、多塩基部位の最初の４残基および最後の４つのアミノ酸は、ＩＥＴＲによって置き換えられている（ＩＥＴＲ↓ＧによるＲＥＲＲＲＫＫＲ↓Ｇの置き換え；Hoffman Eら、２００２年、Vaccine、２０巻：３１６５〜３１７０頁）。上で提供した例の各々において、改変を、卵内でのＨＡの生成を維持しつつ、ウイルスを弱毒化するために実施した。即ち、ＨＡ０前駆体の切断は、ＨＡ０がＨＡ１−ＨＡ２にプロセシングされ、ｐＨコンフォメーション変化を受けるのを可能することによって、宿主細胞におけるウイルス複製を可能にするために、完全には不活化しなかった。
本明細書で使用する場合、用語「改変赤血球凝集素」または「改変ＨＡ」、「変異した赤血球凝集素」または「変異したＨＡ」とは、ＨＡが、ＨＡタンパク質のタンパク質分解性ループまたは切断部位において変更されたアミノ酸配列を生じる改変または変異、例えば、置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを有する、ＨＡを指す。
Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８由来のＨＡ０の結晶構造は決定されている（Chen, J.、１９９８年.Cell ９５巻:４０９〜４１７頁；参照により本明細書中に組み込まれる）。溶媒に曝露される残基は、伸長した高度に曝露された表面ループを形成する切断部位の一部であると一般に考えられている。コンセンサス配列は、限定されないが、例えば、以下の選択された領域において決定され得る：
A/H3/HA0 コンセンサス:NVPEKQTR/GIFGAIAGFIE(配列番号66)
A/H1/HA0 コンセンサス:NIPSIQSR/GLFGAIAGFIE(配列番号67)
トリH5 コンセンサス：QRESRRKKR/GLFGAIAGFIEG(配列番号1)
B/HA0 コンセンサス:PAKLLKER/GFFGAIAGFLE(配列番号68)。
ＨＡ１とＨＡ２との間での切断は、「／」によって示され（Bianchiら、２００５年、Journal of Virology、７９巻：７３８０〜７３８８頁を参照のこと；参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに図１５および１８Ａによっても示される。
ＨＡタンパク質は、タンパク質分解性ループ領域中の改変、例えば、タンパク質分解性ループ（切断部位）の欠失、挿入、置換またはそれらの組合せを有する、インフルエンザＢ型赤血球凝集素またはインフルエンザＡ型赤血球凝集素のタンパク質であり得る。理論に束縛されることは望まないが、このタンパク質分解性ループの改変は、ＨＡ分子がＨＡ０前駆体として維持されることを確実にし得る。それによって、より均質で一貫した、ＨＡ０タンパク質を含むＶＬＰを生成する。
「タンパク質分解性ループ」または「切断部位」は、前駆体ＨＡ０の切断に関与するタンパク質分解部位のコンセンサス配列を意味する。本明細書中で使用する場合、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、複数の配列、例えば特定のインフルエンザＨＡ０配列のサブタイプのアラインメントの分析に基づく関連配列の配列可変性を含む配列（アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のいずれか）を意味する。インフルエンザＨＡ０切断部位のコンセンサス配列は、例えば、コンセンサスＨ１、コンセンサスＨ３、コンセンサスＨ５、またはインフルエンザＢ（例えば、Ｂ ＦｌｏｒｉｄａおよびＢ Ｍａｌａｙｓｉａが挙げられるがこれらに限定されない）コンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列を含む、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列を含み得る。タンパク質分解性ループ領域の配列の非限定的な例は、図１５および１８Ｂに示される（ならびにBianchiら、２００５年、Journal of Virology、７９巻：７３８０〜７３８８頁を参照のこと；参照により本明細書に組み込まれる）。
タンパク質分解性ループまたは切断部位中の残基は、変異していてもよい、例えば、限定されないが、点変異、置換、挿入または欠失していてもよい。用語「アミノ酸変異」または「アミノ酸改変」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入および改変を包含する意味である。置換、欠失、挿入および改変の任意の組合せが、最終構築物に達するために行われ得るが、ただし、最終構築物は、所望の特徴、例えば、プロテアーゼによるタンパク質分解性ループまたは切断部位の切断の低減または消滅を有する。
「改変タンパク質分解性ループ」は、タンパク質分解性ループが、１つもしくは複数の点変異を含み得ること、部分的に欠失し得ること、完全に欠失し得ること、リンカー配列によって部分的に置き換えられ得ること、リンカー配列によって完全に置き換えられ得ること、切断部位内のアミノ酸の、１つもしくは複数の非タンパク質アミノ酸による部分的もしくは完全な置き換えを含み得ること、またはそれらの組合せを意味する。同様に、「改変切断部位」は、タンパク質分解性ループ内の切断部位が、１つもしくは複数の点変異を含み得ること、部分的に欠失し得ること、完全に欠失し得ること、リンカー配列によって部分的に置き換えられ得ること、リンカー配列によって完全に置き換えられ得ること、切断部位内のアミノ酸の、１つもしくは複数の非タンパク質アミノ酸による部分的もしくは完全な置き換えを含むこと、またはそれらの組合せを意味する。タンパク質分解性ループ、切断部位またはその両方に対する改変は、タンパク質分解性ループまたは切断部位配列の外側またはそれらに隣接して位置する１つまたは複数のアミノ酸の欠失、置き換えまたは置換もまた含み得る。「リンカー」は、タンパク質分解性ループもしくは切断部位内に導入され得る、またはタンパク質分解性ループもしくは切断部位のアミノ酸の一部もしくは全てを置き換え得る、１つまたは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列を意味する。リンカーは、タンパク質分解性ループまたは切断部位内の任意のアミノ酸欠失が、改変ＨＡの発現または引き続く活性を破壊しないことを確実にするように設計され得る。
タンパク質分解性ループを改変または欠失させることによってＨＡタンパク質を安定化させることにより、この改変ＨＡが植物において発現させるとき、同じ条件下で植物において発現されたネイティブＨＡと比較した場合に、増加した生成物またはタンパク質収量が達成され得る。さらに、タンパク質分解性ループを改変または欠失させることによって、同じ条件下で植物において発現されたネイティブＨＡと比較した場合に、発現された改変ＨＡの発現の可変性が低減し、生成された改変ＨＡの一貫性が増加する。
したがって、本発明は、植物におけるＨＡタンパク質の生成物収量を増加させる方法もまた含む。理論に束縛されることは望まないが、ＨＡタンパク質中のタンパク質分解性ループを改変または欠失させることによって、植物におけるタンパク質分解性の分解に対する改善された安定性、ゴルジ体分泌プロセスにおけるＨＡの通過の間または精製プロセスの間の安定化が提供されると考えられる。
さらに、本発明は、植物において発現されるＨＡタンパク質の生成物品質を増加させる方法もまた含む。生成物品質とは、例えば、植物において発現されるＨＡの増加した生成物収量、生成物の安定性、例えば、植物において発現されるＨＡの増加した安定性、生成物の一貫性、例えば、同種生成物、例えばＨＡ０の生成、またはそれらの組合せを意味する。
生成物収量またはタンパク質収量における増加とは、そのタンパク質分解性ループが除去されていない同じＨＡタンパク質の生成物収量またはタンパク質収量と比較した場合に、約２０％〜約１００％、または当該分野で標準的な技術を使用して決定されるそれらの間の任意の量、例えば、約４０％〜約７０％またはそれらの間の任意の値、例えば約２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００％またはそれらの間の任意の量の、相対的タンパク質収量における増加を意味する。
図１３Ａおよび１４に示されるように、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉においてはあまり発現されない（レーン１００８を参照のこと）。しかし、タンパク質分解性ループを欠失するように改変されているＨＡ Ｂ型の発現（レーン１０５９、図１３Ａ、図１４を参照のこと）は、増加した発現を生じた。さらに、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２とのＨＡ−Ｂ型の同時発現は、ＨＡ発現における増加を生じる（レーン「１００８＋１２６１」；および「１０５９＋１２６１」を参照のこと）。Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来のＭ２との、タンパク質分解性ループ中に欠失を含むＨＡ Ｂ型の同時発現もまた、増加した発現を生じた（１０５９＋８５９；図１４）。
図４６Ｂにさらに示されるように、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて発現されたＨ７ Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／１３由来のＨＡタンパク質のタンパク質収量は、タンパク質分解性ループを欠失または改変するように改変されたＨＡにおいて増加する。Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との、ネイティブ（野生型）ＨＡ Ｈ７ Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／１３の同時発現は、１００％の相対的タンパク質収量をもたらすが、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との、タンパク質分解性ループ中に欠失を含むＨＡ Ｈ７ Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／１３の同時発現は、１８２％の相対的タンパク質収量をもたらす（図４６Ｂ）。しかし、タンパク質分解性ループ中に欠失を含むＨＡの相対的タンパク質収量の増加は、Ｍ２に依存しない。例えば、図２９Ａに示すように、ネイティブＨ７ Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／１３と比較した場合、タンパク質分解性ループ中に欠失を含むＨ７ Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／１３は、増加した発現（相対的ＨＡ力価によって測定される）を示した。
いくつかの戦略を、Ａ株およびＢ株の両方について、ＨＡ０の切断を不活化するために評価した。プロテアーゼによって認識されるコンセンサス配列は、伸長したループ上に封入され、溶媒に曝露され、タンパク質に対して遠位部分の膜に近い。Ｂ株では、このループは、プロテアーゼによって認識される２つの配列モチーフおよびＨＡ２ドメインの最初のＮ末端アミノ酸を含有する。ＨＡ０前駆体の切断を不活化する点変異アプローチ（例えば、以下の表２を参照のこと）は、Ｂ株ＶＬＰの蓄積の増加なしに、ＨＡ０生成を生じた。２つのプロテアーゼ切断モチーフ（７アミノ酸）を含む配列モチーフの欠失は、Ｂ ＨＡの蓄積を消滅させた。Ｂ株のＨＡタンパク質からの１８アミノ酸ループ全体の除去、およびタンパク質構造の構造的特徴（ベータ鎖）を保存するためのリンカーの挿入は、有効であった（以下；図１３Ａ、１４、１６Ａ、１７Ｂを参照のこと）。Ａ株のＨＡタンパク質におけるタンパク質分解性ループの除去または置き換えもまた、有効であった（図２０、２２を参照のこと）。
アミノ酸配列の欠失および挿入は、アミノ酸欠失およびアミノ酸の挿入を含む。インフルエンザＢにおける欠失の非限定的な例は、例えば、インフルエンザＢ ＦｌｏｒｉｄａおよびＢ Ｍａｌａｙｓｉａについて図１８Ｃに示されるような、成熟ＨＡタンパク質の３４０位から３５７位までの１７アミノ酸（ＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥ）の欠失である。この欠失は、図２１Ｂに示されるような、例えば配列「ＧＧ」を使用することであるがこれに限定されない、適切な発現のためにポリペプチド鎖を連結するための適切なリンカーによって置き換えられ得る（配列番号１７；改変Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８；ＧＧによってＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＧを置き換える；例えば、構築物１０５９、図５Ｄ、１０；構築物１０３９、図８Ｂ、または構築物１４６７；図７Ｄ、７Ｅ）。代替的な置き換えは、図２１Ｃに示されるように、「ＧＳＳＳＧＳＳＳＧ」によって「ＰＰＡＫＬＬＫＥＲ」を置き換えることを含む（配列番号１８）。さらに、配列「ＲＥＳＲＲＫＫＲ」は、インフルエンザＨ５／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａについて図１９に示されるように、「ＴＥＴＲ」または「ＴＥＴＱ」によって置き換えられ得る。
Ａ株由来のＨＡについての代替的アミノ酸変異には、アミノ酸の置換、挿入および欠失が含まれるが、例えば、Ｈ５ Ａｎｈｕｉのタンパク質分解性ループ領域におけるアミノ酸配列「ＲＥＲＲＲＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ」の欠失、Ｈ５ Ｉｎｄｏのタンパク質分解性ループ領域の「ＲＥＳＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ」を含むアミノ酸配列の欠失、またはＨ５ Ｖｉｅｔｎａｍのタンパク質分解性ループ領域のアミノ酸配列「ＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ」の欠失に限定されない。Ｈ３について、図２１Ｅに示されるように、配列「ＲＮＶＰＥＫＱＴＲＧＩＦ」は、欠失し得る、または例えば「ＧＳ」に限定されない適切なリンカー配列によって置き換えられ得る（配列番号２０）。あるいは、Ｈ３中の配列「ＲＮＶＰＥＫＱＴＲ」は、図２１Ｆに示されるように、「ＧＳＳＧＳＳＧＳＳ」によって置き換えられ得る（配列番号２１；改変Ｈ３ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９）。
さらに、プロテアーゼによるタンパク質分解性ループまたは切断部位の切断を低減または消滅させるためにＨＡのタンパク質分解性ループまたは切断部位を改変または変更することは、非保存的アミノ酸置換、即ち、異なる構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸によってあるアミノ酸を置き換えることもまた含み得る。非タンパク質アミノ酸もまた、置換に使用され得る。例えば、アミノ酸置換は、親水性アミノ酸によって疎水性アミノ酸を置き換えることを含み得る。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸による、またはタンパク質アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えを含み得る。
Ｂ株および／またはＡ株由来のＨＡについてのアミノ酸変異は、アミノ酸欠失を含み得る。例えば、プロテアーゼによるタンパク質分解性ループまたは切断部位の切断を低減または消滅させるために、１つまたは複数のアミノ酸は、タンパク質分解性ループまたは切断部位の配列内の欠失または除去である。欠失の非限定的な例には、図１８Ｃに示されるような、ネイティブＨＡ Ｈ５タンパク質、例えば、Ｈ５ Ａｎｈｕｉ（ＲＥＲＲＲＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ）、Ｈ５ Ｉｎｄｏ（ＲＥＳＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ）またはＨ５ Ｖｉｅｔｎａｍ（ＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ）のアミノ酸３２３〜３４１の除去が含まれる。Ｈ３について、配列「ＲＮＶＰＥＫＱＴＲＧＩＦ」は、「ＧＳ」によって置き換えられ得（図２１Ｅ；配列番号２０）、またはＨ３配列「ＲＮＶＰＥＫＱＴＲ」は、「ＧＳＳＧＳＳＧＳＳ」によって置き換えられ得る（図２１Ｆ；配列番号２１）。Ｂ株について、配列「ＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥ」は、図２１Ｂ（配列番号１７）に示すように、欠失し得るおよび／もしくは配列「ＧＧ」によって置き換えられ得、配列「ＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＧ」は「ＧＧ」によって置き換えられ得、または配列「ＰＰＡＫＬＬＫＥＲ」は、「ＧＳＳＳＧＳＳＳＧ」によって置き換えられ得る（図２１Ｃ；配列番号１８）。
アミノ酸変異は、当該分野で周知の遺伝学的方法または化学的方法を使用して生じ得る。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。遺伝子操作以外の方法、例えば化学的改変によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法もまた有用であり得ることが企図される。
したがって、本発明の赤血球凝集素（ＨＡ）配列は、改変されたタンパク質分解性ループ配列または切断部位を含み得、それによって、プロテアーゼによるタンパク質分解性ループまたは切断部位の切断が低減しまたは消滅する。赤血球凝集素ポリペプチド配列は、例えば、図５Ｄ、７Ｄ、８Ａ、１８Ｃ、１９、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｅ、２１Ｆ、２４Ｄ、２５Ｄおよび２６Ｄに示すように、改変タンパク質分解性ループ配列または改変切断部位配列を含み得る。任意のインフルエンザ株の任意の赤血球凝集素ポリペプチド配列の切断部位は、配列アラインメントを含む、当該分野で公知のあらゆる方法を使用して、決定または予測され得る（例えば図１５を参照のこと）。
Ｈ１、Ｈ３およびＢ ＨＡ由来の配列の分析により、Ｈ１が、融合ペプチドの直前に１つの一塩基タンパク質分解性部位（Ｃｌａｒａ型一塩基：Ｑ／ＥＸＲ）を有し、一方でＨ３およびＢ ＨＡが、２つのタンパク質分解性部位を有し、そのうち一方は、Ｃｌａｒａ様プロテアーゼによって認識され（Ｈ１において見出されるのと同様）、もう一方の部位は、トリプシンおよびキモトリプシン様プロテアーゼによって認識される（Ｐ−Ｅ／Ａ−Ｋ）ことが明らかである。これらのＨＡの切断のためのコンセンサス配列は、表１に示される。
Figure 2016516415
ＨＡのＨＡ０前駆体の潜在的なタンパク質分解性切断を回避するために、１つのタンパク質分解性部位だけを、Ｈ１の配列から改変する必要があり得るが、一方、Ｈ３およびＢの場合、２つの一塩基部位を改変する必要があり得る。
例えば、Ｂ／ＦｌｏｒｉｄａおよびＢ／ＢｒｉｓｂａｎｅのＨＡ０の第１の切断部位は、例えば、Ｌｙｓ３４１（成熟タンパク質の番号付け）をＩｌｅによって置き換えることによって、排除され得る（表２を参照のこと）。第２の一塩基部位は、融合ペプチドの前の３つのアミノ酸ＫＥＲ（３４４〜３４６）をＮＩＱによって置き換えることによって、消滅し得る。ＨＡのいくつかの改変タンパク質分解性ループの配列は、表２に提供される。
Figure 2016516415
さらなる例では、ＨＡ０中のタンパク質分解性ループを含む配列が、置き換えまたは欠失し得る。例えば、ＨＡ２のＮ末端アミノ酸ＧＩＦＧＩＡの欠失に加えて、ＨＡ１のＣ末端における配列ＲＮＶＰＥＫＱＴの欠失を含有するＨ３バリアントが、図２１Ｅに提供される。短縮されたＨＡ１−ＨＡ２は、ＧＳリンカーによって一緒に連結され得る。
別の例では、ループは、例えばＨ３中のタンパク質分解性切断部位を含み、可撓性リンカーによって置き換えられていてもよく、ＨＡ２部分はインタクトなままであり得る。（ＧＳＳ）３リンカーが、短縮されたＨＡ１をＨＡ２に適応させるために設計され得る（図２１Ｆを参照のこと）。
別の例では、インフルエンザＢ由来のＨＡは、ＨＡ２のＮ末端アミノ酸ＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＧの欠失に加えて、ＨＡ１のＣ末端における配列ＡＬＫＬＬＫＥＲの欠失を含有し得る。短縮されたＨＡ１−ＨＡ２は、ＧＧリンカーによって一緒に連結され得る（例えば図２１Ｂ；構築物１００８を参照のこと）。この構築物の発現は、図１３ＡおよびＢに示される。
別の例、インフルエンザＢ由来のＨＡでは、タンパク質分解性部位を含有するループは、可撓性リンカーによって置き換えられていてもよく、ＨＡ２部分はインタクトなままであった。より長いＧＳＳＳリンカーが、短縮されたＨＡ１をＨＡ２に適応させるために設計され得る（例えば図２１Ｃを参照のこと）。
図１３Ａおよび１４に示すように、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡは、アグロ浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉においてあまり発現されない（レーン１００８を参照のこと）。しかし、タンパク質分解性ループを欠失するように改変されたＨＡ Ｂ型の発現（レーン１０５９、図１３Ａ、図１４を参照のこと）は、増加した発現を生じた。さらに、ＨＡ−Ｂ型の、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現は、ＨＡ発現における増加を生じる（レーン「１００８＋１２６１」；および「１０５９＋１２６１」を参照のこと）。タンパク質分解性ループ中に欠失を含むＨＡ Ｂ型の、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来のＭ２との同時発現もまた、増加した発現を生じた（１０５９＋８５９；図１４）。
類似の様式で、Ｈ５／Ｉｎｄｏにおけるタンパク質分解性ループの欠失、および「ＧＧ」配列（構築物９２８；図４６Ｄを参照のこと）、「ＴＥＴＲ」配列（構築物６７６；図１９、２４Ｄもまた参照のこと）または「ＴＥＴＱ」配列（構築物７６６；図１９、２５Ｄもまた参照のこと）のいずれかによる置き換えは、ネイティブＨ５／Ｉｎｄｏで観察された発現のレベルと一致したまたはかかるレベルを超えて増加した発現レベルを生じた（構築物４８９；図２０および２３を参照のこと）。
図１３Ｂに示すように、ＨＡ０のタンパク質分解性ループ（図２１Ｂに示される配列）を欠失させることによって、得られたＨＡ０タンパク質は、そのタンパク質分解性ループが除去されていないＨＡタンパク質と比較した場合により高い赤血球凝集能によって示されるような、増加した活性を示す。
活性における増加とは、そのタンパク質分解性ループが除去されていない同じＨＡタンパク質の活性と比較した場合、約２％〜約１００％、または当該分野で標準的な技術を使用して決定されるそれらの間の任意の量、例えば、約１０％〜約５０％またはそれらの間の任意の値、例えば約２、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００％またはそれらの間の任意の量の、赤血球凝集能における増加を意味する。
本発明は、例えば改変されたＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６もしくはＢ型ＨＡ由来の改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６もしくはＢ型ＨＡにハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６もしくはＢ型ＨＡの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた含み、ヌクレオチド配列は、発現された場合にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは、抗体の生成を誘発する。例えば、植物細胞内のヌクレオチド配列の発現は、ＶＬＰを形成し、このＶＬＰは、ＢまたはＨ３由来の成熟ＨＡを含むＨＡに結合することが可能な抗体を生成するために使用され得る。ＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。好ましくは、ＶＬＰは、抗体の生成を誘発し、このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
例えば、植物細胞内のヌクレオチド配列の発現は、ＶＬＰを形成し、このＶＬＰは、ＨＡ０、そのタンパク質分解性ループが欠失または改変されたＨＡ０タンパク質、例えばサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｂ型ＨＡであるがこれらに限定されないものなどの１つまたは複数のインフルエンザ型またはサブタイプのＨＡ１またはＨＡ２が含まれるがこれらに限定されないＨＡなどのウイルスタンパク質に結合することが可能な抗体を生成するために使用され得る。このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは当技術分野で公知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら、編、１９９５年および補遺；Maniatisら、Molecular Cloning (A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory、１９８２年；SambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、２００１年を参照のこと；これらはそれぞれ、参照により本明細書中に組み込まれる）。１つのかかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃で４×ＳＳＣ中での約１６〜２０時間のハイブリダイゼーション、その後６５℃で０．１×ＳＳＣ中での１時間の洗浄、または６５℃で０．１×ＳＳＣ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、であり得る。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で一晩（１６〜２０時間）、その後６５℃で０．１×ＳＳＣ中での１時間の洗浄、または６５℃で０．１×ＳＳＣ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間または一晩（１６〜２０時間）の２回の洗浄、あるいは６５℃でＣｈｕｒｃｈ水性リン酸塩緩衝液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中でのハイブリダイゼーション、５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間のいずれかでの２回の洗浄、または６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのそれぞれ２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、であり得る。
さらに、本発明は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型ＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれらの間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴付けられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、プロテアーゼによるタンパク質分解性ループまたは切断部位の切断が低減しまたは消滅している改変されたタンパク質分解性ループ配列または切断部位を有する赤血球凝集素タンパク質（改変ＨＡ）をコードする。改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列が発現される場合、これはＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、抗体の生成を誘発する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現は、ＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、プロセシングされていないＨＡ（ＨＡ０）またはプロセシングされていない、タンパク質分解性ループが欠失しているものを含むＨＡに結合することが可能な抗体を生成するために使用され得る。このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
さらに、本発明は、配列番号４３、配列番号９１、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１５１、配列番号１５８、配列番号１６５のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれらの間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴付けられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現される場合にＶＬＰを形成する改変ＨＡタンパク質をコードし、ＶＬＰは、プロセシングされていないＨＡ（ＨＡ０）またはプロセシングされていない、タンパク質分解性ループが欠失もしくは改変されているものを含むＨＡに結合することが可能な抗体の生成を誘発する。このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
さらに、本発明は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号４１、配列番号５８、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号９２、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１３４、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５４、配列番号１６１、配列番号１６８、配列番号１９４および配列番号１９９のアミノ酸配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれらの間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴付けられるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、発現される場合にＶＬＰを形成する改変ＨＡタンパク質をコードし、ＶＬＰは、プロセシングされていないＨＡ（ＨＡ０）またはプロセシングされていない、タンパク質分解性ループが欠失もしくは改変されているものを含むＨＡに結合することが可能な抗体の生成を誘発する。このＶＬＰは、被験体に投与される場合、免疫応答を誘発する。
配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されるものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定され得る（例えば、以下であるがこれらに限定されないパラメータを使用する：ＧＡＰペナルティー５、トップダイアゴナル（top diagonal）の数５、固定ＧＡＰペナルティー１０、ｋ−タプル（k-tuple）２、浮動ギャップ（floating gap）１０、およびウインドウサイズ５）。しかし、例えば、SmithおよびWaterman（１９８１年、Adv. Appl. Math. ２巻:４８２頁）、NeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. ４８巻:４４３頁、１９７０年）、PearsonおよびLipman（１９８８年、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ８５巻:２４４４頁）のアルゴリズム、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）による、あるいは手動のアラインメントおよび目視検査によるなどの、比較のための配列のアラインメントの他の方法は、当技術分野で周知である。異なる株のインフルエンザ由来のＨＡの配列アラインメントの例は、図２４中に見出され得る。
例えば、以下をコードするヌクレオチド配列であるがこれらに限定されない：
・配列番号１７、配列番号１８、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５８、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４および配列番号１６８によって規定される改変タンパク質分解性ループを有するＢ型ＨＡ、または配列番号６５、配列番号７２、配列番号７３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３および配列番号１６５において規定される改変タンパク質分解性ループ領域を含むＢ型ＨＡをコードするヌクレオチド配列。
・改変タンパク質分解性ループを有するＨ１は、配列番号６３によって規定される改変切断部位を含む配列を含む。
・改変タンパク質分解性ループを有するＨ２は、配列番号１３４によって規定される改変切断部位を含む配列を含む。
・改変タンパク質分解性ループを有するＨ３は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１４３、配列番号１４７によって規定される配列、または配列番号６４によって規定される改変切断部位を含む配列を含む。
・タンパク質分解性ループが欠失したＨ５は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１によって規定される改変切断部位を含む配列を含む。
・改変タンパク質分解性ループを有するＨ７は、配列番号１５４によって規定される改変切断部位を含む配列、または配列番号１５１において規定される改変タンパク質分解性ループ領域を含むＨ７型ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む。
・改変タンパク質分解性ループを有するＨ９は、配列番号１６１によって規定される改変切断部位を含む配列、または配列番号１５８において規定される改変タンパク質分解性ループ領域を含むＨ９型ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は、膜貫通ドメインを含み、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含むＨＡタンパク質の使用に関し、例えば、ＨＡタンパク質は、ＨＡ０、またはＨＡ１およびＨＡ２を含むプロセシングされたＨＡであり得る。ＨＡタンパク質は、植物または植物細胞の発現系を使用した、ＶＬＰの生成または形成において使用され得る。
増幅エレメントおよびエンハンサーエレメント／調節エレメント
別の例では、改変ＨＡタンパク質は、増幅エレメントおよび／または調節エレメントまたは領域（本明細書でエンハンサーエレメントとも呼ぶ）を含む発現系において発現され得る。例えば、ジェミニウイルス由来の増幅エレメント、例えば、マメ黄化萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の増幅エレメントが、改変ＨＡを発現させるために使用され得る。ＢｅＹＤＶは、双子葉植物に適応したマストレウイルス（Mastreviruses）属に属する。ＢｅＹＤＶは、一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する一分であり、ローリングサークル機構によって非常に高いコピー数まで複製できる。ＢｅＹＤＶ由来のＤＮＡレプリコンベクター系は、植物における迅速で高収量のタンパク質生成のために使用されてきた。
本明細書中で使用する場合、語句「増幅エレメント」は、ジェミニウイルスゲノムのうち１つまたは複数の長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部分を含む核酸セグメントを指す。本明細書中で使用する場合、「長い遺伝子間領域」は、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による切り出しおよび複製を媒介することが可能なｒｅｐ結合部位を含む長い遺伝子間領域の領域を指す。いくつかの態様では、１つまたは複数のＬＩＲを含む核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）をさらに含み得る。本明細書中で使用する場合、「短い遺伝子間領域」は、相補鎖（マストレウイルスの短いＩＲ（ＳＩＲ））を指す。任意の適切なジェミニウイルス由来の増幅エレメントが、本明細書中で使用され得る。例えば、国際公開第２０００／２０５５７号；国際公開第２０１０／０２５２８５号；Zhang X.ら（２００５年、Biotechnology and Bioengineering、９３巻、２７１〜２７９頁）、Huang Z.ら（２００９年、Biotechnology and Bioengineering、１０３巻、７０６〜７１４頁）、Huang Z.ら（２００９年、Biotechnology and Bioengineering、１０６巻、９〜１７頁）；これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。１つより多いＬＩＲ、例えば２つのＬＩＲが構築物において使用される場合、プロモーター、ＣＭＰＶ−ＨＴ領域および対象の核酸配列ならびにターミネーターは、２つのＬＩＲの各々によってひとまとめにされる。
本明細書で記載するように、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のアグロ浸潤によるマメ黄化萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来ベクターおよびＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターの同時送達は、効率的なレプリコン増幅および頑強なタンパク質生成を生じる。タンパク質分解性ループが除去されたまたは除去されていない（構築物については図１７Ａを参照のこと）、増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下または非存在下での（構築物番号１０５９および１０３９）、改変インフルエンザＢ ＨＡ（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来）の発現を駆動する遺伝子構築物で形質転換された植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ＢｅＹＤＶの非存在下では、調節エレメントがＣＰＭＶ−ＨＴであった場合、インフルエンザＢ ＨＡの蓄積が検出できなかったことが示された（図１７Ｂ）。
図１７Ｂに示すように、ＢｅＹＤＶの非存在下でのタンパク質分解性ループが除去されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡの発現は、ウエスタンブロット分析によって検出可能な発現をもたらさない（図１７Ｂ中のレーン１０３９を参照のこと）。しかし、増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下でのタンパク質分解性ループが除去されたＨＡ Ｂ型の発現は、増加した発現を生じる（レーン１０５９を参照のこと）。同様に、ＢｅＹＤＶの非存在下では、タンパク質分解性ループ中に欠失を含む変異体ＨＡ−Ｂ型の、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現は、検出可能なＨＡ発現を生じない（図１７Ｂ中のレーン「１０３９＋１２６１」を参照のこと）。他方、タンパク質分解性ループ中に欠失を含む変異体ＨＡ Ｂ型の、ＢｅＹＤＶの存在下での、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＭ２との同時発現は、増加した発現を生じた（レーン「１０５９＋１２６１」；図１７Ｂを参照のこと）。
しかし、ＢｅｙＤＶの存在は、エンハンサーエレメントが発現系中に存在する場合、およびエンハンサーエレメントがＣＰＭＶ−ＨＴではない場合には、必要とされない。例えば、図２９Ａに示すように、エンハンサーエレメント、例えばＣＰＭＶ １６０、ＣＰＭＶ１６０＋またはＣＰＭＶ ＨＴ＋などの制御下での種々のＢ ＨＡ株の発現は、ＢｅＹＤＶの非存在下で増加した赤血球凝集力価（ＨＭＧ）を示すＨＡタンパク質の生成をもたらす。
したがって、変異体（改変）ＨＡタンパク質は、増幅エレメント、例えばジェミニウイルスベースの増幅エレメント、例えばＢｅＹＤＶの非存在下ではあるが、エンハンサーエレメント、例えばＣＰＭＶ １６０、ＣＰＭＶ １６０＋またはＣＰＭＶ ＨＴ＋などの存在下で、発現され得る。
変異体（改変ＨＡ）は、エンハンサーエレメント、例えばＣＰＭＶ １６０、ＣＰＭＶ１６０＋またはＣＰＭＶ ＨＴ＋などの存在下ではあるが、増幅エレメント、例えばＢｅＹＤＶなどの非存在下または存在下で、発現され得る。図２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｆに示すように、変異体（改変）ＨＡは、増幅エレメントの存在ありまたはなしで、エンハンサーエレメントの存在下で発現され得る。したがって、本発明は、エンハンサーエレメントおよび任意選択で増幅エレメントの存在下での、変異体（改変）ＨＡの発現にも関する。
エンハンサーエレメント（ＣＭＰＶ ＨＴ＋またはＣＭＰＶ １６０＋のいずれか）およびＧＧリンカーによって置き換えられたタンパク質分解性ループ（欠失したタンパク質分解性ループ）を含むＨＡ構築物は、野生型またはＣＰＭＶ ＨＴを含むＨＡ構築物と比較した場合、増加した発現を示す（図２８Ａ、Ｈ３ Ｐｅｒ；図２８Ｂ、Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ；図２８Ｃ、Ｈ９ ＨＫ；図２９Ｄ、Ｂ Ｍａｓｓ；図２８Ｅ、Ｈ２ Ｓｉｎ）。
図２９Ａは、タンパク質分解性ループが欠失した改変ＨＡ（ＧＧリンカー）またはネイティブＨＡのいずれかをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したＣＰＭＶ ＨＴ、ＣＰＭＶ ＨＴ＋、ＣＰＭＶ １６０またはＣＰＭＶ１６０＋ベースのエンハンサーエレメントを含む、植物において生成された改変ＨＡタンパク質の赤血球凝集力価についての要約データを示す。ほとんどの場合、発現（赤血球凝集力価として決定される）は、ＣＰＭＶ ＨＴ＋、ＣＰＭＶ １６０またはＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物についてより高く、顕著な発現レベルを実証している。
エンハンサーエレメントは、改変タンパク質分解性ループを有する変異体（改変）ＨＡタンパク質の高レベルの一過的な発現を達成するために使用され得る。エンハンサーエレメントは、コモウイルス、例えばササゲモザイクウイルスを含むＲＮＡ植物ウイルスに基づき得る（ＣＰＭＶ；例えば、国際公開第２００７／１３５４８０号；国際公開第２００９／０８７３９１号；米国特許出願公開第２０１０／０２８７６７０号、Sainsbury F.ら、２００８年、Plant Physiology；１４８巻：１２１〜１２１８頁；Sainsbury F.ら、２００８年、Plant Biotechnology Journal；６巻：８２〜９２頁；Sainsbury F.ら、２００９年、Plant Biotechnology Journal；７巻：６８２〜６９３頁；Sainsbury F.ら ２００９年、Methods in Molecular Biology、Recombinant Proteins From Plants、４８３巻：２５〜３９頁を参照のこと）。
ＣＰＭＶ １６０（ＣＰＭＶＸ）およびＣＰＭＶ １６０＋（ＣＰＭＶＸ＋）
一実施形態では、エンハンサーエレメントは、参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６１／９２５，８５２号に記載されるように、「ＣＰＭＶＸ」（「ＣＰＭＶ １６０」とも呼ばれる）および／または「ＣＰＭＶＸ＋」（「ＣＰＭＶ １６０＋」とも呼ばれる）である。
発現エンハンサー「ＣＰＭＶＸ」は、コモウイルスササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２配列のヌクレオチド１〜１６０由来の５’ＵＴＲ（配列番号９３）は、野生型コモウイルスゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質のうちの長い方の生成のための開始部位として機能する最初のインフレームの開始コドン（１６１位）に対する転写開始部位において開始する。さらに、ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２ゲノム配列中の１１５位（または１１５位に対応する位置）における「第３の」開始部位もまた、変異され得、欠失し得または他の方法で変更され得る。ＡＵＧ １６１の除去に加えたＡＵＧ １１５の除去は、不完全Ｍタンパク質と組み合わせた場合、発現を増強することが示されている（SainsburyおよびLomonossoff、２００８年、Plant Physiology；１４８巻：１２１２〜１２１８頁；国際公開第２００９／０８７３９１号；これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
ＣＰＭＶＸは、配列番号９３のＸヌクレオチド、ここで、Ｘ＝配列番号９３の１６０、１５５、１５０もしくは１１４、または、ＣＰＭＶＸと８０％〜１００％の間の配列類似性を含む配列、ここで、Ｘ＝配列番号９３の１６０、１５５、１５０もしくは１１４、を含む。この発現エンハンサーは、一般に、ＣＰＭＶＸと呼ばれる（図２６Ａを参照のこと）。
配列番号９３のヌクレオチド１〜１６０からなる、発現エンハンサーＣＰＭＶＸ、ここでＸ＝１６０：
Figure 2016516415
このＣＰＭＶＸエンハンサー配列は、スタッファー配列にさらに融合され得、ここで、ＣＭＰＶＸは、配列番号１のＸヌクレオチド、ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０もしくは１１４、または、ＣＰＭＶＸと８０％〜１００％の間の配列類似性を含む配列、ここで、Ｘ＝配列番号９３の１６０、１５５、１５０もしくは１１４、を含み、スタッファー配列は、ＣＭＰＶＸ配列の３’末端に融合した１〜１００ヌクレオチドを含む。例えば、スタッファー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。
ＣＭＰＶＸ配列がスタッファー断片を含む場合、この発現エンハンサーは、ＣＰＭＶＸ＋としても言及され得（図２６Ａを参照のこと）、ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０、１１４であり、この発現エンハンサーは、スタッファー配列を含むＣＭＰＶＸとして言及され得るか、またはＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶ１５５＋；ＣＰＭＶ１５０＋；ＣＰＭＶ１１４＋として言及され得、ここで、それぞれ、Ｘ−１６０、１５５、１５０もしくは１１４である。スタッファー配列を含まないＣＰＭＶＸを含む構築物は、ＣＰＭＶＸ＋と命名され得、ここで、Ｘ＝配列番号９３の１６０、１５５、１５０、１１４であり、スタッファー配列は、０ヌクレオチド長のものである。
スタッファー配列は、ヌクレオチド１６０に対して３’側に位置するネイティブＣＭＰＶ ５’ＵＴＲ配列の短縮化、欠失または置き換えによって改変され得る。改変スタッファー配列は、５’ＵＴＲと関連する初期または未改変（即ち、ネイティブ）スタッファー配列と比較した場合に、除去、置き換え、短縮化または短縮され得る（Sainsbury F.およびLomonossoff G.P.、２００８年、Plant Physiol.１４８巻：１２１２〜１２１８頁に記載されるとおり）。スタッファー配列は、１つもしくは複数の制限部位（ポリリンカー、マルチクローニング部位、１つもしくは複数のクローニング部位）、１つもしくは複数の植物ｋｏｚａｋ配列、１つもしくは複数のリンカー配列、１つもしくは複数の組換え部位、またはそれらの組合せを含み得る。例えば、限定と解釈すべきではないが、スタッファー配列は、順番に、植物ｋｏｚａｋ配列に融合した所望の長さのマルチクローニング部位を含み得る。スタッファー配列は、ネイティブＣＰＭＶ ５’ＵＴＲのヌクレオチド１６０、例えば、Sainsbury F.およびLomonossoff G.P.（２００８年、Plant Physiol. １４８巻：１２１２〜１２１８頁；これは参照により本明細書に組み込まれる）の図１に示されるようなヌクレオチド１６１〜５１２、または配列番号４のヌクレオチド１６１〜５０９に対して３’側に位置付けられるネイティブ５’ＵＴＲ配列由来のヌクレオチドを含まない。即ち、先行技術のＣＰＭＶ ＨＴ配列（Sainsbury F.およびLomonossoff G.P.、２００８年の図１）中に存在する不完全Ｍタンパク質は、本発明では５’ＵＴＲから除去される。
植物Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、当該分野で公知である（例えば、Ranganら、Mol. Biotechnol.、２００８年、７月、３９巻（３号）、２０７〜２１３頁を参照のこと）。天然に存在するＫｏｚａｋ配列および合成Ｋｏｚａｋ配列の両方が、発現エンハンサーにおいて使用され得、または、本明細書に記載されるように対象のヌクレオチド配列に融合され得る。
植物ｋｏｚａｋ配列は、以下の植物コンセンサス配列が含まれるがこれらに限定されない、任意の公知の植物ｋｏｚａｋ配列（例えば、L. Ranganら. Mol. Biotechnol.２００８年を参照のこと）であり得る：
caA(A/C)a (配列番号174; 植物界)
aaA(A/C)a (配列番号175; 双子葉植物)
aa(A/G)(A/C)a (配列番号176; シロイヌナズナ)
植物ｋｏｚａｋ配列は、以下の群からも選択され得る：
AGAAA (配列番号177)
AGACA (配列番号178)
AGGAA (配列番号179)
AAAAA (配列番号180)
AAACA (配列番号181)
AAGCA (配列番号182)
AAGAA (配列番号183)
AAAGAA (配列番号184)
AAAGAA (配列番号185)

(A/-)A(A/G)(A/G)(A/C)A. (配列番号186;コンセンサス配列)
発現エンハンサーＣＰＭＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋は、植物宿主内での対象のヌクレオチド配列の発現を駆動するために、エンハンサー配列の５’末端において、植物において活性な調節領域に作動可能に連結し得、発現エンハンサーの３’末端において対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る（図２６Ａ）。
ＣＰＭＶ ＨＴ＋、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［５１１］
別の一実施形態では、エンハンサーエレメントは、参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６１／９７１，２７４号に記載されるような「ＣＰＭＶ ＨＴ＋」である。発現エンハンサー「ＣＰＭＶ ＨＴ＋」（図２７Ａを参照のこと）は、コモウイルス５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、改変された、延長された、または短縮化されたスタッファー配列とを含む。
本明細書に記載される１つまたは１つより多い発現エンハンサー（例えば、ＣＰＭＶ ＨＴ＋、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［５１１］）に作動可能に連結した調節領域を含む第１の核酸配列、および改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む植物発現系もまた、提供される。さらに、プロモーター（調節領域）配列、コモウイルス５’ＵＴＲを含む発現エンハンサー（例えば、ＣＰＭＶ ＨＴ＋またはＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］）、および改変ＨＡをコードする１つまたは複数の核酸配列と融合した植物ｋｏｚａｋ配列を有するスタッファー配列を含む核酸が、記載される。核酸は、コモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、プラストシアニン３’ＵＴＲ、または植物において活性な他の３’ＵＴＲ、およびターミネーター配列、例えば、改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列（図２７Ａ中の対象のヌクレオチドを指す）の３’末端に作動可能に連結したＮＯＳターミネーターを含む配列をさらに含み得、その結果、改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列は、コモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、プラストシアニン３’ＵＴＲまたは他の３’ＵＴＲ配列の上流に挿入される。
配列番号１７３は、当該分野で公知の「ＣＰＭＶ ＨＴ」発現エンハンサーを含む（例えば、SainsburyおよびLomonossoff ２００８年、Plant Physiol. １４８巻：１２１２〜１２１８頁の図１；これは参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＰＭＶ ＨＴは、１１５位において改変ヌクレオチド（ｃｇｔ）を有する配列番号１７３のヌクレオチド１〜１６０の５’ＵＴＲ配列、および１６２位において改変ヌクレオチド（ａｃｇ）を有する不完全Ｍタンパク質を含み、植物ｋｏｚａｋ配列を欠く（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１〜１６０；下線を付した不完全Ｍタンパク質、ヌクレオチド１６１〜５０９）。配列番号１７３は、先行技術のＣＰＭＶ ＨＴ配列中には存在しないマルチクローニング部位（イタリック、ヌクレオチド５１０〜５２８）もまた含む：
Figure 2016516415
植物ｋｏｚａｋコンセンサス配列を有するＣＰＭＶ ＨＴ＋は、配列番号１８７中に提供される（ヌクレオチド１〜１６０、５’ＵＴＲ、１１５位において改変ＡＴＧ（ＧＴＧ）を含む、小文字の太字かつイタリック；以下を含むスタッファー断片：下線を付した不完全Ｍタンパク質、ヌクレオチド１６１〜５０９、１６２における改変ヌクレオチド（ＡＣＧ）を有する；マルチクローニング部位、イタリック、ヌクレオチド５１０〜５２８；およびコンセンサス植物ｋｏｚａｋ配列、大文字かつ太字、ヌクレオチド５２９〜５３４）。
Figure 2016516415
配列番号１８８（「ＣＰＭＶ ＨＴ＋５１１」）は、ヌクレオチド１〜１５４のＣＰＭＶ ＲＮＡ ２ゲノムのネイティブ配列のセグメントを含む。配列番号１８８のヌクレオチド１〜５１１の５’ＵＴＲ配列は、１１５位における改変「ａｔｇ」配列（「ａ」の代わりに「ｇ」；イタリックの太字）および１６２位における改変「ａｔｇ」配列（「ｔ」の代わりに「ｃ」；イタリックの太字）、ならびにヌクレオチド１６１〜５１１の不完全Ｍタンパク質（下線）を含む。ＣＰＭＶ ＨＴ＋５１１は、ネイティブＭタンパク質ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ヌクレオチド５０８〜５１１；太字）を含む：
Figure 2016516415
ＣＰＭＶ ＨＴ＋エンハンサー配列の別の非限定的な例は、配列番号１８９の配列によって提供される（ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］）。ＣＰＭＶ ＨＴ＋を含み、かつ配列番号１８９の発現エンハンサー配列と作動可能に関連した植物調節領域を含み、改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列に融合した３’末端において転写開始部位（ＡＴＧ）を含む発現カセットまたはベクターもまた、本発明の一部である。
配列番号１８９（ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］）ヌクレオチド１〜１６０、５’ＵＴＲ、１１５〜１１７位においてＡＴＧを有する、小文字の太字；以下を含むスタッファー断片：下線を付した不完全Ｍタンパク質、ヌクレオチド１６１〜５０９；１６１〜１５３位において改変ＡＴＧを有する、小文字の太字かつ下線、マルチクローニング部位、イタリック、ヌクレオチド５１０〜５２８；および植物ｋｏｚａｋ配列、大文字かつ太字、ヌクレオチド５２９〜５３４）。
Figure 2016516415
配列番号１８９の植物ｋｏｚａｋ配列は、配列番号１７４〜１８６の配列のうちの１つが含まれるがこれに限定されない任意の植物ｋｏｚａｋ配列であり得る。
「キメラタンパク質」
改変されたＨＡはさらに、キメラタンパク質であってもよい。「キメラタンパク質」もしくは「キメラポリペプチド」ともいう「キメラウイルスタンパク質」もしくは「キメラウイルスポリペプチド」または「キメラＨＡ」は、例えば、単一のポリペプチドとして融合した、２つ以上のインフルエンザ型もしくはサブタイプまたは異なる起源のインフルエンザであるがこれらに限定されない、２つまたは２つより多い供給源由来のアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドを意味する。このキメラタンパク質またはポリペプチドは、そのポリペプチドまたはタンパク質の残部と同じまたは異種のシグナルペプチドを含み得る。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、キメラヌクレオチド配列からの転写物として生成され得、合成後に、必要に応じて会合して、多量体タンパク質を形成し得る。従って、キメラタンパク質またはキメラポリペプチド（polpypeptide）は、ジスルフィド架橋を介して会合したサブユニットを含むタンパク質またはポリペプチド（即ち、多量体タンパク質）もまた含む。例えば、２つまたは２つより多い供給源由来のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドは、サブユニットへとプロセシングされ得、これらのサブユニットがジスルフィド架橋を介して会合して、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドを生成し得る。キメラＨＡタンパク質は、第１のインフルエンザウイルスの抗原性タンパク質またはその断片、ならびに膜貫通ドメインおよびサイトゾル側末端ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）を含む、第２のウイルスインフルエンザＨＡ由来の膜貫通ドメイン複合体（ＴＤＣ）もまた含み得る。このポリペプチドは改変ＨＡであり得、このポリペプチドを構成する２つまたは２つより多いアミノ酸配列の各々は、キメラＨＡ、キメラインフルエンザＨＡ、キメラ改変ＨＡまたはキメラ改変インフルエンザＨＡを生成するために、異なるＨＡから得られ得る。キメラＨＡは、タンパク質合成の後またはその間に切断される異種シグナルペプチドを含むアミノ酸配列（キメラＨＡ前タンパク質）もまた含み得る。好ましくは、このキメラポリペプチドまたはキメラインフルエンザＨＡは、天然には存在しない。キメラポリペプチドをコードする核酸は、「キメラ核酸」または「キメラヌクレオチド配列」と記載され得る。例えば、キメラ核酸は、順番に、改変タンパク質分解性ループを含む改変ＨＡ外部ドメイン、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールをコードするキメラヌクレオチド配列を含む改変ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含み得、ここで、改変ＨＡ外部ドメインは、第１のインフルエンザ株由来であり、膜貫通ドメインおよび細胞質テールは、第２のインフルエンザ株由来である。改変ＨＡ外部ドメインが第１のインフルエンザ株由来であり、膜貫通ドメインおよび細胞質テールが第２のインフルエンザ株由来であるキメラヌクレオチド酸の例は、実施例５．１４、５．１６、５．１８、５．１９、５．２１および５．２３中に与えられる。キメラＨＡから構成されるウイルス様粒子は、「キメラＶＬＰ」と記載され得る。
上記のとおり、このキメラタンパク質、キメラポリペプチドまたはキメラＨＡは、そのポリペプチドまたはタンパク質の残部と同じまたは異種のシグナルペプチドを含み得る。用語「シグナルペプチド」は、当技術分野で周知であり、特定のオルガネラに対する新たに翻訳されたポリペプチドの転位を指向し得、他に対するそのポリペプチド鎖の特異的ドメインを配置することを補助し得る、ポリペプチドのＮ末端において一般に見出される、アミノ酸の短い（約５〜３０アミノ酸の）配列を一般に指す。非限定的な例として、このシグナルペプチドは、小胞体中へのタンパク質の転位を標的化し得るおよび／または成熟タンパク質（例えば、改変ＨＡもしくはキメラ改変ＨＡ）の切断および折り畳みを補助するために新生ポリペプチドの膜アンカードメインに対して近位のＮ末端ドメインを配置することを補助し得る。
ＨＡはまた、キメラＨＡまたはキメラ改変ＨＡであり得、ここで、このＨＡまたは改変ＨＡのネイティブ膜貫通ドメインは、異種膜貫通ドメインで置き換えられている。ＨＡタンパク質の膜貫通ドメインは、高度に保存されている（例えば、国際公開第２０１０／１４８５１１号の図１Ｃを参照のこと；これは参照により本明細書に組み込まれる）。異種膜貫通ドメインは、例えば、Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＡ３３４９３．１）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ９９１９４．１）、Ｈ１／Ｂｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＤＥ２８７５０．１）、Ｈ１ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ９９１０９．１）、Ｈ１／ＮＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ３４３２４．１）、Ｈ２ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６４３６６．１）、Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＩ２６３１８．１）、Ｈ３ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＯ３７５９９．１）、Ｈ５ Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ２８１８０．１）、Ｈ５ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＲ４８８７４．１）、Ｈ５−Ｉｎｄｏ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＷ０６１０８．１）由来の膜貫通ドメインであるがこれらに限定されない任意のＨＡ膜貫通ドメインから得られ得る。膜貫通ドメインは、以下のコンセンサスアミノ酸配列によっても規定され得る：
iLXiYystvAiSslXlXXmlagXsXwmcs（配列番号９４）。
異種膜貫通ドメインを有するキメラＨＡを含む構築物の例には、以下が含まれる：構築物番号１８７５（ＣＰＭＶ−ＨＴ＋タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１ＴＭ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９によって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．１９を参照のこと）、構築物番号１９７７（ＣＰＭＶ−１６０＋タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１ＴＭ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９によって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．１４を参照のこと）、構築物番号１０６７（ＣＰＭＶ−ＨＴ タンパク質分解性ループが欠失したＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１ＴＭ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９によって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．１４を参照のこと）、構築物番号２０７４（ＣＰＭＶ ＨＴ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．１６を参照のこと）、構築物番号２０６０（ＣＰＭＶ ＨＴ１６０＋Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．１６を参照のこと）、構築物番号２０６２（ＣＰＭＶ １６０＋Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．２１を参照のこと）、構築物番号１８６０（ＣＰＭＶ ＨＴ＋Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する；実施例５．２３を参照のこと）、構築物番号１４５４（ＣＰＭＶ ＨＴ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する、実施例５．１８を参照のこと）ならびに構築物番号１８９３（ＣＰＭＶ １６０＋Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ、Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置き換えられた膜貫通ドメインおよび細胞質テールを有する）実施例５．１８を参照のこと。これらのキメラ改変ＨＡの活性は、図２６Ｂおよび２７Ｂに示される。
シグナルペプチド
シグナルペプチド（ＳＰ）は、改変ＨＡもしくはキメラ改変ＨＡにとってネイティブであってもよく、またはシグナルペプチドは、発現されている改変ＨＡの一次配列に関して異種であってもよい。改変ＨＡは、１つまたは１つより多い異なるインフルエンザ型、サブタイプまたは株由来のＨＡとバランスを取って、第１のインフルエンザ型、サブタイプまたは株由来のシグナルペプチドを含み得る。例えば、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはインフルエンザＢ型のネイティブシグナルペプチドは、植物系において改変ＨＡを発現させるために使用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＳＰは、インフルエンザＢ型、Ｈ１、Ｈ３もしくはＨ５のもの；またはサブタイプＨ１／Ｂｒｉ、Ｈ１／ＮＣ、Ｈ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ３／ＢｒｉもしくはＢ／Ｆｌｏのものであり得る。
さらに、改変ＨＡまたはキメラ改変ＨＡは、ネイティブまたは非ネイティブのシグナルペプチドを含み得る；非ネイティブシグナルペプチドは、植物起源のものであり得るか、または動物もしくは細菌のポリペプチドから得られ得る。ネイティブシグナルペプチドは、発現されているＨＡまたは改変ＨＡのシグナルペプチドに対応し得、さらに、シグナルペプチドは、インフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質または赤血球凝集素由来であり得る。使用され得るシグナルペプチドの非限定的な例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩ ＳＰ；アクセッション番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３、国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／１４８５１１号または国際公開第２０１０／００３２３５号もまた参照のこと）またはパタチンシグナルペプチド（ＰａｔＡ ＳＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ０８２１５のヌクレオチド１７３８〜１８０６に位置する）である。このアクセッション番号についてのＰａｔＡ ＳＰのヌクレオチド配列は、以下であり：
ATGGCAACTACTAAAACTTTTTTAATTTTATTTTTTATGATATTAGCAACTACTAGTTCAACATGTGCT（配列番号１７１）、
パタチンＡシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下である：
MATTKTFLILFFMILATTSSTCA（配列番号１７２）。
したがって、本発明は、ネイティブまたは非ネイティブのシグナルペプチドを含む改変ＨＡまたはキメラ改変ＨＡ、およびかかるキメラ改変ＨＡタンパク質をコードする核酸を提供する。
チャネルタンパク質との同時発現
変異体（改変）ＨＡは、改変ＨＡをコードする第１の核酸を、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸と同時発現させることによって、植物において生成され得る。この第１の核酸および第２の核酸は、同じステップで植物に導入され得るか、または連続的に植物に導入され得る。この第１の核酸および第２の核酸は、一過的な様式または安定な様式で植物において導入され得る。さらに、改変ＨＡをコードする第１の核酸を発現する植物は、第１の核酸および第２の核酸の両方がこの植物において同時発現されるように、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質（第２の核酸）で形質転換され得る。あるいは、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質（第２の核酸）を発現する植物は、第１の核酸および第２の核酸の両方がこの植物において同時発現されるように、改変ＨＡをコードする第１の核酸で形質転換され得る。さらに、改変ＨＡをコードする第１の核酸を発現する第１の植物が、改変ＨＡおよび例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をそれぞれコードする第１の核酸および第２の核酸を同時発現する後代植物を生成するために、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸を発現する第２の植物と交雑され得る。
理論に束縛されることは望まないが、ゴルジ体が含まれる、改変ＨＡを含む細胞区画のｐＨは、ＨＡの折り畳み、安定性および／またはタンパク質分解に重要であり得る。例えばインフルエンザＭ２タンパク質およびＢＭ２タンパク質などのプロトンチャネルタンパク質は、細胞区画におけるｐＨを調節し得る。例えば、Ｍ２は、インフルエンザウイルス複製の後期段階および初期段階の両方において細胞内区画を緩衝化することによって、膜融合の増強を調節する。
例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質を改変ＨＡと共に同時発現させることによって、ゴルジ体内のｐＨは増加し得、安定性の増加、分解の低減、またはそれらの組合せを生じ得、改変ＨＡおよび／またはＶＬＰの発現レベルおよび収量を増加させ得る。
改変ＨＡを、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質と共に植物において同時発現させることによって、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質の同時発現なしに改変物を発現する植物と比較した場合に、増加した収量の改変ＨＡおよび／またはＶＬＰが観察される（図１３Ａおよび図１４を参照のこと）。例えば図１３Ａに示されるように、Ｍ２の改変インフルエンザＢ ＨＡとの同時発現は、ＨＡの蓄積レベルを増加させた（図１３Ａ、１０５９対１０５９＋１２６１）。
さらに、改変インフルエンザＢ ＨＡおよびＨ３の蓄積を増加させるインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２の効力を、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２の効力と比較した。改変インフルエンザＢ ＨＡについて、比較を、構築物１０５９、１０５９＋１２６１および１０５９＋８５９で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によって行った。得られた結果は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２（構築物番号８５９によってコードされる）の同時発現が、改変されたインフルエンザＢ ＨＡ（図１４）の蓄積を増加させるのに、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２（構築物番号１２６１によってコードされる）の同時発現と同程度に効率的であったことを実証した。
本明細書中で使用する場合、用語「Ｍ２」、「Ｍ２タンパク質」、「Ｍ２配列」および「Ｍ２ドメイン」とは、任意の天然に存在するもしくは人工的に生成されたインフルエンザウイルス株もしくは単離体から単離された、またはそれらに基づいた、またはそれら中に存在する、Ｍ２タンパク質配列の全てまたは一部分を指す。従って、用語Ｍ２などは、ウイルスの生活環の間の変異によって生成されたまたは選択圧（例えば、薬物治療、宿主細胞トロピズムの拡大、または感染性など）に応答して生成された天然に存在するＭ２配列バリアント、ならびに組換えにより生成されたまたは合成により生成されたＭ２配列を含む。本発明で使用され得る配列の非限定的な例には、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２およびＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２が含まれる。
免疫応答
「免疫応答」は一般に、獲得免疫系の応答を指す。獲得免疫系は一般に、体液性応答および細胞媒介性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系譜の細胞（Ｂ細胞）において生成される分泌された抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌された抗体は、侵入性微生物（例えば、ウイルスまたは細菌）の破壊のための旗信号を出す、かかる侵入性微生物の表面上の抗原に結合する。体液性免疫は、抗体生成またはそれに付随するプロセス、ならびにＴｈ２細胞活性化およびサイトカイン生成、メモリー細胞生成、食作用のオプソニン促進、病原体排除などを含む抗体のエフェクター機能を指すために一般に使用される。用語「モジュレートする」または「モジュレーション」などは、そのうちのいくつかが本明細書中に例示される一般に公知のまたは使用されるいくつかのアッセイのいずれかによって決定されるように、特定の応答またはパラメータにおける増加または減少を指す。
細胞媒介性応答は、抗体を含まないが、抗原に応答した、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および種々のサイトカインの放出を含む、免疫応答である。細胞媒介性免疫は、ある種のＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化およびＴ細胞媒介性応答を指すために一般に使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染に応答して特に重要なものである。
例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定され得る；ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は、増殖アッセイを使用して測定され得る。抗インフルエンザ抗体力価は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量され得る；抗原特異的抗体または交差反応性抗体のアイソタイプは、抗アイソタイプ抗体（例えば、抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）を使用しても測定され得る。かかるアッセイを実施するための方法および技術は、当技術分野で周知である。
交差反応性ＨＡＩ力価は、ワクチンサブタイプに関連する他の株のウイルスに対する免疫応答の効力を実証するためにも使用され得る。例えば、第１の株のワクチン組成物（例えば、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ５／０５のＶＬＰ）で免疫した被験体由来の血清は、第２の株の全ウイルスまたはウイルス粒子（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）を用いるＨＡＩアッセイにおいて使用され得、ＨＡＩ力価が決定され得る。
サイトカインの存在またはレベルもまた、定量され得る。例えば、Ｔヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＯｐｔＥＩＡキット）を使用することにより、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４分泌細胞の測定によって特徴付けられるであろう。被験体から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または脾細胞が培養され得、上清が分析され得る。Ｔリンパ球は、マーカー特異的蛍光標識および当技術分野で公知の方法を使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によっても定量され得る。
マイクロ中和アッセイもまた、被験体における免疫応答を特徴付けるために実施され得る。例えば、Roweら、１９７３年の方法を参照のこと。ウイルス中和力価は、以下を含むいくつかの方法で得られ得る：１）細胞のクリスタルバイオレット固定／呈色後の溶解プラークの計数（プラークアッセイ）；２）培養物における細胞溶解の顕微鏡観察；３）ＮＰウイルスタンパク質のＥＬＩＳＡおよび分光光度的検出（宿主細胞のウイルス感染と相関する）。
用語「ウイルス様粒子（「virus like particle」（ＶＬＰ）または「virus-like particles」）」または「ＶＬＰ」とは、自己アセンブルし、ウイルスタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、または例えばＨＡ０タンパク質などの改変ＨＡタンパク質であって、ここでタンパク質分解ループが改変されている改変ＨＡタンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰは一般に、感染において生成されるビリオンと形態学的および抗原性的に類似しているが、複製するのに十分な遺伝子情報を欠いており、従って非感染性である。いくつかの例では、ＶＬＰは、単一のタンパク質種または１つより多いタンパク質種を含み得る。１つより多いタンパク質種を含むＶＬＰについて、これらのタンパク質種は、同じ種のウイルス由来であり得るか、または異なる種、属、亜科もしくは科のウイルス（ＩＣＴＶ命名法によって指定される）由来のタンパク質を含み得る。他の例は、ＶＬＰを含むタンパク質種のうち１つまたは複数は、天然に存在する配列から改変され得る（例えば、本明細書に記載の改変ＨＡなど）。ＶＬＰは、植物宿主細胞および昆虫宿主細胞を含む適切な宿主において生成され得る。宿主細胞からの抽出後、適切な条件下での単離およびさらなる精製の際に、ＶＬＰは、インタクトな構造として精製され得る。
さらに、ＨＡサブタイプの組合せを含むＶＬＰが生成され得る。例えば、ＶＬＰは、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、サブタイプＢ ＨＡからの１つもしくは１つより多いＨＡまたは１つもしくは１つより多い改変ＨＡ、あるいはそれらの組合せを含み得る。ＨＡまたは改変ＨＡの組合せの選択は、ＶＬＰから調製されたワクチンの意図された使用によって決定され得る。例えば、鳥類を接種するのに使用されるワクチンは、ＨＡサブタイプまたは改変ＨＡサブタイプの任意の組合せを含み得るが、ヒトを接種するのに有用なＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、サブタイプＢ ＨＡのサブタイプまたは改変サブタイプのうち１つまたは１つより多いサブタイプを含み得る。しかし、他のＨＡサブタイプまたは改変ＨＡサブタイプの組合せが、ＶＬＰの使用に依存して調製され得る。ＨＡサブタイプまたは改変ＨＡサブタイプの組合せを含むＶＬＰを生成するために、所望のＨＡサブタイプまたは改変ＨＡサブタイプが、植物細胞などの同じ細胞内で同時発現され得る。
本発明に従ってインフルエンザ由来のタンパク質から生成されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質は、ＶＬＰ調製物の汚染物質であるＲＮＡ（WakefieldおよびBrownlee、１９８９年）に結合することが公知である。ＲＮＡの存在は、ＶＬＰ製品についての規制認可を得る場合には望ましくなく、従って、ＲＮＡを欠くＶＬＰ調製物が有利であり得る。
本明細書に記載されるように生成されたＶＬＰは、典型的にはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかし、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが望まれる場合、ＮＡは、ＨＡと共に同時発現され得る。
本発明は、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質外被を得るウイルス由来のＶＬＰもまた含むが、これに限定されない。例えば、ＶＬＰが植物ベースの系で発現される場合、このＶＬＰは、細胞の原形質膜から脂質外被を得ることができる。
一般に、用語「脂質」とは、脂溶性（親油性）の天然に存在する分子を指す。この用語は、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドならびにリン脂質を含む）、ならびに他の脂溶性ステロール含有代謝物またはステロールをより具体的に指すためにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロールおよびタンパク質と共に、全ての生物膜の主要成分である。リン脂質の例には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンなどが含まれる。ステロールの例には、動物ステロール（例えば、コレステロール）および植物ステロールが含まれる。２００を超える植物ステロールが、種々の植物種において同定されており、最も一般的なものは、カンプエステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウコステロール（daunosterol）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはベータ−シトステロールである。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞の培養条件または増殖条件あるいはその細胞が得られる生物によって変動し得る。
細胞膜は一般に、脂質二重層ならびに種々の機能のためのタンパク質を含む。特定の脂質の局在化された濃縮が、脂質二重層において見出され得、「脂質ラフト」と呼ばれる。理論に束縛されることは望まないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染性要因の進入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞または生物の他の構造成分、例えば、細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックスとの相互作用において、重要な役割を有し得る。
植物では、インフルエンザＶＬＰは、原形質膜から出芽し、従って、ＶＬＰの脂質組成はその起源を反映する。本発明に従って生成されたＶＬＰは、植物由来の脂質と複合体化した、１つまたは１つより多い型またはサブタイプのインフルエンザのＨＡを含む。植物脂質は、特異的免疫細胞を刺激でき、誘発された免疫応答を増強できる。植物膜は、脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から構成され、スフィンゴ糖脂質、サポニンおよび植物ステロールもまた含む。さらに、脂質ラフトは、植物原形質膜においても見出される−これらのマイクロドメインは、スフィンゴ脂質およびステロールにおいて富化されている。植物では、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む種々の植物ステロールが存在することが公知である（Mongrandら、２００４年）。
ＰＣおよびＰＥ、ならびにスフィンゴ糖脂質は、哺乳動物免疫細胞、例えば、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに胸腺および肝臓におけるＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞によって発現されるＣＤ１分子に結合できる（Tsuji M,.２００６年）。ＣＤ１分子は、クラスＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と構造的に類似しており、その役割は、ＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）に糖脂質抗原を提示することである。活性化の際に、ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞および樹状細胞などの自然免疫細胞を活性化し、抗体生成Ｂ細胞およびＴ細胞などの獲得免疫細胞もまた活性化する。
種々の植物ステロールが原形質膜において見出され得る−特定の相補体は、いくつかの因子を命名するために、種、増殖条件、栄養素源または病原体状態に依存して変動し得る。一般に、ベータ−シトステロールは、最も豊富な植物ステロールである。
原形質膜由来の外被などの、脂質二重層と複合体化したインフルエンザＶＬＰ中に存在する植物ステロールは、有利なワクチン組成物を提供し得る。理論に束縛されることは望まないが、原形質膜由来の外被などの、脂質二重層と複合体化した、植物が生成したＶＬＰは、他の発現系で生成されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘発し得、生または弱毒化全ウイルスワクチンによって誘発される免疫反応と類似であり得る。
本明細書に記載されるとおりのＶＬＰは、植物由来の脂質二重層と複合体化され得る。いくつかの実施形態では、植物由来の脂質二重層は、ＶＬＰの外被を構成し得る。植物由来の脂質は、ＶＬＰが生成される植物の原形質膜の脂質成分を含み得、この脂質成分には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質、植物ステロールまたはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。植物由来の脂質は、代替的に「植物脂質」と呼ばれ得る。植物ステロールの例は当技術分野で公知であり、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールが含まれる−例えば、Mongrandら、２００４年を参照のこと。
ＶＬＰは、例えば、赤血球凝集アッセイ、電子顕微鏡によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて評価され得る。
サイズ排除クロマトグラフィーのために、総可溶性タンパク質は、凍結し破砕した植物材料の試料を抽出緩衝液中でホモジナイズし（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）、不溶性材料を遠心分離で除去することによって、植物組織から抽出され得る。ＰＥＧによる沈殿が使用され得る。可溶性タンパク質が定量され、抽出物を、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）であるがこれに限定されないサイズ排除マトリックスを通過させる。クロマトグラフィー後、画分は、画分のタンパク質相補体を決定するために、イムノブロットによってさらに分析され得る。
理論に束縛されることは望まないが、ＨＡが異なる動物由来のＲＢＣに結合する能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡの親和性、およびＲＢＣの表面上のこれらのシアル酸の存在によって駆動される。インフルエンザウイルス由来のウマＨＡおよびトリＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシを含むいくつかの種由来の全ての赤血球を凝集させる；一方、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット（guina pig）、ヒトおよびヒツジの赤血球に結合するであろう（Ito T.ら、１９９７年、Virology、２２７巻、４９３〜４９９頁；およびMedeiros Rら、２００１年、Virology、２８９巻、７４〜８５頁もまた参照のこと）。
発現されたウイルスタンパク質の正確な折り畳みは、他の特徴のなかでも、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、ウイルスタンパク質の機能、および抗体によるウイルスタンパク質の認識にとって重要であり得る。タンパク質の折り畳みおよび蓄積は、タンパク質の配列、タンパク質の相対的な存在量、細胞内クラウディングの程度、細胞区画中のｐＨ、折り畳まれたタンパク質、部分的に折り畳まれたタンパク質または折り畳まれていないタンパク質に結合し得るまたはこれらと一過的に会合し得る補因子の利用可能性、１つまたは複数のシャペロンタンパク質の存在などが含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数の因子によって、影響され得る。
ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、このシャペロンタンパク質は、タンパク質合成、細胞内輸送、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリ、タンパク質の折り畳み、ならびにタンパク質脱凝集を含む種々の細胞プロセスに関与し得る。かかるシャペロンタンパク質の例には、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが含まれるがこれらに限定されない（例えば、Macario, A.J.L.、Cold Spring Harbor Laboratory Res.２５巻:５９〜７０頁.１９９５年；Parsell, D.A.およびLindquist, S. Ann. Rev. Genet. ２７巻:４３７〜４９６頁（１９９３年）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照のこと）。本明細書中に記載するように、例えばＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０であるがこれらに限定されないシャペロンタンパク質は、ウイルスタンパク質の折り畳みを確実にするために使用され得る。
Ｈｓｐ７０の例には、哺乳動物細胞由来のＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓなどのマイコバクテリア由来のＤｎａＫ（例えば、カルメット・ゲラン桿菌：本明細書中でＨｓｐ７ｌと呼ばれる）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母および他の原核生物由来のＤｎａＫ、ならびにＡ．ｔｈａｌｉａｎａなどの真核生物由来のＢｉＰおよびＧｒｐ７８が含まれる（Linら ２００１年(Cell Stress and Chaperones ６巻:２０１〜２０８頁）。Ｈｓｐ７０の特定の例は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｈｓｐ７０（Ｇｅｎｂａｎｋ参照：ＡＹ１２０７４７．１によってコードされる）である。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰならびに折り畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに特異的に結合することが可能であり、それによってタンパク質の折り畳みおよび折り畳みなし、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリに関与する。
Ｈｓｐ４０の例には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアなどの原核生物由来のＤｎａＪ、ならびにアルファルファなどの真核生物由来のＨＳＪ１、ＨＤＪｌおよびＨｓｐ４０が含まれる（Frugisら、１９９９年. Plant Molecular Biology ４０巻:３９７〜４０８頁）。Ｈｓｐ４０の特定の例は、Ｍ．ｓａｔｉｖａ ＭｓＪ１（Ｇｅｎｂａｎｋ参照：ＡＪ０００９９５．１）である。Ｈｓｐ４０は、他の細胞活性の中でも、タンパク質折り畳み、熱耐性およびＤＮＡ複製において分子シャペロンとしての役割を果たす。
Ｈｓｐｓ、Ｈｓｐ７０およびそのコシャペロンのうち、Ｈｓｐ４０は、合成が完了する前の、翻訳中のポリペプチドおよび新たに合成されたポリペプチドの安定化に関与する。理論に束縛されることは望まないが、Ｈｓｐ４０は、折り畳まれていない（新生のまたは新たに移行された）ポリペプチドの疎水性パッチに結合し、従って、Ｈｓｐ７０−ＡＴＰ複合体とこのポリペプチドとの相互作用を促進する。ＡＴＰ加水分解は、ポリペプチドとＨｓｐ７０とＡＤＰとの間の安定な複合体の形成、およびＨｓｐ４０の放出を導く。Ｈｓｐ７０−ＡＤＰ複合体とポリペプチドの疎水性パッチとの会合は、それらが他の疎水性パッチと相互作用することを防止し、不正確な折り畳みおよび他のタンパク質との凝集体の形成を防止する（Hartl, FU. １９９６年. Nature ３８１巻:５７１〜５７９頁に概説される）。
ネイティブのシャペロンタンパク質は、低いレベルの組換えタンパク質の正確な折り畳みを促進できる可能性があるが、発現レベルが増加するにつれ、ネイティブシャペロンの存在量は制限因子となり得る。アグロ浸潤した葉におけるウイルスタンパク質の高いレベルの発現は、サイトゾルにおけるウイルスタンパク質の蓄積を導き得、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０またはＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０の両方などの１つまたは１つより多いシャペロンタンパク質の同時発現は、誤って折り畳まれたまたは凝集したタンパク質のレベルを低減させ得、ウイルス様粒子の形成を可能にする三次構造上および四次構造上の特徴を示すタンパク質の数を増加させ得る。
従って、本発明は、ウイルスタンパク質をコードする第１の核酸が、例えばプロトンチャネルタンパク質であるがこれに限定されないチャネルタンパク質をコードする第２の核酸、およびシャペロンをコードする第３の核酸と共に同時発現される、植物においてウイルスタンパク質ＶＬＰを生成する方法もまた提供する。第１、第２および第３の核酸は、同じステップで植物に導入され得るか、または連続的に植物に導入され得る。
植物内で生成されたＶＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含むウイルスタンパク質を誘発し得る。従って、本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンを有するウイルスタンパク質を含むＶＬＰを提供する。
さらに、植物におけるＮ−グリカンの改変は公知であり（例えば、国際公開第２００８／１５１４４０号；国際公開第２０１０／００６４５２号；または米国仮出願第６０／９４４，３４４号を参照のこと；これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）、改変されたＮ−グリカンを有するウイルスタンパク質が生成され得る。例えば、フコシル化された、キシロシル化されたまたはフコシル化されかつキシロシル化されたＮ−グリカンが低減した、改変されたグリコシル化パターンを含むウイルスタンパク質が得られ得るか、あるいは、フコシル化、キシロシル化またはそれら両方を欠き、かつ増加したガラクトシル化（galatosylation）を含む、改変されたグリコシル化パターンを有するウイルスタンパク質が得られ得る。さらに、翻訳後修飾のモジュレーション、例えば、末端ガラクトースの付加は、ウイルスタンパク質を発現する野生型植物と比較した場合、発現されたウイルスタンパク質のフコシル化およびキシロシル化の低減を生じ得る。
例えば、限定とみなすべきでないが、改変されたグリコシル化パターンを有するウイルスタンパク質の合成は、例えば哺乳動物ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴであるがこれらに限定されないベータ−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードするヌクレオチド配列と共に対象のタンパク質を同時発現させることによって達成され得るが、別の供給源由来のＧａｌＴもまた使用され得る。ＧａｌＴの触媒ドメインはまた、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を生成するために、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１）のＣＴＳドメイン（即ち、細胞質テール、膜貫通ドメイン、ステム領域）に融合され得、このハイブリッド酵素が、ウイルスタンパク質と共に同時発現され得る。このウイルスタンパク質はまた、例えば哺乳動物ＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩであるがこれに限定されないＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（N-acetylglucosaminyltrasnferase）ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列と共に同時発現され得、他の供給源由来のＧｎＴ−ＩＩＩもまた使用され得る。さらに、ＧｎＴ−ＩＩＩに融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素もまた使用され得る。
従って、本発明は、改変されたＮ−グリカンを有する１つまたは複数のウイルスタンパク質を含むＶＬＰもまた含む。
改変ＨＡを生成するために本発明で使用され得る配列の非限定的な例には、国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号；国際公開第２０１０／００３２２５号；国際公開第２０１０／１４８５１１号；国際公開第２０１０／００３２３５号；国際公開第２０１０／００６４５２号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）中に記載されるものもまた含まれ、例えば以下であるがこれらに限定されない：
例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）株由来の核酸分子によってコードされるＨ１タンパク質；
この核酸分子によってコードされるＨ２タンパク質は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ３タンパク質は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）由来であり得る；
核酸分子によってコードされるＨ５タンパク質は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来であり得る。
この核酸分子によってコードされるＨ６タンパク質は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ７タンパク質はまた、Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／１３（Ｈ７Ｎ９）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）株由来であり得る；
この核酸分子によってコードされるＨ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株由来であり得る；
この核酸によってコードされるＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／１２、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８株由来であり得る。
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（実施例１）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍトランスフェクション
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＡＧＬ１を、D’Aoustら２００８年（Plant Biotechnology Journal ６巻:９３０〜９４０頁）に記載される方法を使用して、ＤＮＡ構築物を用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトしたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地中で、０．６と１．６との間のＯＤ６００まで増殖させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁物を、使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）中で再懸濁した。
植物バイオマス、接種材料およびアグロ浸潤の準備
用語「バイオマス」および「植物物質」は、本明細書中で使用する場合、植物から誘導された任意の材料を反映する意味である。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、組織、細胞またはそれらの任意の画分を含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せ由来の、植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはそれらの組合せを含み得る。植物の一部分は、植物物質またはバイオマスを含み得る。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、市販のピートモス基材を満たした苗用木箱において種子から成長させた。これらの植物を、１６／８の光周期および２５℃日中／２０℃夜間の温度体制の下で温室中で成長させた。播種の３週間後、個々の小植物を取り上げ、植木鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間温室中で成長させた。
各構築物でトランスフェクトしたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを、１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地中で、それらが０．６と１．６との間のＯＤ６００に達するまで増殖させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁物を、使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。浸潤の日に、培養物バッチを２．５培養容量中に希釈し、使用前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの減圧下で、２分間にわたって気密ステンレス鋼タンク中で細菌懸濁物中に逆さまに置いた。植物を、収穫まで２〜６日間のインキュベーション期間にわたり、温室に戻した。
葉の収穫および総タンパク質抽出
インキュベーション後、植物の大気中の部分を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕してかけらにした。総可溶性タンパク質を、３容量の冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル中で、凍結し破砕した植物材料の各試料をホモジナイズすることによって（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）抽出した。ホモジナイゼーション後、スラリーを１０，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離し、これらの清澄化した粗製抽出物（上清）を分析のために維持した。
タンパク質分析およびイムノブロッティング
清澄化した粗製抽出物の総タンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを参照標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニリデンジフルオライド（polyvinylene difluoride）（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電気泳動転写した。イムノブロッティングの前に、これらのメンブレンを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中５％のスキムミルクおよび０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で、４℃で１６〜１８時間ブロッキングした。
イムノブロッティングを、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中２％のスキムミルク中２μｇ／ｍｌの一次抗体（表４は、各ＨＡの検出のために使用した抗体および条件を示す）との第１のインキュベーションを用いて実施した。化学発光検出に使用した二次抗体は、表４に示すとおりであり、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中２％のスキムミルク中に、示したように希釈した。免疫反応性複合体を、基質としてルミノール（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して化学発光によって検出した。ヒトＩｇＧ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素コンジュゲート化を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅコンジュゲーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して実施した。
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赤血球凝集アッセイ
赤血球凝集アッセイは、NayakおよびReichl（２００４年）に記載された方法に基づい
た。簡潔に述べると、試験試料（１００μＬ）の段階二重希釈を、１００μＬ ＰＢＳを含むＶ底９６ウェルマイクロタイタープレート中で作製し、１ウェル当たり１００μＬの希釈された試料にした。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁物（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ）を各ウェルに添加し、室温で２時間プレートをインキュベートした。完全赤血球凝集を示す最も高い希釈の逆数を、ＨＡ活性として記録した。並行して、組換えＨＡ標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）をＰＢＳ中に希釈し、各プレートに対する対照として実施した。
細胞壁消化によるＶＬＰ抽出
葉組織を、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物から収集し、約１ｃｍ２のかけらへと切断した。葉片を、室温（ＲＴ）で３０分間、５００ｍＭマンニトール中に浸した。次いで、マンニトール溶液を除去し、プロトプラスト化溶液（５００ｍＭマンニトール、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および５ｍＭ ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ５．６））中の酵素ミックス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来のセルラーゼの混合物（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０；３％ｖ／ｖ）およびＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のペクチナーゼの混合物（ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥ（商標）；０．７５％ｖ／ｖ；共にＹａｋｕｌｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製）と交換した。使用した比率は、溶液１００ｍＬ当たり２０ｇの葉片であった。この調製物を、浅い容器（約１１×１８ｃｍ）中に均等に広げ、４０ｒｐｍおよび２６℃でロータリーシェーカー上で１６時間インキュベートした。
あるいは、ＶＬＰ抽出は、以下のように実施され得る：植物を、ＡＧＬ１／番号４８９、９２８、６７６および７６６でアグロ浸潤させた。葉組織を、浸潤の７日後にＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物から収集し、約１ｃｍ２片へと切断した。Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ １６２Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ ＣＧおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を、２００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％亜硫酸水素ナトリウムｐＨ６．０緩衝液；消化緩衝液に添加した。バイオマスをオービタルシェーカーにおいて室温で一晩、２連で消化した。
酵素補助された抽出の後、葉の残骸を、濾過によって除去した（２５０μｍまたは４００μｍメッシュのナイロンフィルター）。粗濾過した抽出物を、５０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を、ＨＡ発現の検出（赤血球凝集活性（図２０を参照のこと）およびウエスタンブロッティング（図２２を参照のこと）に供した。
（実施例２）
ＨＡの蓄積に対する改変タンパク質分解性ループの影響
図１３Ａに示されるように、ネイティブＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号１００８）の発現は、改変タンパク質分解性ループを含むＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号１０５９）の発現よりも低かった。ネイティブＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ ＨＡ（構築物番号１００８；図１３Ｂ）と比較した場合に増加した赤血球凝集活性もまた、改変タンパク質分解性ループを含むＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号１０５９）で観察された。
類似の結果が、ネイティブＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＨＡ（構築物番号１４６２；図１６Ａ）について観察された蓄積レベルよりも高い、改変タンパク質分解性ループを含むＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（構築物番号１４６７）の蓄積レベルにおいて観察された。ネイティブＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＨＡ（構築物番号１４６２；図１６Ｂ）と比較した場合に増加した赤血球凝集活性もまた、改変タンパク質分解性ループを含むＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（構築物番号１４６７）で観察され、これは、変異体タンパク質についてより高い蓄積を示す。
改変タンパク質分解性ループを含むＨ５／Ｉｎｄｏの発現もまた、ＧＧリンカー（構築物番号９２８；配列番号８５）、ＴＥＴＲリンカー（構築物番号６７６；配列番号７７）またはＴＥＴＱリンカー（構築物番号７６６；配列番号８；図２２）を含むタンパク質分解性ループを含む改変で観察された。
ＨＡの蓄積レベルに対するインフルエンザＭ２同時発現の影響
Ｍ２の同時発現を、改変インフルエンザＢ ＨＡの蓄積レベルに対するその影響について評価した。構築物番号１０５９は、タンパク質分解性ループが２アミノ酸リンカーによって置き換えられた（ａａ３４１〜３５９の代わりにＧＧ）インフルエンザＢ ＨＡをコードする。図１３Ａに示されるウエスタンブロット分析からの結果は、タンパク質分解性ループの除去が増加したインフルエンザＢ ＨＡ蓄積レベルを生じたこと（１００８を１０５９と比較する）、およびＭ２の、改変インフルエンザＢ ＨＡとの同時発現もまたＨＡ蓄積レベルを増加させたこと（図１３Ａ、１０５９対１０５９＋１２６１）を示している。改変ありまたはなしの、Ｍ２の同時発現ありまたはなしの、インフルエンザＢ ＨＡで形質転換した植物由来の粗製タンパク質抽出物に対する赤血球凝集活性の分析により、ネイティブインフルエンザＢ ＨＡ（図１３Ｂ、１００８対１００８＋１２６１）および改変インフルエンザＢ ＨＡ（図１３Ｂ、１０５９対１０５９＋１２６１）の蓄積レベルに対するＭ２同時発現の陽性効果が確認された。
Ｍ２の、改変タンパク質分解性ループを含むＡ型ＨＡとの同時発現もまた、ＨＡ発現を生じた。例えば、ＧＳリンカーまたは（ＧＳＳ）３リンカー（図２１Ｅ、２１Ｆを参照のこと）によってタンパク質分解性ループが置き換えられた改変Ｈ３の、Ｍ２との同時発現もまた、植物におけるＨＡ蓄積を生じ得る。
改変インフルエンザＢ ＨＡおよびＨ３の蓄積を増加させるインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２の効力を、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２の効力と比較した。改変インフルエンザＢ ＨＡについて、比較を、構築物１０５９、１０５９＋１２６１および１０５９＋８５９で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によって行った。得られた結果により、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＭ２（構築物番号８５９によってコードされる）の同時発現が、改変インフルエンザＢ ＨＡの蓄積を増加させることに関して、インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来のＭ２（構築物番号１２６１によってコードされる）の同時発現と同等に効率的であったことが実証された（図１４）。
異なる株のＢ ＨＡの蓄積レベルに対するインフルエンザＭ２同時発現の影響
Ｍ２発現構築物（構築物番号１２６１）の存在下または非存在下での、インフルエンザＢ ＨＡ（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来）の発現を駆動する遺伝子構築物（構築物番号１４６２）で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、Ｍ２の同時発現がインフルエンザＢ ＨＡの増加した蓄積を生じることが示された（図１６Ａ）。
Ｍ２の同時発現もまた、改変されたインフルエンザＢ ＨＡの蓄積レベルに対するその影響について評価した。構築物番号１４６７は、そのタンパク質分解性ループが２アミノ酸のリンカーによって置き換えられた（ａａ３４１〜３５９の代わりにＧＧ）インフルエンザＢ ＨＡをコードする。図１６Ａに示されるウエスタンブロット分析からの結果は、タンパク質分解性ループの除去が増加したインフルエンザＢ ＨＡ蓄積レベルを生じたこと（１４６２を１４６７と比較されたい）、およびＭ２と改変されたインフルエンザＢ ＨＡとの同時発現がＨＡ蓄積レベルをまた増加させたこと（図１６Ａ、１４６７対１４６７＋１２６１）を示す。改変ありまたはなし、およびＭ２の同時発現ありまたはなしでの、インフルエンザＢ ＨＡで形質転換した植物由来の粗製タンパク質抽出物に対する赤血球凝集活性の分析により、ネイティブインフルエンザＢ ＨＡ（図１６Ｂ、１４６２対１４６２＋１２６１）および改変されたインフルエンザＢ ＨＡ（図１６Ｂ、１４６７対１４６７＋１２６１）の蓄積レベルに対する、Ｍ２同時発現の陽性効果が確認された。
ＨＡの蓄積に対する増幅エレメントＢｅＹＤＶおよび改変タンパク質分解性ループの影響
タンパク質分解性ループが除去されたまたは除去されていない（構築物については図１７Ａを参照のこと）、増幅エレメントＢｅＹＤＶの存在下または非存在下（構築物番号１０５９および１０３９）での、改変インフルエンザＢ ＨＡ（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来）の発現を駆動する遺伝子構築物で形質転換した植物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ＢｅＹＤＶの非存在下で、調節エレメントがＣＰＭＶ−ＨＴであった場合、インフルエンザＢ ＨＡの蓄積が検出できなかったこと（図１７Ｂ）が示された。
相対的ＨＡ力価および赤血球凝集に対する改変タンパク質分解性ループの影響
図２９Ａを参照すると、タンパク質分解性ループが欠失した改変ＨＡ（ＧＧリンカーで置き換えられている）またはネイティブＨＡのいずれかをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結したＣＰＭＶ ＨＴ、ＣＰＭＶ ＨＴ＋、ＣＰＭＶ １６０またはＣＰＭＶ１６０＋ベースのエンハンサーエレメントを含む、植物において生成された改変ＨＡタンパク質の活性の比較が示されている。ほとんどの場合、発現（赤血球凝集力価または活性として決定される）は、ＣＰＭＶ ＨＴ＋、ＣＰＭＶ １６０またはＣＰＭＶ１６０＋ベースの構築物についてより高く、顕著な発現レベルを実証している。
Figure 2016516415
（実施例３）
タンパク質分解性ループが除去される場合（ＰｒＬ−）、ネイティブ構築物と比較して増加したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＨＡ ＶＬＰ収量
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、ＡＧＬ１／番号２１４２＋１２６１および番号２１５２＋１２６１で浸潤させ、葉を、７日間のインキュベーション期間後に収穫した。葉組織を収集し、約１ｃｍ２の片に切断した。Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ １６２ＬおよびＰｅｃｔｉｎａｓｅ ４４４Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ ＣＧおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を、２００ｍＭマンニトール、１２５ｍＭクエン酸塩、０．０４％亜硫酸水素ナトリウムｐＨ６．０緩衝液に添加した。バイオマスを、オービタルシェーカー中で室温で一晩消化した。
消化後、アポプラスト画分を、４００μｍナイロンフィルターを通して濾過して、未消化の植物性組織（出発バイオマスの＜５％）を粗除去した。次いで、濾過した抽出物を、５０００×ｇで１５分間室温で遠心分離して、プロトプラストおよび細胞内夾雑物（タンパク質、ＤＮＡ、膜、小胞、色素など）を除去した。次に、上清を、１．２μｍグラスファイバーフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ＧＦ ｐｌｕｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）および０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を使用して深層濾過し（清澄化のため）、その後クロマトグラフィーに供した。
清澄化したアポプラスト画分を、平衡化／溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６．０）で平衡化したカチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ ＨＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードした。ＵＶをゼロに戻したところで、抽出物を、漸増する濃度のＮａＣｌ（５００ｍＭ）を含有する平衡化／溶出緩衝液で段階的に溶出した。精製したＶＬＰを、ＴＦＦによって濃縮し、製剤緩衝液（１００ｍＭ ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７．４）に対して透析し、０．２２μｍフィルターを通過させた。
Ｈ７についての赤血球凝集アッセイを、NayakおよびReichl（２００４年）によって記載された方法に基づいて実施した。簡潔に述べると、試験試料（１００μＬ）の連続二重希釈を、１００μＬ ＰＢＳを含有するＶ底９６ウェルマイクロタイタープレート中で行い、１ウェル当たり１００μＬの希釈試料を残した。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁物（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全な赤血球凝集を示す最も高い希釈の逆数を、赤血球凝集活性として記録した。
清澄化した粗製抽出物の総タンパク質含量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。相対的収量を、ＰｒＬ−構築物を対照として使用してネイティブ構築物と比較することによって得た。変性試料ローディング緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、０．０５％ブロモフェノールブルー、１２．５％グリセロール、４％ ＳＤＳおよび５％ベータ−メルカプトエタノール）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を、還元条件下で実施し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０を、タンパク質染色に使用した。
図４６Ａは、植物抽出物における赤血球凝集活性が、ネイティブ構築物（番号２１４２＋番号１２６１、実施例５．３３を参照のこと）と比較して、タンパク質分解性ループが除去されたＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ構築物（番号２１５２＋番号１２６１、実施例５．３４を参照のこと）についてより高いことを示している。
図４６Ｂは、精製されたＶＬＰにおける相対的総タンパク質収量が、ネイティブ構築物（番号２１４２＋番号１２６１）と比較して、タンパク質分解性ループが除去されたＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ構築物（番号２１５２＋番号１２６１）についてより高いことを示している。この実施例は、完全なプロセスを実施した場合に、植物において蓄積したＶＬＰにおける改善対最終収量の間の良好な相関を実証している。
図４６Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン２は、精製された、タンパク質分解性ループが除去されたＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ構築物を示し、レーン３は、精製されたネイティブＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ構築物を示す。各レーンについて、２μｇの総タンパク質を、ゲル上にロードした。タンパク質プロファイルの純度は、両方の構築物について類似であり、９０％よりも高い。
（実施例４．１）
タンパク質分解性ループが改変または除去された場合の変異体Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰのトリプシン耐性は、ネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａよりも高い。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、実施例１（上記）に記載されるように、ＡＧＬ１／番号４８９、番号９２８、番号７６６および番号６７６でアグロ浸潤させた。葉を、浸潤の７日後に植物から収集し、約１ｃｍ２の片へと切断した。Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ １６２Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ ＣＧおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を、２００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％亜硫酸水素ナトリウムｐＨ６．０緩衝液に添加した。バイオマスを、オービタルシェーカー中で室温で一晩消化した。消化した抽出物を、実施例３（Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ）に記載したように、粗濾過し、遠心分離し、清澄化し、精製した。
ネイティブ（番号４８９）、ＰＲＬ−（番号９２８）、ＴＥＴＱ（番号７６６）およびＴＥＴＲ（番号６７６）のＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＨＡ ＶＬＰ抽出物の各々について、ＨＡ ＶＬＰの２つの試料を、ｐＨ７．４で緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ／ＫＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴＷＥＥＮ ８０）中に再懸濁した。トリプシンを、１：１００のタンパク質比で添加した。試料を、室温での３０分間、６０分間および１２０分間のインキュベーション後に取り、次いで、試料ローディング緩衝液中で煮沸して反応を停止させた。非消化抽出物（対照）およびトリプシン消化抽出物を、実施例３に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析した。
図４７Ａは、トリプシン消化試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン２〜５は、消化における異なる時点（０、３０、６０および１２０分）における、ネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰ（番号４８９）を示し、レーン６〜９は、ＰｒＬ−Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰ（番号９２８）を示し、レーン１０〜１３は、ＴＥＴＱ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰ（番号７６６）を示し、レーン１４〜１７は、ＴＥＴＲ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰ（番号６７６）を示す。レーン２の非消化抽出物においておよそ７５ｋＤａにおいて検出可能なＨＡ０一量体に対応するバンドを有するネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＰＬは、トリプシンの添加によって、レーン３〜５においてトリプシン消化の間にそれぞれおよそ５０ｋＤａおよび２５ｋＤａにおいて検出可能なＨＡ１およびＨＡ２のバンドへと迅速にプロセシングされた。ＨＡ０バンドが、ＨＡ１およびＨＡ２のバンドへと切断しなかったので、タンパク質分解性部位の除去または改変によって安定化されたＰｒＬ−Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰおよびＴＥＴＱ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰの両方が、トリプシン耐性を示した。ＴＥＴＲ Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰは、タンパク質分解性部位の改変によって部分的に安定化され、ＨＡ０一量体は、ネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰよりも緩徐に、ＨＡ１およびＨＡ２へと切断された。
これらのデータは、タンパク質分解性ループを欠失させること（ｐｒｌ−）またはタンパク質分解性ループをリンカー配列（ＴＥＴＱ）アプローチで置き換えることのいずれかによって、ＨＡ１−ＨＡ２内のそのタンパク質分解性部位におけるＨＡ０タンパク質の首尾よい保護を実証している。
（実施例４．２）
ネイティブＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰの免疫原性は、マウスにおけるその変異体対応物（ＰｒＬ−、ＴＥＴＱおよびＴＥＴＲ）と類似している。
ネイティブ、ＰｒＬ−、ＴＥＴＲおよびＴＥＴＱのＨ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＶＬＰ抽出物を、実施例４．１（上記）に記載されるように精製した。
図４７Ｂは、２用量後の、マウスにおけるネイティブＨ５ ＶＬＰおよびその変異体対応物（ｐｒｌ−、ＴＥＴＱおよびＴＥＴＲ）の免疫原性（ＨＩ力価）を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８／群）に、１０ｕｇ用量の植物ベースのＨ５ ＶＬＰワクチン（ネイティブ、ｐｒｌ−、ＴＥＴＱまたはＴＥＴＲ）を、そのＨＡ含量に基づいて、２１日離して筋内で２回注射した。ＨＩ力価分析を、各動物の血清から、４２ｄｐｖ（２回目の用量の２１日後）に実施し、Ｈ５ ＶＬＰ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）を抗原として使用した。バーは、各Ｈ５変異体ＶＬＰのＨ５ ＶＬＰネイティブとの相対的（％）ＨＩ力価比較を示す（ｌｏｇ２のＨＩ力価ＧＭＴおよび９５％ＣＩで計算した）。各用量についての群間の統計的差異を、一元ＡＮＯＶＡと、その後のＬｏｇ２変形したデータに対するＴｕｋｅｙの事後分析（それらの通常の分布を前提とする）を使用することによって比較した。＊ｐ＜０．０５を有意とみなした。各用量について群間の差異は観察されなかった。
（実施例５．１）
Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１２６１）
インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。完全Ｍ２コード配列を含む断片を、合成されたＭ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ５０８８６０由来のｎｔ７１５〜９８２に接続されたｎｔ１〜２６に対応する；図２Ｃ、配列番号９）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（図２Ａ、配列番号７）およびＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（図２Ｂ、配列番号８）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系においてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｃ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号１２６１を与えた（図２Ｄ、配列番号１０）。インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列を図２Ｅに示す（配列番号１１）。プラスミド１２６１の表示を図１１に示す。
（実施例５．２）
Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｍ２ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／ＮＯＳ（構築物番号８５９）
インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。完全Ｍ２コード配列を含む断片を、合成されたＭ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ４６７８２４由来のｎｔ７４０〜１００７に接続されたｎｔ２６〜５１に対応する）（図３Ａ、配列番号１２）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ１−Ｍ１＋Ｍ２ＡＮＣ．ｃ（図２Ａ、配列番号７）およびＩＦ−Ｓ１−４−Ｍ２ＡＮＣ．ｒ（図２Ｂ、配列番号８）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系においてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｃ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。ベクターはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号８５９を与えた（図３Ｂ、配列番号１３）。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ２のアミノ酸配列を図３Ｃに示す（配列番号１４）。プラスミド８５９の表示を図１７に示す。
（実施例５．３）
ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１００８）
構築物１００８の調製は、米国仮出願第６１／５４１，７８０号に記載されている。簡潔に述べると、インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）を使用するＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中のＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲ産物を、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームで、ＢｅＹＤＶ増幅系中へとクローニングした。構築物１１９４（図４Ａ、４Ｂを参照のこと）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをアセンブリ反応に使用して、構築物番号１００８を生成した（図４Ｃ、図９；配列番号３２）。
構築物番号１１９４（図４Ａ）は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームで、ＢｅＹＤＶ増幅系中への対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた取り込む。骨格は、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドである。
（実施例５．４）
ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系中へのＩ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ−タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号１０５９）
構築物１０５９の調製は、米国仮出願第６１／５４１，７８０号に記載されている。簡潔に述べると、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、ＰＣＲベースのライゲーション方法（Darveauら、１９９５年、Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁）を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中のＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ４６〜ｎｔ１０６５のＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）を鋳型として使用して増幅した。ｎｔ１１２３〜ｎｔ１７５８のＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含有する第２の断片を、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）を鋳型として使用して増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、第２のラウンドの増幅のための鋳型として使用した。得られた断片（断片間にＧＧリンカーを有するＨＡ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ Δａ．ａ．３５６〜３７４をコードする；図２１Ｂを参照のこと）を、ＢｅＹＤＶ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングして、構築物１１９４を生成した（図４Ａ、４Ｂ）。これを、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをアセンブリ反応に使用した。得られた構築物に番号１０５９を与えた（図５Ｃ、配列番号４０）。
ＰＤＩＳＰ−タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のアミノ酸配列を、図５Ｄに示す（配列番号４１）。
（実施例５．５）
ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／ＮＯＳ（構築物番号１４６２）
構築物１４６２の調製は、米国仮出願第６１／５４１，７８０号に記載されている。簡潔に述べると、インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡをコードする配列を、ＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中のＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。完全ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎコード配列を含有する断片を、合成されたＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）を鋳型として使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにおいてＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系中にクローニングした。構築物１９３（図６Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをアセンブリ反応に使用した。
構築物番号１９３（図６Ｄ、図６Ｅ）は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系への、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図６Ｅに示す（配列番号５２）。得られた構築物に番号１４６２を与えた（図６Ｆ、配列番号５３）。ＰＤＩＳＰ／インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列を、図６Ｇに示す（配列番号５４）。プラスミド１４６２の表示を、図６Ｈに示す。
（実施例５．６）
ＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系中へのＣ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（構築物番号１４６７）
構築物１４６７の調製は、米国仮出願第６１／５４１，７８０号に記載されている。簡潔に述べると、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡをコードする配列を、ＰＣＲベースのライゲーション方法（Darveauら、１９９５年、Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁）を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中のＢｅＹＤＶ（ｍ）＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ１〜ｎｔ１０６２のＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎコード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（図６Ａ、配列番号４９）およびＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｒ（図７Ａ、配列番号５５）を使用し、合成されたＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）（図６Ｃ、配列番号５１）を鋳型として使用して、増幅した。ｎｔ１１２０〜ｎｔ１７５５のＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎコード配列を含有する第２の断片を、プライマーＨＡＢ１１０（ＰｒＬ−）．ｃ（図７Ｂ、配列番号５６）およびＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（図６Ｂ、配列番号５０）を使用し、合成されたＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＮ９９３０１０）（図６Ｃ、配列番号５１）を鋳型として使用して、増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ＨＡＢ１１０．Ｓ１＋３ｃ（図６Ａ、配列番号４９）およびＩＦ−ＨＡＢ１１０．ｓ１−４ｒ（図６Ｂ、配列番号５０）をプライマーとして使用する第２のラウンドの増幅のために鋳型として使用した。得られた断片（断片間にＧＧリンカーを有するＨＡ Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０ Δａ．ａ．３４０〜３５８をコードする）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにおいてクローニングした。構築物１９３（図６Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。
構築物番号１９３は、ＢｅＹＤＶ（ｍ）増幅系への、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図６Ｅに示す（配列番号５２）。得られた構築物に番号１４６７を与えた（図７Ｃ、配列番号５７）。タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡのアミノ酸配列を、図７Ｄに示す（配列番号５８）。プラスミド１４６７の表示を、図７Ｅに示す。
（実施例５．７）
Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ−タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号１０３９）
構築物１１９２の調製は、米国仮出願第６１／５４１，７８０号に記載されている。簡潔に述べると、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、以下のＰＣＲベースのライゲーション方法（Darveauら、１９９５年、Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁）を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ４６〜ｎｔ１０６５のＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）を鋳型として使用して増幅した。ｎｔ１１２３〜ｎｔ１７５８のＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含有する第２の断片を、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）を鋳型として使用して増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、第２のラウンドの増幅のために鋳型として使用した。得られた断片（断片間にＧＧリンカーを有するＨＡ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ Δａ．ａ．３５６〜３７４をコードする）を、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。
構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドである。得られた構築物に番号１０３９を与えた（図８Ｂ）。タンパク質分解ループが欠失したＰＤＩＳＰ−ＨＡ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のアミノ酸配列を図５Ｄに示す（配列番号４１）。プラスミド１０３９の表示を図８Ａ（配列番号１５）に示す。
（実施例５．８）
Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号６７６）
ＴＥＴＲ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５をコードする配列を、以下のＰＣＲベースのライゲーション方法（Darveauら、１９９５年、Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁）を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ１〜ｎｔ１０１５のＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５コード配列由来のＨ５を含有する断片を、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＭｕｔＣｌｅａｖａｇｅ−Ｈ５（Ｉｎｄｏ）．ｒ（図２３Ａ、配列番号７４）を使用し、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の合成されたＨ５（図１Ｇ、配列番号４２）を鋳型として使用して、増幅した。ｎｔ１０３８〜ｎｔ１７０７のＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５コード配列由来のＨ５を含有する第２の断片を、プライマーＭｕｔＣｌｅａｖａｇｅ−Ｈ５（Ｉｎｄｏ）．ｃ（図２３Ｂ、配列番号７５）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）を使用し、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の合成されたＨ５（図１Ｇ、配列番号４２）を鋳型として使用して、増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）をプライマーとして使用する第２のラウンドの増幅のために鋳型として使用した。得られた断片（断片間にＴＥＴＲリンカーを有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Δａ．ａ．３３９〜３４６由来のＨ５をコードする）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにおいてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットとインフレームでの対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号６７６を与えた（図２３Ｃ、配列番号７６）。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ ＴＥＴＲ切断部位変異体由来のＨ５のアミノ酸配列を、図２３Ｄに示す（配列番号７７）。プラスミド６７６の模式的表示を、図２３Ｅに示す。
（実施例５．９）
Ｂ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号７６６）
ＴＥＴＱ切断部位変異を有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５をコードする配列を、以下のＰＣＲベースのライゲーション方法（Darveauら、１９９５年、Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁）を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ１〜ｎｔ１０１５のＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５コード配列由来のＨ５を含有する断片を、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＨ５Ｉ５０５＿ＴＥＴＱ．ｒ（図２４Ａ、配列番号７８）を使用し、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の合成されたＨ５（図１Ｇ、配列番号４２）を鋳型として使用して、増幅した。ｎｔ１０３８〜ｎｔ１７０７のＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５コード配列由来のＨ５を含有する第２の断片を、プライマーＨ５Ｉ５０５＿ＴＥＴＱ．ｃ（図２４Ｂ、配列番号７９）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）を使用し、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の合成されたＨ５（図１Ｇ、配列番号４２）を鋳型として使用して、増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）をプライマーとして使用する第２のラウンドの増幅のために鋳型として使用した。得られた断片（断片間にＴＥＴＱリンカーを有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Δａ．ａ．３３９〜３４６由来のＨ５をコードする）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにおいてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットとインフレームでの対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号７６６を与えた（図２４Ｃ、配列番号８０）。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ ＴＥＴＱ切断部位変異体由来のＨ５のアミノ酸配列を、図２４Ｄに示す（配列番号８１）。プラスミド７６６の模式的表示を、図２４Ｅに示す。
（実施例５．１０）
Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（構築物番号９２８）
タンパク質分解性ループが欠失したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５をコードする配列を、Darveauら（Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））によって示された以下のＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ１〜ｎｔ１０１１のＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５コード配列由来のＨ５を含有する断片を、プライマーＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＨ５Ｉ５０５（ＰｒＬ−）．ｒ（図２５Ａ、配列番号８２）を使用し、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の合成されたＨ５（図１Ｇ、配列番号４２）を鋳型として使用して、増幅した。ｎｔ１０７５〜ｎｔ１７０７のＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５コード配列由来のＨ５を含有する第２の断片を、プライマーＨ５Ｉ５０５（ＰｒＬ−）．ｃ（図２５Ｂ、配列番号８３）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）を使用し、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の合成されたＨ５（図１Ｇ、配列番号４２）を鋳型として使用して、増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−Ｈ５Ａ−Ｉ−０５．ｓ１＋３ｃ（図１Ａ、配列番号２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図１Ｂ、配列番号３）をプライマーとして使用する第２のラウンドの増幅のために鋳型として使用した。得られた断片（断片間にＧＧリンカーを有するＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Δａ．ａ．３３８〜３５８由来のＨ５をコードする）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにおいてクローニングした。構築物１１９１（図１Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットとインフレームでの対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図１Ｄに示す（配列番号４）。得られた構築物に番号９２８を与えた（図２５C、配列番号８４）。タンパク質分解性ループが欠失しているＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５のアミノ酸配列を図２５Ｄに示す（配列番号８５）。プラスミド９２８の表示を図２５Ｅに示す。
（実施例５．１１）
Ｆ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／ＮＯＳ（構築物番号１０２９）
インフルエンザＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡをコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ｈｉｓ野生型シグナルペプチドなしのＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅコード配列を含む断片を、合成されたＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ７６６８４０由来のｎｔ３４〜１７９１に対応する）（図３０Ｃ、配列番号８８）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ−Ｓ２＋Ｓ４−Ｂ Ｂｒｉｓ．ｃ（図３０Ａ、配列番号８６）およびＩＦ−Ｓ１ａ４−Ｂ Ｂｒｉｓ．ｒ（図３０Ｂ、配列番号８７）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームの対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドおよび左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列である。得られた構築物に番号１０２９を与えた（図３０Ｄ、配列番号８９）。インフルエンザＢ Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＰＤＩＳＰ／ＨＡのアミノ酸配列を図３０Ｅに示す（配列番号９０）。プラスミド１０１９の表示を図３０Ｆに示す。
（実施例５．１２）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）についての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１０３９）およびＨＴ＋（構築物番号１８２９）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−；図３１Ａ、配列番号９１）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を、図３１Ｂに示す（配列番号９２）。プラスミド１０３９および１８２９の表示を、図８Ｂおよび３１Ｄに示す。
（実施例５．１３）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）についての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１０３９）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１９３７）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられたタンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに対応するコード配列（ＨＡ配列中の欠失したタンパク質分解性ループ領域に関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月２８日出願の米国仮出願第６１／８０６，２２７号を参照のこと）（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））（図３２Ａ、配列番号９３）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を、図３１Ｂに示す（配列番号９２）。プラスミド１０３９および１９３７の表示を、図８Ｂおよび図３２Ｃに示す。
（実施例１５．１４）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１０６７）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１９７７）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質テール（ＴＭＣＴ）に融合され、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８由来のＨＡの外部ドメインに対応するキメラ赤血球凝集素コード配列（ＨＡ配列中の欠失したタンパク質分解性ループ領域に関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月２８日出願の米国仮出願第６１／８０６，２２７号を参照のこと）（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図３３Ａ、配列番号９５）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を、図３３Ｂに示す（配列番号９６）。プラスミド１０６７および１９７７の表示を、図３３Ｃおよび図３３Ｄに示す。
（実施例５．１５）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）についての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７２）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２０５０）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡに対応するコード配列（ＨＡ配列中の欠失したタンパク質分解性ループ領域に関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月２８日出願の米国仮出願第６１／８０６，２２７号を参照のこと）（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））（図３４Ａ、配列番号９７）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を、図３４Ｂに示す（配列番号９８）。プラスミド２０７２および２０５０の表示を、図３４Ｃおよび図３４Ｄに示す。
（実施例５．１６）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７４）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号２０６０）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質テール（ＴＭＣＴ）に融合し、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡの外部ドメインに対応するキメラ赤血球凝集素コード配列（ＨＡ配列中の欠失したタンパク質分解性ループ領域に関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月２８日出願の米国仮出願第６１／８０６，２２７号を参照のこと）（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図３５Ａ、配列番号９９）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を、図３５Ｂに示す（配列番号１００）。プラスミド２０７４および２０６０の表示を、図３５Ｃおよび３５Ｄに示す。
（実施例５．１７）
ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）についての、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１４４５）、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶＨＴ＋（構築物番号１８２０）およびＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１９７５）
ｈｉｓネイティブシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに対応するコード配列（ＨＡ配列中の欠失したタンパク質分解性ループ領域に関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月２８日出願の米国仮出願第６１／８０６，２２７号を参照のこと）（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））（図３６ＡＡ、配列番号１０１）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴ、ＣＰＭＶＨＴ＋およびＣＰＭＶ１６０中にクローニングした。ｈｉｓネイティブシグナルペプチドを有するＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を、図３６Ｂに示す（配列番号１０２）。プラスミド１４４５、１８２０および１９７５の表示を、それぞれ図３６Ｃ、３６Ｄおよび３６Ｅに示す。
（実施例５．１８）
ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１４５４）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１８９３）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質テール（ＴＭＣＴ）に融合し、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのネイティブシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２／２０１２由来のＨＡの外部ドメインに対応するキメラ赤血球凝集素コード配列（ＨＡ配列中の欠失したタンパク質分解性ループ領域に関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月２８日出願の米国仮出願第６１／８０６，２２７号を参照のこと）（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図３７Ａ、配列番号１０３）を、実施例５．７および５．１１に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０＋中にクローニングした。ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を、図３７に示す（配列番号１０４）。プラスミド１４５４および１８９３の表示を、図３７Ｃおよび３７Ｄに示す。
（実施例５．１９）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１０６７）およびＨＴ＋（構築物番号１８７５）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質テール（ＴＭＣＴ）に融合し、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８由来のＨＡの外部ドメインに対応するキメラ赤血球凝集素コード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図３８Ａ、配列番号１０５）を、実施例５．２６に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を、図３８Ｂに示す（配列番号１０６）。プラスミド１０６７および１８７５の表示を、図３３Ｃおよび３９Ｃに示す。
（実施例５．２０）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）についての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７２）およびＨＴ＋（構築物番号２０５２）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））（図３９Ａ、配列番号１０７）を、実施例５．２６に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を、図３９Ｂに示す（配列番号１０８）。プラスミド２０７２および２０５２の表示を、図３４Ｃおよび図３９Ｃに示す。
（実施例５．２１）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７４）およびＨＴ＋（構築物番号２０６２）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質テール（ＴＭＣＴ）に融合し、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡの外部ドメインに対応するキメラ赤血球凝集素コード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図４０Ａ、配列番号１０９）を、実施例５．２６に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した成熟ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を、図４０Ｂに示す（配列番号１１０）。プラスミド２０７４および２０６２の表示を、図３５Ｃおよび図４０Ｃに示す。
（実施例５．２２）
ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）についての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１４４５）およびＨＴ＋（構築物番号１８３９）
ｈｉｓネイティブシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡに対応するコード配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））（図４１Ａ、配列番号１１１）を、実施例５．２６に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋中にクローニングした。ｈｉｓネイティブシグナルペプチドを有するＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を、図４１Ｂに示す（配列番号１１２）。プラスミド１４４５および１８３９の表示を、図３６Ｃおよび４１Ｃに示す。
（実施例５．２３）
ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号１４５４）およびＨＴ＋（構築物番号１８６０）
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質テール（ＴＭＣＴ）に融合し、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのネイティブシグナルペプチドを有する、タンパク質分解性ループが欠失した（ＰｒＬ−）インフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２／２０１２由来のＨＡの外部ドメインに対応するキメラ赤血球凝集素コード配列（ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図４２Ａ、配列番号１１３）を、実施例５．２６に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋中にクローニングした。ＨＡ Ｂ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのアミノ酸配列を、図４２Ｂに示す（配列番号１１４）。プラスミド１４５４および１８６０の表示を、図３７Ｃおよび４２Ｃに示す。
（実施例５．２４）
Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号４８９）、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋（構築物番号１８８０）および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０（構築物番号１８８５）
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のネイティブＨ５に対応するコード配列（図４３Ａ、配列番号１１５）を、実施例５．２５に記載されるのと同じＰＣＲベースの方法を使用するが、Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＣＰＭＶ−ＨＴ、ＣＰＭＶ１６０＋およびＣＰＭＶ１６０中にクローニングした。インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のネイティブＨ５のアミノ酸配列を、図４３Ｂに示す（配列番号１１６）。プラスミド４８９の表示を、図４３Ｃに示す。
（実施例５．２５）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１８００）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３をコードする配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系（ＣＰＭＶ１６０＋）中にクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａコード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ＊＊（ＳａｃＩＩ）−ＰＤＩ．ｓ１＋４ｃ（図４４Ａ、配列番号１１７）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図４４Ｂ、配列番号１１８）を使用し、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図４４Ｃ、配列番号１１９）を鋳型として使用して、増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号２１７１（図４４Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号２１７１は、ＣＰＭＶ１６０＋ベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４４Ｅに示す（配列番号１２０）。得られた構築物に番号１８００を与えた（図４４Ｆ、配列番号１２１）。ＰＤＩＳＰと融合したインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列を、図４４Ｇに示す（配列番号１２２）。プラスミド１８００の表示を、図４４Ｈに示す。
（実施例５．２６）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１８１９）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３をコードする配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａコード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ（ＳａｃＩＩ）−Ｋｏｚａｃ＿ＰＤＩ．ｃ（図４５Ａ、配列番号１２３）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図４５Ｂ、配列番号１２４）を使用し、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図４４Ｃ、配列番号１１９）を鋳型として使用して、増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号２１８１（図４５Ｄ）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号２１８１は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４５Ｅに示す（配列番号１２５）。得られた構築物に番号１８１９を与えた（図４５Ｅ、配列番号１２６）。ＰＤＩＳＰと融合したインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列を、図４４Ｇに示す（配列番号１２２）。プラスミド１８１９の表示を、図４５Ｆに示す。
（実施例５．２７）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ（構築物番号２２２０）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられたインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７由来のＨ２をコードする配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅコード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ（ＳａｃＩＩ）−Ｋｏｚａｃ＿ＰＤＩ．ｃ（実施例５．２６において構築物１８１９について記載する）およびＩＦ＊＊−Ｈ２Ｓ１５７．ｓ１−６ｒ（図４８Ａ、配列番号１２７）を使用し、ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ配列（図４８Ｂ、配列番号１２８）を鋳型として使用して、増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号２１８１（実施例５．２６において構築物１８１９について記載する）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物２１８１は、ＣＰＭＶ ＨＴ＋ベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４５Ｄに示す。得られた構築物に番号２２２０を与えた（図４８Ｃ、配列番号１２９）。ＰＤＩＳＰと融合したインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７由来の成熟Ｈ２のアミノ酸配列を、図４８Ｄに示す（配列番号１３０）。プラスミド２２２０の表示を、図４８Ｅに示す。
（実施例５．２８）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＮＯＳ（構築物番号２２２１）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７由来のＨ２をコードする配列（ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を、Darveauら（Methods in Neuroscience ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））によって示された以下のＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ｎｔ１〜ｎｔ１０３２のインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７コード配列由来のＨ２を含有する断片を、プライマーＩＦ（ＳａｃＩＩ）−Ｋｏｚａｃ＿ＰＤＩ．ｃ（実施例５．２６において構築物１８１９について記載する）およびＨ２Ｓ１５７（Ｐｒｌ−）．ｒ（図４９Ａ、配列番号１３１）を用い、ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ配列（図４８Ｂ、配列番号１２８）を鋳型として使用して、増幅した。ｎｔ１０８４〜ｎｔ１７１６のインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７コード配列由来のＨ２を含有する第２の断片を、プライマーＨ２Ｓ１５７（Ｐｒｌ−）．ｃ（図４９Ｂ、配列番号１３２）およびＩＦ＊＊−Ｈ２Ｓ１５７．ｓ１−６ｒ（図４８Ａ、配列番号１２７）を用い、ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ配列（図４８Ｂ、配列番号１２８）を鋳型として使用して、増幅した。次いで、両方の増幅由来のＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ（ＳａｃＩＩ）−Ｋｏｚａｃ＿ＰＤＩ．ｃ（実施例５．２６において構築物１８１９について記載する）およびＩＦ＊＊−Ｈ２Ｓ１５７．ｓ１−６ｒ（図４８Ａ、配列番号１２７）をプライマーとして使用する第２のラウンドの増幅のために鋳型として使用した。ＰＣＲ産物（ＰＤＩＳＰ／ＧＧリンカーによって置き換えられたａａ３２１〜３３７を有するＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅコード配列を含む）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物２１８１（実施例５．２６において構築物１８１９について記載する）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号２１８１は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を図４５Ｄに示す（実施例５．２６において構築物１８１９について記載する）。得られた構築物に番号２２２１を与えた（図４９Ｃ、配列番号１３３）。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７由来の成熟Ｈ２のアミノ酸配列を、図４９Ｄに示す（配列番号１３４）。プラスミド２２２１の表示を、図４９Ｅに示す。
（実施例５．２９）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＮＯＳ発現系中のＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（構築物番号２２２２）およびＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（構築物番号２２２３）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループありまたはなしのインフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７由来のＨ２をコードする配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ ＳｉｎｇａｐｏｒｅおよびＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を、それぞれ構築物２２２０および２２２１と同じＰＣＲベースの方法を使用するが、増幅のための改変フォワードプライマーＩＦ＊＊（ＳａｃＩＩ）−ＰＤＩ．ｓ１＋４ｃ（実施例５．２５において構築物１８００について記載する）および異なるアクセプタープラスミドを使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＮＯＳ発現系中にクローニングした。得られたＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物２１７１（実施例５．２５について構築物１８００について記載する）を、ＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号２１７１は、ＣＰＭＶ １６０＋ベースの発現カセット中の対象の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でのサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの同時発現のための遺伝子構築物もまた含む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列を示す（実施例５．２５において構築物１８００について記載する）。得られた構築物に、ＰＤＩＳＰ／Ｈ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅについては番号２２２２（図５０Ａ、配列番号１３５）を与え、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ２ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅについては番号２２２３（図５０Ｂ、配列番号１３６）を与えた。プラスミド２２２２および２２２３の表示を、それぞれ図５０Ｃおよび５０Ｄに示す。
（実施例５．３０）
ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２０１９）および１６０＋（構築物番号２１３９）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドによって置き換えられた、インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来のＨ３に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈ）（図５１Ａ、配列番号１３７）を、それぞれ構築物２２２０および２２２２と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３ Ｐｅｒｔｈのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５１Ｂ、配列番号１３８）を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋および１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合したインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列を、図５１Ｃに示す（配列番号１３９）。プラスミド２０１９および２１３９の表示を、図５１Ｄおよび図５１Ｅに示す。
（実施例５．３１）
ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２０３９）および１６０＋（構築物番号２１５９）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来のＨ３に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈ）（図５２、配列番号１４０）を、それぞれ構築物２２２１および２２２３と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｐｅｒｔｈのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５１Ｂ（配列番号１３８）、５２Ｂ（配列番号１４１）および５３Ｃ（配列番号１４２）を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋および１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列を、図５２Ｄに示す（配列番号１４３）。プラスミド２０３９および２１５９の表示を、図５２Ｅおよび図５２Ｆに示す。
（実施例５．３２）
ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２２３０）および１６０＋（構築物番号２２５０）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（図５３、配列番号１４４）を、それぞれ構築物２２２１および２２２３（実施例５．２８および５．２９を参照のこと）と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ３ Ｖｉｃｔｏｒｉａのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５３Ｂ（配列番号１４５）および５３Ｃ（配列番号１４６）を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋および１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列を、図５３Ｄに示す（配列番号１４７）。プラスミド２２３０および２２５０の表示を、図５３Ｅおよび図５３Ｆに示す。
（実施例５．３３）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ（構築物番号２１４２）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、インフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ）（図５４Ａ、配列番号１４８）を、構築物２２２０と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５４Ｂ、配列番号１４９）を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合したインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来の成熟Ｈ７のアミノ酸配列を、図５４Ｃに示す（配列番号１５０）。プラスミド２１４２の表示を、図５４Ｅに示す。
（実施例５．３４）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ／ＮＯＳ（構築物番号２１５２）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕ）（図５５Ａ、配列番号１５１）を、構築物２２２１と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ７ Ｈａｎｇｚｈｏｕのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５４Ｂ（配列番号１４９）、図５５Ｂ（配列番号１５２）および図５５Ｃ（配列番号１５３））を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来の成熟Ｈ７のアミノ酸配列を、図５５Ｄに示す（配列番号１５４）。プラスミド２１５２の表示を、図５５Ｅに示す。
（実施例５．３５）
ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２２２４）および１６０＋（構築物番号２２２６）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９９９由来のＨ９に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）（図５６Ａ、配列番号１５５）を、それぞれ構築物２２２０および２２２２と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／Ｈ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５６Ｂ、配列番号１５６）を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋および１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９９９由来の成熟Ｈ９のアミノ酸配列を、図５６Ｃに示す（配列番号１５７）。プラスミド２２２４および２２２６の表示を、図５６Ｄおよび図５６Ｅに示す。
（実施例５．３６）
ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇについての、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２２２５）および１６０＋（構築物番号２２２７）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９９９由来のＨ９に対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）（図５７Ａ、配列番号１５８）を、それぞれ構築物２２２１および２２２３と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨ９ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５６Ｂ（配列番号１５６）、図５７Ｂ（配列番号１５９）および図５７Ｃ（配列番号１６０））を用いて、改変ＣＰＭＶ ＨＴ＋および１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９９９由来の成熟Ｈ９のアミノ酸配列を、図５７Ｄに示す（配列番号１６１）。プラスミド２２２５および２２２７の表示を、図５７Ｅおよび図５７Ｆに示す。
（実施例５．３７）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号２０１３）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ）（図５８Ａ、配列番号１６２）を、構築物２２２２と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５８Ｂ、配列番号１６３）を用いて、改変ＣＰＭＶ １６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、インフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来の成熟ＨＡのアミノ酸配列を、図５８Ｃに示す（配列番号１６４）。プラスミド２０１３の表示を、図５８Ｄに示す。
（実施例５．３８）
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０＋／ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ／ＮＯＳ（構築物番号２０１４）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａ）（図５９Ａ、配列番号１６５）を、構築物２２２３と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｍａｌａｙｓｉａのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図５８Ｂ（配列番号１６３）、図５９Ｂ（配列番号１６６）、図５９Ｃ（配列番号１６７）を用いて、改変ＣＰＭＶ １６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４由来の成熟ＨＡのアミノ酸配列を、図５９Ｄに示す（配列番号１６８）。プラスミド２０１４の表示を、図５９Ｅに示す。
（実施例５．３９）
ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ（構築物番号２０７０）、ＨＴ＋（構築物番号２０８０）および１６０＋（−Ｍｐｒｏｔ）（構築物番号２０９０）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、インフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）（図６０Ａ、配列番号１６９）を、それぞれ構築物２０７２、２２２０および２２２２と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのために特に設計した改変ＰＣＲプライマーを用いて、元のＨＴ、改変ＨＴ＋および１６０＋中にクローニングした。ＰＤＩＳＰと融合した、インフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来の成熟ＨＡのアミノ酸配列を、図６０Ｂに示す（配列番号１７０）。プラスミド２０７０、２０８０および２０９０の表示を、図６０Ｃ、図６０Ｄおよび図６０Ｅに示す。
（実施例５．４０）
ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａについての、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２１０２）、ＢｅＹＤＶを有するＨＴ＋（構築物番号２１０４）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ）（図６１Ｄ、配列番号１９３）を、上記と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図６１Ａ（配列番号１９０）、図６１Ｂ（配列番号１９１）および図６１Ｃ（配列番号１９２）を参照のこと）を用いて、改変ＨＴ＋中にクローニングした。得られた発現カセット２１０２のヌクレオチド配列を、図６１Ｆに与える（配列番号１９５）。同様に、ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来のＨＡに対応するコード配列を、増幅エレメントＢｅＹＤＶと一緒に、改変ＨＴ＋中にクローニングした。得られた発現カセット２１０４のヌクレオチド配列を、図６１Ｆに与える（配列番号１９６）。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ由来の成熟ＨＡのアミノ酸配列を、図６１Ｅに示す（配列番号１９４）。プラスミド２１０２および２１０４の表示を、図６１Ｇおよび６１Ｉに示す。
（実施例５．４１）
ＰＤＩＳＰ／タンパク質分解性ループが欠失したＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴについての２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ＋（構築物番号２１０６）、ＢｅＹＤＶを有するＨＴ＋（構築物番号２１０８）
ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのネイティブシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ由来のＨＡに対応するコード配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ）（図６２Ｂ、配列番号１９８）を、上記と同じＩｎ Ｆｕｓｉｏｎベースのアプローチを使用するが、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴのために特に設計した改変ＰＣＲプライマー（図６１Ａ（配列番号１９７）を参照のこと）を用いて、改変ＨＴ＋中にクローニングした。得られた発現カセット２１０６のヌクレオチド配列を、図６２Ｄに与える（配列番号２００）。同様に、ネイティブシグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドによって置き換えられた、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ由来のＨＡに対応するコード配列を、増幅エレメントＢｅＹＤＶと一緒に、改変ＨＴ＋中にクローニングした。得られた発現カセット２１０８のヌクレオチド配列を、図６２Ｆに与える（配列番号２０１）。ＰＤＩＳＰと融合した、タンパク質分解性ループが欠失したインフルエンザＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ＋Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＴＭＣＴ由来の成熟ＨＡのアミノ酸配列を、図６２Ｃに示す（配列番号１９９）。プラスミド２１０６および２１０８の表示を、図６２Ｅおよび６２Ｇに示す。
全ての参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を１つまたは複数の実施形態に関して記載してきた。しかし、いくつかのバリエーションおよび改変が、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかであろう。

Claims (32)

  1. 植物において活性な調節領域および植物において活性な発現エンハンサーを含む核酸であって、前記調節領域および前記発現エンハンサーは、改変タンパク質分解性ループを含む改変インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、核酸。
  2. 前記発現エンハンサーが、ＣＰＭＶＸ、ＣＰＭＶＸ＋、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］およびＣＰＭＶ ＨＴ＋［５１１］からなる群から選択される、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  3. 前記発現エンハンサーがＣＰＭＶ ＨＴではない、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  4. マメ黄化萎縮ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＬＩＲ）およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＳＩＲ）を含まない、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  5. 前記改変タンパク質分解性ループが、ネイティブＨＡの１つまたは複数の切断部位の切断と比較した場合にプロテアーゼによる切断の低減または消滅を示す１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  6. 前記プロテアーゼが、Ｃｌａｒａ様、Ｆｕｒｉｎ様またはトリプシンである、請求項５に記載のヌクレオチド酸。
  7. 前記改変タンパク質分解性ループがリンカー配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  8. 前記リンカー配列が、アミノ酸配列ＧＧ、ＴＥＴＱまたはＴＥＴＲを有する、請求項７に記載のヌクレオチド酸。
  9. 前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記ＨＡが、インフルエンザＢ型、Ｃ型、Ａ型ならびにサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６由来のＨＡからなる群から選択される、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  10. 前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１７、１８、２０、２１、４１、５８、７７、８１、８５、９２、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１３４、１４３、１４７、１５４、１６１、１６８、１９４および１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  11. 前記ＨＡがＨＡ０である、請求項１に記載のヌクレオチド酸。
  12. 前記改変ＨＡが、ネイティブまたは非ネイティブのシグナルペプチドを含む、請求項１に記載の核酸。
  13. 前記改変ＨＡをコードする前記ヌクレオチド配列が、順番に、改変タンパク質分解性ループを含む改変ＨＡ外部ドメイン、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質テールをコードするキメラヌクレオチド配列を含み、前記改変ＨＡ外部ドメインが、第１のインフルエンザ株由来であり、前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質テールが、第２のインフルエンザ株由来である、請求項１に記載の核酸。
  14. 植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
    ａ）請求項１に記載のヌクレオチド酸を、前記植物または前記植物の一部分に導入するステップ、
    ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって前記ＶＬＰを生成するステップ
    を含む、方法。
  15. ステップａ）において、第２のヌクレオチド酸が、前記植物または前記植物の一部分に導入され、前記第２のヌクレオチド酸が、第２の調節領域を含み、前記第２の調節領域が、前記植物において活性であり、プロトンチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記プロトンチャネルタンパク質が、インフルエンザＭ２またはＢＭ２から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
    ａ）請求項１に記載の核酸を含む植物または植物の一部分を準備するステップ、および
    ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって前記ＶＬＰを生成するステップ
    を含む、方法。
  18. ｃ）前記植物を収穫するステップ、および
    ｄ）前記ＶＬＰを精製するステップであって、前記ＶＬＰが、８０〜３００ｎｍのサイズ範囲である、ステップ
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  19. 請求項１４のいずれか１項に記載の方法によって生成されたＶＬＰ。
  20. 植物から誘導された１つまたは１つより多い脂質をさらに含む、請求項１９に記載のＶＬＰ。
  21. 前記改変ＨＡタンパク質が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変Ｎ−グリカンを含む、請求項２０に記載のＶＬＰ。
  22. 植物において切断の低減または消滅を示す１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質分解性ループを含む改変ＨＡタンパク質を生成する方法であって、
    ａ）請求項１に記載のヌクレオチド酸を前記植物に導入するステップ、
    ｂ）前記ＨＡタンパク質の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって前記改変ＨＡタンパク質を生成するステップ、
    ｃ）前記植物を収穫し、前記改変ＨＡタンパク質を精製するステップ
    を含む、方法。
  23. 赤血球凝集素（ＨＡ）活性を有する、請求項２２に記載の方法によって生成されたＨＡタンパク質。
  24. 請求項１に記載の核酸によってコードされるＨＡ。
  25. 導入する前記ステップ（ステップａ）において、前記核酸が、一過的な様式で前記植物に導入されるか、または前記核酸が、前記核酸が安定であるように前記植物に導入される、請求項１４に記載の方法。
  26. 請求項１に記載の核酸を含む植物。
  27. 免疫応答を誘発するための有効用量の請求項１９に記載のＶＬＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  28. 免疫応答を誘発するための有効用量の請求項１９に記載のＶＬＰを含むワクチン。
  29. 請求項１９に記載のＶＬＰを投与するステップを含む、被験体においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘発する方法。
  30. 前記ＶＬＰが、経口、皮内、鼻腔内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下で被験体に投与される、請求項３０に記載の方法。
  31. 植物において発現されるＨＡタンパク質の生成物品質を増加させる方法であって、
    ａ）請求項１に記載のヌクレオチド酸を前記植物に導入するステップ、
    ｂ）前記ＨＡタンパク質の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部分をインキュベートすることによって改変ＨＡタンパク質を生成するステップ、
    ｃ）前記植物を収穫し、前記改変ＨＡタンパク質を精製するステップであって、前記改変ＨＡタンパク質が、ネイティブＨＡと比較した場合に生成物品質が増加している、ステップ
    を含む、方法。
  32. 前記品質が、増加した生成物収量、前記生成物の安定性、前記生成物の一貫性またはそれらの組合せを含む、請求項３２に記載の方法。
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