JP2016505272A - 高血糖症の治療のためのアポリポタンパク質ａ−ｉ由来ペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）に由来するペプチドおよび高血糖症を伴う障害の治療または予防におけるその使用に関する。【選択図】図４

Description

本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）に由来するペプチドおよび高血糖症を伴う障害の治療または予防におけるその使用に関する。
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分であるため、コレステロール逆輸送に重要である（Ｚａｎｎｉｓら（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８４：２７６−２９４）。
アポＡ−Ｉおよびその様々なフラグメントが文献で知られている。例として、改変ヒトアポＡ−Ｉポリペプチドおよびその様々な使用について記載している米国特許出願公開第２０１１／０１７８０２９号が挙げられる。裏付けとなるＱｉｎら（２０１１）のＡｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５０：１２２１８−１２２２１には、様々なタンパク質のトリプシン切断によって生成した後、質量分析により分析したペプチドが多数開示されており、これに多数のアポＡ−Ｉペプチドが含まれている。このほか、中国特許公開第ＣＮ１０２３２３３６５Ａ号がアポＡ−Ｉのフラグメントを開示している。ほかにも、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でアポＡ−Ｉ−Ｍ（Ｍｉｌａｎｏ）を産生する発現系を開示している国際公開第９４／１３８１８９号からわかるように、アポＡ−Ｉを組換えにより作製する方法が知られている。
アポＡ−Ｉタンパク質は、様々な形態のＨＤＬおよび無脂質状態において様々な構造的構成で存在している（Ｒｙｅら（２０００）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５０（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１９５−Ｓ２００）。脂質結合型には、直径が異なる平たい円盤状ＨＤＬ粒子ならびに大きさおよび脂質組成の異なる成熟した球状ＨＤＬ粒子がともに含まれる。アポＡ−Ｉの機能を決定するその重要な特徴としては、アポ状態と脂質結合状態との間で二次構造、三次構造および四次構造に大きな変化をもたらす高度な構造的可塑性に加えて、脂質集合によって形成されるらせんの両親媒性が挙げられる。
無脂質／脂質の少ないアポＡ−Ｉは通常、血漿中に存在するが、血漿アポＡ−Ｉ全体では最大でも５％を占めるにとどまり、細胞膜から流出するコレステロールおよびリン脂質を受け取る。アポＡ−Ｉの脂質化が進行すると円盤状ＨＤＬが生じ、アポＡ−ＩがＨＤＬ画分中へ再循環される。したがって、完全長アポＡ−Ｉは、国際公開第２０１２／２８５２６号、米国特許出願公開第２０１２／００２１９８２号および米国特許出願公開第２０１１／２１２１３９号に開示されるように、治療投与する前にＨＤＬと合成的に一体化させる必要がある疎水性分子である。
アポＡ−Ｉの生物物理学的特性の生物物理学的利用が、例えば、溶解性ならびに輸送粘膜との結合および輸送粘膜を通過する輸送を増大することを目的としたアポＡ−Ｉと様々な治療用ペプチドとの結合を開示している国際公開第２０１２／１５３６２０号に示唆されている。また別の例には、細胞内への脂質の流入促進に完全長アポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉのフラグメントを使用することを開示している米国特許出願公開第２００８／０２２７６８６号がある。
高血糖症による徴候に関連して、血漿グルコースクリアランスの主要部位である骨格筋中へのグルコースの取込み速度が細胞表面のＧＬＵＴ４レベルによって決まることが知られており、このＧＬＵＴ４レベルはインスリンシグナル伝達経路および収縮により誘発されるＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）経路の両方によって制御されている（Ｔｒｅｍｂｌａｙら（２００３）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：ｄ１０７２−ｄ１０８４）。
さらに、無脂質アポＡ−Ｉおよび球状ＨＤＬがＡＭＰＫの活性化を介してＣ２Ｃ１２筋管内（Ｈａｎら（２００７）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５０：１９６０−１９６８）および糖尿病患者ドナー由来の筋サテライト細胞から分化したヒト筋管内（Ｄｒｅｗら（２００９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１９：２１０３−２１１１）へのグルコース取込みを引き起こし得ることが示されている。本出願の優先日以前にこのような観察結果が得られているが、円盤状ＨＤＬが筋肉のグルコース取込みを特異的に調節することができるのかどうか、またこの調節がＡＭＰＫを介して生じるのかどうかは明らかにされていない。また、前述の作用を誘発するアポ−Ｉのドメインもわかっていない。
本発明者らは、ＨＤＬ亜種が異なる方法で血管壁の細胞受容体と相互作用してコレステロールを排出すること、また円盤状ＨＤＬがこの相互作用のための強力な構造であること（Ｆａｖａｒｉら（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：１１０６７−１１０７４）を考慮して、円盤状ＨＤＬが筋肉のグルコース取込みの刺激に高い効果を示すのではないかという仮説を立てた。そこで本発明者らは、Ｌ６筋管および単離した初代短指屈筋（ＦＤＢ）骨格筋線維を用いて、合成の円盤状ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）およびアポＡ−Ｉ由来ペプチドがグルコース取込み、細胞内シグナル伝達および細胞膜（筋細胞膜）へのＧＬＵＴ４転移に及ぼす効果を検討した。そこで本発明者らは驚くべきことに、脂肪体と結合していないアポＡ−ＩのＣ末端に由来するペプチドが細胞のグルコース取込みを誘導することができ、したがって、血糖値に有益な効果があることを発見した。したがって、このようなペプチドは血中グルコース値の上昇を特徴とする疾患の治療に有用である。
したがって、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
長さが１００アミノ酸未満であり、
前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である、
ポリペプチドを提供する。
本発明者らは、アポＡ−ＩのＣ末端ドメインに由来する生物活性ペプチド、例えば配列番号３、４、６および９〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、実質的にこれよりなる単離ポリペプチドなどのほか、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターなどのベクターならびに前記ポリヌクレオチドおよび／または前記ベクターを含む宿主細胞を特定した。
本発明のある態様はほかにも、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクターおよび前記宿主細胞を含む医薬組成物に関する。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする代謝疾患および／または血管疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリヌクレオチドであって、発現時に本明細書の上に定義されるポリペプチドをコードする核酸配列ポリヌクレオチドを含むポリペプチドに関する。
別の態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする代謝疾患および／または血管疾患を治療または予防する方法に使用するための前記ポリヌクレオチドを含むベクターならびに前記ポリヌクレオチドおよび／または前記ベクターを含む宿主細胞に関する。
ある特定の態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする代謝疾患および／または血管疾患の治療および／または予防のための医薬の調製における、
ａ）本明細書で定義される単離ポリペプチド；
ｂ）本明細書で定義される単離ポリヌクレオチド；
ｃ）本明細書で定義されるベクター；および
ｄ）本明細書で定義される単離細胞
からなる群より選択される薬剤の使用に関する。
本発明者らは、アポＡ−ＩのＣ末端ドメインおよびそのペプチドフラグメントが血中グルコースクリアランスの改善をもたらすことを発見した。したがって、前記ポリペプチドおよびペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳動物の血中グルコース高値による障害の治療のための治療薬として有用である。したがって、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする代謝疾患および／または血管疾患の治療および／または予防のための医薬の調製における、
ａ）単離ポリペプチドであって、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
を含むポリペプチド、
ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
からなる群より選択される薬剤の使用に関する。
本発明はほかにも、高血糖症および／または高インスリン血症を特徴とする代謝疾患および／または血管疾患の治療のための方法であって、治療を必要とする個体に、
ａ）単離ポリペプチドであって、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
を含むポリペプチド、
ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
からなる群より選択される治療有効量の薬剤を投与することを含む方法に関する。
さらに本発明は、一態様では、血中グルコースを低下させる方法であって、哺乳動物と、
ａ）単離ポリペプチドであって、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
を含むポリペプチド、
ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
からなる群より選択される治療有効量の薬剤とを接触させることを含む方法に関する。
円盤状ＨＤＬは筋肉でのグルコース取込みおよびＧＬＵＴ４グルコース輸送体の転移を誘導するのに効果的である。ａ）無脂質（左の構造）、円盤状ＨＤＬ（中央の構造）および球状ＨＤＬ（右の構造）の状態のアポＡ−Ｉの構造モデルであり、ＨＤＬ成熟において構造が大幅に再構成されることを示している。薄灰色の部分はリン脂質、コレステロールおよびコレステリルエステルの核を示している。ｂ）Ｌ６筋管のグルコース取込み。Ｌ６筋管を２時間、血清不足の状態にした後、５０μｇ／ｍｌ（１．６μｍｏｌ／ｌ）アポＡ−Ｉまたはインスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）で刺激し、未刺激の対照筋管（Ｃ）と比較した。ｃ）同様に、血清不足の状態にしたＬ６筋管を５０μｇ／ｍｌ（１．６μｍｏｌ／ｌ）ｒＨＤＬ（アポＡ−Ｉ／ＰＯＰＣ）またはインスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）で刺激するか、未刺激（Ｃ）とした後、グルコース取込みアッセイを実施した。ｄ）短指屈筋（ＦＤＢ）線維に５０μｇ／ｍｌ（アポＡ−Ｉ）ｒＨＤＬ、１００ｎｍｏｌ／ｌインスリンまたは未刺激の処置を６０分間実施した後のＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ局在の変化。筋線維を固定し免疫蛍光法を実施した。サイズバーは１０μｍである。画像は、それぞれ２〜４個体の筋線維を用いて実施した３つの別個の実験の代表的なものである。（ｂでは＊＊＊ｐ≦０．００１、ｎ＝４であり、ｃではｎ＝３である）。 ｒＨＤＬにより刺激されるグルコース取込みにおけるリン脂質の役割。ａ）Ｌ６筋管を２時間、血清不足の状態にした後、５０μ／ｍｌ（１．６μｍｏｌ／ｌ；アポＡ−Ｉ）ＤＭＰＣ ｒＨＤＬ、インスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）または０．１６ｍｍｏｌ／ｌもしくは２．２９ｍｍｏｌ／ｌのＤＭＰＣ １００ｎｍ小胞で６０分間刺激したのち、グルコース取込みを測定した。（ｎ＝３、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１）。ｂ）無脂質アポＡ−Ｉ（４．５μｇ）、ＰＯＰＣ ｒＨＤＬ（４．９μｇアポＡ−Ｉ）およびＤＭＰＣ ｒＨＤＬ（５．６μアポＡ−Ｉ）を示すクーマシー染色ブルーネイティブＰＡＧＥ。 Ｌ６筋管におけるＡＭＰＫ、ＡＣＣおよびＡｋｔのリン酸化に対するｒＨＤＬの効果。筋管を４時間、血清不足の状態にした後、ｒＨＤＬ（７００μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉ）、２ｍｍｏｌ／ｌもしくは０．４ｍｍｏｌ／ｌフェンホルミン、１００ｎｍｏｌ／ｌもしくは１ｎｍｏｌ／ｌインスリンまたは対照（Ｃ）で６０分間刺激した。ａ）ホスホ−ＡＭＰＫおよびＡＭＰＫ、ｃ）ホスホ−ＡＣＣおよびＡＭＰＫならびにｆ）ホスホ−ＡｋｔおよびＡｋｔに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した溶解物の濃度測定分析。ｂ）、ｄ）およびｅ）は代表的なウエスタンブロットを示している。結果は、ｎ＝２の１ｎｍｏｌ／ｌインスリンを除いて、３つの独立した実験のものである。エラーバーは、ＳＤであるｆを除いてＳＥＭを示している；＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。 アポＡ−Ｉの特定領域のグルコース取込みに対する効果。ａ）グルコース取込みを含めた効力を分析したアポＡ−Ｉフラグメントを直線で模式的に表したもの（ＦＬアポＡ−Ｉ、完全長アポＡ−Ｉ）。ｂ）２時間血清不足の状態にした後、ヒトアポＡ−Ｉの残基１〜１８９、４４〜１８９、４４〜２４３または１９０〜２４３（配列番号１）を表すペプチド（いずれも５０μｇ／ｍｌ完全長（ＦＬ）アポＡ−Ｉと等モルの１．６μｍｏｌ／ｌ）または１００ｎｍｏｌ／ｌインスリン（Ｉｎｓ）で６０分間刺激したＬ６筋管または未刺激のＬ６筋管（Ｃ）におけるグルコース取込みを測定した（ｎ＝３−４；＊ｐ≦０．０５、＊＊＊ｐ≦０．００１）。ｃ）ｅｘ ｖｉｖｏで６０分間、アポＡ−Ｉの１９０〜２４３フラグメント（配列番号１）（１．６μｍｏｌ／ｌ）またはインスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）で刺激するか、未刺激としたＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰトランスジェニックマウスのＦＤＢ線維の免疫蛍光画像。サイズバーは１０μｍである。画像は、１つの実験当たり２〜４匹のマウスのＦＤＢ線維を用いた３つの独立した実験を示している。 配列番号１の１９０〜２４３アポＡ−Ｉフラグメントの特性。ａ）溶液中の１９０〜２４３フラグメント（１９０〜２４３；０．２６μｇ）およびＬ６筋管と６０分間インキュベートした後の１９０〜２４３フラグメント（１９０〜２４３培地；０．２６μｇ）のネイティブゲル分析。無脂質アポＡ−Ｉ（アポＡ−Ｉ；４．４μｇ）およびｒＨＤＬ（アポＡ−Ｉ；９．４μｇ）を参照試料として用いている。ｒＨＤＬ／アポＡ−Ｉのレーンの２４２ｋＤａと１４６ｋＤａの間に見られるバンドはｒＨＤＬに対応し、６６ｋＤａと２０ｋＤａの間に見られるバンドは完全長アポＡ−Ｉ（１〜２４３）に対応する。１９０〜２４３および１９０〜２４３培地のレーンの６６ｋＤａと２０ｋＤａの間に見られるバンドは１９０〜２４３オリゴマーに対応する。ｂ）ＰＢＳ緩衝溶液中、０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で分析した完全長アポＡ−Ｉ（実線）および１９０〜２４３フラグメント（点線）の円二色性スペクトル。 無脂質アポＡ−Ｉの１９０〜２４３フラグメントはｒＨＤＬの構造とほぼ同じ構造をとり得る。左側は、無脂質構造モデル（下）では折り畳まれ濃い灰色で示されている１９０〜２４３フラグメント（上）の構造である。右側は、１９０〜２４３フラグメントを円盤状ＨＤＬ（下）中でのアポＡ−Ｉのこの領域の構造配置と対応させて、伸長した両親媒性α−へリックスとして濃い灰色で示したもの（上）である。矢印は、溶液中で平衡状態にある無脂質１９０〜２４３アポＡ−Ｉフラグメントが、ＨＤＬに類似した両親媒性α−ヘリックス構造にシフトすることを示している。 グルコース取込みおよびグルコース輸送体ＧＬＵＴ４の転移におけるＨＤＬ中のアポＡ−Ｉの効果。ａ）無脂質（左の構造、Ｌａｇｅｒｓｔｅｄｔら（２０１２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ａｃｔａ；１８２１：４４８−４５５）、円盤状ＨＤＬ（中央の構造、Ｌａｇｅｒｓｔｅｄｔら（２０１１）Ｊ ｏｆ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１；２８６：２９６６−２９７５）および球状ＨＤＬ（右の構造、Ｓｉｌｖａら（２００８）ＰＮＡＳ １０５：１２１７６−１２１８１）の状態のアポＡ−Ｉの構造モデルであり、ＨＤＬ成熟において構造が大幅に再構成されることを示している。円盤状ＨＤＬおよび球状ＨＤＬの構造内にはリン脂質、コレステロールおよびコレステリルエステルの核が薄灰色で示されている。ｂ）無脂質ヒトアポＡ−Ｉ（４．５μｇ）およびＰＯＰＣ ｒＨＤＬ（４．９μｇアポＡ−Ｉ）を示すクーマシー染色ブルーネイティブＰＡＧＥ。ｃ）円盤状ＨＤＬはＬ６筋管でのグルコース取込みを誘導するのに効果的である。Ｌ６筋管を２時間、血清不足の状態にした後、６０分間、２μｍｏｌ／ｌ（６０μｇ／ｍｌ）ＰＯＰＣ ｒＨＤＬ（ｒＨＤＬ中のアポＡ−Ｉの総タンパク質濃度として表される）、インスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）または１００ｎｍ ＰＯＰＣ小胞（０．１０ｍｍｏｌ／ｌ）で刺激するか、未刺激（Ｃ）としたのち、グルコース取込みを測定した（ｎ＝３、＊ｐ≦０．０５。ｄ）短指屈筋（ＦＤＢ）線維に１μｍｏｌ／ｌ ｒＨＤＬ（３０μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉ）、１００ｎｍｏｌ／ｌインスリンまたは未刺激の処置を６０分間実施した後のＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ局在の変化として測定した、筋肉でのＧＬＵＴ４グルコース輸送体の転移。筋線維を固定し免疫蛍光法を実施した。白矢印（上パネル）は、細胞膜に局在するＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ（抗ＨＡ抗体で同定される）の免疫蛍光シグナルを示している。中央パネルはＧＦＰ蛍光シグナルを示している。下パネルは、ＧＦＰシグナルとＨＡシグナルのマージ画像を示している。サイズバーは１０μｍである。画像は、それぞれ２〜４個体の筋線維を用いて実施した３つの別個の実験の代表的なものである（ｎ＝３、±ＳＥＭ；＊ｐ≦０．０５）。 アポＡ−Ｉの特定領域のグルコース取込みおよび細胞内シグナル伝達経路に対する効果。ａ）グルコース取込みを誘導する効力を分析したアポＡ−Ｉフラグメントを直線で模式的に表したもの（ＦＬアポＡ−Ｉ、完全長アポＡ−Ｉ）。ｂ）２時間血清不足の状態にした後、等モルの粒子濃度（１μｍｏｌ／ｌ）のアポＡ−Ｉの残基１〜２４３、１〜１８９、４４〜１８９、４４〜２４３または１９０〜２４３（配列番号１）を表すペプチドまたは１００ｎｍｏｌ／ｌインスリン（Ｉｎｓ）で６０分間刺激したＬ６筋管または未刺激のＬ６筋管（Ｃ）におけるグルコース取込みを測定した。ペプチド処置については、１〜２４３、１〜１８９、４４〜１８９および４４〜２４３では単量体または二量体形成（１μｍｏｌ／ｌペプチド単位）、１９０〜２４３では二量体または四量体（２μｍｏｌ／ｌペプチド単位）に基づくものとした。（ｎ＝３−４；＊ｐ≦０．０５、＊＊＊ｐ≦０．００１）。ｃ）筋管を４時間、血清不足の状態にした後、２μｍｏｌ／ｌ、１０μｍｏｌ／ｌもしくは２０μｍｏｌ／ｌの１９０〜２４３ペプチド、１ｍｍｏｌ／ｌのフェンホルミン（Ｐｈｅｎ）、１００ｎｍｏｌ／ｌのインスリン（Ｉｎｓ）または対照（Ｃ）で６０分間処置し、次いで、リン酸化ＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ；上パネル）またはリン酸化Ａｋｔ（下パネル）のウエスタンブロット分析を実施した。チューブリンをローディング対照として使用した。示されるブロットは３つの独立した実験の代表的なものである。 初代単離筋線維におけるＧＬＵＴ４グルコース輸送体の転移および脂肪細胞におけるグルコース取込みに対するアポＡ−Ｉの１９０〜２４３領域のｅｘ ｖｉｖｏでの効果。ａ）アポＡ−Ｉ（２μｍｏｌ／ｌ）の１９０〜２４３フラグメント（配列番号１）、インスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）または未刺激の処置を６０分間実施したＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ（赤血球凝集素−ＧＬＵＴ４−緑色蛍光タンパク質）トランスジェニックマウスから得られた初代骨格ＦＤＢ（短指屈筋）線維の免疫蛍光画像。サイズバーは１０μｍである。筋線維を固定し免疫蛍光法を実施した。白矢印（上パネル）は、細胞膜に局在するＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ（抗ＨＡ抗体で同定される）の免疫蛍光シグナルを示している。中央パネルはＧＦＰ蛍光シグナルを示している。下パネルは、ＧＦＰシグナルとＨＡシグナルのマージ画像を示している。１つの実験当たり２〜４匹のマウスのＦＤＢ線維を用いた３つの独立した実験を示している。ｂ）単離ラット脂肪細胞をインスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）、１９０〜２４３ペプチドフラグメント（配列番号１）（３０μｇ／ｍｌ）または１〜２４３アポＡ−Ｉタンパク質（１５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処置した後、グルコース取込みを測定した。データは基底値（対照）に対する増加倍数で表されている。（ｎ＝３；＊ｐ≦０．０５）。 アポＡ−Ｉの１９０〜２４３領域のｉｎ ｖｉｖｏグルコース耐性に対する効果。ａ）インスリン抵抗性Ｃ５７ＢＩ／６マウスにアポＡ−Ｉの１９０〜２４３フラグメントによる急性治療を実施することにより、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）におけるグルコース処理能が改善される。ＨＦＤマウスをアポＡ−Ｉの１９０〜２４３フラグメント（四角）またはＮａＣｌ（丸；対照）の単回注射（７ｍｇ／ｋｇ体重）で３時間治療した。マウスにＮａＣｌまたはアポＡ−Ｉの１９０〜２４３フラグメントを注射した３時間後にグルコースを腹腔内に負荷した（５０ｍｇ／マウス）のち、示される時点で（ａ）グルコースおよび（ｃ）インスリンの濃度を測定した。（ｂ）および（ｄ）はそれぞれ、ＧＴＴ時のグルコース値およびインスリン値の曲線下面積（ＡＵＣ）値を示している。ｎ＝３−４；ｐ値は図示される通りである。 アポＡ−Ｉの１９０〜２４３領域内のペプチド（２３量体または２７）およびそのｉｎ ｖｉｖｏグルコース耐性能に対する影響。インスリン抵抗性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにアポＡ−Ｉペプチドによる急性治療を実施した後、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）におけるグルコース処理能を測定した。ＨＦＤマウスを２３〜２７量体ペプチドの単回注射（６〜７ｍｇ／ｋｇ体重）で３時間治療した：ａ）２７量体（アミノ酸１９０〜２１６）；ｂ）２３量体（アミノ酸２０４〜２２６）；ｃ）２７量体（アミノ酸２１７〜２４３）。マウスにＮａＣｌまたはペプチドを注射した３時間後にグルコースを腹腔内に負荷した（５０ｍｇ／マウス）のち、示される時点でグルコース濃度を測定した。ｄ）はＧＴＴ時のグルコース値のＡＵＣ値を示している。ｅ）はＧＴＴ時のグルコース値のＡＵＣ値（基底グルコース値より上の部分）を示している。ｎ＝３〜４。 アポＡ−Ｉの１９０〜２４３領域内のペプチド（１８量体）およびそのｉｎ ｖｉｖｏグルコース耐性能に対する影響。インスリン抵抗性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにアポＡ−Ｉペプチドによる急性治療を実施した後、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）におけるグルコース処理能を測定した。ＨＦＤマウスを１８量体ペプチドの単回注射（７ｍｇ／ｋｇ体重）で３時間治療した：ａ）１８量体（アミノ酸１９０〜２０７）；ｂ）１８量体（アミノ酸２０８〜２２５）；ｃ）１８量体（アミノ酸２２６〜２４３）。マウスにＮａＣｌまたはペプチドを注射した３時間後にグルコースを腹腔内に負荷した（５０ｍｇ／マウス）のち、示される時点でグルコース濃度を測定した。ｄ）はＧＴＴ時のグルコース値のＡＵＣ値を示している。ｅ）はＧＴＴ時のグルコース値のＡＵＣ値（基底グルコース値より上の部分）を示している。ｎ＝３〜４。
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
アポＡ−Ｉ：本明細書で使用されるアポＡ−Ｉ（アポＡ−１、アポＡＩおよびアポＡ１と呼ばれることもある）は、任意の種、特にチンパンジー、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマを含めた哺乳動物、好ましくはヒトから、天然、合成、半合成または組換えに関係なく任意の入手源から得られる実質的に純粋なアポＡ−Ｉのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。この用語はほかにも、上に挙げたいずれかの種から得られるアポＡ−Ｉの生物学的に活性なフラグメントのほか、これらの生物学的に活性な配列変異体および翻訳後修飾を受けたタンパク質を指す。
コード配列：本明細書で使用される「コード配列」という用語は、転写されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列のことである。
発現ベクター：本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができるベクターを指す。一般に、組換えＤＮＡ技術に用いる発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。
フラグメント：本発明によるポリペプチドフラグメントは、その任意の機能的な同等物を含め、一実施形態では、配列番号１〜１０３５または前記配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％）同一であるその変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸残基未満、例えば１４０アミノ酸残基未満など、例えば、１３０アミノ酸残基未満、例えば１２０アミノ酸残基未満など、例えば、１１０アミノ酸残基未満、例えば１００アミノ酸残基未満など、例えば、９０アミノ酸残基未満、例えば８５アミノ酸残基未満など、例えば、８０アミノ酸残基未満、例えば７５アミノ酸残基未満など、例えば、７０アミノ酸残基未満、例えば６５アミノ酸残基未満など、例えば、６０アミノ酸残基未満、例えば５５アミノ酸残基未満など、例えば、５０アミノ酸残基未満、例えば４５アミノ酸残基未満など、例えば、４０アミノ酸残基未満、例えば３５アミノ酸残基など、例えば、３０アミノ酸残基、例えば２５アミノ酸残基など、例えば２０アミノ酸残基など、例えば、１５アミノ酸残基、例えば１０個の隣接するアミノ酸残基を含み得る。このほか、本発明によるポリペプチドフラグメントは、その任意の機能的な同等物を含め、一実施形態では、配列番号１〜１０３５または前記配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％）であるその変異体からなる群より選択される１０アミノ酸残基超、例えば、１５アミノ酸残基超、例えば２０アミノ酸残基超など、例えば、２５アミノ酸残基超、例えば、５０アミノ酸残基超、例えば７５アミノ酸残基超など、例えば、１００アミノ酸残基超、例えば１２５アミノ酸残基超など、例えば、１３０アミノ酸残基超、例えば１４０アミノ酸残基超など、例えば、１４５アミノ酸残基超を含み得る。活性なフラグメントの例としては、配列番号２〜１０３５のうちの１つまたは複数が挙げられる。フラグメントは長さが１０〜１５０アミノ酸、例えば、配列番号１〜１０３５のいずれか１つから選択される１５〜１４０個、２０〜１３０個、２５〜１２０個、２５〜１１０個、２５〜１００個、２５〜９０個、２５〜８０個、２５〜７０個、２５〜６０個、２５〜５４個、３０〜５４個、２０〜４０個または２０〜３０個の連続するアミノ酸残基であり得る。
高血糖症：高血糖症とは、過剰な量のグルコースが血漿中を循環している状態のことである。これは一般に、グルコース値が１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄｌ）より高いことであるが、１５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ（約２５０〜３００ｍｇ／ｄｌ）などのさらに高値になるまで症状が顕著になり始めない場合がある。一貫して１００ｍｇ／ｄｌ〜１２６ｍｇ／ｄｌの範囲であれば（米国糖尿病協会ガイドライン）高血糖であると見なされ、一般に１２６ｍｇ／ｄｌまたは７ｍｍｏｌ／ｌを上回れば糖尿病であるとされる。値が慢性的に７ｍｍｏｌ／ｌ（１２５ｍｇ／ｄｌ）を超えれば、器官の損傷を引き起こし得る。ほとんどの人（空腹時成人）の正常範囲は一般に、約８０〜１１０ｍｇ／ｄｌまたは４〜６ｍｍｏｌ／ｌである（この場合、８０ｍｇ／ｄｌが「至適」である）。血中グルコース値は、当該分野の様々な既知の技術を用いて、例えば市販の血中グルコースメータ、持続グルコースモニタ（ＣＧＭ）またはグルコース感知生体埋込の使用などにより測定され得る。慢性高血糖症は、正常値よりわずかに高くても、長年にわたって腎損傷、神経損傷、心血管系損傷、網膜の損傷または下肢の損傷を含めた多岐にわたる重篤な合併症を来たし得る。長期間にわたる高血糖症により糖尿病性ニューロパチーを来たすことがある。急性または慢性高血糖症により以下に挙げる症状がみられることがあり、最初の３つは高血糖症の古典的三徴である：過食（強い、または頻繁な空腹感）、多飲（過剰な、または頻繁な口渇）、多尿（頻尿）、霧視、疲労、体重減少、創傷治癒不良、口内乾燥、皮膚の乾燥または掻痒感、足および踵の刺痛感、勃起不全、外耳感染症などの感染症の反復、心不整脈、昏迷、昏睡、発作。
増大する：血漿中半減期に関連して使用される増大するという用語は、同等の条件下で求めたとき、アポＡ−Ｉ由来ペプチドの関連する半減期が、ことを示すのに使用される。例えば、関連する半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％など、例えば、少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％または５００％増大し得る。文献に記載されている多数の方法でｉｎ ｖｉｖｏ血漿中半減期の測定を実施することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ血漿中半減期はクリアランスの減少または平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大として定量化され得る。適切なアッセイでクリアランスを測定したとき、クリアランスがアポＡ−Ｉ由来ペプチドのクリアランスの７０％未満、例えば５０％未満など、例えば２０％未満など、例えば１０％未満などに減少している本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドのことを、ｉｎ ｖｉｖｏ血漿中半減期が増大したと言う。適切なアッセイでＭＲＴがアポＡ−ＩのＭＲＴの１３０％超、例えば１５０％超など、例えば２００％超など、例えば５００％超などに増大している本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドのことを、ｉｎ ｖｉｖｏ血漿中半減期が増大したと言う。クリアランスおよび平均滞留時間は適切な試験動物を用いた標準的な薬物動態試験で評価することができる。所与のタンパク質に適した試験動物を選択することは、当業者の能力の範囲内にある。当然のことながら、ヒトでの試験が最終的な試験となる。適切な試験動物としては、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット、マウスおよびカニクイザルが挙げられる。通常、マウスおよびラットでは単回皮下ボーラスで注射するが、サルでは単回皮下ボーラスまたは単回静脈内投与で注射し得る。注射量は試験動物によって決まる。その後、必要に応じて１〜１０日間にわたって（アッセイの感度によっては３０日間に及ぶ場合もある）血液試料を採取して、クリアランスおよびＭＲＴを評価する。血液試料はＥＬＩＳＡ技術をはじめとする免疫学的技術により分析するのが好都合である。
インスリン抵抗性：個体の組織が、血流中のインスリンが不十分であるかのように振る舞い、インスリン反応ならびに肝臓、脂肪組織および骨格筋のグルコース取込みの減少に反映される場合、「インスリン抵抗性」であると言う。インスリン抵抗性に対する最初の反応は身体の感度低下を補うためのインスリンの補償的産生および分泌であり、これが高インスリン血症を引き起こす。したがって、インスリン高値および血流からのグルコースクリアランスに対する組織の反応性の低下がインスリン抵抗性の特徴である。インスリン抵抗性は代償的高インスリン血症、脂質異常症、膵臓ベータ細胞の代償不全および高血糖症を含めた一連の代謝変化をもたらす初期事象である。インスリン抵抗性の徴候および症状には、頭がぼんやりして集中できないこと、血中グルコース高値、腸の膨満感、眠気、体重増加、脂肪蓄積（特に腹部臓器の周囲）、減量困難、血中トリグリセリド値上昇、血圧上昇、心血管疾患の原因となる炎症誘発性サイトカインの増加、うつ、黒色表皮腫、空腹感の増大がある。インスリン抵抗性は、当該分野の様々な技術、例えば、当該分野でよく用いられる正常血糖高インスリンクランプ法または改変インスリン分泌抑制試験を用いることによって診断することが可能である。
リンカー：本明細書で使用される「リンカー」という用語は、原子価結合または多官能性部分、例えばアポＡ−Ｉフラグメントと、アポＡ−Ｉと結合した薬学的に許容される分子とを隔てることによって血漿中半減期などの半減期を増大させる二官能性部分を意味する。
正常脂質値：本明細書で使用される「正常脂質値」という用語は、問題の管轄区域の中心的な保健衛生当局の推奨に従った血中または血漿中脂質値として解釈されるべきである。例えば、欧州では、欧州アテローム性動脈硬化症学会（欧州）によるガイドラインで総コレステロール５．２ｍＭ未満、ＬＤＬ−コレステロール１．８ｍＭ未満、ＨＤＬコレステロール１．０ｍＭ超、トリグリセリド１．７ｍＭ未満とされている。米国心臓協会（米国）によるガイドラインでは、総コレステロール２００ｍｇ／ｄｌ未満、ＬＤＬ−コレステロール１００ｍｇ／ｄｌ未満、ＨＤＬコレステロール６０ｍｇ／ｄｌ超、トリグリセリド１００ｍｇ／ｄ未満である。１２時間絶食後の血液試料により脂質プロファイルが得られる。
作動可能に連結された：本明細書で使用される作動可能に連結されたという用語は、目的とするヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列が発現できる（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、または宿主細胞にベクターを導入する場合は宿主細胞内で発現できる）ように組換え発現ベクター内の制御配列（１つまたは複数）と連結されていることを意味するものとする。
薬学的に許容される分子：本明細書で使用される薬学的に許容される分子という用語は、アポＡ−Ｉと結合したときにアポＡ−Ｉの血清中半減期を減少させる有機小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、グリコシル化物、糖、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ホルモンまたはその変異体のいずれか１つから選択される分子を意味する。通常、薬学的に許容される分子は、特に限定されないが、アルブミン、例えばヒトアルブミン、組換えアルブミンなどまたはポリマー、例えばＰＥＧ、例えば、分子量が少なくとも１０ｋＤａ、例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａなどのＰＥＧなどである。さらに、薬学的に許容される分子は、哺乳動物抗体のＦｃフラグメント、トランスフェリン、ヒトアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン、アルブミンの変異体、ｎが８〜２２のＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−またはポリマー、例えばＰＥＧ、例えば、分子量が少なくとも５ｋＤａ、例えば１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａなどのＰＥＧ、通常は１０〜４０ｋＤａのＰＥＧなどから選択され得る。
血漿中濃度：本明細書で使用される血漿中濃度という用語は、本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチド投与後の所与の時間に循環血中で測定することができる濃度を意味する。
ポリマー：本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、２つ以上のモノマーの共有結合によって形成される分子を意味し、このモノマーはいずれも、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富に存在する血漿タンパク質である場合を除いて、アミノ酸残基ではない。「ポリマー」という用語は「ポリマー分子」という用語と互換的に使用され得る。この用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化によって結合した炭水化物分子を包含する。Ｎ−またはＯ−グリコシル化（以下でさらに記載される）のようなｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化によって結合した炭水化物分子を本明細書では「オリゴ糖部分」と呼ぶ。ポリマー分子の数が明記される場合を除いて、本発明で使用する「ポリマー」または「ポリマー分子」に言及する場合はいずれも、１つまたは複数のポリマー分子を指すものとする。ポリマーは水溶性または不水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ部分などであり得る。ＰＥＧ部分は、平均の大きさが５００Ｄａ〜２００，０００Ｄａ、例えば５００Ｄａ〜１００，０００Ｄａなど、例えば２０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａなどの範囲から選択される。このようなＰＥＧ分子は、すなわちＳｈｅａｒｗａｔｅｒ社から検索され得る。
制御配列：本明細書で使用される「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。
血清中半減期：「血漿中半減期」または「半減期」と互換的に使用される場合がある血清中半減期という用語は、その通常の意味、すなわち、生体系内のアポＡ−Ｉ由来ペプチドの量がその半分の濃度まで減少するのに必要な時間という意味で使用される。したがって、本明細書で使用される「血清中半減期」はｉｎ ｖｉｖｏの血清中半減期を意味する。多くの場合、血清中半減期を求める方が機能的半減期を求めるよりも容易であり、血清中半減期の長さは通常、機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の優れた指標となる。血清中半減期は好ましくは哺乳動物で、より好ましくはオランウータン、チンパンジーまたはゴリラなどのヒト科の種で、より好ましくはヒトで求める。本願で言及される血清中半減期はヒトで決定される半減期である。このほか、マウス、ラットまたはハムスターなどのげっ歯類で半減期または半減期の何らかの変化の指標を得てもよい。さらに、これより大型で体重がヒトと範囲にある、あるいはげっ歯類よりも体重に近い哺乳動物、好ましくはサル、イヌ、ブタまたはウシ（仔ウシ）で半減期を測定してもよい。
配列番号Ｘ〜Ｚ：本明細書で使用される「配列番号Ｘ〜Ｚ」という用語は、用語中のＸとＺがＺ＞Ｘとなる２つの整数であり、整数ＸおよびＺならびにＸとＺの間のあらゆる整数、例えばＸ、Ｙ、Ｚなどを含めたＸからＺの区間（Ｘ〜Ｚ）を包含するものとして解釈されるべきである。したがって、配列番号１〜８という用語は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む区間として解釈されるべきである。同様に、配列番号１〜１０３５は、
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の配列を含むものして解釈されるべきである。
配列同一性：高レベルの配列同一性は、第一の配列が第二の配列に由来する可能性を示すものである。アミノ酸配列の同一性には、整列させた２つの配列の間に同一のアミノ酸配列が必要である。したがって、参照配列との間に７０％のアミノ酸同一性を有する候補配列には、整列後、候補配列中のアミノ酸の７０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることが必要である。同一性は、特に限定されないが、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータ整列プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）およびそこに示される初期パラメータなどのコンピュータ解析によって決定され得る。ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアは欧州バイオインフォマティクス研究所のＣｌｕｓｔａｌＷ ＷＷＷ Ｓｅｒｖｉｃｅとしてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗから入手可能である。このプログラムをその初期設定で用いて、問い合わせポリペプチドの成熟（生物活性）部分と参照ポリペプチドを整列させる。完全に保存されている残基の数をカウントし、参照ポリペプチドの長さで除する。
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを同様に用いてヌクレオチド配列を整列させ得る。アミノ酸配列について示したのとほぼ同じ方法で配列同一性を計算し得る。
対象：本明細書で使用される「対象」という用語は、アポＡ−Ｉポリペプチドフラグメントまたはポリヌクレオチドまたは治療用細胞または生体適合性カプセルを投与し得る任意の哺乳動物を意味するものと見なされる。本発明の方法による治療が特に意図される対象としては、ヒトおよびヒト以外の霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラットならびにマウスのほか、これらの宿主に由来する、またはこれを起源とする臓器、腫瘍および細胞が挙げられる。
形質転換：本明細書で使用される形質転換という用語は、宿主細胞内に外来ポリヌクレオチド（すなわち、「導入遺伝子」）を挿入することを指す。外来ポリヌクレオチドは宿主ゲノム内に組み込まれる。
医薬品：「医薬品」、「薬物」または「医薬」は、患者の病気、疾苦、病態、疾患または傷害の治療（予防、診断、緩和または治癒を含む）に使用し得る本発明による薬剤の任意の治療的または予防的使用を指す。医薬品または薬物という用語の意味には、治療に有用な遺伝的決定基、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが包含される。本明細書で定義されるように、「治療剤」、「医薬品」、「薬物」または「医薬」は一種の生物活性物質である。
医薬組成物：または薬物、医薬または薬剤は、患者に適切に投与したときに所望の治療効果をもたらすことができる任意の化学的もしくは生物学的材料、化合物または組成物を指す。一部の薬物は、ｉｎ ｖｉｖｏで医薬活性のある代謝産物に変換される不活性型で販売されている。本発明の目的のためには、「医薬組成物」および「医薬」という用語は、活性物質それ自体または不活性な薬物とその活性代謝物を包含するのが好ましい。
変異体：本明細書で使用される「変異体」という用語はアミノ酸配列変異体を指し、前記変異体は好ましくは、配列番号１〜１０３５の所定の配列と少なくとも６０％の同一性、例えば少なくとも６３％の同一性、例えば少なくとも６６％の同一性など、例えば少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも７２％の配列同一性、例えば少なくとも７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性など、例えば少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９２％の配列同一性など、例えば少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば９９％の配列同一性を有する。
ベクター：本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それと連結された別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。ベクターの一種に「プラスミド」があり、これはほかのＤＮＡセグメントを連結することが可能な環状二本鎖ＤＮＡループを指す。プラスミドは最もよく使用される形態のベクターであるため、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」が互換的に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを包含するものとする。
ＩＩ．適応症および治療
代謝疾患
本発明者らは驚くべきことに、アポＡ−ＩのＣ末端アミノ酸配列が親水性溶質内で物理的に安定な分子であると同時に、グルコース取込み特性が持続することを発見した。当業者には、現時点で活性なペプチドを医薬効果を有するさらに短いペプチドに短縮した場合にも、この物理的安定性が維持されることが予想される。
そこで本発明者らは、アポＡ−ＩのＣ末端に由来するペプチドが細胞のグルコース取込みを誘導することが可能であり、したがって血中グルコース値に有益な効果をもたらすことを発見した。したがって、このようなペプチドは血漿グルコースクリアランスに何らかの効果があり、血中グルコース値の上昇を特徴とする疾患の治療に有用である。
この発見の治療効果は、これらのペプチドが代謝疾患の治療または代謝疾患が発症するリスクのある哺乳動物の予防的治療に有用であるという点にある。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
長さが１００アミノ酸未満であり、
前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である、
ポリペプチドに関する。
別の態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導であり、
長さが２００アミノ酸未満、好ましくは１９０アミノ酸未満、より好ましくは１８０アミノ酸未満、より好ましくは１７０アミノ未満、より好ましくは１６０アミノ酸未満、より好ましくは１５０アミノ未満、より好ましくは１４０アミノ酸未満、より好ましくは１３０アミノ酸未満、より好ましくは１２０アミノ酸未満、より好ましくは１１０アミノ酸未満、より好ましくは１００アミノ酸未満、より好ましくは９０アミノ酸未満、より好ましくは８０アミノ酸未満、より好ましくは７０アミノ酸未満、より好ましくは７５アミノ酸未満、より好ましくは７０アミノ酸未満、より好ましくは６５アミノ酸未満、より好ましくは６０アミノ酸未満、より好ましくは５５アミノ酸未満である、
ポリペプチドに関する。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための医薬の調製における、
ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体
を含む単離ポリペプチド、
ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
からなる群より選択される薬剤の使用に関する。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療する方法であって、治療を必要とする個体に、
ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
を含む単離ポリペプチド、
ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
からなる群より選択される治療有効量の薬剤を投与することを含む方法に関する。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
長さが１００アミノ酸未満である、
ポリペプチドに関する。
配列変異体は、生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である任意の生物学的に活性な変異体であり得る。好ましくは、変異体は、配列番号１の任意のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に変化し、ただし、１５個以下のアミノ酸がこのように変化した配列番号１の配列変異体、例えば前記配列番号１に関して１４個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して１３個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して１２個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して１１個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して１０個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して９個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して８個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して７個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して６個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して５個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して４個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して３個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して２個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して１個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体である。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と９０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本明細書で定義される使用のためのポリペプチドは、本明細書で定義されるアミノ酸配列のいずれか１つから実質的になるものであり、例えば、配列番号１〜１０３５のいずれか１つから実質的になるものである。
一実施形態では、本明細書で定義される使用のためのポリペプチドは、本明細書で定義されるアミノ酸配列のいずれか１つからなるものであり、例えば、配列番号１〜１０３５のいずれか１つからなるものなどである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対する保存的置換がもたらされるように任意のアミノ酸が変化した変異体ポリペプチドである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対してＡｌａ １、Ｇｌｕ ２、Ｔｙｒ ３、Ｈｉｓ ４、Ａｌａ ５、Ｌｙｓ ６、Ａｌａ ７、Ｇｌｕ ９、Ｌｅｕ １１、Ｌｅｕ １４、Ｇｌｕ １６、Ｌｙｓ １７、Ｐｒｏ ２０、Ｌｅｕ ２２、Ｇｌｕ ２３、Ａｓｐ ２４、Ｌｅｕ ２５、Ａｒｇ ２６、Ｌｅｕ ２９、Ｐｒｏ ３１、Ｇｌｕ ３４、Ｌｙｓ ３７、Ｇｌｕ ４５、Ｇｌｕ ４６、Ｌｙｓ ４９、Ｌｙｓ ５０、Ｌｅｕ ５１、Ｇｉｎ ５４の位置に保存アミノ酸残基を含む。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対してＧｌｕ ２、Ｔｙｒ ３、Ｌｅｕ １１、Ｌｅｕ １４、Ｇｌｕ １６、Ｌｙｓ １７、Ｐｒｏ ２０、Ａｓｐ ２４、Ｌｅｕ ２９、Ｐｒｏ ３１、Ｇｌｕ ３４、Ｌｙｓ ３７、Ｇｌｕ ４５の位置に保存アミノ酸残基を含む。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは完全長のプレプロアポＡ−Ｉではない。
別の実施形態では、本発明によるポリペプチドは完全長のプロアポＡ−Ｉではない。
別の実施形態では、本発明によるポリペプチドは完全長の成熟アポＡ−Ｉではない。
本発明の生物活性を示すポリペプチドは、ヒトアポＡ−ＩのＣ末端ドメイン（すなわち、ＡＡ１９０〜２４３）に由来するペプチド、例えば、本明細書で定義される配列番号１またはそのフラグメントもしくは変異体などであることを理解するべきである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは融合タンパク質の一部ではない、すなわち、前記実施形態では、本発明のポリペプチドは、インスリンまたはＧＬＰ−１などの治療活性のあるさらなるポリペプチドとペプチド結合によってもペプチドリンカーを介しても結合していない。
本発明のペプチドは、血中グルコース高値を直接的または間接的な原因とする任意の疾患の治療に有用である。当業者には、血中および／または血漿グルコース値を低下させることによって治療または予防が可能な疾患が認識できる。一実施形態では、高血糖症を特徴とする疾患は代謝疾患である。
非インスリン依存型糖尿病（成人発症型糖尿病、非ケトン性糖尿病、安定型糖尿病、２型糖尿病および若年者の非インスリン依存型糖尿病を含む）は、血中グルコース値の上昇およびインスリン標的組織（肝組織、筋組織および脂肪組織）のインスリン抵抗性を特徴とする。本発明のアポＡ−Ｉペプチドは血中グルコースクリアランスを改善するほか、インスリン標的組織のインスリン感受性を改善する可能性があり、これにより非インスリン依存型糖尿病の病因が抑制されることから、このペプチドを投与することによって非インスリン依存型糖尿病を治療することができる（Ｔｕｒｎｅｒら（１９９９）ＪＡＭＡ ２８１（２１）：２００５−２０１２；Ｎａｔｈａｎら（２００２）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：１３４２−１３４９；Ｋａｄｏｇｌｏｕら（２００７）３０（９）：２２４２−２２４４）。
したがって、一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、内分泌・代謝疾患および肥満症からなる群より選択される。この疾患群には、特に非インスリン依存型糖尿病、例えば成人発症型糖尿病、非ケトン性糖尿病、安定型糖尿病、２型糖尿病および若年者の非インスリン依存型糖尿病などが含まれる。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患の治療に使用するためのものであり、前記疾患は化学的および潜在性糖尿病；耐糖能異常；および／または前糖尿病を含めたグルコース負荷試験異常である。
したがって、一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は２型糖尿病および／またはインスリン抵抗性である。
本明細書で示されるように（例えば、図１０）、本発明によりグルコースクリアランスが増加する。したがって、本発明は、従来の糖尿病の治療法を補う、またはこれに代わるものとして有用である。一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は１型糖尿病である。
カロリーの過剰摂取によるものを含めた肥満症は、健康に悪影響を及ぼす程度まで脂肪組織が蓄積した状態と定義され、糖尿病および心血管疾患を含めた多数の慢性疾患の主要な危険因子の１つとなっている。この病態はカロリー摂取の増加および運動不足が原因であることが最も多い。本発明のアポＡ−Ｉペプチドによりインスリン感受性が改善されるほか、体重減少がもたらされる可能性があり、これがメタボリック症候群および糖尿病による若年死のリスクを軽減することによって肥満症の病因を抑制するため、このペプチドを投与することによって肥満症を治療することができる（Ｇｏｌａｙら（２００７）Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．８７（２）：５０７−２０）。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は肥満症、例えば、過剰な摂食などの過剰なカロリー摂取による肥満症である。
ＰＣＯＳと略される多嚢胞性卵巣症候群（硬化嚢胞性卵巣症候群およびスタイン・レヴェンタール症候群を含む）は最もよくみられる女性の内分泌障害の１つである。原因は遺伝によるものであると考えられているが、よくみられる症状には、卵巣内に多数認められる小嚢胞、男性ホルモン高値および不規則月経がある。本発明のアポＡ−Ｉペプチドによりグルコースクリアランスが改善されることによりインスリン感受性が改善されるほか、ＰＣＯＳによる高アンドロゲン血症が改善し、ＰＣＯＳによる月経異常および慢性無排卵症が正常化する可能性があるため、このペプチドを投与することによってＰＣＯＳの症状が改善する可能性が考えられる（Ｍｏｇｈｅｔｔｉら（２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．８５（１）：１３９−４６）。
したがって、一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、硬化嚢胞性卵巣症候群およびスタイン・レヴェンタール症候群などの多嚢胞性卵巣症候群からなる群より選択される内分泌・代謝疾患である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高血糖症、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症および多嚢胞性卵巣症候群からなる群より選択される代謝疾患である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、インスリン抵抗性によって引き起こされる代謝疾患であり、前記疾患は、肝臓のインスリン抵抗性、骨格筋のインスリン抵抗性および／または脂肪組織のインスリン抵抗性からなる群より選択される。
一実施形態では、本発明のペプチドは、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高血糖症、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症および多嚢胞性卵巣症候群の治療および／または予防に使用するためのものである。本発明のポリペプチドの治療効果は、疾患に関連する骨格筋のインスリン抵抗性の治療のほか、肝臓のインスリン抵抗性または脂肪組織のインスリン抵抗性にも適している。
アポＡ−ＩのＣ末端ドメインに由来するペプチドに加えて、本発明はほかにも、配列番号１の生物学的に活性なポリペプチド、変異体およびフラグメントのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの医学的使用に関する。
したがって、一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリヌクレオチドであって、発現時に本明細書で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
さらなる態様では、本発明はほかにも、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するためのベクターであって、発現時に本明細書で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、ベクターに関する。一実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。
ベクターは本発明のポリペプチドを発現するのに適した任意のベクターであってよく、したがって、ベクターは当業者によって選択され得る。一実施形態では、ベクターは、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピローマウイルスおよびＭｏ−ＭＬＶからなる群より選択され、好ましくはアデノ随伴ウイルスである。
さらなる態様では、本発明はほかにも、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離宿主細胞であって、本明細書で定義されるポリヌクレオチドおよび／またはベクターで形質転換または形質導入された細胞に関する。細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを収容するのに適した任意の宿主細胞であってよい。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
一実施形態では、細胞は、幹細胞、筋細胞、肝細胞、脂肪細胞ならびにα細胞、β細胞およびδ細胞などの膵臓細胞からなる群より選択される。
別の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＩ１９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｉＢ５細胞、ＲＮ３３ｂ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択される。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための医薬の調製における、
ａ）本明細書で定義される単離ポリペプチド；
ｂ）本明細書で定義される単離ポリヌクレオチド；
ｃ）本明細書で定義されるベクター；および／または
ｄ）本明細書で定義される単離細胞
からなる群より選択される薬剤の使用に関する。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患の治療に使用するためのものである。
さらなる実施形態では、本発明によるポリペプチドはほかにも、高インスリン血症を特徴とする疾患の治療に使用するためのものである。
心血管疾患
高血糖症を直接的または間接的な原因とするその他の病態には、各種の心血管障害がある。循環血中グルコースの濃度を低下させることにより、心臓および血管の病的機序を予防および／または阻害することができる。
したがって、さらなる態様では、本発明は、高血糖症に起因する心血管疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；および
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
長さが１００アミノ酸未満であり、
前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である、
ポリペプチドに関する。
別の態様では、本発明は、心血管疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；および
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導であり、
長さが１００アミノ酸未満、好ましくは１００アミノ酸未満、より好ましくは９０アミノ酸未満、より好ましくは８０アミノ酸未満、より好ましくは７０アミノ酸未満、より好ましくは７５アミノ酸未満、より好ましくは７０アミノ酸未満、より好ましくは６５アミノ酸未満、より好ましくは６０アミノ酸未満、より好ましくは５５アミノ酸未満である、
ポリペプチドに関する。
一態様では、本発明は、高血糖症を特徴とするか、これに起因する心血管疾患を治療する方法であって、治療を必要とする個体に、
ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
を含む単離ポリペプチド、
ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
からなる群より選択される治療有効量の薬剤を投与することを含む方法に関する。
一態様では、本発明は、高血糖症および／または高インスリン血症を特徴とするか、これに起因する心血管疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
長さが１００アミノ酸未満である、
ポリペプチドに関する。
配列変異体は、生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である任意の生物学的に活性な変異体であり得る。好ましくは、変異体は、配列番号１の任意のアミノ酸残基が別のアミノ酸に変化し、ただし、１５個以下のアミノ酸がこのように変化した配列番号１の配列変異体、例えば前記配列番号１に関して１４個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して１３個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して１２個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して１１個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して１０個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して９個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して８個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して７個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して６個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して５個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して４個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して３個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体、例えば前記配列番号１に関して２個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体など、例えば、前記配列番号１に関して１個以下のアミノ酸がこのように変化した変異体である。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と９０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の実施形態では、一実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本明細書で定義される使用のためのポリペプチドは、本明細書で定義されるアミノ酸配列のいずれか１つから実質的になるものであり、例えば、配列番号１〜１０３５のいずれか１つから実質的になるものなどである。
一実施形態では、本明細書で定義される使用のためのポリペプチドは、本明細書で定義されるアミノ酸配列のいずれか１つからなるものであり、例えば、配列番号１〜１０３５のいずれか１つからなるものなどである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対する保存的置換がもたらされるように任意のアミノ酸が変化した変異体ポリペプチドである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対してＡｌａ １、Ｇｌｕ ２、Ｔｙｒ ３、Ｈｉｓ ４、Ａｌａ ５、Ｌｙｓ ６、Ａｌａ ７、Ｇｌｕ ９、Ｌｅｕ １１、Ｌｅｕ １４、Ｇｌｕ １６、Ｌｙｓ １７、Ｐｒｏ ２０、Ｌｅｕ ２２、Ｇｌｕ ２３、Ａｓｐ ２４、Ｌｅｕ ２５、Ａｒｇ ２６、Ｌｅｕ ２９、Ｐｒｏ ３１、Ｇｌｕ ３４、Ｌｙｓ ３７、Ｇｌｕ ４５、Ｇｌｕ ４６、Ｌｙｓ ４９、Ｌｙｓ ５０、Ｌｅｕ ５１、Ｇｉｎ ５４の位置に保存アミノ酸残基を含む。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対してＧｌｕ ２、Ｔｙｒ ３、Ｌｅｕ １１、Ｌｅｕ １４、Ｇｌｕ １６、Ｌｙｓ １７、Ｐｒｏ ２０、Ａｓｐ ２４、Ｌｅｕ ２９、Ｐｒｏ ３１、Ｇｌｕ ３４、Ｌｙｓ ３７、Ｇｌｕ ４５の位置に保存アミノ酸残基を含む。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは完全長のプレプロアポＡ−Ｉではない。別の実施形態では、本発明によるポリペプチドは完全長のプロアポＡ−Ｉではない。さらに別の実施形態では、本発明によるポリペプチドは完全長の成熟アポＡ−Ｉではない。
本発明の生物活性を示すポリペプチドは、ヒトアポＡ−ＩのＣ末端ドメイン（すなわち、ＡＡ１９０〜２４３）に由来するペプチド、例えば、本明細書で定義される配列番号１またはそのフラグメントもしくは変異体などであることを理解するべきである。
高脂血症は血中脂質値が上昇する複数の病態（ほとんどが、コレステロールが上昇する「高コレステロール血症」もしくはトリグリセリドが上昇する「高グリセリド血症」またはその両方の組合せを含む）を包含するものである。本発明のアポＡ−Ｉペプチドにより血中グルコースの管理が改善され脂質分解が阻害されることにより、肝臓で産生されるＬＤＬコレステロールが減少し、これが高脂血症の病因を抑制するため、このペプチドを投与することによって高脂血症を治療することができる（Ｓｏｌａｎｏら（２００６）Ｃａｒｄｉｏｌ Ｒｅｖ．１４（３）：１２５−３５；Ｋｌｏｐら（２０１３）Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ５：１２１８−１２４０）。したがって、本発明は以下に挙げる適応症の治療に有用である。
グルコース値を調節することによって本発明により治療可能な疾患としてはさらに、単純な高コレステロール血症（家族性高コレステロール血症、フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＩａ型、高βリポタンパク血症、高脂血症Ａ群、低密度リポタンパク質型［ＬＤＬ］高リポタンパク血症を含む）；単純な高グリセリド血症（内因性高グリセリド血症、フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＶ型、高脂血症Ｂ群、高プレβリポタンパク血症、超低密度リポタンパク質型［ＶＬＤＬ］高リポタンパク血症を含む）；混合型高脂血症（広域または浮上βリポタンパク血症、フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＩｂ型またはＩＩＩ型、プレβリポタンパク血症を伴う高βリポタンパク血症、内因性高グリセリド血症を伴う高コレステロール血症、高脂血症Ｃ群、結節・発疹型黄色腫、結節型黄色腫を含む）；高カイロミクロン血症（フレドリクソン高リポタンパク血症Ｉ型またはＶ型、高脂血症Ｄ群、混合型高グリセリド血症を含む）；およびその他の高脂血症（家族性複合型高脂血症、リポタンパク質欠乏症（無βリポタンパク血症、高密度リポタンパク質欠乏症、低αリポタンパク血症、低βリポタンパク血症（家族性）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、タンジール病を含む）を含む）が挙げられる。
一実施形態では、配列番号１〜１０３５のいずれか１つのポリペプチドは、高脂血症または高コレステロール血症の治療に使用するためのものではない。
別の実施形態では、配列番号１〜１０３５のいずれか１つのポリペプチドはしかし、高脂血症または高コレステロール血症以外の心血管系の治療に使用するためのものである。
化学的および潜在性糖尿病，耐糖能異常ならびに前糖尿病を含めたグルコース負荷試験異常は、介入しなければ２型糖尿病になる血中グルコース値上昇を含む。健康的な食事および身体活動の増加を含めた生活習慣の変化が正常な血中グルコース値を回復させる可能性がある。本発明アポＡ−Ｉペプチドによりグルコース代謝が改善され、耐糖能異常および前糖尿病の病因が抑制されることから、このペプチドを投与することによって耐糖能異常および前糖尿病を正常化することができる。初期の段階でグルコース代謝を回復させて、心血管疾患増加の原因となる２型糖尿病の発症に進行するを防ぐのが望ましい（Ｎｉｃｈｏｌｓら（２００７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ３０（２）：２２８−２３３）。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症；血液の異常所見；動脈、細動脈および毛細血管の疾患；虚血性心疾患をはじめとする心疾患からなる群より選択される疾患の治療に使用するためのものである。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症、例えば、家族性高コレステロール血症；フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＩａ型；高βリポタンパク血症；高脂血症Ａ群；および低密度リポタンパク質型［ＬＤＬ］高リポタンパク血症のような単純な高コレステロール血症からなる群より選択されるリポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症などである。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、内因性高グリセリド血症；フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＶ型；高脂血症Ｂ群；高プレβリポタンパク血症；および超低密度リポタンパク質型［ＶＬＤＬ］高リポタンパク血症を含めた単純な高グリセリド血症からなる群より選択される、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、広域または浮上βリポタンパク血症；フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＩｂ型またはＩＩＩ型；プレβリポタンパク血症を伴う高βリポタンパク血症；内因性高グリセリド血症を伴う高コレステロール血症；高脂血症Ｃ群；結節・発疹型黄色腫；および結節型黄色腫などの混合型高脂血症からなる群より選択される、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、フレドリクソン高リポタンパク血症Ｉ型またはＶ型；高脂血症Ｄ群；および混合型高グリセリド血症などの高カイロミクロン血症からなる群より選択される、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、家族性複合型高脂血症などの他の高脂血症からなる群より選択される、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、無βリポタンパク血症、高密度リポタンパク質欠乏症、低αリポタンパク血症；低βリポタンパク血症（家族性）；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症およびタンジール病などのリポタンパク質欠乏症からなる群より選択される、リポタンパク質代謝の疾患をはじめとする脂血症である。
アテローム性動脈硬化症（細動脈硬化症、動脈硬化性血管疾患、アテローム、変性（動脈変性、動脈血管変性および血管変性）を含む）およびアテローム硬化性心疾患（冠（動脈）性を含む）は、動脈壁の肥厚とともに、硬直および弾性喪失がみられる適応症である。最もよくみられる形態の動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の内側にプラーク（ＬＤＬコレステロールとマクロファージとからなる）が過剰に形成されることにより動脈が狭窄して硬化する病態であり、重篤な心血管合併症を引き起こす。１）本発明アポＡ−Ｉペプチドがグルコース値を低下させることによって、アテローム性動脈硬化症の原因となる危険因子の１つを低減すること；２）本発明アポＡ−Ｉペプチドの投与により、ＨＤＬ値が改善されることによってマクロファージからのコレステロール除去が改善され、ＬＤＬの酸化が阻害され、また根本的な炎症過程が制限されることによって、アテローム性動脈硬化症が改善し得ること；３）本発明アポＡ−Ｉペプチドの投与により、インスリン値が回復して脂肪組織およびトリグリセリドリッチリポタンパク粒子からの脂質分解が抑制されることによって、循環血中の脂肪酸値、次いでＬＤＬ値が低下し、これがアテローム性動脈硬化症の進行を低下させることによって、アテローム性動脈硬化症が改善し得ることから、このペプチドを投与することによってアテローム性動脈硬化症を治療および／または予防することができる（Ｂａｒｔｅｒ（２００５）Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ．７（ｓｕｐｐｌ Ｆ）：Ｆ４−Ｆ８；Ｒａｄｅｒ（２００２）Ａｍ Ｊ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，９０（８）：６２−７０）。
本発明は、一実施形態でアテローム性動脈硬化症の予防に有用であるのと同様に、虚血性心疾患をはじめとする心疾患、例えば狭心症、心筋梗塞、大動脈弁狭窄症および代謝疾患における心筋症などの予防にも有用である。代謝性心筋症はエネルギー代謝の異常が原因であることが多い。本発明アポＡ−Ｉペプチドがグルコース代謝を改善し、循環血中の脂肪酸を減少させ、ＬＤＬコレステロールを減少させ、これが心筋のグルコース取込みおよび解糖流量を改善し、これにより代謝疾患による心筋症の病因が抑制されることから、このペプチドを投与することによって代謝疾患における心筋症を治療することができる（Ｇｕｅｒｔｌら（２０００）８１（６）：３４９−３７２；Ｗｉｔｔｅｌｅｓら（２００８）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．５１（２）：９３−１０２）；ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｉｊｅｒら（２０１１）９２：１０−１８）。
したがって、一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、細動脈硬化症；動脈硬化性血管疾患；アテローム；動脈変性；動脈血管変性および血管変性などのアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、動脈、細動脈および毛細血管の疾患である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、冠（動脈）性心疾患などのアテローム硬化性心疾患からなる群より選択される、動脈、細動脈および毛細血管の疾患である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、狭心症；心筋梗塞；大動脈弁狭窄症；および代謝疾患における心筋症からなる群より選択される、虚血性心疾患をはじめとする心疾患群に属する疾患である。
一実施形態では、本発明によって治療可能な疾患は、非正常脂質値または身体構成要素内への脂質を含有する沈着を特徴とする心血管疾患である。したがって、治療効果はほかにも、非正常脂質値または身体構成要素内への脂質を含有する沈着を特徴とする疾患または病態、例えば急性冠動脈症候群、アテローム性動脈硬化症、血管内のアテローム性動脈硬化プラーク、狭窄性弁膜症、敗血症性ショック、狭心症、心筋梗塞、不安定狭心症、動脈狭窄症、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症、冠動脈狭窄症、血管性認知症、再狭窄、不安定プラークまたは一過性黒内障などの治療に関連する。
ＩＩＩ．投与および製剤化
本発明のアポＡ−Ｉ由来ポリペプチドは、医学的に許容される任意の方法で投与し得る。このような方法としては、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜外内、頭蓋内などのほか、経鼻または局所のような非経口経路による注射が挙げられる。このほか、蓄積注射または受食性埋植物などの手段による徐放投与が特に本発明に含まれる。
本発明によるアポＡ−Ｉの投与は、特に限定されないが、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内またはその他の適切な部位への注射；ポンプ（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅ，４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１６９８（１９８４）を参照されたい）、マイクロカプセル化（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号を参照されたい）、徐放ポリマー埋植物（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｂｅｌ，米国特許第４，８８３，６６６号を参照されたい）、カプセル化および非カプセル化細胞移植物（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０８２，６７０号および同第５，６１８，５３１号を参照されたい；ならびに吸入を含めた任意の適切な送達手段を用いて実施し得る。
投与は定期的なボーラス注射であっても、あるいは外部（例えば、静注バッグ）または内部（例えば、生体内分解性埋植物、バイオ人工臓器または移植したアポＡ−Ｉ由来ペプチド産生細胞のコロニー）のリザーバーからの静脈内または腹腔内投与によってより持続的なものにしてもよい。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号および同第５，８００，８２８号を参照されたい。
局所送達は、カテーテルを介した１つまたは複数の動脈への送達などの手段によるものであってよい。さらなるタイプの局所送達には、通常は注射によって投与される遺伝子治療ベクターの局所送達が含まれる。
本発明の好ましい実施形態では、投与は非経口注射、好ましくは静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、頭蓋内注射または腹腔内注射である。本発明の化合物を未加工の化学物質として（例えば、ポリペプチド単独で）投与することが可能であるが、本発明の化合物を医薬製剤の形態で提供するのが好ましい。医薬製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されているような、従来の技術によって調製し得る。
「薬学的に許容される担体」という用語は、アポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドと組み合わせてその適用を容易にする１つまたは複数の天然または合成の有機または無機成分を意味する。適切な担体としては無菌生理食塩水が挙げられるが、薬学的に許容されるものとして知られているその他の水性および非水性で等張の無菌溶液および無菌懸濁液が当業者に知られている。
本発明の化合物は、非経口投与用に製剤化し、任意選択で保存剤を加えて、アンプル、予め充填したシリンジ、小容量注入の単位用量形態で、または複数回用量容器に入れて提供し得る。組成物は、油性または水性賦形剤の懸濁液、溶液または乳濁液など、例えば水性ポリエチレングリコールの溶液の形態をとり得る。油性または非水性の担体、希釈剤、溶媒または賦形剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、これらに保存剤、湿潤剤、乳化剤もしくは懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの薬剤を含ませ得る。あるいは、有効成分は、無菌固体の無菌単離または溶液からの凍結乾燥によって得られ、使用前に適切な賦形剤、例えば無菌の無発熱物質水で構成するための粉末形態であってもよい。
「有効量」は、疾患状態、変性状態または損傷状態を改善するか、その進行を遅らせることができる量を指す。有効量は個別の基準によって決定され得るものであり、また部分的には、治療する症状および求める結果の検討に基づくものとなる。当業者がこのような因子およびルーチンの実験のみを用いることによって、有効量を決定することができる。
リポソームシステムは任意の様々な一枚膜小胞、多重膜小胞または安定な多層小胞（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）であってよく、当業者に周知の方法に従って、例えば、米国特許第５，１６９，６３７号、同第４，７６２，９１５号、同第５，０００，９５８号または同第５，１８５，１５４号の教示に従って調製し投与し得る。さらに、本発明の新規なポリペプチドのほかにも、そのリポソームとの結合を強化するためにリポタンパク質として選択したポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。組換えアポＡ−Ｉ由来タンパク質を例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは他の任意の好都合な方法によってＣＨＯ細胞から精製した後、リポソームと混合し、リポソームに効率よく組み込む。リポソーム封入タンパク質については、細胞増殖の刺激に何らかの効果を示すがどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで試験し得る。
アポＡ−Ｉポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患または障害の治療に適切な放出特性を有する製剤でのアポＡ−Ｉポリペプチドの徐放投与が望まれる場合、アポＡ−Ｉ由来ペプチドのマイクロカプセル化が企図される。徐放のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化については、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈｌＦＮ−）、インターロイキン−２およびＭＮ ｒｇｐ１２０で成功している。Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，” ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編，（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５），ｐｐ．４３９−４６２；国際公開第９７／０３６９２号、同第９６／４００７２号、同第９６／０７３９９号；ならびに米国特許第５，６５４，０１０号。
ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーには生体適合性および広範囲の生分解性があることから、このポリマーを用いてこれらのタンパク質の徐放製剤が開発された。ＰＬＧＡの分解産物、乳酸とグリコール酸はヒト体内で迅速に除去され得る。さらに、このポリマーの分解性をその分子量および組成に応じて数か月〜数年に調節することができる。Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編），Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０），ｐｐ．１−４１のＬｅｗｉｓ，”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ”。
本発明の一実施形態では、アポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドを含む組成物が企図される。この組成物は、本明細書に記載される単離ポリペプチド、本明細書に記載される単離核酸、本明細書に記載されるアポＡ−Ｉ由来ペプチドをコードする発現ベクターまたは本明細書に記載されるアポＡ−Ｉ由来ペプチドを発現する細胞系を含み得る。
一実施形態では、本発明は、本発明に従って使用するためのアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドに関し、ここでは、ポリペプチドは経腸投与、局所投与、非経口投与で、または徐放埋植物の一部として投与されるか、このような投与に適合している。
一実施形態では、本発明は、本発明に従って使用するためのアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドに関し、ここでは、非経口投与は静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内または腹腔内投与である。
一実施形態では、本発明は、本発明に従って使用するためのアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドに関し、ここでは、経腸投与は経口、経直腸またはバッカル投与である。
一実施形態では、本発明は、本発明に従って使用するためのアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドに関し、ここでは、局所投与は経皮投与、皮膚上投与、経膣投与、膀胱内投与、経肺投与、鼻腔内投与、気管内投与または点眼剤としての投与である。
一実施形態では、本発明は、本発明に従って使用するためのアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドに関し、ここでは、ポリペプチドは皮下投与または静脈内投与で投与されるか、このような投与に適合している。
一実施形態では、前記投与を連日反復し、別の実施形態では、前記投与を少なくとも週１〜３回、例えば週２〜５回など、例えば週３〜６回などで反復する。
一態様では、本発明は、本明細書で定義される本発明による単離ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、医薬組成物は、医薬成分を代謝疾患の治療または代謝疾患の発症リスクのある哺乳動物の予防的治療のための別の組成物と組み合わせて含む。
一実施形態では、化合物または組成物は、代謝疾患の治療または代謝疾患の発症リスクのある哺乳動物の予防的治療のためのものであり、インスリン（またはインスリンの誘導体）、メトホルミンなどからなる群より選択される糖尿病薬と組み合わせたものである。
一実施形態では、医薬組成物は、代謝疾患および／または心血管疾患の治療のための第二の有効成分をさらに含む。一実施形態では、前記第二の有効成分は、代謝疾患の治療または代謝疾患の発症リスクのある哺乳動物の予防的治療に使用される化合物である。
一実施形態では、前記第二の有効成分は糖尿病の治療に使用される化合物である。一実施形態では、前記第二の有効成分は、インスリン、インスリンの誘導体、メトホルミンまたはその誘導体からなる群より選択される化合物である。
一実施形態では、前記第二の有効成分は、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、β遮断剤、アスピリンなどの抗凝血剤；およびスタチンまたはフィブラートなどのコレステロール低下薬からなる群より選択される化合物である。
一実施形態では、前記第二の有効成分は、インスリン、エクセナチド、エクセナチド徐放製剤、リラグルチド、プラムリンチド；スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、α−グルコシダーゼおよび胆汁酸捕捉剤阻害剤からなる群より選択される化合物である。
ＩＶ．用量
全身投与のための様々な投与レジメンが企図される。一実施形態では、対象に本発明によるアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドを含む製剤を投与する方法は、前記ペプチドまたはポリペプチドを１用量当たり、対象の体重に対して１mｇ／ｋｇ〜１０，０００mｇ／ｋｇで投与することを含む。別の実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して１mｇ／ｋｇ〜７，５００mｇ／ｋｇである。さらなる実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して１mｇ／ｋｇ〜５，０００mｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して１mｇ／ｋｇ〜２，０００mｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して１mｇ／ｋｇ〜１，０００mｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して１mｇ／ｋｇ〜７００mｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して５mｇ／ｋｇ〜５００mｇ／ｋｇである。最も好ましい実施形態では、用量は１用量当たり、対象の体重に対して１０mｇ／ｋｇ〜１００mｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、治療する対象はヒトである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドを１mｇ／ｋｇ体重〜１０，０００mｇ／ｋｇ体重、例えば１mｇ／ｋｇ体重〜７，５００mｇ／ｋｇ体重など、例えば１mｇ／ｋｇ体重〜５，０００mｇ／ｋｇ体重など、例えば１mｇ／ｋｇ体重〜２，０００mｇ／ｋｇ体重など、例えば１mｇ／ｋｇ体重〜１，０００mｇ／ｋｇ体重など、例えば１mｇ／ｋｇ体重〜７００mｇ／ｋｇ体重など、例えば５mｇ／ｋｇ体重〜５００mｇ／ｋｇ体重など、例えば１０mｇ／ｋｇ体重〜１００mｇ／ｋｇ体重などの用量で投与するか、このような投与に適合させる。
具体的な用量および送達方法に関する指針が文献に記載されており、例えば、国際公開第０２／７８７３０号および同第０７／１００８９８号を参照されたい。動物実験に用いられる用量に基づいてヒト等価用量を計算するための指針については、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２２，６５９−６６１（２００７）に記載されている。
投与する用量は、治療する個体の年齢、体重および状態のほか、投与経路、剤形およびレジメンならびに所望する結果に合わせて慎重に調整する必要があり、正確な用量は実施者が決定するべきである。
本発明の一実施形態では、投与を連日反復し、例えば連日１〜８回など、例えば連日２〜５回などで反復する。別の実施形態では、投与を少なくとも週１〜３回、例えば週２〜５回など、例えば週３〜６回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回または７日に１回などで反復する。
他の実施形態では、本発明によるアポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはポリペプチドを比較的長い投与間隔で投与する。比較的長い投与間隔は、投与と投与の間に少なくとも２日、例えば投与と投与の間に少なくとも３日など、例えば、１週間当たり２回の投与を含むものとする。より好ましくは、長い投与間隔は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間など、より好ましくは少なくとも３週間、例えば、少なくとも４週間または少なくとも１か月などである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドを連日投与する。
別の実施形態では、、本発明によるポリペプチドの投与を少なくとも週に１〜３回、例えば週に２〜５回など、例えば週に３〜６回などで反復する。
別の方法で表現すると、投与間隔は、アポＡ−Ｉ由来ポリペプチドを１回投与した後、治療する対象の血清中にそのポリペプチドが検出されなくなってから次の投与を実施する程度の長さである。別の実施形態では、血清中濃度は１０ｎｇ／ｍＬ未満、例えば５ｎｇ／ｍＬ未満など、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ未満、例えば０．５ｎｇ／ｍＬ未満など、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ未満である。
いくつかの実施形態では、アポＡ−Ｉ由来ペプチドの初回投与は、例えば、１日２回、連日、２日に１回、３日に１回または４日に１回である。この投与スケジュールを、例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、９日間、１１日間、１４日間、２１日間またはそれ以上維持し得る。この投与スケジュールが終了した後、アポＡ−Ｉ由来ペプチドを、例えば上記のように、頻度を減らして投与することができる。
Ｖ．アポＡ−Ｉ由来ペプチド
本発明は、高血糖症を特徴とするか、これに起因する疾患の治療における、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）のＣ末端ドメイン（ＡＡ１９０〜２４３）に由来するポリペプチドおよびペプチドならびに前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
アポＡ−Ｉは、ヒトではＡＰＯＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。このタンパク質は脂質代謝に何らかの特定の役割を果たしている。アポＡ−Ｉは血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分である。腸内の腸細胞から分泌されるカイロミクロンにもアポＡ−Ｉが含まれているが、血流中で迅速にＨＤＬに移行する。このタンパク質は、ほとんどの血漿コレステリルエステルの形成に関与するレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の補因子である。アポＡ−Ｉはプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）安定化因子としても単離されており、したがって、抗凝固作用を有する可能性もある。
一態様では、本発明は、高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
長さが１００アミノ酸未満であり、
前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である、
ポリペプチドに関する。
変異体は、アミノ酸配列の点で、もしくは配列とは関係ない点で、またはその両方の点で、天然のアポＡ−Ｉペプチド（例えば、配列番号１）と異なり得る。アミノ酸配列の変異体（「配列変異体」）は、天然のアポＡ−Ｉペプチドの１つまたは複数のアミノ酸が異なる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体または非天然アミノ酸で置換されたときに生じる。特に好ましい変異体としては、天然のアポＡ−Ｉまたは天然のアポＡ−ＩペプチドのＣ末端ドメイン（ＡＡ１９０〜２４３）の生物学的に活性なフラグメントが挙げられ、このフラグメントの配列は１つまたは複数の保存的および／または半保存的アミノ酸置換によって野生型配列とは異なるものになっており、このようなアミノ酸置換は通常、タンパク質またはペプチドの二次構造および三次構造ならびに疎水性に及ぼす影響が最小限のものである。変異体はこのほか、アポＡ−ＩのＣ末端ドメイン（ＡＡ１９０〜２４３）の生物活性を打ち消すことのない１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入によって異なるものになった配列を有し得る。
本発明の意味の範囲内においては、以下に挙げるグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、「強い」保存グループ）内での置換を保存的置換と見なすことができる―Ｓ、Ｔ、Ａ；Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ；Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｆ；Ｈ、Ｙ；Ｆ、Ｙ、Ｗ。
本発明の意味の範囲内においては、以下に挙げるグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、「弱い」保存グループ）内での置換を半保存的置換と見なすことができる―Ｃ、Ｓ、Ａ：Ａ、Ｔ、Ｖ；Ｓ、Ａ、Ｇ；Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｋ；Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ａ；Ｓ、Ｇ、Ｎ、Ｄ；Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ；Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ；Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ；Ｈ、Ｆ、Ｙ。
本発明に含まれるその他の変異体には、ペプチドの安定性を増大させる修飾を有する変異体がある。このような変異体は、例えば、ペプチド配列中に１つまたは複数の非ペプチド結合（ペプチド結合に代わる結合）を含み得る。ほかにも、天然のＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸またはβもしくはγアミノ酸などの非天然または合成アミノ酸などを含む変異体および環状変異体が挙げられる。ポリペプチド内にＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を組み込むことにより、そのプロテアーゼに対する耐性が増大し得る。例えば、米国特許第５，２１９，９９０号を参照されたい。本発明には特にスプライス変異体が含まれる。
一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜１０３５からなる群より選択される配列の天然の対立遺伝子変異体である。このポリペプチドは、配列番号１〜１０３５をコードする核酸配列とヌクレオチド１個だけが異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、ポリペプチドは本明細書に記載される変異体ポリペプチドであり、一実施形態では、選択される配列内の任意の特定のアミノ酸が変化して保存的置換が生じたポリペプチドを含む。
配列以外の修飾としては、例えば、天然のアポＡ−Ｉの一部分のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学的誘導体化のほか、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、ＰＥＧ化またはグリコシル化を挙げ得る。タンパク質の置換基を置き換えることが可能であるのと全く同じように、タンパク質と結合している官能基を、ほぼ同じ特性を特徴とする基に置き換えることも可能である。このような修飾は一次配列を変化させるものではない。これらは最初は保存的なものである、すなわち、置き換わった基は大きさ、形状、疎水性および電荷が元の基とほぼ同じである。
本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドフラグメントなどの治療用タンパク質の効果を改善する方法の１つが、その血清中持続時間を増大させて循環血中濃度を高め、かつ／または循環血中濃度の存続時間を長くすることにより、曝露量（ＡＵＣ）を増大させ、投与頻度を減らし、用量を減じることである。
例えば、市販の製品と候補薬物などの２つの製品の間で生物学的同等性を判定する場合、クロスオーバー試験で各製剤を有志被験者、一般的には健常者であるが、場合によっては患者に投与する、薬物動態試験を実施する。定期的に血清／血漿試料を採取し、親薬物（または場合により代謝産物）の濃度をアッセイする。両製品間で血中濃度を比較することが実現不可能または不可能である場合、薬物動態評価項目ではなく薬力学評価項目を比較に用いる。薬物動態の比較には、血漿中濃度のデータを用いて、重要な薬物動態パラメータ、例えば曲線下面積（ＡＵＣ）、最高濃度（Ｃｍａｘ）、最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）および吸収遅延時間（ｔｌａｇ）などを評価する。特に薬物が非線形薬物動態を示す場合には、複数の異なる用量で試験を実施してもよい。
生物学的同等性の規制要件を満たすために、生物学的同等性試験に加えて、これ以外のデータを提出する必要が生じる場合がある。このような証拠としては、分析方法の妥当性評価および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ相関性試験（ＩＶＩＶＣ）を挙げ得る。
１つの特定の実施形態では、曝露量（ＡＵＣ）を増大させ、投与頻度を減らし、用量を減じるために、本発明のポリペプチドなどの本発明の薬剤を修飾する。
別の実施形態では、患者に投与したときの半減期、特に血漿中半減期を増大させるために、本発明のポリペプチドなどの本発明の薬剤を修飾する。特に、血漿中半減期を増大させるために、ポリペプチドなどの薬剤を修飾する。半減期を増大させるためにペプチド薬物を修飾する多数の方法が当該技術分野で利用可能であり、当該技術分野のこのような方法を本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドおよびその変異体の修飾に用いることができる。血漿中半減期が短いのは多くの場合、迅速な腎クリアランスおよび体循環中に起こる酵素的分解が原因である。ペプチド／タンパク質に修飾を施すことにより血漿中半減期を長くすることができる。例えば、ポリペプチドの総アミノ酸量を減らすことによって半減期の増大をもたらすことができる。
エキソペプチダーゼは、血漿、肝臓および腎臓に存在し治療用ペプチドおよびタンパク質に影響を及ぼす、よく知られたタンパク質分解酵素のグループである。したがって、ペプチド薬末端の一方または両方に改変を施すと多くの場合、酵素的安定性、ひいては血漿中半減期が増大する。したがって、１つの方法では、血漿中半減期を増大させるために、１つまたは複数のほかの化合物と本発明のポリペプチドとを結合させる。一実施形態では、末端修飾はＮ−アセチル化および／またはＣ−アミド化である。別のこのような実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化合物を結合させる。具体的なポリペプチドの修飾の１つにＮ末端パルミトイルとＣ末端ＰＥＧ化による二重修飾がある。このほか、エキソペプチダーゼによるアポＡ−Ｉ由来ペプチドの分解を防ぐために、Ｃ末端とＮ末端との間のアミド結合形成によってポリペプチド薬を頭−尾環化させることが可能である。
別の実施形態では、酵素的切断を受けやすいことがわかっている１つまたは複数のアミノ酸を置換しポリペプチドがタンパク質分解を受けないようにすることによって、血漿中半減期の増大をもたらす。例えば、分解を回避して血漿中半減期を増大させるために、一方もしくは両方のポリペプチド末端および／またはポリペプチド内の１つもしくは複数のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換することができる。
このほか、ポリペプチドと１つまたは複数の特定の酵素阻害剤を共投与することによって、本発明のポリペプチドの半減期の増大をもたらすことができる。このような酵素阻害剤を本発明のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）に含ませることができる。また別の方法では、本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドの分子質量を増大させることによって半減期の増大をもたらすことができる。
一般に、血漿タンパク質と結合していない分子質量が５ｋＤａ未満の物質が腎経路から排泄されるのに対して、分子質量が５０ｋＤａを超える分子は糸球体限外ろ過液中にはみられないか、ごく少量みられる。したがって、酵素的分解以外でペプチドおよびタンパク質の半減期が短くなる主な原因は、これらが迅速に腎臓から排泄されることにある。したがって、ポリペプチド薬の大きさを増大させることによって半減期を長くすることができる。さらに、これに酵素阻害を加えることによって相乗効果がもたらされ得る。エキソペプチダーゼを阻害するのに効果的なＮ末端およびＣ末端の化学修飾ならびに不安定なアミノ酸の置換以外にも、ＰＥＧ化によって、危険に曝される末端を特異的に保護し、さらに分子質量を増大させることが可能になる。さらに、薬物分子内にＰＥＧ化を施せば、タンパク質分解酵素の立体障害によって仲介される酵素的安定性が改善されることが期待される。
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、水溶解性が高い、溶液中での移動性が高い、毒性および免疫原性がない、体内から容易に除去されるといういくつかの特性を示す。このような特性がＰＥＧ−タンパク質またはＰＥＧ−ペプチド複合体に引き継がれることは極めてよくあることである。このような特性の強さは結合するＰＥＧの分子量によって左右される。
ほかにも、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ポリシアル酸）のポリマーを本発明のポリペプチドとの複合体として用いてもよい。ポリシアル酸は、天然の生分解性、高親水性の化合物であり、ヒト体内に既知の受容体がない。ＰＥＧ化とシアリル化を施すと、２つの機序、すなわち酵素的安定性の改善と分子質量増大による腎排泄の減少の組合せによって半減期が長くなる。
アルブミンは血漿中半減期が長いことが知られており、この特性から、薬物の半減期を増大させるために薬物送達に用いられてきた。この目的のために、アルブミンをこのような医薬化合物に結合させてきた。特に適切なものは、アルブミン分子上の遊離システイン残基（Ｃｙｓ３４）を、例えば、国際公開第２０１００９２１３５号に記載されている方法、特にＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）を用いてアルブミンと結合させる方法によって、アポＡ−Ｉポリペプチドとのヒドラゾン結合を介してフラグメントを含めた本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドと結合させることである。別の結合技術については、酵素的糖結合を用いたＮｅｏｓｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１２６８３８号を参照されたい）によって記載されている。この技術を用いれば、適切なリンカーを使用して、例えばアルブミンと本発明のアポＡ−Ｉポリペプチドとを結合させることができる。
ある特定の実施形態では、本発明は長時間作用型に改変されたアポＡ−Ｉ由来ペプチドに関し、前記改変されたポリペプチドは、薬学的に許容される分子と結合した哺乳動物アポＡ−Ｉ由来ペプチドまたはその類似体、例えば、いくつかの実施形態で哺乳動物での哺乳動物アポＡ−Ｉ由来ペプチドもしくはその類似体または改変アポＡ−Ｉ由来ペプチドの２〜４８時間以上、通常は４〜２８時間、例えば６〜８時間などのｉｎ ｖｉｖｏ血漿中半減期をもたらす、例えばアルブミンと融合した、適切な長さの脂肪酸と融合した、哺乳動物抗体のＦｃフラグメントもしくは哺乳動物抗体のＦｃフラグメントの変異体と融合した、またはアシル化基もしくはＰＥＧと結合したヒトアポＡ−Ｉ由来ペプチドを含む。
目的とするタンパク質またはそのフラグメントと結合した免疫グロブリン定常領域からなる融合タンパク質の作製が記載されている（例えば、米国特許第５，１５５，０２７号、同第５，４２８，１３０号、同第５，４８０，９８１号および同第５，８０８，０２９号を参照されたい）。このような分子は通常、結合した目的とする分子がもたらす生物活性と、免疫グロブリン定常領域がもたらすエフェクター機能または他の何らかの望ましい特徴の両方を有する。免疫グロブリンのＦｃ部分を含む融合タンパク質は、増大した安定性、増大した血清中半減期（Ｃａｐｏｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５を参照されたい）および新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体との結合（米国特許第６，０８６，８７５号、同第６，０３０，６１３号および同第６，４８５，７２６号）を含めたいくつかの望ましい特性を融合タンパク質に付与し得る。
一実施形態では、半減期の増大をもたらす部分は二官能性または三官能性などの多官能性部分であり、これを１つまたは複数のアポＡ−Ｉ由来ペプチドと共有結合させ、かつ１つまたは複数の薬学的に許容される分子と共有結合させて改変アポＡ−Ｉ由来ペプチドを作製し得る。リンカーは安定なものであってよく、これは治療期間中に生理的条件（例えば、温度３７℃、ｐＨ７．４）で有意な化学反応、例えば加水分解が全く起こらないことを意味する。このことは、当該技術分野で公知の安定性試験によって判定することができる。リンカーは化学的リンカーであってよく、これはそれが生細胞外部で有機化学反応によって生成されることを意味する。リンカーは、タンパク質上のグリコシル化などの糖部分であってよく、あるいは化学的に調製し、アポＡ−Ｉ由来ペプチド分子と、第二の薬学的に許容される分子、例えばＰＥＧ変異体、アルブミン、脂肪酸または抗体もしくはＦｃフラグメントのような抗体フラグメントなどとを結合させてもよい。
一実施形態では、本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドと、ＩｇＧ−Ｆｃなどの免疫グロブリン−Ｆｃとを結合させる。
本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドは任意選択で少なくとも１つのペプチドリンカーを含み得る。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸からなり、ここでは、アミノ酸は２０種類の天然のアミノ酸から選択される。種々の実施形態では、リンカーは１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸または１００〜２００個のアミノ酸を含み得る。一実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。一実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸で構成されている。
一実施形態では、ペプチドリンカーは少なくとも１個、例えば１〜２００個などのアミノ酸、通常は１〜５０個のアミノ酸を有し、ここでは、アミノ酸は２０種類の天然のアミノ酸から選択される。通常、ペプチドリンカーは１〜４０個、例えば１〜３０個など、例えば１〜２０個など、例えば１〜１０個などのアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択されるアミノ酸で構成されるリンカーから選択される。通常、ペプチドリンカーは、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸で構成されている。
抗体、抗体フラグメント、アルブミン、脂肪酸または半減期を延長させる他のいずれか１つを、任意の適切なリンカーまたはリンカー領域を介して本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドと結合させ得る。リンカーは、ジスルフィド架橋、例えば、それぞれアポＡ−Ｉおよび薬学的に許容される分子にある２つのシステイン（Ｃｙｓ）アミノ酸残基間の−Ｓ−Ｓ−結合などであり得る。リンカーは融合リンカーであってよく、これはアポＡ−Ｉ由来ペプチドが生細胞内で１つのポリペプチドまたはタンパク質として発現し得ることを意味する。リンカーは、アポＡ−Ｉ由来ペプチドと、化学的部分を有する薬学的に許容される分子とを分離する親水性リンカーであってよく、このようなリンカーは水素以外の原子を少なくとも５個含み、そのうちの３０〜５０％がＮまたはＯである。リンカーは、米国特許第６，５１５，１００号、同第７，１２２，１８９号、同第７，７００，５５１号、国際公開第２００４／０８９２８０号、同第２００６／１３８５７２号および同第２００９／０９５４７９号に記載されているような加水分解性のものであってよい。本発明においてリンカーとして有用な典型的な化合物としては、ジカルボン酸、マレミド（ｍａｌｅｍｉｄｏ）ヒドラジド、ＰＤＰＨ、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ、カルボン酸ヒドラジドおよび小分子ペプチドを有するグループから選択される化合物が挙げられる。本発明においてリンカーとして有用な化合物のさらに具体的な例としては：（ａ）コハク酸、グルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸；（ｂ）Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、Ｎ−［マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＭＰＨまたはＢＭＰＨ）、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジドおよびＮ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）などのマレイミドヒドラジド；（ｃ）ＮＨＳ−３−マレイミドプロピオナートスクシンイミドエステル（ＭＰＳ−ＥＤＡ）；（ｄ）スルフルヒドリル（ｓｕｌｆｕｒｈｙｄｒｙｌ）反応性タンパク質と結合した（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）などのＰＤＰＨリンカー；（ｅ）Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオナート（ＳＰＤＰ）、（ｆ）スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノアート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、（ｇ）Ｎ−（ｖ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）ならびに（ｈ）２〜５個の炭素原子から選択されるカルボン酸ヒドラジドが挙げられる。その他の非ペプチドリンカーでも可能である。例えば、ｍが２〜２０から選択される整数である−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（０）−などのアルキルリンカーを用いることができる。このようなアルキルリンカーを、立体障害を起こさない基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどでさらに置換してもよい。例示的な非ペプチドリンカーにはＰＥＧリンカーがある。本発明において有用なほかのリンカーが米国特許第６，６６０，８４３号に記載されている。
アポＡ−Ｉ由来ペプチドと薬学的に許容される分子などの２つ以上の分子を、任意選択で二官能性リンカーのような多官能性リンカーを介して互いに結合させる様々な技術が先行技術で利用可能であり、ここで適切な参考文献には、国際公開第０１／５８４９３号およびその中で列記および引用されているあらゆる関連文献がある。
一実施形態では、患者に投与したときの半減期、特に血漿中半減期を増大させるために、発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドを修飾する。修飾は、本発明の薬剤と結合し、部分が結合した薬剤を形成する部分であってよく、ここでは、前記部分が結合した薬剤は、血漿中および／または血清中半減期が、部分が結合していない薬剤の血漿中および／または血清中半減期よりも長い。１つのこのような実施形態では、薬剤と結合した部分は、アルブミンおよびその変異体、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アシル化基、抗体ならびに抗体フラグメントからなる群より選択される１つまたは複数の種類の部分である。部分と本発明のポリペプチドとの結合は、本発明のポリペプチド（主鎖または側鎖）の任意の適切なアミノ酸残基との結合であってよい。部分はほかにも、リンカーによって本発明のポリペプチドと結合していてもよい。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドと結合している部分は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する輸送を促進する部分である。このようなＢＢＢ横断輸送を促進するものには、ラクダ科の種に由来する抗体がある。ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャおよびグアナコなどのラクダ科の動物は、ＢＢＢを横断することができる一本鎖抗体を有する。
所与のポリペプチド内にある末端アミノ酸を含めた多数のアミノ酸が、グリコシル化をはじめとする翻訳後修飾などの天然の過程によって、または当該技術分野で周知の化学修飾によってさらに修飾されていてよい。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の修飾としていくつか例を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、糖化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などの転移ＲＮＡによって仲介されるタンパク質へのアミノ酸付加およびユビキチン化がある。
このような修飾は当業者に周知であり、科学文献に極めて詳細に記載されている。特によく用いられるいくつかの修飾、例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化については、ほとんどの基本的テキスト、例えば、Ｉ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３などに記載されている。この主題に関しては、例えば、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，ｉｎ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ １−１２，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６，１９９０およびＲａｔｔａｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２，１９９２に記載されている概説など、多数の詳細な概説が利用可能である。
さらに、タンパク質は、のちの精製および任意選択のエンドペプチダーゼを用いるタグの除去を可能にするタンパク質タグを含み得る。このほか、タグはのちのタグ除去を容易にするプロテアーゼ切断部位を含み得る。アフィニティータグの非限定的な例としては、ポリｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＳＶタグ、Ｖ５タグ、マルトース結合タンパク質タグ、セルロース結合ドメインタグが挙げられる。作製および精製には、タグはポリｈｉｓタグであるのが好ましい。タグはタンパク質のＣ末端部分にあるのが好ましい。
修飾はポリペプチドのペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めたあらゆる場所で生じ得る。実際、天然および合成ポリペプチドには、ポリペプチド内のアミノ基もしくはカルボキシル基またはその両方の共有結合修飾による遮断がよくみられ、本発明のポリペプチドにもこのような修飾が存在し得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でタンパク質分解プロセシングの前に施されるポリペプチドのアミノ末端残基はほぼ例外なく、Ｎ−ホルミルメチオニンとなる。
ポリペプチド内に生じる修飾は多くの場合、それが施される方法に応じたものとなる。例えば、宿主内でクローン化遺伝子を発現させることによって作製されるポリペプチドでは、修飾の性質および程度は主として、宿主細胞の翻訳後修飾能およびポリペプチドのアミノ酸配列内に存在する修飾シグナルによって決まる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主ではグリコシル化が起こらない場合が多い。したがって、グリコシル化が望まれる場合、グリコシル化が起こる宿主、一般には真核細胞内でポリペプチドを発現させるべきである。昆虫細胞は多くの場合、哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行い、このため、特に天然のグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現する昆虫細胞発現系が開発されている。他の修飾についても同様の考察が当てはまる。
所与のポリペプチドの複数の部位に同じ種類の修飾が同程度または異なる程度に存在し得ることが理解されよう。また、所与のポリペプチドが多数の種類の修飾を含んでいてもよい。
一般に、本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、このような修飾、特に宿主細胞内でポリヌクレオチドを発現させることによって合成されたポリペプチドに存在する修飾をすべて包含する。
一態様では、本発明は、配列番号３、４または６のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる単離ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号３、４または６のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドに関する。
さらに別の態様では、本発明は、配列番号９〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる単離ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号９〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドに関する。
一実施形態では、前記アミノ酸配列中のいずれか１つのアミノ酸残基が対応するＤ−アミノ酸に変化しており、別の実施形態では、前記アミノ酸配列中の全アミノ酸残基が対応するＤ−アミノ酸に変化している。
一態様では、本発明は、配列番号１（すなわち、５４量体ペプチドのＣ末端ペプチド１９０〜２４３に対応するヒト配列）を含むか、これよりなるアポＡ−１の配列に由来するポリペプチドに関する。
一実施形態では、アポＡ−Ｉ由来配列は、アポＡ−Ｉの配列番号１を超えないポリペプチド配列を含むか、これよりなる。
一実施形態では、ポリペプチドは、アポＡ−Ｉ以外のポリペプチドであり得るポリペプチド、分子またはリンカーと結合している。
一態様では、本発明は、本明細書で定義されるポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、本発明の医薬の有効成分は配列番号１の配列である。
一実施形態では、ペプチドの溶解性をさらに増大させる、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が存在する。
一実施形態では、配列番号１のペプチドの１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が、哺乳動物細胞のグルコース取込みを維持または増大させる。
一実施形態では、組換え宿主細胞もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系でのアポＡ−Ｉ由来ポリペプチドの発現または化学合成での生成を増大させる、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が存在する。
一実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、配列番号１〜配列番号８からなる群より選択されるものの少なくとも１つである。
ＶＩ．アポＡ−Ｉ由来ポリヌクレオチド
本発明は、アポＡ−Ｉ（配列番号１）のＣ末端ドメイン（ＡＡ１９０〜２４３）およびそのフラグメント（配列番号２〜１０３５）をコードする単離ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの医学的使用を提供する。一般に、ｃＤＮＡ配列はゲノム配列よりもはるかに短く、しかるべき発現ベクターに挿入し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで産生細胞またはヒト細胞に形質導入／感染させるのが容易である。
さらに、本発明のヌクレオチド配列は、これらの配列の誘導体である配列を含む。本発明はほかにも、これらの配列の１つまたはこれらの配列の１つの誘導体を含んだベクター、リポソームをはじめとする運搬媒体を含む。本発明はこのほか、特に限定されないがヒトアポＡ−Ｉならびに誘導体および変異体を含めた、アポＡ−Ｉ ｃＤＮＡ、好ましくはヒトアポＡ−Ｉ ｃＤＮＡから転写され翻訳されるタンパク質を含む。
このほか、特に限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母種、チャイニーズハムスター、ベビーハムスター、昆虫、真菌およびヒトを含めた選択された宿主細胞での発現を増強するためのコドン最適化核酸分子が企図される。
変異体核酸は最新技術の変異誘発法によって作製することができる。このほか、ヒトのコード配列と、マウス、ラットまたはチンパンジーのコード配列とをシャッフルする方法が企図される。
ヒトアポＡ−Ｉに存在するアミノ酸と、マウスまたはラットアポＡ−Ｉの対応する位置に存在するアミノ酸とを交換することによって作製される変異体核酸では、後者のアミノ酸がヒトアポＡ−Ｉに存在するアミノ酸と異なっているべきである。
一態様では、本発明は、発現時に配列番号３、４または６の配列を有するポリペプチドなどの本明細書で定義されるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
ＶＩＩ．ベクター
ウイルスベクター
遺伝子治療は広義には、患者の細胞に遺伝物質を新たに導入することによって患者に治療利益をもたらすことを目指すものである。このような利益には、広範囲にわたる疾患、障害をはじめとする状態の治療または予防が含まれる。
ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法では、単離細胞（特に限定されないが、膵臓の幹細胞、α細胞、β細胞およびγ細胞、神経およびグリア前駆細胞ならびに胎児幹細胞を含む）を改変し、次いでこれを患者に融合するか、移植するか、別の方法で移植する。例えば、米国特許第４，８６８，１１６号、同第５，３９９，３４６号および同第５，４６０，９５９号を参照されたい。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、ｉｎ ｖｉｖｏで宿主患者組織を直接標的とすることを目指すものである。
遺伝子導入ベクターとして有用なウイルスとしては、パポバウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。適切なレトロウイルスとしては、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＭｏＭＬＶからなる群が挙げられる。さらなる適切なレトロウイルスのグループとしては、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＡＩＶ、ＣＩＶからなる群が挙げられる。また別の好ましいウイルスベクターのグループとしては、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピローマウイルス、Ｍｏ−ＭＬＶからなる群、好ましくはアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
遺伝子治療の分野で好ましいウイルスにはレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスがある。この２種類のウイルスは細胞分裂がなくても細胞内に組み込むことが可能であり、ともに前臨床動物試験で検証されている。
レンチウイルスベクターは複製欠損レンチウイルス粒子である。このようなレンチウイルス粒子は、５’レンチウイルスＬＴＲと、ｔＲＮＡ結合部位と、パッケージングシグナルと、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドシグナルと作動可能に連結されたプロモーターと、第二鎖ＤＮＡ合成起点と、３’レンチウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターから作製することができる。
レトロウイルスベクターは、７〜８ｋｂを運搬すること、また細胞に感染する能力を有し、その遺伝物質が効率よく宿主細胞内に安定に組み込まれることから、ヒト臨床試験で最もよく用いられるベクターである。例えば、国際公開第９５／３０７６１号；同第９５／２４９２９号を参照されたい。オンコウイルス亜科では、患者に外来核酸配列を導入して組み込むのに標的細胞の増殖が少なくとも１ラウンド必要である。レトロウイルスベクターは患者のゲノム内にランダムに組み込まれる。レトロウイルスを用いて幹細胞を標的とすることができる。
３つのクラスのレトロウイルス粒子が記載されており、エコトロピックレトロウイルスはマウス細胞に効率的に感染することが可能であり、アンフォトロピックレトロウイルスは多数の種の細胞に感染することが可能である。３つ目のクラスには、ウイルスを産生した種以外の別の種の細胞に感染することが可能なゼノトロピックレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスは、分裂細胞のゲノムのみに組み込むことが可能であることから、発生研究で細胞系列を標識したり、癌または腫瘍に治療遺伝子または自殺遺伝子を送達したりするのに魅力的なものになっている。
ヒト患者に使用する場合、レトロウイルスベクターは複製欠損でなければならない。これにより、標的組織内で感染性レトロウイルス粒子がさらに生成することが阻止され、その代わりに複製欠損ベクターが、標的細胞ゲノム内に安定に組み込まれる「自家」導入遺伝子になる。複製欠損ベクターには通常、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子が（ウイルスゲノムの残りの大部分とともに）欠損している．
欠損ウイルス遺伝子の代わりには異種ＤＮＡが挿入される。異種遺伝子は内因性異種プロモーター、標的細胞内で活性なまた別の異種プロモーターまたはレトロウイルス５’ＬＴＲ（このウイルスＬＴＲは多様な組織で活性である）の制御下にあり得る。通常、レトロウイルスベクターの導入遺伝子容量は約７〜８ｋｂである。
複製欠損レトロウイルスベクターでは、複製および組立てに必要なウイルスタンパク質が、例えば、操作されたパッケージング細胞系から供給される必要がある。パッケージング細胞が複製要素ウイルスおよび／またはヘルパーウイルスを放出しないことが重要である。これは、Ψシグナルを欠くＲＮＡからウイルスタンパク質を発現させ、別々の転写単位からｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を発現させることによって達成されてきた。さらに、一部の第二世代および第三世代のレトロウイルスでは、５’ＬＴＲがこれらの遺伝子の発現を制御する非ウイルスプロモーターに置き換えられており、３’プロモーターが近位プロモーターのみを含むよう最小化されている。このような設計により、複製要素ベクターまたはヘルパーウイルスの産生を引き起こす組換えの起こる可能性が最小限に抑えられる。
発現ベクター
本発明のアポＡ−Ｉ由来ペプチドの組換え発現のためのベクター構築は、当業者に詳細な説明を必要としない従来の技術を用いて実施され得る。しかし、当業者が再検討するためにＭａｎｉａｔｉｓら，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（ＮＹ １９８２）を参考にすることを望む場合もあろう。医学的に使用するアポＡ−Ｉペプチドおよびポリペプチドの組換え産生のための産生細胞の作製ならびに裸のままで、または封入して治療に用いるアポＡ−Ｉ由来ペプチドを分泌する治療用細胞の作製に発現ベクターを使用し得る。
簡潔に述べると、組換え発現ベクターの構築では標準的なライゲーション技術を用いる。構築したベクター内の正確な配列を確認する解析では、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：３０９−，１９８１）、Ｍａｘａｍらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９，１９８０）または当業者にわかる他の適切な方法を用いて遺伝子の配列を決定する。
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ．１３３−１３４，１９８２）に記載されている従来のゲル電気泳動を用いて、切断したフラグメントのサイズ分離を実施する。
効率的な発現ベクターを作製するには、発現ベクターが正確なリーディングフレーム内に、コードされる遺伝子の発現に必要な制御配列を含んでいる必要がある。遺伝子の発現は転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルで制御される。転写開始は遺伝子発現の初期に起こる重要な事象である。この事象はプロモーターおよびエンハンサー配列に依存し、これらの配列と相互作用する特定の細胞内因子によって影響を受ける。多くの遺伝子の転写単位はプロモーターおよび場合によってはエンハンサーまたは調節エレメントからなる（Ｂａｎｅｒｊｉら，Ｃｅｌｌ ２７：２９９（１９８１）；Ｃｏｒｄｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４０６（１９８０）；ならびにＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９（１９８１））。レトロウイルスでは、レトロウイルスゲノムの複製に関与する制御エレメントが長い末端反復配列（ＬＴＲ）内に存在する（Ｗｅｉｓｓら編，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＲＮＡ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（ＮＹ １９８２））。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲにはプロモーターおよびエンハンサー配列が含まれている（Ｊｏｌｌｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１８５５（１９８３）；Ｃａｐｅｃｃｈｉら．，Ｉｎ：Ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＧｕｌｚｍａｎおよびＳｈｅｎｋ編，ｐｐ．１０１−１０２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＮＹ １９９１）。その他の強力なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターをはじめとする野生型ウイルスプロモーターが挙げられる。
このほか、非ウイルスプロモーターのプロモーターおよびエンハンサー領域が多数記載されている（Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８５（１９８５）；ＲｏｓｓｉおよびｄｅＣｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５５９０−５５９４（１９８７））。休止細胞での導入遺伝子の発現を維持し増大させる方法としては、Ｉ型コラーゲン（１および２）（ＰｒｏｃｋｏｐおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：３７６（１９８４）；ＳｍｉｔｈおよびＮｉｌｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：１８２０（１９８０）；ｄｅ Ｗｅｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１４３８５（１９８３））、ＳＶ４０およびＬＴＲプロモーターを含めたプロモーターの使用が挙げられる
本発明の一実施形態によれば、プロモーターは、ユビキチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１−α）、ＲＳＶ、ＣＡＧからなる群より選択される構成的プロモーターである。誘導／抑制プロモーターの例としては、Ｔｅｔ−オン、Ｔｅｔ−オフ、ラパマイシン誘導プロモーター、Ｍｘ１、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、プロゲステロン、ＲＵ４８６が挙げられる。
好ましいプロモーターのグループには、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＪｅＴ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、Ｔｅｔ調節プロモーター、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１、Ｍｔ１およびＥＦ−１αが含まれる。
ウイルスおよび非ウイルスプロモーターを用いて導入遺伝子発現を駆動することに加えて、エンハンサー配列を用いて導入遺伝子の発現レベルを増大させてもよい。エンハンサーはその天然の遺伝子のみならず、一部の外来遺伝子の転写活性も増大させ得る（Ａｒｍｅｌｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７０：２７０２（１９７３））。例えば、本発明では、コラーゲンエンハンサー配列をコラーゲンプロモーター ２（Ｉ）とともに用いて導入遺伝子の発現を増大させ得る。さらに、ＳＶ４０ウイルスにみられるエンハンサーエレメントを用いて導入遺伝子の発現を増大させてもよい。このエンハンサー配列は、Ｇｒｕｓｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：９４３（１９８１）；ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４（１９８１）ならびにＦｒｏｍｍおよびＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：４５７（１９８２）（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、７２塩基対の反復からなる。この反復配列は、各種プロモーターと直列で存在する場合に多数の異なるウイルス遺伝子および細胞遺伝子の転写を増大させることができる（Ｍｏｒｅａｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：６０４７（１９８１）。
さらなる発現増強配列としては、特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント，ＷＰＲＥ，ＳＰ１６３，ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβグロビンインスレーターをはじめとするインスレーターが挙げられる。
一態様では、本発明は、配列番号１〜１０３５のいずれか１つによるポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクターまたは発現ベクターなどのベクターに関する。
ＶＩＩＩ．宿主細胞
一態様では、本発明は、本発明によるベクターで遺伝子改変した単離宿主細胞に関する。
本発明はこのほか、アポＡ−Ｉ由来ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変され、患者に移植して生物活性アポＡ−Ｉポリペプチドを局所に、例えば機能不全を起こした膵臓に送達することが可能であり、裸の細胞または封入した細胞を介したアポＡ−ＩのＣ末端ドメインに由来するペプチドのバイオデリバリーに適した細胞に関する。このような細胞は広義に治療用細胞と呼ばれ得る。
ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療では、好ましい細胞のグループには、幹細胞、筋細胞、肝細胞、脂肪細胞ならびにα細胞、β細胞およびδ細胞などの膵臓細胞が含まれる。
一態様では、本発明は、配列番号１〜１０３５のいずれか１つによるポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドを含む宿主細胞または前記ポリペプチドを含むベクターに関する。
一実施形態では、細胞は、幹細胞、筋細胞、肝細胞、脂肪細胞ならびにα細胞、β細胞およびδ細胞などの膵臓細胞からなる群より選択される。
別の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＩ１９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｉＢ５細胞、ＲＮ３３ｂ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択される。
配列の総覧
Figure 2016505272
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実施例
実施例１：ポリペプチドの作製
当業者であれば、当該技術分野で公知の方法を用いて、例えば、ポリペプチドの化学合成または異種発現系により、例えば、完全長ヒトアポＡ−Ｉタンパク質のアミノ酸１〜２４３ならびに１〜１８９、４４〜１８９、４４〜２４３および１９０〜２４３からなるポリペプチドについて以下に記載する方法などを用いて、配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列を有する本発明によるポリペプチドを作製し得ることが理解されるであろう。完全長ヒトアポＡ−Ｉタンパク質のアミノ酸１９０〜２４３からなるポリペプチドフラグメントが配列番号１の配列を有することに留意されたい。
組換えヒトアポＡ−Ｉ変異体の発現および精製
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＮ−末端にヘキサ−Ｈｉｓアフィニティータグを含むヒトアポＡ−Ｉ遺伝子からヒトアポＡ−Ｉ変異体（部位特異的変異誘発によって作製される、それぞれアミノ酸１〜２４３ならびに１〜１８９、４４〜１８９、４４〜２４３および１９０〜２４３に対応する完全長および短縮変異体）をを発現させた（Ｌａｇｅｒｓｔｅｄｔら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：９１４３−９１４９）。簡潔に述べると、遺伝子（遺伝子の完全長変異体または短縮変異体）をｐＥＸＰ−５プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ）にクローン化して細菌内に導入し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中、３７℃で培養した。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｍｏｌ／ｌを加えた後、３〜４時間、タンパク質発現を誘導した。細胞を破壊した後、Ｈｉｓ−トラップ−ニッケル−キレートカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および３ｍｏｌ／ｌグアニジンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４の移動相を用いて、細胞の可溶性画分からアポＡ−Ｉを精製した。次いで、タンパク質を１００ｍｍｏｌ／ｌイミダゾールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）でＰＢＳ（ｐＨ７．４）洗浄した後、５００ｍｍｏｌ／ｌイミダゾールを含有するＰＢＳで溶離させた。ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって、タンパク質試料からイミダゾールを除去した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、濃度をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）により、またはｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて求めた。
上記方法により、ヒト完全長アポＡ−Ｉのアミノ酸１〜２４３、１〜１８９、４４〜１８９、４４〜２４３および１９０〜２４３からなる完全長アポＡ−Ｉポリペプチドおよび短縮変異体（完全長アポＡ−Ｉのポリペプチドフラグメント）が作製された。図４ａに短縮変異体の模式的な概観を示す。
実施例２：筋芽細胞における誘導されたグルコース取込みの検証
完全長ヒト無脂質アポＡ−Ｉおよび完全長ヒトアポＡ−Ｉを含む成熟球状高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は誘導されたグルコース取込みの研究に有用である。合成の再構成円盤状ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）のＧＬＵＴ４転移およびグルコース取込みに対する効果を検討するため、細胞のインキュベーションに必要な組換えヒトアポＡ−Ｉおよび再構成ＨＤＬを作製し、誘導されたグルコース取込みに対するその効果をＬ６筋芽細胞で検証した。このほか、完全長アポＡ−Ｉの残基１〜１８９（Ｎ末端／中央ドメイン）、４４〜１８９（中央ドメイン）、４４〜２４３（中央／Ｃ末端ドメイン）および１９０〜２４３（Ｃ末端ドメイン）に対応する短縮タンパク質フラグメント（図４ａ）を用いて、アポＡ−Ｉの特定の領域がグルコース取込みを増大させる相対的効果を検討した。最後のタンパク質フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対応する。
細胞培養
Ｌ６筋芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４５８）を１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）および１％抗生物質／抗真菌剤（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。６〜７日間または６〜１２日間、増殖培地を２％ＦＢＳのα−ＭＥＭに切り替えることによって、筋管に分化させた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
グルコース取込みの測定
刺激（または処置）の前に細胞を無血清α−ＭＥＭ中、２時間飢餓状態にした後、それに続く処置についてはすべて三重反復で実施し、細胞による非特異的放射活性の評価基準としてサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を用い、取込み緩衝液（１４０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳＯ４、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で実施した。刺激後、室温で１５分間、処置を取込み緩衝液に溶かした１０μｍｏｌ／ｌ ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）、１０μｍｏｌ／ｌ ２−［３Ｈ］−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に置き換えた。次いで細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上にて１ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨで溶解させた。溶解物を収集し、シンチレーション計数法により放射活性を定量化した。
統計解析
別途明記されない限り、全データを平均±ＳＥＭで示す。必要に応じて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、両側スチューデントｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニの事後検定による解析を実施した。ｐ≦０．０５を有意であると見なした。
再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）の作製
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＰＯＰＣ）または１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）をクロロホルム：メタノール（３：１）に溶かし、窒素ガス流下で蒸発させ、得られた脂質薄膜をＰＢＳに再懸濁させた。ＰＯＰＣ ｒＨＤＬでは、ＰＯＰＣ乳濁液にデオキシコール酸を２：１のモル比（デオキシコール酸：ＰＯＰＣ）で加え、２２℃で１時間、アポＡ−Ｉと１００：１のモル比（リン脂質：タンパク質）でインキュベートした（Ｌａｇｅｒｓｔｅｄｔら（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１；２８６：２９６６−２９７５）。ＰＢＳで十分に透析することによって、ＰＯＰＣ ｒＨＤＬ調製物からデオキシコール酸を除去した。ＤＭＰＣ ｒＨＤＬはＰｅｔｒｌｏｖａら（２０１２）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ５３：３９０−３９８に従って調製した。簡潔に述べると、ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔシステム（Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いて、ＤＭＰＣ乳濁液を細孔径１００ｎｍのポリカルボナート膜に最小限の２０回通した。得られた小胞を２２℃で４日間、アポＡ−Ｉと１００：１のモル比（リン脂質：タンパク質）でインキュベートした。ｒＨＤＬ形成の指標となるアポＡ−Ｉ二量体をブルーネイティブＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により確認した。特に明示されない限り、ＰＯＰＣ ｒＨＤＬで処置を実施した。
ウエスタンブロット法
刺激または処置の前に培養筋芽細胞を無血清α−ＭＥＭ中、４時間血清不足状態にした後、それに続く処置についてはすべて、陽性対照としてインスリンまたはフェンホルミン（Ｓｉｇｍａ）を用い、無血清α−ＭＥＭ中で実施した。処置後、細胞を氷冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、氷上でプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する非変性溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて溶解させた。溶解物を４℃、１６，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清にＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を実施した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写した。免疫検出にｐＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、ｐＡＣＣ、ｐＡｋｔ、ＡｋｔおよびチューブリンをＩＲＤｙｅ ８００ＣＷおよび６８０ＲＤ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）とともに用いた。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃシステムを用いてブロットを画像化し、Ｉｍａｇｅ ｓｔｕｄｉｏ ｖ２．０ソフトウェアを用いて定量化した。
ｒＨＤＬは骨格筋細胞のグルコース取込みおよびＧＬＵＴ４転移を誘導する
円盤状ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）のＧＬＵＴ４転移およびグルコース取込みに対する効果を検討するため、細胞のインキュベーションに必要な組換えヒトアポＡ−Ｉおよび再構成ＨＤＬを作製した。Ｌ６筋管を５０μｇ／ｍｌ（１．６μｍｏｌ／ｌ）アポＡ−Ｉと１時間インキュベートしたあと、上記の通りにグルコース取込みアッセイを実施した。インスリンとのインキュベーションによる処置ではグルコース取込みが２倍増加し、アポＡ−Ｉで処置した細胞は１．３倍のグルコース取込み増加を示した（図１ｂ）。次に、Ｌ６筋管を５０μｇ／ｍｌの円盤状ｒＨＤＬ（１粒子当たりアポＡ−Ｉ分子が２個であると仮定して、ｒＨＤＬ中のアポＡ−Ｉの総濃度で表した）との１時間にわたるインキュベーションにより処置した。ｒＨＤＬ処置により基準の２．６倍（ｐ＝０．０９５）のグルコース取込みが誘導され、この値はインスリン刺激の場合（２．４±１．０倍）と同程度であった。しかし、１つの実験ではアポＡ−Ｉ処置およびインスリン処置ともに、他の実験の１．６〜１．９倍の範囲の効果と比較して４倍の効果がみられたことから、この値は有意に達するものではなかった（図１ｃ）。のちに細胞の数および質を含めより制御された方法でこの実験を再び実施した（筋芽細胞から多核筋管に分化する間に、分裂細胞間の時間、細胞密度、用いる細胞の代をほぼ同じにして細胞を処置した）（図７ｃ）。その結果、同程度のグルコース取込み増加（対照の約２．５倍）が観察され、統計的有意性も認められた。
完全長アポＡ−Ｉの残基１〜１８９（Ｎ末端／中央ドメイン），４４〜１８９（中央ドメイン），４４〜２４３（中央／Ｃ末端ドメイン）および１９０〜２４３（Ｃ末端ドメイン）に対応する短縮タンパク質フラグメント（図４ａ）を用いて、アポＡ−Ｉの特定の領域がグルコース取込みを増大させる相対的効果を検討した。完全長アポＡ−ＩによるＬ６筋管の処置について上に記載した通りに短縮タンパク質フラグメントのインキュベーションによる処置を実施した後、グルコース取込みアッセイを上記の通りに実施した。
図４ｂおよび８ｂからわかるように、４種類のペプチドはいずれもグルコース取込みを誘導し、１９０〜２４３のポリペプチドフラグメント（配列番号１の配列を有するポリペプチドからなる）がＬ６筋管のグルコース取込みに対して最も大きく一貫した影響を示した（対照に対して１．７７±０．２３の変化倍数；ｐ≦０．０５）。
ｒＨＤＬ仲介性のグルコース取込みはアポＡ−Ｉタンパク質に依存する
構成要素リン脂質のＬ６筋管のｒＨＤＬ誘導性グルコース取込みへの関与を検証するため、ほかにもＤＭＰＣからなるｒＨＤＬを作製し、アポＡ−Ｉタンパク質を含有しない１００ｎｍのＤＭＰＣ小胞と比較した。アポＡ−Ｉの非存在下でＤＭＰＣを用いて安定な直径１００ｎｍの小胞を合成することが可能であるため、これをリン脂質対照として用いた。グルコース取込みに対する効果を上記の通りに検証した。アポＡ−Ｉ（５０μｇ／ｍｌ）とＤＭＰＣ（０．１６ｍｍｏｌ／ｌ）とから合成したｒＨＤＬ小胞がインスリン刺激細胞と同程度にグルコース取込みを誘導したのに対して、空のＤＭＰＣ小胞（５０ｍｇ／ｍｌアポＡ−Ｉを含むｒＨＤＬ中の脂質濃度と等しい０．１６ｍｍｏｌ／ｌ）とのインキュベーションではグルコース取込みの誘導はみられなかった。ＤＭＰＣ小胞の濃度を１４倍（２．２９ｍｍｏｌ／ｌ）にしてもグルコース取込みに全く影響を及ぼさなかった（図２ａ）。ほかにも、構成要素ＰＯＰＣリン脂質のｒＨＤＬ誘導性グルコース取込みへの関与を検証するため、ＰＯＰＣからなるｒＨＤＬを、アポＡ−Ｉタンパク質を含有しない１００ｎｍのＰＯＰＣ小胞と比較した。空のＰＯＰＣ小胞（０．１０ｍｍｏｌ／ｌ）とのインキュベーションではグルコース取込みの誘導はみられなかった（図７ｃ）。ｒＨＤＬ処置では基準の２．３±０．３９倍（ｐ≦０．０５）のグルコース取込みが誘導され、この値はインスリン刺激の場合（２．４±１．０倍）と同程度であった（図７ｃ）。
ｒＨＤＬで処置したＬ６筋管ではＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化が増加するが、Ａｋｔのリン酸化は増加しない
円盤状ｒＨＤＬの非インスリン依存性シグナル伝達経路に対する効果を詳細に分析するため、ｒＨＤＬとインキュベートしたＬ６筋管の溶解物を用いてウエスタンブロット法を実施した。６０分間の処置（７００μｇ／ｍｌアポＡ−Ｉ ｒＨＤＬ）の後、Ｌ６筋管溶解物にリン酸化ＡＭＰＫのレベル（１．３６±０．０７１倍；ｐ≦０．０１）（図３ａ、３ｂ）およびその下流の標的ＡＣＣ（１．６４±０．２６倍；ｐ≦０．０５）のレベル（図３ｃ、３ｄ）の増加がみられた。陽性対照としてフェンホルミンを使用し、０．４ｍｍｏｌ／ｌの濃度でＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化がそれぞれ１．９８±０．３３倍（ｐ≦０．０５）および２．７±０．７４倍（ｐ≦０．０５）上昇した。これに対してＡｋｔリン酸化はｒＨＤＬによる影響を全く受けなかった（１．１２±０．３８Ｓ．Ｄ倍）が、インスリン（１ｎｍｏｌ／ｌ）は２．０６±０．４７Ｓ．Ｄ．倍の効果を示した（図３ｆ、３ｅ）。明確にするため、１ｎｍｏｌ／ｌインスリン（ｎ＝２）および１００ｎｍｏｌ／ｌインスリン（ｎ＝３）（５１±１２．５倍；ｐ≦０．０１）を図３ｅにプロットした。図３ａ、３ｃおよび３ｆに定量的に示した免疫ブロットの代表的なものをそれぞれ、図３ｂ、３ｄおよび３ｅに示す。
ヒトアポＡ−Ｉの１９０〜２４３ポリペプチドフラグメント（配列番号１）で処置したＬ６筋管ではＡＭＰＫのリン酸化が増加するが、Ａｋｔのリン酸化は増加しない
ヒトアポＡ−Ｉのペプチドフラグメント１９０〜２４３（配列番号１）の非インスリン依存性シグナル伝達経路に対する効果を、ｒＨＤＬについて上に記載した通りにＬ６筋管の溶解物を用いて検証した。筋管を４時間、血清不足の状態にした後、２μｍｏｌ／ｌ、１０μｍｏｌ／ｌもしくは２０μｍｏｌ／ｌの１９０〜２４３ペプチド、１ｍｍｏｌ／ｌのフェンホルミン、１００ｎｍｏｌ／ｌのインスリンまたは対照（Ｃ）で６０分間処置し、次いで、リン酸化ＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ）またはリン酸化Ａｋｔのウエスタンブロット分析を実施した。チューブリンをローディング対照として使用した。示されるブロットは３つの独立した実験の代表的なものである。
図８ｃからわかるように、Ｌ６筋管溶解物はリン酸化ＡＭＰＫレベルの増加を示した（図８ｃの上パネル）。これに対して、Ａｋｔリン酸化はペプチドフラグメント１９０〜２４３による処置に影響を受けなかった（図８ｃの下パネル）。
当業者は、配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列を有する本発明によるポリペプチドのいずれについても、この実施例の方法を用いることによって筋芽細胞および／または筋管のグルコース取込みに対する効果を検証することができることを理解するであろう。
実施例３：細胞膜ＧＬＵＴ４レベルに対する効果に関するｅｘ ｖｉｖｏ研究
実施例２に記載したグルコース取込みに関する観察結果を裏付けるため、筋特異的ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ発現を有するトランスジェニックマウスモデル（Ｌｉｚｕｎｏｖら（２０１２）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ３０２：Ｅ９５０−９６０）から単離したインタクトの初代短指屈筋（ＦＤＢ）骨格筋線維の免疫蛍光顕微鏡観察により、ｒＨＤＬおよび１９０〜２４３ポリペプチドフラグメント（配列番号１）が細胞膜中のＧＬＵＴ４の量を増大させる能力を評価した。ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ構築物の最初の細胞外表面ループ上に存在するＨＡエピトープにより、細胞膜内に挿入されたＧＬＵＴ４の検出が可能になる。インタクトのＦＤＢ線維をｒＨＤＬとｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートした後、以下に記載するように固定および非透過性細胞のＨＡ抗体標識を実施した。
初代骨格筋線維の調製および免疫染色
筋特異的ＨＡ−ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ発現を有するトランスジェニックマウス（Ｃ５７／ＢＩ６；１０〜１４週齢）（Ｓ．Ｃｕｓｈｍａｎ氏からの贈与）（Ｌｉｚｕｎｏｖら（２０１２）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ３０２：Ｅ９５０−９６０）２〜５匹を各条件に用いた。マウスを安楽死させ、短指屈筋（ＦＤＢ）を切り出し、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを添加し酸素通気したクレブス−ヘンゼライト炭酸塩Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＢＨ）緩衝液（６ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＰＯ４、１．４ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳＯ４、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２、１２８ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）でインキュベートした。筋肉を切り分けた後、水浴に入れて振盪し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で常時酸素通気ながら３７℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベーション後、筋肉を酸素通気したＫＲＢＨで３回洗浄し、次いで１時間、インスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）、アポＡ−Ｉ（完全長無脂質）、ｒＨＤＬまたはアポＡ−Ｉ１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントのいずれかで処置するか、基本条件のままで置いた。刺激後、基本条件の（未刺激の）筋肉および刺激した筋肉をＰＢＳに溶かした４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで３回洗浄し、抗ＨＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ）と３０〜６０分間インキュベートした後、蛍光標識した二次抗体Ａｌｅｘａ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３０分間インキュベートした。
共焦点顕微鏡法
共焦点ＬＳＭ５１０顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）に４０倍の対物レンズＮＡ１．３とＢＰ５０５−５３０およびＬＰ６５０を用いて、固定した細胞の画像を撮像した。ＬＳＭソフトウェアで画像を収集した。
インスリン処置、ｒＨＤＬ処置ともに、ＨＡシグナルによって検出される筋細胞膜内へのＧＬＵＴ４の転移が誘導された（図１ｄの上段パネル）。図１ｄの下段パネルは、ＧＦＰシグナルとＨＡシグナルとをマージして検出された未刺激の筋線維および刺激した筋線維の総ＧＬＵＴ４を示している。立体障害により横行小管の標識が制限されるため、細胞膜ＧＬＵＴ４転移は筋細胞膜においてのみ評価されている。同じデータをまた別に示した図７ｄも参照されたい。
この観察結果を裏付けるため、ｅｘ ｖｉｖｏで１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントとインキュベートした後、ＨＡ抗体で標識したＦＤＢ線維の共焦点免疫蛍光撮像を実施した。これらの画像は、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントに応答してＧＬＵＴ４タンパク質の膜レベルが基本条件の場合に比して高くなっていることを示していることから（図４ｃ）、図４ｂの観察結果を裏付けるものである。同じデータをまた別に示した図９ａも参照されたい。
当業者は、配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列を有する本発明によるポリペプチドのいずれについても、この実施例の方法を用いることによって細胞膜ＧＬＵＴ４レベルに対する効果を検証することができることを理解するであろう。
実施例４：本発明によるポリペプチドの構造的特徴付け
当該技術分野で公知の方法を用いることによって、配列番号１〜１０３５を有する本発明のポリペプチドをポリペプチドの分子質量、二次および三次ヘリックス含量をはじめとする特徴について明らかにし得る。例えば、ヒトアポＡ−Ｉタンパク質のアミノ酸１〜２４３および１９０〜２４３からなるポリペプチドについて以下に記載する方法のいずれか１つを用いることによって。１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントがヒトアポＡ−Ｉタンパク質のアミノ酸１９０〜２４３からなり、配列番号１の配列を有することに留意されたい。
ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
当該技術分野で公知の方法を用いて全ｒＨＤＬ調製物にブルーネイティブＰＡＧＥを実施し、直径１０ｎｍの円盤状アポＡ−Ｉ二量体の形成を確認した。図２ｂは代表的なクーマシー染色ゲルであり、単量体無脂質アポＡ−Ｉ（約２８ｋＤａ）が存在することおよびＰＯＰＣ ｒＨＤＬとＤＭＰＣ ｒＨＤＬの大きさがほぼ同じであること（ともに直径約１０ｎｍ）を示している。
円二色性（ＣＤ）分光測定
２５℃に設定されたＪａｓｃｏ ＣＤＦ−４２６Ｓ Ｐｅｌｔｉｅｒを備えたＪａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計でＣＤ測定を実施した。アポＡ−Ｉ（完全長および１９０〜２３４ポリペプチドフラグメント）を０．２ｍｇ／ｍｌになるようＰＢＳに溶かし（最終濃度はリン酸塩が２５ｍｍｏｌ／ｌ、ＮａＣｌが２５ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．４であった）、０．１ｍｍの石英セルに入れ、窒素で十分にパージした後、２００〜２６０ｎｍの領域をスキャンした（スキャン速度を２０ｎｍ／分とした）。５回のスキャンの平均値からベースラインを減じ（ＰＢＳ；２５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、２５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、既に記載されている通りに２２２ｎｍにおけるモル楕円率からα−ヘリックス含量を計算した（Ｐｅｔｒｌｏｖａら（２０１２）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ５３：３９０−３９８）．
無脂質１９０〜２４３フラグメントの構造的配座は脂質結合アポＡ−Ｉの配座に類似している
Ｌ６筋管およびＦＤＢ線維とインキュベートする場合、細胞脂質と１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントが結合するにはそのグルコース取込み誘導作用が必要であろうとする仮説を立てた。溶液中の脂質の可溶化によって１９０〜２３４ポリペプチドフラグメントが円盤状粒子を形成し得ることが知られており（Ｖｅｄｈａｃｈａｌａｎら（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５：３１９６５−３１９７３）、これをネイティブＰＡＧＥでオリゴマーとして可視化することが可能である。脂質結合の指標となるオリゴマー形成を評価するため、精製１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントおよび精製１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントで１時間処置した細胞の馴化培地をブルーネイティブＰＡＧＥで泳動し、クーマシー染色した（図５ａ）。精製１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントはいずれの条件下でも、四量体に対応する約４０ｋＤａの位置に単一のバンドとして見られた。ゲルには無脂質アポＡ−ＩおよびｒＨＤＬを完全長タンパク質の単量体および二量体の参照として含めた。
図１ａに図示されるように、アポ状態のアポＡ−Ｉの構造は、ｒＨＤＬ粒子内の同じタンパク質の構造的構成と大きく異なっている。脂質結合過程のこの構造転移では、α−へリックス二次構造が大幅に増加する（アポ状態で約４４％であったものが円盤状ＨＤＬ内のα−へリックス二次構造では７８％に増加する）（Ｓａｉｔｏら（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：２０９７４−２０９８１）。ｒＨＤＬは対応する無脂質タンパク質よりも強力に筋管のグルコース取込みを刺激すると思われることから（図１ｂと図１ｃのグルコース取込みレベルを比較されたい）、本発明者らは、無脂質１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントが溶液中で両親媒性α−へリックスの形をとるのではないかと推測した。この推測を検討するため、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントおよび完全長タンパク質からＣＤ分光測定スペクトルを取得し比較した（図５）。ヘリックス含量は、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントおよび完全長アポＡ−Ｉの２２２ｎｍにおける楕円率からそれぞれ２８％および４３％と推定され、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントのヘリックス構造の増加を示していた。図６は、提唱される１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントのヘリックス構造の構造的概観を示している。
実施例５：アポＡ−Ｉポリペプチドが脂肪細胞のグルコース取込みに及ぼす効果に関する研究
脂肪細胞の調製
脂肪細胞を既に記載されている通りに調製した（Ｒｏｄｂｅｌｌ（１９６４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２３９：３７５−８０）。簡潔に述べると、精巣上体脂肪体を細切し、１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｎＭアデノシン、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有しコラゲナーゼを１ｍｇ／ｍｌ加えたクレブス−リンガー炭酸水素塩ＨＥＰＥＳ（ＫＲＢＨ）緩衝液、ｐＨ７．４で消化した。消化後、細胞をナイロンメッシュ（２５０μｍ）でろ過し、ＫＲＢＨ緩衝液で洗浄した。
脂肪細胞のグルコース取込み
単離ラット脂肪細胞をインスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメント（配列番号１からなるアミノ酸配列を有する）（３０μｇ／ｍｌ）または１〜２４３ヒトアポＡ−Ｉタンパク質（１５０μｇ／ｍｌ）で６０分間処置した後、ＵＣ１４トレーサーグルコース（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の添加によりグルコース取込みを測定した（３０分間）。遠心分離でフタル酸ジノニル油に通すことによって取り込みを停止させた。サイトカラシンＢとのインキュベーションを用いて、非特異的バックグラウンド結合を差し引いた。グルコースの量をβカウンタによって測定される放射活性計数として検出した。同位体標識ＵＣ１４アッセイを用いて、グルコース輸送量を測定した。
図９ｂからわかるように、脂肪細胞とインスリン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）とのインキュベーションおよび脂肪細胞と１９０〜２４３ポリペプチドフラグメント（３０μｇ／ｍｌ）とのインキュベーションによってグルコース取込みが有意に誘導された。
当業者は、配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列を有する本発明によるポリペプチドのいずれについても、この実施例の方法を用いることによって脂肪細胞のグルコース取込みに対する効果を検証することができることを理解するであろう。
実施例６：アポ−Ａ１由来ペプチドによる処置のｉｎ ｖｉｖｏ効果
高脂肪食（ＨＦＤ）マウスモデルにおけるヒトアポＡ−Ｉ１９０〜２４３ポリペプチドフラグメント（配列番号１）およびそのフラグメントによる短時間処置のｉｎ ｖｉｖｏ効果に関する研究
動物および餌料
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を９〜１２週齢で用いた。マウスを１２時間の光サイクルの下に置き、餌料および水を自由摂取とした。ＨＦＤ個体にはＨＦＤ（Ｄ１２４９２、脂肪含有量６０％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を２週間摂取させた。動物の処置はいずれも、スウェーデン、ルンドのマルメ／ルンド動物実験倫理委員会によって承認されたものである。
ポリペプチド
次に挙げるヒトアポＡ−Ｉのペプチドフラグメントを試験した：
５４量体フラグメント
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸１９０〜２４３からなるフラグメント（配列番号１）
２７量体フラグメント
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸１９０〜２１６からなるフラグメント（配列番号７）
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸２１７〜２４３からなるフラグメント（配列番号８）
２３量体フラグメント
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸２０４〜２２６からなるフラグメント（配列番号５１８）
１８量体フラグメント
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸１９０〜２０７からなるフラグメント（配列番号２）
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸２０８〜２２５からなるフラグメント（配列番号３）
ヒトアポＡ−Ｉのアミノ酸２２６〜２４３からなるフラグメント（配列番号４）
グルコース負荷試験
上記アポＡ−Ｉペプチドを一晩（１２時間）絶食させたＨＦＤマウスの腹膜内に（ｉ．ｐ．）注射し（５４量体フラグメントについてはＰＢＳ、ｐＨ７．４に７ｍｇ／ｍｌで溶かしたもの、その他のフラグメントについてはＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶かしたもの６〜７ｍｇ／ｋｇを投与した；対照個体にはＮａＣｌを投与した）、次いで、示される時間に血清試料を採取した。処置の３時間後、グルコース（５０ｍｇ／マウス）をｉ．ｐ．注射し、次いで、示される時間に血清試料を採取した。血中グルコース値を測定し（ＯｎｅｔｏｕｃｈＵｌｔｒａ２；Ｌｉｆｅｓｃａｎ）、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を用いて血清中のインスリン値をアッセイした。
統計解析
別途明記されない限り、全データを平均±ＳＥＭで示す。必要に応じて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、両側スチューデントｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニの事後検定による解析を実施した。ｐ≦０．０５を有意であると見なした。
結果
図１０からわかるように、グルコース負荷試験では、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメント（配列番号１）を用いた処置により、対照個体を上回る高率でインスリン分泌（図１０ｃ、１０ｄ）および血中グルコースクリアランス（図１０ａ、１０ｂ）が有意に改善された。血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の測定結果は、試験時間中（１２０分）にペプチド処置個体にみられる総グルコースが約４０％低下することを示している。同様に、試験時間中（１２０分）にグルコースに刺激されるインスリン分泌が約６０％増大している。
図１１からわかるように、アポＡ−Ｉの１９０〜２４３の領域内の被験ペプチド（２３量体または２７量体）はグルコース耐性能に何らかの影響を及ぼした。ペプチド２３量体（ａａ２０４〜２２６、配列番号５１８）および２７量体（ａａ２１７〜２４３、配列番号８）は、血中グルコースのクリアランス能の著しい増大を示した。この結果は、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントをベースにした短いペプチドの方がグルコース耐性の改善に優れていることを示している。
図１２からわかるように、アポＡ−Ｉの１９０〜２４３領域内のペプチド（１８量体）はグルコース耐性能に影響を及ぼした。ペプチド１８量体（ａａ１９０〜２０７、配列番号２）および１８量体（ａａ２２６〜２４３、配列番号４）は、血中グルコースのクリアランス能の著しい増大を示した。この結果は、１９０〜２４３ポリペプチドフラグメントをベースにした短いペプチドの方がグルコース耐性の改善に優れていることを示している。
当業者は、配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列を有する本発明によるポリペプチドのいずれについても、この実施例の方法を用いることによってグルコース耐性の改善に対する効果を検証することができることを理解するであろう。
実施例７：インスリン抵抗性患者の治療
インスリン抵抗性のあるヒト患者を、生理食塩水（対照群）または配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトアポＡ−Ｉの１９０〜２４３ペプチドフラグメントからなるポリペプチドを生理食塩水に溶かした溶液５ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかを食前３０〜６０分に皮下注射することにより治療する。
この治療の目的は、治療する患者の細胞のグルコース取込みを誘導して空腹時血漿グルコース値を低下させることにより、グルコース代謝に正の効果を及ぼすことである。個人の投薬に対する応答に応じて、１日当たり２〜５回のボーラス注射またはこれに代えて注入が必要とされ得る。
ＹＳＩ ２３００ ＳＴＡＴ Ｐｌｕｓ（ＹＳＩ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＯＨ）などのグルコースオキシダーゼアッセイを用いて食前または食後の選択した時点の血漿グルコースを追跡することにより、グルコース取込みに対する効果を測定する。
実施例８：メタボリック症候群の治療
メタボリック症候群の基準（腹部肥満がある、ＨＤＬコレステロールが男性で４０ｍｇ／ｄｌ未満、女性で５０ｍｇ／ｄｌ未満である、血圧が少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇである、空腹時血漿グルコース値が少なくとも１１０ｍｇ／ｄｌである、および血漿トリグリセリドが少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌである）のうち少なくとも３つに該当すると診断されるヒト患者を８週間にわたって、アポＡ−Ｉの１９０〜２４３ポリペプチド（配列番号１）を１日２〜５回、食前３０〜６０分以内に皮下注射することにより治療する。
この治療の目的は、治療する患者の細胞のグルコース取込みを誘導することにより、例えば、血圧、空腹時血漿グルコース値または血漿トリグリセリド値を低下させ、ＨＤＬコレステロールを増加させて、メタボリック症候群の徴候に正の効果を及ぼすことである。個人の投薬に対する応答に応じて、１日当たり２〜５回のボーラス注射またはこれに代えて注入が必要とされ得る。

Claims (104)

  1. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
    ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
    ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体；および
    ｃ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む生物学的に活性なａ）またはｂ）のフラグメント
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    長さが１００アミノ酸未満であり、
    前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である、
    ポリペプチド。
  2. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記配列変異体において、いずれか１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に変化し、ただし、前記配列番号１に関して、１５個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば１４個以下のアミノ酸が変化したなど、例えば、１３個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば１２個以下のアミノ酸がこのように変化したなど、例えば、１１個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば１０個以下のアミノ酸がこのように変化したなど、例えば、９個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば８個以下のアミノ酸がこのように変化したなど、例えば、７個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば６個以下のアミノ酸がこのように変化したなど、例えば、５個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば４個以下のアミノ酸がこのように変化したなど、例えば、３個以下のアミノ酸がこのように変化した、例えば２個以下のアミノ酸がこのように変化したなど、例えば、１個以下のアミノ酸がこのように変化した、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  4. 前記アミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  5. 前記アミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  6. 配列番号１のアミノ酸配列に対する保存的置換がもたらされるように任意のアミノ酸が変化した変異体ポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  7. 配列番号１のアミノ酸配列に対してＡｌａ １、Ｇｌｕ ２、Ｔｙｒ ３、Ｈｉｓ ４、Ａｌａ ５、Ｌｙｓ ６、Ａｌａ ７、Ｇｌｕ ９、Ｌｅｕ １１、Ｌｅｕ １４、Ｇｌｕ １６、Ｌｙｓ １７、Ｐｒｏ ２０、Ｌｅｕ ２２、Ｇｌｕ ２３、Ａｓｐ ２４、Ｌｅｕ ２５、Ａｒｇ ２６、Ｌｅｕ ２９、Ｐｒｏ ３１、Ｇｌｕ ３４、Ｌｙｓ ３７、Ｇｌｕ ４５、Ｇｌｕ ４６、Ｌｙｓ ４９、Ｌｙｓ ５０、Ｌｅｕ ５１、Ｇｉｎ ５４の位置に保存アミノ酸残基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  8. 配列番号１のアミノ酸配列に対してＧｌｕ ２、Ｔｙｒ ３、Ｌｅｕ １１、Ｌｅｕ １４、Ｇｌｕ １６、Ｌｙｓ １７、Ｐｒｏ ２０、Ａｓｐ ２４、Ｌｅｕ ２９、Ｐｒｏ ３１、Ｇｌｕ ３４、Ｌｙｓ ３７、Ｇｌｕ ４５の位置に保存アミノ酸残基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  9. 前記高血糖症を特徴とする疾患が代謝疾患である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  10. 前記疾患が２型糖尿病である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  11. 前記疾患がインスリン抵抗性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  12. 前記疾患が１型糖尿病である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  13. 前記疾患が、内分泌・代謝疾患および肥満症からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  14. 前記疾患が、成人発症糖尿病、非ケトン性糖尿病、安定型糖尿病、２型糖尿病および若年者の非インスリン依存型糖尿病などの非インスリン依存型糖尿病からなる群より選択される内分泌・代謝疾患である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  15. 前記疾患が、硬化嚢胞性卵巣症候群およびスタイン・レヴェンタール症候群などの多嚢胞性卵巣症候群からなる群より選択される内分泌・代謝疾患である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  16. 前記疾患が、例えば過剰なカロリー摂取による、肥満症などの内分泌・代謝疾患である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  17. 前記疾患が、化学的および潜在性糖尿病；耐糖能異常；ならびに／または前糖尿病を含めたグルコース負荷試験異常である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  18. 前記疾患が、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高血糖症、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症および多嚢胞性卵巣症候群からなる群より選択される代謝疾患である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  19. 前記代謝疾患が、肝臓のインスリン抵抗性、骨格筋のインスリン抵抗性および／または脂肪組織のインスリン抵抗性からなる群より選択されるインスリン抵抗性によって引き起こされるものである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  20. 治療する対象が哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  21. 前記治療が、骨髄および／または脂肪組織のグルコース取込みの増大をもたらす、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  22. 前記治療が、少なくともの一部の治療した対象の疾患修正をもたらす、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  23. 経腸投与、局所投与、非経口投与で、または徐放埋植物の一部として投与されるか、このような投与に適合している、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  24. 前記非経口投与が、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内または腹腔内投与である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  25. 前記経腸投与が、経口、経直腸またはバッカル投与である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  26. 前記局所投与が、経皮投与、皮膚上投与、経膣投与、膀胱内投与、経肺投与、鼻腔内投与、気管内投与または点眼剤としての投与である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  27. 皮下投与または静脈内投与で投与されるか、このような投与に適合している、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  28. １μｇ／ｋｇ体重〜１０，０００μｇ／ｋｇ体重、例えば１μｇ／ｋｇ体重〜７，５００μｇ／ｋｇ体重など、例えば１μｇ／ｋｇ体重〜５，０００μｇ／ｋｇ体重など、例えば１μｇ／ｋｇ体重〜２，０００μｇ／ｋｇ体重など、例えば１μｇ／ｋｇ体重〜１，０００μｇ／ｋｇ体重など、例えば１μｇ／ｋｇ体重〜７００μｇ／ｋｇ体重など、例えば５μｇ／ｋｇ体重〜５００μｇ／ｋｇ体重など、例えば１０μｇ／ｋｇ体重〜１００μｇ／ｋｇ体重などの用量で投与するか、このような投与に適合している、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  29. 前記投与を連日反復する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  30. 前記投与を少なくとも週１〜３回、例えば週２〜５回など、例えば週３〜６回などで反復する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  31. 前記投与を連日１〜８回、例えば連日２〜５回などで反復する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  32. 配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  33. 配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  34. 配列番号１〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  35. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  36. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  37. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  38. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号５１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  39. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号５１８からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  40. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号５１８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  41. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  42. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  43. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号５１８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  44. 配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  45. 配列番号１のアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  46. 配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  47. ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）に由来しないポリペプチドおよび／またはリンカーなどの別の分子と結合した、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  48. 配列番号１〜１０３５のいずれか１つと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失を含み、この置換、付加または欠失が、配列番号１〜１０３５の１つまたは複数のアミノ酸配列に比してペプチドの溶解性をさらに増大させる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  49. 配列番号１〜１０３５のいずれか１つと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失を含み、この置換、付加または欠失が、前記ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉに比して哺乳動物細胞のグルコース取込みを増大させる、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  50. 配列番号１〜１０３５のいずれか１つと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失を有し、この置換、付加または欠失が、配列番号１〜１０３５のいずれか１つの１つまたは複数のアミノ酸配列に比して、組換え宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系での前記ポリペプチドの発現を増大させるか、化学合成での生成を促進する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  51. 患者に投与したときの半減期、特に血漿中半減期を増大させるために化学的に修飾された、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  52. 前記ポリペプチドと結合し、部分が結合したポリペプチドを生じさせる部分をさらに含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  53. 前記部分が結合したポリペプチドの血漿中および／または血清中半減期が、部分が結合していないポリペプチドの血漿中および／または血清中半減期よりも長い、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  54. 前記部分が結合したポリペプチドが、アルブミン、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アシル化基、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される１つまたは複数の種類の部分である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  55. 前記ポリペプチドと前記部分がリンカーによって互いに結合している、請求項１〜５４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  56. ２つ以上の部分が結合している、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  57. 前記配列番号１〜１０３５のいずれか１つが治療効果を有する、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  58. ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１の生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体を含まない、請求項１〜５７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  59. 配列番号３、４または６のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、単離ポリペプチド。
  60. 配列番号３、４または６のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド。
  61. 配列番号９〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、単離ポリペプチド。
  62. 配列番号９〜１０３５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド。
  63. 前記アミノ酸配列中のいずれか１つのアミノ酸残基が、対応するＤ−アミノ酸に変化している、請求項１〜６２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  64. 前記アミノ酸配列中の全アミノ酸残基が、対応するＤ−アミノ酸に変化している、請求項１〜６３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  65. 発現時に請求項５９〜６２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
  66. 請求項６５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターなどのベクター。
  67. 請求項６５に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項６６〜６７のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  68. 医薬として使用するための、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド、請求項６５に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項６６に記載のベクターまたは請求項６７に記載の宿主細胞。
  69. 請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド、請求項６５に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項６６に記載のベクターまたは請求項６７に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
  70. 代謝疾患および／または心血管疾患の治療のための第二の有効成分をさらに含む、請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 前記第二の有効成分が、代謝疾患の治療または代謝疾患が発症するリスクのある哺乳動物の予防的治療に使用される化合物である、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 前記第二の有効成分が、糖尿病の治療に使用される化合物である、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  73. 前記第二の有効成分が、インスリン、インスリンの誘導体、メトホルミンまたはその誘導体からなる群より選択される化合物である、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  74. 前記第二の有効成分が、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、β遮断剤、アスピリンなどの抗凝血剤；およびスタチンまたはフィブラートなどのコレステロール低下薬からなる群より選択される化合物である、請求項６９〜７３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  75. 前記第二の有効成分が、インスリン、エクセナチド、エクセナチド徐放製剤、リラグルチド、プラムリンチド；スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、α−グルコシダーゼおよび胆汁酸捕捉剤阻害剤からなる群より選択される化合物である、請求項６９〜７４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  76. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド、請求項６５に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項６６に記載のベクターまたは請求項６７に記載の宿主細胞。
  77. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリヌクレオチドであって、発現時に請求項１〜６４のいずれか１項で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
  78. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するためのベクターであって、発現時に請求項１〜６４のいずれか１項で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  79. 前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項７８に記載のベクター。
  80. アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピローマウイルスおよびＭｏ−ＭＬＶからなる群より選択され、好ましくはアデノ随伴ウイルスである、請求項７８〜７９のいずれかに記載のベクター。
  81. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療または予防する方法に使用するための単離宿主細胞であって、請求項６７に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項７８〜８０に記載のベクターで形質転換または形質導入された細胞。
  82. ヒト細胞である、請求項８１に記載の細胞。
  83. 幹細胞、筋細胞、肝細胞、脂肪細胞ならびにα細胞、β細胞およびδ細胞などの膵臓細胞からなる群より選択される、請求項８１および８２のいずれか１項に記載の細胞。
  84. 前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＩ１９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｉＢ５細胞、ＲＮ３３ｂ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択される、請求項８３に記載の細胞。
  85. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための医薬の調製における、
    ａ）請求項１〜６４のいずれか１項で定義される単離ポリペプチド；
    ｂ）請求項７７で定義される単離ポリヌクレオチド；
    ｃ）請求項７８〜８０のいずれか１項で定義されるベクター；および
    ｄ）請求項８１〜８４のいずれか１項で定義される単離細胞
    からなる群より選択される薬剤の使用。
  86. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための医薬の調製における、
    ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
    ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
    ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体
    を含む単離ポリペプチド、
    ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
    ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
    ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
    からなる群より選択される薬剤の使用。
  87. 高血糖症および／またはインスリン抵抗性を特徴とする疾患を治療する方法であって、治療を必要とする個体に、
    ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
    ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
    ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
    ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
    を含む単離ポリペプチド、
    ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
    ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
    ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
    からなる群より選択される治療有効量の薬剤を投与することを含む方法。
  88. 前記ポリペプチドが、請求項１〜８７のいずれか１項で定義されるものである、請求項８６に記載の使用または請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ポリペプチドが、請求項１〜８８のいずれか１項で定義されるものである、請求項８６に記載の使用または請求項８７に記載の方法。
  90. 血中グルコースを低下させる方法であって、哺乳動物と、
    ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
    ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
    ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
    ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
    を含む単離ポリペプチド、
    ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
    ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
    ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
    からなる群より選択される治療有効量の薬剤とを接触させることを含む方法。
  91. インスリン分泌を増大させる方法であって、哺乳動物と、
    ａ）１００個未満のアミノ酸残基からなり、
    ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；または
    ｉｉ）前記配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なｉ）のアミノ酸配列の配列変異体、
    ｉｉｉ）ｉ）〜ｉｉ）のいずれか１つの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント
    を含む単離ポリペプチド、
    ｂ）ａ）で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
    ｃ）ｂ）で定義される核酸分子を含むベクター、
    ｄ）ｂ）の核酸またはｃ）のベクターで形質転換または形質導入した単離宿主細胞
    からなる群より選択される治療有効量の薬剤とを接触させることを含む方法。
  92. 高血糖症に起因する心血管疾患を治療または予防する方法に使用するための単離ポリペプチドであって、
    ａ）配列番号１のアミノ酸配列；および
    ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性なａ）の配列変異体
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    長さが１００アミノ酸未満であり、
    前記生物活性が細胞のグルコース取込みの誘導である、
    ポリペプチド。
  93. 前記疾患が、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症；血液の異常所見；動脈、細動脈および毛細血管の疾患；虚血性心疾患をはじめとする心疾患からなる群より選択される、請求項８２に記載のポリペプチド。
  94. 前記疾患が、リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症、例えば、家族性高コレステロール血症；フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＩａ型；高βリポタンパク血症；高脂血症Ａ群；および低密度リポタンパク質型［ＬＤＬ］高リポタンパク血症のような単純な高コレステロール血症からなる群より選択されるリポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症などである、請求項９２〜９３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  95. 前記リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症が、内因性高グリセリド血症；フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＶ型；高脂血症Ｂ群；高プレβリポタンパク血症；および超低密度リポタンパク質型［ＶＬＤＬ］高リポタンパク血症を含めた単純な高グリセリド血症からなる群より選択される、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  96. 前記リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症が、広域または浮上βリポタンパク血症；フレドリクソン高リポタンパク血症ＩＩｂ型またはＩＩＩ型；プレβリポタンパク血症を伴う高βリポタンパク血症；内因性高グリセリド血症を伴う高コレステロール血症；高脂血症Ｃ群；結節・発疹型黄色腫；および結節型黄色腫などの混合型高脂血症からなる群より選択される、請求項９２〜９５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  97. 前記リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症が、フレドリクソン高リポタンパク血症Ｉ型またはＶ型；高脂血症Ｄ群；および混合型高グリセリド血症などの高カイロミクロン血症からなる群より選択される、請求項９２〜９６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  98. 前記リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症が、家族性複合型高脂血症などの他の高脂血症からなる群より選択される、請求項９２〜９７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  99. 前記リポタンパク質代謝の障害をはじめとする脂血症が、無βリポタンパク血症、高密度リポタンパク質欠乏症、低αリポタンパク血症；低βリポタンパク血症（家族性）；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症およびタンジール病などのリポタンパク質欠乏症からなる群より選択される、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  100. 前記動脈、細動脈および毛細血管の疾患が、細動脈硬化症；動脈硬化性血管疾患；アテローム；動脈変性；動脈血管変性および血管変性などのアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項９２〜９９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  101. 前記動脈、細動脈および毛細血管の疾患が、冠（動脈）性心疾患などのアテローム硬化性心疾患からなる群より選択される、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  102. 前記虚血性心疾患をはじめとする心疾患が、狭心症；心筋梗塞；大動脈弁狭窄症；および代謝疾患における心筋症からなる群より選択される、請求項９２〜１０１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  103. 前記心血管疾患が、非正常脂質値または身体構成要素内への脂質を含有する沈着を特徴とする、請求項９２〜１０２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  104. 前記心血管疾患が、急性冠動脈症候群、アテローム性動脈硬化症、血管内のアテローム性動脈硬化プラーク、狭窄性弁膜症、敗血症性ショック、狭心症、心筋梗塞、不安定狭心症、動脈狭窄症、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症、冠動脈狭窄症、血管性認知症、再狭窄、不安定プラークおよび一過性黒内障からなる群より選択される、請求項９２〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
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