JP2016198066A - ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ニトリルヒドラターゼ又はニトリルヒドラターゼの形態が精製酵素、粗精製酵素、酵素を含む菌体、酵素または酵素を含む菌体の固定化物、酵素を含む菌体を含む培養液である凍結体の工業的な解凍方法の提供。
【解決手段】ニトリルヒドラターゼを含有する菌体及び／又はその菌体処理物の凍結体を解凍する際に、解凍浴槽１の解凍液の一部を解凍浴槽１へ戻すための循環ポンプ３を備えた外部循環ライン２を解凍浴槽１に設置し、循環ポンプ３による循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値W/V[１/ｈ]を０．３以上とし、更に外部循環ライン２に温度制御装置を付け、解凍液の温度を５〜２５℃の範囲に制御する、酵素の活性低下を抑制する解凍方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、アミド化合物の生産など工業的に有用であるニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法に関するものである。

アミド化合物の主要な製造方法の一つとして、ニトリル化合物を原料とする水和法は多くの場合に用いられており、アクリルアミド等のアミド化合物の工業的製法としては、例えば、ラネー銅等などの金属銅触媒を触媒として用い、アクリロニトリル等のニトリル化合物を水和する方法、あるいは近年ではニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物等を触媒として用い、ニトリル化合物を水和する方法が知られている。
ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を触媒として用いる方法は、アクリロニトリル等のニトリル化合物の転化率および選択率が高いことから工業的に注目を浴びている。

ニトリルヒドラターゼなどの酵素は一般にその活性の低下を抑制する目的で、凍結された状態で-２０℃以下の冷凍庫などに保存されている。酵素の凍結保存の状態は一般的には、アンプルや凍結保存用の容器に培養液もしくは集菌液の状態で凍結されている。このように凍結保存されている酵素は、必要に応じて解凍し、各種酵素反応に用いられる。この解凍の際に重要なことは活性の低下を起こさぬように解凍することである。活性低下の主要因は、解凍における熱履歴であると考えられ、短時間かつ低温にて解凍することが望ましい。ここで活性低下とは、解凍前の活性に対し解凍後の活性が減少することを示し、活性低下が無いことが理想であるが、熱履歴による活性低下は避けられず、解凍前の活性に対する解凍後の活性の比率で表す活性残存率は、５０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましい。

凍結された酵素は、一般的には室温で自然解凍する方法がとられているが、酵素を工業的に大量使用する際の解凍方法は、ほとんど知られていない。
凍結された細胞の解凍方法に関しては、これまでにも検討が行われており、例えば、特許文献１には、水不透過性を有する袋を用い、１〜３７℃の温度範囲の水に浸漬することにより動物細胞を解凍する方法が開示されている。あるいは、例えば、特許文献２には、解凍装置に気体を流通させることにより熱交換を行い、動物細胞を解凍する方法が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも少量の細胞の解凍方法を開示するのみであり、工業的な酵素利用を考慮した規模における解凍方法とは言いがたい。

特許文献３には、酵素を含む菌体を含む培養液である凍結体の失活の少ない工業的な解凍方法として、解凍浴槽水温を５〜２５℃とすることを特徴とするニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法が開示され、さらに、効果的な方法として解凍時に振とうする方法が開示されている。しかしながら、解凍浴槽水温を制御するのみでは解凍時の活性低下を抑制するには不十分であり、振とうするための装置を用いることは、工業的な生産規模を考慮すると、解凍装置の設備費用が増大し経済的に好ましくない。
上記の観点から、工業的な生産規模において、より効率的な解凍方法が求められている。

特開２００４-９７１６９号パンフレット 特開２００４-９７１７０号パンフレット 特開２００３-３２５１７２号パンフレット

本発明の課題は、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物の凍結体を解凍するに際し、凍結体に含まれる酵素の活性低下の少ない工業的な解凍方法を提供することである。

本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物の凍結体を解凍する際に、解凍浴槽の解凍液の一部を解凍浴槽へ戻すための循環ポンプを備えた外部循環ラインを解凍浴槽に設置し、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値W/V[１/ｈ]が、０．３以上であることを特徴とする解凍方法により上記課題を解決できることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明には以下の事項が含まれる。
＜１＞ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物の凍結体を解凍する方法であって、解凍浴槽の解凍液の一部を外部循環ラインに循環させ、循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値W/V[１/ｈ]が、０．３以上であることを特徴とする解凍方法
＜２＞前記外部循環ラインに温度制御装置を有することを特徴とする前記＜１＞に記載の解凍方法
＜３＞前記解凍液の温度が５〜２５℃の範囲内である前記＜１＞または＜２＞に記載の解凍方法

本発明においては、工業的な方法にてニトリルヒドラターゼ凍結体を解凍するに際し、特に凍結解凍をするに際し、酵素の活性低下を抑制することができる。本発明はニトリルヒドラターゼの産業上の利用において、有用な解凍方法である。ここで酵素の活性とは、実施例記載の方法で測定したニトリル化合物の水和活性をいう（以下、「ニトリルヒドラターゼ活性」ともいう）。

図１は、本発明の解凍装置の一実施形態を示す模式図である。 図２は、本発明の解凍装置の一実施形態を示す模式図である。 図３は、本発明の解凍装置の一実施形態を示す模式図である。

本発明のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法について、以下にその詳細を説明する。

〔ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法〕
＜ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物＞
本発明は、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物（以下、これらを単に「菌体触媒」ともいう。）の凍結体の解凍方法を提供するものである。
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力（以下、「ニトリルヒドラターゼ活性」ともいう。）を有する酵素（たんぱく質）をいう。

ニトリルヒドラターゼを含有する菌体としては、ニトリルヒドラターゼを産出し、かつニトリル化合物およびアミド化合物の水溶液中でニトリルヒドラターゼ活性を保持している菌体であれば特に限定されない。ニトリルヒドラターゼを産生する菌体としては、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バクテリジューム（Bacteridium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する菌体などが挙げられる。これらは一種で用いても二種以上を併用しても良い。

また、これら菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体、および組換えＤＮＡ技術を用いて該ニトリルヒドラターゼの構成アミノ酸の一個または二個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体なども挙げられる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６ 独立行政法人 品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７８５として、特許手続き上の菌体の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。

これら菌体の中でも、高活性、高安定性のニトリルヒドラターゼを有するという点で、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する菌体、および該菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体、および変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体形質転換体が好ましい。なお、上記形質転換体は、ニトリルヒドラターゼの安定性をより高め、菌体当たりの活性がより高い点で好ましい。

また、菌体内にニトリルヒドラターゼを高発現できる、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１、該菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体も同様に好ましい。上記ニトリルヒドラターゼを産生する菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法により調製できる。

本発明に係る組換えベクターは、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を含有するものであり、ベクターにニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を連結することにより得ることができる。ベクターとしては、特に限定されるものではなく、例えばpET-21a(+)、pKK223-3、pUC19、pBluescriptKS(+)およびpBR322等に代表される市販の発現プラスミドに、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を組み込むことにより、該ニトリルヒドラターゼの発現プラスミドを構築することができる。また、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自己増殖可能で、さらに外来のＤＮＡの形質が発現できるものであれば良く、例えば大腸菌が好例として挙げられるが、大腸菌だけに限らず枯草菌、酵母等に導入することにより、ニトリルヒドラターゼの生産能を有する形質転換体を得ることができる。

上述のようなニトリルヒドラターゼを生産する菌体は、公知の方法により、適宜培養し増殖させ、ニトリルヒドラターゼを生産させても良い。この場合使用される培地としては炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養素を適量含有する培地であれば合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等の通常の液体培地に、菌体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でも良い。）で培養させることにより調製できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。形質転換体の培養温度としては、１５〜３７ ℃が好ましい。培養条件は、特に限定されるものではなく、培養の種類、培養方法により適宜選択すれば良く、菌株が生育しニトリルヒドラターゼを生産することが出来れば良い。

本発明では上述のニトリルヒドラターゼを生産する菌体を、遠心等による集菌や、破砕し菌体破砕物を作製する等、さまざまな処理を行っても良く、これらのなんらかの処理を施した菌体を菌体処理物と総称する。

破砕される菌体の形態としては、ニトリルヒドラターゼを産生する菌体を含む限り特に限定はされず、例えば、該菌体を含む培養液そのもの、その培養液を遠心分離して分離・回収された集菌体、さらにこの集菌体を生理食塩水等で洗浄したものなどが挙げられる。
本発明においては、上述のニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物の凍結体を用いる。

凍結体の温度としては、菌体および/またはその菌体処理物が凍結する温度であれば特に限定はされるものではないが、好ましくは０℃以下、より好ましくは-１０℃以下である。凍結体の容積としては、特に限定されるものではないが、工業的な利用を考慮すると、通常０．１L以上、好ましくは、０．１〜１０００L、より好ましくは、１〜１００Lである。凍結体の表面積としては、特に限定されるものではないが、通常０．０４ｍ^２以上、好ましくは、０．０４〜１０ｍ^２、より好ましくは、０．０７〜１．５ｍ^２である。
また、菌体触媒の凍結方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、冷却した空気を用いる方法、不凍液を用いる方法、さらには、液化ガスを用いる方法が挙げられる。好ましくは、冷却した空気を用いる流動式空気凍結法である。

＜解凍浴槽＞
解凍浴槽は、内部に解凍液を一定温度で保有し、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物の凍結体を解凍する機能を有する。解凍浴槽に用いられる解凍液としては、特に限定されるものではなく、解凍温度を維持できる任意の液体を用いることができるが、コストあるいは取扱いの容易性の観点から水を用いることが好ましい。解凍浴槽の容積は、特に限定するものではないが、工業的な生産を考慮すると、通常０．１ｍ³以上、好ましくは０．１〜５０ｍ³、より好ましくは０．１〜１０ｍ³である。

解凍浴槽には、酵素の活性低下を抑制する観点から、循環ポンプを備えた外部循環ラインが設置されることが好ましい。循環ポンプを備えた外部循環ラインは、解凍浴槽に一つ設置されていても、複数設置されていても良い。外部循環ラインに備えられた循環ポンプを用いて、解凍液の一部が解凍浴槽内から取り出され、外部循環ラインを経由して解凍浴槽へ戻される。

本発明において、解凍浴槽から解凍液が排出されるポートであって、かつ外部循環ラインへ接続されたポートを「解凍液出口」ともいい、解凍液出口から排出された解凍液が解凍浴槽に供給されるポートであって、かつ外部循環ラインに接続されたポートを「解凍液入口」ともいい、外部循環ラインを介して循環される解凍液を「循環液」ともいう。

解凍浴槽は、解凍液出口および解凍液入口を有する。解凍液出口の設置箇所は特に限定するものでなく、任意の場所を選択できるが、解凍浴槽内の解凍液の排出の容易性の観点から、例えば、解凍液出口を解凍浴槽の底部付近に設けることが好ましい。解凍液入口の設置箇所は特に限定するものでなく、任意の場所を選択できるが、解凍浴槽内の解凍液の混合の効率の観点から、例えば、解凍液入口を解凍液中に配置して、循環液を解凍液中に供給することが好ましい。解凍液入口の形状は特に限定するものでなく、任意の形状を選択できるが、解凍浴槽内の解凍液の混合の効率の観点から、例えば、解凍液入口の断面積を外部循環ラインの断面積より小さくすることで、解凍液入口における循環液の線速度を大きくすることが好ましい。解凍液入口の数は、特に限定するものでなく、任意の数を選択できる。解凍液入口の数は一つでも良く、複数でも良い。例えば、外部循環ラインを解凍液中に配置する配管とし、当該配管へ複数の穴をあけることで解凍液入口を複数にすることは、解凍浴槽内の解凍液の混合の効率の観点から好ましい。

循環ポンプによる解凍液の循環は、循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値W/V[１/ｈ]が０．３以上となる値で実施される。W/V[１/ｈ]が０．３以上となる値で実施される場合には、ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍を効率的に実施でき、活性の低下を抑制することが出来るため好ましい。また、W/V[１/ｈ]が０．３未満となる場合には、ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍効率が低下するため、解凍に長時間を要するか、あるいは、解凍のための解凍液の温度を高くする必要があり活性を維持することが困難である。

W/V[１/ｈ]の上限値については、０．３以上となる値であれば特に限定はされないが、１００倍以下が好ましく、５０倍以下がより好ましい。W/V[１/ｈ]が１００倍を超える場合には、エネルギー使用量が過大となるためである。
外部循環ラインに備えられた循環ポンプは、特に限定されるものではなく、例えば、遠心ポンプ、傾斜ポンプあるいは軸流ポンプなどのターボ式ポンプや、往復ポンプや回転ポンプなどの容積型ポンプなどが挙げられる。

解凍浴槽内の解凍液量は、特に限定するものではなく、任意の量を選択できるが、解凍槽内の解凍液量が解凍する凍結体の容量に対して少なすぎる場合には、解凍の効率が低下するために好ましくない。また、解凍槽内の解凍液量が解凍する凍結体の容量に対して多すぎる場合には、解凍装置の容積効率が低下するなど好ましくない。解凍槽内の解凍液量は、解凍に供する凍結体の容量に対して０．１倍〜１００倍の範囲が好ましく、０．５倍〜５０倍の範囲がより好ましく、１〜１０倍の範囲がさらに好ましい。

解凍浴槽の解凍液の温度は、高すぎる場合には、活性の低下が引き起こされ好ましくない。また、温度が低すぎる場合には、解凍に長時間が必要となり好ましくない。解凍浴槽の解凍液の温度としては、通常０〜３０℃であり、好ましくは、５〜２５℃であり、より好ましくは、１０〜２０℃である。

解凍浴槽内の混合状態によっては解凍液には温度分布が生じる場合がある。温度分布とは、温度検知部の位置によって規定温度以外の温度の箇所が生じることを意味する。解凍浴槽内の温度分布の幅は、通常５℃未満、好ましくは、２℃未満、より好ましくは、１℃未満である。温度分布は生じないことが好ましいことから、温度分布の幅の下限は０℃であることが好ましいが、例えば、下限値が０．１℃であっても実用上は問題がないのが通常である。

解凍液の温度は解凍槽内の任意の箇所で測定可能であり、特に限定するものではないが、外部循環ラインに温度制御装置を有している場合には、解凍液出口、解凍液入口あるいは外部循環ライン上で温度を測定することが好ましい。

解凍浴槽は、温度制御装置を有していても良く、温度制御装置を有していなくても良いが、ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍における解凍液温を制御する観点から、温度制御装置を有することが好ましい。解凍浴槽が温度制御装置を有する場合の温度制御装置は、解凍浴槽に設置される外部循環ライン上に設けても良く、解凍浴槽自体に設けても良い。

解凍浴槽における温度制御装置としては、例えば、熱交換器が挙げられる。熱交換器としては、例えば、多管円筒式熱交換器、渦巻管式熱交換器、渦巻板式熱交換器、プレート式熱交換器、二重管式熱交換などの解凍浴槽の外部循環ラインに設置する形態のもの、あるいはジャケット式熱交換器、コイル式熱交換器などの解凍浴槽に直接設置する形態のものが挙げられる。
解凍浴槽の圧力は、特に限定するものではなく、任意の圧力を選択できるが通常は常圧である。

解凍浴槽は攪拌機を有していても良く、攪拌機を有していなくても良い。菌体触媒貯槽が攪拌機を有する場合の攪拌機の攪拌翼は任意の形状のものを選択でき、例えば、プロペラ翼、フラットパドル翼、ピッチドパドル翼、フラットタービン翼、ピッチドタービン翼、リボン翼、アンカー翼、フルゾーン翼などが挙げられる。攪拌翼は、１枚であっても良く、複数枚備えていても良い。

〔ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍装置〕
本発明のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍装置は、ニトリルヒドラターゼ凍結体を解凍する解凍浴槽と解凍浴槽の解凍液の一部を解凍浴槽へ戻すための循環ポンプを備えた外部循環ラインを備えることを特徴とする。
解凍浴槽については、ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法にて記載した通りである。

本発明の菌体触媒の凍結体を解凍する際に用いる解凍装置の具体例について、図面を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
図1は、ジャケット式熱交換器４を備える解凍浴槽１と、解凍浴槽には外部循環ライン２を備える解凍装置である。外部循環ライン上には循環ポンプ３を備える。
図２は、コイル式熱交換器４を備える解凍浴槽１と、解凍浴槽には外部循環ライン２を備える解凍装置である。外部循環ライン上には循環ポンプ３を備える。
図３は、外部循環ライン２を備える解凍浴槽１と、外部循環ライン上には循環ポンプ３と、熱交換器４を備える解凍装置である。

以下に本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
〔ニトリルヒドラターゼ凍結体の調製〕
特開２００１−３４００９１号公報の実施例１に記載の方法に従いＮｏ．３クローン菌体を取得し、同じく、同実施例１の方法、すなわち下記方法で培養してニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体を得た。

本菌株の培養は９０Ｌの培養槽に下記の組成の培地４５．０Ｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、上記Ｎｏ．３クローン菌体を一白金耳植菌し、３７℃・７００ｒｐｍにて４０時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、分離した液に流動性を持たせるため固形分率が約１５重量％となるように遠心分離時の上澄み液を加えて湿菌体（以下集菌液）を得た。この一部をサンプリングし下記方法にてニトリルヒドラターゼ活性測定した。
培地組成 酵母エキストラクト ５．０ｇ／Ｌ
ポリペプトン １０．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ５．０ｇ／Ｌ
塩化コバルト・六水和物 １０．０ｍｇ／Ｌ
硫酸第二鉄・七水和物 ４０．０ｍｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
次に集菌液を２０Ｌのポリプロプレン製の容器（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ充填し、−２５℃の温度の冷凍庫にて凍結し、ニトリルヒドラターゼ凍結体を得た。

〔ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍〕
解凍浴槽として縦７０ｃｍ、横１３０ｃｍ、高さ５０ｃｍの箱型の浴槽を準備した。解凍浴槽にはジャケット式熱交換器が設置されている。また、解凍浴槽には循環ポンプを備えた外部循環ラインが設置され、解凍浴槽内の解凍液の一部は抜き出され、外部循環ラインを経由して解凍浴槽へ戻される。

解凍浴槽には、解凍液として１００Ｌの水を仕込んだ。上記方法で得られたニトリルヒドラターゼ凍結体の容器８つ(８ｘ１８Ｋｇ、-２５℃)を解凍浴槽へ入れ、解凍液を外部循環ライン上に設置した循環ポンプを用いて０．１ｍ³／ｈの流速で解凍浴槽より抜き出し、外部循環ラインを経由して解凍浴槽へ戻した。解凍液入口で測定した解凍液が１５±０．５℃の範囲の液温になるようにジャケット式熱交換器を用いて温度制御を行った。解凍浴槽の圧力は常圧である。

解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．１ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は１[１/ｈ]であった。

解凍開始から２４時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。

次に解凍液のサンプリングを実施し、そのニトリルヒドラターゼ活性を測定した。ニトリルヒドラターゼ活性の指標として、活性残存率を次式にて求めた。解凍前の活性を１００とした時の解凍後の活性を相対値として表す指標である。
活性残存率（％）＝（解凍後の活性／解凍前の活性）×１００
上記条件で解凍した解凍液の活性残存率は、９３％であった。

(ニトリルヒドラターゼ活性の測定方法)
サンプリングした菌体を含む解凍液のニトリルヒドラターゼ活性を以下の方法で測定する。解凍液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で１０分間反応させる。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を高速液体クロマトグラフィー分析により測定する。

ここで分析条件は以下の通りである。
・分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長２５０ｎｍ、カラム温度４０℃）
分離カラム ：ＳＣＲ-１０１Ｈ (株式会社島津製作所製)
溶離液 ：０．００５％（容積基準）−リン酸水溶液

［実施例２］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、１ｍ³／ｈの流量で抜き出したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は１ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は１０[１/ｈ]であった。
解凍開始から１２時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。
解凍液の活性残存率を実施例１と同様の方法で算出したところ、９５％であった。

［実施例３］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、解凍槽内の解凍液温を１５℃の一定温度に制御する代わりに、１０℃±０．５℃の範囲の温度に制御したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．１ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は１[１/ｈ]であった。
解凍開始から２４時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。
解凍液の活性残存率を実施例１と同様の方法で算出したところ、９５％であった。

［比較例１］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、０．０１ｍ³／ｈの流量で抜き出したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．０１ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は０．１[１/ｈ]であった。
解凍開始から２４時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りが存在し、完全に解凍することができなかった。

［比較例２］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、０．０１ｍ³／ｈの流量で抜き出したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．０１ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は０．１[１/ｈ]であった。
解凍開始から７２時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。
解凍液の活性残存率を実施例１と同様の方法で算出したところ、４０％であった。

［比較例３］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、０．０２ｍ³／ｈの流量で抜き出したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．０２ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は０．２[１/ｈ]であった。
解凍開始から２４時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りが存在し、完全に解凍することができなかった。

［比較例４］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、０．０２ｍ³／ｈの流量で抜き出したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．０２ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は０．２[１/ｈ]であった。
解凍開始から４８時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。
解凍液の活性残存率を実施例１と同様の方法で算出したところ、４５％であった。

［比較例５］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、０．０１ｍ³／ｈの流量で抜き出し、解凍槽内の解凍液温を１５℃±０．５℃の範囲の温度に制御する代わりに、３０℃±０．５℃の範囲の温度に制御したこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］は０．１ｍ³であり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］は０．０１ｍ³/ｈであり、循環ポンプによる循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍浴槽内の解凍液量V［ｍ³］で除した値は０．１[１/ｈ]であった。
解凍開始から２４時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。
解凍液の活性残存率を実施例１と同様の方法で算出したところ、１５％であった。

［比較例６］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、解凍液の抜き出しを行わなかったこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍開始から２４時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りが存在し、完全に解凍することができなかった。

［比較例７］
実施例１のニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍において、循環ポンプによって解凍浴槽からの解凍液を０．１ｍ³／ｈの流量で抜き出す代わりに、解凍液の抜き出しを行わなかったこと以外は実施例１と同様にして解凍を行った。
解凍開始から７２時間後に容器を解凍浴槽から取り出し、篩目開き２ｍｍのフィルターを用いて濾過を行い溶け残りの有無を確認したところ、フィルター上には溶け残りは存在しなかった。
解凍液の活性残存率を実施例１と同様の方法で算出したところ、３０％であった。

１：解凍浴槽
２：外部循環ライン
３：循環ポンプ
４：熱交換器
５：冷却水入口
６：冷却水出口

Claims (3)

1. ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物の凍結体を解凍する方法であって、解凍浴槽の解凍液の一部を外部循環ラインに循環させ、循環流量W［ｍ³/ｈ］を解凍液量V［ｍ³］で除した値W/V[１/ｈ]が、０．３以上であることを特徴とする解凍方法
2. 前記外部循環ラインに温度制御装置を有することを特徴とする請求項１に記載の解凍方法
3. 前記解凍液の温度が５〜２５℃の範囲内である請求項１または２に記載の解凍方法