JP2016513451A - ポリメラーゼ連鎖反応検出システム - Google Patents

ポリメラーゼ連鎖反応検出システム Download PDF

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Abstract

本発明は、アッセイシステムにおける核酸検出の方法及びキットに関する。

Description

本発明は、アッセイシステムにおける核酸検出の方法及びキットに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標的核酸配列を迅速に増幅するための強力な方法である。PCRにより、遺伝子発現及び/又は調節を含めた遺伝子の特徴付け並びにPCR増幅したDNAの直接配列決定、対立遺伝子の変異の決定、感染性及び遺伝性疾患障害の検出を含めた分子クローニング技術の開発が促進されてきた。PCRは、標的配列を含有するDNA鋳型の熱変性と、相補的DNA鎖と反対向きのプライマーのアニーリングとDNAポリメラーゼでのアニールしたプライマーの伸張の繰り返しサイクルによって実行される。複数のPCRサイクルにより、隣接する増幅プライマーが定めるヌクレオチド配列の増幅がもたらされる。PCRプロトコルへの熱安定性DNAポリメラーゼの組み込みにより、繰り返し酵素を添加する必要性がなくなり、プライマーと鋳型との会合の特異性を増強する高いアニーリング及びプライマー伸長温度が許容される。Taq DNAポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼが、そのように機能して、PCRの特異性及び簡便性が高められる。
PCRに基づく増幅の多くで、シグナル発生システムを利用して、例えば増幅産物の生産が検出される。PCRに基づく反応において使用されるシグナル発生システムの1つの型は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)システムであり、核酸検出器は蛍光ドナー及びアクセプター群を含む。FRET標識システムは、結合していない標識核酸検出器と結合しているものとの分離工程を必要としない均一なアッセイを実行する能力を含めて、他の標識システムに比べていくつかの利点を含む。多くの従来技術での主要な問題は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドの合成と関連している。欧州特許出願公開第1726664号は、自由溶液中で互いにハイブリダイズして蛍光消光した対(蛍光/消光物質カセット)を形成し、配列の一方に対する相補配列の導入により測定可能なシグナルを生成し、配列の一方がPCR過程のアニーリング温度(Ta)より低いTmのものである、融解温度(Tm)が異なる単一標識オリゴヌクレオチド配列を使用することによってこの問題を克服する検出システムについて開示している。このシステムにおいて、単一標識オリゴヌクレオチド配列の一方は、好ましくは他方より10塩基長く、より好ましくは少なくとも15塩基長い。
標識核酸検出器を使用する検出システムにおいては、忠実度の高い増幅が重要である。PCR過程及びTaq DNAポリメラーゼの性質のため、そのような方法は、所望の重合反応に代わる副反応を起こすことがある。例えば、反応が周囲温度で組立てられる場合、PCRは非特異的増幅を起こすことがある。Taqポリメラーゼは、全ての温度で活性の一部分を保持しており、従って、非相補的にアニールされるプライマーを伸長することができ、望ましくない産物の形成がもたらされる。次いで新たに合成された領域は、更なるプライマー伸長及び望ましくない増幅産物の合成の鋳型として機能する。しかしながら、ポリメリゼーションが開始する前に反応をおよそ50℃又はそれ以上の温度に加熱すると、プライマーアニーリングのストリンジェンシーが増大され、望ましくないPCR産物の合成が回避される又は減少する。
プライマーダイマーも、PCRに影響を及ぼす一般的な副反応である。プライマーが互いにハイブリダイゼーションし、伸張するので、プライマーダイマーの蓄積が起こる。プライマーダイマーの形成は、試薬の消耗、それ故PCR効率の全体的な減少及び/又は偽陽性結果の生産をもたらす。
ホットスタートPCRは、非特異的増幅を減少させ、それ故、プライマーダイマーを含めた非特異的PCR産物の形成を限定する方法である。これを実現するために異なる手法が多く開発されてきた;例えばMoretti, T.ら、「Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase」、BioTechniques 25、716〜22頁 (1998)、及び「Hot Start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance」、Nucleic Acids Res (2008) 36(20): e131頁を参照のこと。そのような方法は、PCR開始前の非特異的ハイブリダイゼーションに続くプライマーの伸張を減少させる。しかしながら、程度はより小さいが、PCR増幅の間にプライマーのダイマー形成を含めたミスプライミング事象が起り得るので、そのような技術は、そのような問題を部分的に軽減するに過ぎない。PCRプライマーより内側にある配列の存在を検出するPCRプローブの使用は、そのような任意の非特異的産物の検出を妨げるのに役立つが、検出しようとする各個々の配列について専用のプローブが必要となるので、その過程に著しいコストが加わる。費用効率が高い高スループット遺伝分析は、汎用検出システムの使用を必要とするが、原理的には、これは非特異的増幅産物の検出による影響を受け得る。
欧州特許出願公開第1726664号 PCT/GB2012/050645 国際公開第01/42505号パンフレット 国際公開第01/86001号パンフレット
Moretti, T.ら、「Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase」、BioTechniques 25、716〜22頁 (1998) Moretti, T.ら、「Hot Start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance」、Nucleic Acids Res (2008) 36(20): e131頁 Braithwaite及びIto、Nucleic Acids Res. (1993) 21:787〜802頁 Proc. Natl. Acad. Sci USA (1994) 91:2216〜2220頁
既存のPCRの検出システムでみられる問題を解決する、(例えば均一なPCRアッセイにおいて)プライマー伸長産物の検出に使用する合成が容易で、低コストで信頼性が高い特異的な検出システムについての必要性が存在する。均一なPCRアッセイという用語は当技術分野で周知であり、反応結果を得るために反応成分を互いに物理的に分離する必要がないものである。本発明は、互いにハイブリダイズして蛍光消光した対を形成する標識オリゴヌクレオチド配列の相対的な長さの選択が、特にリアルタイム装置に使用する場合に、核酸検出アッセイシステムを改善するという発見に基づく。本発明において、組み込まれていない任意の蛍光オリゴヌクレオチドが、蛍光取得温度で消光物質オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるように、蛍光/消光物質カセットのTmが増幅のTaより高く設計されていることにより、反応をリアルタイムに又は終了点で監視することが可能になる。消光物質オリゴヌクレオチドの長さ及びTmを調整することにより、蛍光/消光物質カセットの安定性の増大がPCRを簡単に阻害することになるとの予想がなされた。しかしながら、リアルタイムにおけるサンプルと鋳型なし対照の間のCq値(別名Ct値)の差異の著しい増加、又は終了点適用における鋳型なし対照の検出の減少で示されるように、蛍光プライマーの増幅特異性が改善されることが予想外に見出された。
本発明によると、プライマー伸長産物の検出方法であって、
a)1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
によって特徴づけられ、
特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、工程と、
b)1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程であって、各組が、
i)蛍光部分(ドナー部分)で標識され、所与のオリゴヌクレオチドプライマーの群内における任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイゼーションできる配列を有する第1カセットオリゴヌクレオチドと、
ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
によって特徴づけられ、
カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、
蛍光消光した対がTm Aを有する、工程と、
c)プライマー伸長反応を開始し、それによって(関連する標的ポリヌクレオチドが存在する場合に)関連する第1オリゴヌクレオチドプライマーに対する相補配列を生成し、それにより関連する第2(アクセプター、例えば消光物質、標識される)カセットオリゴヌクレオチドが、関連する第1(蛍光標識される)カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる程度が低くなり、それによってシグナルが生成される工程と、
d)生成されるシグナルを検出する工程と
を含み、
プライマー伸長反応が、少なくとも一部には1つ以上の蛍光消光した対に対するTm A又はTm Asより低いTaで実行される方法を提供する。
そのような方法に使用するのに適したキットも、提供される。
本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 本発明の方法を具体化するSNP遺伝子型判定におけるDNA配列の検出の簡単な反応の概要を示す図である。 以下の実施例2に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する3つのクラスターは、検出できる3つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例2に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する3つのクラスターは、検出できる3つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例2に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する3つのクラスターは、検出できる3つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例2に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する3つのクラスターは、検出できる3つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例2に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する3つのクラスターは、検出できる3つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例2に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する3つのクラスターは、検出できる3つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例3に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット5(左)及び蛍光/消光物質カセット1(右)の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。各例に存在する2つのクラスターは、検出できる2つの考え得る遺伝子型を表す。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 以下の実施例4に記載されるアッセイを使用して生成されたデータを示す図である。蛍光/消光物質カセット1〜4の増幅産物の遺伝子型判定のデータ例である。全ての場合において、鋳型なし対照が検出されない場合、対立遺伝子特異的な増幅が実証される。明快にするために鋳型なし対照を黒点で、更に丸で囲んで表す。 本発明に使用する考え得るオリゴヌクレオチドの組合せの概略例を示す図である。遺伝子の複数の対立遺伝子を分析するために示されるリバースプライマーは共通であってもよいが、そうでなければならないわけではない。 本発明に使用する考え得るオリゴヌクレオチドの組合せの概略例を示す図である。遺伝子の複数の対立遺伝子を分析するために示されるリバースプライマーは共通であってもよいが、そうでなければならないわけではない。
本発明の第1の態様は、プライマー伸長産物の検出方法であり、
a)1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
によって特徴づけられ、
特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、工程と、
b)1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程であって、各組が、
i)蛍光部分(ドナー部分)で標識され、所与のオリゴヌクレオチドプライマーの群内における任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイゼーションできる配列を有する第1カセットオリゴヌクレオチドと、
ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
によって特徴づけられ、
カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、
蛍光消光した対がTm Aを有する、工程と、
c)プライマー伸長反応を開始し、それによって(関連する標的ポリヌクレオチドが存在する場合に)関連する第1オリゴヌクレオチドプライマーに対する相補配列を生成し、それにより関連する第2(アクセプター、例えば消光物質、標識される)カセットオリゴヌクレオチドが、関連する第1(蛍光標識される)カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる程度が低くなり、それによってシグナルが生成される工程と、
d)生成されるシグナルを検出する工程と
を含み、
プライマー伸長反応が、少なくとも一部には1つ以上の蛍光消光した対に対するTm A又はTm Asより低いTaで実行される方法を提供する。
シグナルは、リアルタイムに測定することができる。別法として、シグナルは、反応の終了点で測定することができる。
蛍光部分で標識される第1カセットオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応におけるプライマーとして作用することができ得る(例えば3'OH基を有することができる)。別法として、蛍光部分で標識される第1カセットオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応におけるプライマーとして作用することができない場合がある(又はプライマーとして作用することができるか否かは、重要にならない場合がある)。蛍光部分で標識される第1カセットオリゴヌクレオチドが、プライマー伸長反応におけるプライマーとして作用できる場合、通常より多くのプライマー伸長産物が形成され、それ故より良好なシグナルが得られると考えられる。例えばアクセプター/消光物質は、オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用することを妨げ得るので、一般にアクセプター/消光物質標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応におけるプライマーとして作用することができない場合がある。
オリゴヌクレオチドのTmとは、一本鎖オリゴヌクレオチドの集団中にある分子の50%がその相補配列にハイブリダイズされており、その集団中にある分子の50%が前記相補配列にハイブリダイズされていない、℃での温度である。(例えば)蛍光消光した対のTmは、経験的に測定することができ、例えばTmは、例えばRoche社LightCycler 480機器で、96ウェル白色プレートを使用して融解曲線分析を使用して測定することができる。好ましくは、Tmは、プライマー伸長反応を行うために使用した測定器と同じものを使用して測定することができる。蛍光消光した対(カセット)のTmは、標準的な反応緩衝液中でポリメラーゼの非存在下で試験できる。標準的な反応緩衝液については、実施例に示す。更なる代表的な詳細についても、実施例に提供する。融解ピークは、LightCycler 480の分析機能(-dF/dt)によって、融解曲線データから生成することができる。マニュアルでTmオプションを使用して逆融解ピークの最低点を同定することによって、Tmsを算出する。
オリゴヌクレオチドの部分を含むハイブリダイゼーションのTmに言及する場合、関連するTmは、第1オリゴヌクレオチドの関連する部分に対応する試験オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションに対して決定できるTmであると考えられる。
蛍光消光した対(単数)又は対(複数)のTm(Tm A)は、好ましくはプライマー伸長反応のTaより15℃まで、例えば10℃までの範囲で高く、例えば、プライマー伸長反応のTaより1〜10℃など、1〜15℃高い。Tm A又はTm Asは、非特異的検出を妨げるには十分高いが、検出を阻害しないように十分低く(プライマー伸長反応を阻害することによると考えられる)選択されるべきである。用語Taは、当業者に周知であり、プライマー伸長反応の間に著しい増幅が起こる温度(一般に、反応パラメータを制御する装置に設定又はプログラムされる)のことを指す。一般に、プライマー伸長反応の全体を通じて、同じTaが実質的に使用される。時々、異なるTa(一般により高い)が、プライマー伸長反応の初期の回に使用されることがある。蛍光消光した対(単数)[又は複数の蛍光消光した対が使用される場合は、対(複数)]のTmは、一般にプライマー伸長反応の過程で使用されるどのTaよりも高く、又はプライマー伸長反応の多数のサイクルに使用されるTaより高く、例えばプライマー伸長反応で最高の若しくは多数のTaより15℃まで、例えば10℃までの範囲で高く、例えばプライマー伸長反応で最高の若しくは多数のTaより1〜10℃など1〜15℃高い。一般に、Taは、およそ46〜65℃、例えば50〜60℃であることができる。
本発明において、標識蛍光カセットオリゴヌクレオチド(又はプライマーオリゴヌクレオチド)の対の一方又は両方は、ホスホロチオエート修飾塩基など修飾塩基を含有することができる。任意の所与のオリゴヌクレオチド/プライマーにおいてホスホロチオエートによって置き換えられるホスホジエステル結合の数は、ホスホロチオエート(phosphothioates)によって置き換えられるホスホジエステル結合なしから全て、例えば1、2、3、4個又はより多くの範囲であり得る。オリゴヌクレオチド/プライマーは、5'及び/又は3'終端でホスホロチオエートを含有することができるが、そのような終端修飾の代わりとして又はそれに加えて、オリゴヌクレオチド/プライマーの内部塩基の少なくとも1つが、ホスホロチオエートであることが好ましい。例えば、塩基の10〜90%、20〜80%、30〜70%又は40〜60%が、ホスホロチオエートであることができる。一実施形態において、ホスホロチオエート修飾塩基(2つ以上ある場合)は、少なくとも1つ、例えば1〜3つの無修飾[ホスホジエステル(phosphorodiester)]塩基によって分離されており、例えばオリゴヌクレオチド/プライマー内の代わりの塩基は、ホスホロチオエートであることができる。一例において、ホスホロチオエート修飾塩基を含有することは、蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチド(単数)又はオリゴヌクレオチド(複数)に特に有用となり得る。ホスホロチオエート修飾塩基の存在は、蛍光性であり、従って誤った蛍光シグナルの生成をもたらし得る異常な産物の形成を減少させるのに役に立ち得ると考えられる。例えば、本発明に関連して更に有用になると考えられるホスホロチオエート組み込みパターンに関する議論については、PCT/GB2012/050645を参照のこと。
本発明の方法において生成されるシグナルは、プライマー伸長反応の間か後の任意の点でシグナルを測定することによって検出できる。シグナルの測定は、定性的又は定量的であり得る。シグナルを測定できるように、反応の温度を特に適合させなければならない必要性はないと考えられる。シグナルは、プライマー伸長反応の正常な経過の間に検出することができる。
本発明は、様々な異なる用途における使用を見出し、PCRに基づく反応における使用、並びにSNP検出用途、対立遺伝子の変異検出用途、遺伝子発現研究、コピー数変異研究、リアルタイム及び終了点PCR等を含めた用途に特に適している。
前述の通り、本発明は、鋳型依存的プライマー伸長反応における、及びプライマー伸長反応混合物中のプライマー伸長産物の生産を決定する、例えばプライマー伸長産物がプライマー伸長反応において作製されるかどうか検出するための有用性を見出す。プライマー伸長産物とは、鋳型依存的なプライマー伸長反応に由来する核酸分子を意味する。鋳型依存的なプライマー伸長反応とは、ポリメラーゼが、鋳型核酸分子にハイブリダイズされる核酸プライマー分子を伸長する反応であり、プライマー核酸分子の終端に付加される塩基の配列は、鋳型鎖にある塩基の配列によって決定される。鋳型依存的なプライマー伸長反応は、増幅及び非増幅プライマー伸長反応を含む。本発明のいくつかの実施形態において、プライマー伸長産物の生産が検出される鋳型依存的なプライマー伸長反応は、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。
本発明の方法を使用して同定できる核酸標的には、天然のDNA又はRNAなど任意の核酸含有標的がある。核酸は、必要に応じて4アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシル-メチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチル-グアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケウオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン(oxybutoxosine)、シュードウラシル、ケウオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル並びに2,6-ジアミノプリンなどDNA及びRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を含むことができる;又はPNAを含有することもできる。
本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、必要に応じてそのような塩基類似体又はPNAを含むことができるが、これは典型的ではない場合がある。
本発明の方法を実施するにあたって、第1工程は、プライマー伸長混合物、例えばプライマー伸長反応を起こすのに必要な要素の全てを含む組成物を作製することである。一例において、一般に、プライマー伸長混合物は、プライマー伸長反応に使用する標識オリゴヌクレオチド[カセットオリゴヌクレオチドの組(単数)又は組(複数)]を少なくとも一対含み、そのオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズして蛍光消光した対が形成され、一方のオリゴヌクレオチドは蛍光部分で標識されており、他方のオリゴヌクレオチドは消光部分で標識されており、蛍光消光した対はプライマー伸長反応のTaより高いTm(Tm A)を有する。各組の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の群の各プライマーの組の第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)の5'上流の蛍光カセット特異的領域の相補部にハイブリダイゼーションできる配列を含む。群内のフォワードプライマーはそれぞれ、(一般に異なる)標的特異的部分及び(一般に同一又は密接に関連する)5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する。5'上流の蛍光カセット特異的部分(そこに蛍光標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできる)への相補配列の導入(例えば特定のプライマーの組のプライマーが指向する標的核酸が存在するときに、プライマー伸長反応の進行による)により、アクセプター(消光物質)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドが、蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドに結合できる程度が低くなり、そこからのシグナルを消光することができる程度が低くなるので、検出可能なシグナルが生成される。プライマー伸長反応が進行し、蛍光標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な伸張産物がより多く生成されるにつれて、通常はより大きなシグナルが作製される。
従って発蛍光団領域に加えて、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)の所与の群の5'上流の尾部(単数)又は(複数)の相補部[蛍光カセット特異的部分(単数)又は部分(複数)]にハイブリダイゼーションできる配列も含む。この「タグ」配列は、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えばプライマー伸長反応混合物中でTa又はそれより高い温度で、例えば少なくともTaであるTmで、反応に含まれるタグ付けされたプライマー(単数)若しくはプライマー(複数)に対する相補部として形成される核酸配列(伸張産物)(未標識であってもよく、又は例えば、プライマー伸長反応のその後の回において蛍光標識カセットオリゴヌクレオチド自体になってもよい)に結合する。
上記のように、蛍光カセット特異的部分又は特定の群内の第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)のそれぞれの「タグ」配列は、一般に同一であるか又は密接に関係していることができ、例えば、同じ長さであるか又は約10未満、より一般には5、4、3、2若しくは1ヌクレオチドの長さで異なり、重なりあった領域において互いに少なくとも約80、85、90、より一般には少なくとも約95、96、97、98、99若しくは100%の同一性を有する。例えば、同一でないヌクレオチドは、多くても3、2又は1つであり得る。同一であることは、これらの蛍光カセット特異的部分にとって最も確実であり得るが、それは必須ではなく、そのためより柔軟性があるオリゴヌクレオチド設計が可能になる。
一群の蛍光カセット特異的部分又はタグ配列若しくは配列は、一般に異なる群のものと著しく異なり、従って当業者にとって明らかになるように、一方の群の蛍光カセット特異的部分と別の群の蛍光カセット特異的部分の相補部の間に関連するハイブリダイゼーションは実質的にない。
アクセプター領域に加えて、アクセプター部分標識カセットオリゴヌクレオチドは、対応する蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、蛍光消光した対を形成することができ、蛍光消光した対はTm Aを有する。
一般に、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドは、標的配列特異的部分を含まず、即ち第1オリゴヌクレオチドプライマー(単数)又はプライマー(複数)の標的特異的部分がハイブリダイズしようとする標的ポリヌクレオチドに(プライマー伸長反応のTaで)ハイブリダイズする配列を含まない。従って、そのような構成において、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドは、特定の標的配列に拘束されないが、(適当なオリゴヌクレオチドプライマーの組で)任意の標的配列から生じるプライマー伸長産物の検出に使用できる。蛍光標識カセットオリゴヌクレオチド(及び対応するアクセプター/消光物質標識カセットオリゴヌクレオチド)は、(標的特異的)「アッセイ」混合物と一緒に使用される「マスター」アッセイ混合物に含まれてもよい。一般に、アクセプター/ドナー標識カセットオリゴヌクレオチドは、標的配列特異的部分も含まない。
一般に、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドは、蛍光部分(ドナー部分)及び第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイゼーションできる配列からなる。一般に、アクセプター/消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドは、アクセプター/消光物質部分及び蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの蛍光カセット特異的部分にハイブリダイゼーションできる配列からなる。
蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとアクセプター(消光物質)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとの間の相互作用が、蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドと、関連する群の各プライマーの組のフォワードオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流の蛍光カセット特異的部分に相補的な伸張産物との間の相互作用より不安定になることが好ましい場合がある。そのような構成は、異常なシグナルの生成を回避することと、プライマー伸長反応を効率的に進行できるようにすることとの最適な兼ね合いを実現するのに有用になり得る。従って蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとアクセプター(消光物質)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのTmは、蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドと、関連する群の各プライマーの組のフォワードオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流の蛍光カセット特異的部分に相補的な伸張産物とのハイブリダイゼーションのTm Tm C(又はTms; Tm Cs)より低くてもよい。従って、プライマー伸長反応のTaは、蛍光消光した対(単数)若しくは対(複数)のTm A又はTm Asより低く、同様に、Tm C又はTm Cs(即ち、蛍光標識オリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物とのハイブリダイゼーションが形成される)より低く(例えば約1〜10℃低く)てもよい。
各プライマーの組について(必ずしも必要でないが)異なるTm Cがあってもよく、(プライマーの組の)各群に関連する複数のTm Cs並びに異なる群に関連する複数のTm Csがあってもよいことに留意されたい。一般に、(プライマーの組の)特定の群に関連するTm Csは、関連する蛍光カセットの組のTm Aより高い。一般に、特定のプライマー伸長反応における全てのTm Asは、その反応のTaより高い。一般に、特定のプライマー伸長反応のTm Csの全ては、互いにおよそ10、より一般には5、4、3、2又は1℃の範囲内にある。一般に、特定のプライマー伸長反応のTm Asの全ては、互いにおよそ10、より一般には5、4、3、2又は1℃の範囲内にある。
一例(例えば蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドが標的特異的な配列を含まない)において、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドは、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドより1〜5ヌクレオチド塩基短い。一般に、(消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドに対して)対になっていない蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの部分は、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの3'末端又は消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドの5'末端の「反対側」にある。相補部が蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする関連するオリゴヌクレオチドプライマー(単数)[又はプライマー(複数)]の部分は、例えば一般にオリゴヌクレオチドプライマー及び蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの5'末端に任意の長さの差異を持ち、一般に、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの長さの約5ヌクレオチドの範囲内(例えば、5、4、3、2又は1ヌクレオチド短く;5、4、3、2又は1ヌクレオチド長く;例えば同じ長さ)である。プライマー伸長反応のその後の回において、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチド自体が、プライマーとして機能することができるので、プライマー伸長の間に形成される相補部は、通常蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの5'末端にまで伸長する。従って、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする相補部の部分は、一般に消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドの長さである。
他の例において、別法として又は加えて、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドと蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの間には、関連するオリゴヌクレオチドプライマー(単数)[又はプライマー(複数)]に対する相補部と蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドとの間より多くの(又はより著しい)ミスマッチがあってもよい。当業者にとって周知の通り、オリゴヌクレオチド対の中のミスマッチの位置及びミスマッチの性質(例えばA:T対合が壊されるのか又はG:C対合かどうか)は、安定性の変化/Tmの変化に対するミスマッチの重要性に影響する。
更に他の例において、別法として又は加えて、プライマー伸長反応混合物に使用される(それ故プライマーに対する相補部に組み込まれる)ヌクレオチド/塩基と比較して異なるそれらを消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドに使用し、それにより、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドと蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物の間のハイブリダイゼーションの相対的な安定性を改変することができる。一般に、「標準的でない」塩基(単数)又は塩基(複数)が、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドに使用でき、「標準的な」塩基がプライマー伸長混合物に使用できるが、他の構成も可能であり、そのことは当業者には明らかであろう。
異なる構成において、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドが、「タグ」配列だけでなく検出しようとする標的核酸に相補的な配列(後に記載する「直接」実施形態を参照のこと)も含む場合、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドが「タグ」配列を有するが、検出しようとする標的核酸に相補的な配列を持たない場合より、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドと伸張産物の間の相補性がかなり長い領域になることはいうまでもない。この構成において、減少する蛍光消光した対のTm Aから得られる利点は少ないと考えられる。従って、例えば、アクセプター標識カセットオリゴヌクレオチド中の「タグ」に対応する領域が、発蛍光団標識カセットオリゴヌクレオチド中の「タグ」と比較してより短い又はミスマッチ若しくは異なる塩基組成物を有することの特定の利益は得られないと考えられる。この構成(以下で「直接」構成と称する)は、潜在的に有用であると考えられるが、少なくとも異なる蛍光/ドナー標識オリゴヌクレオチドが、検出しようとする各標的配列に対して一般に必要とされることを意味し、一方で、標的特異的な配列(例えばプライマー伸長反応のTaでハイブリダイズできる)がないこれまでの(「間接」)構成では、検出しようとする各標的配列(数百又は数千の可能性があり得る)に対して異なる蛍光/ドナー標識オリゴヌクレオチド(又はアクセプター/消光物質標識オリゴヌクレオチド)を合成する必要がないことに留意されたい。所与のプライマー伸長反応において、特定のプライマー伸長反応で分析される各標的配列(例えば以下で更に検討されるように、2、3、4又は5つ)に対して異なる蛍光/ドナー標識オリゴヌクレオチドが一般に必要とされるが、同じ集合の蛍光カセットオリゴヌクレオチドを任意の標的配列と共に潜在的に使用することができる。
オリゴヌクレオチド及びアッセイ自体の性質によって(例えば「直接」又は「間接」構成が使用されるかどうかにかかわらず)、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの少なくとも「タグ」領域は、プライマー伸長産物の領域にハイブリダイズすることができる。例えば、アッセイがSNP遺伝子型判定アッセイであり、例えば汎用(「間接」)カセットレポーティングシステムが利用される場合、タグ領域はストリンジェントな条件下でプライマー伸長産物のタグ領域にハイブリダイズする。
上記のように、例においてアクセプター部分標識カセットオリゴヌクレオチド中のハイブリダイズしている領域は、伸張産物にハイブリダイズする発蛍光団標識カセットオリゴヌクレオチド中の配列より短くてよく(例えば1〜5ヌクレオチド短い)、又はミスマッチ若しくは異なる型の塩基を有してもよく、それによりカセットオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションのTm Aは、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドと伸張産物(単数)[又は伸張産物(複数)]の間のハイブリダイゼーションのTm C(又はTm Cs)より低くなる。
適切な蛍光エネルギードナー及びエネルギーアクセプター部分が互いに近接近するとき、蛍光エネルギー移動が起こる。ドナーによって吸収された励起エネルギーは、アクセプターへ移動され、次いでアクセプターが発蛍光団の場合には蛍光放射又は消光物質の場合には非蛍光手段かいずれかによりこのエネルギーを更に放散することができる。励起された発蛍光団から対の他のメンバーへとエネルギー移動できるように、ドナー-アクセプター対は重なり合うスペクトルを有する蛍光基と蛍光修飾基の2つを含み、ドナー(蛍光基)の放射はアクセプター(蛍光修飾)の吸収と重なる。従って、本発明の標識オリゴヌクレオチド対(蛍光カセットオリゴヌクレオチドの組)は、蛍光エネルギードナー、即ちドナー、が配置される発蛍光団領域及び蛍光エネルギーアクセプター、即ちアクセプター、が配置されるアクセプター領域を持つ第2オリゴヌクレオチドを別々のオリゴヌクレオチド上に含む核酸検出器である。上述の通り、ドナーオリゴヌクレオチドは、ドナー発蛍光団を含む。ドナー発蛍光団は、核酸検出器のどこに配置されてもよいが、一般にオリゴヌクレオチドの5'末端に存在する。
アクセプター領域は、蛍光エネルギーアクセプターを含む。アクセプターは、アクセプター領域のどこに配置されてもよいが、一般にオリゴヌクレオチドの3'末端に存在する。
本発明において、一対の標識オリゴヌクレオチドにおいて、カセットオリゴヌクレオチドのそれぞれは、1つ以上の標識、例えば、1、2又は3つの標識を含有することができる。一方又は両方のカセットオリゴヌクレオチドが好ましくは単一の標識を含有し、より好ましくは両方のオリゴヌクレオチドが単一の標識を含有する。
例えば好ましくは、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5'末端に又はその中に標識を含有し、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3'末端に又はその中に標識を含有する。
標識オリゴヌクレオチド対の発蛍光団は、類似の化学族又はシアニン色素若しくはキサンテン等など異なる族からになるように選択することができる。対象の発蛍光団には、それだけには限らないが、フルオレセイン色素[例えば5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',4',1,4-テトラクロロフルオレセイン(TET)、2',4',5',7',1,4-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、及び2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(Joe)]、Cy5などのシアニン色素、ダンシル誘導体、ローダミン色素[例えばテトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)及びテトラプロパノ-6-カルボキシローダミン(ROX)]、DABSYL、DABCYL、Cy3などのシアニン、アントラキノン、ニトロチアゾール、及びニトロイミダゾール化合物、又は他の非インターカレーション色素がある。対象の発蛍光団は、国際公開第01/42505号パンフレット及び国際公開第01/86001号パンフレットに更に記載されている。
2つ以上のプライマー群(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個)、従っていくつかのカセットオリゴヌクレオチドの組が使用される場合、発蛍光団基は、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個(又はより多く)のカセットオリゴヌクレオチドの組のそれぞれに対して、一般に異なることができる。満足な様式で対になった発蛍光団基の蛍光をモジュレートできる限り、アクセプター(例えば消光物質)基は同じでも異なっていてもよい。一般に、1、2、3又は4つの異なるプライマー群(そのそれぞれは、1つ以上のプライマーの組、一般に1つのプライマーの組を有することができる)、従って1、2、3又は4つのカセットオリゴヌクレオチドの組は、単一の反応チューブ内で使用することができる。限定要因は、区別することが可能な異なるスペクトルの数であり得、それは利用可能な蛍光生成/測定装置の特徴によって決まり得る。発蛍光団及びアクセプター/消光物質の適合する組を選ぶ際に考慮すべき点は、当業者に公知であろう。
本発明の方法において、プライマー伸長反応に利用されるポリメラーゼは、少なくとも1つのファミリーAを含み、用語「ファミリーA」及び「ファミリーB」は、Braithwaite及びIto、Nucleic Acids Res. (1993) 21:787〜802頁に報告されている分類スキームに対応する。対象のファミリーAポリメラーゼには、天然に存在するポリメラーゼ(Taq)並びにその誘導体及び相同物を含めたKlentaq(Proc. Natl. Acad. Sci USA (1994) 91:2216〜2220頁に記載の通り)などのサーマスアクアチクス(Thermus aquaticus)ポリメラーゼ;天然に存在するポリメラーゼ(Tth)並びにその誘導体及び相同物を含めたサーマスサーモフィルス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼ等がある。本発明に使用するポリメラーゼは、精製した又は精製していない形態で使用することができる。一般に、ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を欠いている。当業者にとって明らかになるように、これは、例えばSNP型検査アッセイにおいてより良好な特異性をもたらすことができる。
本方法の第1工程において作製される反応混合物の別の成分は、鋳型核酸である。鋳型としての機能を果たす核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよく、核酸は、一般にデオキシリボ核酸(DNA)である。鋳型核酸の長さは、20bp程度に短くてもよいが、通常は少なくとも約50若しくは100bpの長さ、より通常には少なくとも約150bpの長さであってもよく、1,000若しくは10,000bp程度又はより長く、例えばゲノムDNA抽出物、その消化物又は粗溶解物等を含む長さ50,000bp若しくはより長くてもよい。核酸は、溶液中で自由であり、一方又は両方の末端で非鋳型核酸と隣接し、例えばプラスミド等のベクター中に存在することができ、唯一の基準は核酸がプライマー伸長反応に関与できるということである。鋳型核酸は、精製した形態で、又は他の非鋳型核酸との複合混合物、例えば細胞DNA調製物等の中に存在することができる。
鋳型核酸は、PCRが実行される用途に応じて様々な異なる供給源から得ることができ、そのような供給源には、核酸を含む生物、即ちウイルス;原核生物、例えば細菌、古細菌及びシアノバクテリア;並びに真核生物、例えば鞭毛虫、アメーバ及びその同系統、アメーバ様寄生虫、繊毛虫等などの原生生物界のメンバー;粘菌類、真正粘菌類、細胞性粘菌類、水生菌類、真性菌類、接合菌類、子嚢菌類、ホウキタケ類、不完全菌類等などの菌界のメンバー;藻、コケ、苔類、マツモ、クラブモス、トクサ、シダ、裸子植物及び顕花植物、単子葉植物と双子葉植物の両方などの植物;並びに海綿、刺胞動物門のメンバー、例えばクラゲ、珊瑚等、有櫛動物、毛虫、ワムシ、回虫、環形動物、軟体動物、節足動物、棘皮動物、キボシムシ、並びに爬虫類、魚、トリ、ヘビを含めた脊椎動物、及び哺乳動物、例えば齧歯類、ヒトを含めた霊長類を含めた動物がある。鋳型核酸は、天然に存在する供給源から、例えば粗溶解物として直接使用することができ、及び/又は当技術分野で公知のいくつかの異なる方法で前処理することもできる。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、合成の供給源に由来するものでもよい。
対象の方法の第1工程において作製される反応混合物の成分は、プライマー伸長反応に利用されるプライマー、例えばPCRプライマー(幾何級数的増幅に利用されるフォワード及びリバースプライマーなど)である。既に示した通り、1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を使用することができ、各群は1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含む。各組は、フォワード及びリバースプライマーを一般に有することができる。上記したように、一般に、1、2、3、4つ又はより多くのプライマーの群を使用することができる。各群は、(例えば、2つ別々のプライマーの組から生じる混合した増幅産物を測定することが望まれる理由がない限り)1つのプライマーの組を一般に含むことができる。SNP遺伝子型判定反応の場合、各プライマー伸長反応混合物は、少なくとも1つのフォワードプライマー、通常は2つ又は3つのフォワードプライマー、より通常には5つ又は7つのフォワードプライマーを一般に含む。各フォワードプライマーに対応するリバースプライマーも存在できるが、例えばSNP遺伝子型判定反応において、これらは異ならなくてもよく、共通のリバースプライマーをいくつかの異なるフォワードプライマーと共に使用することができる。プライマー伸長反応混合物は、蛍光標識(ドナー)プライマー及び相補的なアクセプター、消光物質標識オリゴヌクレオチド(例えば、消光物質が3'末端に配置され、オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能することを妨げるので、プライマーとして作用することが一般にできない)を少なくとも含む。
より通常には、例えば指数関数的増幅の場合、一般に、プライマー伸長混合物は、蛍光/ドナー標識プライマー及び相補的なアクセプター/消光物質標識オリゴヌクレオチド並びに未標識リバースプライマーを少なくとも含むことができ、オリゴヌクレオチド若しくはプライマーの1つ又はいずれも、少なくとも1つの修飾された基、例えばホスホロチオエートを含有することができる。最も通常には、汎用レポータシステムを使用する指数関数的増幅の場合に、プライマー伸長混合物は、蛍光アクセプター標識プライマー及び相補的なドナー、消光物質標識オリゴヌクレオチド、未標識リバースプライマー及び未標識タグ付けフォワードプライマーを少なくとも含む。プライマーは、長さ少なくとも15bp、例えば長さ少なくとも20bp又は22bpであることができる。プライマーは、長さ30bp又はより長くてもよく、例えば、プライマーの長さは、長さ約20〜35bpなど長さ18〜60bpであることができる。一般に、タグ付けされたプライマーは、蛍光カセットオリゴヌクレオチド(一般に、プライマー伸長反応のTaで相補部にハイブリダイズするのに十分長いタグ配列;及び更にプライマー伸長反応のTaで相補部にハイブリダイズするのに十分長くなければならない標的配列特異的部分を含有することが必要になるので)、又はリバースプライマー(一般にタグがない)より長くなる。
プライマー伸長反応において(それ故、プライマー伸長反応開始前の反応混合物において)発蛍光団標識カセットオリゴヌクレオチドと比較してアクセプター標識カセットオリゴヌクレオチドが過剰になることが望ましくなり得る。カセットオリゴヌクレオチドの組における少なくとも1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1又は5:1、例えば1:1〜10:1若しくは15:1、例えば1.5:1〜5:1の発蛍光団標識カセットオリゴヌクレオチドに対するアクセプター標識の比率は、実現すべきシグナルを最適化する及び/又は「鋳型なし対照」(NTC)に生じるシグナルを最小化するのに有用になり得る。
本明細書では「核酸」は、DNA、RNA、一本鎖又は二本鎖のいずれか及びその任意の化学修飾も意味する。修飾には、それだけには限らないが、核酸に追加の電荷、分極、水素結合、静電相互作用及び機能を組み込む他の化学基をもたらすものがある。そのような修飾には、それだけには限らないが、2位での糖修飾、5位でのピリミジン修飾、8位でのプリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモ又は5-ヨードウラシルの置換;骨格修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等などの通常でない塩基対合の組合せがある。修飾は、キャップ形成など3'及び5'修飾を含むこともできる。
本明細書では「相補的」とは、DNAの相補鎖又はDNAとRNAが接合している混成分子を接続する、水素結合によってピリミジンに連結されたプリンからなる窒素含有塩基の対のことを指す。
本明細書では「蛍光基」とは、選択された波長を有する光で励起されたときに、異なる波長の光を放射する分子のことを指す。蛍光基は、「発蛍光団」と呼ばれることもある。
本明細書では、「蛍光修飾基」とは、蛍光基からの蛍光放射を何らかの方法で改変することができる分子のことを指す。通常、蛍光修飾基は、エネルギー移動機序によってこれを達成する。蛍光修飾基の同一性により、蛍光放射は、減弱、完全な消光、増強、波長のシフト、極性のシフト、蛍光寿命の変化を含むがこれに限定されない、いくつかの変更を受け得る。蛍光修飾基の一例は、消光基である。
本明細書では「エネルギー移動」とは、蛍光基の蛍光放射が蛍光修飾基によって変化する過程のことを指す。次いで、蛍光修飾基が消光基である場合、蛍光基からの蛍光放射は減弱される(消光される)。エネルギー移動は、蛍光共鳴エネルギー移動又は直接エネルギー移動によって起こり得る。これら2つの場合の厳密なエネルギー移動機序は、異なっている。本適用においてエネルギー移動へのいかなる言及も、機構的に異なるこれら現象の全てを包含することを理解すべきである。エネルギー移動は、本明細書では蛍光エネルギー移動又はFETとも称する。
本明細書では「エネルギー移動対」とは、エネルギー移動に関与する任意の2つの分子のことを指す。一般に、分子の一方は蛍光基として機能し、他方は蛍光修飾基として機能する。そのような対は、例えば、互いに異なることができる2つの蛍光基、並びに1つの消光基、2つの消光基及び1つの蛍光基、又は複数の蛍光基及び複数の消光基を含むことができる。複数の蛍光基及び/又は複数の消光基がある場合、個々の蛍光及び/又は消光基は、互いに異なることができる。本発明の好ましいエネルギー移動対は、蛍光基及び消光基を含む。いくつかの場合において、蛍光基と蛍光修飾基との差異は、不明瞭であり得る。例えば、特定の状況下で、隣接する2つのフルオレセイン基は、直接エネルギー移動によって互いの蛍光放射を消光することができる。この理由により、この用途においてエネルギー移動対の個々のメンバーの同一性に関して制限はない。個々のメンバー間の距離がいくつかの重要な量によって改変される場合、必要なのは、エネルギー移動対の分光学的特性が全体としていくつかの測定可能な方法に変化することだけである。
本明細書では「プライマー」とは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が起こり得る条件下に配置された場合に、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドのことを指す。従って、プライマーとして作用できるオリゴヌクレオチドは、3'OH基を一般に有することができる。
本明細書では、「消光基」とは、蛍光基によって放射される光を少なくとも部分的に減弱することができる任意の蛍光修飾基のことを指す。本明細書においてこの減弱のことを「消光」と称する。それ故、消光基の存在下における蛍光基の照明は、期待される程強くない、又は更に放射シグナルは完全になくなる。消光は、蛍光基と消光基の間のエネルギー移動によって起こる。
本明細書では「蛍光共鳴エネルギー移動」又は「FRET」とは、励起された蛍光基によって放射される光が蛍光修飾基によって少なくとも部分的に吸収されるエネルギー移動現象のことを指す。蛍光修飾基が消光基である場合、その基は、吸収した光を異なる波長の光として放射することができるか又は熱として放散することができるかいずれかである。FRETは、蛍光基の放射スペクトルと消光基の吸収スペクトルとの重なりに左右される。FRETは、消光基と蛍光基との距離にも左右される。特定の臨界距離を超えると、消光基は蛍光基によって放射される光を吸収することができない、又は十分に吸収することができない。
本明細書では「テイルドプライマー」とは、少なくとも2つの領域を含有するオリゴヌクレオチドのことを指し、一方が対象の標的核酸、例えばDNAに特異的、即ち前記標的核酸にハイブリダイズ可能であり、他方の配列(一般に標的特異的な配列の5')は「タグ」配列の相補部を含む伸張産物を生産するための鋳型としての機能を果たす。次いで「タグ」配列の相補部は、例えば、対応する蛍光標識カセットオリゴヌクレオチド(「タグ」部分以外のどんな配列も欠くことができる)の「タグ」部分に結合することができる。タグ付けされたプライマーは、上記の2つの領域及び/又はタグの間のリンカーなど追加の領域を含むこともできる。
本明細書では「直接エネルギー移動」とは、蛍光基と蛍光修飾基の間に光子の通過が起こらないエネルギー移動機序のことを指す。1つの機序に束縛されるものではないが、直接エネルギー移動において、蛍光基と蛍光修飾基は、互いの電子構造に干渉すると考えられている。蛍光修飾基が消光基である場合、消光基は蛍光基が光を放射するのを妨げる。
一般に、直接エネルギー移動による消光は、FRETによる消光より効果的である。実際、(蛍光基との必要なスペクトルの重なりがないので)FRETによって特定の蛍光基を消光しないいくつかの消光基も、直接エネルギー移動によって効率的に消光する。更に、蛍光基が他の蛍光基と十分近くて直接エネルギー移動を誘発する場合、いくつかの蛍光基は、消光基自体として作用することができる。例えば、これらの条件下で、隣接する2つのフルオレセイン基は、互いの蛍光を効果的に消光することができる。これらの理由により、この発明の実行に有用な蛍光基及び消光基の性質に制限はない。
「ハイブリダイゼーション」又は別のヌクレオチド配列に「ハイブリダイズする」オリゴヌクレオチド及び/又はプライマーの能力に言及する場合、そのようなハイブリダイゼーションが、オリゴヌクレオチド及び/又はプライマーが利用される鋳型伸張反応、例えばPCR反応における一般的な条件下で起こり得ることは当業者には理解されよう。
本発明は、プライマー伸長産物の検出方法に使用するのに適したキットであって、前記工程が、
a)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群の工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
によって特徴づけられ、
特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、
工程と、
b)2つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組の工程であって、各組が
i)蛍光部分(ドナー部分)で標識され、所与のオリゴヌクレオチドプライマーの群内における任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイゼーションできる配列を有する第1カセットオリゴヌクレオチドと、
ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
によって特徴づけられ、
カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、蛍光消光した対がTm Aを有し、
蛍光消光した対のTm Asのそれぞれが、キットのオリゴヌクレオチドを使用するプライマー伸長反応のTaとして使用するのに適した温度より高い、例えば46〜65℃、例えば50〜60℃の温度より高い、
工程とを含む、キットも提供する。
第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に未標識でもよい。蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドは、標的特異的配列を一般に含まない。蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとアクセプター(消光物質)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのTm Aは、蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドと関連する群の各プライマーの組のフォワードオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流の蛍光カセット特異的部分に相補的な伸張産物とのハイブリダイゼーションのTm Tm C(又は、Tms; Tm Cs)より低くてもよい。消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドは、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドより1〜5ヌクレオチド塩基短くてもよい。
オリゴヌクレオチド及びプライマー伸長反応の更なる選好は、上記の通りである。
本発明によるキットは、ポリメラーゼ及び/又は例えばマグネシウム塩に由来する二価陽イオン、デオキシリボヌクレオチド5'三リン酸(dNTP)、緩衝剤等など、プライマー伸長反応に使用するのに適した他の成分を含有することもできる。
キットは、第1容器に1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を含むことができ、任意選択で、第1容器は、緩衝液、熱安定性DNAポリメラーゼなどプライマー伸長反応を実行するための他の成分を含み、任意選択で第1カセットオリゴヌクレオチドは、標的特異的部分を含まず;別々の更なる容器(単数)又は容器(複数)に1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を含む。
本発明の更なる態様は、プライマー伸長産物の検出方法であって:
a)1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1標識オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
によって特徴づけられ、
特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、工程と、
b)1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程であって、各組が、
i) プライマー群の第1標識オリゴヌクレオチドプライマー(単数)又はプライマー(複数)[フォワードプライマー(単数)又はプライマー(複数)]である蛍光部分(ドナー部分)で標識される第1カセットオリゴヌクレオチド(単数)又はオリゴヌクレオチド(複数)と、
ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
によって特徴づけられ、
カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、
蛍光消光した対がTm Aを有する、工程と、
c)プライマー伸長反応を開始し、それによって(関連する標的ポリヌクレオチドが存在する場合に)関連する第1オリゴヌクレオチドプライマーに対する相補配列を生成し、それにより関連する第2(アクセプター、例えば消光物質、標識される)カセットオリゴヌクレオチドが、関連する第1(蛍光標識される)カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる程度が低くなり、それによってシグナルが生成される工程と、
d)生成されるシグナルを検出する工程と
を含み、
プライマー伸長反応が、少なくとも一部には1つ以上の蛍光消光した対に対するTm A又はTm Asより低いTaで実行される方法を提供する。
これは、「直接」検出法を決定することができる。
本発明の方法又はキットは、様々な状況、例えば対立遺伝子特異的なPCRに基づくSNP遺伝子型判定、遺伝子発現研究又はコピー数変異研究に使用するのに有用であると考えられる。
本発明の使用例は、以下を含む。
PCR産物の直接(リアルタイム)検出:
この実施形態は、蛍光標識テイルドオリゴヌクレオチドプライマーを利用してPCR過程を開始し、蛍光を生成する。従って、第1オリゴヌクレオチドプライマー及び蛍光部分で標識した対応する第1カセットオリゴヌクレオチドは、一般に同じ実体である。このプライマーは、対象(標的ポリヌクレオチド)の鋳型領域に対して作られており、従って反応の特異性を引き起こす。本発明の相補的な消光物質標識オリゴヌクレオチドも使用される。消光物質標識オリゴヌクレオチドの長さは、反応のTaより高いTmを与えるのに十分長いので、産物生成は、任意のリアルタイムPCR機器(ABI社7900 Prism機器など)によるPCR過程の各サイクルで、又は反応の終わりで評価することができる。
2つの標識オリゴヌクレオチド(消光物質及び蛍光標識テイルドプライマー)の相補性により、それらは互いにハイブリダイズする。発蛍光団がFAMの場合に、適切な波長、例えば488nmで励起したとき、このハイブリダイゼーションにより、消光物質標識が発蛍光団に極めて近接近し、それにより発蛍光団からの蛍光シグナルが全て消光される。
更に反応に含まれるものは、PCRプライマー対を形成するための従来通りのリバースプライマーである。次いでPCR過程が開始され、PCR産物が生成され始める。
PCR増幅及びPCRの形成の間に蛍光プライマーに対する相補配列が生成される。消光物質を欠いているこの増幅配列は、蛍光標識テイルドプライマーとの結合で消光物質オリゴヌクレオチドと競合する。それらの組み込まれた蛍光標識テイルドプライマーはもはや消光されず、生成されるPCR産物の量に正比例する蛍光シグナルを発生する。
PCR産物の間接(リアルタイム)検出
この実施形態は、従来通りの(未標識)オリゴヌクレオチド(プライマー)を利用してPCR過程を開始する。この従来通りのプライマーは、対象のアンプリコン領域に対して作られていないDNA配列でテイルされている。このタグ配列は、プライマーの5'部分に配置される。また、反応に含まれるものは、反応において生成される従来通りのプライマーのタグ配列領域の相補部にハイブリダイズできる、単一の蛍光標識オリゴヌクレオチドである。いくつかの適切な発蛍光団が存在し、普及している選択はFAM(フルオレセインの誘導体)である。最後に、反応に含まれるものは、FAM標識オリゴヌクレオチドに対してアンチセンスの3'消光物質標識オリゴヌクレオチドである。いくつかの適切な標識が存在するが、その中でもBlack Hole quencherシリーズの標識が普及している選択である。
消光物質オリゴヌクレオチドの長さは、反応のTaより高いTmを与えるのに十分長いので、産物生成は、任意のリアルタイムPCR機器(Roche社LC480又はABI社7900 Prism機器など)によるPCR過程の各サイクルで評価することができる。
2つの標識オリゴヌクレオチドの相補性により、それらは互いにハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションにより、消光物質標識が発蛍光団に極めて近接近し、それにより発蛍光団からの蛍光シグナルが全て消光される。次いでPCR過程が開始され、PCR産物が生成され始める。PCRの最初の数サイクルの後に、蛍光プライマーに対する相補配列が生成される。次いで、蛍光PCRプライマーはPCRの間に合成を開始することができ、それを開始する。蛍光オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用できることは必須でないが、蛍光オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用する場合、より多くのPCR産物が生成され得ると考えられており、それにより、より良好なシグナルを得ることができる。これは、蛍光分子を含有するアンプリコンを発生する。これが一旦起こると、PCR過程が二本鎖アンプリコンDNAを発生するので、消光オリゴは蛍光標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる程度が低くなる。消光オリゴヌクレオチドが蛍光標識オリゴヌクレオチドにもはやハイブリダイズしないので、次いで、生成されるPCR産物の量に正比例するシグナルが生成され、サイクル毎に測定することができる。
生成される尾部領域の相補配列が蛍光標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする限り、テイルドプライマーのタグ領域は、単一蛍光標識オリゴヌクレオチドと同一である必要はない。
PCR産物の間接(エンドポイント)検出-SNP遺伝子型判定:
図1に例示されるこの実施形態は、上記の通り同じ発蛍光団及び消光物質標識オリゴヌクレオチド対を利用する。
SNP遺伝子型判定は、少なくとも2つの標識オリゴヌクレオチド対、例えば2、3又は4つの対を利用し、各対は異なる発蛍光団を好ましくは含み、各発蛍光団、例えばFAMとHEXは、互いにスペクトル分解可能である。テイルドプライマー(上で示した通り、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドプライマーの群に対応している)は、固有の配列でテイルされており、プライマーのテイルされていない部分(通常、フォワードと言われる)は、対象のDNAに対して作られている。プライマーのこの部分において、それらは、例えば3'終端の塩基における単一ヌクレオチドだけが互いに異なり得る。各プライマーは、当業者に周知であるように、対象のDNA中にある多形塩基に対して作られている。プライマーが対象の標的配列と一致するとき、例えば3'塩基が完全に一致するときだけ合成を開始することにより、PCRが行なわれる。ミスマッチが起こる場合、合成は進行しない。
反応の間、テイルされていない(標的特異的)部分は、遺伝子型に応じて合成を開始することができる(又は異型接合体の場合、両方ができる)。これにより、PCR産物へプライマーの固有の蛍光テイル部分が組み込まれ、それにより、対応する蛍光オリゴヌクレオチドへの消光物質オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが妨げられる。従って、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのうちどちらが合成を開始したかに従ってシグナルが生成される。次いで、1つ以上の発蛍光団を組み込んでいる増幅産物を蛍光プレートリーダーで読み取ることができる。次いで、得られたデータをプロットすることができ、一方の発蛍光団の他方に対するクラスタープロットが生成される。次いでクラスタープロットに基づいて、得られた遺伝子型を決定することができる。
この明細書及び添付の請求項において、文脈に別段の明確な指示がない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。別段の規定がない限り、本明細書に使用される全ての専門及び科学用語は、この発明が属する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
値に範囲が与えられている場合、上下限の範囲に挟まれた各値、及び他の任意の記載されている又はその記載されている範囲に挟まれる値は、文脈に別段の明確な指図がない限り、下限の単位の10分の1まで本発明に包含されるものと理解される。これらのより狭い範囲の上下限は、それぞれ独立に範囲内に含まれてもよく、また本発明に包含され、記載されている範囲の特別に除外される任意の限度も対象になる。記載された範囲が、一方又は両方に限定を含む場合、それら含まれている限定のどちらか又は両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
本明細書で言及される全ての刊行物は、現在記載している発明に関連して使用できる刊行物に記載されている構成要素を記載し、開示する目的で可能な限り最大限を参照により本明細書に組み込む。
以下、本発明は、以下の実施例を参照することにより記載され、その実施例は例示目的であり、本発明の範囲を制限するものと解釈されない。
略語:
6FAM:6-カルボキシフルオレセイン
HEX:2',4',5',7',1,4-ヘキサクロロフルオレセイン
Dab:非蛍光性暗消光物質
*:ホスホロチオエート[ホスホロチオエート(又は、S-オリゴ)は、非架橋酸素の1つが硫黄によって置き換えられている正常DNAのバリアントである]の組み込み。
Tm:オリゴヌクレオチド融解温度
Ta:増幅反応のアニーリング温度
一連の5つの蛍光/消光物質カセットを使用して、非特異的増幅の対照におけるカセット融解温度の効果を実証した。これらの蛍光/消光物質カセットの配列を、以下に詳述する。
Figure 2016513451
蛍光/消光物質カセットへのホスホロチオエートの組み込みについては、特許出願PCT/GB2012/050645に記載されている。カセット5のいくつかのバリアントも、列挙した配列の代わりに使用できる。列挙した配列を置き換えるために使用できる配列バリアントの選択は、以下の通りである:
Figure 2016513451
(実施例1):蛍光/消光物質カセットの融解温度の決定
蛍光/消光物質カセットの融解温度を、実験的に決定した。カセット1〜5は、以下の最終濃度の構成要素を含有する反応混合物に組み込まれた:
1)0.1μM FAM標識オリゴヌクレオチド
2)0.1μM HEX標識オリゴヌクレオチド
3)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(FAM標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
4)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(HEX標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
5)8.5mM Tris/HCl pH 8.3
6)42.5mM KCl
7)1.8mM塩化マグネシウム
8)165.2μM dNTP
9)212.5nM 5-カルボキシ-X-ローダミン、SE(5-ROX、SE)
10)0.04% Igepal。
各カセットの融解温度は、DNAポリメラーゼの非存在下で決定した。各蛍光/消光物質カセットの融解曲線分析は、Roche社LightCycler 480機器によって、96ウェル白色プレートでウェル当たり10μLの反応混合物を使用して実施した。
融解曲線分析は、混合物を95℃に30秒間加熱した後に行った。融解曲線分析は、0.06℃/秒で40℃から95℃へと実施した。各カセットについて6回反復試験した。融解ピークは、LightCycler 480の分析機能(-dF/dt)によって、融解曲線データから生成した。手作業のTm選択を使用して逆融解ピークの最低点を同定することによって、Tmsを算出した(このソフトウェアを使用して、反転したピークの自動Tm算出ができないので、これが必要である)。各蛍光/消光物質カセットについて実験的に決定したTmsを、以下に記載する:
Figure 2016513451
Figure 2016513451
(実施例2)蛍光1の終点検出
カセット1とカセット5の間で直接比較を実施した。カセット1は、この増幅反応に使用したアニーリング温度より高い実験的に決定したTmを有する。カセット5は、増幅反応のアニーリング温度より低い実験的に決定したTmを有する(実施例1を参照のこと)。
全てのオリゴヌクレオチドは凍結乾燥されたものを購入し、10mM Tris/HCl pH 8.0に初濃度200μMとなるように再懸濁した。更なる希釈は全てこの希釈液で実施した。
増幅は、384ウェル黒色プレートで、反応容積4μLで実施した。1×反応混合物は、以下の成分を含有した:
1)0.16μM対立遺伝子特異的プライマー1
2)0.16μM対立遺伝子特異的プライマー2
3)0.41μMリバース(共通)プライマー
4)0.1μM FAM標識オリゴヌクレオチド
5)0.1μM HEX標識オリゴヌクレオチド
6)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(FAM標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
7)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(HEX標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
8)8.5mM Tris/HCl pH 8.3
9)42.5mM KCl
10)1.8mM塩化マグネシウム
11)165.2μM dNTP
12)212.5nM 5-カルボキシ-X-ローダミン、SE(5-ROX、SE)
13)0.04% Igepal
列挙した構成要素に加えて、各混合物は、2〜50μL/mLのエキソヌクレアーゼ活性を持たないN末端切断ポリメラーゼ酵素を含有するべきである。酵素がエキソヌクレアーゼ活性を持たないことは必須ではないが、特にSNP分析の場合には好ましい。
使用したアッセイ特異的プライマーは、以下の通りである:
Figure 2016513451
オリゴヌクレオチドへのホスホロチオエートの付加の使用については、特許出願PCT/GB2012/050645に記載されている。ホスホロチオエート標識アッセイプライマーを使用することもできる。上で列挙した配列と交換できる代わりのプライマーの例は、以下の通りである:
Figure 2016513451
増幅反応は、水浴型のHydrocycler PCR機械で実施した。増幅条件は以下の通りであった:
94℃で15分間(ホットスタート活性化)
以下を60サイクル:
94℃で20秒間
57℃で60秒間(即ち57℃のTa)
反応の完了後に、BMG社Pherastar蛍光プレートリーダーによって終点蛍光を室温で読み取った。
図2は、上述したプライマー対を使用して生成できる3つの対立遺伝子それぞれの例データを提供する。図は、3つの遺伝子型クラスターのそれぞれの位置と比較して鋳型なし対照(NTC)サンプル(丸で囲んだ)のものも示す。示した例において、Tmが増幅反応のTaより低い反応(左)からのNTCは、明らかに互いに異なり、非特異的増幅の証拠を提示する。Tmが増幅反応のTaより高いカセット1の例データ(右)は、この反応におけるNTCが、適切に増幅したサンプルのクラスターより低い蛍光で密に集まったままであることを示す。これは、非特異的産物が全く生成されなかったことを示す。
(実施例3)蛍光2の終点検出
カセット1とカセット5の間で直接比較を実施した。カセット1は、この増幅反応に使用したアニーリング温度より高い実験的に決定したTmを有する。カセット5は、増幅反応のアニーリング温度より低い実験的に決定したTmを有する(実施例1を参照のこと)。
全てのオリゴヌクレオチドは凍結乾燥されたものを購入し、10mM Tris/HCl pH 8.0に初濃度200μMとなるように再懸濁した。更なる希釈は全てこの希釈液で実施した。
増幅は、384ウェル黒色プレートで、反応容積4μLで実施した。1×反応混合物は、以下の成分を含有した:
1)0.16μM対立遺伝子特異的プライマー1
2)0.16μM対立遺伝子特異的プライマー2
3)0.41μMリバース(共通)プライマー
4)0.1μM FAM標識オリゴヌクレオチド
5)0.1μM HEX標識オリゴヌクレオチド
6)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(FAM標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
7)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(HEX標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
8)10mM Tris/HCl pH 8.3
9)10mM KCl
10)1.8mM塩化マグネシウム
11)165.2μM dNTP
12)212.5nM 5-カルボキシ-X-ローダミン、SE(5-ROX、SE)
列挙した構成要素に加えて、各混合物は、2〜50μL/mLのエキソヌクレアーゼ活性を持たないN末端切断ポリメラーゼ酵素を含有するべきである。
使用したアッセイ特異的プライマーは、以下の通りである:
Figure 2016513451
増幅反応は、Hydrocycler PCR機器で実施した。増幅条件は以下の通りであった:
94℃で15分間(ホットスタート活性化)
以下を10サイクル:
94℃で20秒間
61℃〜55℃のタッチダウンで60秒間(1サイクルにつき0.6℃)
以下を35サイクル:
94℃で20秒間
55℃で60秒間
反応の完了後に、BMG社Pherastar蛍光プレートリーダーで終点蛍光を室温で読み取った。
図3は、上述したプライマー対を使用して生成できる2つの対立遺伝子それぞれの例データを提示する。図は、2つの遺伝子型クラスターのそれぞれの位置と比較して鋳型なし対照(NTC)サンプル(丸で囲んだ)のものも示す。示した例において、Tmが増幅反応のTaより低い反応(左)からのNTCは、HEXプライマーを使用して増幅した産物のものより実質的に高いFAM蛍光及びFAMプライマーを使用して増幅した産物のものより実質的に高いHEX蛍光を有する。このデータは、非特異的増幅の証拠を提示する。Tmが増幅反応のTaより高いカセット1の例データ(右)は、この反応におけるNTCが図の下の左角の方へ密に集まったままであることを示す。これは、非特異的産物が、殆ど又は全く生成されなかったことを示す。
(実施例4)蛍光のリアルタイム検出
増幅反応をリアルタイム蛍光検出と組み合わせて実施して、蛍光/消光物質カセットの融解温度を高める効果を実証した。
全てのオリゴヌクレオチドは凍結乾燥されたものを購入し、10mM Tris/HCl pH 8.0に初濃度200μMとなるように再懸濁した。更なる希釈は全てこの希釈液で実施した。リアルタイム増幅は、96ウェル白色プレートで、反応容積10μLで実施した。1×反応混合物は、以下の成分を含有した:
14)0.16μM対立遺伝子特異的プライマー1
15)0.16μM対立遺伝子特異的プライマー2
16)0.41μMリバース(共通)プライマー
17)0.1μM FAM標識オリゴヌクレオチド
18)0.1μM HEX標識オリゴヌクレオチド
19)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(FAM標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
20)0.5μM消光物質標識オリゴヌクレオチド(HEX標識オリゴヌクレオチドに対するアンチセンス)
21)8.5mM Tris/HCl pH 8.3
22)42.5mM KCl
23)1.8mM塩化マグネシウム
24)165.2μM dNTP
25)212.5nM 5-カルボキシ-X-ローダミン、SE(5-ROX、SE)
26)0.04% Igepal
列挙した構成要素に加えて、各混合物は、2〜50μL/mLのエキソヌクレアーゼ活性を持たないN末端切断ポリメラーゼ酵素を含有するべきである。
使用したアッセイ特異的プライマーは、以下の通りである:
Figure 2016513451
記載した混合物のリアルタイム適用を、Roche社LightCycler 480リアルタイムPCR機器によって96ウェル白色プレートで試験した。2×アッセイ混合物5μLを、3〜4ng/μLの濃度に前もって希釈したヒトゲノムDNA 5μLに添加した。LC480 QPCRシールを使用してプレートを密閉した。以下のサイクル条件で、LC480リアルタイムPCR機械(Roche社)中でプレートを熱サイクルした;FAM及びHEX蛍光の変化を、全てのサイクルでリアルタイムに記録した。
94℃で15分間(ホットスタート活性化)
以下を60サイクル:
94℃で10秒間
57℃で60秒間(この温度でプレートを読み取る)
PCRを60サイクル行って、NTC増幅の減少に対するより高いTmの蛍光/消光物質カセットの効率を実証した。リアルタイム検出の結果を図4に示す。鋳型なし対照の結果を丸で囲む。蛍光-消光物質カセットのTmが増幅反応のTaより高いので、非特異的NTC産物のリアルタイム検出はリアルタイムに起こらない。

Claims (21)

  1. プライマー伸長産物の検出方法であって、
    a)1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
    i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
    ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
    によって特徴づけられ、
    特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
    同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、
    1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程と、
    b)1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程であって、各組が、
    i)蛍光部分(ドナー部分)で標識され、所与のオリゴヌクレオチドプライマーの群内における任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイゼーションできる配列を有する第1カセットオリゴヌクレオチドと、
    ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
    によって特徴づけられ、
    カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、
    蛍光消光した対がTm Aを有する、
    1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程と、
    c)プライマー伸長反応を開始する工程であって、それによって(関連する標的ポリヌクレオチドが存在する場合に)関連する第1オリゴヌクレオチドプライマーに対する相補配列を生成し、それにより関連する第2(アクセプター、例えば消光物質、標識される)カセットオリゴヌクレオチドが、関連する第1(蛍光標識される)カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる程度が低くなり、それによってシグナルが生成される、
    プライマー伸長反応を開始する工程と、
    d)生成されるシグナルを検出する工程と
    を含み、
    プライマー伸長反応が、少なくとも一部には1つ以上の蛍光消光した対に対するTm A又はTm Asより低いTaで実行される、方法。
  2. 蛍光消光した対(単数)又は対(複数)のTm(Tm A)が、プライマー伸長反応のTaより15℃まで、任意選択で1〜15℃;又は10℃まで、任意選択で1〜10℃の範囲で高い、請求項1に記載の方法。
  3. 非特異的増幅の検出を妨げる又は減少させる、請求項1又は2に記載の方法。
  4. シグナルがリアルタイムに測定される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. シグナルが反応の終了点で測定される、請求項1、2又は3のいずれか一項に記載の方法。
  6. 蛍光部分で標識される第1カセットオリゴヌクレオチドが、プライマー伸長反応におけるプライマーとして作用することができる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 蛍光部分で標識される第1カセットオリゴヌクレオチドが、プライマー伸長反応におけるプライマーとして作用することができない、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとアクセプター(消光物質)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドとの間の相互作用が、蛍光(ドナー)標識蛍光カセットオリゴヌクレオチドと、関連する群の各プライマーの組のフォワードオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流の蛍光カセット特異的部分に相補的な伸張産物との間の相互作用より不安定である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. アクセプター標識オリゴヌクレオチドが、対応する第1(蛍光標識される)カセットオリゴヌクレオチドより1〜5ヌクレオチド塩基短い、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 各オリゴヌクレオチドプライマーの群が、1つのオリゴヌクレオチドプライマーの組を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のオリゴヌクレオチドプライマーの群及び対応するカセットオリゴヌクレオチドの組がある、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. カセットオリゴヌクレオチドの一方又は両方が単一の標識を含有する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. カセットオリゴヌクレオチドの両方が単一の標識を含有する、請求項12に記載の方法。
  14. 蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの5'末端に又はその中に標識を含有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの3'末端に又はその中に標識を含有する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法又はキット。
  16. オリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、例えばカセットオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、任意選択で蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの塩基の少なくとも1つが、ホスホロチオエートである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. オリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、例えばカセットオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、任意選択で蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドの塩基の20〜80%が、ホスホロチオエートである、請求項16に記載の方法。
  18. プライマー伸長産物の検出方法に使用するのに適したキットであって、前記方法が、
    a)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群の工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
    i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
    ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
    によって特徴づけられ、
    特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
    同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、
    2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群の工程と、
    b)2つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組の工程であって、各組が
    i)蛍光部分(ドナー部分)で標識され、所与のオリゴヌクレオチドプライマーの群内における任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイゼーションできる配列を有する第1カセットオリゴヌクレオチドと、
    ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
    によって特徴づけられ、
    カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、
    蛍光消光した対がTm Aを有し、
    蛍光消光した対のTm Asのそれぞれが、キットのオリゴヌクレオチドを使用するプライマー伸長反応のTaとして使用するのに適した温度より高い、例えば46〜65℃、例えば50〜60℃の温度より高い、
    2つ以上のカセットオリゴヌクレオチドのの工程と
    を含む、キット。
  19. 第1オリゴヌクレオチドプライマーが未標識であり、消光物質標識カセットオリゴヌクレオチドが、蛍光標識カセットオリゴヌクレオチドより1〜5ヌクレオチド塩基短い、請求項18に記載のキット。
  20. プライマー伸長産物の検出方法であって、
    a)1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程であって、各群が1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含み、各組が
    i)標的特異的部分及び5'上流の蛍光カセット特異的部分を有する第1標識オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー)と、
    ii)標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマー(リバースプライマー)と
    によって特徴づけられ、
    特定の組におけるオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして、プライマー伸長産物、例えばPCR産物の形成を可能にするのにそれぞれ適しており、
    同じ群内の各組の第1オリゴヌクレオチドプライマーが、同じ群内の任意の組の第1オリゴヌクレオチドプライマーの蛍光カセット特異的部分の相補部にハイブリダイズできる蛍光カセット特異的部分を含有する、
    1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの群を用意する工程と、
    b)1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程であって、各組が、
    i)プライマー群の第1標識オリゴヌクレオチドプライマー(単数)又はプライマー(複数)[フォワードプライマー(単数)又はプライマー(複数)]である蛍光部分(ドナー部分)で標識される第1カセットオリゴヌクレオチド(単数)又はオリゴヌクレオチド(複数)と、
    ii)アクセプター部分(例えば消光物質部分)で標識される第2カセットオリゴヌクレオチドと
    によって特徴づけられ、
    カセットオリゴヌクレオチドの各組が、互いにハイブリダイして蛍光消光した対が形成され、蛍光消光した対がTm Aを有する、
    1つ以上のカセットオリゴヌクレオチドの組を用意する工程と、
    c)プライマー伸長反応を開始する工程であって、それによって(関連する標的ポリヌクレオチドが存在する場合に)関連する第1オリゴヌクレオチドプライマーに対する相補配列を生成し、それにより関連する第2(アクセプター、例えば消光物質、標識される)カセットオリゴヌクレオチドが、関連する第1(蛍光標識される)カセットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる程度が低くなり、それによってシグナルが生成される、
    プライマー伸長反応を開始する工程と、
    d)生成されるシグナルを検出する工程と
    を含み、
    プライマー伸長反応が、少なくとも一部には1つ以上の蛍光消光した対に対するTm A又はTm Asより低いTaで実行される、方法。
  21. 対立遺伝子特異的なPCRに基づくSNP遺伝子型判定、遺伝子発現研究又はコピー数変異研究において使用するための、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法又はキット。
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