JP2016502404A - 治療剤の送達方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞由来の小胞を介した潜在的治療剤の送達に関する。
癌は、全世界で死因の第1位となっている。世界保健機関(WHO)によると、2008年には様々な癌を原因とする死亡例が760万例であった(全死亡例の約13%)。この数は増え続けると予測されており、2030年には全世界で1310万の死亡をもたらすと推定される[GLOBOCAN 2008 (IARC) Section of Cancer Information (11/11/2012)](非特許文献1)。
(a) ヒト癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの遺伝子産物を阻害することができる核酸をコードするDNA配列を、哺乳動物細胞に導入する工程;
(b) オリゴヌクレオチドインヒビターの発現を可能にする条件下で、該細胞を維持する工程;および
(c) 該細胞から、該オリゴヌクレオチドインヒビターを含むナノ小胞を入手する工程。
(a) 該癌細胞を有する患者に、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトした細胞を投与する工程であって、該DNA配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、工程;および
(b) 該誘導性プロモーターを活性化させる物質の投与によってインヒビターオリゴヌクレオチドの発現を誘導する工程。
本発明は、哺乳動物細胞を含む細胞に起因するナノ小胞が、重要な細胞機能を標的とする潜在的な治療用インヒビター分子の送達のためのビヒクルとして使用可能であり、先行技術の送達技術と比較して、その効果が増大し有害な副作用のリスクが低下しているという認識に基づくものである。
最初にGPIアンカータンパク質またはI-CAM1のいずれかと共にEGFまたはMSHをインフレームで発現するpCMV-zeoベクターを作製し、HEK 293細胞または間葉系幹細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、ゼオシンで処理し、磁気ビーズまたはセルソーターを用いて、EGFまたはMSHの表面発現に基づき耐性細胞を選別する。トランスジェニック発現の維持は、フローサイトメトリーによりルーチンでモニターしてもよい。
A.c-Mycに非依存的であるようにするヒト細胞の改変
マウスレトロウィルス受容体(mCAT-1)と、IRES(キャップ非依存的翻訳を可能にする)によって隔てられているN-Myc:GFP融合物を含む哺乳動物発現ベクターを、HEK 293T細胞または間葉系幹細胞にトランスフェクトする。使用する細胞株は、職員の安全性の向上のため、マウス特異的エンベロープ偽型レンチウィルスに対するエコトロピック受容体を備えていてもよい。さらに、クローニングのためにpcDNA-neoベクターを用いて、ネオマイシン耐性カセットを発現させることも可能である。代替として、インヒビターがc-Mycに指向している場合、N-Myc遺伝子の代わりに、発現ベクターはL-myc遺伝子を含有していてもよい。
Sigma Aldrich, USA(MISSION TRCpLKO-puro clones)から入手した、SEQ ID NO:185〜196からなる群より選択される配列を有するレンチウィルスプラスミドを、HEK 293T細胞にトランスフェクトする。細胞にトランスフェクトする際、3'の長い末端反復内の欠失によって複製能がなく、自己不活性化されているHIV-1ベースの転写物を作製する。さらにレンチウィルスベクターを、pCMV-dR8.2 dvprおよびpHCMV-Eco(どちらもAddgene plasmid depositoryから入手)と同時トランスフェクションし、前者はHIV-GAGを発現する最小限のベクターを含有し、後者はエコトロピックエンベロープを含有する。したがってHEK 293T細胞が産生するレンチウィルスは、複製能がなく、実施例2Aに記載のようにマウス細胞またはマウスレトロウィルス受容体(mCAT1)を発現する細胞にのみ感染することができる。次に、HEK 293T細胞を培養し、トランスフェクトした細胞由来のウィルスを含む細胞培養物の上清を用いて、mCAT1を発現するヒト細胞の形質導入を行い、その後ピューロマイシン(レンチウィルスプラスミドによってコードされる)によって選択する。mCAT1を発現するヒト細胞は、N-Myc遺伝子には依存的であるが、ヒト標的遺伝子、例えばc-Mycには非依存的であるため、その成長と生存は、ヒト標的遺伝子、例えばヒトc-Mycに指向するインヒビター分子の発現には影響され得ない。
ナノ小胞およびまたは天然の細胞外小胞の単離は、遠心分離工程を含む公知の手順により行うことができる。例えば、人工ナノ小胞をUS 2012/0177574に記載のように作製してもよい。核膜から生じる人工の高密度小胞を、短い遠心分離工程によって取り出すことができる。例えばEGF受容体を標的とする分子を発現するナノ小胞を、advanced FACSソーティングプロトコール、磁気法、または任意の他の方法のいずれかを用いて、抗体技術を用いて、陽性選択または陰性選択のいずれかにより精製してもよい。
A.Mycタンパク質に対するインヒビターをコードするDNA配列(誘導性発現)のヒト細胞への導入
テトラサイクリン(ドキシサイクリン)またはIPTG誘導性発現システムを、所望のインヒビター分子のDNA配列(ここではSEQ ID NO:185〜218のいずれか一つに記載のDNA配列)をクローニングするために用いる。例えば、pLKO-TetON-puroシステム(Addgene)またはpLKO_IPTG_3xLacOシステム(Sigma)を用いてもよい。
ナノ小胞およびまたは天然の細胞外小胞の単離は、遠心分離工程を含む公知の手順により行うことができる。例えば、人工ナノ小胞をUS 2012/0177574に記載のように作製してもよい。核膜から生じる人工の高密度小胞を、短い遠心分離工程によって取り出すことができる。例えばEGF受容体を標的とする分子を発現するナノ小胞を、advanced FACSソーティングプロトコール、磁気法、または任意の他の方法のいずれかを用いて、抗体技術を用いて、陽性選択または陰性選択のいずれかにより精製してもよい。
A.MycインヒビターをコードするDNA配列のマウス細胞への導入
Sigma Aldrich, USA(MISSION TRCpLKO-puro clones)から入手した、SEQ ID NO:185〜218からなる群より選択される配列を有するレンチウィルスプラスミドを、HEK 293T細胞にトランスフェクトする。細胞にトランスフェクトする際、3'の長い末端反復内の欠失によって複製能がないHIV-1ベースの転写物を作製する。さらにレンチウィルスベクターを、pCMV-dR8.2 dvprおよびpHCMV-Eco(どちらもAddgene plasmid depositoryから入手)と同時トランスフェクションし、前者はHIV-GAGを発現する最小限のベクターを含有し、後者はエコトロピックエンベロープを含有する。したがってHEK 293T細胞が産生するレンチウィルスは、複製能がなく、マウス細胞にのみ感染することができる。次に、HEK 293T細胞を培養し、トランスフェクトした細胞由来のウィルスを含む細胞培養物の上清を用いて、NIH 3T3マウス線維芽細胞の形質導入を行い、その後ピューロマイシン(レンチウィルスプラスミドによってコードされる)によって選択する。マウス線維芽細胞は、ネイティブのマウス遺伝子には依存的であるが、ヒト標的遺伝子、例えばc-Mycには非依存的であるため、その成長と生存は、ヒト標的遺伝子、例えばヒトc-Mycに指向するインヒビター分子の発現には影響され得ない。
ナノ小胞および/または天然の細胞外小胞の単離は、遠心分離工程を含む公知の手順により行うことができる。例えば、人工ナノ小胞をUS 2012/0177574に記載のように作製してもよい。核膜から生じる人工の高密度小胞を、短い遠心分離工程によって取り出すことができる。例えばEGF受容体を標的とする分子を発現するナノ小胞を、advanced FACSソーティングプロトコール、磁気法、または任意の他の方法のいずれかを用いて、抗体技術を用いて、陽性選択または陰性選択のいずれかにより精製してもよい。
Claims (25)
- 以下の工程を含む、癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの遺伝子産物に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を作製する方法:
(a) ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を、哺乳動物細胞に導入する工程;
(b) 該細胞に該インヒビターオリゴヌクレオチドを発現させる条件下で、該細胞を維持する工程;および
(c) 該細胞から、該インヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を入手する工程。 - 前記インヒビターオリゴヌクレオチドが、ヒトMYC遺伝子または遺伝子産物に対する、好ましくはc-Myc遺伝子または遺伝子産物に対するインヒビターである、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがRNA、好ましくはRNAi分子である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードする前記DNA配列が、SEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196からなる群より選択されるDNA配列である、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞表面でターゲティング分子を発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程 (a) の前または工程 (a) と同時に、該細胞表面で発現されるターゲティング分子をコードするDNA配列を導入する工程を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲティング分子が、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に特異的に結合するリガンドである、請求項5または6に記載の方法。
- 前記ターゲティング分子が、上皮増殖因子(EGF)、メラニン細胞刺激ホルモン(MSH)、または、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に指向する抗体の可変領域もしくは該抗体のfab断片である、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞に、N-MycまたはL-Myc遺伝子を含む構築物がトランスフェクトまたは形質導入され、該細胞がN-MycまたはL-Mycを過剰発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程 (a) が、動作可能なように誘導性プロモーターに連結された、ヒトc-Mycを阻害できるオリゴヌクレオチドをコードする前記DNA配列を含む遺伝子構築物を導入することを含み、工程 (b) が、該誘導性プロモーターの活性化により発現を誘導することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロまたはエクスビボで実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって作製される、単離されたナノ小胞。
- ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含む、単離されたナノ小胞。
- 前記癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子が、MYC遺伝子および遺伝子産物のファミリーのメンバーであり、より好ましくはヒトc-Mycまたはヒトc-Mycをコードする遺伝子である、請求項13または14に記載の単離されたナノ小胞。
- 前記癌遺伝子または癌原遺伝子が、E2F遺伝子または遺伝子産物のファミリーのメンバーであり、より好ましくはヒトE2f1、E2f2、もしくはE2f3またはヒトE2f1、E2f2、もしくはE2f3をコードするヒト遺伝子である、請求項13または14に記載の単離されたナノ小胞。
- 前記オリゴヌクレオチドがRNA、好ましくはRNAi分子である、請求項13〜16のいずれか一項に記載の単離されたナノ小胞。
- 前記RNAが、SEQ ID NO: 93〜102からなる群より選択される配列を含むshRNAまたはsiRNAである、請求項17に記載の単離されたナノ小胞。
- マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって作製された人工ナノ小胞である、請求項14に記載の単離されたナノ小胞。
- 遺伝子を含む遺伝子構築物をトランスフェクトまたは形質導入したヒト細胞であって、該遺伝子の遺伝子産物が、該ヒト細胞によって天然に発現されるヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子と機能的に置き換わり、該細胞が、該ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列をさらに含む、ヒト細胞。
- 前記ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子が、MYC遺伝子ファミリーの1つのメンバーによってコードされ、前記遺伝子構築物が、MYC遺伝子ファミリーの別のメンバーを含む、請求項20に記載のヒト細胞。
- ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対する、好ましくはヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトしたヒト細胞であって、該DNA配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、ヒト細胞。
- 前記DNA配列が、SEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196からなる群より選択される、請求項20または22に記載のヒト細胞。
- 幹細胞、好ましくは胚性幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項20〜23のいずれか一項に記載のヒト細胞。
- 請求項13〜19のいずれか一項に記載のナノ小胞と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
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