BR112015021615B1 - Sistema de detecção de reação em cadeia da polimerase - Google Patents

Abstract

SISTEMA DE DETECÇÃO DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE. A presente invenção se refere a métodos e kits para a detecção de ácido nucleico em um sistema de ensaio.

Description

INTRODUÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a métodos e kits para a detecção de ácido nucleico em um sistema de ensaio.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método poderoso para a amplificação rápida de sequências de ácido nucleico alvo. A PCR tem facilitado o desenvolvimento da caracterização de genes, incluindo expressão e/ou regulação de genes, e tecnologias de clonagem molecular, incluindo o sequenciamento direto de DNA amplificado por PCR, a determinação da variação alélica, e a detecção de doenças infecciosas e distúrbios genéticos. A PCR é realizada por ciclos repetidos de desnaturação pelo calor de um molde de DNA que contém a sequência alvo, emparelhamento de iniciadores opostos às cadeias de DNA complementares, e extensão dos iniciadores emparelhados com uma DNA polimerase. Múltiplos ciclos de PCR resultam na amplificação da sequência de nucleotídeos delimitada pelos iniciadores de amplificação de flanqueamento. A incorporação de uma DNA polimerase termoestável ao protocolo de PCR evita a necessidade de adições repetidas de enzimas e permite elevadas temperaturas de extensão e hibridização de iniciador, as quais aumentam a especificidade de associações iniciador—molde. Polimerases termostáveis, tais como DNA-Taq polimerase, servem, portanto, para aumentar a especificidade e simplicidade da PCR.

[003] Em muitos amplificações baseadas em PCR, um sistema de produção de sinal é utilizado, por exemplo, para detectar a produção de produto amplificado. Um tipo de sistema de produção de sinal que é utilizado em reações baseadas em PCR é o sistema de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), na qual um detector de ácido nucleico inclui grupos de fluorescência de doador e receptor. Sistemas de rotulação FRET incluem uma série de vantagens em relação a outros sistemas de rotulagem, incluindo a capacidade de realizar ensaios homogêneos em que não é necessária uma etapa de separação de detectores de ácido nucleico rotulados ligado e não ligado. Um problema principal com muitas técnicas do estado da arte está relacionado com a síntese de oligonucleotídeos fluorescentes duplamente marcados. O pedido de Patente Europeu EP1726664 descreve um sistema de detecção que supera este problema, utilizando sequências de oligonucleotídeos unicamente marcadas, de diferentes temperaturas de fusão (Tm), que hibridizam uns com os outros em solução livre para formar um par de fluorescência bloqueada (cassete flúor/bloqueador), que após a introdução de uma sequência complementar a uma das sequências gera um sinal mensurável, uma das sequências sendo de uma Tm que é inferior à temperatura de emparelhamento (Ta) do processo de PCR. Neste sistema, uma das sequências de oligonucleotídeos unicamente marcadas é de preferência mais do que 10 bases mais longa do que a outra e mais preferencialmente pelo menos 15 bases mais longa.

[004] Em sistemas de detecção utilizando um detector de ácido nucleico marcado, a amplificação de alta fidelidade é crítica. Devido à natureza do processo de PCR e DNA Taq polimerase tais métodos podem sofrer reações secundárias alternativas à reação de polimerização desejada. Por exemplo, a PCR pode sofrer uma amplificação não específica quando a reação é montada à temperatura ambiente. Taq polimerase retém uma fração da sua atividade a todas as temperaturas e pode, portanto, estender iniciadores que não são complementarmente emparelhados, levando à formação de produtos indesejáveis. A região recém-sintetizada em seguida atua como um molde para uma maior extensão do iniciador e síntese de produtos de amplificação não desejados. No entanto, se a reação é aquecida a temperaturas de cerca de 50°C ou maior, antes de a polimerização começar, o rigor de emparelhamento de iniciador é aumentado, e a síntese de produtos de PCR indesejados é evitada ou reduzida.

[005] Dímero de iniciador é também uma reação secundária comum que afeta a PCR. A acumulação de dímeros de iniciadores ocorre devido à hibridização e extensão dos iniciadores entre si. Formação de dímeros de iniciadores resulta na depleção dos reagentes e, por conseguinte, na redução global de eficiência da PCR e/ou na produção de resultados falsos positivos.

[006] PCR de início quente é um método para reduzir a amplificação não específica e, portanto, limitar a formação de produtos PCR não específicos, incluindo dímeros de iniciadores. Muitas abordagens diferentes têm sido desenvolvidas para alcançar este objetivo; ver, por exemplo, Moretti, T. et al. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase. BioTechniques 25, 716-22 (1998) e Hot Start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance Nucleic Acids Res (2008) 36(20): e131. Tais métodos reduzem a extensão dos iniciadores seguindo hibridização não específica antes do início da PCR. No entanto, tais técnicas só conseguem alívio parcial de tais problemas, uma vez que eventos de falsa iniciação, incluindo a formação de dímeros de iniciadores pode ocorrer, embora em menor grau, durante a amplificação por PCR. A utilização de sondas de PCR para detectar a presença de uma sequência interna dos iniciadores de PCR ajuda a evitar a detecção de tais produtos não específicos, mas acrescenta um custo significativo ao processo uma vez que uma sonda específica é necessária para cada sequência individual a ser detectada. A análise genética de alto rendimento economicamente eficiente requer a utilização de um sistema de detecção universal, mas, em princípio, isso pode ser influenciado pela detecção de produtos de amplificação não específicos.

[007] Existe uma necessidade de sistemas de detecção específicos, confiáveis, de baixo custo e fáceis de sintetizar para uso na detecção de produtos de extensão de iniciadores, por exemplo, em ensaios de PCR homogêneos, que abordam os problemas encontrados nos sistemas de detecção para PCR existentes. O termo ensaio de PCR homogêneo é bem conhecido na técnica, e é aquele em que não é necessário separar fisicamente os componentes da reação uns dos outros, a fim de obter o resultado da reação. A presente invenção é baseada na descoberta de que a seleção dos comprimentos relativos de sequências de oligonucleotídeos marcados que hibridizam um com o outro para formar um par fluorescente bloqueado resulta em melhorias nos sistemas de ensaio de detecção de ácidos nucleicos, em particular quando usados em um cenário em tempo-real. Na invenção, a Tm do cassete flúor/bloqueador é projetada para estar acima da Ta de amplificação de tal modo que qualquer oligonucleotídeo fluorescente não incorporado é hibridizado com o oligonucleotídeo bloqueador à temperatura de aquisição de fluorescência, permitindo que a reação seja monitorada em tempo-real ou no final. Ao ajustar o comprimento e Tm do oligonucleotídeo bloqueador, seria de esperar que o aumento da estabilidade do cassete flúor/bloqueador simplesmente inibiria PCR. No entanto, é inesperadamente verificado que a especificidade de amplificação do iniciador fluorescente é melhorada, como mostrado pelo aumento significativo na diferença de valores Cq (também conhecidos como valores Ct) entre as amostras e controles sem molde em tempo-real, ou detecção reduzida de controles sem molde em aplicações de end-point.

RESUMO DA INVENÇÃO

[008] De acordo com a invenção, é proporcionado um método para a detecção de um produto de extensão do iniciador, o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar um ou mais grupos de iniciadores de oligonucleotídeos, cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeo, cada conjunto caracterizado por, i) um primeiro iniciador de oligonucleotídeo (iniciador direto) que tem uma porção específica para o alvo e uma porção fluorescente especifica para o cassete a montante de 5'; e ii) um segundo iniciador de oligonucleotídeo (iniciador reverso), que tem uma porção específica para o alvo, em que os oligonucleotídeos iniciadores num conjunto particular são adequados, respectivamente, para a hibridização em cadeias complementares de uma sequência de nucleotídeos alvo correspondente para permitir a formação de um produto de extensão de iniciador, por exemplo, um produto de PCR; e em que o primeiro iniciador de oligonucleotídeo de cada conjunto no mesmo grupo contém uma porção especifica para o cassete de fluorescência que é capaz de hibridizar com o complemento da porção especifica para o cassete de fluorescência do primeiro iniciador de oligonucleotídeo de qualquer conjunto no mesmo grupo, b) proporcionar um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos de cassetes, cada conjunto caracterizado por, i) um primeiro oligonucleotídeo de cassete marcado com uma porção fluorescente (porção doadora) e possuindo uma sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção especifica do cassete de fluorescência do primeiro iniciador de oligonucleotídeo de qualquer conjunto em um dado grupo de iniciador de oligonucleotídeo; e ii) um segundo oligonucleotídeo de cassete marcado com uma porção receptora (por exemplo, uma porção bloqueadora), em que cada conjunto de oligonucleotídeos de cassete hibridiza com o outro para formar um par fluorescente bloqueado, em que o par fluorescente bloqueado tem uma Tm A, c) iniciar a reação de extensão do iniciador gerando assim (se o polinucleotídeo alvo relevante está presente) uma sequência complementar ao primeiro iniciador de oligonucleotídeo relevante, de tal modo que o segundo oligonucleotídeo de cassete relevante (receptor, por exemplo, bloqueador, marcado) é menos capaz de hibridizar com o primeiro oligonucleotídeo de cassete relevante (marcado por fluorescência), pelo que é gerado um sinal; e d) detectar o sinal que é gerado, em que a reação de extensão do iniciador é efetuada, pelo menos em parte, a uma Ta que é menor do que a Tm A ou Tm As para um ou mais pares fluorescentes desativados. Kits adequados para utilização em tal método também são fornecidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] A Figura 1 é um esquema de reação simples para a detecção de uma sequência de DNA na genotipagem de SNP compreendendo um método da presente invenção.

[010] A Figura 2 mostra os dados gerados usando o ensaio descrito no Exemplo 2 abaixo. Exemplo de dados de genotipagem para produtos de amplificação de cassete flúor/bloqueador 5 (esquerdo) e cassete flúor/bloqueador 1 (direito). Os três grupos em cada um dos exemplos representam os três genótipos possíveis que podem ser detectados. Controles sem molde são representados em preto sólido e rodeados por motivos de clareza.

[011] A Figura 3 mostra os dados gerados usando o ensaio descrito no Exemplo 3 abaixo. Exemplo de dados de genotipagem para produtos de amplificação de cassete flúor/bloqueador 5 (esquerdo) e cassete flúor/bloqueador 1 (direito). Os dois grupos presentes em cada um dos exemplos representam os dois genótipos possíveis que podem ser detectados. Controles sem molde são representados em preto sólido e rodeados por motivos de clareza.

[012] A Figura 4 mostra os dados gerados usando o ensaio descrito no Exemplo 4 abaixo.

[013] Exemplo de dados de genotipagem de produtos de amplificação do cassete flúor/bloqueador 1 a 4. Em todos os casos, a amplificação específica de alelo é demonstrada na ausência de detecção de controle sem molde. Controles sem molde são representados em preto sólido e rodeados por motivos de clareza.

[014] A Figura 5 mostra exemplos esquemáticos de possíveis combinações de oligonucleotídeos para utilização na presente invenção. Os iniciadores reversos apresentados para analisar múltiplos alelos de um gene podem ser comuns, mas não precisam de ser.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] Um primeiro aspecto da invenção proporciona um método para a detecção de um produto de extensão de iniciador, o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar um ou mais grupos de iniciadores de oligonucleotídeos, cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeo, cada conjunto caracterizado por; i) um primeiro iniciador de oligonucleotídeo (iniciador direto) que tem uma porção específica de alvo e uma porção especifica para o cassete a montante de 5'; e ii) um segundo iniciador de oligonucleotídeo (iniciador reverso), que tem uma porção específica para o alvo, em que os iniciadores de oligonucleotídeos em um conjunto particular são adequados, respectivamente, para a hibridização em cadeias complementares de uma sequência de nucleotídeos alvo correspondente para permitir a formação de um produto de extensão de iniciador, por exemplo, um produto de PCR; e em que o primeiro iniciador de oligonucleotídeo de cada conjunto no mesmo grupo contém uma porção especifica para o cassete de fluorescência que é capaz de hibridizar com o complemento da porção especifica para o cassete de fluorescência do primeiro iniciador de oligonucleotídeo de qualquer conjunto no mesmo grupo, b)proporcionar um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos de cassetes, cada conjunto caracterizado por; i)um primeiro oligonucleotídeo de cassete marcado com uma porção fluorescente (porção doadora) e possuindo uma sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção especifica do cassete de fluorescência do primeiro iniciador de oligonucleotídeo de qualquer conjunto em um dado grupo de iniciador de oligonucleotídeo; e ii) um segundo oligonucleotídeo de cassete marcado com uma porção receptora (por exemplo, uma porção bloqueador), em que cada conjunto de oligonucleotídeos de cassete hibridiza com o outro para formar um par fluorescente bloqueado, em que o par fluorescente bloqueado tem uma Tm A, c) iniciar a reação de extensão do iniciador gerando assim (se o polinucleotídeo alvo relevante está presente) uma sequência complementar ao primeiro iniciador de oligonucleotídeo relevante, de tal modo que o segundo oligonucleotídeo de cassete relevante (receptor, por exemplo, bloqueador, marcado) é menos capaz de hibridizar com o primeiro oligonucleotídeo de cassete relevante (marcado por fluorescência), pelo que é gerado um sinal; e d) detectar o sinal que é gerado, em que a reação de extensão do iniciador é efetuada, pelo menos em parte, a uma Ta que é menor do que a Tm A ou Tm As para um ou mais pares fluorescentes desativados.

[016] O sinal pode ser medido em tempo-real. Em alternativa, o sinal pode ser medido no final da reação.

[017] O ou um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente pode ser capaz de atuar como um iniciador em uma reação de extensão de iniciador (por exemplo, pode ter um "grupo 3' OH). Alternativamente, o ou um primeiro oligonucleotídeo de cassete marcado com uma porção fluorescente pode não ser capaz de atuar como um iniciador na reação de extensão de iniciador (ou pode não importar se é ou não é capaz de atuar como um iniciador). Considera-se que, geralmente, mais produto de extensão de iniciador é formado, e, portanto, um melhor sinal é obtido, se o ou um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente é capaz de atuar como um iniciador na reação de extensão de iniciador. O oligonucleotídeo cassete marcado por fluorescência receptor/bloqueador pode, tipicamente, não ser capaz de atuar como um iniciador em uma reação de extensão de iniciador, por exemplo, porque o receptor/bloqueador pode impedir o oligonucleotídeo de atuar como um iniciador.

[018] A Tm de um oligonucleotídeo é a temperatura em °C, à qual 50% das moléculas de uma população de um oligonucleotídeo de cadeia simples são hibridizadas com a sua sequência complementar e 50% das moléculas na população estão não-hibridizadas com a referida sequência complementar. A Tm do par fluorescente bloqueado (por exemplo) pode ser medida empiricamente, por exemplo a Tm pode ser medida utilizando a análise de curva de fusão, por exemplo, utilizando um instrumento Roche LightCycler 480 em uma placa branca de 96 poços. A Tm pode, preferencialmente, ser medida utilizando os mesmos instrumentos que utilizada para realizar a reação de extensão do iniciador. A Tm dos pares fluorescentes bloqueados (cassetes) pode ser testada em tampão de reação padrão, na ausência de polimerase. Tampão de reação padrão está indicado nos Exemplos. Mais detalhes representativos são também proporcionados nos exemplos. Picos de fusão podem ser gerados a partir de dados da curva de fusão a partir da função de análise (- dF/dt) do LightCycler 480. Tms são calculadas usando uma opção de Tm manual para identificar o ponto mais baixo do pico de fusão reverso.

[019] Sempre que é feita referência a uma Tm de hibridização envolvendo parte de um oligonucleotídeo, a Tm considera-se relevante por ser a Tm que pode ser determinada por hibridização utilizando um oligonucleotídeo teste correspondente para a parte relevante do primeiro oligonucleotídeo.

[020] A Tm (Tm A) do par ou pares fluorescentes bloqueados é de preferência inferior ou igual a 15°C, por exemplo inferior ou igual a 10°C, acima da Ta de reação de extensão de iniciador, por exemplo, entre 1 e 15°C, tal como entre 1 e 10°C, acima da Ta de reação de extensão do iniciador. A Tm A ou Tm As devem ser selecionadas para serem suficientemente elevadas para impedir a detecção não específica e suficientemente baixas para não inibir detecção (assimconsiderada pela inibição da reação de extensão do iniciador). O termo Ta será bem conhecido pelos indivíduos com conhecimentos técnicos na área e refere-se à temperatura (tipicamente ajustada ou programada no aparelho que controla os parâmetros de reação) na qual a amplificação significativa ocorre durante a reação de extensão do iniciador. Tipicamente, o mesmo Ta será utilizado substancialmente ao longo de uma reação de extensão do iniciador. Às vezes um Ta diferente (normalmente maior) será usado em rodadas iniciais de uma reação de extensão do iniciador. A Tm do par fluorescente bloqueado (ou pares, se vários pares fluorescentes bloqueados estiverem sendo usados) é tipicamente maior que qualquer Ta utilizada durante o decorrer de uma reação de extensão de iniciador, ou acima da Ta utilizada para a preponderância de ciclos de reação de extensão de iniciador, por exemplo, é inferior ou igual a 15°C, por exemplo inferior ou igual a 10°C, acima do mais alto ou preponderante Ta da reação de extensão de iniciador, por exemplo, entre 1 e 15°C, tal como entre 1 e 10°C, acima da Ta mais elevada ou preponderante da reação de extensão de iniciador. Normalmente, o Ta pode estar entre cerca de 46 e 65 °C, por exemplo, entre 50 e 60 °C.

[021] Na presente invenção, um ou ambos os pares de oligonucleotídeos cassete marcados por fluorescência (ou os oligonucleotídeos iniciadores) podem conter bases modificadas, tais como bases de fosforotioato modificadas. O número de ligações fosfodiéster substituídas por fosforotioatos em qualquer oligonucleotídeo/iniciador pode variar de zero a todas as ligações fosfodiéster sendo substituídas por fosforotioatos, por exemplo, um, dois, três, quatro ou mais. Os oligonucleotídeo(s)/iniciador(es) podem conter fosforotioatos na extremidade 5' e/ou 3', no entanto prefere-se que, como alternativa ou em adição a tais modificações terminais, pelo menos uma das bases internas do oligonucleotídeo/iniciador é um fosforotioato. Por exemplo 10-90%, 20-80%, 30-70% ou 40-60% das bases podem ser fosforotioatos. Em uma modalidade, as bases de fosforotioato modificadas (onde existe mais do que um) são separadas por pelo menos uma, por exemplo, uma a três, bases não modificadas (fosfodiéster), por exemplo bases alternadas dentro de oligonucleotídeo(s)/iniciador(es) podem ser fosforotioatos. Em um exemplo, pode ser particularmente útil para o oligonucleotídeo ou oligonucleotídeos cassete marcados por fluorescência (doador) conter bases de fosforotioato modificadas. Considera-se que a presença de bases de fosforotioato modificadas podem ajudar a reduzir a formação de produtos aberrantes que podem ser fluorescentes e, portanto, levariam à geração de sinal de fluorescência errôneo. Ver, por exemplo, PCT/GB2012/050645, para a discussão de padrões de incorporação de fosforotioato que são também consideradas por serem úteis em relação com a presente invenção.

[022] O sinal que é gerado nos métodos da invenção pode ser detectado através da medição do sinal em qualquer momento durante ou após a reação de extensão de iniciador. A medição do sinal pode ser qualitativa ou quantitativa. Não se considera necessário ter de se adaptar a temperatura da reação, especificamente a fim de ser capaz de medir o sinal. O sinal pode ser detectado durante o curso normal da reação de extensão de iniciador.

[023] A presente invenção encontra utilização em uma variedade de aplicações diferentes, e é particularmente adequada para utilização em reações baseadas em PCR, e para aplicações incluindo aplicações de detecção de SNP, aplicações de detecção de variação alélica, estudos de expressão de gene, estudos de variação de número de cópias, PCR em tempo-real e de end-point, e semelhantes.

[024] Tal como indicado acima, a presente invenção encontra utilidade em reações de extensão de iniciadores dependentes de molde e para determinar a produção de produtos de extensão de iniciador em uma mistura de reação de extensão de iniciador, por exemplo, detectando se os produtos de extensão de iniciador são produzidos em uma reação de extensão do iniciador. Por produto da extensão de iniciador entende-se uma molécula de ácido nucleico que resulta de uma reação de extensão de iniciador dependente de molde. Reações de extensão de iniciadores dependentes do molde são aquelas reações em que uma polimerase estende uma molécula de iniciador de ácido nucleico que está hibridizada com uma molécula de ácido nucleico molde, em que a sequência de bases que é adicionada ao terminal da molécula de ácido nucleico iniciadora é determinada pela sequência de bases na cadeia molde. Reações de extensão de iniciadores dependentes de molde incluem tanto reações de extensão de iniciador de amplificação quanto de não- amplificação. Em algumas modalidades da presente invenção, a reação de extensão do iniciador dependente de molde em que é detectada a produção de produtos de extensão do iniciador é uma reação de amplificação, por exemplo, uma reação em cadeia de polimerase (PCR).

[025] Alvos de ácidos nucleicos que podem ser identificados usando os métodos da invenção incluem todos os alvos contendo ácido nucleico, tal como DNA ou RNA nativo. Os ácidos nucleicos podem, onde apropriado incluir sequências que incluem quaisquer dos análogos de base conhecidos de DNA e de RNA, tal como 4 acetilcitosina, 8- hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxil-metil) uracila, 5- flúorouracila, 5-bromouracila, 5-carboximetilaminometil-2- tiouracila, 5-carboximetil-aminometiluracila, di- hidrouracila, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metiladenina, 1-metilpseudo-uracila, 1-metilguanina, 1- metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2- metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5- metoxi-amino-metil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio- N-isopenteniladenina, éster metílico do ácido uracil-5- oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracila uracil-5-oxiacético, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, ácido N-uracil-5-oxiacético do éster metílico, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina e 2,6-diaminopurina; ou podem conter PNAs.

[026] Os oligonucleotídeos utilizados no método da invenção podem incluir tanto bases análogas como PNAs, conforme apropriado, embora isso possa não ser típico.

[027] Na prática dos métodos da invenção, a primeira etapa é produzir uma mistura de extensão de iniciador, por exemplo, uma composição que inclui todos os elementos necessários para que uma reação de extensão de iniciador ocorra. Em um exemplo, a mistura de extensão de iniciador inclui, tipicamente, pelo menos, um par de oligonucleotídeos marcados (o conjunto ou conjuntos de oligonucleotídeo cassete) para utilização em uma reação de extensão de iniciador que oligonucleotídeos hibridizam um com o outro para formar um par fluorescente desativado, em que um oligonucleotídeo é marcado com uma porção fluorescente e o outro oligonucleotídeo é marcado com uma porção bloqueadora, em que o par fluorescente bloqueado tem uma Tm (Tm A) que está acima da Ta da reação de extensão de iniciador. O oligonucleotídeo marcado com fluorescência de cada conjunto compreende uma sequência que é capaz de hibridização com o(s) complemento(s) da região específica do cassete de fluorescência 5' a montante do primeiro iniciador de oligonucleotídeo (iniciador direto) de cada conjunto de iniciadores de um grupo particular. Os iniciadores diretos em um grupo, têm, cada um, uma porção específica para o alvo (tipicamente diferente) e uma porção específica para o cassete a montante de 5' (tipicamente diferente ou intimamente relacionada). Após a introdução (por exemplo ao longo do progresso da reação de extensão de iniciador, quando está presente o ácido nucleico alvo ao qual os iniciadores de um determinado conjunto de iniciadores são dirigidos) de uma sequência complementar à porção especifica para o cassete marcado com fluorescência a montante 5' (com a qual o oligonucleotídeo de cassete marcado por fluorescência é capaz de hibridizar), um sinal detectável é gerado, porque o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência receptor (bloqueado) é menos capaz de se ligar a e suprimir o sinal do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência (doador). À medida que a reação de extensão de iniciador progride e mais do produto da extensão com o qual o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência é capaz de hibridizar, é gerado, geralmente tanto maior é o sinal produzido.

[028] Assim, em adição ao domínio fluoróforo, o oligonucleotídeo marcado com fluorescência também compreende uma sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção ou porções de extremidade a montante de 5' (porção ou porções fluorescentes específicas para cassete) de um dado grupo de primeiros oligonucleotídeos iniciadores (iniciadores diretos). Esta sequência "etiqueta" liga-se a uma sequência de ácido nucleico (produto de extensão) que é criada como um complemento para o iniciador ou iniciadores etiquetados incluídos na reação (que podem não ser marcados, ou que podem, por exemplo, em ciclos subsequentes da reação de extensão de iniciador, ser o próprio oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência), por exemplo, sob condições de hibridização rigorosas, por exemplo, na mistura de reação de extensão do iniciador, a uma temperatura igual ou superior a Ta, por exemplo com uma Tm que é, pelo menos, a Ta.

[029] Como observado acima, a porção fluorescente especifica para o cassete ou uma sequência "etiqueta" de cada um dos primeiros oligonucleotídeos iniciadores (iniciadores diretos) de um grupo particular pode geralmente ser idêntico ou estreitamente relacionado, por exemplo, ter o mesmo comprimento ou diferir os comprimentos por menos do que cerca de 10, mais tipicamente 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos e tem, pelo menos, cerca de 80, 85, 90, mais tipicamente pelo menos cerca de 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade com o outro na região de sobreposição. Por exemplo, pode não haver mais do que 3, 2 ou 1 nucleotídeos não idênticos. Pode ser mais simples para estas porções fluorescentes especificas para o cassete serem idênticas, mas não é essencial, o que permite mais flexibilidade no projeto de oligonucleotídeos.

[030] A porção fluorescente especifica para o cassete ou uma sequência ou sequências "etiqueta" de um grupo tipicamente diferem significativamente dos de um grupo diferente, de modo que não há praticamente relevante hibridização entre a porção fluorescente específica para o cassete (s) de um grupo e os complementos da porção especifica para o cassete de fluorescência (s) de um outro grupo, como será evidente para os conhecedores da tecnologia.

[031] Adicionalmente ao domínio receptor, a porção receptora de oligonucleotídeo cassete marcado é capaz de hibridizar com o correspondente oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência para formar um par fluorescente bloqueado, em que o par fluorescente bloqueado tem uma Tm A.

[032] Tipicamente, o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência não compreende uma porção de sequência específica o alvo , ou seja não compreende uma sequência que hibridiza (na Ta da reação de extensão de iniciador) com o polinucleotídeo alvo, com a qual a porção específica de alvo do primeiro iniciador ou iniciadores de oligonucleotídeo se destina a hibridizar. Assim, em uma tal disposição, o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência não é ligado a uma sequência alvo particular, mas pode ser utilizado (com conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeos apropriados) para a detecção de um produto de extensão de iniciador, resultante de qualquer sequência alvo. O oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência (e correspondente oligonucleotídeo cassete marcado com receptor/bloqueador) podem ser incluídos em uma mistura de ensaio "mestre", para ser usado juntamente com uma mistura "ensaio" (específica para o alvo). Tipicamente, o oligonucleotídeo cassete marcado com receptor/doador também não compreende a porção específica para a sequência alvo.

[033] Tipicamente, o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência consiste na porção fluorescente (porção doadora) e a sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção fluorescente de específica para o cassete de um primeiro iniciador de oligonucleotídeo. Tipicamente, o oligonucleotídeo cassete marcado receptor/inibidor consiste na porção receptora/inibidora e a sequência que é capaz de hibridização com a porção especifica para o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência.

[034] Pode ser desejável que a interação entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado com fluorescência (doador) e o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado com receptor (bloqueador) seja menos estável do que a interação entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado com fluorescência (doador) e o produto de extensão complementar à porção fluorescente específica para cassete a montante 5' do oligonucleotídeo iniciador direto de cada conjunto de iniciador do grupo relevante. Uma tal disposição pode ser útil na obtenção de um equilíbrio ótimo entre evitar a geração de sinal aberrante e permitir que a reação de extensão do iniciador prossiga eficientemente. Assim, a Tm para a hibridização entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado por fluorescência (doador) e o oligonucleotídeo de cassete fluorescente marcado por receptor (bloqueador) pode ser menor do que a Tm Tm C (ou Tms; Tm Cs) para a hibridização entre oligonucleotídeo cassete marcado por fluorescência (doador) e o produto de extensão complementar à porção fluorescente específico para cassete a montante de 5’ do oligonucleotídeo iniciador direto de cada conjunto de iniciador do grupo relevante. Assim, o Ta da reação de extensão de iniciador é inferior a Tm A ou Tm As para o par ou pares fluorescentes bloqueados, as quais podem por sua vez ser mais baixas (por exemplo entre cerca de 1 e 10°C mais baixas) do que a Tm C ou Tm Cs (isto é, para a hibridização entre o(s) oligonucleotídeo(s) marcado(s) com fluorescência e o(s) produto(s) da extensão de iniciador sendo formados).

[035] Observe que pode (mas não precisa) ser uma Tm C diferente para cada conjunto de iniciadores, portanto, pode haver múltiplos Tm Cs relevantes para cada grupo (de conjuntos de iniciadores), bem como múltiplos Tm Cs relevantes para diferentes grupos. Tipicamente, as Tm Cs relevantes para um determinado grupo (de conjuntos de iniciadores) são mais elevadas do que a Tm A para o conjunto de cassete de fluorescência em questão. Normalmente, todas as Tm As em uma determinada reação de extensão do iniciador são mais elevadas do que o Ta para essa reação. Tipicamente, toda a Tm Cs para uma determinada reação de extensão do iniciador estará dentro de cerca de 10, mais tipicamente 5, 4, 3, 2 ou 1 o C umas das outras. Tipicamente, todas as Tm As para uma determinada reação de extensão de iniciador será de cerca de 10, mais tipicamente 5, 4, 3, 2 ou 1 o C umas das outras.

[036] Em um exemplo (por exemplo quando o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência não compreende a sequencia específica do alvo), o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador, é mais curto em 1 a 5 bases de nucleotídeos que o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência. Tipicamente, a porção não emparelhada (relativa ao oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador) do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência se situa na extremidade 3’ do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência ou do lado oposto da extremidade 5’ do oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador. A porção do oligonucleotídeo iniciador (ou iniciadores) relevante, cujo complemento hibridiza com o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência, tipicamente se situa entre cerca de 5 nucleotídeos do comprimento (por exemplo, entre 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos mais curto e 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos mais longo, por exemplo do mesmo comprimento) do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência, por exemplo, com alguma diferença no comprimento tipicamente na extremidade 5’ do oligonucleotídeo iniciador e do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência. Em ciclos subsequentes da reação de extensão do iniciador, o próprio oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência, pode atuar como o iniciador, e assim o complemento formado durante a extensão do iniciador geralmente vai estender até à extremidade 5’ do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência. Deste modo, a porção do complemento que hibridiza com o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador é tipicamente tão comprida quanto o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador.

[037] Em outros exemplos, pode alternativamente ou adicionalmente haver mais desconformidades entre oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador e o oligonucleotídeo de cassete marcado com fluorescência, que entre o complemento do oligonucleotídeo iniciador relevante (ou iniciadores) e o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência. Conforme é bem conhecido para os indivíduos com conhecimento técnico na área, a posição da desconformidade dentro de um par de oligonucleotídeos e a natureza da desconformidade (por exemplo, se um emparelhamento A:T ou um emparelhamento G:C é interrompido) vai influenciar a importancia da desconformidade na alteração da estabilidade/alteração de Tm.

[038] Ainda em outros exemplos, alternativamente ou adicionalmente, diferentes nucleotídeos/bases podem ser usados no oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador em relação aos que são usados no mix de reação de extensão do iniciador ( e assim, incorporados nos complementos do iniciador), consequentemente alterando a estabilidade relativa das hibridizações entre o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador e o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência e o produto de extensão do iniciador. Tipicamente, a base ou bases “não-padrão” podem ser usadas nos oligonucleotídeo cassete marcados com bloqueador, e as bases “padrão” no mix de extensão do iniciador, mas outras combinações são igualmente possíveis, tal como se torna evidente para um individuo com conhecimento técnico na área.

[039] Será apreciado que se, em uma combinação diferente, o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência compreender não apenas a sequencia da “etiqueta”, mas também a sequencia complementar ao ácido nucleico alvo a ser detectado (ver modalidades “diretas” descritas em seguida) que haverá uma região de complementaridade consideravelmente mais longa entre o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência e o produto de extensão, do que se o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência tiver uma sequencia de “etiqueta”, mas nenhuma sequencia complementar ao ácido nucleico alvo a ser detectado. É considerado que nesta combinação existe menos vantagem como consequência do Tm A para o par desativado fluorescente sendo reduzido. Assim, não é considerado que resulte em particular beneficio para, por exemplo, a região correspondente à etiqueta no oligonucleotídeo cassete marcado com receptor ser mais curto ou ter desconformidades ou composição com bases diferentes comparado com a “etiqueta” no oligonucleotídeo cassete marcado com fluoróforo. É notado que esta combinação (denominada combinação “direta” abaixo) é considerada potencialmente útil, mas significa que, pelo menos, um oligonucleotídeo marcado com doador/fluorescência diferente é tipicamente necessário para cada sequencia alvo a ser detectada, enquanto que na combinação “indireta” anterior, em que não há nenhuma sequencia especifica de alvo (por exemplo, capaz de hibridizar no Ta da reação de extensão do iniciador) não é necessário sintetizar um oligonucleotídeo marcado com fluorescência/doador diferente (ou oligonucleotídeo marcado com receptor/bloqueador) para cada sequencia alvo (das quais pode haver centenas ou milhares de possibilidades) a ser detectada. Numa dada reação de extensão do iniciador, um oligonucleotídeo marcado com fluorescência/doador diferente, é tipicamente necessário para cada sequencia alvo (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5, tal como discutido adiante) sendo analisada em esta particular reação de extensão do iniciador, mas a mesma coleção de oligonucleotídeos cassete fluorescentes pode potencialmente ser usada com qualquer sequencia alvo.

[040] Dependendo da natureza dos oligonucleotídeos e do próprio ensaio (por exemplo, se a combinação “direta” ou “indireta” é usada, pelo menos a região da “etiqueta” do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência pode hibridizar com a região do produto de extensão do iniciador. Por exemplo, quando o ensaio é um ensaio de genotipagem SNP, por exemplo, no qual é utilizado um universal cassette reporting system “indireto”, a região da “etiqueta” hibridiza com a região de “etiqueta” do produto de extensão do iniciador, sob condições rigorosas.

[041] Tal como notado acima, em exemplos, a região de hibridização no oligonucleotídeo cassete marcado com porção aceitadora pode ser mais curta (por exemplo, 1 a 5 nucleotídeos mais curta) que a sequencia na porção receptora do oligonucleotídeo cassete marcado com fluoróforo que hibridiza com o produto de extensão ou pode ter uma desconformidade, ou um tipo de base diferente, de forma que o Tm A de hibridização entre os oligonucleotídeos cassete é menor que o Tm (ou Ym Cs) para a hibridização entre o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência e o produto de extensão (ou produtos de extensão).

[042] A transferência de energia fluorescente ocorre quando um doador de energia fluorescente adequado e uma porção aceitadora de energia estão em grande proximidade um do outro. A energia de excitação absorvida pelo doador é transferida para o aceitador, que pode ainda dissipar esta energia, tanto por emissão de fluorescência, se for um fluoróforo, ou por meios não-fluorescentes, se for um bloqueador. Um par doador-receptor compreende dois - um grupo de fluorescência e um grupo de modificação de fluorescência com espectros sobrepostos, em que a emissão do doador (grupo de fluorescência) se sobrepõe à absorção do receptor (modificação de fluorescência), para que haja transferência de energia do flúoroforo excitado para o outro membro do par. Como tal, o par (pares) de oligonucleotídeos marcados (conjuntos de oligonucleotídeos cassete fluorescente) da presente invenção são detectores de ácidos nucleicos que incluem um domínio flúoroforo nos oligonucleotídeos separados, em que o doador de energia fluorescente, ou seja, o doador, está posicionado e um segundo oligonucleotídeo com um domínio receptor, em que o receptor de energia fluorescente, ou seja, o receptor, está posicionado. Como referido acima, o oligonucleotídeo doador inclui o fluoróforo doador. O fluoróforo doador pode estar posicionado em qualquer lugar do detector de ácidos nucleicos, mas, tipicamente, está presente na extremidade 5’ do oligonucleotídeo.

[043] O domínio receptor inclui o receptor de energia fluorescente. O receptor pode estar posicionado em qualquer lugar no domínio receptor, mas, tipicamente, está presente na extremidade 3’ do oligonucleotídeo.

[044] Na presente invenção, em um par de oligonucleotídeos marcados, cada um dos oligonucleotídeos cassete pode conter uma ou mais etiquetas, por exemplo, 1, 2 ou 3 etiquetas. Um ou ambos os oligonucleotídeos cassete contêm preferencialmente uma única etiqueta, mais preferencialmente, ambos os oligonucleotídeos contêm uma única etiqueta.

[045] Por exemplo, o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência, contém preferencialmente uma etiqueta na ou dentro dos limites da extremidade 5’ do oligonucleotídeo e o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador contém uma etiqueta na ou dentro dos limites da extremidade 3’ do oligonucleotídeo.

[046] Os flúoroforos dos pares oligonucleotídeos marcados podem ser selecionados de forma a serem provenientes de uma família química semelhante ou de uma diferente, tal como os corantes de cianina, xantenos ou semelhantes. Os fluoróforos de interesse incluem, mas não estão limitados a corantes de fluoresceína (e.g. 5- carboxifluoresceína (5-FAM), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2’,4’,1,4-tetraclorofluoresceína (TET), 2’,4’,5’,7’,1,4- hexaclorofluoresceína (HEX), e 2’,7’-dimeoxi-4’,5’-dicloro- 6-carboxifluoresceína (JOE)), corantes de cianina, tais como Cy5, derivados de dansil, corantes rodamina (e.g. tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), e tetrapropano-6- carboxirodamina (ROX)), DABSYL, DABCYL, cianina, tal como Cy3, antroquinona, nitrotiazol e composto de nitromidazol, e outros corantes não-intercalantes. Os fluoróforos de interesse são ainda descritos nas aplicações internacionais de patente WO 01/42505 e WO 01/86001.

[047] No caso de ser usado mais que um grupo de iniciador (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) e consequentemente vários conjuntos de oligonucleotídeos cassete, o grupo fluoróforo pode tipicamente ser diferente de cada um dos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 (ou mais) conjuntos de oligonucleotídeos cassete. O grupo receptor (por exemplo, bloqueador) pode ser o mesmo ou diferente, enquanto for capaz de modular a fluorescência do grupo fluoróforo emparelhado de uma forma satisfatória. Tipicamente 1, 2, 3 ou 4 grupos de iniciador diferentes (cada um dos quais pode ter um ou mais conjuntos de iniciador, tipicamente, um conjunto de iniciador) e consequentemente, 1, 2, 3 ou 4 conjuntos de oligonucleotídeos cassete podem ser usados em um único tubo de reação. Um fator limitante pode ser o numero de diferentes espectros que é possível distinguir, os quais podem depender das características dos equipamentos de geração/medição disponíveis. As considerações na escolha de compatíveis irão ser conhecidas para um individuo com conhecimento técnico na área.

[048] Nos métodos da presente invenção, a polimerase utilizada na reação de extensão do iniciador inclui, pelo menos, uma Família A, onde os termos “Família A” e “Família B” correspondem ao esquema de classificação reportado em Braithwaite & Ito, Nucleic Acids Res. (1993) 21:787-802. As polimerases de Família A de interesse incluem: polimerases Thermus aquaticus, incluindo as polimerases que ocorrem naturalmente (Taq) e derivados e homólogos das mesmas, tal como Klentaq (como descrito em Proc. Natl. Acad. Sci USA (1994) 91:2216-2220); polimerases Thermus thermophiles, incluindo as polimerases que ocorrem naturalmente (Tth) e derivados e homólogos das mesmas, e similares. As polimerases para uso na presente invenção podem ser usadas na forma purificada ou não purificada. Tipicamente, a polimerase não apresenta atividade de exonuclease. Isto pode proporcionar melhor especificidade, por exemplo em um ensaio de tipagem SNP, tal como será evidente para os indivíduos com conhecimento técnico na área.

[049] Outro componente da reação de mistura produzido na primeira etapa dos métodos é o molde do ácido nucleico. O ácido nucleico que serve como molde pode ser de cadeia simples ou de dupla cadeia, em que o ácido nucleico é tipicamente ácido desoxirribonucleico (DNA). O comprimento do molde de ácido nucleico pode ser tão curto quanto 20 pares de base, mas frequentemente, terá, pelo menos, 50 ou 100 pares de base de comprimento, e mais frequentemente, terá, pelo menos, cerca de 150 pares de base de comprimento, e poderá ser tão comprido quanto 1000 ou 10000 pares de base ou mais comprido ainda, e.g., 50000 pares de base de comprimento, incluindo um extrato de DNA genômico, uma porção digerida do mesmo ou um lisado em estado bruto, etc. O ácido nucleico pode estar livre em solução, ladeado em uma ou ambas as extremidades por ácido nucleico não- molde, presente em um vetor, e.g. plasmídeo e similares, sendo os únicos critérios, que o ácido nucleico esteja disponível para participar na reação de extensão do iniciador. O ácido nucleico molde pode estar presente na forma purificada, ou em uma mistura, complexado com os outros ácidos nucleicos não-molde, e.g. em uma preparação de DNA celular, etc.

[050] O ácido nucleico molde pode ser derivado de uma variedade de outras proveniências, dependendo da aplicação para a qual o PRC é realizado, em que tais proveniências incluem organismos que contêm ácidos nucleicos, i.e. vírus, procariotas, e.g. bactérias, arquea e cianobactérias e eucariotas, e.g. membros do reino Protista, tal como flagelados, amibas e os seus aparentados, amibas parasitas, ciliados e similares, membros do reino fungi, tal como bolor limoso, bolor limoso acelular, bolor limoso celular, bolor aquático, bolores verdadeiros, fungos conjugados, fungos sac, fungos club, fungos imperfeitos e similares; plantas, tal como algas, musgos, planta Hepatica americana, Phaeoceros laevis, musgos club, cavalinhas, samambaias, gimnospermas e plantas de flor, tanto monocotiledôneas, como dicotiledônias; e animais, incluindo, esponjas, membros do filo Cnidaria, por exemplo, medusas, corais e similares, ctenóforos, vermes, rotíferos, lombrigas, anelídeos, moluscos, artrópodes, equinodermos, vermes- bolota, e vertebrados, incluindo repteis, peixes, pássaros, cobras, e mamíferos, e.g. roedores, primatas, incluindo humanos. O molde de ácido nucleico pode ser usados diretamente a partir da fonte onde ocorre naturalmente, e.g., como um lisado bruto e/ou pode ser pré-processado num numero de diferentes formas, como é conhecido na área tecnológica. Em algumas modalidades, o molde de ácido nucleico pode ser derivado de uma fonte sintética.

[051] Um componente da mistura de reação produzido na primeira etapa do presente método, é o iniciador utilizado na reação de extensão do iniciador, e.g., os iniciador do PCR (tais como iniciadores diretos e reversos utilizados em amplificação geométrica). Tal como previamente indicado, um ou mais grupos de iniciadores de oligonucleotídeos pode ser usados, a cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeos. Cada conjunto pode, tipicamente, ter um iniciador direto e reverso. Como notado acima, tipicamente, 1, 2, 3, 4 ou mais grupos de iniciadores podem ser usados. Cada grupo pode, tipicamente, incluir um conjunto de iniciadores (a menos que, por exemplo, exista uma razão pela qual é desejado medir os produtos de amplificação combinados, resultantes de dois conjuntos separados de iniciadores). Cada mix de reação de extensão de iniciador, tipicamente irá compreender, pelo menos um iniciador direto e frequentemente, dois ou três iniciadores diretos e mais frequentemente cinco ou sete iniciadores diretos, no caso de reação de genotipagem SNP. Também pode estar presente um iniciador reverse correspondente para cada iniciador direto, mas estes podem não ser diferentes, por exemplo, numa reação de genotipagem SNP, em que um iniciador reverse comum pode ser usado com diferentes iniciadores diretos. O mix de reação de extensão do iniciador irá compreender, pelo menos, um iniciador marcado com fluorescência (dador) e um oligonucleotídeo marcado com um bloqueador, aceitador complementar (que tipicamente, não é capaz de atuar como iniciador, por exemplo, devido ao bloqueador estar posicionado na extremidade 3’ e evitar que o oligonucleotídeo seja capaz de atuar como iniciador).

[052] Mais frequentemente, por exemplo, no caso de amplificação exponencial, o mix de extensão do iniciador, tipicamente, compreende, pelo menos, um iniciador dador, marcado com fluorescência e um oligonucleotídeo complementar, aceitador marcado com um bloqueador e um iniciador reverso sem marcador, em que um ou qualquer um dos oligonucleotídeos ou iniciadores contêm, pelo menos um grupo modificado, e.g., um grupo fosforotioato. Mais frequentemente, no caso de amplificação exponencial usando um sistema repórter universal, o mix de extensão do iniciador irá compreender, pelo menos, um iniciador fluorescente marcado com aceitador e um dador complementar, oligonucleotídeo marcado com um bloqueador, um iniciador reverso sem marcador e um iniciador direto sem marcador, com etiqueta. Os iniciadores podem ter, pelo menos, 15 pares de base de comprimento, e.g., pelo menos 20 pares de base ou 22 pares de base de comprimento. Os iniciadores podem ter 30 pares de base de comprimento ou mais, por exemplo, o comprimento dos iniciadores pode ser de 18 a 60 pares de base de comprimento, tal como de 20 a 35 pares de base de comprimento. O iniciador etiquetado irá, tipicamente, ser mais longo que os oligonucleotídeos cassete fluorescentes (na medida, em que tipicamente, irá precisar de conter uma sequencia de etiqueta suficientemente longa para hibridizar com o seu complemento na Ta da reação de extensão do iniciador; bem como, uma porção especifica da sequencia alvo que também precisa de ser suficientemente longa para hibridizar com o seu complemento na Ta da reação de extensão do iniciador) ou o iniciador reverso (tipicamente não etiquetado).

[053] Pode ser desejável que exista, na reação de extensão do iniciador, (e consequentemente, no mix da reação, antes do inicio da reação de extensão do iniciador) um excesso de oligonucleotídeo cassete marcado com aceitador, em relação ao oligonucleotídeo cassete marcado com fluoróforo. Uma razão, de pelo menos, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1, por exemplo entre 1:1 e 10:1 ou 15:1, por exemplo entre 1.5:1 e 5:1 de oligonucleotídeo cassete marcado com aceitador para oligonucleotídeo cassete marcado com fluoróforo em um conjunto de oligonucleotídeo cassete, pode ser útil otimizar o sinal alcançado e/ou minimizar o sinal que surge em um controle sem molde (NTC).

[054] Conforme usado presentemente, “ácido nucleico” significa tanto DNA, RNA, de cadeia simples ou dupla, e quaisquer modificações dos mesmos. As modificações incluem, mas não estão limitadas a aquelas que fornecem outros grupos químicos que incorporam carga adicional, polarizabilidade, ligações de hidrogênio, interações eletroestáticas e funcionalidade aos ácidos nucleicos. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a modificações de açúcares em 2’-posição, modificações de pirimidina em 5’-posição, modificações de purina em 8- posição, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracil; modificações de esqueleto, metilações, combinações de emparelhamento de bases menos frequentes tais como isobases, isocitina e similares. Modificações também podem incluir modificações 3’ e 5’, tais como capping.

[055] Tal como usado presentemente, “complementar” se refere ao par de bases nitrogenosas, consistindo em uma purina ligada a uma pirimidina por ligação hidrogênio, que conecta as cadeias complementares de DNA ou de moléculas hibridas se juntando a DNA ou RNA.

[056] Tal como usado presentemente, “grupo fluorescente” se refere a uma molécula que, quando excitada com luz de um comprimento de onda selecionado, emite luz em um comprimento de onda diferente. Grupos fluorescentes também podem ser referidos como “fluoróforos”.

[057] Tal como usado presentemente, “grupo de modificação de fluorescência” se refere a uma molécula que pode alterar de qualquer forma a emissão de fluorescência de um grupo fluorescente. Um grupo de modificação de fluorescência geralmente realiza isto através de mecanismos de transferência de energia. Dependendo da identidade do grupo de modificação de energia, a emissão de fluorescência pode sofrer um numero de alterações, incluindo, mas não limitadas a: atenuação, supressão completa, melhoria, mudança no comprimento de onda, mudança na polaridade, alteração no tempo de vida de fluorescência. Um exemplo de um grupo de modificação de fluorescência é o grupo bloqueador.

[058] Tal como usado presentemente, “transferência de energia” se refere ao processo pelo qual a emissão de fluorescência de um grupo fluorescente é alterada por um grupo de modificação de fluorescência. Se o grupo de modificação de fluorescência é um grupo bloqueador, então a emissão de fluorescência do grupo de fluorescência é atenuada (bloqueada). A transferência de energia pode ocorrer através de transferência de energia por ressonância de fluorescência ou através de transferência de energia direta. O mecanismos exatos de transferência de energia nestes dois casos são diferentes. Deve ser entendido que qualquer referência a transferência de energia no presente pedido, abrange todos estes fenómenos mecanisticamente distintos. A transferência de energia também é presentemente referida como transferência de energia fluorescente ou FET.

[059] Tal como usado presentemente, “par de transferência de energia” se refere a quaisquer duas moléculas que participam na transferência de energia. Tipicamente, uma das moléculas atua como um grupo fluorescente e a outra atua como um grupo de modificação de fluorescência. Tais pares podem compreender, por exemplo, dois grupos de fluorescência, os quais podem ser diferentes um do outro, e um grupo bloqueador, dois grupos bloqueadores e um grupo fluorescente, ou múltiplos grupos fluorescentes e múltiplos grupos bloqueadores. Em casos em que existem múltiplos grupos fluorescentes e/ou múltiplos grupos bloqueadores, os grupos fluorescentes e/ou bloqueadores individuais podem ser diferentes uns dos outros. Os pares de transferência de energia preferencias da presente invenção compreendem um grupo fluorescente e um grupo bloqueador. Em alguns casos, a distinção entre o grupo fluorescente e o grupo de modificação de fluorescência pode ser turva. Por exemplo, sob certas circunstancias, dois grupos de fluoresceína adjacentes podem bloquear a emissão de fluorescência um do outro via transferência de energia direta. Por esta razão, não há limitação à identidade dos membros individuais dos pares de transferência de energia no presente pedido. Tudo quanto é requerido é que haja alteração nas propriedades espectroscópicas do par de transferência de energia, como um todo, de alguma forma mensurável, se a distancia entre os membros individuais é alterada por alguma quantidade critica.

[060] Tal como usado presentemente, “iniciador” se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese, quando colocado sob condições, nas quais a síntese de um produto de extensão de iniciador, que é complementar à cadeia de ácido nucleico, pode ocorrer. Por conseguinte, um oligonucleotídeo capaz de atuar como um iniciador, poderá tipicamente, ter um grupo OH 3’.

[061] Tal como usado presentemente, “grupo bloqueador” se refere a qualquer grupo de modificação de fluorescência que pode atenuar, pelo menos, parcialmente, a luz emitida por um grupo fluorescente. Esta atenuação é, presentemente, referida como “bloqueio”. Consequentemente, a iluminação do grupo fluorescente na presença do grupo bloqueador leva a uma emissão de sinal que é menos intensa que o esperado, ou até, completamente ausente. O bloqueio ocorre através da transferência de energia entre o grupo fluorescente e o grupo bloqueador.

[062] Tal como usado presentemente “transferência de energia de ressonância por fluorescência” ou “FRET” se refere a um fenómeno de transferência de energia, no qual a luz emitida pelo grupo fluorescente excitado é absorvida, pelo menos, parcialmente, pelo grupo de modificação de fluorescência. Se o grupo de modificação de fluorescência é um grupo bloqueador, então esse grupo tanto pode irradiar a luz absorvida como luz de um comprimento de onda diferente, como pode dissipá-la como calor. FRET depende de uma sobreposição entre o espectro de emissão de um grupo fluorescente e o espectro de absorção de um grupo bloqueador. A tecnologia FRET também depende da distancia entre o grupo bloqueador e o grupo fluorescente. Acima de uma determinada distancia critica, o grupo bloqueador é incapaz de absorver a luz emitida pelo grupo fluorescente, ou consegue apenas de forma insuficiente.

[063] Tal como usado presentemente, “iniciador marcado na extremidade” se refere a oligonucleotídeo contendo pelo menos dois domínios, um específico para o ácido nucleico alvo, e.g. DNA de interesse, i.e. capaz de hibridar com o ácido nucleico alvo mencionado, e a outra sequencia (tipicamente na extremidade 5’ da sequencia específica do alvo), servindo como um molde para a produção do produto de extensão, compreendendo o complemento da sequencia da “etiqueta”. O complemento da sequencia da “etiqueta” pode então se ligar a, por exemplo, a porção de “etiqueta” do oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência correspondente (ao qual pode faltar qualquer outra sequencia que não a porção de “etiqueta”). Os iniciadores marcados também podem compreender regiões adicionais, tais como um vinculador entre os dois domínios referidos acima e/ou etiquetas.

[064] Tal como usado presentemente, “transferência de energia direta” se refere a um mecanismo de transferência de energia, no qual não ocorre passagem de um fóton entre o grupo fluorescente e o grupo de modificação de fluorescência. Sem estarem ligados por um único mecanismo, se acredita que em uma transferência de energia direta, o grupo fluorescente e o grupo de modificação de fluorescência interferem com a estrutura eletrônica um do outro. Se o grupo de modificação de fluorescência é um grupo bloqueador, isto vai resultar no grupo bloqueador de impedir o grupo fluorescente de emitir luz.

[065] Em geral, o bloqueio através de transferência de energia direta é mais eficiente que o bloqueio por FRET. Na verdade, alguns grupos bloqueadores que não bloqueiam determinados grupos fluorescentes por FRET (porque não possuem a sobreposição espectral necessária com o grupo fluorescente) podem fazê-lo de forma eficiente por transferência de energia direta. Além disso, alguns grupos fluorescentes podem, os próprios, atuar como grupos bloqueadores se estão suficientemente perto de outros grupos fluorescentes para causar transferência de energia direta. Por exemplo, nestas condições, dois grupos adjacentes de fluoresceína podem bloquear a fluorescência um do outro de forma eficaz. Por estas razões, não há qualquer limitação sobre a natureza dos grupos fluorescentes e grupos bloqueadores útil para a prática da presente invenção.

[066] Sempre que se faça referência à "hibridização" ou à capacidade de um oligonucleotídeo e/ou iniciador de "hibridizar" com outra sequência de nucleotídeos, um conhecedor da tecnologia compreenderá que tal hibridização é capaz de ocorrer sob as condições prevalecentes na reação de extensão do molde, e.g. reação de PCR, em que o oligonucleotídeo e/ou iniciador é utilizado.

[067] A invenção também proporciona um kit adequado para uso em um método para a detecção de um produto de extensão do iniciador, o método compreendendo as etapas de: a)dois ou mais grupos oligonucleotídeos iniciadores, cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores, cada conjunto caracterizado por; i)um primeiro oligonucleotídeo iniciador (iniciador direto) que tem uma porção específica para o alvo e uma porção fluorescente especifica para o cassete, a montante 5', e ii) um segundo oligonucleotídeo iniciador (iniciador inverso), que tem uma porção específica para o alvo; em que os oligonucleotídeos iniciadores em um conjunto particular são adequados, respectivamente, para a hibridização em fitas complementares de uma sequência de nucleotídeos alvo correspondente para permitir a formação de um produto de extensão do iniciador, por exemplo, um produto de PCR; e em que o primeiro oligonucleotídeo iniciador de cada conjunto no mesmo grupo contém uma porção fluorescente específica para o cassete, que é capaz de hibridizar com o complemento da porção fluorescente específica para o cassete do primeiro oligonucleotídeo iniciador de qualquer conjunto no mesmo grupo; e b) dois ou mais conjuntos de oligonucleotídeos de cassete, cada conjunto caracterizado por; i) um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente (porção doadora) e possuindo uma sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção fluorescente especifica para o cassete do oligonucleotídeo iniciador de qualquer conjunto em um dado grupo de oligonucleotídeos iniciadores; e ii) um segundo oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção receptora (por exemplo, uma porção bloqueadora), em que cada conjunto de oligonucleotídeos cassete hibridiza com o outro para formar um par fluorescente desativado, em que o par fluorescente desativado tem uma Tm A, em que cada um dos Tm As para os pares fluorescentes desativados, é acima de uma temperatura adequada para uso como a Ta de uma reação de extensão de iniciador, usando os oligonucleotídeos do kit, por exemplo, acima de uma temperatura entre 46 e 65 oC, por exemplo, entre 50 e 60 oC,.

[068] Os primeiros iniciadores oligonucleotídeos podem, tipicamente, não ser marcados. O oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência, tipicamente, não compreende uma sequencia especifica para o alvo. A Tm A para a hibridização entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado com fluorescência (doador) e o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador (aceitador) poderá ser menor que Tm Tm C (ou Tms; Tm Cs) para a hibridização entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado com fluorescência (doador) e o produto de extensão complementar à porção fluorescente específica para o cassete, a montante de 5’ do oligonucleotídeo iniciador direto de cada conjunto de iniciadores do grupo relevante. O oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador pode ter entre 1 e 5 bases de nucleotídeos a menos que o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescência.

[069] Mais preferencias para os oligonucleotídeos e reações de extensão do iniciador conforme indicadas abaixo.

[070] Os kits, de acordo com a invenção também podem conter uma polimerase e/ou outros componentes adequados para uso em reações de extensão do iniciador, tais como cátions divalentes, e.g. derivados de sais de magnésio, dNTPs (desoxirribonucleotídeos 5’-trifosfatados), agentes tamponantes, etc.

[071] O kit compreende um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos cassete em um primeiro recipiente, opcionalmente, em que o primeiro recipiente compreende outros componentes para executar a reação de extensão do iniciador, tais como, tampões, DNA polimerase termoestável, e opcionalmente, em que os primeiros oligonucleotídeos cassete não compreendem uma porção especifica para o alvo; e um ou mais grupos iniciadores de oligonucleotídeos em um outro recipiente ou recipientes.

[072] Em uma outra modalidade, a presente invenção providencia um método para a detecção de produtos de extensão do iniciador, o método compreendendo as etapas de: a) proporcionar um ou mais grupos de iniciadores de oligonucleotídeos, cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de iniciadores de oligonucleotídeo, cada conjunto caracterizado por; i)um primeiro iniciador oligonucleotídeo marcado (iniciador direto), possuindo uma porção especifica para o alvo e uma porção fluorescente especifica para cassete, a montante de 5’, e ii) um segundo iniciador de oligonucleotídeo (iniciador inverso), que tem uma porção específica alvo, em que os iniciadores de oligonucleotídeos num conjunto particular são adequados, respectivamente, para a hibridização em cadeias complementares de uma sequência de nucleotídeos alvo correspondente para permitir a formação de um produto de extensão de iniciador, por exemplo, um produto de PCR; e em que o primeiro iniciador de oligonucleotídeo de cada conjunto no mesmo grupo contém uma porção especifica para o cassete de fluorescência que é capaz de hibridizar com o complemento da porção especifica para o cassete de fluorescência do primeiro iniciador de oligonucleotídeo de qualquer conjunto no mesmo grupo, b)proporcionar um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos cassete, cada conjunto caracterizado por; i) um primeiro oligonucleotídeo ou oligonucleotídeos cassete marcado com uma porção fluorescente (porção doadora) que é o primeiro oligonucleotídeo iniciador/iniciadores marcado (iniciador/iniciadores direto) de um grupo de iniciadores, ii) um segundo oligonucleotídeo de cassete marcado com uma porção receptora (por exemplo, uma porção bloqueador). em que cada conjunto de oligonucleotídeos de cassete hibridiza com o outro para formar um par fluorescente bloqueado, em que o par fluorescente bloqueado tem uma Tm A, c) iniciar a reação de extensão do iniciador gerando assim (se o polinucleotídeo alvo relevante está presente) uma sequência complementar ao primeiro iniciador de oligonucleotídeo relevante, de tal modo que o segundo oligonucleotídeo cassete relevante (receptor, por exemplo, bloqueador, marcado) é menos capaz de hibridizar com o primeiro oligonucleotídeo cassete relevante (marcado por fluorescência), pelo que é gerado um sinal; e d) detectar o sinal que é gerado, em que a reação de extensão do iniciador é efetuada, pelo menos em parte, a uma Ta que é menor do que a Tm A ou Tm As para um ou mais pares fluorescentes desativados.

[073] Isto pode ser determinado como um método “direto” de detecção.

[074] O método ou kits da presente invenção são considerados uteis numa variedade de circunstâncias, por exemplo, para uso em genotipagem SNP baseado em PCR especifico para alelos, estudos de expressão genética ou estudos da variação do número de cópias.

[075]Exemplos do uso da presente invenção incluem os seguintes: Detecção direta de produtos de PCR (tempo-real)

[076] Esta modalidade utiliza um oligonucleotídeo iniciador marcado com fluorescência na extremidade para iniciar o processo de PCR e gerar a fluorescência. Desta forma, o primeiro oligonucleotídeo iniciador e o primeiro oligonucleotídeo cassete correspondente, marcado com uma porção fluorescente são tipicamente a mesma entidade. Este iniciador é direcionado para a região de interesse no molde (polinucleotídeo alvo)e assim, conduz a especificidade da reação. Um oligonucleotídeo complementar da invenção, marcado como bloqueador, também é usado. Uma vez que o comprimento do oligonucleotídeo marcado como bloqueador é longo suficiente para providenciar uma Tm acima da Ta da reação, a geração de produto pode ser avaliada em cada ciclo do processo PCR em qualquer instrumento de PCR de tempo-real (tal como o instrumento ABI7900 Prism) ou no final da reação.

[077] Devido à complementaridade dos dois oligonucleotídeos marcados (bloqueador e iniciador, marcado com fluorescência na extremidade), estes hibridizam um com o outro. Esta hibridização traz a etiqueta bloqueadora em grande proximidade com o fluoróforo, tornando assim todos os sinais fluorescentes do fluoróforo bloqueados, quando excitado a um comprimento de onda adequado, e.g. 488nm, quando o fluoróforo está em FAM.

[078] Também está incluído na reação um iniciador reverso convencional para criar um par iniciador PCR. O processo PCR é então iniciado e o produto PCR começa a ser gerado.

[079] Durante a amplificação PCR e formação de PCR, é formada a sequencia complementar do iniciador fluorescente. Esta sequencia amplificada, sem bloqueador, compete com o oligonucleotídeo bloqueador pela ligação com o iniciador marcado com fluorescência na extremidade. Estes iniciadores incorporados com extremidades marcadas com fluorescência, não são mais bloqueados, mas produzem um sinal fluorescente que é diretamente proporcional à quantidade de produto PCR gerado. Detecção indireta de produtos PCR (tempo-real)

[080] Esta modalidade utiliza um oligonucleotídeo (iniciador) convencional (não-marcado) para iniciar o processo PCR. Este iniciador convencional possui na extremidade uma sequencia de DNA que não é direcionada para a região de interesse do amplicon. Esta sequencia etiqueta está posicionada na porção 5’ do iniciador. Também está incluído na reação um único oligonucleotídeo marcado com fluorescência que é capaz de hibridizar com o complemento da região da sequencia etiqueta do iniciador convencional gerado na reação. Existe um numero de fluoróforos adequados, sendo o FAM uma escolha popular (um derivado de fluoresceína). Finalmente, está incluído na reação um oligonucleotídeo, marcado com bloqueador em 3’, anti-senso para o oligonucleotídeo marcado com FAM. Existe um numero adequado de marcadores, dos quais a série de bloqueadores Black Hole é uma escolha popular.

[081] Uma vez que o comprimento do oligonucleotídeo marcado com bloqueador é longo suficiente para providenciar uma Tm acima da Ta da reação, a geração de produto pode ser avaliada em cada ciclo do processo PCR em qualquer instrumento de PCR em tempo real (tal como os instrumentos Roche LC480 or ABI 7900 Prism).

[082] Devido á complementaridade dos dois oligonucleotídeos marcados, estes hibridizam um com o outro. Esta hibridização traz a etiqueta bloqueadora em grande proximidade com o fluoróforo, tornando assim todos os sinais fluorescentes do fluoróforo bloqueados. O processo PCR é então iniciado e começam a ser gerados os produtos PCR. Após alguns ciclos iniciais de PCR, a sequencia complementar do iniciador fluorescente é gerada. O iniciador PCR fluorescente é então capaz de iniciar a síntese durante o PCR e assim faz. Não é essencial que o oligonucleotídeo fluorescente seja capaz de atuar como iniciador, no entanto, considera-se que que podem ser gerados mais produtos de PCR se o oligonucleotídeo atuar como iniciador, o que pode providenciar um melhor sinal. Isto produz um amplicon contendo a molécula fluorescente. Assim que tal ocorre, o oligo bloqueador se torna menos capaz de hibridizar com o oligonucleotídeo marcado com fluorescência, uma vez que o processo de PCR produz amplicon de DNA com cadeia dupla. Uma vez que o oligonucleotídeo bloqueador não se encontra mais hibridizado com o oligonucleotídeo marcado com fluorescência, é então gerado um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR gerado e pode ser medido numa base de ciclo a ciclo.

[083] A região etiqueta do iniciador marcado na extremidade não precisa ser idêntica ao oligonucleotídeo único marcado com fluorescência, enquanto uma sequencia complementar à região de marcação na extremidade gerada hibridizar com o oligonucleotídeo marcado com fluorescência. Detecção indireta de produtos de PCR (end-point)— Genotipagem SNP

[084] Esta modalidade, ilustrada na figura 1, utiliza o(s) mesmo(s) par(es) fluoróforo — e oligonucleotídeo marcado com bloqueador, tal como descrito acima.

[085] A genotipagem SNP utiliza, pelo menos, dois pares de oligonucleotídeos marcados, por exemplo, 2, 3 ou 4 pares, em que cada par, preferencialmente compreende um fluoróforo diferente, os quais são espectralmente resolúveis uns dos outros, e.g. FAM e HEX. Os iniciadores com extremidade marcada (cada um correspondendo a um grupo de iniciadores oligonucleotídeos diferente, como indicado acima) são marcados na extremidade com uma sequencia distinta, sendo as porções dos iniciadores, não marcadas na extremidade (geralmente, denominadas por diretas) direcionadas para o DNA de interesse. Nesta porção do iniciador podem distinguir-se umas das outras somente por um único nucleotídeo e.g. na sua extremidade 3’. Cada iniciador é direcionado para uma base polimórfica no DNA de interesse, conforme é bem conhecido para os conhecedores da tecnologia. O PCR é conduzido pelo que os iniciadores apenas iniciam a síntese quando combinam com a sequencia alvo de interesse, e.g. quando a extremidade 3’ está perfeitamente correspondida. Quando ocorre uma falha na correspondência, a síntese não prossegue.

[086] Durante a reação, a porção não-extremidade (especifica para alvo), dependendo do genótipo, é capaz de iniciar a síntese (ou ambas são, no caso de heterozigotos). Tal resulta na incorporação de distintas porções de extremidade fluorescente do iniciador no produto de PCR, assim impedindo a hibridização do oligonucleotídeo correspondente. É assim gerado um sinal de acordo com o qual os oligonucleotídeos específicos para alelos iniciaram a síntese. O produto de amplificação que incorpora um ou mais dos fluoróforos pode então ser lido como num leitor de placas de fluorescência. Os dados resultantes podem então ser compilados e uma parcela de um conjunto de um fluoróforo é gerado sobre o outro. Os genótipos resultantes são então possíveis de ser determinados com base nas parcelas de conjuntos.

[087] Nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um/uma” e “a/o” incluem as referencias plurais, salvo se o contexto claramente ordenar de outra forma. Exceto quando definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente relatório possuem o mesmo significado tal como é entendido de forma comum para um conhecedor da tecnologia, à qual pertence a presente invenção.

[088] Quando é fornecido um intervalo de valores, fica entendido que está compreendido na presente invenção cada valor no intervalo, até à décima da unidade do limite inferior, salvo se o contexto claramente ordenar de outra forma, entre o limite superior e o inferior do referido intervalo, e qualquer outro valor declarado ou interveniente no referido intervalo. Os limites superiores inferiores de estes intervalos menores podem incluídos nos intervalos de forma independente, e estão também compreendidos na presente invenção, sujeitos a qualquer limite excluído especificamente, no referido intervalo. Quando o referido intervalo inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo qualquer um ou ambos os limites incluídos, também estão incluídos na presente invenção.

[089] Todas as publicações mencionadas no presente relatório são incorporadas no presente relatório por referencia, na sua máxima extensão possível com a finalidade de descrever e revelar os componentes que são descritos nas publicações, os quais podem ser utilizados em relação a invenção presentemente descrita.

[090] A presente invenção será de seguida descrita por referencia dos seguintes exemplos, os quais se prestam a finalidades ilustrativas e não devem ser interpretados como uma limitação no âmbito da presente invenção. EXEMPLOS: Abreviações: 6FAM: 6-carboxi-fluoresceína HEX: 2',4',5',7',1,4-hexa-clorofluoresceína Dab: Bloqueador escuro não fluorescente *: Incorporação de fosforotioato (fosforotioatos (ou S-oligos) são uma variante de DNA normal, no qual um dos oxigénios, com apenas uma ligação, é substituído por um enxofre). Tm: Temperatura de Fusão do oligonucleotídeo Ta: Temperatura de Emparelhamento de uma reação de amplificação

[091] Uma série de cinco cassetes flúor/bloqueador foi usada para demonstrar o efeito da Temperatura de fusão das cassetes no controlo de uma amplificação não especifica. As sequencias de estas cassetes flúor/bloqueadores são detalhadas abaixo.

[092] Par cassete 1: Oligonucleotídeo fluorescente FAM: /6FAM /TGA GCG ATT AGC CGT TAG GAT GA Oligonucleotídeo bloqueador complementar FAM: AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA /Dab/ Oligonucleotídeo fluorescente HEX: /HEX/GCT GGT CGG TGA ACA GGT TAG AGA Oligonucleotídeo bloqueador complementar HEX: TAA CCT GTT CAC CGA CCA GC/Dab/

[093] Par cassete 2: Oligonucleotídeo fluorescente FAM: /6FAM/TCA GTG AGC GAT TAG CCG TTA GGA TGA Oligonucleotídeo bloqueador complementar FAM: AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA CTG A/Dab Oligonucleotídeo fluorescente HEX: /HEX/TAC AGC TGG TCG GTG AAC AGG TTA GAG A Oligonucleotídeo bloqueador complementar HEX: TAA CCT GTT CAC CGA CCA GCT GTA /Dab/

[094] Par cassete 3: Oligonucleotídeo fluorescente FAM: /6FAM/TGT CTC AGT GAG CGA TTA GCC GTT AGG ATG A Oligonucleotídeo bloqueador complementar FAM: AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA CTG AGA CA/Dab Oligonucleotídeo fluorescente HEX: /5HEX/ATG CTA CAG CTG GTC GGT GAA CAG GTT AGA GA Oligonucleotídeo bloqueador complementar HEX: TAA CCT GTT CAC CGA CCA GCT GTA GCA T/Dab/

[095] Par cassete 4: Oligonucleotídeo fluorescente FAM: /6FAM /ATG CTG TCT CAG TGA GCG ATT AGC CGT TAG GAT GA Oligonucleotídeo bloqueador complementar FAM: AAC CTA ACG GCT AAT CGC TCA CTG AGA CAG CAT /Dab/ Oligonucleotídeo fluorescente HEX: /5HEX/AAG CAT GCT ACA GCT GGT CGG TGA ACA GGT TAG AGA Oligonucleotídeo bloqueador complementar HEX: TAA CCT GTT CAC CGA CCA GCT GTA GCA TGC TT/Dab/

[096] Par cassete 5: Oligonucleotídeo fluorescente FAM: /6FAM/G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A Oligonucleotídeo bloqueador complementar FAM: CCTAACGGCTAATCGC/Dab/ Oligonucleotídeo fluorescente HEX: /5HEX/ G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A Oligonucleotídeo bloqueador complementar HEX: 5’AACCTGTTCACCGAC/Dab/

[097] A incorporação de fosforotioato no cassete flúor/bloqueador é descrita no pedido de patente PCT/GB2012/050645. Um numero de variantes do cassete 5 poderiam igualmente ser usadas, ao invés das listadas. Uma seleção das sequencias variantes que poderiam ser usadas para substituir as listadas, seriam: 1) /6FAM/ GCGATTAGCCGTTAGGATGA 2) /6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATG*A 3) /6FAM/ G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*AG*G*A*T*G*A 4) /HEX/ GTCGGTGAACAGGTTAGAGA 5) /HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAG*A 6) /5HEX/*G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A 7) C*CT*AA*CG*GC*TA*AT*CG*C /3Dab/ 8) CC*TA*AC*GG*CT*AA*TC*GC /3Dab/ 9) C*C*T*A*A*C*G*G*C*T*A*A*T*C*G*C /3Dab/ 10) AA*CC*TG*TT*CA*CC*GA* /3Dab/ 11) A*AC*CT*GT*TC*AC*CG*AC /3Dab/ 12) A*A*C*C*T*G*T*T*C*A*C*C*G*A*C /3Dab/

EXEMPLO 1: Determinação da temperatura de fusão dos cassetes flúor/bloqueador

[098] As temperaturas de fusão dos cassetes flúor/bloqueador foram determinadas experimentalmente. Os cassetes 1 a 5 foram incorporados em um mix de reação contendo os seguintes componentes na concentração final: 1) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com FAM 2) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com HEX 3) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador (anti-senso ao oligonucleotídeo marcado com FAM) 4) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador (anti-senso ao oligonucleotídeo marcado com HEX) 5) 8.5mM Tris / HCl pH 8.3 6) 42.5mM KCl 7) 1.8mM Cloreto de magnésio 8) 165.2uM dNTPs 9) 212.5nM 5-carboxi-X-rodamina, SE (5-ROX, SE) 10) 0.04% Igepal

[099] As temperaturas de fusão para cada cassete foram determinadas na ausência de DNA polimerase. A análise da curva de fusão para cada cassete flúor/bloqueador foi realizada em um instrumento Roche LightCycler 480 em uma placa branca com 96 poços, usando 10ul do mix de reação por poço.

[0100] A analise da curva de fusão foi precedida por aquecimento do mix a 95°C por 30 segundos. A analise da curva de fusão foi realizada de 40 a 95°C a 0,06°C/seg. Foram testadas seis réplicas para cada cassete. Os picos de fusão foram gerados a partir da curva dos dados da curva de melt pela função de análise do LightCycler 480 (-dF/dt). A Tms foi calculada usando a opção manual Tm para identificar o ponto mais baixo do pico inverso de melt (tal é necessário uma vez que o calculo automático de Tm não é possível em picos invertidos, usando este software). As Tms determinadas experimentalmente para cada cassete flúor/bloqueador são listadas abaixo:

[0101] Oligonucleotídeos fluorescentes marcados com FAM e bloqueadores correspondentes:

[0102] Oligonucleotídeos fluorescentes marcados com HEX e bloqueadores correspondentes:

EXEMPLO 2 - detecção de fluorescência 1 end-point

[0103] Foi realizada uma comparação direta entre o cassete 1 e o cassete 5. O cassete 1 tem uma Tm determinada experimentalmente acima da temperatura de emparelhamento usada para a reação de amplificação. O cassete 5 tem uma Tm determinada experimentalmente abaixo da temperatura de emparelhamento usada para a reação de amplificação (ver exemplo 1).

[0104] Todos os oligonucleotídeos foram comprados sob a forma de congelado-seco e foram re-suspendidos para 200μM de concentração inicial em 10mM de Tris/HCl a pH 8.0 Todas as diluições subsequentes foram realizadas neste diluente.

[0105] As amplificações foram realizadas em 4μl volumes de reação, em placas pretas de 384 poços. O mix de reação 1x continha os seguintes componentes: 1) 0.16 uM Iniciador 1 especifico para alelo 2) 0.16 uM Iniciador 2 especifico para alelo 3) 0.41 uM Iniciador reverso (comum) 4) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com FAM 5) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com HEX 6) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador(anti- senso ao oligonucleotídeo marcado com FAM) 7) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador(anti- senso ao oligonucleotídeo marcado com HEX) 8) 8.5mM Tris / HCl pH 8.3 9) 42.5mM KCl 10) 1.8mM Cloreto de magnésio 11) 165.2uM dNTPs 12) 212.5nM 5-carboxi-X-rodamina, SE (5-ROX, SE) 13) 0.04% Igepal

[0106] Adicionalmente aos componentes listados, cada mix deve conter 2-50μl/ml de enzima polimerase truncada em terminação-N sem atividade exonuclease. Não é essencial que a enzima seja sem atividade exonuclease, mas é preferível, particularmente para análise SNP.

[0107] Iniciadores específicos para ensaios usados: Iniciador 1 especifico para alelos: 5’GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAT3’ Iniciador 2 especifico para alelos: 5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAA3’ Iniciador reverso comum: 5’CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA3’

[0108] O uso da adição de fosforotioato aos oligonucleotídeos é descrita no pedido de patente PCT/GB2012/050645. Iniciadores de ensaio marcados com fosforotioato também podem ser usados. Exemplos de iniciadores alternativos que poderiam ser substitutos para os iniciadores listados acima: 1) 5’GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA *T3’ 2) 5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA *A3’ 3) 5’G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*AT*GA*AG*CT*CC*AC*AA *TT*TG*GT*GA*AT*TA*TC*AA*T3 4) 5’G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*AT*GA*AG*CT*CC*AC*AA *TT*TG*GT*GA*AT*TA*TC*AA*A3 5) 5’CA*CT*CT*AG*TA*CT*AT*AT*CT*GT*CA*CA*TG*GT*A3’ 6) 5’G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*A*G*G*A*T*G*A*A*T*G*A*A *G*C*T*C*C*A*C*A*A*T*T*T*G*G*T*G*A*A*T*T*A*T*C*A*A* T3’ 7) 5’G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A*T*G*A*A*G *C*T*C*C*A*C*A*A*T*T*T*G*G*T*G*A*A*T*T*A*T*C*A*A*A3 8) 5’C*A*C*T*C*T*A*G*T*A*C*T*A*T*A*T*C*T*G*T*C*A*C*A*T *G*G*T*A3’

[0109] As reações de amplificação foram executadas num aparelho de PCR Hydrocycler baseado em banho de água. As condições de amplificação foram: 94°C para 15 minutos (ativação inicio-quente) 60 ciclos de: 94°C para 20 segundos 57°C para 60 segundos (i.e. a Ta de 57oC)

[0110] Fluorescência end-point foi lida à temperatura ambiente em leitor de placas fluorescentes BMG Pherastar após a reação ser completa.

[0111] A figura 2 fornece dados ilustrativos para cada um dos três alelos que podem ser gerados usando o par de iniciadores descrito acima. A figura mostra também as posições das amostras controlo sem moldes (NTC, rodeadas) em relação as amostras de cada um dos grupos dos três genótipos. No exemplo mostrado, as amostras NTCs da reação onde Tm está abaixo de Ta da reação de amplificação (esquerda) são claramente distintas umas das outras e fornecem provas de amplificação não-específica. Os dados do exemplo para o cassete 1 (direita), para o qual a Tm está acima da Ta da reação de amplificação, mostram que os NTCs em esta reação permanecem bem agrupados, com uma fluorescência abaixo da mesma do grupo de amostra amplificados de forma apropriada. Tal indica que não foram gerados produtos não específicos.

EXEMPLO 3 - Detecção de fluorescência 2 end-point

[0112] Foi realizada uma comparação direta entre o cassete 1 e o cassete 5. O cassete 1 tem uma Tm determinada experimentalmente acima da temperatura de emparelhamento usada para esta reação de amplificação. O cassete 5 tem uma Tm determinada experimentalmente abaixo da temperatura de emparelhamento usada para esta reação de amplificação (ver exemplo 1).

[0113] Todos os oligonucleotídeos foram comprados sob a forma de congelado-seco e foram re-suspensos a 200μM de concentração inicial em 10mM de Tris/HCl a pH de 8.0. Todas as diluições subsequentes foram realizadas em este diluente.

[0114] A amplificação foi realizada em 4μl volumes de reação, em placas pretas de 384 poços. Um mix de reação de 1x contendo os seguintes compostos: 1) 0.16 uM Iniciador 1 especifico para alelos 2) 0.16 uM Iniciador 2 especifico para alelos 3) 0.41 uM Iniciador reverso (comum) 4) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com FAM 5) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com HEX 6) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador (anti-senso para oligonucleotídeo marcado com FAM) 7) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador (anti-senso para oligonucleotídeo marcado com HEX) 8) 10mM Tris / HCl pH 8.3 9) 10mM KCl 10) 1.8mM Cloreto de magnésio 11) 165.2uM dNTPs 12) 212.5nM 5-carboxi-X-rodamina, SE (5-ROX, SE)

[0115] Adicionalmente aos componentes listados, cada mix deve conter enzima polimerase truncada em terminação-N a 2-50μl/ml, sem atividade de exonuclease.

[0116] Os iniciadores específicos para ensaio usados foram: Iniciadores específicos para alelos 1: 5’ GCGATTAGCCGTTAGGATGATCATTCTCATAATCGCCCACGGA 3’ 5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATCATTCTCATAATCGCCCACGGG 3’ Iniciador reverso comum: 5’ GTAGTTTGAGTTTGCTAGGCAGAATAGTA 3’

[0117] As reações de amplificação foram realizadas em um aparelho de PCR Hydrocycler. As condições de amplificação foram: 94°C por 15 minutos (ativação inicio-quente) 10 ciclos de: 94°C por 20 segundos 61°C -55°C Descida por 60 segundos (0.6°C por ciclo) 35 ciclos de: 94°C por 20 segundos 55°C por 60 segundos

[0118] A fluorescência end-point foi lida à temperatura ambiente em leitor de placas fluorescente BMG Pherastar após finalização da reação.

[0119] A figura 3 fornece dados ilustrativos para cada um dos dois alelos que podem ser gerados usando o par de iniciadores descrito acima. A figura mostra também as posições das amostras controlo sem moldes (NTC, rodeadas) em relação às amostras de cada um dos grupos dos dois genótipos. No exemplo mostrado, as amostras NTCs da reação onde Tm está abaixo de Ta da reação de amplificação (esquerda) possuem uma fluorescência FAM substancialmente mais alta que que a dos produtos amplificados usando um iniciador HEX e uma fluorescência HEX substancialmente mais alta que a dos produtos amplificados usando um iniciador FAM. Estes dados fornecem prova de amplificação não- especifica. Exemplos de dados para cassete 1 (direita), para o qual a Tm está acima da Ta da reação de amplificação, mostram que as NTCs em esta reação se mantêm fortemente agrupadas em direção ao canto inferior esquerdo da figura. Tal indica que foram gerados poucos ou não foram gerados produtos não-específicos.

EXEMPLO 4 - Detecção de Fluorescência em tempo-real

[0120] As reações de amplificação foram realizadas em conjunto com detecção de fluorescência em tempo-real, de forma a demonstrar o efeito do aumento da temperatura de fusão do cassete flúor/bloqueador.

[0121] Todos os oligonucleotídeos foram comprados sob a forma de congelado-seco e foram re-suspendidos em concentrações iniciais de 200μM em 10mM Tris/HCl, a pH 8.0. Todas as diluições subsequentes foram realizadas neste diluentes. A amplificação em tempo-real foi realizada em 10μl de volumes de reação em uma placa branca de 96 poços. Um mix de reação 1x conteve os seguintes componentes: 14) 0.16 uM Iniciador especifico para alelo 1 15) 0.16 uM Iniciador especifico para alelo 2 16) 0.41 uM Iniciador reverso (comum) 17) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com FAM 18) 0.1uM Oligonucleotídeo marcado com HEX 19) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador (anti-senso para Oligonucleotídeo marcado com FAM) 20) 0.5uM Oligonucleotídeo marcado com bloqueador (anti-senso para Oligonucleotídeo marcado com HEX) 21) 8.5mM Tris / HCl pH 8.3 22) 42.5mM KCl 23) 1.8mM Cloreto de magnésio 24) 165.2uM dNTPs 25) 212.5nM 5-carboxi-X-rodamina, SE (5-ROX, SE) 26) 0.04% Igepal

[0122] Adicionalmente aos componentes listados, cada mix deve conter enzima polimerase truncada em terminação-N a 2-50μl/ml, sem atividade de exonuclease.

[0123] Os iniciadores específicos de ensaio usados foram: Iniciadores específicos de alelo 1: 5’GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAT3’ Iniciadores específicos de alelo 2: 5’GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAA3’ Iniciador reverso comum: 5’CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA3’

[0124] Foram testadas aplicações em tempo-real do mix descrito, em placas brancas de 96 poços no instrumento de PCR de tempo-real Roche LightCycler 480. Foram adicionados 5μl do mix de ensaio 2x a 5μl de DNA genômico humano, previamente diluído a uma concentração de 3-4ng/μl. A placa foi selada usando selo LC480 QPCR. A placa foi ciclada termicamente em máquina de PCR em tempo-real LC480 (Roche), sob as condições de ciclagem seguintes; alterações de fluorescência FAM e HEX foram registradas em tempo-real em cada ciclo. 94°C para 15 minutos (ativação início-quente) 60 ciclos de: 94°C para 10 segundos 57°C para 60 segundos (placa foi lida a esta temperatura)

[0125] O PCR foi executado por 60 ciclos para demonstrar a eficiência de Tm mais elevada de cassete flúor/bloqueador na redução de NTC da amplificação. Os resultados da detecção em tempo-real são mostrados na Figura 4. Nenhum resultado de controlo de molde está rodeado. A detecção em tempo-real de produtos NTC não- específicos não ocorre em tempo-real, uma vez que a Tm do cassete flúor/bloqueador está acima da Ta da reação de amplificação.

Claims (18)

1. Método para a detecção de um produto de extensão do iniciador caracterizado pelo fato que o método compreende os passos de: a) proporcionar um ou mais grupos de oligonucleotídeos iniciadores, cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores, em que cada conjunto compreende: i) um primeiro oligonucleotídeo iniciador (iniciador direto) possuindo uma porção específica para o alvo e uma porção fluorescente específica para o cassete a montante 5', e ii) um segundo oligonucleotídeo iniciador (iniciador reverso) tendo uma porção específica para o alvo; em que os oligonucleotídeos iniciadores em um conjunto particular são adequados, respectivamente, para a hibridização com fitas complementares de uma sequência de nucleotídeos alvo correspondente para permitir a formação de um produto de extensão do iniciador, por exemplo, um produto de PCR; e em que o primeiro oligonucleotídeo iniciador de cada conjunto do mesmo grupo contem uma porção fluorescente específica para o cassete que é capaz de hibridizar com o complemento da porção fluorescente específica para o cassete do primeiro oligonucleotídeo iniciador de qualquer conjunto no mesmo grupo; b) proporcionar um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos cassete, em que cada conjunto compreende: i) um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente (porção doadora) e consistindo em uma sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção fluorescente específica para o cassete do primeiro oligonucleotídeo iniciador de qualquer conjunto em um dado grupo de oligonucleotídeo iniciador e não compreendendo uma porção de sequência específica do alvo; e ii) um segundo oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção aceitadora (por exemplo, uma porção bloqueadora) em que o segundo oligonucleotídeo de cassete não compreende a sequência específica alvo e em que o segundo oligonucleotídeo de cassete está entre 1 a 5 bases nucleotídicas mais curtas que o primeiro oligonucleotídeo de cassete correspondente; em que cada conjunto de oligonucleotídeos cassete hibridiza com o outro para formar um par fluorescente desativado, em que o par fluorescente desativado tem uma Tm A, c) iniciar a reação de extensão do iniciador gerando assim (se o polinucleotídeo-alvo relevante está presente) uma sequência complementar ao primeiro oligonucleotídeo iniciador relevante, de tal modo que o segundo oligonucleotídeo de cassete relevante (aceitador, por exemplo, marcado com bloqueador) é menos capaz de hibridizar com o primeiro oligonucleotídeo cassete relevante (marcado com fluorescência), pelo que é gerado um sinal; e d) detectar o sinal que é gerado, em que a reação de extensão do iniciador é realizada, pelo menos em parte, a uma Ta que é menor do que a Tm A ou Tm As para um ou mais pares fluorescentes desativados.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Tm (Tm A) do par ou pares fluorescente(s) desativado(s) é menor que ou igual a 15 °C, opcionalmente, entre 1 e 15 °C; ou menor que ou igual a 10°C, opcionalmente, entre 1 e 10°C acima do Ta da reação de extensão do iniciador.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o método evita ou reduz a detecção de amplificação não específica.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que de o sinal é medido em tempo real.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o sinal é medido no ponto final da reação.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ou um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente é capaz de atuar como iniciador em uma reação de extensão do iniciador.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ou um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente não é capaz de atuar como iniciador na reação de extensão do iniciador.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a interação entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado como fluorescente (doador) e o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado como aceitador (bloqueador) é menos estável que a interação entre o oligonucleotídeo cassete fluorescente marcado como fluorescente (doador) e o produto de extensão complementar à porção fluorescente específica para o cassete a montante 5’ do oligonucleotídeo iniciador direto de cada conjunto de iniciadores do grupo relevante.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que cada grupo de oligonucleotídeos iniciadores compreende um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que existem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 grupos de oligonucleotídeos iniciadores e os conjuntos de oligonucleotídeos cassete correspondentes.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que um ou ambos os oligonucleotídeos cassete contêm uma única etiqueta, preferencialmente em que ambos os oligonucleotídeos cassete contêm uma única etiqueta.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescente contem uma etiqueta na ou próxima da extremidade 5’ do oligonucleotídeo.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador contém uma etiqueta na ou próxima da extremidade 3’ do oligonucleotídeo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das bases de pelo menos um dos oligonucleotídeos, por exemplo, pelo menos um dos oligonucleotídeos cassete, opcionalmente o nucleotídeo cassete marcado com fluorescente, é uma base modificada com fosforotioato, preferencialmente em que 20 a 80% das bases de pelo menos um dos oligonucleotídeos, por exemplo, pelo menos um dos nucleotídeos cassete, opcionalmente, o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescente, são bases modificadas com fosforotioatos.

15. Kit adequado para o uso no método para a detecção de um produto de extensão do iniciador caracterizado pelo fato de que o kit compreende: a) dois ou mais grupos oligonucleotídeos iniciadores, cada grupo compreendendo um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores, em que cada conjunto compreende: i) um primeiro oligonucleotídeo iniciador (iniciador direto) tendo uma porção específica para o alvo e uma porção fluorescente especifica para o cassete a montante 5', e ii) um segundo oligonucleotídeo iniciador (iniciador inverso), tendo uma porção específica para o alvo; em que os oligonucleotídeos iniciadores em um conjunto particular são adequados, respectivamente, para a hibridização em fitas complementares de uma sequência de nucleotídeos alvo correspondente para permitir a formação de um produto de extensão do iniciador, por exemplo, um produto de PCR; e em que o primeiro oligonucleotídeo iniciador de cada conjunto no mesmo grupo contém uma porção fluorescente específica para o cassete, que é capaz de hibridizar com o complemento da porção fluorescente específica para o cassete do primeiro oligonucleotídeo iniciador de qualquer conjunto no mesmo grupo; e b) dois ou mais conjuntos de oligonucleotídeos de cassete, em que cada conjunto compreende; i) um primeiro oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção fluorescente (porção doadora) e possuindo uma sequência que é capaz de hibridização com o complemento da porção fluorescente específica para o cassete do primeiro oligonucleotídeo iniciador de qualquer conjunto em um dado grupo de oligonucleotídeos iniciadores; e ii) um segundo oligonucleotídeo cassete marcado com uma porção receptora (por exemplo, uma porção bloqueadora) em que cada conjunto de oligonucleotídeos cassete hibridiza com o outro para formar um par fluorescente desativado, em que o par fluorescente desativado tem uma Tm A, em que cada um dos Tm As para os pares fluorescentes desativados está acima de uma temperatura adequada para uso como a Ta de uma reação de extensão de iniciador usando os oligonucleotídeos do kit, por exemplo, acima de uma temperatura entre 46 e 65 oC, por exemplo, entre 50 e 60 oC.

16. Kit, conforme definido na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os primeiros oligonucleotídeos iniciadores não estão marcados e em que o oligonucleotídeo cassete marcado com bloqueador é mais curto entre 1 e 5 bases de nucleotídeo que o oligonucleotídeo cassete marcado com fluorescente.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para uso em genotipagem SNP baseado em PCR específico para alelos, estudos de expressão genética ou estudos de variação do número de cópias.

18. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que é para uso em genotipagem SNP baseado em PCR específico para alelos, estudos de expressão genética ou estudos de variação do número de cópias.

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