JP2016508149A - 二重活性Ｈ１インバースアゴニスト／５−ＨＴ２Ａアンタゴニストとしての（チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル化合物 - Google Patents

Abstract

以下の式：（Ｉ）の二重Ｈ１インバースアゴニスト／５−ＨＴ２Ａ受容体アンタゴニスト、その使用およびその調製方法が記載される。

Description

（該当個所なし）

ヒスタミンは、少なくとも４個の異なるＧタンパク質共役受容体、Ｈ１−Ｈ４受容体とのその相互作用により種々の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ＣＮＳにおいて、Ｈ１受容体は睡眠調節サイクルにおいて重要な役割を果たし、Ｈ１アンタゴニスト／インバースアゴニストは眠気を誘導することが知られている。

同様に、セロトニンは、少なくとも１４個の異なるＧタンパク質共役受容体とのその相互作用により種々の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ＣＮＳにおける５−ＨＴ_２Ａ受容体の調節は眠気調節サイクルにおいて重要な役割を果たし、５−ＨＴ_２Ａアンタゴニストは、不眠症を患っている患者における徐波睡眠および睡眠維持を改善することが示されている。

Ｈ１または５−ＨＴ_２Ａインバースアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物（例えば、それぞれドキセピンおよびトラゾドン）は不眠症の治療に使用されており、動物の睡眠研究において有意な薬理学的効果を示している。しかしながら、選択的二重活性Ｈ１／５−ＨＴ_２Ａインバースアゴニスト／アンタゴニストは現在市販されていない。

特許文献１は、睡眠障害を治療するための特定の置換（チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾジアゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イルおよび（チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル化合物を記載している。

国際公開第２００７／０２２０６８号

本発明は、特に他のヒスタミン受容体、セロトニン受容体および他の生理学的に関連する受容体と比べて、特に５−ＨＴ_２Ｃ受容体、ＧＡＢＡ_Ａ受容体、ムスカリン受容体、ドーパミン受容体、アドレナリン受容体およびｈＥＲＧチャネルと比べて、Ｈ１受容体に対して高いインバースアゴニスト効力、５−ＨＴ_２Ａ受容体に対して高いアンタゴニスト効力、およびこれらの受容体に対して良好な選択性を有する、３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸およびその薬学的に許容可能な塩を提供する。これらの化合物はまた、動物モデルにより、これらが不十分な睡眠維持によって特徴付けられる睡眠障害の治療に有用であり得ることを実証する。このように、化合物は、例えば、慢性もしくは一過性一次性不眠症、または慢性もしくは一過性二次性不眠症、あるいはその両方などの不眠症の治療などの、不十分な睡眠潜時または不十分な睡眠維持あるいはその両方によって特徴付けられる睡眠障害の治療に有用であると考えられる。二次性不眠症の例としては、限定されないが、抑鬱障害（例えば、大鬱病性障害、気分変調および／または気分循環症）に関連する不眠症、不安障害（例えば、全般性不安障害および／または社会恐怖）に関連する不眠症、疼痛（例えば、炎症性関節炎もしくは変形関節炎、または糖尿病性神経障害に関連するものなどの線維筋痛、慢性骨痛または関節痛）に関連する不眠症、アレルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、掻痒、鼻炎、鬱血など）に関連する不眠症、肺または気道障害（例えば、閉塞性睡眠時無呼吸、反応性気道疾患など）に関連する不眠症、精神障害、認知症および／または神経変性疾患に関連する不眠症、ならびに／あるいは概日リズム睡眠障害（例えば、交代勤務睡眠障害、時差ぼけ障害、睡眠相後退障害、睡眠相前進障害および非２４時間睡眠−覚醒症候群など）に関連する不眠症が挙げられる。

本発明は、式Ｉの化合物

またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。すなわち、３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸またはその薬学的に許容可能な塩である。

本発明の別の態様において、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物が提供される。さらに、本発明のこの態様は、例えば、長時間の睡眠潜時または不十分な睡眠維持あるいはその両方によって特徴付けられる不眠症、例えば一次性不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退障害、睡眠相前進障害、および／または非２４時間睡眠−覚醒障害のような不眠症を治療するための医薬組成物であって、１種以上の薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、医薬組成物を提供する。

本発明のこの態様のさらなる実施形態は、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と、任意の他の治療成分とを組み合わせて、式Ｉに記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、例えば、哺乳動物における、長時間の睡眠潜時または不十分な睡眠維持あるいはその両方によって特徴付けられる不眠症、例えば、一次性不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退障害、睡眠相前進障害、および／または非２４時間睡眠−覚醒障害のような不眠症を治療する方法であって、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を、このような治療を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む、方法を提供する。これらの治療方法の１つの特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。

本発明はまた、療法に使用するための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。この態様において、本発明は、不眠症の治療に使用するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。さらなる実施形態において、不眠症は、例えば、一次性不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退障害、睡眠相前進障害および／または非２４時間睡眠−覚醒障害のような長時間の睡眠潜時または不十分な睡眠維持あるいはその両方によって特徴付けられる。本発明のこの態様の１つの特定の実施形態は、哺乳動物、特にヒトにおける使用である。

本発明の別の態様は、例えば、長時間の睡眠潜時または不十分な睡眠維持あるいはその両方によって特徴付けられる一次性不眠症、例えば、一次性不眠症、時差ぼけ、交代勤務睡眠障害、睡眠相後退障害、睡眠相前進障害、および／または非２４時間睡眠−覚醒障害のような不眠症の治療のための医薬の製造における式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。

明確にするために、三環系構造の以下の番号付けが本出願全体を通して使用される：

本発明の化合物は塩基性および酸性部分を有するので、多くの有機酸および無機酸ならびに塩基と反応して、薬学的に許容可能な塩を形成する。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は本出願の範囲内に意図される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、生物に対して実質的に無毒性である本発明の化合物の任意の塩を指す。このような塩としては、当業者に公知である、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、２−１９（１９７７）に記載されているものが挙げられる。

本明細書に使用される略語は以下のように定義される：
「ブライン」は飽和ＮａＣｌ水溶液を意味する。
「ＤＭＥＭ」はダルベッコ最小イーグル培地を意味する。
「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味する。
「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
「Ｅｑｕｉｖ」は等価を意味する。
「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を意味する。
「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を意味する。
「ＨＰＬＣ」は高圧液体クロマトグラフィーを意味する。
「ｈｒ．」は時間を意味する。
「ＩＣ_５０」は５０％の最大阻害が達成される濃度を意味する。
「ＬＣ−ＭＳ」はＨＰＬＣ質量分析を意味する。
「ＭｅＯＨ」はメタノールを意味する。
「ｍｉｎ．」は分を意味する。
「ＭＳ」は質量分析を意味する。
「ＭＳ（ＥＳ＋）」はエレクトロスプレーイオン化を使用した質量分析を意味する。
「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味する。
「ＲＯ」は受容体占有を意味する。
「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味する。

一般化学
本発明の化合物は以下の合成実施例に従って調製され得る。
調製例１． ２，５−ジクロロチオフェン−３−カルボニルクロリド

ジクロロメタン（５００ｍＬ）中の２，５−ジクロロ−チオフェン−３−カルボン酸（４９．７ｇ；２５２．２３ｍｍｏｌ；１．００当量）の懸濁液に、ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ；６．４７ｍｍｏｌ）、続いてジクロロメタン（１３８．７３ｍＬ；２７７．４５ｍｍｏｌ；１．１当量）中の２Ｍ塩化オキサリル溶液を１．５時間にわたって加えた（発生したガスは苛性溶液を通して通気する）。ガス発生が停止し、反応がＬＣＭＳ（反応モニタリングのために７Ｍ ＮＨ_３／ＭｅＯＨ内で試料をクエンチする）によって完了するまで、室温にて１時間、得られた透明な溶液を撹拌する。対応する一級アミドについてＭＳ（ｍ／ｚ）：＝１９５．９，１９７．９（Ｍ＋Ｈ）^＋。蒸発乾固して茶色の油（５５ｇ、２５２ｍｍｏｌ、定量的）として標題の中間体を得る。

調製例２． ２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−４−メチル−フェニル）チオフェン−３−カルボキサミド

ＴＨＦ（４５０ｍＬ）中の６−アミノ−ｍ−クレゾール（３４．１４ｇ；２７７．２０ｍｍｏｌ；１．１当量）の溶液に、ピリジン（４０．７６ｍＬ；５０４．００ｍｍｏｌ；２当量）、続いてＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の２，５−ジクロロチオフェン−３−カルボニルクロリド（５４．３０ｇ、２５２ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を、１５〜２０℃の温度を維持するために氷浴を使用して３０分にわたって加える。得られた厚い混合物を室温にて１時間撹拌して、ＬＣＭＳによってアミノフェノールの完全な消費を得た。撹拌しながら２ＭのＨＣｌ水溶液（５００ｍｌ）及び氷（２５０ｍｌ）の混合物上に注ぐ。得られたベージュ色の固体を濾過によって回収し、水で十分に洗浄し、空気中で乾燥させる。ＭＳ（ｍ／ｚ）：＝３０１．８４，３０３．９４（Ｍ＋Ｈ）^＋。４０℃にて一晩Ｐ_２Ｏ_５上で真空オーブン中で乾燥させて標題の中間体（８４．５ｇ、推定定量的）を得る。

調製例３． ２−クロロ−８−メチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−オン

ジメチルスルホキシド（４５０ｍＬ）中の２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−４−メチル−フェニル）チオフェン−３−カルボキサミド（７６．１５ｇ；２５２ｍｍｏｌ；１．００当量）の十分に撹拌した懸濁液に、炭酸カリウム（３８．３１ｇ；２７７．２０ｍｍｏｌ；１．１当量）を加え、混合物を４．５時間、１００〜１１０℃で加熱して、ＬＣＭＳによって本質的に完全な変換を得る。室温に冷却し、１Ｍ塩酸水溶液（５００ｍｌ）を含有する２つの別のビーカーにゆっくり加え、ガス発生を観察する。室温にて０．５時間撹拌し、得られた濃い灰色の固体を濾過によって回収する。水、続いて少量のエタノール、続いて少量のジエチルエーテルで連続して洗浄する。４５℃にて一晩、真空オーブン中で乾燥させて、標題の中間体（５８．５ｇ、８７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：＝２６５．９９（Ｍ＋Ｈ）^＋。

調製例４． ２，４−ジクロロ−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン

１Ｌの丸底フラスコにメトキシベンゼン（２２５ｍＬ、５Ｖ）、２−クロロ−８−メチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−オン（４５ｇ；１６９．４ｍｍｏｌ；１当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（４７．２ｇ；３８９．５ｍｍｏｌ；２．３当量）を入れる。６０℃で加熱し、塩化ホスホリル（８５．７ｇ；５５８．９ｍｍｏｌ；３．３当量）を０．５時間にわたって滴下して加える。１００℃に加温し、ＴＬＣ分析によって完了するまで２時間撹拌する。４０〜６０℃に冷却し、蒸発させて、暗褐色の固体（１２３．１ｇ、４３３．２ｍｍｏｌ、２５６％収率、アッセイによって補正されていない）として標題の中間体を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８３．８（Ｍ＋Ｈ）。

調製例５． メチル３−［４−（２−クロロ−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパノエート

１Ｌの丸底フラスコに、２，４−ジクロロ−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン（１２１．１ｇ；１６９．４ｍｍｏｌ；１．０当量）、続いてアセトニトリル（６００ｍＬ、１２．５Ｖ）、次いで炭酸カリウム（１１９．４ｇ；８６３．９ｍｍｏｌ）を一度に入れる。１０〜２０分間撹拌し、次いでメチル２，２−ジメチル−３−（ピペラジン−１−イル）プロパノエートジヒドロクロリド（５５．５４ｇ；２０３．３ｍｍｏｌ；１．２当量）を一度に加える。８０℃で加熱し、３０時間撹拌する。混合物を真空下で濃縮乾固し、次いで酢酸エチル（１９２０ｍＬ、４０Ｖ）および水（１９２０ｍＬ、４０Ｖ）を混合物中に入れる。撹拌し、濾過し、次いで水相を分離し、酢酸エチル（９６０ｍＬ、２０Ｖ）で抽出する。有機相を合わせ、水（９６０ｍＬ×２）およびブライン（２００ｍＬ、４Ｖ）で洗浄する。濃縮し、シリカゲルカラム（石油エーテル／酢酸エチル（０〜１０％））によって精製して、黄色の固体（５５．４ｇ、１２３．７ｍｍｏｌ、９５．８％純度、７３．０％収率、アッセイによって補正されていない）として標題の中間体を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４８．２（Ｍ＋Ｈ）．^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．０３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，４Ｈ），２．５８−２．５４（ｑ，６Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｓ，６Ｈ）。

調製例６． メチル３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパノエート

メチル３−［４−（２−クロロ−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパノエート（３０．００ｇ、６６．９７ｍｍｏｌ）、シクロプロピルボロン酸（７．４８ｇ、８７．０６ｍｍｏｌ）、第三リン酸カリウムｎ−水和物（４９．７５ｇ、２３４．３８ｍｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスフィンテトラフルオロボレート（２．４７ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、水（１３．３９ｍＬ、１３．３９ｇ、７４３．４ｍｍｏｌ）およびトルエン（２６７．８７ｍＬ、２３３．３６ｇ、２．５３ｍｏｌ）の混合物を１０分間、窒素により脱気する。酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．７５１ｇ、３．３５ｍｍｏｌ）を加え、１００℃にて一晩撹拌する。反応混合物を室温に冷やし、水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル抽出物（Ｎａ_２ＳＯ４）を乾燥させ、濃縮し、シリカ（ＩＳＣＯ）上でクロマトグラフし、酢酸エチル／イソヘキサン（０％：１００％〜２０％：８０％）で勾配溶出する。生成物を含有する画分を回収し、濃縮する。２５％エタノールおよび０．２％ジメチルアミンによる超臨界流体（ＣＯ_２）クロマトグラフィーを使用してさらにクロマトグラフする。生成物を含有する画分を回収し、濃縮し、真空中で６時間４０℃にて、得られた固体を乾燥させて、メチル３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパノエート（２３．７３ｇ、８２．９３％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５４．２５（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：６．９８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝１．４，８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．５０−３．４７（ｍ，４Ｈ），２．５８−２．５４（ｍ，６Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），１．９４−１．８９（ｍ，１Ｈ），１．５８（ｓ，１Ｈ），１．１９（ｓ，６Ｈ），０．９４−０．８７（ｍ，１Ｈ），０．６５−０．５９（ｍ，１Ｈ）。

実施例１． ３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸

水酸化ナトリウム（９．２７ｇ、２３１．６８ｍｍｏｌ）を、水（２１０．１８ｍＬ）およびイソプロピルアルコール（２１０．１８ｍＬ）中のメチル３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパノエート（３５．０３ｇ、７７．２３ｍｍｏｌ）のスラリーに加え、８５℃で４５分間加熱する。室温に冷やし、２Ｍの塩酸でｐＨ６〜６．５に中和する。混合物を濃縮してイソプロピルアルコールを除去し、得られた沈殿物を濾過により単離し、シンター上で洗浄する。単離した固体を真空中で４０℃にて一晩乾燥させて、３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸（３２．６ｇ、９５．１２％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４０．１（Ｍ＋Ｈ）．１Ｈ ＮＭＲ（３００．１１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．０３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝１．３，８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，Ｈ），３．７０（ｓ，４Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，４Ｈ），２．６２（ｓ，２Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），１．９７−１．９１（ｍ，１Ｈ），１．２８（ｓ，６Ｈ），０．９８−０．９１（ｍ，２Ｈ），０．６７−０．６２（ｍ，２Ｈ）。

実施例２． ３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸ジヒドロクロリド

２Ｍの塩酸（０．１１９ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１ｍＬ）および水（１ｍＬ）中の３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸（０．０４９７ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、凍結乾燥して、３−［４−（２−シクロプロピル−８−メチル−チエノ［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾオキサゼピン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２，２−ジメチル−プロパン酸ジヒドロクロリド（０．０５８ｇ、１００％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４０．２（Ｍ＋Ｈ）。

文献データ（Ｍｏｒａｉｒｔｙ ＳＲ，Ｈｅｄｌｅｙ Ｌ，Ｆｌｏｒｅｓ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｒ，Ｋｉｌｄｕｆｆ ＴＳ．（２００８） Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ５−ＨＴ_２Ａ ａｎｄ ５−ＨＴ_６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｌｅｅｐ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｓｌｅｅｐ ３１，３４−４４．；およびＢａｒｂｉｅｒ，Ａ．Ｊ．， ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｉｓｔａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｓｌｅｅｐ−Ｗａｋｅ Ｃｙｃｌｅｓ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｓｌｅｅｐ ａｎｄ Ｗａｋｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ＣＮＳ ＆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，ｖｏｌ ６，ｐｇ．３１−４３（２００７））および非臨床動物研究において生成されたデータは、不眠症の治療ならびに抑鬱障害、不安障害、疼痛、アレルギー、肺または気道障害、精神障害、認知症および／または神経変性疾患ならびに／あるいは概日リズム睡眠障害などの他の障害に関連する不眠症の対症療法における二重活性Ｈ１インバースアゴニスト／５−ＨＴ_２Ａアンタゴニストについての役割を支持している。具体的には、特定の二重活性Ｈ１インバースアゴニスト／５−ＨＴ_２Ａアンタゴニストが、過度もしくは臨床的に意義のある低活動性、ＲＥＭ睡眠の減少または傾眠過剰のないＥＥＧでモニタリングした齧歯動物を使用して、総睡眠時間の増加に効果的であることが見出される。

本化合物の特性をさらに実証するために、それらは以下のインビトロおよびインビボアッセイにおいて実施され得る。

インビトロ結合および活性アッセイ：
Ｈ１競合結合アッセイ
［^３Ｈ］−ピリラミン結合実験をＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）９６ウェル形式において実行する。このアッセイにおいて使用する膜を組換えＨ１受容体（ヒト）を安定的に発現するＨＥＫ−２９３細胞から調製する。インキュベーションは、３．５ｎＭの［^３Ｈ］−ピリラミンおよび変動する濃度の試験化合物（１０点濃度応答曲線）を含有するアッセイバッファー（６７ｍＭトリス；ｐＨ７．６）へ、ＷＧＡ ＰＶＴ ＰＡビーズ（１ｍｇ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（ＭＡ、ＵＳＡ）ＲＰＮＱ０００１）および３μｇの膜混合物を添加することによって開始する。非特異的結合は１０μＭのトリプロリジンの存在下において決定する。サンプルを室温（２２℃）で４時間インキュベーションし、次いでＭｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）Ｔｒｉｌｕｘにおいて読み取る。

５−ＨＴ _２Ａ 競合結合アッセイ
［^３Ｈ］−ケタンセリン結合実験をＳＰＡ ９６ウェル形式において実行する。このアッセイにおいて使用する膜を組換え５−ＨＴ_２Ａ受容体（ヒト）を安定的に発現するＡＶ−１２細胞から調製する。インキュベーションは、３．１ｎＭの［^３Ｈ］−ケタンセリンおよび変動する濃度の試験化合物（１０点濃度応答曲線）を含有するアッセイバッファー（６７ｍＭトリス、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．６）へ、ＷＧＡ ＹＳｉ ＳＰＡビーズ（１ｍｇ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（ＭＡ、ＵＳＡ）ＲＰＮＱ００１１）および２μｇの膜混合物を添加することによって開始する。非特異的結合は２０μＭの１−（１−ナフチル）ピペラジンの存在下において決定する。サンプルを室温（２２℃）で４時間インキュベーションし、次いでＭｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）Ｔｒｉｌｕｘにおいて読み取る。

５−ＨＴ _２Ｃ 競合結合アッセイ
［^１２５Ｉ］−（±）ＤＯＩ結合実験をＳＰＡ ９６ウェル形式において実行する。このアッセイにおいて使用する膜を組換え５−ＨＴ_２Ｃ受容体（ヒト）を安定的に発現するＡＶ−１２細胞から調製する。インキュベーションは、０．２ｎＭ［［^１２５Ｉ］−（±）ＤＯＩおよび変動する濃度の試験化合物（１０点濃度応答曲線）を含有するアッセイバッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭパルギリン、０．１％アスコルビン酸、ｐＨ７．４）へ、ＷＧＡ ＰＶＴ ＳＰＡビーズ（０．５ｍｇ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（ＭＡ、ＵＳＡ）、ＲＰＮＱ０００１）および２．５μｇの膜混合物の添加によって開始する。非特異的結合は２０μＭの１−（１−ナフチル）ピペラジンの存在下において決定する。サンプルを室温（２２℃）で４時間インキュベーションし、次いでＭｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）Ｔｒｉｌｕｘにおいて読み取る。

結合データ解析
４パラメータのロジスティック非線形方程式を使用して曲線を評価して、放射性リガンド結合の５０％阻害を引き起こす競合物の濃度（ＩＣ_５０）を得る。平衡解離定数（Ｋ_ｉ）を方程式Ｋ_ｉ＝ＩＣ_５０／（１＋Ｌ／Ｋ_ｄ）に従って計算し、式中、Ｌは実験において使用される放射性リガンドの濃度と等しく、Ｋ_ｄは受容体について放射性リガンドの一定の平衡解離と等しく、標準的な飽和分析または相同な競合実験から決定される。Ｋ_ｉについて報告された値は、ｎ値が示される場合、ｎによって示される重複した決定の数により幾何平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示される。幾何平均値は、方程式ＧｅｏＭｅａｎ＝１０＾（Ａｖｅｒａｇｅ（ｌｏｇＫ_ｉ１＋ｌｏｇＫ_ｉ２＋．．．ｌｏｇＫ_ｉｎ）／ｓｑｒｔ ｎ）によって計算される。

初代ニューロン培養におけるネイティブ受容体を使用するＧＡＢＡ _Ａ アンタゴニズム
ネイティブＧＡＢＡ_Ａ受容体に対する化合物の活性は、９６ウェルフォーマットＦＬＩＰＲ（登録商標）システム（蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ（登録商標））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、カルシウムフラックスをモニタリングすることによって評価する。簡潔には、胚性皮質ニューロンをＥ１８ラット胚から分離し、黒色壁で囲まれた透明底のポリ−Ｄ−リジンコート９６ウェルＦＬＩＰＲ（登録商標）プレートの中へ最適の密度でプレーティングする。カルシウム感受性色素（Ｆｌｕｏ４−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）と共に細胞をロードした後に、細胞を低塩化物含有溶液（塩化物をグルコン酸塩によって置き換える）中に入れる。これらの条件下で、ＧＡＢＡ_Ａ受容体の活性化は塩化物イオンの流出を引き起こし（化学勾配の方向において）、電位関門型カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）の膜脱分極およびしたがって活性化をもたらす。ＶＧＣＣを介するカルシウム流入を記録し、ＦＬＩＰＲ（登録商標）システムを使用してオフラインで分析する。アッセイの薬理学的検証のために、標準的なアゴニスト（ＧＡＢＡ）および標準的なアンタゴニスト（ギャバジン）について濃度応答曲線（ＣＲＣ）を記録する。任意の効果は１０μＭのアゴニストＧＡＢＡの固定した濃度（ＥＣ_９０ＧＡＢＡ応答と等価）に対するＣＲＣモードにおいて決定される。

方法：
化合物のアンタゴニスト効果を、化合物の存在および非存在下におけるアゴニストＧＡＢＡに対するピーク蛍光応答を比較することによって、１０点用量応答曲線を使用して定量化する。アッセイウィンドウは、ギャバジンの完全阻害濃度（５０μＭ）によって得られた応答を引いた、あらかじめ決定したＥＣ_９０濃度でのＧＡＢＡによって得られた最大応答として定義される。アンタゴニスト効果はアッセイウィンドウのパーセントとして計算される。すべてのデータは、４パラメータのロジスティック曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標）３．０１）を使用して、相対的ＩＣ_５０値として計算される。すべての化合物についてのアンタゴニスト効力は、各アッセイランにおける３つの重複測定によりギャバジンに対して比較される。

さらに、本発明の化合物は、他の生理的に重要な受容体（ｈＥＲＧチャネル、他のセロトニン受容体（特に５−ＨＴ_１Ｂ、５−ＨＴ_１Ｄ受容体、５−ＨＴ_２Ｂ受容体でのアゴニスト活性の欠如、５−ＨＴ_２Ｃ、５−ＨＴ_５、５−ＨＴ_６および５−ＨＴ_７受容体）、ドーパミン作動性受容体（特にＤ１、Ｄ２およびＤ３）、ＧＡＢＡ_Ａ受容体、アドレナリン作動性受容体およびモノアミン輸送体等であるがこれらに限定されない）についての周知の方法による結合アッセイおよび機能的活性アッセイにおいて、試験することができる。

実施例２の化合物は本質的には上記のように試験され、表１中で示されるような活性プロファイルを有することが見出される。

したがって、本発明の化合物の生理的に意義のある用量は、Ｈ１および５−ＨＴ_２Ａ受容体のインビボでの実質的な阻害を提供するが、他の生理的に意義のある受容体と実質的に相互作用しないことが期待され、したがって所望される薬理学を提供するが、標的外の活性と関連する所望されない効果を回避することが期待される。かかる所望されない効果は以下のもの含むが、これらに限定されない。治療下で出現した体重増加と関連する５−ＨＴ_２Ｃアンタゴニスト活性、弁膜症と関連する５−ＨＴ_２Ｂアゴニスト活性、ＱＴ延長と関連するｈＥＲＧチャネル修飾、および発作活動と関連するＧＡＢＡ_Ａアンタゴニスト活性。さらに、睡眠／覚醒生理的機能に対する妨害は、ドーパミン受容体、他のセロトニン受容体、アドレナリン作動性受容体およびモノアミン輸送体に関する選択性によって回避される。

５ＨＴ _２Ａ 受容体占有：受容体占有（ＲＯ）をアッセイして、５−ＨＴ_２Ａ受容体のインビボでのアンタゴニスト／インバースアゴニスト活性を実証する。簡潔には、およそ２３０〜２８０グラムの体重のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、３時間の実験プロトコルの開始まで飲水および摂食を自由にさせる。１ｍｇ／ｋｇのケタンセリン（非選択的５−ＨＴ_２Ａアンタゴニスト）をアッセイ妥当性を確立するために陽性対照として使用する。試験化合物または対照を、２０％のヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンからなるビヒクル中で経口強制投与によって投与する。ＭＤＬ １００９０７（（Ｒ）−（＋）−α−（２，３−ジメトキシフェニル）−１−［２−（４−フルオロフェニル）エチル］−４−ピペリジンメタノール）（選択的５−ＨＴ_２Ａアンタゴニスト）をトレーサーとして使用する。ＭＤＬ １００９０７を５μｌの希釈乳酸（１ｍｇ／ｍｌ）により水中で懸濁し、生理食塩水により６μｇ／ｍｌまで希釈し、１ｍＬ／ｋｇの体積で外側尾静脈を介して静脈内に投与して、３μｇ／ｋｇのトレーサー用量がもたらされる。ラットに試験化合物、ケタンセリンまたはビヒクル（Ｎ＝４）、続いて１時間後に静脈内で３μｇ／ｋｇのトレーサー用量のＭＤＬ １００９０７を投与する。ＲＯを測定するべきと判断されるのはトレーサー投与からの時間である。トレーサー投与の１５分後に、ラットは頸椎脱臼によって屠殺される。血漿サンプルを回収し、前頭皮質および小脳のサンプルを取り出す。ＭＤＬ １００９０７トレーサーのレベルを各皮質サンプルおよび小脳サンプルにおいて測定する。ＲＯはよく確立されている比率法を使用して計算され、その方法は受容体がないかまたは非常に低いレベルの領域（小脳）によって正規化された代表的な高い受容体密度の領域（前頭皮質）の全結合を用いるものである。ヌル領域と称されるこの領域は、リガンドプローブの非特異的結合を示す。小脳と比較して皮質におけるトレーサーレベルのビヒクル比は、０％占有を示す。１の比は１００％占有を示し、ＭＤＬ １００９０７トレーサーの５−ＨＴ_２Ａ受容体への特異的な結合がすべてブロッキングされる場合に達成される。試験化合物で前処理された群からの小脳トレーサーに対する皮質トレーサーの中間の比は、パーセント５−ＨＴ_２ＡＲＯを決定するために、ビヒクル処理の動物におけるトレーサーレベルの比（０％占有）と１の比（１００％占有）との間に直線補間される。

ＭＤＬ １００９０７分析：皮質サンプルおよび小脳サンプルの重量を量り、氷上のコニカル遠心分離機チューブ中に置く。４体積（ｗ／ｖ）の０．１％ギ酸を含有するアセトニトリルを各チューブに添加する。次いでサンプルをホモジナイズし、１４，０００ＲＰＭ（２１９２０×ｇ）で１６分間遠心分離する。上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のためにＨＰＬＣ注射バイアル中で１００〜９００μＬの滅菌水の添加によって希釈する。ＭＤＬ １００９０７の分析を、Ａｇｉｌｅｎｔモデル１２００ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＡＰＩ ４０００質量分析計を使用して実行する。クロマトグラフ分離は、全体的に０．１％ギ酸含有量で水中で６０％アセトニトリルからなる移動相により、２．１×５０ｍｍのＣ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔパーツ番号９７１７００−９０７）上で行なわれる。ＭＤＬ １００９０７の検出は、３７４．２対１２３．０の質量対電荷比（ｍ／ｚ）により、前駆体から産物へのイオン移行のモニタリングによって遂行される。スタンダードは、未処理のラットからの脳組織サンプルへ検体の既知量を添加し上記のように加工することによって調製する。

統計的方法：ＪＭＰ（登録商標）バージョン８．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ ＮＣ）を使用して、０％で固定されたボトムにより、各研究についての曲線を４パラメータのロジスティック関数へフィッティングさせ、絶対的ＥＤ_５０をソフトウェアによって計算する。値は平均、標準誤差および９５％の信頼区間として与えられる。実施例２の化合物は本質的に記載されるように試験され、０．４１ｍｇ／ｋｇのＥＤ_５０で高い５−ＨＴ_２Ａ受容体占有を達成することが見出される。

ＤＯＩ誘導性頭部振戦活性の阻害：本発明の化合物のインビボでの５−ＨＴ_２Ａ受容体アンタゴニスト活性を、５−ＨＴ_２Ａ受容体アゴニスト（２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（ＤＯＩ））によって誘導された頭部振戦活性をブロッキングする能力によって、さらに実証する（例えばＢａｒｔｏｓｚｙｋ ＧＤ，ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｃ，Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ Ｈ，Ｓｅｙｆｒｉｅｄ ＣＡ．ＥＭＤ ２８１０１４，ａ ｎｅｗ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ５−ＨＴ２Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３ ４７３：２２９−２３０を参照されたい）。簡潔には、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０〜２５ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、標準的な収容条件（大きなＩＶＣケージ中で３２匹のマウス、０７．００〜１９．００の明相、一定温度（１９〜２３℃）および湿度（５０％±１０）、自由飲水および摂食）において収容する。マウスに、ビヒクル（０．２５％メチルセルロース）、ＤＯＩ（生理食塩水中で３ｍｇ／ｋｇ）または１０ｍｇ／ｋｇ経口で試験化合物＋ＤＯＩ（生理食塩水中で３ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した。試験化合物は、各化合物についてｎ＝４で、ビヒクルおよびＤＯＩ＋ビヒクル（ｎ＝８）と共に、１実験あたり４群で個別に評価される。６０分間の試験化合物前処理時間後に、マウスにビヒクル（生理食塩水）または３ｍｇ／ｋｇのＤＯＩいずれかを皮下投薬し、次いで透明なパースペックス観察チャンバの中へ置く。ＤＯＩまたはビヒクル投与の５分後に、個別のマウスによって示される視覚的にスコアリングした頭部振戦の数を、１５分間カウントする。データはＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔ検定を使用して解析される。実施例２の化合物は本質的に記載されるように試験され、１０ｍｇ／ｋｇで、３ｍｇ／ｋｇＤＯＩによって生じるＤＯＩ誘導性頭部振戦応答を１００％阻害することが見出される。

ラットにおける睡眠および行動のモニタリング：本発明の化合物は、所望されない効果（ＲＥＭ睡眠の阻害、覚醒運動不全、および／または反跳性不眠症など）なしの、睡眠の量の増加もしくは睡眠中断の減少または両方の能力についてラットにおいて試験される。試験動物は、脳波図（ＥＥＧ）、筋電図（ＥＭＧ）ならびに累積非ＲＥＭ睡眠を測定する体動、累計睡眠、平均睡眠バウト継続、最長の睡眠バウト継続、反跳性不眠症、ＲＥＭ睡眠阻害および不眠の間の自発運動活性強度によって連続的にモニタリングされる。かかる研究のための方法は当該技術分野において公知である（例えばＥｄｇａｒ ＤＭ，Ｓｅｉｄｅｌ ＷＦ．Ｍｏｄａｆｉｎｉｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ｗａｋｅｆｕｌｎｅｓｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ ｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｒｅｂｏｕｎｄ ｈｙｐｅｒｓｏｍｎｏｌｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １９９７；２８３：７５７−７６９；ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ ＲＮ，Ｅｄｇａｒ ＤＭ，Ｄｅｍｅｎｔ ＷＣ．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｌｅｅｐ ｓｃｏｒｉｎｇ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍｉｃｅ．Ｓｌｅｅｐ １９９１，１４：４８−５５；およびＧｒｏｓｓ ＢＡ，Ｗａｌｓｈ ＣＭ，Ｔｕｒａｋｈｉａ ＡＡ，Ｂｏｏｔｈ Ｖ，Ｍａｓｈｏｕｒ ＧＡ，Ｐｏｅ ＧＲ．Ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ ｌｏｇｉｃ−ｂａｓｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｌｅｅｐ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；１８４（１）：１０−８．中に記載される方法を参照されたい）。研究は以下のように行なわれる。

動物調製。成体のオスのＷｉｓｔａｒラット（外科手術時でおよそ２７０〜３００ｇ）は、ＥＥＧ、ＥＭＧおよび動作の長期記録のために以下のように外科的に取り付けられる。ＥＥＧ記録のための４つのステンレス鋼ネジからなる頭蓋のインプラント（前頭部に２つ［前頂部から前方に３．９ｍｍおよび中外側に±２．０ｍｍ］および後頭部に２つ［前頂部から後方に６．４ｍｍおよび中外側に±５．５ｍｍ］）、およびＥＭＧ記録のための２つのテフロン加工のステンレス鋼ワイヤー（項部僧帽筋下に配置した）により、ラットを外科的に調製する。全ての導線を外科手術前に小型のコネクタ（Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ、Ｂｏｏｔｈｗｙｎ、ＰＡ）へはんだ付けする。インプラントアセンブリを、ステンレス鋼ＥＥＧ記録ネジ、インプラントコネクターと頭蓋骨との間に適用されたシアノアクリレート、および歯科用アクリル樹脂の組み合わせによって頭脳に貼付する。腹部の中へ外科的に置いた小型の発信機（Ｍｉｎｉｍｉｔｔｅｒ ＰＤＴ４０００Ｇ、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ、Ｂｅｎｄ、ＯＲ）を介して、自発運動活性をモニタリングする。少なくとも３週間回復させる。

記録環境。各ラットを、頭上に垂直により多くのスペースをとるように挿入したポリカーボネートフィルタートップライザーにより修飾した微隔離器ケージ内で個別に収容する。移動を最小に限定したフレキシブルケーブルを、１つの端部でケージ上部に貼付した整流子へ、および他の端部で動物の頭蓋のインプラントへ連結する。各ケージは、ステンレス鋼の睡眠−覚醒記録チャンバーの分離して換気されたコンパートメント内に位置する。餌および水は自由に利用可能であり、周囲温度は約２３±１℃で維持される。蛍光灯を使用する２４時間の明暗サイクル（ＬＤ １２：１２）を、研究の全体にわたって維持する。相対的湿度はおよそ５０％の平均である。各動物は処理前後の少なくとも３０時間安静にさせる。

研究デザインおよび投薬。ラットが同じ処理を２回受けず、そしてラットが任意の１つの研究において８つの処理のうちの２つを超えてを受けないように、ビヒクル（プラセボ、水中でメチルセルロース１５センチポアズ０．２５％）または試験化合物のうちの１つの用量レベルを１ｍＬ／ｋｇで経口で擬似無作為に投与する。各ラットの体重を量り処理するために約１分間ケージから取り出す。少なくとも６日間の「ウォッシュアウト」期間が各処理に先行および後続する。

データ収集。睡眠および覚醒の区別は自動化することができる（例えばＶａｎ Ｇｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９１（上述）；Ｅｄｇａｒ ｅｔ ａｌ．１９９７（上述）；Ｗｉｎｒｏｗ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１０；５８（１）：１８５−９４．；およびＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００９（上述））。ＥＥＧは増幅およびフィルタリングされ（Ｘ１００００、バンドパス１〜３０Ｈｚ）、ＥＭＧは増幅および積分され（バンドパス１０〜１００Ｈｚ、ＲＭＳ積分）、非特異的自発運動活性（ＬＭＡ）は同時にモニタリングされる。喚起状態は、非ＲＥＭ睡眠、ＲＥＭ睡眠、覚醒またはθ優勢覚醒として１０秒エポックに分類される。自発運動活性（ＬＭＡ）は１分あたりのカウントとして記録し、商業的に入手可能な遠隔測定レシーバー（ＥＲ４０００、Ｍｉｎｉｍｉｔｔｅｒ、Ｂｅｎｄ、ＯＲ）によって検出する。

統計解析。少なくとも１つの転帰を有する動物はすべて、要約した結果中に含まれる（例えば、遠隔測定データが使用可能であるがＥＥＧデータはそうではない動物処理からの適切なデータを含む）。処理後の観察期間は各転帰に適切な投薬後の区間へと分割され、そこで投薬の時間は開始の時間＝０として定義され、転帰は、各期間にわたって１時間ごとの平均または累積値のいずれかを計算することによって観察期間において要約される（各転帰の正確な定義については表２の凡例を参照）。睡眠バウトは変動を安定化するためにｌｏｇスケール上で解析し、他のすべての変数は直線スケールで解析する。各期間における各転帰は、因子として処理群および処理期日、ならびに共変数として対応する前処理区間（２４時間早いもの）を使用して、共分散分析によって解析する。調整された平均およびビヒクル平均からの変化ならびにそれらの対応する標準誤差は、各処理群について要約される。ｌｏｇスケールで解析した転帰を逆変換し、幾何平均値および平均比対ベヒクルの結果を報告する。

実施例２の化合物は本質的に記載されるように試験される。実施例２の化合物は、３ｍｇ／ｋｇで有意な反跳性不眠症、ＲＥＭ睡眠阻害または自発運動強度（ＬＭＩ）の阻害なしに、累積ＮＲＥＭ睡眠時間および累積睡眠時間を有意に増加させることが見出される（表２中の睡眠プロファイルおよび自発運動活性強度を参照されたい）。

表２．転帰統計：略称：Ｎ＝サンプルサイズ；Ａｄｊ．平均＝ビヒクル対照と比較して調整された群平均値；ＳＥ＝標準誤差；ＬＣＬ＝下側９５％信頼限界、ＮＥＲＭ＝非ＲＥＭ、すなわち、ＲＥＭ睡眠以外のすべての睡眠。並列の参照ビヒクルサンプルサイズはＮ＝２７であった。

定義および単位−平均はビヒクル対照からの差異を調整したものである：
・累積睡眠：分における、処理後最初の６時間にわたるもの（「全睡眠」はＮＲＥＭ睡眠＋ＲＥＭ睡眠を示す）。
・平均睡眠バウト：ビヒクル対照に対してｎ倍増加として表現される、処理後最初の６時間のにわたる１時間ごとの平均化された睡眠バウトの平均。
・最長睡眠バウト：ビヒクル対照に対してｎ倍増加として表現される、処理後最初の６時間における最長睡眠バウト。
・反跳性不眠症：点灯期間の最初の３時間の間の（すなわち処理後７、８および９時間目）ＮＲＥＭ＋ＲＥＭ睡眠の累積分。
・ＲＥＭ阻害：処理後最初の１２時間の間のＲＥＭ睡眠の累積分。
・自発運動活性（ＬＭＡ）強度：処理後最初の６時間にわたって平均化したＥＥＧで定義した覚醒の１分あたりのカウントをＬＭＡとして表現したもの。

有効性の決定。各々の４つの有効性変数についての閾有効性は、処理後の６時間の期間の間のビヒクル対照と比較した各変数における増加を、ｌｏｇ（用量）に対してプロットすることによって計算される。各変数についての閾有効性は、定義された有効性閾値、すなわち蓄積された非ＲＥＭ睡眠の＋３０分の追加、蓄積された全睡眠の＋２５分の追加、平均睡眠バウト継続における１．７５倍の増加、および最長の睡眠バウト継続における１．５倍の増加を、与える用量（４パラメータのロジスティック非直線回帰によって推測される）である。最後の値は遊離塩基濃度に関して表現される。実施例２の化合物は表３中に示されるような閾有効用量を有することが見出される。

所望されない効果の決定。各「所望されない効果」転帰変数（定義については表２の凡例を参照）を、ｌｏｇ（用量）に対してプロットする。ＲＥＭ睡眠阻害についての閾値は−１０分のＲＥＭ睡眠の累積減少として定義される。反跳性不眠症についての閾値は−２０分として定義される。ＬＭＩ減少についての閾値は、ＥＥＧで定義した覚醒の１分あたり−５の自発運動活性カウントとして定義される。有意な所望されない効果は、下側信頼限界が任意の用量での閾値より下または平均有効用量の１０倍より下になるとき、生じると定義され、そして用量応答傾向は閾有効性用量より上の用量について明らかである。実施例２の化合物について、ＲＥＭ睡眠阻害は１０ｍｇ／ｋｇで閾値を超えるが、この用量は最も控え目な有効性用量の０．７８ｍｇ／ｋｇの１０倍を超える（表３）。負の値は、ＲＥＭ阻害、反跳性不眠症および減少したＬＭＩを示す。上記のプロットにおいて、アスタリスクは所与の用量についてのビヒクルに対する統計的有意性を示すが、望ましくない効果を必ずしも示すわけではない。したがって、ＲＥＭ阻害、反跳性不眠症またはＬＭＩの減少の望ましくない事例は、最も控え目な有効性用量の１０倍内で観察されないことが結論付けられる。

血漿クリアランス：望まれない効果（所望される睡眠期間を超える延長された傾眠、日中の眠気、覚醒後の認知力不全など等）を回避するために、好ましいクリアランス率により身体から適切にクリアランスされることは睡眠障害（不眠症等）の治療に有用な化合物において重要である。本発明は改善されたクリアランス率を備えた化合物を提供する。クリアランス率は本質的に以下に記載されるようにアッセイすることができる。

留置大腿動脈カニューレを備えたオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重範囲２５０〜３２０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ ０１８８７、ＵＳＡから得る。試験化合物は、１．０ｍｇ／ｍＬの最終薬物濃度（遊離塩基等価物）で、２２．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２）中の２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で、溶液（１ｍＬ／ｋｇ）で静脈内に投与される。血液サンプルは２４時間にわたり留置カニューレを使用して得られる。血漿のサンプルを遠心分離によって得て、分析前に凍結（−２０℃）またはドライアイス上で保存する。

オスのビーグル犬（体重範囲１０〜１２ｋｇ）をＭａｒｓｈａｌｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＵＳＡから得る。試験化合物は、１．０ｍｇ／ｍＬの最終薬物濃度（遊離塩基等価物）で、２２．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２）中の２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で、溶液（１ｍＬ／ｋｇ）で静脈内に投与される。血液サンプルは２４時間にわたり頚静脈から得られる。血漿のサンプルを遠心分離によって得て、分析前に凍結（−２０℃）保存する。

凍結された血漿サンプルを、試験化合物の濃度のバイオ分析のために室温へ融解する。アセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中の関連する内部スタンダード化合物を、血漿のすべてのサンプルに添加する（１：１、ｖ／ｖ）。サンプルを遠心分離して沈殿させたタンパク質を分析前に除去する。上清は、Ｊａｖｅｌｉｎ Ｂｅｔａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２０×２．１ｍｍカートリッジ、移動相Ａ：水／１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、２０００：１０ ｖ／ｖ、移動相Ｂ：ＭｅＯＨ／１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、２０００：１０ ｖ／ｖ）上でのインジェクションおよび迅速な勾配溶出によって分析する。溶出した検体は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００トリプル四重極質量分析計を使用するＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析によって検出する。化合物の濃度は、同一の条件下で調製および分析したスタンダードから決定する。クリアランスは、Ｗａｔｓｏｎ ７．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）中の非コンパートメント分析を使用して計算する。

実施例２の化合物は本質的に記載されるように実行され、以下の好ましいクリアランスプロファイルを有することが見出される。
実施例 クリアランス（ｍＬ／分／Ｋｇ）
イヌ
２ ６．０６（＋／−０．９０）

製剤化なしに本発明の方法において用いられるような化合物を直接投与することは可能であるが、化合物は通常、活性成分としての化合物またはその薬学的に許容される塩ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物の形態で投与される。これらの組成物は、経口、舌下、鼻腔、皮下、静脈内および筋肉内を含む多様な経路によって投与することができる。それらの調製のためのかかる医薬組成物およびプロセスは当該技術分野において周知である。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ編、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．、２００５年）を参照されたい。

単位投薬量形態において好ましくは製剤化され、各投薬量は約０．１〜約６０ｍｇ、通常約０．５〜約３０ｍｇ、例えば約１〜約１０ｍｇの間の活性成分を含有する。「単位投薬量形態」という用語はヒト被験体および他の哺乳類についての一体型投薬量として好適な物理的に不連続の単位を指し、各単位は計算された既定量の活性材料を含有して、少なくとも１つの好適な薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共同して所望される治療法上の効果を産生する。

式Ｉの組成物は概して広範囲の投薬量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの投薬量は、通常約０．００２〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、より通常約０．００８〜０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．０１５〜０．１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。いくつかの実例において、前記範囲の下限より下の投薬量レベルが適切であるよりも多いが、他の事例において、任意の有害な副作用も引き起こさずにさらに多い用量を用いることができ、したがって上記の投薬量範囲はいかなる方法でも本発明の範囲を限定することは意図しない。実際に投与される化合物の量は、治療条件、選ばれた投与経路、投与される実際の化合物（複数も含む）、個別の患者の年齢、重量、および応答ならびに患者の症状の重症度を含む関連する状況を考慮して、医師によって決定されることが理解されるだろう。

Claims (13)

1. 以下の式の化合物：
   

   

   またはその薬学的に許容可能な塩。
2. ＨＣｌ塩である、請求項１に記載の化合物。
3. 少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、医薬組成物。
4. 有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における不眠症を治療する方法。
5. 前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。
6. 前記不眠症が、睡眠開始もしくは睡眠維持またはその両方の困難性によって特徴付けられる、請求項４に記載の方法。
7. 前記哺乳動物がヒトである、請求項６に記載の方法。
8. 療法に使用するための請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
9. 不眠症の治療に使用するための請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
10. 前記不眠症が、睡眠開始もしくは睡眠維持またはその両方の困難性によって特徴付けられる、請求項９に記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
11. ヒトにおける請求項９または１０に記載の使用のための化合物。
12. 不眠症を治療するための医薬の製造における請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用。
13. 前記不眠症が、哺乳動物における睡眠開始もしくは睡眠維持またはその両方における困難性によって特徴付けられる、請求項１２に記載の使用。