CN105407909A - 用于治疗高血糖症的载脂蛋白a-i源性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源于载脂蛋白A-I(apoA-I)的肽和它们用于治疗或预防与高血糖症相关的疾病和病症的用途。

Description

用于治疗高血糖症的载脂蛋白A-I源性肽
发明领域
本发明涉及源于载脂蛋白A-I(apoA-I)的肽和它们用于治疗或预防与高血糖症相关的病症的用途。
发明背景
载脂蛋白A-I(apoA-I)是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白质组分，并且因此对于胆固醇逆向转运是重要的(Zannis等(2006)J.Mol.Med.84:276-294)。
ApoA-I及其各种片段在文献中是已知的。实例包括US2011/0178029，其描述修饰的人apoA-I多肽及其各种用途。Qin等(2011)AngewandteChemie50:12218-12221的补充材料公开在那些许多apoA-I肽之中，通过胰蛋白酶裂解各种蛋白质所产生，并且随后通过质谱测定法所分析的肽的长清单。CN102323365A也公开apoA-I的片段。也已知如何重组产生apoA-I，如例如由WO94/138189所显示，所述专利公开一种用于在大肠杆菌(E.coli)中产生apoA-I-M(Milano)的表达系统。
在不同形式的HDL中以及在无脂质状态下，apoA-I蛋白以多种结构组织方式存在(Rye等(2000)J.LipidRes.50(增刊):S195-S200)。脂质结合形式包括具有不同直径的盘状平面HDL粒子与具有不同尺寸和脂质组成的成熟球形HDL粒子与脂质结合状态之间两者。apoA-I的决定它的功能的关键特征包括在脱辅基状态在二级、三级和四级结构方面产生重大变化的高结构可塑性以及通过脂质缔合形成的螺旋的两亲特性。
无脂质/脂质贫乏apoA-I通常存在于血浆中，但仅占总血浆apoA-I的多达5％，并且接受自细胞膜流出的胆固醇和磷脂。apoA-I的渐进性脂质化产生盘状HDL，并且使apoA-I再循环回HDL级分中。因此，全长apoA-I是一种在治疗性施用之前需要与HDL合成整合的疏水性分子，如WO2012/28526、US2012/0021982和US2011/212139中所公开。
对apoA-I的生物物理学性质的生物物理学开发已例如在WO2012/153620中提出，所述专利公开使apoA-I偶联于各种治疗性肽，目的在于增加溶解性以及与粘膜结合和跨越粘膜转运。另一实例是US2008/0227686，其公开用于促进脂质流入细胞中的全长apoA-I和apoA-I的片段。
关于与高血糖症相关的适应症，已知作为血浆葡萄糖清除的主要部位的骨骼肌中的葡萄糖摄取速率由细胞表面GLUT4水平决定，所述GLUT4由胰岛素信号传导通路与AMP激酶(AMPK)收缩诱导的通路两者控制(Tremblay等(2003)Front.Biosci.8:d1072-d1084)。
此外，已显示无脂质apoA-I和球形HDL可通过活化AMPK来诱导C2C12肌管中(Han等(2007)Diabetologia50:1960-1968)和自来自糖尿病供体的肌肉卫星细胞分化的人肌管中(Drew等(2009)Circulation119:2103-2111)的葡萄糖摄取。尽管存在这些研究结果，但在本申请的优先权日之前，并不明确盘状HDL是否能够特异性调控肌肉葡萄糖摄取以及这是否通过AMPK而发生。也不了解apo-I的哪些结构域引发所述作用。
发明概述
鉴于HDL亚种与血管壁处的用于胆固醇流出的细胞受体差异性相互作用，并且盘状HDL是这个相互作用的强效结构(Favari等(2009)Biochemistry48:11067-11074)，本发明者假设盘状HDL将高度有效刺激肌肉中的葡萄糖摄取。因此，本发明者使用L6肌管和分离的初级骨骼趾短屈肌(FDB)纤维来探究合成的盘状HDL(rHDL)和apoA-I源性肽对葡萄糖摄取、细胞内信号传导以及GLUT4易位至质膜(肌纤维膜)的影响。因此，本发明者已惊人地发现源于apoA-I的C末端的不与脂质体缔合的肽能够诱导细胞中的葡萄糖摄取，并且因此对血糖水平具有有益作用。因此，所述肽适用于治疗特征在于血液中的葡萄糖水平增加的疾病。
因此，本发明提供一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸，
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度，并且其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。
本发明者已鉴定源于apoA-I的C末端结构域的生物活性肽，如由以下组成或基本上由以下组成的分离的多肽：选自由氨基酸序列SEQIDNO:3、4、6以及9至1035组成的组的氨基酸序列；以及编码所述多肽的多核苷酸；和包含所述多核苷酸的载体，如表达载体；和包含所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。
在某些方面，本发明也涉及一种包含所述多肽、所述多核苷酸、所述载体和所述宿主细胞的药物组合物。
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的代谢和/或血管疾病的方法中的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含在表达后编码如上文定义的多肽的核酸序列。
在另一方面，本发明涉及用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的代谢和/或血管疾病的方法中的包含所述多核苷酸的载体以及包含所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。
在某些方面，本发明涉及选自由以下组成的组的药剂的用途：
a)如本文定义的分离的多肽；
b)如本文定义的分离的多核苷酸；
c)如本文定义的载体；以及
d)如本文定义的分离的细胞，
所述药剂用于制备用于治疗和/或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的代谢和/或血管疾病的医药。
本发明者已发现apoA-I的C末端结构域及其肽片段导致血液中的葡萄糖清除改善。因此，编码所述多肽和肽的多核苷酸适用作用于治疗与哺乳动物的血液中的高葡萄糖水平相关的病症的治疗剂。因此，本发明涉及选自由以下组成的组的药剂的用途：
a)分离的多肽，其包含：
i)氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的核酸分子的载体，
d)用b)的核酸或c)的载体转化或转导的分离的宿主细胞，
所述药剂用于制备用于治疗和/或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的代谢和/或血管疾病的医药。
本发明也涉及一种用于治疗特征在于高血糖症和/或高胰岛素血症的代谢和/或血管疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的选自由以下组成的组的药剂：
a)分离的多肽，其包含：
i)氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的核酸分子的载体，
d)用b)的核酸或c)的载体转化或转导的分离的宿主细胞,
另外，在一个方面，本发明涉及一种用于降低血糖的方法，所述方法包括使哺乳动物与有效量的选自由以下组成的组的药剂接触：
a)分离的多肽，其包含：
i)氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的核酸分子的载体，
d)用b)的核酸或c)的载体转化或转导的分离的宿主细胞。
附图说明
图1.盘状HDL有效诱导肌肉中的葡萄糖摄取和GLUT4葡萄糖转运体易位。a)在无脂质(左侧结构)、盘状HDL(中间结构)和球形HDL(右侧结构)状态下的apoA-I的结构模型，其指示HDL成熟中的显著结构重排。淡灰色区域指示磷脂、胆固醇和胆固醇酯的核心。b)L6肌管中的葡萄糖摄取。在2小时血清饥饿之后，用50μg/ml(1.6μmol/l)apoA-I或胰岛素(100nmol/l)刺激L6肌管，并且与未刺激的对照肌管(C)进行比较。c)类似地，将血清饥饿的L6肌管用50μg/ml(1.6μmol/l)rHDL(apoA-I/POPC)或胰岛素(100nmol/l)刺激或不刺激(C)，随后进行葡萄糖摄取测定。d)在用50μg/ml(apoA-I)rHDL、100nmol/l胰岛素处理趾短屈肌(FDB)肌肉纤维60分钟或不刺激之后，HA-GLUT4-GFP定位的变化。固定肌纤维，并且进行免疫荧光分析。棒条尺寸是10μm。图像代表各自用来自2-4只动物的肌纤维进行的3次独立实验。(在b(n＝4)和c(n＝3)中，***p＝≤0.001)
图2.磷脂在rHDL刺激的葡萄糖摄取中的作用。a)在2小时血清饥饿之后，用50μg/ml(1.6μmol/l；apoA-I)DMPCrHDL、胰岛素(100nmol/l)或0.16mmol/l或2.29mmol/lDMPC100nm囊泡刺激L6肌管60分钟，随后测定葡萄糖摄取(n＝3)*p＝≤0.05，**p＝≤0.01。b)显示无脂质apoA-I(4.5μg)、POPCrHDL(4.9μgapoA-I)和DMPCrHDL(5.6μgapoA-I)的考马斯(Coomassie)染色的蓝色-非变性PAGE。
图3.rHDL对L6肌管中AMPK、ACC和Akt的磷酸化的影响。使肌管血清饥饿4小时，接着用rHDL(700μg/mlapoA-I)、2mmol/l或0.4mmol/l苯乙双胍、100nmol/l或1nmol/l胰岛素或对照(C)处理60分钟。a)对经受使用针对磷酸-AMPK和AMPK，c)磷酸-ACC和AMPK，以及f)磷酸-Akt和Akt的抗体进行的蛋白质印迹分析的裂解物的光密度分析。b)、d)和e)显示代表性蛋白质印迹。结果来自3次独立实验，例外之处是1nmol/l胰岛素n＝2。误差棒显示SEM，例外之处是在误差棒是SD的f中；*p＝≤0.05，**p＝≤0.01。
图4.apoA-I的特定区域对葡萄糖摄取的影响。a)供分析其诱导葡萄糖摄取的效能的apoA-I片段的示意性线性表示(FLapoA-I即全长apoA-I)。b)测量已被血清饥饿2小时，接着用代表人apoA-I的残基1-189、44-189、44-243或190-243(SEQIDNO:1)的肽(都是与50μg/ml全长(FL)apoA-I等摩尔的1.6μmol/l)或100nmol/l胰岛素(Ins)刺激或不刺激(C)60分钟的L6肌管中的葡萄糖摄取。(n＝3-4；*p＝≤0.05，***p＝≤0.001)。c)来自HA-GLUT4-GFP转基因小鼠的用apoA-I的190-243片段(SEQIDNO:1)(1.6μmol/l)、胰岛素(100nmol/l)离体处理或不刺激60分钟的FDB纤维的免疫荧光图像。棒条尺寸是10μm。图像指示每次实验用来自2-4只小鼠的FDB纤维进行的3次独立实验。
图5.SEQIDNO:1的190-243apoA-I片段的性质。a)对含190-243片段的溶液(190-243；0.26μg)以及在与L6肌管一起孵育60分钟之后(190-243培养基；0.26μg)的非变性凝胶分析。无脂质apoA-I(apoA-I；4.4μg)和rHDL(apoA-I；9.4μg)用作参照样品。rHDL/apoA-I泳道中的在242kDa与146kDa之间的条带对应于rHDL，而在66kDa与20kDa之间的条带对应于全长apoA-I(1-243)。在190-243和190-243培养基泳道中在66kDa与20kDa之间的条带对应于190-243寡聚物。b)在0.2mg/ml的蛋白质浓度下于PBS缓冲溶液中分析的全长apoA-I(实心迹线)和190-243片段(虚线)的圆二光谱。
图6.无脂质apoA-I190-243片段可采用与rHDL中的结构类似的结构。左侧是以深灰色显示的如无脂质结构模型(底部)中折叠的190-243片段的结构(顶部)。右侧是以深灰色显示为对应于apoA-I的这个区域在盘状HDL中的结构排列(底部)的延伸的两亲性α螺旋的190-243片段的结构(顶部)。箭头指示在溶液中在平衡时向无脂质190-243apoA-I片段的类似HDL的两亲性α螺旋结构的变换。
图7.HDL中的apoA-I在葡萄糖摄取和葡萄糖转运体GLUT4易位中的影响。a)在无脂质(左侧结构，Lagerstedt等(2012)BiochemicaBiophysicsActa；1821:448-455)、盘状HDL(中间结构，Lagerstedt等(2011)JofBiologicalChemistry,2011；286:2966-2975)和球形HDL(右侧结构，Silva等(2008)PNAS105:12176-12181)状态下的apoA-I的结构模型，其指示HDL成熟中的显著结构重排。磷脂、胆固醇和胆固醇酯的核心以淡灰色包括在盘状和球形HDL结构中。b)显示无脂质人apoA-I(4.5μg)和POPCrHDL(4.9μgapoA-I)的考马斯染色的蓝色-非变性PAGE。c)盘状HDL有效诱导L6肌管中的葡萄糖摄取。在2小时血清饥饿之后，用2μmol/l(60μg/ml)POPCrHDL(表示为含apoA-I的rHDL的总蛋白质浓度)、胰岛素(100nmol/l)或100nmPOPC囊泡(0.10mmol/l)刺激或不刺激(C)L6肌管60分钟，随后测定葡萄糖摄取(n＝3)，*p＝≤0.05。d)测量为在用1μmol/lrHDL(30μg/mlapoA-I)、100nmol/l胰岛素处理趾短屈肌(FDB)肌肉纤维60分钟或不刺激之后，HA-GLUT4-GFP定位的变化的肌肉中GLUT4葡萄糖转运体易位。固定肌纤维，并且进行免疫荧光分析。白色箭头(上部图)指示位于质膜中的HA-GLUT4-GFP的免疫荧光信号(用抗HA抗体鉴定)。中间图显示GFP荧光信号。底部图显示GFP和HA信号的合并图像。棒条尺寸是10μm。图像代表各自用来自2-4只动物的肌纤维进行的3次独立实验，n＝3，±SEM；*p＝≤0.05。
图8.apoA-I的特定区域对葡萄糖摄取和细胞内信号传导通路的影响。a)供分析其诱导葡萄糖摄取的效能的apoA-I片段的示意性线性表示(FLapoA-I即全长apoA-I)。b)测量已被血清饥饿2小时，接着用等摩尔粒子浓度(1μmol/l)的代表apoA-I的残基1-243、1-189、44-189、44-243或190-243(SEQIDNO:1)的肽或100nmol/l胰岛素(Ins)刺激或不刺激(C)60分钟的L6肌管中的葡萄糖摄取。肽处理是基于1-243、1-189、44-189和44-243的单体或二聚组织方式(1μmol/l肽单位)以及190-243的二聚或四聚组织方式(2μmol/l肽单位)。(n＝3-4；*p＝≤0.05，***p＝≤0.001)。c)使肌管血清饥饿4小时，接着用2、10或20μmol/l190-243肽、1mmol/l苯乙双胍(Phen)、100nmol/l胰岛素(Ins)或对照(C)处理60分钟，随后蛋白质印迹分析磷酸化的AMPK(AMP活化的蛋白质激酶；上部图)或磷酸化的Akt(下部图)。微管蛋白用作装载对照。所示印迹代表三次独立实验。
图9.apoA-I的190-243区域对初级分离的肌肉纤维中的GLUT4葡萄糖转运体易位以及对脂肪细胞中的葡萄糖摄取的离体影响。a)来自HA-GLUT4-GFP(血凝素-GLUT4-绿色荧光蛋白)转基因小鼠的用apoA-I的190-243片段(SEQIDNO:1)(2μmol/l),、胰岛素(100nmol/l)离体处理或不刺激60分钟的初级骨骼FDB(趾短屈肌)纤维的免疫荧光图像。棒条尺寸是10μm。固定肌纤维，并且进行免疫荧光分析。白色箭头(上部图)指示位于质膜中的HA-GLUT4-GFP的免疫荧光信号(用抗HA抗体鉴定)。中间图显示GFP荧光信号。底部图显示GFP和HA信号的合并图像。图像指示每次实验用来自2-4只小鼠的FDB纤维进行的3次独立实验。b)用胰岛素(100nmol/l)、190-243肽片段(SEQIDNO:1)(30μg/ml)或1-243apoA-I蛋白(150μg/ml)处理分离的大鼠脂肪细胞30分钟，随后测量葡萄糖摄取。数据呈现为超过基础(对照)的倍数增加。(n＝3；*p＝≤0.05)。
图10.apoA-I的190-243区域对体内葡萄糖耐受性的影响。a)对胰岛素抗性C57Bl/6小鼠的急性apoA-I190-243片段治疗改善葡萄糖耐受性测试(GTT)中的葡萄糖分解能力。用单次注射(每千克体重7mg)apoA-I的190-243片段(方块)或NaCl(圆圈；对照)处理HFD小鼠3小时。在注射NaCl或apoA-I的190-243片段之后3小时，小鼠接受腹膜内葡萄糖负载(50mg/小鼠)，随后在指示时间点测定(a)葡萄糖和(c)胰岛素浓度。(b)和(d)分别显示在GTT期间的葡萄糖和胰岛素水平的曲线下面积(AUC)值。n＝3-4；p值如所示。
图11.apoA-I的190-243区域内的肽(23或27-mer)以及它们对体内葡萄糖耐受能力的影响。在对胰岛素抗性C57Bl/6小鼠的急性apoA-I肽治疗之后在葡萄糖耐受性测试(GTT)中测定葡萄糖分解能力。用单次注射(每千克体重6-7mg)以下23-27-mer肽治疗HFD小鼠3小时：a)27-mer(氨基酸190-216)；b)23-mer(氨基酸204-226)；c)27-mer(氨基酸217-243)。在注射NaCl或肽之后3小时，小鼠接受腹膜内葡萄糖负载(50mg/小鼠)，随后在指示时间点测定葡萄糖浓度。d)显示在GTT期间的葡萄糖水平的AUC值。e)显示在GTT期间的葡萄糖水平的AUC值(高于基础葡萄糖水平)。n＝3-4。
图12.apoA-I的190-243区域内的肽(18-mer)以及它们对体内葡萄糖耐受能力的影响。在对胰岛素抗性C57Bl/6小鼠的急性apoA-I肽治疗之后在葡萄糖耐受性测试(GTT)中测定葡萄糖分解能力。用单次注射(每千克体重7mg)以下18-mer肽治疗HFD小鼠3小时：a)18-mer(氨基酸190-207)；b)18-mer(氨基酸208-225)；c)18-mer(氨基酸226-243)。在注射NaCl或肽之后3小时，小鼠接受腹膜内葡萄糖负载(50mg/小鼠)，随后在指示时间点测定葡萄糖浓度。d)显示在GTT期间的葡萄糖水平的AUC值。e)显示在GTT期间的葡萄糖水平的AUC值(高于基础葡萄糖水平)。n＝3-4。
发明详述
I.定义
apoA-I：如本文所用的apoA-I(有时也称为apoA-1、apoAI和apoA1)是指具有自任何物种(特别是哺乳动物，包括黑猩猩、牛、羊、猪、鼠、马并且优选是人)获得的基本上纯的apoA-I的氨基酸序列的来自任何来源(无论天然、合成、半合成或重组)的多肽。所述术语也指自这些物种中的任一个获得的apoA-I的生物活性片段以及这些apoA-I的生物活性序列变体和经受翻译后修饰的蛋白质。
编码序列：如本文所用的术语“编码序列”是转录并翻译成多肽的多核苷酸序列。
表达载体：如本文所用的术语“表达载体”是指能够指导它们所可操作地连接的基因的表达的载体。一般来说，在重组DNA技术方面具有用途的表达载体常呈质粒形式。
片段：在一个实施方案中，根据本发明的多肽片段(包括其任何功能性等效物)可包含选自由SEQIDNO:1至1035或与所述序列具有至少70％(例如至少85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的其变体组成的组的氨基酸序列的小于150个氨基酸残基，如小于140个氨基酸残基，例如小于130个氨基酸残基，如小于120个氨基酸残基，例如小于110个氨基酸残基，如小于100个氨基酸残基，例如小于90个氨基酸残基，如小于85个氨基酸残基，例如小于80个氨基酸残基，如小于75个氨基酸残基，例如小于70个氨基酸残基，如小于65个氨基酸残基，例如小于60个氨基酸残基，如小于55个氨基酸残基，例如小于50个氨基酸残基，如小于45个氨基酸残基，例如小于40个氨基酸残基，如35个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基，如25个氨基酸残基，如20个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，如10个连续氨基酸残基。此外，在一个实施方案中，根据本发明的多肽片段(包括其任何功能性等效物)可包含选自由SEQIDNO:1至1035或与所述序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或至少99％)同一性的其变体组成的组的大于10个氨基酸残基，例如大于15个氨基酸残基，如大于20个氨基酸残基，例如大于25个氨基酸残基，例如大于50个氨基酸残基，如大于75个氨基酸残基，例如大于100个氨基酸残基，如大于125个氨基酸残基，例如大于130个氨基酸残基，如大于140个氨基酸残基，例如大于145个氨基酸残基。活性片段的实例包括以下中的一个或多个：SEQIDNO:2至1035。片段的长度可为选自SEQIDNO:1至1035中的任一个的10至150个氨基酸，例如15至140、20至130、25至120、25至110、25至100、25至90、25至80、25至70、25至60、25至54、30至54、20至40或20至30个连续氨基酸残基。
高血糖症：高血糖症是一种其中过量葡萄糖在血浆中循环的病状。这通常是葡萄糖水平高于11.1mmol/l(200mg/dl)，但症状可能不开始变得显著，直至甚至更高的值，如15-20mmol/l(约250-300mg/dl)。一致范围在100mg/dl与126mg/dl之间(美国糖尿病联合会(AmericanDiabetesAssociation)指导方针)的受试者被视为高血糖，而高于126mg/dl或7mmol/l通常被认定患有糖尿病。长期水平超过7mmol/l(125mg/dl)可产生器官损害。一般来说，大多数人(空腹成人)的正常范围是约80至110mg/dl或4至6mmol/l(其中80mg/dl被视为“最优”)。可通过使用本领域中的各种已知技术测定血糖水平，诸如例如通过使用可商购获得的血糖仪、连续葡萄糖监测器(CGM)或葡萄糖传感生物植入物。处于超过略微超常的水平的慢性高血糖症可历经数年的时期产生极广泛的多种严重并发症，包括肾损害、神经损害、心血管损害、对视网膜的损害或对足部和腿部的损害。糖尿病性神经病变可为长期高血糖症的结果。以下症状可与急性或慢性高血糖症相关，其中前三个组成经典高血糖三联征：多食(显著或频繁饥饿)、烦渴(过度或频繁口渴)、多尿(频繁排尿)、视力模糊、疲劳、体重减轻、创伤愈合不良、口干、皮肤干燥或发痒、足部和踵部中有刺痛感、勃起功能障碍、复发性感染(诸如例如外耳感染)、心律不齐、木僵、昏迷、癫痫发作。
增加：如与血浆半衰期关联使用的术语增加用于指示apoA-I源性肽的如在类似条件下确定的相关半衰期。举例来说，相关半衰期可增加至少约25％，如至少约50％，例如至少约100％、150％、200％、250％或500％。可以如文献中所述的许多方式对体内血浆半衰期进行测量。体内血浆半衰期的增加可定量为清除率的降低或平均滞留时间(MRT)的增加。如在适合测定中所测定，清除率降低至apoA-I源性肽的清除率的小于70％，如小于50％，如小于20％，如小于10％的本发明的apoA-I源性肽被称为具有增加的体内血浆半衰期。在适合测定中，MRT增加至apoA-I的MRT的大于130％，如大于150％，如大于200％，如大于500％的本发明的apoA-I源性肽被称为具有增加的体内血浆半衰期。可使用适合的测试动物在标准药代动力学研究中评估清除率和平均滞留时间。在本领域技术人员的能力内的是选择适于给定蛋白质的测试动物。当然，在人中进行测试代表最终测试。适合的测试动物包括正常Sprague-Dawley雄性大鼠、小鼠和食蟹猕猴。通常，以单次皮下推注注射小鼠和大鼠，而可以单次皮下推注或以单次静脉内剂量注射猴。注射的量取决于测试动物。随后，酌情历经1至10天的时期(视测定的灵敏度而定，它可长达30天)获取血液样品以评估清除率和MRT。通过ELISA技术或其它免疫学技术来便利地分析血液样品。
胰岛素抗性：如通过肝、脂肪组织和骨骼肌中的胰岛素应答和葡萄糖摄取降低所反映，当个体的组织表现得好像在血流中存在不足胰岛素时，他们被称为具有‘胰岛素抗性’。对胰岛素抗性的第一应答是代偿性产生和分泌胰岛素以补偿身体的敏感性降低，从而导致高胰岛素血症。因此，高胰岛素水平和组织对葡萄糖自血流清除的应答性降低是胰岛素抗性的特征。胰岛素抗性是导致一系列代谢变化的主要事件，所述变化包括代偿性高胰岛素血症、血脂异常、胰腺β细胞的代偿失调和高血糖症。胰岛素抗性的征象和症状是：脑模糊和不能集中、高血糖水平、肠发胀、困倦、体重增加、脂肪储存(特别是在腹部器官中和周围)、体重难以减轻、血液甘油三酯水平增加、血压增加、与心血管疾病相关的促炎症性细胞因子增加、抑郁、黑棘皮病、饥饿感增加。可通过使用本领域中的不同技术来诊断胰岛素抗性，所述技术例如在本领域中通常使用的高胰岛素血症正血糖钳夹术或改进的胰岛素抑制测试。
接头：如本文所用的术语“接头”意指分隔apoA-I片段和缀合于apoA-I的药学上可接受的分子，因此导致半衰期增加，如血浆半衰期增加的价键或多官能部分，如双官能部分。
正常脂质水平：如本文所用的术语‘正常脂质水平’应解释为血液或血浆脂质水平符合所论述管辖区域的中央卫生机关的推荐规范。例如在欧洲，根据欧洲动脉粥样硬化学会(EuropeanAtherosclerosisSociety)(欧洲)的指导方针：总胆固醇<5.2mM，LDL胆固醇<1.8mM，HDL胆固醇>1.0mM，甘油三酯<1.7mM。根据美国心脏联合会(AmericanHeartAssociation)(美国)的指导方针：总胆固醇<200mg/dl，LDL胆固醇<100mg/dl，HDL胆固醇>60mg/dl，甘油三酯<100mg/dl))。通过在禁食12小时之后的血液样品获得脂质特征。
可操作地连接：如本文所用，术语可操作地连接(operablylinked)或可操作性地连接(operatively-linked)旨在意指目标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在所述宿主细胞中)的方式在重组表达载体内连接于调控序列。
药学上可接受的分子：如本文所用的术语药学上可接受的分子意指选自当连接于apoA-I时增加apoA-I或其变体的血清半衰期的以下中的任一个的分子：小有机分子、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、糖基化物、糖、聚合物(例如聚乙二醇PEG)、核酸(例如DNA和RNA)、激素。通常，药学上可接受的分子是(不限于)白蛋白，如人白蛋白、重组白蛋白；或聚合物，如PEG，例如分子量是至少10kDa，如10kDa至150kDa的PEG。此外，药学上可接受的分子可选自哺乳动物抗体的Fc片段、转铁蛋白、白蛋白(如人白蛋白、重组白蛋白、白蛋白的变体)、CH3(CH2)nCO-(其中n是8至22)、或聚合物(如PEG，例如分子量是至少5kDa，如10kDa至150kDa，通常10至40kDa的PEG)。
血浆浓度：如本文所用的术语血浆浓度意指可在施用本发明的apoA-I源性肽之后的任何给定时间测量的在循环中的浓度。
聚合物：如本文所用的术语“聚合物”意指通过共价键联两个或更多个单体形成的分子，其中无单体是氨基酸残基，例外之处是当聚合物是人白蛋白或另一丰富的血浆蛋白时。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。所述术语旨在涵盖通过体外糖基化连接的碳水化合物分子。通过体内糖基化，如N-糖基化或O-糖基化(如以下进一步所述)连接的碳水化合物分子在本文中称为“寡糖部分”。除当明确指示聚合物分子的数目时之外，每次提及如本发明中所用的“一种聚合物”、“一种聚合物分子”、“所述聚合物”或“所述聚合物分子”都将是对一种或多种聚合物分子的提及。聚合物可为水溶性或水不溶性聚合物，如PEG部分。PEG部分可具有选自500Da至200,000Da，如500Da至100,000Da，如2000Da至50,000Da的范围的平均尺寸。此类PEG分子可自即ShearwaterInc检索。
调控序列：如本文所用的术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。
血清半衰期：可与“血浆半衰期”或“半衰期”互换使用的术语血清半衰期是以它的正常含义使用，即为生物系统中的apoA-I源性肽的量降低至它的浓度的一半所需的时间。因此，如本文所用，“血清半衰期”意指体内血清半衰期。确定血清半衰期常比确定功能性半衰期更简单，并且血清半衰期的量值通常是功能性体内半衰期的量值的良好指示。优选地，测量在哺乳动物中，更优选在人科物种，如猩猩、黑猩猩或大猩猩中，更优选在人中的血清半衰期。本申请中提及的血清半衰期是如在人中确定的半衰期。也可获得在啮齿动物，如小鼠或大鼠或仓鼠中的半衰期或任何半衰期变化的示值。此外，可测量在体重与人类在相同范围内或比啮齿动物更接近人类的较大哺乳动物中的半衰期：优选是猴、狗、猪或牛(小牛)。
SEQIDNO.X至Z：如本文所用的术语‘SEQIDNOX至Z’(其中X和Z是两个整数，并且其中Z>X)应解释为包括区间X至Z(X-Z)，包括整数X和Z以及在X与Z之间的各个和每个整数，如X、Y、Z。因此，术语SEQIDNO:1至8应解释为包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的区间。类似地，SEQIDNO:1至1035和SEQIDNO:1-1035应解释为包括序列SEQIDNO:1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7，SEQIDNO：8，SEQIDNO：9，SEQIDNO：10，SEQIDNO：11，SEQIDNO：12，SEQIDNO：13，SEQIDNO：14，SEQIDNO：15，SEQIDNO：16，SEQIDNO：17，SEQIDNO：18，SEQIDNO：19，SEQIDNO：20，SEQIDNO：21，SEQIDNO：22，SEQIDNO：23，SEQIDNO：24，SEQIDNO：25，SEQIDNO：26，SEQIDNO：27，SEQIDNO：28，SEQIDNO：29，SEQIDNO：30，SEQIDNO：31，SEQIDNO：32，SEQIDNO：33，SEQIDNO：34，SEQIDNO：35，SEQIDNO：36，SEQIDNO：37，SEQIDNO：38，SEQIDNO：39，SEQIDNO：40，SEQIDNO：41，SEQIDNO：42，SEQIDNO：43，SEQIDNO：44，SEQIDNO：45，SEQIDNO：46，SEQIDNO：47，SEQIDNO：48，SEQIDNO：49，SEQIDNO：50，SEQIDNO：51，SEQIDNO：52，SEQIDNO：53，SEQIDNO：54，SEQIDNO：55，SEQIDNO：56，SEQIDNO：57，SEQIDNO：58，SEQIDNO：59，SEQIDNO：60，SEQIDNO：61，SEQIDNO：62，SEQIDNO：63，SEQIDNO：64，SEQIDNO：65，SEQIDNO：66，SEQIDNO：67，SEQIDNO：68，SEQIDNO：69，SEQIDNO：70，SEQIDNO：71，SEQIDNO：72，SEQIDNO：73，SEQIDNO：74，SEQIDNO：75，SEQIDNO：76，SEQIDNO：77，SEQIDNO：78，SEQIDNO：79，SEQIDNO：80，SEQIDNO：81，SEQIDNO：82，SEQIDNO：83，SEQIDNO：84，SEQIDNO：85，SEQIDNO：86，SEQIDNO：87，SEQIDNO：88，SEQIDNO：89，SEQIDNO：90，SEQIDNO：91，SEQIDNO：92，SEQIDNO：93，SEQIDNO：94，SEQIDNO：95，SEQIDNO：96，SEQIDNO：97，SEQIDNO：98，SEQIDNO：99，SEQIDNO：100，SEQIDNO：101，SEQIDNO：102，SEQIDNO：103，SEQIDNO：104，SEQIDNO：105，SEQIDNO：106，SEQIDNO：107，SEQIDNO：108，SEQIDNO：109，SEQIDNO：110，SEQIDNO：111，SEQIDNO：112，SEQIDNO：113，SEQIDNO：114，SEQIDNO：115，SEQIDNO：116，SEQIDNO：117，SEQIDNO：118，SEQIDNO：119，SEQIDNO：120，SEQIDNO：121，SEQIDNO：122，SEQIDNO：123，SEQIDNO：124，SEQIDNO：125，SEQIDNO：126，SEQIDNO：127，SEQIDNO：128，SEQIDNO：129，SEQIDNO：130，SEQIDNO：131，SEQIDNO：132，SEQIDNO：133，SEQIDNO：134，SEQIDNO：135，SEQIDNO：136，SEQIDNO：137，SEQIDNO：138，SEQIDNO：139，SEQIDNO：140，SEQIDNO：141，SEQIDNO：142，SEQIDNO：143，SEQIDNO：144，SEQIDNO：145，SEQIDNO：146，SEQIDNO：147，SEQIDNO：148，SEQIDNO：149，SEQIDNO：150，SEQIDNO：151，SEQIDNO：152，SEQIDNO：153，SEQIDNO：154，SEQIDNO：155，SEQIDNO：156，SEQIDNO：157，SEQIDNO：158，SEQIDNO：159，SEQIDNO：160，SEQIDNO：161，SEQIDNO：162，SEQIDNO：163，SEQIDNO：164，SEQIDNO：165，SEQIDNO：166，SEQIDNO：167，SEQIDNO：168，SEQIDNO：169，SEQIDNO：170，SEQIDNO：171，SEQIDNO：172，SEQIDNO：173，SEQIDNO：174，SEQIDNO：175，SEQIDNO：176，SEQIDNO：177，SEQIDNO：178，SEQIDNO：179，SEQIDNO：180，SEQIDNO：181SEQIDNO：182，SEQIDNO：183，SEQIDNO：184，SEQIDNO：185，SEQIDNO：186，SEQIDNO：187，SEQIDNO：188，SEQIDNO：189，SEQIDNO：190，SEQIDNO：191，SEQIDNO：192，SEQIDNO：193，SEQIDNO：194，SEQIDNO：195，SEQIDNO：196，SEQIDNO：197，SEQIDNO：198，SEQIDNO：199，SEQIDNO：200，SEQIDNO：201，SEQIDNO：202，SEQIDNO：203，SEQIDNO：204，SEQIDNO：205，SEQIDNO：206，SEQIDNO：207，SEQIDNO：208，SEQIDNO：209，SEQIDNO：210，SEQIDNO：211，SEQIDNO：212，SEQIDNO：213，SEQIDNO：214，SEQIDNO：215，SEQIDNO：216，SEQIDNO：217，SEQIDNO：218，SEQIDNO：219，SEQIDNO：220，SEQIDNO：221，SEQIDNO：222，SEQIDNO：223，SEQIDNO：224，SEQIDNO：225，SEQIDNO：226，SEQIDNO：227，SEQIDNO：228，SEQIDNO：229，SEQIDNO：230，SEQIDNO：231，SEQIDNO：232，SEQIDNO：233，SEQIDNO：234，SEQIDNO：235，SEQIDNO：236，SEQIDNO：237，SEQIDNO：238，SEQIDNO：239，SEQIDNO：240，SEQIDNO：241，SEQIDNO：242，SEQIDNO：243，SEQIDNO：244，SEQIDNO：245，SEQIDNO：246，SEQIDNO：247，SEQIDNO：248，SEQIDNO：249，SEQIDNO：250，SEQIDNO：251，SEQIDNO：252，SEQIDNO：253，SEQIDNO：254，SEQIDNO：255，SEQIDNO：256，SEQIDNO：257，SEQIDNO：258，SEQIDNO：259，SEQIDNO：260，SEQIDNO：261，SEQIDNO：262，SEQIDNO：263，SEQIDNO：264，SEQIDNO：265，SEQIDNO：266，SEQIDNO：267，SEQIDNO：268，SEQIDNO：269，SEQIDNO：270，SEQIDNO：271，SEQIDNO：272，SEQIDNO：273，SEQIDNO：274，SEQIDNO：275，SEQIDNO：276，SEQIDNO：277，SEQIDNO：278，SEQIDNO：279，SEQIDNO：280，SEQIDNO：281，SEQIDNO：282，SEQIDNO：283，SEQIDNO：284，SEQIDNO：285，SEQIDNO：286，SEQIDNO：287，SEQIDNO：288，SEQIDNO：289，SEQIDNO：290，SEQIDNO：291，SEQIDNO：292，SEQIDNO：293，SEQIDNO：294，SEQIDNO：295，SEQIDNO：296，SEQIDNO：297，SEQIDNO：298，SEQIDNO：299，SEQIDNO：300，SEQIDNO：301，SEQIDNO：302，SEQIDNO：303，SEQIDNO：304，SEQIDNO：305，SEQIDNO：306，SEQIDNO：307，SEQIDNO：308，SEQIDNO：309，SEQIDNO：310，SEQIDNO：311，SEQIDNO：312，SEQIDNO：313，SEQIDNO：314，SEQIDNO：315，SEQIDNO：316，SEQIDNO：317，SEQIDNO：318，SEQIDNO：319，SEQIDNO：320，SEQIDNO：321SEQIDNO：322，SEQIDNO：323，SEQIDNO：324，SEQIDNO：325，SEQIDNO：326，SEQIDNO：327，SEQIDNO：328，SEQIDNO：329，SEQIDNO：330，SEQIDNO：331，SEQIDNO：332，SEQIDNO：333，SEQIDNO：334，SEQIDNO：335，SEQIDNO：336，SEQIDNO：337，SEQIDNO：338，SEQIDNO：339，SEQIDNO：340，SEQIDNO：341，SEQIDNO：342，SEQIDNO：343，SEQIDNO：344，SEQIDNO：345，SEQIDNO：346，SEQIDNO：347，SEQIDNO：348，SEQIDNO：349，SEQIDNO：350，SEQIDNO：351，SEQIDNO：352，SEQIDNO：353，SEQIDNO：354，SEQIDNO：355，SEQIDNO：356，SEQIDNO：357，SEQIDNO：358，SEQIDNO：359，SEQIDNO：360，SEQIDNO：361SEQIDNO：362，SEQIDNO：363，SEQIDNO：364，SEQIDNO：365，SEQIDNO：366，SEQIDNO：367，SEQIDNO：368，SEQIDNO：369，SEQIDNO：370，SEQIDNO：371，SEQIDNO：372，SEQIDNO：373，SEQIDNO：374，SEQIDNO：375，SEQIDNO：376，SEQIDNO：377，SEQIDNO：378，SEQIDNO：379，SEQIDNO：380，SEQIDNO：381，SEQIDNO：382，SEQIDNO：383，SEQIDNO：384，SEQIDNO：385，SEQIDNO：386，SEQIDNO：387，SEQIDNO：388，SEQIDNO：389，SEQIDNO：390，SEQIDNO：391，SEQIDNO：392，SEQIDNO：393，SEQIDNO：394，SEQIDNO：395，SEQIDNO：396，SEQIDNO：397，SEQIDNO：398，SEQIDNO：399SEQIDNO：400，SEQIDNO：401，SEQIDNO：402，SEQIDNO：403，SEQIDNO：404，SEQIDNO：405，SEQIDNO：406，SEQIDNO：407，SEQIDNO：408，SEQIDNO：409，SEQIDNO：410，SEQIDNO：411，SEQIDNO：412，SEQIDNO：413，SEQIDNO：414，SEQIDNO：415，SEQIDNO：416，SEQIDNO：417，SEQIDNO：418，SEQIDNO：419，SEQIDNO：420，SEQIDNO：421，，SEQIDNO：422，SEQIDNO：423，SEQIDNO：424，SEQIDNO：425，SEQIDNO：426，SEQIDNO：427，SEQIDNO：428，SEQIDNO：429，SEQIDNO：430，SEQIDNO：431，SEQIDNO：432，SEQIDNO：433，SEQIDNO：434，SEQIDNO：435，SEQIDNO：436，SEQIDNO：437，SEQIDNO：438，SEQIDNO：439，SEQIDNO：440，SEQIDNO：441，SEQIDNO：442，SEQIDNO：443，SEQIDNO：444，SEQIDNO：445，SEQIDNO：446，SEQIDNO：447，SEQIDNO：448，SEQIDNO：449，SEQIDNO：450，SEQIDNO：451，SEQIDNO：452，SEQIDNO：453，SEQIDNO：454，SEQIDNO：455，SEQIDNO：456，SEQIDNO：457，SEQIDNO：458，SEQIDNO：459，SEQIDNO：460，SEQIDNO：461，SEQIDNO：462，SEQIDNO：463，SEQIDNO：464，SEQIDNO：465，SEQIDNO：466，SEQIDNO：467，SEQIDNO：468，SEQIDNO：469，SEQIDNO：470，SEQIDNO：471，SEQIDNO：472，SEQIDNO：473，SEQIDNO：474，SEQIDNO：475，SEQIDNO：476，SEQIDNO：477，SEQIDNO：478，SEQIDNO：479，SEQIDNO：480，SEQIDNO：481，SEQIDNO：482，SEQIDNO：483，SEQIDNO：484，SEQIDNO：485，SEQIDNO：486，SEQIDNO：487，SEQIDNO：488，SEQIDNO：489，SEQIDNO：490，SEQIDNO：491，SEQIDNO：492，SEQIDNO：493，SEQIDNO：494SEQIDNO：495，SEQIDNO：496，SEQIDNO：497，，SEQIDNO：498，SEQIDNO：499，SEQIDNO：500，SEQIDNO：501，SEQIDNO：502，SEQIDNO：503，SEQIDNO：504，SEQIDNO：505，SEQIDNO：506，SEQIDNO：507，SEQIDNO：508，SEQIDNO：509，SEQIDNO：510，SEQIDNO：511，SEQIDNO：512，SEQIDNO：513，SEQIDNO：514，SEQIDNO：515，SEQIDNO：516，SEQIDNO：517，SEQIDNO：518，SEQIDNO：519，SEQIDNO：520，SEQIDNO：521，SEQIDNO：522，SEQIDNO：523，SEQIDNO：524，SEQIDNO：525，SEQIDNO：526，SEQIDNO：527，SEQIDNO：528，SEQIDNO：529，SEQIDNO：530，SEQIDNO：531，SEQIDNO：532，SEQIDNO：533，SEQIDNO：534，SEQIDNO：535，SEQIDNO：536，SEQIDNO：537，SEQIDNO：538，SEQIDNO：539，SEQIDNO：540，SEQIDNO：541，SEQIDNO：542，SEQIDNO：543，SEQIDNO：544，SEQIDNO：545，SEQIDNO：546，SEQIDNO：547，SEQIDNO：548，SEQIDNO：549，SEQIDNO：550，SEQIDNO：551SEQIDNO：552，SEQIDNO：553，SEQIDNO：554，SEQIDNO：555，SEQIDNO：556，SEQIDNO：557，SEQIDNO：558，SEQIDNO：559，SEQIDNO：560，SEQIDNO：561，SEQIDNO：562，SEQIDNO：563，SEQIDNO：564，SEQIDNO：565SEQIDNO：566，SEQIDNO：567，SEQIDNO：568，SEQIDNO：569，SEQIDNO：570，SEQIDNO：571，SEQIDNO：572，SEQIDNO：573，SEQIDNO：574，SEQIDNO：575，SEQIDNO：576，SEQIDNO：577，SEQIDNO：578，SEQIDNO：579，SEQIDNO：580，SEQIDNO：581，SEQIDNO：582，SEQIDNO：583，SEQIDNO：584SEQIDNO：585，SEQIDNO：586，SEQIDNO：567，SEQIDNO：588，SEQIDNO：589，SEQIDNO：590，SEQIDNO：591，SEQIDNO：592，SEQIDNO：593，SEQIDNO：594，SEQIDNO：595，SEQIDNO：596，SEQIDNO：597，SEQIDNO：598，SEQIDNO：599，SEQIDNO：600，SEQIDNO：601，SEQIDNO：602，SEQIDNO：603，SEQIDNO：604，SEQIDNO：605，SEQIDNO：606，SEQIDNO：607，SEQIDNO：608，SEQIDNO：609，SEQIDNO：610，SEQIDNO：611，SEQIDNO：612，SEQIDNO：613，SEQIDNO：614，SEQIDNO：615，SEQIDNO：616，SEQIDNO：617，SEQIDNO：618，SEQIDNO：619，SEQIDNO：620，SEQIDNO：621SEQIDNO：622SEQIDNO：623，SEQIDNO：624，SEQIDNO：625，SEQIDNO：626，SEQIDNO：627，SEQIDNO：628，SEQIDNO：629，SEQIDNO：630，SEQIDNO：631，SEQIDNO：632，SEQIDNO：633，SEQIDNO：634，SEQIDNO：635，SEQIDNO：636，SEQIDNO：637，SEQIDNO：638，SEQIDNO：639，SEQIDNO：640，SEQIDNO：641，SEQIDNO：642，SEQIDNO：643，SEQIDNO：644，SEQIDNO：645，SEQIDNO：646，SEQIDNO：647，SEQIDNO：648，SEQIDNO：649，SEQIDNO：650，SEQIDNO：651，SEQIDNO：652，SEQIDNO：653，SEQIDNO：654，SEQIDNO：655，SEQIDNO：656，SEQIDNO：657，SEQIDNO：658，SEQIDNO：659，SEQIDNO：660，SEQIDNO：661，SEQIDNO：662，SEQIDNO：663，SEQIDNO：664，SEQIDNO：665，SEQIDNO：666，SEQIDNO：667，SEQIDNO：668，SEQIDNO：669，SEQIDNO：670，SEQIDNO：671，SEQIDNO：672，SEQIDNO：673，SEQIDNO：674，SEQIDNO：675，SEQIDNO：676，SEQIDNO：677，SEQIDNO：678，SEQIDNO：679SEQIDNO：680，SEQIDNO：681，SEQIDNO：682，SEQIDNO：683，SEQIDNO：684，SEQIDNO：685，SEQIDNO：686，SEQIDNO：687，SEQIDNO：688，SEQIDNO：689，SEQIDNO：690，SEQIDNO：691，SEQIDNO：692，SEQIDNO：693，SEQIDNO：694，SEQIDNO：695，SEQIDNO：696，SEQIDNO：697，SEQIDNO：698SEQIDNO：699，SEQIDNO：700，SEQIDNO：701，SEQIDNO：702，SEQIDNO：703，SEQIDNO：704，SEQIDNO：705，SEQIDNO：706，SEQIDNO：707，SEQIDNO：708，SEQIDNO：709，SEQIDNO：710，SEQIDNO：711，SEQIDNO：712，SEQIDNO：713，SEQIDNO：714，SEQIDNO：715，SEQIDNO：716，SEQIDNO：717，SEQIDNO：718，SEQIDNO：719，SEQIDNO：720，SEQIDNO：721，SEQIDNO：722，SEQIDNO：723，SEQIDNO：724，SEQIDNO：725，SEQIDNO：726，SEQIDNO：727，SEQIDNO：728，SEQIDNO：729，SEQIDNO：730，SEQIDNO：731，SEQIDNO：732，SEQIDNO：733，SEQIDNO：734，SEQIDNO：735，SEQIDNO：736，SEQIDNO：737，SEQIDNO：738，SEQIDNO：739，SEQIDNO：740，SEQIDNO：741，SEQIDNO：742，SEQIDNO：743，SEQIDNO：744，SEQIDNO：745，SEQIDNO：746，SEQIDNO：747，SEQIDNO：748，SEQIDNO：749，SEQIDNO：750，SEQIDNO：751，SEQIDNO：752，SEQIDNO：753，SEQIDNO：754，SEQIDNO：755，SEQIDNO：756，SEQIDNO：757，SEQIDNO：758，SEQIDNO：759，SEQIDNO：760，SEQIDNO：761，SEQIDNO：762，SEQIDNO：763，SEQIDNO：764，SEQIDNO：765SEQIDNO：766，SEQIDNO：767，SEQIDNO：768，SEQIDNO：769，SEQIDNO：770，SEQIDNO：771，SEQIDNO：772，SEQIDNO：773，SEQIDNO：774，SEQIDNO：775，SEQIDNO：776，SEQIDNO：777，SEQIDNO：778，SEQIDNO：779，SEQIDNO：780，SEQIDNO：781，SEQIDNO：782，SEQIDNO：783，SEQIDNO：784SEQIDNO：785，SEQIDNO：786，SEQIDNO：787，SEQIDNO：788，SEQIDNO：789，SEQIDNO：790，SEQIDNO：791，SEQIDNO：792，SEQIDNO：793，SEQIDNO：794，SEQIDNO：795，SEQIDNO：796，SEQIDNO：797，SEQIDNO：798，SEQIDNO：799，SEQIDNO：800，SEQIDNO：801，SEQIDNO：802，SEQIDNO：803，SEQIDNO：804，SEQIDNO：805，SEQIDNO：806，SEQIDNO：807，SEQIDNO：808，SEQIDNO：809，SEQIDNO：810，SEQIDNO：811，SEQIDNO：812，SEQIDNO：813，SEQIDNO：814，SEQIDNO：815，SEQIDNO：816，SEQIDNO：817，SEQIDNO：818，SEQIDNO：819，SEQIDNO：820，SEQIDNO：821，SEQIDNO：822，SEQIDNO：823，SEQIDNO：824，SEQIDNO：825，SEQIDNO：826，SEQIDNO：827，SEQIDNO：828，SEQIDNO：829，SEQIDNO：830，SEQIDNO：831，SEQIDNO：832，SEQIDNO：833，SEQIDNO：834，SEQIDNO：835，SEQIDNO：836，SEQIDNO：837，SEQIDNO：838，SEQIDNO：839，SEQIDNO：840，SEQIDNO：841，SEQIDNO：842，SEQIDNO：843，SEQIDNO：844，SEQIDNO：845，SEQIDNO：846，SEQIDNO：847，SEQIDNO：848，SEQIDNO：849，SEQIDNO：850，SEQIDNO：851，SEQIDNO：852，SEQIDNO：853，SEQIDNO：854，SEQIDNO：855，SEQIDNO：856，SEQIDNO：857，SEQIDNO：858，SEQIDNO：859，SEQIDNO：860SEQIDNO：861，SEQIDNO：862，SEQIDNO：863，SEQIDNO：864，SEQIDNO：865，SEQIDNO：866，SEQIDNO：867，SEQIDNO：868，SEQIDNO：869，SEQIDNO：870，SEQIDNO：871，SEQIDNO：872，SEQIDNO：873，SEQIDNO：874，SEQIDNO：875，SEQIDNO：876，SEQIDNO：877，SEQIDNO：878，SEQIDNO：879SEQIDNO：880，SEQIDNO：881，SEQIDNO：882，SEQIDNO：883，SEQIDNO：884，SEQIDNO：885，SEQIDNO：886，SEQIDNO：887，SEQIDNO：888，SEQIDNO：889，SEQIDNO：890，SEQIDNO：891SEQIDNO：892，SEQIDNO：893SEQIDNO：894，SEQIDNO：895，SEQIDNO：896，SEQIDNO：897，SEQIDNO：898，SEQIDNO：899，，SEQIDNO：900，SEQIDNO：901，SEQIDNO：902，SEQIDNO：903，SEQIDNO：904，SEQIDNO：905，SEQIDNO：906，SEQIDNO：907，SEQIDNO：908，SEQIDNO：909，SEQIDNO：910，SEQIDNO：911，SEQIDNO：912，SEQIDNO：913，SEQIDNO：914，SEQIDNO：915，SEQIDNO：916，SEQIDNO：917，SEQIDNO：918，SEQIDNO：919，SEQIDNO：920，SEQIDNO：921，SEQIDNO：922，SEQIDNO：923，SEQIDNO：924，SEQIDNO：925，SEQIDNO：926，SEQIDNO：927，SEQIDNO：928，SEQIDNO：929，SEQIDNO：930，SEQIDNO：931，SEQIDNO：932，SEQIDNO：933，SEQIDNO：934，SEQIDNO：935，SEQIDNO：936，SEQIDNO：937，SEQIDNO：935，SEQIDNO：939，SEQIDNO：940，SEQIDNO：941，SEQIDNO：942，SEQIDNO：943，SEQIDNO：944，SEQIDNO：945，SEQIDNO：946，SEQIDNO：947，SEQIDNO：948，SEQIDNO：949，SEQIDNO：950，SEQIDNO：951，SEQIDNO：952，SEQIDNO：953，SEQIDNO：954，SEQIDNO：955，SEQIDNO：956，SEQIDNO：957，SEQIDNO：958，SEQIDNO：959，SEQIDNO：960，SEQIDNO：961，SEQIDNO：962，SEQIDNO：963，SEQIDNO：964，SEQIDNO：965，SEQIDNO：968，SEQIDNO：967，SEQIDNO：968，SEQIDNO：969，SEQIDNO：970，SEQIDNO：971，SEQIDNO：972，SEQIDNO：973，SEQIDNO：974，SEQIDNO：975，SEQIDNO：976，SEQIDNO：977，SEQIDNO：978，SEQIDNO：979，SEQIDNO：980，SEQIDNO：981，SEQIDNO：982，SEQIDNO：983，SEQIDNO：984，SEQIDNO：985，SEQIDNO：986，SEQIDNO：987，SEQIDNO：988，SEQIDNO：989，SEQIDNO：990，SEQIDNO：991，SEQIDNO：992，SEQIDNO：993，SEQIDNO：994，SEQIDNO：995，SEQIDNO：996，SEQIDNO：997，SEQIDNO：998，SEQIDNO：999，SEQIDNO：1000，SEQIDNO：1001，SEQIDNO：1002，SEQIDNO：1003，SEQIDNO：1004，SEQIDNO：1005，SEQIDNO：1006，SEQIDNO：1007，SEQIDNO：1008，SEQIDNO：1009，SEQIDNO：1010，SEQIDNO：1011，SEQIDNO：1012，SEQIDNO：1013，SEQIDNO：1014，SEQIDNO：1015，SEQIDNO：1016，SEQIDNO：1017，SEQIDNO：1018，SEQIDNO：1019，SEQIDNO：1020，SEQIDNO：1021，SEQIDNO：1022，SEQIDNO：1023，SEQIDNO：1024，SEQIDNO：1025，SEQIDNO：1026，SEQIDNO：1027，SEQIDNO：1028，SEQIDNO：1029，SEQIDNO：1030，SEQIDNO：1031，SEQIDNO：1032，SEQIDNO：1033，SEQIDNO：1034和SEQIDNO：1035。
序列同一性：高水平的序列同一性指示第一序列源于第二序列的可能性。氨基酸序列同一性要求在两个比对序列之间具有同一的氨基酸序列。因此，与参照序列共有70％氨基酸同一性的候选序列要求在比对之后，所述候选序列中70％的氨基酸与所述参照序列中的相应氨基酸是同一的。可借助于计算机分析，如(不限于)ClustalW计算机比对程序(HigginsD.，ThompsonJ.，GibsonT.，ThompsonJ.D.，HigginsD.G.GibsonT.J.，1994.CLUSTALW：improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsRes.22:4673-4680)和其中建议的默认参数来确定同一性。ClustalW软件可自http://www.ebi.ac.uk/clustalw以欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)的ClustalW万维网服务(ClustalWWWWService)形式利用。在它的默认设置下使用这个程序，比对查询和参照多肽的成熟(生物活性)部分。对完全保守残基的数目进行计数，并且除以参照多肽的长度。
ClustalW算法可类似地用于比对核苷酸序列。可以如对于氨基酸序列指示的类似方式计算序列同一性。
受试者：本文使用的术语“受试者”被视为意指可向其施用apoA-I多肽片段或多核苷酸或治疗性细胞或生物相容性胶囊的任何哺乳动物。特定旨在用本发明方法治疗的受试者包括人以及非人灵长类动物、绵羊、马、牛、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠、以及由这些宿主获得或来源于这些宿主的器官、肿瘤和细胞。
转化：如本文所用的术语转化是指将外源性多核苷酸(即“转基因”)插入宿主细胞中。外源性多核苷酸整合在宿主基因组内。
药物制剂：术语“药物制剂”或“药物”或“医药”是指根据本发明的药剂的任何治疗性或防治性用途，所述药剂可用于治疗(包括预防、诊断、减轻或治愈)患者的不适、痛苦、病状、疾病或损伤。治疗适用的遗传决定子、肽、多肽和多核苷酸可包括在术语药物(pharmaceutical)或药物(drug)的含义内。如本文所定义，“治疗剂”、“药物制剂”或“药物”或“医药”是一种类型的生物活性剂。
药物组合物：或药物、医药或药剂是指当向患者适当施用时能够诱导所需治疗作用的任何化学或生物物质、化合物或组合物。一些药物是以在体内转化成具有药物活性的代谢物的非活性形式销售。出于本发明的目的，术语“药物组合物”和“医药”优选涵盖活性剂本身或非活性药物和活性代谢物。
变体：如本文所用的术语“变体”是指氨基酸序列变体，所述变体优选与预定序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少60％同一性，例如至少63％同一性，如至少66％同一性，例如至少70％序列同一性，例如至少72％序列同一性，例如至少75％序列同一性，例如至少80％序列同一性，如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，例如99％序列同一性。
载体：如本文所用的术语“载体”是指能够转运已与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将其它DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最通常使用的载体形式。然而，本发明旨在包括发挥等效功能的此类其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
II.适应症和治疗
代谢疾病
本发明者已惊人地发现apoA-I的C末端氨基酸序列在亲水性溶质中是物理稳定分子，同时保留葡萄糖摄取性质。对于在本领域中工作的人士来说，预期当将目前具有活性的肽进一步截短成包括医学作用的较短肽时，物理稳定性也将被保持。
因此，本发明者已发现源于apoA-I的C末端的肽能够诱导细胞中的葡萄糖摄取，并且因此对血糖水平具有有益作用。因此，此类肽对血浆葡萄糖清除具有影响，并且适用于治疗特征在于血液中的葡萄糖水平增加的疾病。
这个研究结果的治疗影响是肽适用于治疗代谢疾病，或适用于防治性治疗面临患上代谢疾病的风险的哺乳动物。
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度，并且其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸
其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取，并且其中所述多肽具有小于200个氨基酸，优选小于190个氨基酸，更优选小于180个氨基酸，更优选小于170个氨基酸，更优选小于160个氨基酸，更优选小于150个氨基酸，更优选小于140个氨基酸，更优选小于130个氨基酸，更优选小于120个氨基酸，更优选小于110个氨基酸，更优选小于100个氨基酸，更优选小于90个氨基酸，更优选小于80个氨基酸，更优选小于70个氨基酸，更优选小于75个氨基酸，更优选小于70个氨基酸，更优选小于65个氨基酸，更优选小于60个氨基酸，更优选小于55个氨基酸的长度。
在一个方面，本发明涉及选自由以下组成的组的药剂的用途：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的核酸分子的载体，
d)用b)的核酸或c)的载体转化或转导的分离的宿主细胞，
所述药剂用于制备用于治疗和/或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的医药。
在一个方面，本发明涉及一种治疗特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的选自由以下组成的组的药剂：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的核酸分子的载体，
d)用b)的核酸或c)的载体转化或转导的分离的宿主细胞。
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度。
序列变体可为任何生物活性变体，其中生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。优选地，变体是SEQIDNO:1的序列变体，其中SEQIDNO:1的任何氨基酸残基已改变成另一氨基酸残基，前提是相对于所述SEQIDNO:1，至多15个氨基酸已如此改变，如其中至多14个氨基酸已如此改变，例如其中至多13个氨基酸已如此改变，如其中至多12个氨基酸已如此改变，例如其中至多11个氨基酸已如此改变，如其中至多10个氨基酸已如此改变，例如其中至多9个氨基酸已如此改变，如其中至多8个氨基酸已如此改变，例如其中至多7个氨基酸已如此改变，如其中至多6个氨基酸已如此改变，例如其中至多5个氨基酸已如此改变，如其中至多4个氨基酸已如此改变，例如其中至多3个氨基酸已如此改变，如其中至多2个氨基酸已如此改变，例如其中至多1个氨基酸已如此改变。
在一个实施方案中，本发明的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少60％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少75％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少80％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少85％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有90％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少95％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少98％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少99％序列同一性。
在另一实施方案中，本发明的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少60％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少70％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少75％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少80％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少85％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有90％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有至少98％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。
在一个实施方案中，供如本文所定义使用的多肽基本上由本文定义的任一氨基酸序列组成，如基本上由SEQIDNO:1至1035中的任一个组成。
在一个实施方案中，供如本文所定义使用的多肽由本文定义的任一氨基酸序列组成，如由SEQIDNO:1至1035中的任一个组成。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽是变体多肽，其中在所述变体中，任何氨基酸已被改变来提供相对于氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的取代。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽在位置Ala1、Glu2、Tyr3、His4、Ala5、Lys6、Ala7、Glu9、Leu11、Leu14、Glu16、Lys17、Pro20、Leu22、Glu23、Asp24、Leu25、Arg26、Leu29、Pro31、Glu34、Lys37、Glu45、Glu46、Lys49、Lys50、Leu51、Gln54处包含相对于氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的氨基酸残基。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽在位置Glu2、Tyr3、Leu11、Leu14、Glu16、Lys17、Pro20、Asp24、Leu29、Pro31、Glu34、Lys37、Glu45处包含相对于氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的氨基酸残基。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽不是全长前-原-apoA-I。
在另一实施方案中，根据本发明的多肽不是全长原-apoA-I。
在另一实施方案中，根据本发明的多肽不是全长成熟apoA-I。
应了解展现本发明的生物活性的多肽是如本文定义的源于人apoA-I的C末端结构域(即AA190-243)的肽(如SEQIDNO:1)或其片段或变体。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽不是融合蛋白的一部分，即在所述实施方案中，本发明的多肽不通过肽键或通过肽接头连接于另一治疗活性多肽，如胰岛素或GLP-1。
本发明的肽适用于治疗与血液中的高葡萄糖水平直接或间接相关的任何疾病。本领域技术人员了解哪些疾病可通过降低血液和/或血浆葡萄糖水平来治疗或预防。在一个实施方案中，特征在于高血糖症的疾病是代谢疾病。
非胰岛素依赖性糖尿病(包括成年期发作型、成熟期发作型、非酮症性、稳定性、II型和年轻人的非胰岛素依赖性糖尿病)的特征在于血糖水平升高和胰岛素的靶标组织(肝、肌肉和脂肪组织)中的胰岛素抗性。非胰岛素依赖性糖尿病可通过施用本发明的apoA-I肽来治疗，因为所述肽改善血糖清除，并且潜在改善胰岛素的靶标组织中的胰岛素敏感性，此抑制非胰岛素依赖性糖尿病的病因(Turner等(1999)JAMA281(21):2005-2012；Nathan等(2002)NEnglJMed347:1342-1349；Kadoglou等(2007)30(9):2242-2244)。
因此，在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病选自由内分泌和代谢疾病以及肥胖症组成的组。这组疾病尤其包括非胰岛素依赖性糖尿病，如成年期发作型、成熟期发作型、非酮症性、稳定性、II型和年轻人的非胰岛素依赖性糖尿病。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病，其中所述疾病是葡萄糖耐受性测试异常，包括化学性和隐性糖尿病；葡萄糖耐受性受损；和/或糖尿病前期。
因此，在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是II型糖尿病和/或胰岛素抗性。
如本文(例如图10)所证明，本发明导致葡萄糖清除增加。因此，本发明适用作糖尿病常规治疗的补充或替代。在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是I型糖尿病。
肥胖症(包括归因于过度摄入卡路里的肥胖症)定义为脂肪组织以它负面影响健康的程度的异常累积，并且是许多慢性疾病，包括糖尿病和心血管疾病的主要风险因素。所述病状最通常是由于卡路里摄入增加和缺乏锻炼。肥胖症可通过施用本发明的apoA-I肽来治疗，因为所述肽导致胰岛素敏感性改善，并且也可导致体重减轻，此通过降低与早期死亡相关的代谢综合征和糖尿病的风险来抑制肥胖症的病因(Golay等(2007)PhysiolRev.87(2):507-20)。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是肥胖症，例如归因于过度摄入卡路里，如过度摄入食物的肥胖症。
缩写为PCOS的多囊卵巢综合征(包括硬囊卵巢综合征和斯坦-利文撒尔综合征(Stein-Leventhalsyndrome))是女性中的一种最常见的内分泌病症。病因被假定为是遗传性的，但共同症状是在卵巢中存在许多小囊肿，雄性激素水平较高以及月经不规则。PCOS的症状可通过施用本发明的apoA-I肽来改善，因为所述肽改善葡萄糖清除以及由此改善胰岛素敏感性，并且可潜在改善高雄性激素血症，逆转与PCOS相关的月经异常和慢性无排卵(Moghetti等(2000)JClinEndocrinolMetab.85(1):139-46)
因此，在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由多囊卵巢综合征，如硬囊卵巢综合征和斯坦-利文撒尔综合征组成的组的内分泌和代谢疾病。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的代谢疾病：代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受性、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常和多囊性卵巢综合征。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是由胰岛素抗性引起的代谢疾病，其中所述疾病选自肝中的胰岛素抗性、骨骼肌中的胰岛素抗性和/或脂肪组织中的胰岛素抗性的组。
在一个实施方案中，本发明的肽用于治疗和/或防治代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受性、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常和多囊性卵巢综合征。本发明的多肽的治疗作用切合用于治疗骨骼肌中的疾病相关的胰岛素抗性，而且也切合用于治疗肝中的胰岛素抗性或脂肪组织中的胰岛素抗性。
除源于apoA-I的C末端结构域的肽之外，本发明也涉及编码SEQIDNO:1的生物活性多肽、变体和片段中的任一个的多核苷酸的医学用途。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含在表达后编码如本文定义的多肽的核酸序列。
在另一方面，本发明也涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的载体，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含在表达后编码如本文定义的多肽的核酸序列。在一个实施方案中，载体还包含可操作地连接于多核苷酸的启动子。
载体可为适于表达本发明的多肽的任何载体，并且载体可因此由本领域技术人员选择。在一个实施方案中，载体选自由以下组成的组：α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒和Mo-MLV，优选是腺相关病毒。
在另一方面，本发明也涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的宿主细胞，其中用如本文定义的多核苷酸和/或载体转化或转导所述细胞。细胞可为适于容纳本发明的多核苷酸或载体的任何宿主细胞。优选地，细胞是人细胞。
在一个实施方案中，细胞选自由以下组成的组：干细胞、肌肉细胞、肝细胞、脂肪细胞和胰腺细胞，如α细胞、β细胞和δ细胞。
在另一实施方案中，细胞选自由以下组成的组：CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、HiB5、RN33b和BHK细胞。
在一个方面，本发明涉及选自由以下组成的组的药剂的用途：
a)如本文定义的分离的多肽；
b)如本文定义的分离的多核苷酸；
c)如本文定义的载体；和/或
d)如本文定义的分离的细胞，
所述药剂用于制备用于治疗和/或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的医药。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病。
在另一实施方案中，根据本发明的多肽也用于治疗特征在于高胰岛素血症的疾病。
心血管疾病
与高血糖症直接或间接相关的其它病状是各种心血管病症。通过降低循环血糖的浓度，心脏和血管的病理机制可得以阻止和/或抑制。
因此，在另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防由高血糖症所致的心血管疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；以及
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度，并且其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防心血管疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；以及
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取，并且其中所述多肽具有小于100个氨基酸，优选小于100个氨基酸，更优选小于90个氨基酸，更优选小于80个氨基酸，更优选小于70个氨基酸，更优选小于75个氨基酸，更优选小于70个氨基酸，更优选小于65个氨基酸，更优选小于60个氨基酸，更优选小于55个氨基酸的长度。
在一个方面，本发明涉及一种治疗特征在于高血糖症或由高血糖症所致的心血管疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的选自由以下组成的组的药剂：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的核酸分子的载体，
d)用b)的核酸或c)的载体转化或转导的分离的宿主细胞。
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或高胰岛素血症或由高血糖症和/或高胰岛素血症所致的心血管疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度。
序列变体可为任何生物活性变体，其中生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。优选地，变体是SEQIDNO:1的序列变体，其中SEQIDNO:1的任何氨基酸残基已改变成另一氨基酸残基，前提是相对于所述SEQIDNO:1，至多15个氨基酸已如此改变，如其中至多14个氨基酸已如此改变，例如其中至多13个氨基酸已如此改变，如其中至多12个氨基酸已如此改变，例如其中至多11个氨基酸已如此改变，如其中至多10个氨基酸已如此改变，例如其中至多9个氨基酸已如此改变，如其中至多8个氨基酸已如此改变，例如其中至多7个氨基酸已如此改变，如其中至多6个氨基酸已如此改变，例如其中至多5个氨基酸已如此改变，如其中至多4个氨基酸已如此改变，例如其中至多3个氨基酸已如此改变，如其中至多2个氨基酸已如此改变，例如其中至多1个氨基酸已如此改变。
在一个实施方案中，本发明的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少60％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少75％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少80％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少85％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有90％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少95％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少98％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少99％序列同一性。
在另一实施方案中，在一个实施方案中，本发明的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少60％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少70％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少75％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少80％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个具有至少85％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有90％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有至少98％序列同一性，更优选与氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的任一个的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。
在一个实施方案中，供如本文所定义使用的多肽基本上由本文定义的任一氨基酸序列组成，如基本上由SEQIDNO:1至1035中的任一个组成。
在一个实施方案中，供如本文所定义使用的多肽由本文定义的任一氨基酸序列组成，如由SEQIDNO:1至1035中的任一个组成。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽是变体多肽，其中在所述变体中，任何氨基酸已被改变来提供相对于氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的取代。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽在位置Ala1、Glu2、Tyr3、His4、Ala5、Lys6、Ala7、Glu9、Leu11、Leu14、Glu16、Lys17、Pro20、Leu22、Glu23、Asp24、Leu25、Arg26、Leu29、Pro31、Glu34、Lys37、Glu45、Glu46、Lys49、Lys50、Leu51、Gln54处包含相对于氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的氨基酸残基。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽在位置Glu2、Tyr3、Leu11、Leu14、Glu16、Lys17、Pro20、Asp24、Leu29、Pro31、Glu34、Lys37、Glu45处包含相对于氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的氨基酸残基。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽不是全长前-原-apoA-I。在另一实施方案中，根据本发明的多肽不是全长原-apoA-I。在另一实施方案中，根据本发明的多肽不是全长成熟apoA-I。
应了解展现本发明的生物活性的多肽是如本文定义的源于人apoA-I的C末端结构域(即AA190-243)的肽(如SEQIDNO:1)或其片段或变体。
高脂血症涵盖血脂水平升高的若干病状(主要涉及胆固醇升高“高胆固醇血症”或甘油三酯升高“高甘油三酯血症”或两者组合)。高脂血症可通过施用本发明的apoA-I肽来治疗，因为所述肽改善血糖控制，抑制脂解，并且由此降低自肝产生的LDL胆固醇，此抑制高脂血症的病因(Solano等(2006)CardiolRev.14(3):125-35；Klop等(2013)Nutrients5:1218-1240)。因此，本发明适用于治疗以下适应症。
此外，可通过调控葡萄糖水平来通过本发明治疗的疾病包括单纯性高胆固醇血症(包括家族性高胆固醇血症、IIa型弗雷德里克森(Fredrickson)高脂蛋白血症、高β脂蛋白血症、A组高脂血症、低密度脂蛋白型[LDL]高脂蛋白血症)；单纯性高甘油三酯血症(包括内源性高甘油三酯血症、IV型弗雷德里克森高脂蛋白血症、高脂血症、B组高前β脂蛋白血症、极低密度脂蛋白型[VLDL]高脂蛋白血症)；混合型高脂血症(包括宽β脂蛋白血症或漂浮β脂蛋白血症、IIb或III型弗雷德里克森高脂蛋白血症、高β脂蛋白血症伴有前β脂蛋白血症、高胆固醇血症伴有内源性高甘油三酯血症、C组高脂血症、结节发疹性黄瘤、结节性黄瘤)；高乳糜微粒血症(包括I或V型弗雷德里克森高脂蛋白血症、D组高脂血症、混合型高甘油三酯血症)；和其它高脂血症(包括家族性复合型高脂血症脂蛋白缺乏症(包括无β脂蛋白血症、高密度脂蛋白缺乏症、低α脂蛋白血症、低β脂蛋白血症(家族性)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症、丹吉尔氏病(Tangier’sdisease))。
在一个实施方案中，具有SEQIDNO:1至1035中的任一个的多肽不用于治疗高脂血症或高胆固醇血症。
在另一实施方案中，然而，具有SEQIDNO:1至1035中的任一个的多肽用于治疗除高脂血症或高胆固醇血症以外的心血管病。
包括化学性和隐性糖尿病、葡萄糖耐受性受损和糖尿病前期的葡萄糖耐受性测试异常涉及在不干预下将发展成2型糖尿病的血糖水平升高。包括健康食物和增加身体活动的生活方式变化可潜在恢复正常血糖水平。
葡萄糖耐受性受损和糖尿病前期可通过施用本发明的apoA-I肽来逆转，因为所述肽导致葡萄糖代谢改善，这抑制葡萄糖耐受性受损和糖尿病前期的病因。在早期阶段恢复葡萄糖代谢合乎防止进展成与心血管疾病增加相关的显性2型糖尿病的需要(Nichols等(2007)DiabetesCare30(2):228-233)。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗选自由以下组成的组的疾病：脂蛋白代谢病症和其它脂质血症；血液测定结果异常；动脉、小动脉和毛细血管疾病；缺血性和其它心脏疾病。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是脂蛋白代谢病症和其它脂质血症，如选自由以下组成的组的脂蛋白代谢病症和其它脂质血症：单纯性高胆固醇血症，如家族性高胆固醇血症；IIa型弗雷德里克森高脂蛋白血症；高β脂蛋白血症；A组高脂血症；和低密度脂蛋白型[LDL]高脂蛋白血症。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的脂蛋白代谢病症和其它脂质血症：单纯性高甘油三酯血症，包括内源性高甘油三酯血症；IV型弗雷德里克森高脂蛋白血症；B组高脂血症；高前β脂蛋白血症；和极低密度脂蛋白型[VLDL]高脂蛋白血症。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的脂蛋白代谢病症和其它脂质血症：混合型高脂血症，如宽β脂蛋白血症或漂浮β脂蛋白血症；IIb或III型弗雷德里克森高脂蛋白血症；高β脂蛋白血症伴有前β脂蛋白血症；高胆固醇血症伴有内源性高甘油三酯血症；C组高脂血症；结节发疹性黄瘤；和结节性黄瘤。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的脂蛋白代谢病症和其它脂质血症：高乳糜微粒血症，如I或V型弗雷德里克森高脂蛋白血症；D组高脂血症；和混合型高甘油三酯血症。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的脂蛋白代谢病症和其它脂质血症：其它高脂血症，如家族性复合型高脂血症。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的脂蛋白代谢疾病和其它脂质血症：脂蛋白缺乏症，如无β脂蛋白血症、高密度脂蛋白缺乏症、低α脂蛋白血症；低β脂蛋白血症(家族性)；卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症和丹吉尔氏病。
动脉粥样硬化(包括小动脉硬化、动脉硬化性血管疾病、粉瘤、退化(动脉性、动脉血管性和血管性))和动脉粥样硬化性心脏病(包括冠脉(动脉))是涉及动脉壁增厚以及僵硬和弹性丧失的适应症。动脉粥样硬化，作为动脉硬化的最常见形式，是一种其中由于斑块(由LDL胆固醇和巨噬细胞组成)在动脉壁周围过度积累，动脉变得狭窄和硬化，从而导致严重心血管并发症的病状。动脉粥样硬化可通过施用本发明的apoA-I肽来治疗和/或预防，因为所述肽1)导致葡萄糖水平降低，并且由此降低与动脉粥样硬化相关的一个风险因素；2)施用本发明的apoA-I肽可通过改善HDL水平，并且由此改善自巨噬细胞移除胆固醇，抑制LDL氧化，以及通过限制潜在的炎症性过程来改善动脉粥样硬化；3)施用本发明的apoA-I肽可通过恢复胰岛素水平来改善动脉粥样硬化，所述恢复胰岛素水平将抑制自脂肪组织和富含甘油三酯的脂蛋白粒子的脂解，并且因此降低循环脂肪酸的水平和随后LDL水平，此将降低动脉粥样硬化的进展(Barter(2005)EurHeartJ.7(增刊F):F4-F8；Rader(2002)AmJofCardiology,90(8):62-70)。
因为在一个实施方案中，本发明适用于预防动脉粥样硬化，所以它也适用于预防缺血性和其它心脏疾病，如心绞痛、心肌梗塞、主动脉瓣狭窄和代谢疾病中的心肌病变。代谢性心肌病变通常由能量代谢改变引起。代谢疾病中的心肌病变可通过施用本发明的apoA-I肽来治疗，因为所述肽导致葡萄糖代谢改进，循环脂肪酸降低，LDL胆固醇降低，此改善心肌葡萄糖摄取和糖酵解通量，这抑制与代谢疾病相关的心肌病变的病因(Guertl等(2000)81(6):349-372；Witteles等(2008)JAmCollCardiol.51(2):93-102)；vandeWeijer等(2011)92:10-18)。
因此，在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的动脉、小动脉和毛细血管疾病：动脉粥样硬化，如小动脉硬化；动脉硬化性血管疾病；粉瘤；动脉性退化；动脉血管性退化和血管性退化。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是选自由以下组成的组的动脉、小动脉和毛细血管疾病：动脉粥样硬化性心脏病，如冠脉(动脉)心脏病。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是属于选自由以下组成的组的缺血性和其它心脏疾病群组的疾病：心绞痛、心肌梗塞；主动脉瓣狭窄；和代谢疾病中的心肌病变。
在一个实施方案中，可通过本发明治疗的疾病是特征在于身体组成部分内的脂质水平或含脂质沉积物不正常的心血管疾病。因此，治疗作用也涉及治疗特征在于身体组成部分内的脂质水平或含脂质沉积物不正常的疾病或病状，如急性冠脉综合征、或动脉粥样硬化、或血管中的动脉粥样硬化性斑块、或瓣膜狭窄、或感染性休克、或心绞痛、或心肌梗塞、或不稳定性心绞痛、或动脉狭窄、或外周动脉疾病(PAD)、或颈动脉狭窄、或脑动脉狭窄、或冠状动脉狭窄、或血管性痴呆、或再狭窄、或脆性斑块、或一时性黑蒙(amaurosisfugax)。
III.施用和配制
本发明的ApoA-I源性多肽可以医学上可接受的任何方式施用。这可包括注射，通过胃肠外途径，如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌肉内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内、颅内或其它途径以及经鼻或局部。缓释施用也明确包括在本发明中，通过此类方式作为长效注射剂或可蚀性植入物。
施用根据本发明的apoA-I可使用任何适合递送方式来实现，所述方式包括但不限于皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内注射或向其它适合部位注射；泵(参见例如AnnalsofPharmacotherapy,27:912(1993)；Cancer,41:1270(1993)；CancerResearch,44:1698(1984)，以引用的方式并入本文)、微囊化(参见例如美国专利4,352,883；4,353,888；和5,084,350，以引用的方式并入本文)、缓释聚合物植入物(参见例如Sabel，美国专利4,883,666，以引用的方式并入本文)、囊封和未囊封细胞移植物(参见例如美国专利5,082,670和5,618,531，各自以引用的方式并入本文)；以及吸入。
施用可通过定期推注注射制剂来进行，或可通过自外部(例如静脉内袋)或内部(例如生物可蚀性植入物、生物人工器官或一群产生apoA-I源性肽的植入细胞)储集器静脉内或腹膜内施用来更连续进行。参见例如US4,407,957、5,798,113和5,800,828，各自以引用的方式并入本文。
通过此类方式，局部递送可作为通过导管至一种或多种动脉的递送。另一类型的局部递送包括局部递送通常注射的基因疗法载体。
在本发明的一优选实施方案中，施用是胃肠外注射，优选是静脉内、皮下、肌肉内、颅内或腹膜内注射。尽管本发明化合物有可能以原始化学制剂(例如单独多肽)形式施用，但优选的是以药物制剂形式来呈现它们。药物制剂可通过例如如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy2005,Lippincott,Williams&Wilkins中所述的常规技术来制备。
术语“药学上可接受的载体”意指apoA-I源性肽或多肽与其组合以有助于所述肽或多肽的应用的一种或多种天然或合成的有机或无机成分。适合载体包括无菌盐水，但已知是药学上可接受的其它水性和非水性等渗无菌溶液以及无菌混悬液为本领域普通技术人员所知。
本发明化合物可被配制来供胃肠外施用，并且可以单位剂型提供于任选添加有防腐剂的安瓿、预填充注射器、小体积输注中或多剂量容器中。组合物可采用如于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，例如于水性聚乙二醇中的溶液的形式。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)，并且可含有如防腐剂、湿润剂、乳化剂或混悬剂、稳定剂和/或分散剂的试剂。或者，活性成分可呈用于在使用之前用适合媒介物，例如无菌无热原水重构的粉末形式，其通过无菌分离无菌固体或通过自溶液冻干获得。
“有效量”是指能够改善或延迟患病、退行性或损害状况的进展的量。有效量可以个体为基础来确定，并且将部分地基于对待治疗的症状和寻求的结果的考虑。有效量可由本领域普通技术人员采用此类因素和使用至多常规实验来确定。
脂质体系统可为任何种类的单层囊泡、多层囊泡或稳定的复层囊泡，并且可根据为本领域技术人员所熟知的方法，例如根据美国专利5,169,637、4,762,915、5,000,958或5,185,154的教义制备和施用。此外，可合乎需要的是以脂蛋白形式表达本发明的新型多肽以及其它所选多肽以增强它们与脂质体的结合。例如通过免疫亲和色谱法或任何其它适宜方法从CHO细胞中纯化重组apoA-I源性蛋白，接着与脂质体混合，并且以高效率并入它们之中。可在体外测试脂质体囊封蛋白质对刺激细胞生长的任何影响。
当需要缓释施用释放特征适于治疗要求施用apoA-I多肽的任何疾病或病症的制剂中的apoA-I多肽时，预期使apoA-I源性肽微囊化。已用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MNrgp120成功进行使重组蛋白微囊化用于持续释放。Johnson等,Nat.Med.,2:795-799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993)；Hora等,Bio/Technology,8:755-758(1990)；Cleland,"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,Powell和Newman编,(PlenumPress:NewYork,1995),第439-462页；WO97/03692、WO96/40072、WO96/07399；以及美国专利号5,654,010。
由于聚乳酸共乙醇酸(PLGA)聚合物的生物相容性和广泛范围的生物可降解性质而使用它来开发这些蛋白质的缓释制剂。PLGA的降解产物乳酸和乙醇酸可在人体内被快速清除。此外，视它的分子量和组成而定，这种聚合物的可降解性可自数月至数年加以调整。Lewis,"Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer,"M.Chasin和R.Langer(编),BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker:NewYork,1990),第1-41页。
在本发明的一个实施方案中，涵盖包含apoA-I源性肽或多肽的组合物。所述组合物可包含如本文所述的分离的多肽、如本文所述的分离的核酸、编码如本文所述的apoA-I源性肽的表达载体或表达如本文所述的apoA-I源性肽的细胞系。
在一个实施方案中，本发明涉及一种供根据本发明使用的apoA-I源性肽或多肽，其中所述多肽是经肠、经局部、经胃肠外或作为持续释放植入物的一部分施用或适合于经上述施用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种供根据本发明使用的apoA-I源性肽或多肽，其中胃肠外施用是静脉内、皮下、肌肉内、颅内或腹膜内施用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种供根据本发明使用的apoA-I源性肽或多肽，其中经肠施用是经口服、经直肠或经颊施用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种供根据本发明使用的apoA-I源性肽或多肽，其中局部施用是经真皮、经上皮、经阴道、膀胱内、经肺、鼻内、气管内或以滴眼剂形式施用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种供根据本发明使用的apoA-I源性肽或多肽，其中所述多肽是皮下或静脉内施用或适合于上述施用。
在一个实施方案中，所述施用是每日重复，而在另一实施方案中，所述施用是每周重复至少1-3次，如每周2-5次，如每周3-6次。
在一个方面，本发明涉及一种包含如本文定义的根据本发明的分离的多肽的药物组合物。
在一个实施方案中，药物组合物包含与用于治疗代谢疾病，或用于防治性治疗面临患上代谢疾病的风险的哺乳动物的另一组合物组合的药物成分。
在一个实施方案中，化合物或组合物用于治疗代谢疾病，或用于防治性治疗面临患上代谢疾病的风险的哺乳动物，与选自胰岛素(或胰岛素衍生物)、二甲双胍(metformin)等的组的糖尿病药物组合。
在一个实施方案中，药物组合物还包含用于治疗代谢疾病和/或心血管疾病的第二活性成分。在一个实施方案中，所述第二活性成分是用于治疗代谢疾病，或用于防治性治疗面临患上代谢疾病的风险的哺乳动物的化合物。
在一个实施方案中，所述第二活性成分是用于治疗糖尿病的化合物。在一个实施方案中，所述第二活性成分是选自由以下组成的组的化合物：胰岛素、胰岛素衍生物、二甲双胍或其衍生物。
在一个实施方案中，所述第二活性成分是选自由以下组成的组的化合物：利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β阻断剂、血液稀释剂，如阿司匹林(aspirin)；和降胆固醇药物，如士他汀(statin)或贝特类(fibrate)。
在一个实施方案中，所述第二活性成分是选自由以下组成的组的化合物：胰岛素、艾塞那肽(Exenatide)、缓释艾塞那肽、利拉鲁肽(Liraglutide)、普兰林肽(Pramlintide)；磺酰脲、双胍、氯茴苯酸(Meglitinide)、噻唑烷二酮、DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂、α-葡萄糖苷酶和胆汁酸螯合剂抑制剂。
IV.剂量
涵盖用于全身性施用的各种给药方案。在一个实施方案中，向受试者施用包含根据本发明的apoA-I源性肽或多肽的制剂的方法包括以每剂每千克所述受试者的体重1μg与10,000μg之间的剂量施用所述肽或多肽。在另一实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重1μg与7,500μg之间。在另一实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重1μg与5,000μg之间。在一不同实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重1μg与2,000μg之间。在另一实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重1μg与1,000μg之间。在另一实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重1μg与700μg之间。在一更优选实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重5μg与500μg之间。在一最优选实施方案中，剂量在每剂每千克受试者的体重10μg与100μg之间。在一优选实施方案中，待治疗的受试者是人。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽是以每千克体重1μg-10,000μg，如每千克体重1μg-7,500μg，如1μg-5,000μg，如1μg-2,000μg，如1μg-1,000μg，如1μg-700μg，如5μg-500μg，如10μg至100μg的剂量施用或适合于以上述施用。
关于特定递送剂量和方法的指导提供于文献中；参见例如WO02/78730和WO07/100898。关于基于用于动物实验中的剂量计算人等效剂量的指导提供于Reagan-Shaw等,FASEBJ,22,659-661(2007)中。
必须根据所治疗的个体的年龄、体重和病状以及施用途径、剂型和方案、以及所需结果仔细调整施用的剂量，并且精确剂量应由从业者确定。
在本发明的一个实施方案中，施用是每日重复，如每日1-8次，如每日2-5次。在另一实施方案中，施用是每周重复至少1-3次，如每周2-5次，如每周3-6次，每三天一次，每四天一次，每五天一次，每六天一次，或每7天一次。
在其它实施方案中，、以相对长的剂量间隔施用根据本发明的apoA-I源性肽或多肽。相对长的剂量间隔旨在包括在剂量之间至少2天，如在剂量之间至少3天，例如每周2剂。更优选地，长的剂量间隔是至少1周，如至少2周，更优选是至少3周，如至少4周，或至少1个月。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽是每日施用。
在另一实施方案中，每周至少1-3次，如每周2-5次，如每周3-6次重复施用根据本发明的多肽。
以不同方式表示，剂量间隔是如此之长，以致在一个剂量的apoA-I源性多肽之后，当施用下一剂量时所述多肽在待治疗的受试者的血清中不再可检测。在另一实施方案中，血清水平低于10ng/mL，如低于5ng/mL，更优选低于1ng/mL，如低于0.5ng/mL，例如低于0.1ng/mL。
在一些实施方案中，初始施用apoA-I源性肽是例如每日两次、每日一次、每两天一次、每三天一次或每四天一次。这个给药时程可维持例如2、3、4、5、6、7、9、11、14、21天或大于21天。在完成这个给药时程之后，apoA-I源性肽可以较小频率施用，例如如上所述。
V.apoA-I源性肽
本发明涉及源于载脂蛋白A-I(apoA-I)的C末端结构域(AA190-243)的多肽和肽以及编码所述蛋白质的多核苷酸在治疗特征在于高血糖症或由高血糖症所致的疾病方面的用途。
ApoA-I是一种在人中由APOA1基因编码的蛋白质。它在脂质代谢中具有特定作用。ApoA-I是血浆中高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白质组分。自肠上皮细胞分泌的乳糜微粒也含有apoA-I，但它在血流中快速转移至HDL中。所述蛋白质是负责形成大多数血浆胆固醇酯的卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的辅因子。ApoA-I也作为前列环素(PGI2)稳定因子被分离，并且因此可具有抗凝作用。
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸，
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度，并且其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。
变体可在氨基酸序列方面或在不涉及序列的方面或在两方面不同于天然存在的apoA-I肽(例如SEQIDNO:1)。当天然存在的apoA-I肽中的一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或非天然氨基酸取代时，产生氨基酸序列变体(“序列变体”)。特别优选的变体包括天然存在的apoA-I或天然存在的apoA-I肽的C末端结构域(AA190-243)的生物活性片段，其序列与野生型序列的不同之处在于一个或多个保守性和/或半保守性的氨基酸取代，所述取代通常对蛋白质或肽的二级和三级结构以及疏水性质具有最小限度的影响。变体也可具有不同之处在于一个或多个不消除apoA-I的C末端结构域(AA190-243)的生物活性的非保守性的氨基酸取代、缺失或插入的序列。
以下群组(ClustalW‘强’保守群组)内的取代将在本发明的意义内被视为保守性取代-S、T、A；N、E、Q、K；N、H、Q、K；N、D、E、Q；Q、H、R、K；M、I、L、V；M、I、L、F；H、Y；F、Y、W。
以下群组(ClustalW‘弱’保守群组)内的取代将在本发明的意义内被视为半保守性取代-C、S、A；A、T、V；S、A、G；S、T、N、K；S、T、P、A；S、G、N、D；S、N、D、E、Q、K；N、D、E、Q、H、K；N、E、Q、H、R、K；V、L、I、M；H、F、Y。
本发明内的其它变体是具有增加肽稳定性的修饰的那些。此类变体在肽序列中可含有例如一个或多个非肽键(其替换肽键)。也包括的是：包括除天然存在的L-氨基酸以外的残基，如D-氨基酸或非天然存在或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸和环状变体的变体。将D-氨基酸而非L-氨基酸并入多肽中可增加它对蛋白酶的抗性。参见例如US5,219,990。剪接变体明确包括在本发明中。
在一个实施方案中，多肽是选自由SEQIDNo.1至1035组成的组的序列的天然存在的等位基因变体。这个多肽可包含与编码SEQIDNO.1至1035的核酸序列不同之处在于单一核苷酸的核酸序列的翻译产物的氨基酸序列。
在一个实施方案中，多肽是如本文所述的变体多肽，在一个实施方案中，包括其中所选序列中指定的任何氨基酸被改变来提供保守性取代的多肽。
非序列修饰可包括例如天然存在的apoA-I的各部分的体内或体外化学衍生化以及乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化、聚乙二醇化或糖基化。恰如有可能替换蛋白质的取代基，也可能用特征在于具有类似特征的基团取代结合于蛋白质的官能团。此类修饰不改变一级序列。这些将最初是保守的，即替换基团与原始基团将具有近似相同的尺寸、形状、疏水性和电荷。
一种用以改善治疗性蛋白质，如本发明的apoA-I源性肽片段的功效的方法是增加它的血清持久性，由此使得循环水平较高，和/或使得循环水平存在较长时间，由此提供较高暴露量(AUC)、较小施用频率和降低的剂量数。
在确定例如两个产品，如可商购获得的产品与候选药物之间的生物等效性时，进行药代动力学研究，借此在交叉研究中向志愿受试者(通常是健康个体，但有时在患者中)施用各制剂。在规则间隔下获得血清/血浆样品，并且测定母体药物(或有时代谢物)浓度。有时，血液浓度水平既不可行又不可能用以比较两个产品，那么药效动力学终点而非药代动力学终点用于比较。对于药代动力学比较，血浆浓度数据用于评估关键药代动力学参数，如曲线下面积(AUC)、峰值浓度(Cmax)、达到峰值浓度的时间(Tmax)和吸收滞后时间(tlag)。可在若干不同剂量下进行测试，尤其当药物显示非线性药代动力学时。
除来自生物等效性研究的数据之外，也可需要提交其它数据来满足生物等效性的调控要求。此类证据可包括分析方法验证和/或体外-体内关联研究(IVIVC)。
在一个特定实施方案中，本发明的药剂，如本发明的多肽，被修饰来提供较高暴露量(AUC)、较小施用频率和降低的剂量数。
在另一实施方案中，本发明的药剂，如本发明的多肽，被修饰以在向患者施用时增加它的半衰期，特别是它的血浆半衰期。具体来说，如多肽的药剂被修饰来增加它的血浆半衰期。在本领域中，许多方法可用于修饰肽药物以增加它的半衰期，并且本领域的此类方法可用于修饰本发明的apoA-I源性肽及其变体。短的血浆半衰期时间常由快速肾清除以及发生在全身性循环期间的酶促降解引起。对肽/蛋白质的修饰可导致血浆半衰期时间延长。可例如通过缩短多肽的总体氨基酸量来获得半衰期增加。
外肽酶是一组存在于血浆、肝和肾中的主要蛋白水解酶，其影响治疗性肽和蛋白质。因此，在许多情况下，修饰肽药物任一或两个末端使酶促稳定性以及因此血浆半衰期增加。因此，在一种方法中，使一种或多种其它化合物偶联于本发明的多肽以增加它的血浆半衰期。在一个实施方案中，末端修饰是N-乙酰化和/或C-酰胺化。在另一此类实施方案中，使N末端和/或C末端缀合于聚乙二醇(PEG)化合物。对多肽的一种特定修饰是N末端棕榈酰基和C末端聚乙二醇化双重修饰。也可能通过在C末端与N末端之间形成酰胺键来使多肽药物头-尾环化以防止外肽酶导致的apoA-I源性肽降解。
在另一实施方案中，通过替换一个或多个已知易经受酶促裂解的氨基酸，由此使得多肽逃脱蛋白水解降解来获得血浆半衰期增加。举例来说，可在一个或两个多肽末端处和/或在多肽内用D-氨基酸取代一个或多个L-氨基酸以避免降解，并且由此增加血浆半衰期。
也可通过与一种或多种特定酶抑制剂一起共同施用多肽来获得本发明的多肽的半衰期增加。所述酶抑制剂可包括在本发明的各组分的试剂盒中。
在另一方法中，可通过增加本发明的apoA-I源性肽的分子质量来获得半衰期增加。
作为一般规律，分子质量低于5kDa的未结合于血浆蛋白质的物质是通过肾途径排泄，而分子质量超过50kDa的分子不能或仅极少量可见于肾小球超滤液中。因此，除酶促降解之外，肽和蛋白质半衰期时间较短的主要原因是它们的快速肾排泄。因此，可通过增加多肽药物尺寸来延长半衰期时间。此外，可通过额外酶抑制来给予协同作用。除对N末端和C末端的化学修饰(这是一种抑制外肽酶的有效方式)和替换不稳定氨基酸之外，聚乙二醇化允许特定保护危及的末端，并且此外增加分子质量。此外，药物分子内的聚乙二醇化预期会导致由蛋白水解酶的空间位阻介导的酶促稳定性改善。
聚(乙二醇)(PEG)展现若干有益性质：高水溶性、在溶液中高移动性、缺乏毒性和免疫原性以及易于自身体清除。这些性质极常转移至PEG-蛋白质或PEG-肽缀合物。这些特征的程度取决于连接的PEG的分子量。
此外，N-乙酰神经氨酸的聚合物(聚唾液酸)可用作与本发明的多肽的缀合物。聚唾液酸是天然存在的、生物可降解的、高度亲水性的化合物，其在人体中不具有已知受体。聚乙二醇化和唾液酸化通过以下两种机制的组合来延长半衰期时间-改善酶促稳定性和通过增加分子质量来降低肾排泄。
已知白蛋白具有长的血浆半衰期，并且由于这个性质，它已在药物递送中用于增加药物的半衰期。出于这个目的，已使白蛋白缀合于此类药物化合物。尤其适合的是例如通过WO2010092135中所述的方法，尤其是使用PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼)的方法偶联于白蛋白分子上的游离半胱氨酸残基(Cys34)，以通过与apoA-I多肽进行腙连接来使白蛋白连接于本发明的apoA-I源性肽，包括其片段。使用酶促糖缀合的另一偶联技术由Neose(参见例如US2004/0126838)所述。这个技术可用于使用适合的接头使例如白蛋白连接于本发明的apoA-I多肽。
在某些实施方案中，本发明涉及一种长效修饰的apoA-I源性肽，其中所述修饰的多肽包含连接于药学上可接受的分子的哺乳动物apoA-I源性肽或其类似物，例如连接于(例如融合于)白蛋白，或融合于适合长度的脂肪酸，或融合于哺乳动物抗体的Fc片段或哺乳动物抗体的Fc片段的变体，或缀合于酰化基团或PEG的人apoA-I源性肽，所述长效修饰的apoA-I源性肽在一些实施方案中提供哺乳动物apoA-I源性肽或其类似物或修饰的apoA-I源性肽在哺乳动物中的体内血浆半衰期是2至48小时更长，通常是4至28小时，如6-8小时。
已描述产生包含连接于目标蛋白质或其片段的免疫球蛋白恒定区的融合蛋白(参见例如美国专利号5,155,027、5,428,130、5,480,981和5,808,029)。这些分子通常具有与连接的目标分子相关的生物活性以及效应子功能或与免疫球蛋白恒定区相关的某一其它所需特征两者。包含免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白可赋予融合蛋白若干合乎需要的性质，包括稳定性增加、血清半衰期增加(参见Capon等(1989)Nature337:525)以及与如新生儿Fc受体(FcRn)的Fc受体结合(美国专利号6,086,875、6,030,613和6,485,726)。
在一个实施方案中，导致半衰期增加的部分是可共价连接于一个或多个apoA-I源性肽，并且共价连接于一个或多个药学上可接受的分子以便产生修饰的apoA-I源性肽的多官能部分，如双官能或三官能部分。接头可为稳定的，此意味着在生理条件(例如温度37℃和pH7.4)下历经治疗时期不发生显著化学反应，例如水解。这可通过本领域中已知的稳定性研究来确定。接头可为化学接头，这意味着它是在活细胞外部通过有机化学产生。接头可为糖部分，如蛋白质上的糖基化，或可以化学方式制备并用于连接apoA-I源性肽分子和第二药学上可接受的分子，如PEG变体、白蛋白、脂肪酸或抗体或抗体片段，如Fc片段。
在一个实施方案中，使本发明的apoA-I源性肽偶联于免疫球蛋白-Fc，如IgG-Fc。
本发明的apoA-I源性肽可任选包含至少一个肽接头。在一个实施方案中，接头包含由肽键连接在一起的氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在各种实施方案中，接头可包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、或100-200个氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个实施方案中，接头由大多数在空间上不受阻碍的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸组成。
在一个实施方案中，肽接头具有至少1个氨基酸，如1-200个氨基酸，通常1-50个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。通常，肽接头具有1-40个氨基酸，如1-30个，如1-20个，如1-10个氨基酸。在另一实施方案中，肽接头选自由选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸的氨基酸组成的接头。通常，肽接头由大多数在空间上不受阻碍的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸组成。
可通过任何适合接头或接头区域使抗体、抗体片段、白蛋白、脂肪酸或任何另一半衰期延长物缀合于本发明的apoA-I源性肽。接头可为在apoA-I和药学上可接受的分子各自之中的两个半胱氨酸(Cys)氨基酸残基之间的二硫桥，如-S-S-键。接头可为融合接头，这意味着apoA-I源性肽可在活细胞中以一种多肽或蛋白质形式表达。接头可为用化学部分分隔apoA-I源性肽和药学上可接受的分子的亲水性接头，所述化学部分包含至少5个非氢原子，其中这些非氢原子中的30-50％是N或O。接头可为可水解的，如US6,515,100、US7,122,189、US7,700,551、WO2004/089280、WO2006/138572和WO2009/095479中所述。适用作本发明中的接头的典型化合物包括选自具有二羧酸、顺丁烯二酰亚胺基酰肼(malemidohydrazide)、PDPH、SPDP、LC-SPDP、GMBS、羧酸酰肼和小肽的组的那些。适用作本发明的接头的化合物的更具体实例包括：(a)二羧酸，如丁二酸、戊二酸和己二酸；(b)顺丁烯二酰亚胺基酰肼，如N-[顺丁烯二酰亚胺基己酸]酰肼(EMCH)、N-[顺丁烯二酰亚胺基丙酸]酰肼(MPH或BMPH)、4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基酰肼和N-[k-顺丁烯二酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)、4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)；(c)NHS-3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸琥珀酰亚胺酯(MPS-EDA)；(d)PDPH接头，如缀合于硫氢基反应性蛋白质的(3-[2-吡啶基二硫基]丙酰肼)；(e)N-3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)，(f)6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)，(g)N-(v-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)，和(h)选自2-5个碳原子的羧酸酰肼。其它非肽接头也是可能的。举例来说，可使用烷基接头，如-NH-(CH2)m-C(0)-，其中m是选自2-20的整数。这些烷基接头可进一步被任何非空间位阻性基团，如低级烷基(例如C1至C6)低级酰基、卤素(例如Cl、Br、I、F)、CN、NH2、苯基等取代。一种示例性非肽接头是PEG接头。根据本发明适用的其它接头描述于美国专利号6,660,843中。
用于将两个或更多个分子(如apoA-I源性肽和药学上可接受的分子)连接在一起，并且任选通过多官能接头(如双官能接头)的不同技术可在先前技术中获得，并且此处适合的参考文献是WO01/58493，包括其中所列和所引用的所有相关文件。
在一个实施方案中，本发明的apoA-I源性肽被修饰以在向患者施用时增加它的半衰期，特别是它的血浆半衰期。修饰可呈某一部分缀合于本发明的药剂的形式，由此产生部分缀合的药剂，其中所述部分缀合的药剂具有的血浆和/或血清半衰期长于非部分缀合的药剂的血浆和/或血清半衰期。在一个此类实施方案中，缀合于药剂的部分是选自由白蛋白及其变体、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)、酰化基团、抗体和抗体片段组成的组的一种或多种类型的部分。部分与本发明的多肽的缀合可针对本发明的多肽的任何适合的氨基酸残基(骨架或侧链)。部分也可通过接头缀合于本发明的多肽。
在一个实施方案中，缀合于根据本发明的多肽的部分是有助于跨越血脑屏障(BBB)进行转运的部分。此类跨BBB转运促进剂的一实例是来自骆驼科物种的抗体。如单峰驼、骆驼、美洲驼、羊驼、小羊驼和南美野生羊驼(guanacos)的骆驼科动物具有能够跨越BBB的单链抗体。
此外，给定多肽中包括末端氨基酸的许多氨基酸可通过自然过程(如糖基化和其它翻译后修饰)，或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。仅举几个说明性实例，在可存在于本发明的多肽中的已知修饰之中的是乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接多核苷酸或多核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖化、糖基化、形成GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化)和泛素化。
此类修饰为技术人员所熟知，并且已非常详细地描述于科学文献中。若干特别常见的修饰，糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化例如描述于大多数基础教科书中，诸如例如I.E.Creighton,Proteins-StructureandMolecularProperties,第2版,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993中。关于这个主题的许多详述综述是可用的，诸如例如由Wold,F.,PosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson编,AcademicPress,NewYork,第1-12页,1983；Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646,1990以及Rattan等,ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62,1992提供的那些。
此外，蛋白质可包含蛋白质标签以允许后续纯化以及任选使用内肽酶移除标签。标签也可包含蛋白酶裂解位点以有助于后续移除标签。亲和标签的非限制性实例包括多聚组氨酸标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合结构域标签。优选地，对于产生和纯化，标签是多聚组氨酸标签。优选地，标签在蛋白质的C末端部分中。
修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。实际上，通过共价修饰来阻断多肽中的氨基或羧基或两者常见于天然存在的和合成的多肽中，并且此类修饰也可存在于本发明的多肽中。举例来说，在大肠杆菌中制备的多肽的氨基末端残基在蛋白水解加工之前几乎不变地将为N-甲酰甲硫氨酸。
发生在多肽中的修饰常将随它如何制备而变。对于通过在宿主中表达克隆的基因制备的多肽，举例来说，修饰的性质和程度大部分将由宿主细胞的翻译后修饰能力和多肽氨基酸序列中存在的修饰信号决定。举例来说，糖基化常不发生在如大肠杆菌的细菌宿主中。因此，当需要糖基化时，多肽应在糖基化性宿主，通常是真核细胞中表达。昆虫细胞常与哺乳动物细胞进行相同的翻译后糖基化，出于这个原因，已开发昆虫细胞表达系统来尤其高效表达具有天然糖基化样式的哺乳动物蛋白质。类似考虑适用于其它修饰。
应了解相同类型的修饰可在相同或不同程度上存在于给定多肽中的若干位点。此外，给定多肽可含有许多类型的修饰。
一般来说，如本文所用，术语多肽涵盖所有此类修饰，特别是存在于通过在宿主细胞中表达多核苷酸来合成的多肽中的那些。
在一个方面，本发明涉及一种基本上由选自由氨基酸序列SEQIDNO:3、4或6组成的组的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在另一方面，本发明涉及一种由选自由氨基酸序列SEQIDNO:3、4或6组成的组的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在另一方面，本发明涉及一种基本上由选自由氨基酸序列SEQIDNO:9至1035组成的组的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在另一方面，本发明涉及一种由选自由氨基酸序列SEQIDNO:9至1035组成的组的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一个实施方案中，所述氨基酸序列中的任一氨基酸残基已被改变成相应D-氨基酸，而在另一实施方案中，所述氨基酸序列中的所有氨基酸残基都已被改变成相应D-氨基酸。
在一个方面，本发明涉及一种源于apoA-1的序列的多肽，其包含SEQIDNO:1(即对应于54-mer肽(C末端肽190-243)的人序列)或由SEQIDNO:1组成。
在一个实施方案中，apoA-I源性序列包含不超过apoA-I的SEQIDNO:1的多肽序列或由所述多肽序列组成。
在一个实施方案中，使多肽结合于可为除apoA-I以外的多肽的多肽、分子或接头。
在一个方面，本发明涉及一种包含如本文定义的多肽的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的医药的活性成分是SEQIDNO:1的子序列。
在一个实施方案中，存在一个或多个进一步增加肽的溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
在一个实施方案中，SEQIDNO:1的肽的一个或多个氨基酸取代、添加或缺失保持或增加哺乳动物细胞的葡萄糖摄取。
在一个实施方案中，存在一个或多个增加apoA-I源性多肽在重组宿主细胞中或在体外翻译系统中的表达，或在化学合成中产生的氨基酸取代、添加或缺失。
在一个实施方案中，生物活性多肽是选自SEQIDNo1至SEQIDNo8的组的至少一个。
VI.apoA-I源性多核苷酸
本发明提供编码apoA-I的C末端结构域(AA190-243)(SEQIDNO:1)及其片段(SEQIDNO:2至1035)的分离的基因组DNA和cDNA的医学用途。通常，cDNA序列比基因组序列短得多，更易于插入适当表达载体中以及在体内或离体转导/转染至产生细胞或人细胞中。
此外，本发明的核苷酸序列包括是这些序列的衍生物的序列。本发明也包括涵盖这些序列中的一个或这些序列中的一个的衍生物的载体、脂质体和其它运载媒介物。本发明也包括自apoA-IcDNA，优选是人apoA-IcDNA，包括但不限于人apoA-I以及衍生物和变体转录和翻译的蛋白质。
也涵盖用于增强在所选宿主细胞中表达的密码子优化的核酸分子，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母物种、中国仓鼠、幼小仓鼠、昆虫、真菌和人。
可通过现有的诱变方法来制备变体核酸。也涵盖用于用小鼠、大鼠或黑猩猩编码序列改组来自人的编码序列的方法。
如果小鼠或大鼠apoA-I中在相应位置处存在的氨基酸不同于人apoA-I中存在的氨基酸，那么通过使人apoA-I中存在的氨基酸与这个氨基酸交换来制备变体核酸。
在一个方面，本发明涉及一种在表达后编码本文定义的多肽，如具有序列SEQIDNO:3、4或6的多肽的分离的多核苷酸。
VII.载体
病毒载体
广泛来说，基因疗法寻求将新的遗传物质转移至患者的细胞中，从而得到对所述患者的治疗益处。此类益处包括治疗或防治广泛范围的疾病、病症和其它病状。
离体基因治疗方法涉及修饰分离的细胞(包括但不限于胰腺的干细胞以及α、β和γ细胞、神经和神经胶质前体细胞、以及胎儿干细胞)，其接着被输注、移植或另外植入患者中。参见例如美国专利号4,868,116、5,399,346和5,460,959。体内基因疗法寻求在体内直接靶向宿主患者组织。
适用作基因转移载体的病毒包括乳头多瘤空泡病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和逆转录病毒。适合的逆转录病毒包括由HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV组成的组。另一组适合的逆转录病毒包括由HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV组成的组。另一组优选病毒载体包括由α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV组成的组，优选是腺相关病毒。
基因疗法领域内的优选病毒是慢病毒和腺相关病毒。两种类型的病毒均可在无细胞分裂下整合至基因组中，并且两种类型均已在临床前动物研究中加以测试。
慢病毒载体是一种复制缺陷型慢病毒粒子。此类慢病毒粒子可由包含5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接于编码所述融合蛋白的多核苷酸信号的启动子、第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR的慢病毒载体产生。
逆转录病毒载体是最通常用于人临床试验中的载体，因为它们携带7-8kb，并且因为它们能够感染细胞以及以高效率使它们的遗传物质稳定整合至宿主细胞中。参见例如WO95/30761；WO95/24929。致肿瘤病毒亚科要求至少一轮靶标细胞增殖来将外源性核酸序列转移并整合至患者中。逆转录病毒载体随机整合至患者的基因组中。逆转录病毒可用于靶向干细胞。
已描述三类逆转录病毒粒子；即可高效感染鼠类细胞的嗜亲性逆转录病毒粒子，以及可感染许多物种的细胞的双嗜性逆转录病毒粒子。第三类包括可感染另一物种的细胞的程度大于感染产生病毒的物能力已使得逆转录病毒具有用于在发育研究中标记细胞谱系以及用于向癌或肿瘤递送治疗性或自杀性基因的吸引力。
对于在人患者中使用，逆转录病毒载体必须是复制缺陷型的。这防止在靶标组织中进一步产生感染性逆转录病毒粒子-代之以复制缺陷型载体变为稳定并入靶标细胞基因组中的“捕获性(captive)”转基因。通常，在复制缺陷型载体中，gag、env和pol基因已被缺失(连同病毒基因组的大多数其余部分一起)。
异源DNA替代缺失的病毒基因被插入。异源基因可受控于内源性异源启动子、在靶标细胞中具有活性的另一异源启动子、或逆转录病毒5'LTR(病毒LTR在不同组织中具有活性)。通常，逆转录病毒载体具有约7-8kb的转基因容量。
复制缺陷型逆转录病毒载体要求提供为自例如工程化包装细胞系反式复制和装配所必需的病毒蛋白质。重要的是包装细胞不释放复制感受态病毒和/或辅助病毒。这已通过自缺乏Ψ信号的RNA表达病毒蛋白质，以及自单独转录单元表达gag/pol基因和env基因来实现。此外，在一些2.代和3.代逆转录病毒中，5’LTR已被控制这些基因的表达的非病毒启动子替换，并且已使3’启动子最小以仅含有近端启动子。这些设计使导致产生复制感受态载体或辅助病毒的重组的可能性减至最小限度。
表达载体
可使用不需要对本领域普通技术人员详细解释的常规技术来实现对用于重组表达本发明的apoA-I源性肽的载体的构建。然而，对于综述，普通技术人员可能希望查阅Maniatis等,在MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,(NY1982)中。表达载体可用于产生用于重组产生供医学使用的apoA-I肽和多肽的产生细胞，以及用于产生分泌供裸露或囊封疗法用的apoA-I源性肽的治疗性细胞。
简要来说，构建重组表达载体采用标准连接技术。对于用以确认构建的载体中的正确序列的分析，使用例如Messing等(NucleicAcidsRes.,9:309-,1981)的方法，Maxam等(MethodsinEnzymology,65:499,1980)的方法，或将为本领域技术人员所知的其它适合方法将基因测序。
如例如由Maniatis等(MolecularCloning,第133-134页,1982)所述，使用常规凝胶电泳对裂解片段进行尺寸分离。
对于产生高效表达载体，这些表达载体应含有为编码的基因以正确阅读框表达所必需的调控序列。在转录、翻译或翻译后水平上控制基因的表达。转录起始是基因表达中的早期和关键事件。这取决于启动子和增强子序列，并且受与这些序列相互作用的特定细胞因子影响。许多基因的转录单元由启动子以及在一些情况下增强子或调控元件组成(Banerji等,Cell27:299(1981)；Corden等,Science209:1406(1980)；以及Breathnach和Chambon,Ann.Rev.Biochem.50:349(1981))。对于逆转录病毒，逆转录病毒基因组的复制中涉及的控制元件存在于长末端重复序列(LTR)中(Weiss等编,Themolecularbiologyoftumorviruses:RNAtumorviruses,ColdSpringHarborLaboratory,(NY1982))。莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒(MLV)和劳斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus，RSV)LTR含有启动子和增强子序列(Jolly等,NucleicAcidsRes.11:1855(1983)；Capecchi等,Enhancerandeukaryoticgeneexpression,Gulzman和Shenk编,第101-102页,ColdSpringHarborLaboratories(NY1991))。其它强效启动子包括源于巨细胞病毒(CMV)的那些和其它野生型病毒启动子。
也已描述许多非病毒启动子的启动子和增强子区域(Schmidt等,Nature314:285(1985)；Rossi和deCrombrugghe,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5590-5594(1987))。用于维持和增加转基因在休眠细胞中的表达的方法包括使用启动子，包括I型(1和2)胶原蛋白(Prockop和Kivirikko,N.Eng.J.Med.311:376(1984)；Smith和Niles,Biochem.19:1820(1980)；deWet等,J.Biol.Chem.,258:14385(1983))、SV40和LTR启动子。
根据本发明的一个实施方案，启动子是选自由以下组成的组的组成型启动子：泛素启动子、CMV启动子、SV40启动子、延伸因子1α启动子(EF1-α)、RSV、CAG。诱导型/阻遏型启动子的实例包括：Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素(Rapamycin)诱导型启动子、Mx1、Mo-MLV-LTR、孕酮(progesterone)、RU486。
一组优选启动子包括CAG、CMV、人UbiC、JeT、SV40、RSV、Tet可调控启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1、Mt1和EF-1α。
除使用病毒和非病毒启动子来驱动转基因表达之外，增强子序列可用于增加转基因表达的水平。增强子不仅可增加它们的天然基因的转录活性，而且也增加一些外来基因的转录活性(Armelor,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:2702(1973))。举例来说，在本发明中，胶原蛋白增强子序列可与胶原蛋白启动子2(I)一起用于增加转基因表达。此外，见于SV40病毒中的增强子元件可用于增加转基因表达。这个增强子序列由72个碱基对重复序列组成，如由Gruss等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:943(1981)；Benoist和Chambon,Nature290:304(1981)以及Fromm和Berg,J.Mol.Appl.Genetics,1:457(1982)所述，所述参考文献都以引用的方式并入本文。当这个重复序列与各种启动子串联存在时，它可增加许多不同病毒和细胞基因的转录(Moreau等,NucleicAcidsRes.9:6047(1981))。
其它表达增强序列包括但不限于旱獭肝炎病毒转录后调控元件、WPRE、SP163、CMV增强子和鸡[β]-球蛋白绝缘子或其它绝缘子。
在一个方面，本发明涉及一种包含能够编码根据SEQIDNO:1至1035中的任一个的多肽的多核苷酸的载体，如病毒载体或表达载体。
VIII.宿主细胞
在一个方面，本发明涉及用根据本发明的载体遗传修饰的分离的宿主细胞。
本发明也涉及适于通过裸露或囊封细胞来生物递送源于apoA-I的C末端结构域的肽的细胞，其被遗传修饰来过度表达apoA-I源性多肽，并且其可被植入患者中以例如在功能失常的胰腺中局部递送生物活性apoA-I多肽。此类细胞可广泛地称为治疗性细胞。
对于离体基因疗法，优选细胞组包括干细胞、肌肉细胞、肝细胞、脂肪细胞和胰腺细胞，如α细胞、β细胞和δ细胞。
在一个方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含能够编码根据SEQIDNO:1至1035中的任一个的多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体。
在一个实施方案中，细胞选自由以下组成的组：干细胞、肌肉细胞、肝细胞、脂肪细胞和胰腺细胞，如α细胞、β细胞和δ细胞。
在另一实施方案中，细胞选自由以下组成的组：CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、HiB5、RN33b和BHK细胞。
序列概述
实施例
实施例1：产生多肽
本领域技术人员将了解具有氨基酸序列SEQIDNO:1至1035的根据本发明的多肽可使用本领域中已知的方法，例如通过多肽的化学合成或异源表达系统，诸如例如使用如下对于由全长人apoA-I蛋白的氨基酸1-243、以及1-189、44-189、44-243和190-243组成的多肽所述的方法来产生。应注意由全长人apoA-I蛋白的氨基酸190-243组成的多肽片段具有序列SEQIDNO:1。
表达和纯化重组人apoA-I变体
在大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株BL21Star(DE3)pLysS细胞(Invitrogen)中由在N末端含有六组氨酸亲和标签的人apoA-I基因表达人apoA-I变体(分别对应于氨基酸1-243以及1-189、44-189、44-243和190-243的全长和通过定点诱变产生的截短变体)(Lagerstedt等(2007)JBiolChem282:9143-9149)。简要来说，将基因(全长或基因的截短变体)克隆至pEXP-5质粒(Novagen,Inc,Madison)中，并且转移至细菌中，并在37℃下在具有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基中培养。在添加0.5mmol/l异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(Sigma)之后诱导蛋白质表达3-4小时。在细胞破裂之后，使用His-Trap-镍螯合柱(GEHealthcare)和具有3mol/l胍的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)的流动相，自细胞的可溶性级分纯化apoA-I。蛋白质接着于含有100mmol/l咪唑的PBS(pH7.4)中洗涤，接着用含有500mmol/l咪唑的PBS洗脱。通过使用用PBS(pH7.4)平衡的脱盐柱(GEHealthcare)从蛋白质样品移除咪唑。通过SDS-PAGE分析蛋白质纯度，并且通过BCA方法(Pierce)或使用nanodrop2000c分光光度计(Thermoscientific)测定浓度。
以上方法产生由人全长apoA-I的氨基酸1-243、1-189、44-189、44-243和190-243组成的全长apoA-I多肽和截短变体(全长apoA-I的多肽片段)。图4a显示截短变体的示意性概述。
实施例2：测试成肌细胞中诱导的葡萄糖摄取
全长人无脂质apoA-I和包含全长人apoA-I的成熟球形高密度脂蛋白(HDL)适用于诱导的葡萄糖摄取的研究。为探究合成的重构盘状HDL(rHDL)对GLUT4易位和葡萄糖摄取的影响，产生为细胞孵育所需的重组人apoA-I和重构HDL，并且测试它们对L6成肌细胞中诱导的葡萄糖摄取的影响。也使用对应于全长apoA-I的残基1-189(N末端/中心结构域)、44-189(中心结构域)、44-243(中心/C末端结构域)和190-243(C末端结构域)的截短的蛋白质片段探究apoA-I的特定区域对增加葡萄糖摄取的相对影响(图4a)。后述蛋白质片段对应于具有氨基酸序列SEQIDNO:1的多肽。
细胞培养
使L6成肌细胞(ATCC号CRL-1458)在补充有10％FBS(Sigma)和1％抗生素/抗霉菌素(青霉素、链霉素、两性霉素B；Invitrogen)的α-MEM(Invitrogen)中生长。通过自生长培养基转换成2％FBSα-MEM，持续6-7或6-12天来实现分化成肌管。在37℃和5％CO2下维持细胞。
葡萄糖摄取测量
在刺激(或处理)之前，使细胞在无血清α-MEM中饥饿2小时，并且一式三份进行并包括细胞松弛素B(Sigma)作为细胞相关的非特异性放射性的测量的所有后续处理都在摄取缓冲液(140mmol/lNaCl、20mmol/lHEPES、5mmol/lKCl、2.5mmol/lMgSO4、1mmol/lCaCl2，pH7.4)中进行。在刺激之后，用含10μmol/l2-脱氧-D-葡萄糖(Sigma)、10μmol/l2-[3H]-脱氧-D-葡萄糖(PerkinElmer)的摄取缓冲液在室温下替换处理剂15分钟。细胞接着用冰冷PBS洗涤两次，并且用1mol/lNaOH在冰上裂解。收集裂解物，并且通过闪烁计数来定量放射性。
统计分析
除非另外指示，否则所有数据都显示为平均值±SEM。当适当时，使用MicrosoftExcel和GraphPadPrism软件，通过双尾学生t检验(student’sttest)或单因素ANOVA以及邦费罗尼氏事后检验(Bonferroni’sposthoctest)来进行分析。p＝≤0.05被视为显著。
产生重构HDL(rHDL)
将1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)(AvantiPolarLipids)溶解于氯仿:甲醇(3:1)中，其在氮气流下蒸发，并且将所得脂质薄膜再混悬于PBS中。对于POPCrHDL，在2:1摩尔比(脱氧胆酸盐:POPC)下添加脱氧胆酸盐至POPC乳液中，并且在22℃下在100:1摩尔比(磷脂:蛋白质)下与apoA-I一起孵育1小时(Lagerstedt等(2011)JournalofBiologicalChemistry,2011；286:2966-2975)。通过相对于PBS进行彻底透析从POPCrHDL制剂移除脱氧胆酸盐。根据Petrlova等(2012)JLipidRes53:390-398制备DMPCrHDL。简要来说，使用LiposoFast系统(Avestin)，使DMPC乳液穿过具有100nm孔径的聚碳酸酯膜最少20次。在22℃下以100:1摩尔比(磷脂:蛋白质)下使所得囊泡与apoA-I一起孵育4天。通过蓝色非变性PAGE(Invitrogen)确认指示rHDL形成的ApoA-I二聚体。除非另外指示，否则用POPCrHDL进行处理。
蛋白质印迹
在刺激或处理之前，使培养的成肌细胞在无血清α-MEM中血清饥饿4小时，并且包括胰岛素或苯乙双胍作为阳性对照(Sigma)的所有后续处理都在无血清α-MEM中进行。在处理之后，细胞用冰冷PBS缓冲液洗涤，并且使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的非变性裂解缓冲液(1％曲通(Triton)X-100、50mmol/lTris、150mmol/lNaCl，pH8.0)在冰上裂解。在4℃下在16,000×g下离心裂解物20分钟，并且对上清液进行BCA蛋白质测定(Pierce)。通过SDS-PAGE分离相等蛋白质量，并且转移至硝酸纤维素膜中。pAMPK、AMPK、pACC、pAkt、Akt和微管蛋白用于用IRDye800CW和680RD二抗(LI-COR)进行免疫检测。使用OdysseyFc系统使印迹成像，并且使用Imagestudiov2.0软件进行定量。
rHDL诱导骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取和GLUT4易位
为探究盘状HDL(rHDL)对GLUT4易位和葡萄糖摄取的影响，我们产生为细胞孵育所需的重组人apoA-I和重构HDL。使L6肌管与50μg/ml(1.6μmol/l)apoA-I一起孵育1小时，随后如上所述进行葡萄糖摄取测定。通过与胰岛素一起孵育进行处理使葡萄糖摄取增加2倍，并且apoA-I处理的细胞显示葡萄糖摄取增加1.3倍(图1b)。接着，通过与50μg/ml盘状rHDL(表示为含apoA-I的rHDL的总浓度，假定每个粒子2个apoA-I分子)一起孵育1小时来处理L6肌管。rHDL处理诱导葡萄糖摄取超过基础2.6倍(p＝0.095)，此类似于胰岛素刺激(2.4±1.0倍)。然而，由于相较于在其它实验中在1.6-1.9倍的范围内的影响，在一个实验中apoA-I处理与胰岛素处理两者均为4倍影响，所以这未达到显著性(图1c)。此后，以包括细胞数目和品质的更加受控的方式重复这个实验(在从成肌细胞分化成多核肌管期间在细胞分裂之间的时间、细胞密度、所用细胞的传代方面类似地处理细胞)。(图7c)。接着观察到也显示统计显著性的类似葡萄糖摄取增加(超过对照约2.5倍)。这个细胞系在胰岛素刺激的葡萄糖摄取方面的类似差异可在文献中注意到(Rudich和Klip,2003)。然而，这些数据明确显示rHDL比无脂质apoA-I对葡萄糖摄取施加更强效影响。
使用对应于全长apoA-I的残基1-189(N末端/中心结构域)、44-189(中心结构域)、44-243(中心/C末端结构域)和190-243(C末端结构域)的截短的蛋白质片段探究apoA-I的特定区域对增加葡萄糖摄取的相对影响(图4a)。如上对于用全长apoA-I处理L6肌管以孵育截短的蛋白质片段进行处理，并且随后如上所述进行葡萄糖摄取测定。
如可在图4b和8b中所见，所有四种肽都诱导葡萄糖摄取，其中190-243多肽片段(由具有序列SEQIDNo:1的多肽组成)显示对L6肌管葡萄糖摄取的最大和最一致影响(相对于对照，1,77±0.23倍变化；p＝≤0.05)。
rHDL介导的葡萄糖摄取是apoA-I蛋白依赖性的
为测试成分磷脂对L6肌管中rHDL诱导的葡萄糖摄取的作用，也产生用DMPC制备的rHDL，并且与不含有apoA-I蛋白的100nmDMPC囊泡进行比较。可在不存在apoA-I下用DMPC合成稳定的100nm直径囊泡，并且因此用作磷脂对照。如上所述测试对葡萄糖摄取的影响。尽管自apoA-I(50μg/ml)和DMPC(0.16mmol/l)合成的rHDL粒子诱导葡萄糖摄取的程度类似于胰岛素刺激的细胞，但与空DMPC囊泡(0.16mmol/l等效于具有50mg/mlapoA-I的rHDL中的脂质浓度)一起孵育不诱导葡萄糖摄取。甚至在14倍较高浓度(2.29mmol/l)下，DMPC囊泡对葡萄糖摄取不具有影响(图2a)。为也测试成分POPC磷脂对rHDL诱导的葡萄糖摄取的作用，将用POPC制备的rHDL与不含有apoA-I蛋白的100nmPOPC囊泡进行比较。与空POPC囊泡(0.10mmol/l)一起孵育不诱导葡萄糖摄取(图7c)。rHDL处理诱导葡萄糖摄取超过基础2.3±0.39倍(p＝≤0.05)，此类似于胰岛素刺激(2.4±1.0倍)(图7c)。
用rHDL处理的L6肌管中的AMPK和ACC而非Akt的磷酸化增加
为剖析盘状rHDL对非胰岛素依赖性信号传导通路的影响，我们使用来自与rHDL一起孵育的L6肌管的裂解物进行蛋白质印迹。在处理60分钟(700μg/mlapoA-IrHDL)之后，L6肌管裂解物显示磷酸化的AMPK水平增加(1.36±0.071倍；p＝≤0.01)(图3a、3b)以及它的下游靶标ACC水平增加(1.64±0.26倍；p＝≤0.05)(图3c、3d)。苯乙双胍用作阳性对照，其在0.4mmol/l的浓度下诱导磷酸化的AMPK和ACC分别升高1.98±0.33倍(p＝≤0.05)和2.7±0.74倍(p＝≤0.05)。相反，Akt磷酸化不受rHDL影响(1.12±0.38S.D.倍)，而胰岛素(1nmol/l)具有2.06±0.47S.D.倍影响(图3f、3e)。为明晰起见，在图3e中绘制1nmol/l胰岛素(n＝2)和100nmol/l胰岛素(n＝3)(51±12.5倍；p＝≤0.01)。图3a、3c和3f所定量的那些物质的代表性免疫印迹分别在图3b、3d和3e中给出。
用人ApoA-I的190-243多肽片段(SEQIDNO:1)处理的L6肌管中的AMPK而非Akt的磷酸化增加。
如上对于rHDL所述，使用来自L6肌管的裂解物测试人ApoA-I的肽片段190-243(SEQIDNO:1)对非胰岛素依赖性信号传导通路的影响。使肌管血清饥饿4小时，接着用2、10或20μmol/l190-243肽、1mmol/l苯乙双胍、100nmol/l胰岛素或对照(C)处理60分钟，随后对磷酸化的AMPK(AMP活化的蛋白质激酶)或磷酸化的Akt进行蛋白质印迹分析。微管蛋白用作装载对照。所示印迹代表三个独立实验。
如可由图8c所见，L6肌管裂解物显示磷酸化的AMPK的水平增加(图8c顶部图)。相反，Akt磷酸化不受用肽片段190-243处理影响(图8c下部图)。
本领域技术人员将了解可通过使用这个实施例的方法来测试具有氨基酸序列SEQIDNO:1至1035的根据本发明的多肽中的任一个对成肌细胞和/或肌管的葡萄糖摄取的影响。
实施例3：关于对质膜GLUT4水平的影响的离体研究
为支持实施例2中所述的葡萄糖摄取观察结果，通过对完整的初级骨骼趾短屈肌(FDB)肌肉纤维进行免疫荧光显微术分析来评估rHDL和190-243多肽片段(SEQIDNO:1)增加质膜中GLUT4的量的能力，所述肌肉纤维分离自具有肌肉特异性HA-GLUT4-GFP表达的转基因小鼠模型(Lizunov等(2012)AmJPhysiolEndocrinolMetab302:E950-960)。HA-GLUT4-GFP构建体的第一外表面环上存在的HA表位允许检测插入质膜中的GLUT4。使完整的FDB纤维与rHDL一起离体孵育，随后如下所述进行非渗透化细胞的固定和HA抗体标记。
制备和免疫染色初级骨骼肌纤维
2至5只具有肌肉特异性HA-GLUT4-GFP表达的转基因小鼠(C57/Bl6；10-14周)(由S.Cushman赠送)(Lizunov等(2012)AmJPhysiolEndocrinolMetab302:E950-960)用于各条件。使动物安乐死，并且解剖出趾短屈肌(FDB)肌肉，并与具有0.5％(w/v)牛血清白蛋白的充氧的Krebs-Henseleit碳酸盐Hepes(KRBH)缓冲液(6mmol/lKCl、1mmol/lNa2HPO4、0.2mmol/lNaHPO4、1.4mmol/lMgSO4、1mmol/lCaCl2、128mmol/lNaCl、10mmol/lHEPES，pH7.4)一起孵育。在解剖之后，用95％O2/5％CO2对肌肉连续充氧，并且在37℃下在缓慢振荡下在水浴中孵育1-2小时。在孵育之后，肌肉用充氧的KRBH洗涤3次，并且接着用胰岛素(100nmol/l)、apoA-I(全长无脂质)、rHDL或apoA-I190-243多肽片段处理，或保持基础状态1小时。在刺激之后，基础(未刺激)的肌肉和刺激的肌肉用含4％多聚甲醛的PBS固定10分钟，用含有1％BSA的PBS洗涤3次，并且与抗HA(Covance)一起孵育30-60分钟，随后与荧光标记的二抗Alexa-647(Invitrogen)一起孵育30分钟。
共聚焦显微术
使用共聚焦LSM510显微镜(Zeiss)，使用40×物镜(NA1.3)，使用BP505-530和LP650来使固定的细胞成像。用LSM软件收集图像。
胰岛素处理与rHDL处理两者均诱导GLUT4易位至肌纤维膜质膜中，如通过HA信号所检测(图1d上部图)。图1d中的下部图显示未刺激的肌肉纤维和刺激的肌肉纤维中通过GFP信号与HA信号合并所检测的总GLUT4。由于空间位阻，对横小管标记受限制，并且因此仅评估在肌纤维膜处的质膜GLUT4易位。请也参照图7d，其显示相同数据的替代性表示。
为验证这个观察结果，在与190-243多肽片段一起离体孵育之后，对用HA抗体标记的FDB纤维进行共聚焦免疫荧光成像。相对于基础条件，这些图像显示应答于190-243多肽片段的膜GLUT4蛋白水平更大(图4c)，因此支持图4b中的研究结果。请也参照图9a，其显示相同数据的替代性表示。
本领域技术人员将了解可通过使用这个实施例的方法来测试具有氨基酸序列SEQIDNO:1至1035的根据本发明的多肽中的任一个对质膜GLUT4水平的影响。
实施例4：对根据本发明的多肽的结构表征
可通过使用本领域中已知的方法，在多肽的分子质量、二级和三级螺旋含量和其它特征方面来表征具有SEQIDNO:1至1035的本发明的多肽。举例来说，通过使用如下对于由人apoA-I蛋白的氨基酸1-243和190-243组成的多肽所述的任一方法。应注意190-243多肽片段由人apoA-I蛋白的氨基酸190-243组成，并且具有序列SEQIDNO:1。
蓝色-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
使用本领域中已知的方法对所有rHDL制剂进行蓝色-非变性PAGE以确认10nm直径盘状apoA-I二聚体的形成。图2b是代表性考马斯染色凝胶，其显示单体无脂质apoA-I(约28kDa)以及POPC与DMPCrHDL之间的尺寸类似性(均约10nm直径)。
圆二色性(CD)光谱法
在配备有设置成25℃的JascoCDF-426SPeltier的JascoJ-810分光偏振计上进行CD测量。在PBS(最终浓度是25mmol/l磷酸盐、25mmol/lNaCl，pH7.4)中将ApoA-I(全长和190-234多肽片段)稀释至0.2mg/ml，放置在0.1mm石英比色皿中，并且在用氮气彻底净化之后，在200至260nm的范围内扫描(扫描速度是20nm/min)。自5次扫描的平均值减去基线值(PBS；25mmol/l磷酸盐、25mmol/lNaCl)，并且如先前所述由222nm下的摩尔椭圆率计算α螺旋含量(Petrlova等(2012)JLipidRes53:390-398)。
无脂质190-243片段的结构构象类似于脂质结合的apoA-I的构象
假设在与L6肌管和FDB纤维一起孵育后，细胞脂质结合190-243多肽片段可为它的葡萄糖摄取诱导作用所必需。已知190-234多肽片段可通过脂质溶解于溶液中来形成盘状粒子(Vedhachalan等(2010)JBiolChem285:31965-31973)，其在非变性PAGE上可以寡聚物形式可视化。为评估指示脂质结合的寡聚物形成，在蓝色非变性PAGE上使纯化的190-243多肽片段和来自用纯化的190-243多肽片段处理1小时的细胞的条件培养基跑电泳，并且进行考马斯染色(图5a)。在两种条件下，纯化的190-243多肽片段均显现为在约40kDa下的对应于四聚体的单一条带。无脂质apoA-I和rHDL作为全长蛋白质单体和二聚体参照被包括在凝胶上。
如图1a中所描绘，apoA-I在脱辅基状态下的结构显著不同于相同蛋白质在rHDL粒子中的结构组织方式。脂质结合过程的这个结构转换涉及α螺旋二级结构的重大增加(自脱辅基状态下的约44％至盘状HDL中的78％α螺旋二级结构)(Saito等(2004)JBiolChem279:20974-20981)。因为rHDL在刺激肌管中的葡萄糖摄取方面似乎比相应无脂质蛋白质更强效(比较图1b和1c中的葡萄糖摄取水平)，所以我们推测无脂质190-243多肽片段在溶液中可能采用两亲性α螺旋。为对这个进行探究，获得190-243多肽片段和全长蛋白质的CD光谱法光谱以供比较(图5)。由190-243多肽片段和全长apoA-I在222nm下的摩尔椭圆率估计它们的螺旋含量分别是28％和43％，从而表明190-243多肽片段的螺旋结构增加。图6显示对190-243多肽片段提出的螺旋结构的结构概述。
实施例5：apoA-I多肽对脂肪细胞中葡萄糖摄取的影响的研究
脂肪细胞制备
如先前所述制备脂肪细胞(Rodbell(1964)JBiolChem.239:375-80)。简要来说，切碎附睾脂肪垫，并且在含有10mM碳酸氢钠、30mMHEPES、200nM腺苷、1％牛血清白蛋白(BSA)的具有1mg/ml胶原蛋白酶的Krebs-Ringer-碳酸氢盐-HEPES(KRBH)缓冲液(pH7.4)中消化。在消化之后，细胞经尼龙筛(250μm)过滤，并且用KRBH缓冲液洗涤。
脂肪细胞中的葡萄糖摄取
用胰岛素(100nmol/l)、190-243多肽片段(具有由SEQIDNO:1组成的氨基酸序列)(30μg/ml)或1-243人apoA-I蛋白(150μg/ml)处理分离的大鼠脂肪细胞60分钟，随后通过添加UC14示踪葡萄糖(PerkinElmer)来测量葡萄糖摄取(30分钟)。通过穿过邻苯二甲酸二壬酯油进行离心来终止摄取。与细胞松弛素B一起孵育用于减去非特异性本底结合。葡萄糖的量被检测为通过β计数器测量的计数放射性。使用同位素标记的UC14测定来测量转运的葡萄糖的量。
如可由图9b所见，通过使脂肪细胞与胰岛素(100nmol/l)以及与190-243多肽片段(30μg/ml)一起孵育，葡萄糖摄取得以显著诱导。
本领域技术人员将了解可通过使用这个实施例的方法来测试具有氨基酸序列SEQIDNO:1至1035的根据本发明的多肽中的任一个对脂肪细胞中诱导的葡萄糖摄取的影响。
实施例6：用apo-A1源性肽进行治疗的体内作用
用人apoA-I190-243多肽片段(SEQIDNO:1)及其片段在高脂肪饮食喂食(HFD)小鼠模型中进行短暂治疗的体内作用的研究
动物和饮食
使用9-12周龄的雄性C57BL/6小鼠(Taconic)。在不限制食物和水的情况下使动物经受12小时光照循环。对HFD动物喂食HFD(D12492，60％脂肪含量；ResearchDiets)2周。所有动物程序都由瑞典隆德的马尔摩/隆德动物实验伦理学委员会(/LundCommitteeforAnimalExperimentEthics,Lund,Sweden)核准。
多肽
测试人ApoA-I的以下肽片段：
54-mer片段
由人ApoA-I的氨基酸190-243组成的片段(SEQIDNO:1)
27-mer片段
由人ApoA-I的氨基酸190-216组成的片段(SEQIDNO:7)
由人ApoA-I的氨基酸217-243组成的片段(SEQIDNO:8
23-mer片段
由人ApoA-I的氨基酸204-226组成的片段(SEQIDNO:518)
18-mer片段
由人ApoA-I的氨基酸190-207组成的片段(SEQIDNO:2)
由人ApoA-I的氨基酸208-225组成的片段(SEQIDNO:3)
由人ApoA-I的氨基酸226-243组成的片段(SEQIDNO:4)
葡萄糖耐受性测试
用如上所列的apoA-I肽(7mg/ml于PBS(pH7.4)中(对于54-mer片段)以及6-7mg/kg于PBS(pH7.4)中(对于其它片段)；对照动物接受NaCl)腹膜内(i.p.)注射禁食过夜(12小时)的HFD小鼠，并且在这之后在指示时间收集血清样品。在治疗之后3小时腹膜内注射葡萄糖(50mg/小鼠)，之后在指示时间收集血清样品。测量血糖水平(OnetouchUltra2；Lifescan)，并且使用ELISA(Mercodia)测定血清中的胰岛素水平。
统计分析
除非另外指示，否则所有数据都显示为平均值±SEM。当适当时，使用MicrosoftExcel和GraphPadPrism软件，通过双尾学生t检验或单因素ANOVA以及邦费罗尼氏事后检验来进行分析。p＝≤0.05被视为显著。
结果
如可在图10中所见，用190-243多肽片段(SEQIDNO:1)治疗显著改善葡萄糖耐受性测试中的胰岛素分泌(图10c、10d)和血糖清除(图10a、10b)，其中效率超过对照动物的效率。曲线下面积(AUC)测量结果显示在测试的时期(120分钟)期间由肽治疗的动物经受的总葡萄糖降低约40％。类似地，在测试的时期(120分钟)期间，葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加约60％。
如可在图11中所见，在apoA-I的190-243区域内的测试肽(23或27-mer)对葡萄糖耐受能力具有影响。肽23-mer(aa204-226，SEQIDNO:518)和27-mer(aa217-243，SEQIDNO:8)显示特别增加的血糖清除能力。结果显示基于190-243多肽片段的较短肽在改善葡萄糖耐受性方面是胜任的。
如可由图12所见，在apoA-I的190-243区域内的肽(18-mer)对葡萄糖耐受能力具有影响。肽18-mer(aa190-207，SEQIDNO:2)和18-mer(aa226-243，SEQIDNO:4)显示特别增加的血糖清除能力。结果显示基于190-243多肽片段的较短肽在改善葡萄糖耐受性方面是胜任的。
本领域技术人员将了解可通过使用这个实施例的方法来测试具有氨基酸序列SEQIDNO:1至1035的根据本发明的多肽中的任一个对改善葡萄糖耐受性的影响。
实施例7：治疗胰岛素抗性患者
罹患胰岛素抗性的人患者用盐水溶液(对照组)或每千克体重5mg由具有氨基酸序列SEQIDNO:1的人apoA-I190-243肽片段组成的多肽的盐水溶液治疗，所述盐水溶液在进餐之前30-60分钟内皮下注射。
治疗的目的在于诱导治疗的患者中的细胞葡萄糖摄取，并且降低空腹血浆葡萄糖水平，由此对葡萄糖代谢具有正面影响。视个体对药物治疗的应答而定，每天可需要2-5次推注注射，或者输注。
通过在进餐之前和之后的所选时间点，使用如YSI2300STATPlus(YSI,YellowSprings,OH)的葡萄糖氧化酶测定追踪血浆葡萄糖来测量对葡萄糖摄取的影响。
实施例8：治疗代谢综合征
在8周时期期间，在进餐之前30-60分钟内，用皮下注射的ApoA-I190-243多肽(SEQIDNO:1)每日2-5次治疗被诊断符合至少三个代谢综合征准则(腹部肥胖、男性HDL胆固醇小于40mg/dl以及女性HDL胆固醇小于50mg/dl、血压至少130/85mmHg、空腹血浆葡萄糖水平至少110mg/dl以及血浆甘油三酯至少150mg/dl)的人患者。
治疗的目的在于诱导治疗的患者中的细胞葡萄糖摄取，由此例如通过降低血压、空腹血浆葡萄糖水平或血浆甘油三酯水平，以及增加HDL胆固醇来对代谢综合征的征象具有正面影响。视个体对药物治疗的应答而定，每天可需要2-5次推注注射，或者输注。

Claims (104)

1.一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQIDNO:1；
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性；以及
c)a)或b)的生物活性片段，其中所述片段包含SEQIDNO:1的至少10个连续氨基酸
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度，并且
其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与所述氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，与所述氨基酸序列SEQIDNO:1具有更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选90％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％序列同一性。
3.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中在所述序列变体中，任一氨基酸残基已被改变成另一氨基酸残基，前提是相对于所述SEQIDNO:1，至多15个氨基酸已如此改变，如其中至多14个氨基酸已如此改变，例如其中至多13个氨基酸已如此改变，如其中至多12个氨基酸已如此改变，例如其中至多11个氨基酸已如此改变，如其中至多10个氨基酸已如此改变，例如其中至多9个氨基酸已如此改变，如其中至多8个氨基酸已如此改变，例如其中至多7个氨基酸已如此改变，如其中至多6个氨基酸已如此改变，例如其中至多5个氨基酸已如此改变，如其中至多4个氨基酸已如此改变，例如其中至多3个氨基酸已如此改变，如其中至多2个氨基酸已如此改变，例如其中至多1个氨基酸已如此改变。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽基本上由所述氨基酸序列组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽由所述氨基酸序列组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是其中所述的变体多肽，其中任何氨基酸已被改变来提供相对于所述氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的取代。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽在位置Ala1、Glu2、Tyr3、His4、Ala5、Lys6、Ala7、Glu9、Leu11、Leu14、Glu16、Lys17、Pro20、Leu22、Glu23、Asp24、Leu25、Arg26、Leu29、Pro31、Glu34、Lys37、Glu45、Glu46、Lys49、Lys50、Leu51、Gln54处包含相对于所述氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的氨基酸残基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽在位置Glu2、Tyr3、Leu11、Leu14、Glu16、Lys17、Pro20、Asp24、Leu29、Pro31、Glu34、Lys37、Glu45处包含相对于所述氨基酸序列SEQIDNO:1的保守的氨基酸残基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述特征在于高血糖症的疾病是代谢疾病。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是II型糖尿病
11.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是胰岛素抗性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是I型糖尿病。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病选自由内分泌和代谢疾病以及肥胖症组成的组。
14.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是选自由以下组成的组的内分泌和代谢疾病：非胰岛素依赖性糖尿病，如成年期发作型、成熟期发作型、非酮症性、稳定性、II型和年轻人的非胰岛素依赖性糖尿病。
15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是选自由以下组成的组的内分泌和代谢疾病：多囊卵巢综合征，如硬囊卵巢综合征和斯坦-利文撒尔综合征。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是内分泌和代谢疾病，如肥胖症，例如归因于过度摄入卡路里的肥胖症。
17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是葡萄糖耐受性测试异常，包括化学性和隐性糖尿病；葡萄糖耐受性受损；和/或糖尿病前期。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述疾病是选自由以下组成的组的代谢疾病：代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受性、高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常和多囊性卵巢综合征。
19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述代谢疾病是由选自肝中的胰岛素抗性、骨骼肌中的胰岛素抗性和/或脂肪组织中的胰岛素抗性的组的胰岛素抗性引起。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中待治疗的受试者是哺乳动物，优选是灵长类动物，更优选是人类。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述治疗导致骨髓和/或脂肪组织中的葡萄糖摄取增加。
22.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述治疗导致至少一子组的所述治疗的受试者的疾病改进。
23.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是经肠、经局部、经胃肠外或作为持续释放植入物的一部分施用或适合于经上述施用。
24.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述胃肠外施用是静脉内、皮下、肌肉内、颅内或腹膜内施用。
25.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述经肠施用是经口服、经直肠或经颊施用。
26.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述局部施用是经真皮、经上皮、经阴道、膀胱内、经肺、鼻内、气管内或以滴眼剂形式施用。
27.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是皮下或静脉内施用或适合于上述施用。
28.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是以每千克体重1μg-10,000μg，如每千克体重1μg-7,500μg，如1μg-5,000μg，如1μg-2,000μg，如1μg-1,000μg，如1μg-700μg，如5μg-500μg，如10μg至100μg的剂量施用或适合于以上述施用。
29.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述施用是每日重复。
30.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述施用是每周重复至少1-3次，如每周2-5次，如每周3-6次。
31.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述施用是每日重复1至8次，如每日2至5次。
32.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自由氨基酸序列SEQIDNO:1至1035组成的组的氨基酸序列。
33.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽基本上由选自由氨基酸序列SEQIDNO:1至1035组成的组的氨基酸序列组成。
34.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽由选自由氨基酸序列SEQIDNO:1至1035组成的组的氨基酸序列组成。
35.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自由氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的组的氨基酸序列。
36.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽基本上由选自由氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的组的氨基酸序列组成。
37.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽由选自由氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的组的氨基酸序列组成。
38.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:518组成的组的氨基酸序列。
39.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽基本上由选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:518组成的组的氨基酸序列组成。
40.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽由选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:518组成的组的氨基酸序列组成。
41.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的组的氨基酸序列。
42.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽基本上由选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8组成的组的氨基酸序列组成。
43.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽由选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:518组成的组的氨基酸序列组成。
44.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽包含所述氨基酸序列SEQIDNO:1。
45.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽基本上由所述氨基酸序列SEQIDNO:1组成。
46.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽由所述氨基酸序列SEQIDNO:1组成。
47.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽缀合于不源于人载脂蛋白A-I(apoA-I)的多肽和/或另一分子，如接头。
48.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽相较于SEQIDNO:1至1035中的任一个包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，相较于所述氨基酸序列SEQIDNO:1至1035中的一个或多个，所述取代、添加或缺失进一步增加所述肽的溶解性。
49.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽相较于SEQIDNO:1至1035中的任一个包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，相较于所述人载脂蛋白A-I，其增加哺乳动物细胞的葡萄糖摄取。
50.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽相较于SEQIDNO:1至1035中的任一个具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，相较于SEQIDNO:1至1035中的任一个的一种或多种氨基酸序列，其增加所述多肽在重组宿主细胞中或在体外翻译系统中的表达，或有助于在化学合成中产生。
51.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽被化学修饰以在向患者施用时增加它的半衰期，特别是它的血浆半衰期。
52.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含缀合于所述多肽的部分，由此产生部分缀合的多肽
53.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述部分缀合的多肽具有长于非部分缀合的多肽的血浆和/或血清半衰期的血浆和/或血清半衰期。
54.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述缀合于所述多肽的部分是选自由白蛋白、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)、酰化基团、抗体和抗体片段组成的组的一种或多种类型的部分。
55.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽和所述部分是通过接头彼此缀合。
56.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中一个以上部分缀合于所述多肽。
57.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述SEQIDNO:1至1035中的任一个具有治疗作用。
58.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽不包含GLP-1或GLP-1的生物活性片段或变体。
59.一种分离的多肽，其基本上由选自由所述氨基酸序列SEQIDNO:3、4或6组成的组的氨基酸序列组成。
60.一种分离的多肽，其由选自由所述氨基酸序列SEQIDNO:3、4或6组成的组的氨基酸序列组成。
61.一种分离的多肽，其基本上由选自由所述氨基酸序列SEQIDNO:9至1035组成的组的氨基酸序列组成。
62.一种分离的多肽，其由选自由所述氨基酸序列SEQIDNO:9至1035组成的组的氨基酸序列组成。
63.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列中的任一氨基酸残基已被改变成相应D-氨基酸。
64.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列中的所有氨基酸残基都已被改变成相应D-氨基酸。
65.一种分离的多核苷酸，其在表达后编码根据权利要求59至62中任一项所述的多肽。
66.一种如表达载体的载体，其包含根据权利要求65所述的多核苷酸。
67.一种宿主细胞，其包含根据权利要求65所述的多核苷酸和/或根据权利要求66至67中任一项所述的载体。
68.根据权利要求59至64中任一项所述的分离的多肽，根据权利要求65所述的分离的多核苷酸，根据权利要求66所述的载体，或根据权利要求67所述的宿主细胞，其用作医药。
69.一种药物组合物，其包含根据权利要求59至64中任一项所述的分离的多肽、根据权利要求65所述的分离的多核苷酸、根据权利要求66所述的载体、或根据权利要求67所述的宿主细胞。
70.根据权利要求69所述的药物组合物，其还包含用于治疗代谢疾病和/或心血管疾病的第二活性成分。
71.根据权利要求70所述的药物组合物，其中所述第二活性成分是用于治疗代谢疾病，或用于防治性治疗面临患上代谢疾病的风险的哺乳动物的化合物。
72.根据权利要求69至71中任一项所述的药物组合物，其中所述第二活性成分是用于治疗糖尿病的化合物。
73.根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物，其中所述第二活性成分是选自由胰岛素、胰岛素衍生物、二甲双胍或其衍生物组成的组的化合物。
74.根据权利要求69至73中任一项所述的药物组合物，其中所述第二活性成分是选自由利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β阻断剂、血液稀释剂，如阿司匹林；和降胆固醇药物，如士他汀或贝特类组成的组的化合物。
75.根据权利要求69至74中任一项所述的药物组合物，其中所述第二活性成分是选自由胰岛素、艾塞那肽、缓释艾塞那肽、利拉鲁肽、普兰林肽；磺酰脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑烷二酮、DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂、α-葡萄糖苷酶和胆汁酸螯合剂抑制剂组成的组的化合物。
76.根据权利要求59至62中任一项所述的分离的多肽，根据权利要求65所述的分离的多核苷酸，根据权利要求66所述的载体，或根据权利要求67所述的宿主细胞，其用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法。
77.一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含在表达后编码如权利要求1至64中任一项中定义的多肽的核酸序列。
78.一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的载体，所述载体包含含有在表达后编码如权利要求1至64中任一项中定义的多肽的核酸序列的多核苷酸。
79.根据权利要求78所述的载体，其还包含可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
80.根据前述权利要求78至79中任一项所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒和Mo-MLV，优选是腺相关病毒。
81.一种用于治疗或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法中的分离的宿主细胞，其中所述细胞用根据权利要求67所述的多核苷酸和/或权利要求78至80所述的载体转化或转导。
82.根据权利要求81所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
83.根据权利要求81和82中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：干细胞、肌肉细胞、肝细胞、脂肪细胞和胰腺细胞，如α细胞、β细胞和δ细胞。
84.根据权利要求83所述的细胞，其中所述宿主细胞选自由以下组成的组：CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、HiB5、RN33b和BHK细胞。
85.选自由以下组成的组的药剂的用途：
a)如权利要求1至64中任一项中定义的分离的多肽；
b)如权利要求77中定义的分离的多核苷酸；
c)如权利要求78至80中任一项中定义的载体；以及
d)如权利要求81至84中任一项中定义的分离的细胞，
所述药剂用于制备用于治疗和/或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的医药。
86.选自由以下组成的组的药剂的用途：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)所述氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的所述核酸分子的载体，
d)用b)的所述核酸或c)的所述载体转化或转导的分离的宿主细胞，
所述药剂用于制备用于治疗和/或预防特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的医药。
87.一种用于治疗特征在于高血糖症和/或胰岛素抗性的疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的选自由以下组成的组的药剂：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)所述氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的所述核酸分子的载体，
d)用b)的所述核酸或c)的所述载体转化或转导的分离的宿主细胞，
88.根据权利要求86所述的用途，或根据权利要求87所述的方法，其中所述多肽是如前述权利要求中任一项中所定义。
89.根据权利要求86所述的用途，或根据权利要求87所述的方法，其中所述多肽是如前述权利要求中任一项中所定义。
90.一种用于降低血糖的方法，所述方法包括使哺乳动物与有效量的选自由以下组成的组的药剂接触：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)所述氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的所述核酸分子的载体，
d)用b)的所述核酸或c)的所述载体转化或转导的分离的宿主细胞。
91.一种用于增加胰岛素分泌的方法，所述方法包括使哺乳动物与有效量的选自由以下组成的组的药剂接触：
a)分离的多肽，其由小于100个氨基酸残基组成，并且包含：
i)所述氨基酸序列SEQIDNO:1；或
ii)i)的所述氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
iii)i)至ii)中的任一个的至少10个连续氨基酸的生物活性片段，
b)编码如a)中定义的多肽的核酸序列；
c)包含如b)中定义的所述核酸分子的载体，
d)用b)的所述核酸或c)的所述载体转化或转导的分离的宿主细胞。
92.一种用于治疗或预防由高血糖症所致的心血管疾病的方法中的分离的多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)所述氨基酸序列SEQIDNO:1；以及
b)a)的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性，
其中所述多肽具有小于100个氨基酸的长度，并且其中所述生物活性是诱导细胞中的葡萄糖摄取。
93.根据权利要求82所述的多肽，其中所述疾病选自由以下组成的组：脂蛋白代谢病症和其它脂质血症；血液测定结果异常；动脉、小动脉和毛细血管疾病；缺血性和其它心脏疾病。
94.根据权利要求92至93中任一项所述的多肽，其中所述疾病是脂蛋白代谢病症和其它脂质血症，如选自由以下组成的组的脂蛋白代谢病症和其它脂质血症：单纯性高胆固醇血症，如家族性高胆固醇血症；IIa型弗雷德里克森高脂蛋白血症；高β脂蛋白血症；A组高脂血症；和低密度脂蛋白型[LDL]高脂蛋白血症。
95.根据权利要求92至94中任一项所述的多肽，其中所述脂蛋白代谢病症和其它脂质血症选自由以下组成的组：单纯性高甘油三酯血症，包括内源性高甘油三酯血症；IV型弗雷德里克森高脂蛋白血症；B组高脂血症；高前β脂蛋白血症；和极低密度脂蛋白型[VLDL]高脂蛋白血症。
96.根据权利要求92至95中任一项所述的多肽，其中所述脂蛋白代谢病症和其它脂质血症选自由以下组成的组：混合型高脂血症，如宽β脂蛋白血症或漂浮β脂蛋白血症；IIb或III型弗雷德里克森高脂蛋白血症；高β脂蛋白血症伴有前β脂蛋白血症；高胆固醇血症伴有内源性高甘油三酯血症；C组高脂血症；结节发疹性黄瘤；和结节性黄瘤。
97.根据权利要求92至96中任一项所述的多肽，其中所述脂蛋白代谢病症和其它脂质血症选自由以下组成的组：高乳糜微粒血症，如I或V型弗雷德里克森高脂蛋白血症；D组高脂血症；和混合型高甘油三酯血症。
98.根据权利要求92至97中任一项所述的多肽，其中所述脂蛋白代谢病症和其它脂质血症选自由以下组成的组：其它高脂血症，如家族性复合型高脂血症。
99.根据权利要求92至98中任一项所述的多肽，其中所述脂蛋白代谢病症和其它脂质血症选自由以下组成的组：脂蛋白缺乏症，如无β脂蛋白血症、高密度脂蛋白缺乏症、低α脂蛋白血症；低β脂蛋白血症(家族性)；卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症和丹吉尔氏病。
100.根据权利要求92至99中任一项所述的多肽，其中所述动脉、小动脉和毛细血管疾病选自由以下组成的组：动脉粥样硬化，如小动脉硬化；动脉硬化性血管疾病；粉瘤；动脉性退化；动脉血管性退化和血管性退化。
101.根据权利要求92至100中任一项所述的多肽，其中所述动脉、小动脉和毛细血管疾病选自由以下组成的组：动脉粥样硬化性心脏病，如冠脉(动脉)心脏病。
102.根据权利要求92至101中任一项所述的多肽，其中所述缺血性和其它心脏疾病选自由以下组成的组：心绞痛、心肌梗塞；主动脉瓣狭窄；和代谢疾病中的心肌病变。
103.根据权利要求92至102中任一项所述的多肽，其中所述心血管疾病的特征在于身体组成部分内的脂质水平或含脂质沉积物不正常。
104.根据权利要求92至103中任一项所述的多肽，其中所述心血管疾病选自由以下组成的组：急性冠脉综合征、动脉粥样硬化、血管中的动脉粥样硬化性斑块、瓣膜狭窄、感染性休克、心绞痛、心肌梗塞、不稳定性心绞痛、动脉狭窄、外周动脉疾病(PAD)、颈动脉狭窄、脑动脉狭窄、冠状动脉狭窄、血管性痴呆、再狭窄、脆性斑块和一时性黑蒙。
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