JP2016188225A

JP2016188225A - 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド

Info

Publication number: JP2016188225A
Application number: JP2016109018A
Authority: JP
Inventors: メアリー・エリクソン; Erickson Mary; デイビッド・シー・リッツィンガー; C Litzinger David; スーミトラ・エス・ゴッシュ; Soumitra S Ghosh; ジジエン・グオ; Zijian Guo; マノジ・ピー・サマント; P Samant Manoj; アブヒナンディニ・シャルマ; SHARMA Abhinandini; ララ・マメドバ; Mamedova Lala; オディール・エスター・レビー; Esther Levy Odile; キャロライン・エクブラッド; Ekblad Caroline
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC; AstraZeneca Pharmaceuticals LP
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC; AstraZeneca Pharmaceuticals LP
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2016-11-04
Also published as: JP6006309B2; EP2729481B1; US20140235535A1; WO2013009545A1; EP2729481A1; US9382304B2; JP2014527405A; EP2729481A4; CN104271588B; WO2013009545A8; CN104271588A

Abstract

【課題】とりわけ良好な作用持続期間、高い効力及び／又は経口投与を含めた好都合な投与レジメンを有し、免疫原生が減少した化合物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むように操作されたアルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と，エキセンディン配列，エキセンディン類似体配列又はそれらの活性断片配列を含む第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチド，肥満症及び過体重、糖尿病、脂質異常症、高脂血症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、短腸症候群、パーキンソン病並びに心血管疾患を含めた疾患及び障害のための医薬組成物及び治療方法。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年７月８日に出願されたＵＳＳＮ６１／５０５９８２ならびに２０１２年１月１１日に出願されたＵＳＳＮおよびＵＳＳＮ６１／５８５５７７の優先権を主張し、その両方ともすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含有し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。２０１２年６月２２日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２６３ＷＯ１．ｔｘｔと名づけられ、３６６，３９２バイトの大きさである。

本願は、良好な作用持続期間、高い効力および／または経口投与を含めた好都合な投与レジメンを有する化合物ならびにその使用方法に関する。アルブミン結合ドメインを、生物学的に活性なペプチドと組み合わせて組み込む操作されたポリペプチドが、本明細書において提供される。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、アルブミンと結合し得るので、化合物が捕捉され得（例えば、アルブミンと結合され）、一方で、例えば、腎クリアランスおよび／または分解の減少のために、循環における作用持続期間の増大につながると考えられる。このような治療に適している(amendable)疾患として、肥満症および過体重、糖尿病、脂質異常症、高脂血症、短腸症候群、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、パーキンソン病、心血管疾患および中枢神経系のその他の障害またはそれらの組合せが挙げられる。

上記の代謝疾患、状態および障害において有用なポリペプチドを開発する必要性が依然としてある。したがって、本発明の目的は、上記の状態を治療するのに有用な、半減期が延長された操作されたポリペプチドならびにそれらを製造および使用する方法を提供することである。

各特許、特許出願および本明細書に引用された刊行物は、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれる。

アルブミンに対する結合親和性およびさらなる治療上の有用性を有する、操作されたポリペプチド化合物が提供される。化合物は、アルブミンと結合できる本明細書で定義されたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドと、ホルモンドメイン（ＨＤ）ポリペプチドとを含む、操作されたポリペプチドであり、ＨＤポリペプチドは、生物学的に活性であり、ＡＢＤとの共有結合において有益な生物学的応答を発揮できる。本明細書に記載されたＡＢＤまたはＨＤポリペプチドのいずれも、リンカーＬ、例えば、本明細書に記載のＬ１を介して、操作されたポリペプチド中で共有結合によって結合されていてもよい。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、アルブミンと結合し得るので、化合物が、対象において捕捉され得、対象における作用持続期間の増大につながると考えられる。

第１の態様において、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドが提供される。操作されたポリペプチドは、本明細書に記載のアルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、ホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む。ホルモンドメインは、エキセンディン、エキセンディンの断片またはエキセンディンの類似体であるポリペプチドを含む。

別の態様では、治療を必要とする対象において、疾患または障害を治療する方法が提供される。方法は、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドを、対象に投与することを含む。

さらに別の態様では、本明細書に記載された操作されたポリペプチド化合物を、医薬上許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。

さらに別の態様では、操作されたポリペプチドおよびその中間体をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを有する発現ベクター、このようなポリヌクレオチドを発現する宿主細胞ならびにそれらの発現、合成、翻訳後修飾および単離のための手段である。

本発明の１つの利点は、操作されたポリペプチドは、組換え法によって完全に合成され、複雑またはさらなる合成工程または化学工程ならびに関連反応試薬および触媒を避けることができるということである。結果として、本発明のポリペプチドは、化学的に誘導される延長された作用持続期間の化合物よりも、合成するのにあまり費用がかからない。長い作用持続期間（例えば、必要な場合には、１日１回にもかかわらず、ヒト対象において少なくとも１週間も達成され得る）に加えて、さらなる利点は、その比較的小さい大きさであり、それによって、患者のコンプライアンスを改善するための経口送達が可能となり得る。

本明細書に開示された化合物は、ヒトでは５〜７日またはそれより長くに変換される、マウスにおける少なくとも２４時間およびさらに長く２日までのＯＧＴＴＤＯＡ（作用持続期間についての経口糖負荷試験）試験における驚くべき有効性、頑強な血糖コントロール、体重減少、食物摂取および体重の用量依存的減少を実証する。ラットでは、単回投与の際の化合物曝露は、４〜７日間持続し、これは、ヒトでは、少なくとも週に１回の曝露に変換される。化合物は、血漿において、また血漿プロテアーゼに対して安定であり、血清アルブミンと結合していながら活性であり、エキセンディン−４に類似するか、またはそれよりも高いインビボ(in vivo)最大有効性を提供し得る。さらにより驚くべきことに、化合物は、経口送達に適している。

図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527）；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６１）の例のアミノ酸配列の一覧である。図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527）；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６１）の例のアミノ酸配列の一覧である。図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527）；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６１）の例のアミノ酸配列の一覧である。図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527）；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６１）の例のアミノ酸配列の一覧である。図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527）；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６１）の例のアミノ酸配列の一覧である。図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527）；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６１）の例のアミノ酸配列の一覧である。図２は、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）の、ヒト血清アルブミンとの結合を調べるためにＢｉａｃｏｒｅ機器において実施された結合分析の結果を示す。３種の異なる濃度の精製タンパク質（４０ｎＭ、太い灰色の線；１０ｎＭ、黒色の線および２．５ｎＭ、灰色の線）を、固定化されたヒト血清アルブミンの９５５ＲＵを有する表面上に注入した。図３Ａ〜Ｃは、１２６種の個々の正常ヒト血清中に存在する、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＰＥＰ０７９１１（配列番号４５９）とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）の、ＩｇＧ分子との結合を調べるためのＥＬＩＳＡによって実施された結合分析の結果を示し、Ａ）は、平均ＯＤ値を示し、Ｂ）は、陰性血清（ＯＤ＜０．１５として定義される）のパーセンテージを示し、Ｃ）は、陽性血清（ＯＤ＞１．０として定義される）のパーセンテージを示す。図４Ａ〜Ｃは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイにおける、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＰＥＰ０７９１１（配列番号４５９）とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）の免疫原性評価を示す図である。Ａ）は、５２人のコーカサス人種のドナーのコホートにおける、組換えヒトアルブミンと比較したアルブミン結合ポリペプチドに反応する個体数を示す。Ｂ）は、組換えヒトアルブミンを含有する陰性対照と比較した、ＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８の平均刺激指数（ＳＩ）を示す。Ｃ）は、バッファー対照と比較される、研究においてすべてのタンパク質に対して反応する個体数を示す。図５Ａ〜５Ｃ。４週間の投与後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるアルブミン結合性の操作されたポリペプチドの効果。図５Ａ：７．２または１００ナノモル／ｋｇ／日の連続注入された（ＣＳＩ）エキセンディン−４と比較した、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物０８８の週に２回の注射後の示された日でのＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンＡ１ｃ）の変化。図５Ｂ：図５Ａについて記載されるような投与量後の血糖の変化。図５Ｃ：図５Ａについて記載されるような投与量後の体重の変化。^＊ビヒクル対照に対してｐ＜０．５；分散分析、ダネット検定。図５Ａ〜５Ｃ。４週間の投与後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるアルブミン結合性の操作されたポリペプチドの効果。図５Ａ：７．２または１００ナノモル／ｋｇ／日の連続注入された（ＣＳＩ）エキセンディン−４と比較した、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物０８８の週に２回の注射後の示された日でのＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンＡ１ｃ）の変化。図５Ｂ：図５Ａについて記載されるような投与量後の血糖の変化。図５Ｃ：図５Ａについて記載されるような投与量後の体重の変化。^＊ビヒクル対照に対してｐ＜０．５；分散分析、ダネット検定。図５Ａ〜５Ｃ。４週間の投与後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるアルブミン結合性の操作されたポリペプチドの効果。図５Ａ：７．２または１００ナノモル／ｋｇ／日の連続注入された（ＣＳＩ）エキセンディン−４と比較した、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物０８８の週に２回の注射後の示された日でのＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンＡ１ｃ）の変化。図５Ｂ：図５Ａについて記載されるような投与量後の血糖の変化。図５Ｃ：図５Ａについて記載されるような投与量後の体重の変化。^＊ビヒクル対照に対してｐ＜０．５；分散分析、ダネット検定。図６Ａ〜６Ｃ。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、投薬された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性。図６Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図６Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図６Ｃは、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。図では、ビヒクルは、中黒四角であり、操作されたポリペプチドは、中白三角である。図６Ａ〜６Ｃ。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、投薬された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性。図６Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図６Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図６Ｃは、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。図では、ビヒクルは、中黒四角であり、操作されたポリペプチドは、中白三角である。図６Ａ〜６Ｃ。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、投薬された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性。図６Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図６Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図６Ｃは、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。図では、ビヒクルは、中黒四角であり、操作されたポリペプチドは、中白三角である。図７Ａ〜７Ｃ。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、投薬された例示的な操作されたポリペプチド化合物９の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性。図７Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図７Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図７Ｃは、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。図では、ビヒクルは、中黒四角であり、操作されたポリペプチドは、中黒三角である。図７Ａ〜７Ｃ。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、投薬された例示的な操作されたポリペプチド化合物９の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性。図７Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図７Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図７Ｃは、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。図では、ビヒクルは、中黒四角であり、操作されたポリペプチドは、中黒三角である。図７Ａ〜７Ｃ。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、投薬された例示的な操作されたポリペプチド化合物９の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性。図７Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図７Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図７Ｃは、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。図では、ビヒクルは、中黒四角であり、操作されたポリペプチドは、中黒三角である。図８Ａ〜８Ｃ。図８Ａ〜８Ｃは、正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、静脈内に投薬されたコンジュゲートしていないエキセンディン類似体と比較した、例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。図８Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図８Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図８Ｃは、単回静脈内用量後の例示的化合物のＰＫプロフィールを表す。ピコモル血漿レベルとして示された結果。説明文：ビヒクル（菱形）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶの［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４（四角）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶのエキセンディン−４（丸）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶの化合物１１（中白および中黒三角）。図８Ａ〜８Ｃ。図８Ａ〜８Ｃは、正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、静脈内に投薬されたコンジュゲートしていないエキセンディン類似体と比較した、例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。図８Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図８Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図８Ｃは、単回静脈内用量後の例示的化合物のＰＫプロフィールを表す。ピコモル血漿レベルとして示された結果。説明文：ビヒクル（菱形）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶの［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４（四角）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶのエキセンディン−４（丸）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶの化合物１１（中白および中黒三角）。図８Ａ〜８Ｃ。図８Ａ〜８Ｃは、正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、静脈内に投薬されたコンジュゲートしていないエキセンディン類似体と比較した、例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。図８Ａは、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図８Ｂは、体重を低減する化合物の効果を表す。図８Ｃは、単回静脈内用量後の例示的化合物のＰＫプロフィールを表す。ピコモル血漿レベルとして示された結果。説明文：ビヒクル（菱形）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶの［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４（四角）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶのエキセンディン−４（丸）；２ｎｍｏｌ／ｋｇＩＶの化合物１１（中白および中黒三角）。図９Ａ〜９Ｆ。図９Ａ〜９Ｆは、毎日か、または週に２回のいずれかで亜慢性的に投与された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。化合物１１は、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで１４日にわたって２５ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与され、ビヒクル（中黒丸）と比較された。図９Ａは、累積食物摂取を表す。図９Ｂは、毎日の食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｃは、累積食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｄは、総体重を表す。図９Ｅは、体重のパーセント変化を表す。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。図９Ａ〜９Ｆ。図９Ａ〜９Ｆは、毎日か、または週に２回のいずれかで亜慢性的に投与された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。化合物１１は、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで１４日にわたって２５ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与され、ビヒクル（中黒丸）と比較された。図９Ａは、累積食物摂取を表す。図９Ｂは、毎日の食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｃは、累積食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｄは、総体重を表す。図９Ｅは、体重のパーセント変化を表す。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。図９Ａ〜９Ｆ。図９Ａ〜９Ｆは、毎日か、または週に２回のいずれかで亜慢性的に投与された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。化合物１１は、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで１４日にわたって２５ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与され、ビヒクル（中黒丸）と比較された。図９Ａは、累積食物摂取を表す。図９Ｂは、毎日の食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｃは、累積食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｄは、総体重を表す。図９Ｅは、体重のパーセント変化を表す。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。図９Ａ〜９Ｆ。図９Ａ〜９Ｆは、毎日か、または週に２回のいずれかで亜慢性的に投与された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。化合物１１は、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで１４日にわたって２５ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与され、ビヒクル（中黒丸）と比較された。図９Ａは、累積食物摂取を表す。図９Ｂは、毎日の食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｃは、累積食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｄは、総体重を表す。図９Ｅは、体重のパーセント変化を表す。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。図９Ａ〜９Ｆ。図９Ａ〜９Ｆは、毎日か、または週に２回のいずれかで亜慢性的に投与された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。化合物１１は、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで１４日にわたって２５ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与され、ビヒクル（中黒丸）と比較された。図９Ａは、累積食物摂取を表す。図９Ｂは、毎日の食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｃは、累積食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｄは、総体重を表す。図９Ｅは、体重のパーセント変化を表す。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。図９Ａ〜９Ｆ。図９Ａ〜９Ｆは、毎日か、または週に２回のいずれかで亜慢性的に投与された例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび生物活性を表す。化合物１１は、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで１４日にわたって２５ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下投与され、ビヒクル（中黒丸）と比較された。図９Ａは、累積食物摂取を表す。図９Ｂは、毎日の食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｃは、累積食物摂取のパーセント変化を表す。図９Ｄは、総体重を表す。図９Ｅは、体重のパーセント変化を表す。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。この図は、経口送達後に血糖を低下させる、コンジュゲートしていないエキセンディン類似体と比較した、ポリペプチド（化合物０８８）の生物活性の経時的推移を表す。実施例を参照のこと。平均処理前グルコース：約６２３ｍｇ／ｄＬ。説明文：ビヒクル（中黒四角）；エキセンディン−４類似体（中白四角）；化合物０８８（菱形）。

Ｉ．定義
「肥満症」および「過体重」とは、普通に予測されるものよりも多い体重を有する哺乳類を指し、例えば、外見、当技術分野で公知の肥満度指数（ＢＭＩ）、ウエストとヒップ周りの比率、皮下脂肪厚、ウエスト周りなどによって決定され得る。疾病管理予防センター（ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ＣＤＣ）は、過体重を、２５〜２９．９のＢＭＩを有する成人ヒトとして定義しており；肥満を、３０以上のＢＭＩを有する成人ヒトとして定義している。肥満症の決定のためにはさらなる測定基準が存在する。例えば、ＣＤＣは、１．０より大きいウエストとヒップの比率を有するヒトは過体重であると述べている。

「除脂肪体重」とは、脂肪を含まない体重を指し、すなわち、総体重−体脂肪重量が、除脂肪体重である。除脂肪体重は、当技術分野で公知の、流体静力学的計量、コンピュータ化チャンバー、二重エネルギーＸ線吸収測定法、皮膚ノギス、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および生体電気インピーダンス法（ＢＩＡ）などの方法によって測定できる。

「哺乳類」とは、一般に、毛皮または毛を有し、生児出生をその後代に与え、その後代に乳を与える温血動物を指す。哺乳類は、ヒト、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、野生動物などを含む。一実施形態では、哺乳類は、雌である。一実施形態では、哺乳類は、女性のヒトである。一実施形態では、哺乳類は、ネコまたはイヌである。一実施形態では、哺乳類は、糖尿病哺乳類、例えば、２型糖尿病を有するヒトである。一実施形態では、哺乳類は、肥満糖尿病哺乳類、例えば、２型糖尿病を有する肥満哺乳類である。用語「対象」とは、本明細書に記載された方法との関連で、哺乳類を指す。

「断片」とは、ポリペプチドとの関連において、本明細書において、通常の化学的意味で、ポリペプチドの一部を指す。例えば、断片は、親ポリペプチドの１個または複数の残基のＮ末端欠失またはＣ末端欠失に起因し得、および／または断片は、親ポリペプチドの１個または複数の残基の内部欠失に起因し得る。「断片」とは、抗体との関連において、可溶性、対象内での分布などを調節するために生物学的に活性な分子と連結され得る抗体の一部を指す。例えば、エキセンディン−４（１−３０）は、アミノ酸３１〜３９のエキセンディンＣ末端「テール」が欠失しているエキセンディン−４の生物学的に活性な断片を説明する。用語「親」とは、ポリペプチドとの関連において、通常の意味で、修飾、例えば、挿入、欠失および／または置換の前に参照構造として働くポリペプチドを指す。用語「コンジュゲート」とは、本明細書に記載された操作されたポリペプチドとの関連において、成分ポリペプチド、例えば、ＡＢＤ、ＨＤ１などの間の共有結合を指す。用語「融合」とは、本明細書に記載された操作されたポリペプチドとの関連において、ペプチド主鎖の末端アミノまたはカルボキシ官能基のいずれか、または両方を介した、成分ポリペプチド、例えば、ＡＢＤ、ＨＤ１などの間の共有結合を指す。操作されたポリペプチドは、合成によってか、または組換えによって製造され得る。典型的には、融合物は、組換えバイオテクノロジーを使用して製造されるが、化学合成およびコンジュゲーション法によっても製造され得る。

本明細書において「類似体」とは、ポリペプチドとの関連において、親化合物に対して、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換を有する化合物を指す。ポリペプチドとの関連において、本明細書において「類似体配列」とは、親アミノ酸配列（例えば、野生型配列、天然配列）に対して、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換を有するアミノ酸配列を指す。類似体は、優れた安定性、溶解度、有効性、半減期などを有し得る。いくつかの実施形態では、類似体は、親化合物に対して、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い配列同一性を有する化合物である。好ましい実施形態では、類似体は、挿入、欠失、付加および置換のうちいずれか１種または組合せから独立に選択される１〜５のアミノ酸修飾を有する。本明細書における実施形態のいずれかでは、エキセンディン類似体は、挿入、欠失、付加および置換のうちいずれか１種または組合せから独立に選択される１〜５のアミノ酸修飾を有し得、好ましくは、親化合物に対して少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い配列同一性を、より好ましくは、親化合物に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い配列同一性を保持し、好ましくは、親化合物は、エキセンディン−４、エキセンディン−４（１−３８）、エキセンディン−４（１−３７）、エキセンディン−４（１−３６）、エキセンディン−４（１−３５）、エキセンディン−４（１−３４）、エキセンディン−４（１−３３）、エキセンディン−４（１−３２）、エキセンディン−４（１−３１）、エキセンディン−４（１−３０）、エキセンディン−４（１−２９）またはエキセンディン−４（１−２８）またはそのＬｅｕ−１４置換対応物、例えば、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３８）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３８）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３７）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３６）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３５）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３４）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３３）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３２）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３１）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−３０）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（１−２９）またはＬｅｕ１４エキセンディン−４（１−２８）であり、最も好ましくは、親化合物は、エキセンディン−４またはＬｅｕ１４エキセンディン−４の配列を有する。好ましい実施形態では、エキセンディン類似体断片は、エキセンディン−４（１−２８）またはＬｅｕ１４エキセンディン−４（１−２８）などのそのアミノ酸置換類似体ではない。好ましくは、エキセンディン類似体断片は、少なくとも２９アミノ酸の長さである。一実施形態では、少なくともエキセンディン−４の位置１、４、６、７および９に対応するアミノ酸とは、天然エキセンディン−４中のとおりのものであり、さらに、１〜５の修飾は、エキセンディン−４の位置１、４、６、７および９以外の位置の保存的アミノ酸置換である。例えば、本明細書における実施形態のなおさらなる実施形態では、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４の位置３、４、６、５、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２２、２３、２５、２６および／または３０に少なくとも見られるアミノ酸を保持し、さらに好ましくは、１〜５以下の別のアミノ酸、最も好ましくは、化学的に保存的なアミノ酸で置換された残りの位置を有する。本明細書における類似体のすべてにおいて、位置１および／または２の任意の置換または修飾は、デスアミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４などのエキセンディン−４類似体について当技術分野で公知であるように、インスリン分泌活性を保持または改善しながら、ＤＰＰ−ＩＶ切断に対する抵抗性を保持する。当技術分野で通例のように、用語「保存的」とは、アミノ酸置換との関連において、荷電の種類（例えば、アニオン性、カチオン性、中性、極性など）、疎水性または親水性、バルク（例えば、ファンデルワールス接触など）および／または官能性（例えば、ヒドロキシ、アミン、スルフヒドリルなど）の特性を維持する置換を指す。用語「非保存的」とは、保存的ではないアミノ酸置換を指す。

「同一性」、「配列同一性」などは、２種以上の核酸またはポリペプチド配列の比較の関連において、同一であるか、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０を使用して測定されるような、特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって、最大一致を求めて比較およびアラインされた場合の、特定の領域にわたる、約５０％の同一性、好ましくは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する２種以上の配列または部分配列を指す。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するもの、ならびに天然に存在するもの、例えば、多型または対立遺伝子変異体および人為的変異体を含む。好ましいアルゴリズムでは、当技術分野で公知のように、ギャップなどについて考慮される。配列比較のためには、典型的には、１種の配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できるか、または代替パラメータを指定できることが好ましい。次いで、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する、試験配列の配列同一性パーセントが算出される。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似法の検索によって、これらのアルゴリズム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗｅｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ,５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施によって、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって実施できる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement))を参照のこと。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例として、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられ、これらは、Altschul et al., 1977, Nuci. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、当技術分野で公知のように、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを介して市販されている。このアルゴリズムは、まず、クエリー配列において、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインされた場合に幾分か正の値の閾値スコアＴにマッチするか、またはそれを満たす短いワード長Ｗを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., Id.）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積的アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。例えば、ヌクレオチド配列についての累積的スコアは、パラメータＭ（１対のマッチング残基についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、累積的スコアを算出するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積的アラインメントスコアが、最大達成値から量Ｘだけ減少する；１つまたは複数の負のスコアを示す残基のアラインメントの蓄積のために累積的スコアが０以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する時点で停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長および１０の期待値（Ｅ）および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。

用語「約」とは、数値との関連において、数値の＋／−１０％を指す。

用語「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、本明細書に記載された操作されたポリペプチドの成分との関連において、同義である。

ＩＩ．化合物
第１の態様において、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列と、少なくとも１種のポリペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）配列とを含む配列を有する操作されたポリペプチド化合物が提供される。用語「アルブミン結合ドメイン」、「ＡＢＤ」などは、本明細書に記載されようなアルブミンと結合できるポリペプチドを指す。用語「ホルモンドメイン」、「ホルモンドメインポリペプチド」などは、対象において生物学的応答を誘発できるＧＬＰ−１受容体アゴニストポリペプチドを指す。例示的ホルモンドメインとして、それだけには限らないが、エキセンディン、エキセンディン断片またはエキセンディン類似体が挙げられるが、ＰＥＧ化誘導体などのレプチン誘導体であってもよい。

驚くべきことに、エキセンディン、エキセンディン類似体または活性断片は、十分なエキセンディン−４生物活性を保持し、例えば、ヒト対象では、少なくとも１週間またはそれ以上の持続期間に変換される、げっ歯類における少なくとも３日、さらには５日の延長された作用持続期間を有しながら、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８の細菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインに由来し、それに対して相当なアミノ酸配列同一性を有する極めて高親和性のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）と融合され得ることを見出した。「作用持続期間」とは、通例の意味では、治療レジメンにおいて、より低頻度の投薬を可能にすることを指す。したがって、延長された作用持続期間は、あまり頻繁でないおよび／またはより好都合な投薬スケジュールを可能にする。このようなＡＢＤペプチドが、治療的タンパク質担体として頑強なプラットフォームであることは広く実証されておらず、それらは、比較的疎水性であり、付いている治療用ペプチドと悪い相互作用をする可能性があり、少なくとも１ファミリーのペプチドホルモンの担体として作用できなかったので、これは幾分か驚くべきことであった。具体的には、ラットアミリンは、本明細書に記載されたＡＢＤとコンジュゲートされるか、融合される場合には、種々のエキセンディン−ＡＢＤコンストラクトが活性であり、長い作用持続期間を有するとわかった同じげっ歯類モデルにおいて、大きな、または長時間作用性のインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）活性を全く示さなかった。

さらに、本明細書における治療用コンジュゲートまたは融合化合物は、驚くべきことに、低い免疫原性およびエキセンディン−４治療活性を有しながら、アルブミン結合親和性および特異性を保持していた。化合物は、驚くべきことに、エキセンディンとＡＢＤの間に血漿−プロテアーゼ切断部位がないにもかかわらず、活性である。さらに驚くべきことに、治療用化合物は、アルブミンと結合している場合でさえも活性であると考えられる。本明細書に記載されたＡＢＤ化合物は、これまでに記載されたＡＢＤ化合物よりも低い免疫原性を有しながら、ストレプトコッカスのプロテインＧ株１４８（Ｇ１４８）の、およびJonsson et al.(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)中のアルブミン結合領域に基づいた、アルブミン結合親和性および特異性を提供する。最近、ストレプトコッカスのプロテインＧ株１４８（Ｇ１４８）のアルブミン結合領域内で、２、３のＴおよびＢ細胞エピトープが実験によって同定された（Goetsch et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10:125-32, 2003）。著者らは、ワクチンにおけるＧ１４８のＴ細胞エピトープの利用、すなわち、アルブミン結合領域の固有の免疫刺激特性を利用することに興味があった。Goetsch et al.は、さらに、Ｇ１４８の配列中のＢ細胞エピトープ、すなわち、免疫処置後に抗体によって結合される領域を見出した。ヒト投与のための医薬組成物では、免疫反応は望まれない。したがって、アルブミン結合ドメインＧ１４８は、その上記の免疫刺激特性のために、このような組成物における使用には、そのようなものとして好ましくない。

生物学的に活性な成分
本明細書に記載された化合物および方法における使用が考慮される生物学的に活性な化合物成分として、エキセンディンが挙げられる。用語「生物学的に活性な化合物」などは、通常の意味で、生物学的応答を誘発し得る化合物、例えば、ポリペプチドなどを指す。

エキセンディン。エキセンディンは、アメリカドクトカゲおよびメキシコドクトカゲ、アリゾナ州およびメキシコ北部に内在する爬虫類の唾液分泌物中に見られるペプチドである。エキセンディン−３は、メキシコドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａｈｏｒｒｉｄｕｍ）の唾液分泌物中に存在し、エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液分泌物中に存在する。Eng et al, 1990, J. Biol. Chem., 265:20259-62;Eng et al, 1992, J. Biol. Chem., 267:7402-7405参照のこと。エキセンディン−３およびエキセンディン−４の配列は、それぞれ以下のとおりである：
HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂（配列番号１）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂（配列番号２）。

Hargrove et al.(Regulatory Peptides, 2007, 141:113-119)では、天然エキセンディン−４と比較して位置１４に単一ヌクレオチド相違を有する全長Ｃ末端アミド化エキセンディン−４ペプチド類似体であるエキセンディン−４ペプチド類似体が報告された。［Ｌｅｕ^１４］エキセンディン−４の配列は以下のとおりである：
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂（配列番号３）。
Ｌｅｕ１４エキセンディン−４は、操作されたポリペプチドにおいて使用するのに、また本明細書に記載されたその使用にとって好ましい類似体である。別のエキセンディン−４ペプチド類似体として、位置１４および２８にアミノ酸置換を有するエキセンディン−４の最初の３２個のアミノ酸と、それに続く、非哺乳類（カエル）ＧＬＰ１のＣ末端に由来する５個のアミノ酸配列のキメラ：［Ｌｅｕ^１４，Ｇｌｎ^２８］エキセンディン−４（１−３２）−ｆＧＬＰ−１（３３−３７）がある。この化合物は、以下の配列：
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号４）
を有する。また、エキセンディン−４（１−２８）、エキセンディン−４（１−２９）、エキセンディン−４（１−３０）、エキセンディン−４（１−３１）、エキセンディン−４（１−３２）などのエキセンディン−４のＣ末端の末端切断型、生物学的に活性な形態およびそれらのアミド化形態も当技術分野で公知である。これらのエキセンディン類似体のすべてが、本発明の操作されたポリペプチドの成分として適している。当技術分野で通例であるように、ペプチド化合物名中の角括弧（すなわち、「［］」）は、角括弧内の残基または化学的特徴の置換を示す。例えば、［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４、［^１４Ｌｅｕ］Ｅｘ−４などは、位置１４にロイシンを有するエキセンディン−４を指す。アミノ酸の数的位置は、当技術分野で日常的に使用される種々の方法で、先頭に追加されたか、または後ろに追加された数字によって示され得る。例えば、用語^１４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１４、１４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ^１４などは、位置１４のロイシンへの言及において同義である。

いくつかの実施形態では、Ｃ末端アミドまたはその他のＣ末端キャッピング部分が、本明細書に記載された化合物中に存在し得るということは理解される。

エキセンディンは、グルカゴン様ペプチドファミリーのいくつかのメンバーに対して幾分かの配列類似性を有し、膵β細胞からのインスリン分泌を刺激するインスリン分泌効果を有するＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２(Goke et al, 1993、J. Biol. Chem., 268:19650-55) ［ＧＬＰ−１（７−３７）ＮＨ_２の配列: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG（配列番号５）］、「ＧＬＰ−１」と呼ばれることもある）に対して最高相同性、５３％を有するが、エキセンディンは、ＧＬＰ−１相同体ではない。

薬理学的研究は、エキセンディン−４は、インビトロ(in vitro)で特定のインスリン分泌細胞上のＧＬＰ−１受容体で作用し得るという報告につながったが、エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１によっては作用されない受容体で作用する可能性があるということも報告されている。さらに、エキセンディン−４は、すべてではないが一部のインビボにおける生物学的特性をＧＬＰ−１と共有し、ＧＬＰ−１よりも大幅に長い作用持続期間を有する。そのインスリン分泌活性に基づいて、真性糖尿病の治療および高血糖症の予防のためのエキセンディン−３およびエキセンディン−４の使用が提案されており（参照により、すべての目的のためにその全文が本明細書に組み込まれる、英語の米国特許第５，４２４，２８６号）、実際、エキセンディン−４は、２型糖尿病を治療するための治療薬として米国において、また欧州において承認されている。

実際、アメリカドクトカゲからエキセンディン遺伝子をクローニングしたＣｈｅｎおよびＤｒｕｃｋｅｒによって報告されたように、エキセンディンは、哺乳類ＧＬＰ−１の種相同体ではないと考えられている(J. Biol. Chem. 272:4108-15 (1997))。アメリカドクトカゲはまた、プログルカゴン（それからＧＬＰ−１がプロセシングされる）について、エキセンディンよりも哺乳類プログルカゴンに対してより類似している別個の遺伝子を有するという知見は、エキセンディンが単にＧＬＰ−１の種相同体ではないことを示した。

エキセンディンアゴニストを使用して胃腸運動を調節する方法が、米国特許第６，８５８，５７６号（すなわち、１９９６年８月８日に出願された米国出願第０８／６９４，９５４号の一部継続である、１９９７年８月８日に出願された米国出願第０８／９０８，８６７号に基づく）に記載されている。エキセンディンアゴニストを使用して食物摂取を低減する方法が、米国特許第６，９５６，０２６号（すなわち、１９９７年１月７日に出願された米国出願第６０／０３４，９０５号、１９９７年８月７日に出願された同６０／０５５，４０４号、１９９７年１１月１４日に出願された同６０／０６５，４４２号および１９９７年１１月１４日に出願された同６０／０６６，０２９号の利益を主張する、１９９８年１月７日に出願された米国出願第０９／００３，８６９号に基づく）に記載されている。

新規エキセンディンアゴニスト化合物配列は、その認められた米国特許対応物とともに、参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＷＯ９９／０７４０４（すなわち、１９９８年８月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／１６３８７）に、ＷＯ９９／２５７２７（すなわち、１９９８年１１月１３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２４２１０）に、ＷＯ９９／２５７２８（すなわち、１９９８年１１月１３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２４２７３）に、ＷＯ９９／４０７８８に、ＷＯ００／４１５４６に、ＷＯ００／４１５４８に記載されている。当技術分野で公知の、インビトロおよびインビボで、インスリン分泌性、食物摂取阻害活性および体重活性を含めたエキセンディン活性をアッセイする方法は、本明細書に、また、上記の参考文献およびそこで列挙されたその他の参考文献に記載されている。

特定の例示的エキセンディン、エキセンディンアゴニストおよびエキセンディン類似体アゴニストとして、エキセンディン断片エキセンディン−４（１−３０）(His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly)（配列番号６８０）；エキセンディン−４（１−２８）、エキセンディン−４（１−２９）、エキセンディン−４（１−３０）、エキセンディン−４（１−３１）およびエキセンディン−４（１−３２）が挙げられる。類似体は、^１４Ｍｅｔ位置（すなわち、^１４Ｍｅｔ）で、ロイシンなどの非酸化性アミノ酸での置換を含む。例として、［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４、［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４（１−３０）、［^１４Ｌｅｕ］エキセンディン−４（１−２８）および［^１４Ｌｅｕ，^２５Ｐｈｅ］エキセンディン−４が挙げられる。

本明細書に記載された操作されたポリペプチドにおいて使用するためのエキセンディン類似体アゴニストとして、米国特許第７，２２３，７２５号（参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、例えば、式：Ｘａａ_１Ｘａａ_２Ｘａａ_３ＧｌｙＸａａ_５Ｘａａ_６Ｘａａ_７Ｘａａ_８Ｘａａ_９Ｘａａ_１０Ｘａａ_１１Ｘａａ_１２Ｘａａ_１３Ｘａａ_１４Ｘａａ_１５Ｘａａ_１６Ｘａａ_１７ＡｌａＸａａ_１９Ｘａａ_２０Ｘａａ_２１Ｘａａ_２２Ｘａａ_２３Ｘａａ_２４Ｘａａ_２５Ｘａａ_２６Ｘａａ_２７Ｘａａ_２８−Ｚ_１；（式中、Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＴｙｒであり；Ｘａａ_２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘａａ_３は、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_５は、ＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘａａ_６は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであり；Ｘａａ_７は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｘａａ_８は、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；Ｘａａ_９は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１０は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＭｅｔであり；Ｘａａ_１１は、ＡｌａまたはＳｅｒであり；Ｘａａ_１２は、ＡｌａまたはＬｙｓであり；Ｘａａ_１３は、ＡｌａまたはＧｌｎであり；Ｘａａ_１４は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＭｅｔであり；Ｘａａ_１５は、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１６は、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１７は、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１９は、ＡｌａまたはＶａｌであり；Ｘａａ_２０は、ＡｌａまたはＡｒｇであり；Ｘａａ_２１は、ＡｌａまたはＬｅｕであり；Ｘａａ_２２は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであり；Ｘａａ_２３は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＭｅｔであり；Ｘａａ_２４は、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり；Ｘａａ_２５は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであり；Ｘａａ_２６は、ＡｌａまたはＬｅｕであり；Ｘａａ_２７は、ＡｌａまたはＬｙｓであり；Ｘａａ_２８は、ＡｌａまたはＡｓｎであり；Ｚ_１は、−ＯＨ、−ＮＨ_２、Ｇｌｙ−Ｚ_２、ＧｌｙＧｌｙ−Ｚ_２、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１−Ｚ_２、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１Ｓｅｒ−Ｚ_２（配列番号６８１）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒ−Ｚ_２（配列番号６８２）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙ−Ｚ_２（配列番号６８３）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａ−Ｚ_２（配列番号６８４）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＸａａ_３６−Ｚ_２（配列番号６８５）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＸａａ_３６Ｘａａ_３７−Ｚ_２（配列番号６８６）またはＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＸａａ_３６Ｘａａ_３７Ｘａａ_３８−Ｚ_２（配列番号６８７）であり；Ｘａａ_３１、Ｘａａ_３６、Ｘａａ_３７およびＸａａ_３８は独立に、Ｐｒｏであるか、または存在せず；Ｚ_２は、−ＯＨまたは−ＮＨ_２である）の化合物が挙げられる。上記のエキセンディン類似体のいずれかおよび各々では、Ｘａａ１に対応するヒスチジンの置換が、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−イミダゾアセチル、デス−アミノ−ヒスチジル（イミダゾプロピオニル）、β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジルまたはβ−カルボキシ−イミダゾプロピオニルのいずれかを用いて行われているものも具体的に考慮される。さらに具体的には、Ｘａａ２のグリシンの置換が、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸のいずれかを用いて行われている本明細書に記載されたエキセンディン類似体も本明細書において考慮される。

一実施形態によれば、例示的化合物として、Ｘａａ_１が、ＨｉｓまたはＡｒｇであり；Ｘａａ_２が、ＧｌｙまたはＡｌａであり；Ｘａａ_３が、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_５が、ＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘａａ_６が、ＡｌａまたはＰｈｅであり；Ｘａａ_７が、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｘａａ_８が、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；Ｘａａ_９が、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１０が、ＡｌａまたはＬｅｕであり；Ｘａａ_１１が、ＡｌａまたはＳｅｒであり；Ｘａａ_１２が、ＡｌａまたはＬｙｓであり；Ｘａａ_１３が、ＡｌａまたはＧｌｎであり；Ｘａａ_１４が、ＡｌａまたはＬｅｕであり；Ｘａａ_１５が、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１６が、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１７が、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ_１９が、ＡｌａまたはＶａｌであり；Ｘａａ_２０が、ＡｌａまたはＡｒｇであり；Ｘａａ_２１が、ＡｌａまたはＬｅｕであり；Ｘａａ_２２が、Ｐｈｅであり；Ｘａａ_２３が、Ｉｌｅ、Ｖａｌであり；Ｘａａ_２４が、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｐであり；Ｘａａ_２５が、Ａｌａ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；Ｘａａ_２６が、ＡｌａまたはＬｅｕであり；Ｘａａ_２７が、ＡｌａまたはＬｙｓであり；Ｘａａ_２８が、ＡｌａまたはＡｓｎであり；Ｚ_１が−ＯＨ、−ＮＨ_２、Ｇｌｙ−Ｚ_２、ＧｌｙＧｌｙ−Ｚ_２、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１−Ｚ_２、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１Ｓｅｒ−Ｚ_２（配列番号６８１）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒ−Ｚ_２（配列番号６８２）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙ−Ｚ_２（配列番号６８３）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａ−Ｚ_２（配列番号６８４）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＸａａ_３６−Ｚ_２（配列番号６８５）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＸａａ_３６Ｘａａ_３７−Ｚ_２（配列番号６８６）、ＧｌｙＧｌｙＸａａ_３１ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｌａＸａａ_３６Ｘａａ_３７Ｘａａ_３８−Ｚ_２（配列番号６８７）であり；Ｘａａ_３１、Ｘａａ_３６、Ｘａａ_３７およびＸａａ_３８は独立に、Ｐｒｏであるか、または存在せず、Ｚ_２は、−ＯＨまたは−ＮＨ_２である（ただし、Ｘａａ_３、Ｘａａ_５、Ｘａａ_６、Ｘａａ_８、Ｘａａ_１０、Ｘａａ_１１、Ｘａａ_１２、Ｘａａ_１３、Ｘａａ_１４、Ｘａａ_１５、Ｘａａ_１６、Ｘａａ_１７、Ｘａａ_１９、Ｘａａ_２０、Ｘａａ_２１、Ｘａａ_２４、Ｘａａ_２５、Ｘａａ_２６、Ｘａａ_２７およびＸａａ_２８のうち３種以下が、Ａｌａである）上記の式のものが挙げられる。上記のエキセンディン類似体のいずれかおよび各々において、位置Ｘａａ１に対応するヒスチジンの置換が、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−イミダゾアセチル、デス−アミノ−ヒスチジル（イミダゾプロピオニル）、β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジルまたはβ−カルボキシ−イミダゾプロピオニルのいずれかを用いて行われているものも具体的に考慮される。Ｘａａ２のグリシンの置換が、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸のいずれかを用いて行われている本明細書に記載されたエキセンディン類似体が、さらに具体的に考慮される。

その他の例示的化合物として、ＷＯ９９／２５７２７において、そこで化合物２−２３として示されるものが挙げられる。別の実施形態によれば、Ｘａａ_１４がＬｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌ、より好ましくは、Ｌｅｕであり、および／またはＸａａ_２５が、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒ、より好ましくは、ＴｒｐまたはＰｈｅである化合物が提供される。これらの化合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ならびに化合物の合成の際に酸化分解をあまり受けない。

本融合ポリペプチドにおける使用に適したエキセンディン類似体のさらなる例として、２００３年３月４日に公開された米国特許第６５２８４８６号（参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。具体的には、エキセンディン類似体として、適宜、位置３４〜３９に１〜５の間の欠失および前記エキセンディンと共有結合によって結合している４〜２０個のアミノ酸単位のペプチド配列のＣ末端伸長を有し、前記ペプチド伸長配列中の各アミノ酸単位が、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＭｅｔからなる群から選択される、エキセンディン−４に対して少なくとも９０％の相同性を有するエキセンディンまたはエキセンディン類似体からなるものが挙げられる。より好ましくは、伸長は、４〜２０個のアミノ酸残基の、例えば、４〜１５個の範囲の、より好ましくは、４〜１０個の範囲の、特に、４〜７の範囲のアミノ酸残基、例えば、４、５、６、７、８または１０個のアミノ酸残基のペプチド配列であり、６個のアミノ酸残基が好ましい。最も好ましくは、米国特許第６５２８４８６号によれば、伸長ペプチドは、少なくとも１個のＬｙｓ残基を含有し、３〜７個のリシンがさらにより好ましく、６個のリシンがさらに最も好ましい。

例えば、１種の類似体として、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１８）（（［デス−^３６Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）−Ｌｙｓ_６とも呼ばれる）がある。さらなる例示的類似体として、Ｌｙｓ_６−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）_６（Ｈ−Ｌｙｓ_６−デスＰｒｏ ^３６エキセンディン−４（１−３９）−Ｌｙｓ_６）（配列番号６８８）；Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｈ−［デス^３６Ｐｒｏ、^{３７，３８}Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）−ＮＨ_２）（配列番号６８９）；Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−［デス^３６Ｐｒｏ、^{３７，３８}Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）（配列番号６９０）；Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−［デス^３６Ｐｒｏ、^{３７，３８}Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）（配列番号６９１）；Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）_６（［デス^３６Ｐｒｏ、^{３７，３８}Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）_６）（配列番号６９２）；（Ｌｙｓ）_６−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）_６（Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−［デス^３６Ｐｒｏ、^{３７，３８}Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）_６）（配列番号６９３）；およびＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）_６（Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−［デス^３６Ｐｒｏ、^{３７，３８}Ｐｒｏ］エキセンディン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）_６）（配列番号６９４）が挙げられる。当技術分野で通例のように、アミノ酸の反復は、反復数を示す下付き数字によって示され得る；すなわち、Ｌｙｓ_６（配列番号６９５）、（Ｌｙｓ）_６（配列番号６９５）などは、ヘキサリシル（配列番号６９５）を指す。上記のエキセンディン類似体のいずれかおよび各々において、位置１に対応するヒスチジンの置換が、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−イミダゾアセチル、デス−アミノ−ヒスチジル（またはイミダゾプロピオニル）、β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジルまたはβ−カルボキシ−イミダゾプロピオニルのいずれかを用いて行われているものが具体的に考慮される。位置２のグリシンの置換が、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸のいずれかを用いて行われている、本明細書に記載されたエキセンディン類似体が、本明細書においてさらに具体的に考慮される。

操作されたポリペプチドコンストラクトにおいて使用するのに適したエキセンディン類似体のさらなる例として、エキセンディン−４（１−３９）の対応する位置に関して、特に、位置^１３Ｇｌｎ、^１４Ｍｅｔ、^２５Ｔｒｐまたは^２８Ａｓｎに少なくとも１個の修飾されたアミノ酸残基を有するエキセンディン類似体を説明する、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２００４０３５６２３（参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、特に、天然に生じるアミノ酸を含んでなるものがある。その刊行物によれば、少なくとも１個のＬｙｓアミノ酸、より好ましくは、６個または７個のＬｙｓアミノ酸単位などの少なくとも５個のＬｙｓアミノ酸単位を含む、１〜７個のアミノ酸Ｃ末端伸長をさらに含むさらなるこのような類似体がある。

操作されたポリペプチドコンストラクトにおいて使用するのに適したエキセンディン類似体のなおさらなる例として、エキセンディンまたはエキセンディン類似体のＮ末端部分中に修飾されたアミノ酸残基を有して、その領域中の高いβ−ターン特徴を作製するエキセンディン類似体を説明する、「N-Terminus Conformationally Constrained GLP-1 Receptore Agonist Compounds」と題された公開ＰＣＴ出願ＷＯ／２０１０／１２０４７６に記載されたもの（参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる）がある。例えば、類似体は、コンホメーション的に制約された領域を作製することによって、アミノ酸残基Ｈｉｓ１Ｇｌｙ２Ｇｌｕ３を摸倣するよう設計され、エキセンディン−４における修飾として、リキシセナチドまたは本明細書に記載されたその他の類似体を使用できる、Ｈｉｓ１Ｇｌｙ２Ｇｌｕ３にチアゾリジン−プロリンペプチドミメティックを含有するエキセンディン類似体を含む（例えば、その中の図１７Ａ〜Ｆに記載される化合物を参照のこと）。

本明細書に記載されたエキセンディン、例えば、エキセンディン−４、類似体および式のいずれかおよび各々において、位置１に対応するヒスチジンの置換が、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−イミダゾアセチル、デス−アミノ−ヒスチジル（イミダゾプロピオニル）、β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジルまたはβ−カルボキシ−イミダゾプロピオニルのいずれかを用いて行われているものが具体的に考慮される。例えば、Ｈｉｓ１位置が修飾されている、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドコンジュゲートにおいて使用するための好ましいエキセンディン類似体として、（４−イミダゾアセチル）エキセンディン−４、（デス−アミノ−ヒスチジル）エキセンディン−４（または（イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４）、（β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４、（Ｎ−ジメチル−ヒスチジル）エキセンディン−４および（β−カルボキシ−イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４がある。位置２のグリシンの置換が、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、ｌ−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸のいずれかを用いて行われている本明細書に記載されたエキセンディンまたはエキセンディン類似体が、本明細書においてさらに具体的に考慮される。したがって、例えば、このような操作されたポリペプチドとして、エキセンディン−４類似体が、リンカーとしてのグリシンとそのＣ末端αカルボキシ基で結合しているペプチドを介して、ペプチド結合を介してＰＥＰ０７９８６配列のＮ末端と連結している、（４−イミダゾアセチル）エキセンディン−４−Ｇｌｙ−ＰＥＰ０７９８６が挙げられるであろう。

上記のエキセンディン類似体またはその活性断片のいずれも、ＡＢＤとのリンカーを有するか、有さない、本操作されたポリペプチドにおける使用に適している。

アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ペプチド。ストレプトコッカスのプロテインＧ株１４８（Ｇ１４８）に由来するこれまでに開示されたアルブミン結合ドメインについて、またアルブミンに対して高親和性を有するいくつかの変異体、例えば、ＷＯ０９／０１６０４３について、熱安定性の低下を犠牲にしてより高い親和性が達成された。さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープが、Ｇ１４８のアルブミン結合領域内で実験的に同定されたことが報告された（Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003）。この研究を行った著者らは、ワクチンにおけるＧ１４８のＴ細胞エピトープの使用、すなわち、アルブミン結合領域の固有の免疫刺激特性を利用することに関心をもった。Goetsch et alは、さらに、Ｂ細胞エピトープ、すなわち、Ｇ１４８の配列中の、免疫処理後に抗体によって結合される領域を見出した。したがって、アルブミン結合ドメインＧ１４８およびＧ１４８に由来するポリペプチドおよびひいては、それらを含有する融合物／コンジュゲート、上記の免疫刺激特性のリスク。ヒト投与用の医薬組成物では、免疫応答がないこと（または低減）が望まれる。

このような融合物および／またはコンジュゲートの上記の欠点および欠乏は、本発明の操作されたポリペプチドにおいて使用するための本明細書に開示された改善されたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ペプチドの使用によって克服または低減される。このようなＡＢＤは、アルブミンに対して比較的高親和性を有するものであり、ストレプトコッカス株Ｇ１４８の細菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインに由来し、それに対して相当なアミノ酸配列同一性を有し、望ましい免疫学的特性、例えば、低減された免疫原性をさらに提供するよう本明細書に記載されるようにさらに修飾されている。したがって、本明細書に記載された長期間の操作されたポリペプチドコンジュゲートまたは融合物を含むアルブミン結合ドメインポリペプチドは、アルブミン結合モチーフと、３ヘリックス立体配置を含むさらなる配列とを含む３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインである。本明細書に記載され、本明細書に記載された操作されたポリペプチドについて考慮されるＡＢＤペプチドは、Jonsson et al.(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)によって記載されたようなアルブミン結合配列を有するものならびに同文献に記載されたＡＢＤペプチド、およびＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号にさらに記載されるＡＢＤペプチドよりも優れている。本明細書に記載された操作されたポリペプチドを製造するには、本明細書に記載されたＡＢＤポリペプチドに、エキセンディンまたは類似体またはその活性断片が融合される。エキセンディン化合物とのコンジュゲーションまたは融合に適したアルブミン結合ドメインポリペプチドは、以下から選択された配列を含む改善されたＡＢＤアミノ酸配列を含み得る：
式（ｉ）
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）
（配列中、各々独立に、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）および
式（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：
LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）によって定義されず、配列中、互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）。

第１の態様の上記の式（ｉ）または（ｉｉ）のアルブミン結合ポリペプチドのさらなる実施形態では、Ｘ６はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ６はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ７はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ７はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＣである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＫである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ２６はＤである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ２６はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３９はＤである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３９はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４０はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４０はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４３はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４３はＫである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４４はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４４はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４４はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、位置４５のロイシンは存在する。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、位置４５のロイシンが存在しない。さらなる実施形態では、位置４６のプロリンが存在する。さらなる実施形態では、位置４６のプロリンが存在しない。

さらなる好ましい実施形態では、エキセンディン化合物とのコンジュゲーションまたは融合に適したアルブミン結合ドメインポリペプチドは、
式（ｉｉｉ）
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）
（配列中、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）および
式（ｉｖ）（ｉｉｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：
LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）によって定義されず、配列中、互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）
から選択された、改善されたＡＢＤアミノ酸配列を含み得る。

この態様の式（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のアルブミン結合ポリペプチドのさらなる実施形態では、Ｘ６はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ６はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ７はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ７はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＣである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＫである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、位置４５のロイシンは存在する。さらなる実施形態では、位置４６のプロリンが存在する。さらなる実施形態では、位置４６のプロリンが存在しない。

式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１種のさらなる実施形態では、ＡＢＤは、１個または複数のＮ末端ヘリックスキャッピングアミノ酸を含み、さらなる実施形態では、ヘリックスキャッピングアミノ酸は、セリンであり得るか、またはグリシン−セリンであり得る。したがって、図および配列表中のものを含めて、本明細書に開示された各アルブミン結合ドメイン配列について、その中に含有される式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１種のＡＢＤに対応するアルブミン結合ドメイン、そのＳｅｒ−ＡＢＤ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡＢＤ、Ｇｌｙ−ＡＢＤ、Ａｌａ−ＡＢＤおよびそのデス−Ｃ末端−プロリン配列が、操作されたポリペプチドにおいて本明細書に開示されるように、すべての態様について具体的に考慮される。

したがって、得られた配列が、（ｉ）または（ｉｉｉ）によって定義されるクラスに属する配列と少なくとも９５％同一であるようなものである（ｉ）または（ｉｉｉ）の修飾された変異体も包含される。例えば、アミノ酸残基の特定の官能基分類（例えば、疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同一官能基群に由来する別のアミノ酸残基と交換され得る可能性がある。

アルブミンに対する結合親和性を有するＡＢＤポリペプチドと関連する配列の上記で定義されたクラスは、３αヘリックスバンドルドメインにフォールディングされる共通の親ポリペプチド配列に由来する。より詳しくは、上記のポリペプチドは、血清アルブミンとアルブミン結合ドメインＧ１４８−ＧＡ３間の複合体の構造に基づくモデルビルディング（Lejon et al, J. Biol. Chem. 279:42924-8, 2004）ならびに共通の親ポリペプチド配列のいくつかの突然変異による変異体の結合および構造特性の分析から導かれる。式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１種の上記で定義されたアミノ酸配列は、親ポリペプチド配列と比較して、ほとんど同一である３ヘリックスバンドルドメインにフォールディングされると予測されるポリペプチドのクラスをもたらすアミノ酸置換を含む。親ポリペプチド配列は、アルブミンとの相互作用のための結合表面をすでに含んでいるが、その結合表面は、上記の定義の置換の一部によって修飾される。上記の定義の置換は、親ポリペプチド配列と比較して、改善されたアルブミン結合能を提供する。重要で、驚くべきことに、上記の定義の置換は、アルブミンに対する強力な親和性の保持および／または改善に加えて、免疫学的特性の増強を提供する。

したがって、開示内容の第１の態様の改善されたＡＢＤポリペプチドは、例えば、ヒト投与のための治療分子の融合またはコンジュゲートパートナーとして使用するのに適したものにする一連の特徴を示す。重要で、驚くべきことに、本開示内容の改善されたＡＢＤは、例えばアルブミン結合ドメインＧ１４８−ＧＡ３およびＷＯ０９／０１６０４３に開示されたアルブミン結合ポリペプチドなどの関連アルブミン結合ポリペプチドとの比較において、以下の６つの特徴のうち少なくとも５つを実証する。

（１）ＡＢＤポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８−ＧＡ３およびその他の細菌由来のアルブミン結合ドメインと比較して異なる表面を示す。相違は、このような細菌タンパク質に対して先に曝露されているヒトなどの対象における抗体反応の任意のリスクを低減または排除し得る

（２）ＡＢＤポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８−ＧＡ３および共通の親ポリペプチド配列のその他の関連するが異なる突然変異による変異体よりも、少ない可能性あるＴエピトープしか含まず、したがって、ヒトなどの対象に投与された場合に低いおよび／またはより低い免疫原性を示す。

（３）ポリペプチドは、ヒトなどの対象に投与された場合に、循環抗体と、より低い反応性を示す。したがって、循環抗体に曝露されたポリペプチドの表面における、すなわち、アルブミンとの結合相互作用に関与していないポリペプチド表面におけるアミノ酸置換によって、抗体交差反応性は、例えば、ヒト血清の試験セットにおいて測定されるような、Ｇ１４８−ＧＡ３によって引き起こされる抗体交差反応性と比較して低下する。

（４）ポリペプチドは、Ｋ_Ｄ値によって定義されるような、より高い結合親和性の点で、およびｋｏｆｆ値によって定義されるような、より遅い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の点の両方で、例えば、細菌タンパク質由来のアルブミン結合ドメインなどの既知の天然に存在するアルブミン結合ポリペプチドよりも高いアルブミン結合能を有する。

（５）ポリペプチドは、例えば、細菌タンパク質由来のアルブミン結合ドメインなどの既知の天然に存在するアルブミン結合ポリペプチドよりも少ない、ポリペプチドの安定性の問題と関連しているアミノ酸残基を含む。したがって、ポリペプチドは、例えば、酸化傾向のあるメチオニンまたはトリプトファンを含まず、１個しかアスパラギンを含まない。

（６）ポリペプチドは、５５℃を超える融点によって定義されるような、ＷＯ０９／０１６０４３に開示されるものなどのこれまでのアルブミン結合ポリペプチドよりも高い構造的安定性を有する。

一実施形態では、第１の態様のコンジュゲート／融合物のアルブミン結合ポリペプチドは、上記で列挙された特徴のうち６つすべてを示す。別の実施形態では、第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドは、アルブミンと結合している場合に、例えば、ＷＯ０９／０１６０４３に開示されるものなどのこれまでのアルブミン結合ポリペプチドよりもより親水性のプロフィールを示す。ポリペプチドがアルブミンと相互作用する場合に周囲に曝露されるアルブミン結合ポリペプチドの表面は、表面疎水性を付与する、より少ないアミノ酸残基を含む。

ＡＢＤ配列の本明細書における実施形態の各々についてさらに、Ｃ末端プロリン（上記の位置４６に対応する）が適宜存在しないこともある。ＡＢＤ配列の各実施形態についてなおさらに、位置４５のロイシンが適宜存在するか、または存在しないこともある。「ＡＢＤ配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するＡＢＤ化合物の配列である。「ペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）化合物の配列である。「エキセンディン配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するエキセンディン化合物の配列である。「エキセンディン類似体配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するエキセンディン類似体化合物の配列である。「エキセンディン活性断片配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するエキセンディン活性断片化合物の配列である。「エキセンディン類似体活性断片配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するエキセンディン類似体活性断片化合物の配列である。「アルブミン結合モチーフ（ＡＢＭ）配列」とは、一価または二価であり、必要に応じて、本明細書に開示された操作されたポリペプチドの一部を形成するＡＢＭの配列である。別に記載のない限り、操作されたポリペプチドが、化合物（例えば、ＡＢＤまたはＨＤ１）を「含む」場合には、操作されたポリペプチドの配列は、化合物（例えば、ＡＢＤ配列またはＨＤ１配列）の配列を含むと理解される。

アルブミン結合モチーフが存在するため、ＡＢＤペプチドは、最大で１×１０^−６Ｍである相互作用のＫ_Ｄ値で、さらにより好ましくは、最大で１×１０^−９Ｍ（さらにより密接な親和性）でアルブミンと結合する。より好ましくは、最大で１×１０^−１０Ｍである相互作用のＫ_Ｄ値で、いっそうより好ましくは、最大で１×１０^−１１Ｍであり、なおいっそうより好ましくは、最大で１×１０^−１２Ｍであり、いっそうさらには、最大で１×１０^−１３Ｍである。値は、最も好ましくは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）に対する親和性のものである。

本明細書において使用される用語「アルブミン結合」および「アルブミンに対する結合親和性」とは、例えば、当技術分野において公知のＢｉａｃｏｒｅ機器などにおける表面プラズモン共鳴技術の使用によって試験され得るポリペプチドの特性を指す。例えば、以下の実施例に記載されるように、アルブミン結合親和性は、アルブミンまたはその断片が、機器のセンサーチップ上に固定化されており、試験されるべきポリペプチドを含有するサンプルがチップ上を通過する実験において試験され得る。あるいは、試験されるべきポリペプチドが、機器のセンサーチップ上に固定化されており、アルブミンまたはその断片を含有するサンプルがチップ上を通過する。アルブミンは、この関連では、ヒト血清アルブミンなどの哺乳類に由来する血清アルブミンであり得る。当業者ならば、このような実験によって得られた結果を解釈して、アルブミンに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的測定を確立し得る。定量的測定が望まれる場合には、例えば、相互作用のＫ_Ｄ値を調べるために、表面プラズモン共鳴法を使用してもよい。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）において定義され得る。アルブミンは、適宜、測定のセンサーチップ上に固定化されており、その親和性が調べられるポリペプチドのサンプルは、段階希釈によって調製され、注入される。次いで、例えば、機器製造業者（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデルを使用して、結果からＫ_Ｄ値が算出され得る。

一実施形態では、この態様のアルブミン結合ポリペプチドは、相互作用のｋ_ｏｆｆ値が、最大で５×１０^−５ｓ^−１、例えば、最大で５×１０^−６ｓ^−１であるようにアルブミンと結合する。

別の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３０１〜３４４のいずれか１種から選択される。さらに詳しくは、アミノ酸配列は、配列番号３０４〜３０５、配列番号３０７〜３０８、配列番号３１０〜３１１、配列番号３１３〜３１４、配列番号３１６〜３１７、配列番号３１９〜３２０、配列番号３２２〜３２３、配列番号３２５〜３２６、配列番号３２８〜３２９、配列番号３３１〜３３２、配列番号３３４〜３３５、配列番号３３７〜３３８、配列番号３４１〜３４２および配列番号３４９〜３５０から選択される。

本明細書に記載された操作されたポリペプチドにおいて使用されるＡＢＤの別の好ましい実施形態では、操作されたポリペプチドのアルブミン結合ポリペプチド部分のアミノ酸配列は、本明細書における表１または図１、配列表に由来するものを含めた、また、そのデス−Ｐｒｏ４６および／またはデス−Ｌｅｕ４５形態をさらに含めた本明細書に記載された配列のいずれか１種から選択されるＡＢＤを含む。

一実施形態では、この態様のアルブミン結合ポリペプチドは、（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるＡＢＤ配列のＮ末端および／またはＣ末端に位置する１個または複数のさらなるアミノ酸残基をさらに含む。これらのさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドによるアルブミンの結合のさらなる増強およびフォールディングされたアルブミン結合ドメインのコンホメーション的安定性の改善において役割を果たし得るが、例えば、ポリペプチドの製造、精製、インビボまたはインビトロでの安定化、カップリング、標識または検出のうち１つまたは複数ならびにそれらの任意の組合せと関連するその他の目的に等しく十分に役立ち得る。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために、例えば、ＨＤ１に付加された１個または複数のアミノ酸残基を含み得る。

例えば、したがって、一実施形態では、ＡＢＤアミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）のＮまたはＣ末端のαヘリックスの直前または直後のアミノ酸は、コンホメーションの安定性に影響を及ぼし得る。コンホメーションの安定性の改善に寄与し得るアミノ酸残基の一例として、上記で定義されるＡＢＤアミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）のＮ末端に位置するセリン残基がある。Ｎ末端セリン残基は、いくつかの場合には、セリン側鎖のγ酸素とグルタミン酸残基のポリペプチド主鎖ＮＨの間に水素結合を含むことによって基準のＳ−Ｘ−Ｘ−Ｅキャッピングボックスを形成し得る。このＮ末端キャッピングは、本開示内容の第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインの第１のαヘリックスの安定化に寄与し得る。

したがって、一実施形態では、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端に少なくとも１個のセリン残基を含む。言い換えれば、１個または複数のセリン残基がＡＢＤアミノ酸配列に先行する。アルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、さらなるアミノ酸は、ＡＢＤ配列のＮ末端にグリシン残基を含む。１、２、３、４または任意の適した数のアミノ酸残基がＡＢＤアミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）に先行し得るということが理解される。したがって、単一のセリン残基、単一のグリシン残基またはグリシン−セリン（ＧＳ）組合せもしくはグリシン−セリン−セリン（ＧＳＳ）組合せなどの２種の組合せがＡＢＤアミノ酸配列に先行し得る。Ｎ末端にさらなるアミノ残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号４４５〜４６３、例えば、配列番号４４５〜４４８および配列番号４６２〜４６３、ならびに表１および図１に示されている。さらに別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基は、配列式（ｉ）または（ｉｉｉ）によって定義されるようなポリペプチドのＮ末端にセリンを含む。Ｎ末端セリンを有するこのようなＡＢＤの１種の一例として、SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号６９６）がある。対応するデス−プロリン形態は、SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号６９７）である。対応するデス−Ｌｅｕ形態は、SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAP（配列番号６９８）である。対応するデス−Ｐｒｏデス−Ｌｅｕ形態は、SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号６９９）である。

なお別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基（単数または複数）は、本明細書において定義されたＡＢＤポリペプチドのＮ末端にアラニン酸を含むか、または上記のＡＢＤ配列のＮ末端にアラニン−セリン配列としてセリンと組み合わせて含む。なお別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基（単数または複数）は、本明細書において定義されたＡＢＤポリペプチドのＮ末端にグルタミン酸を含む。なお別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基（単数または複数）は、本明細書において定義されたＡＢＤポリペプチドのＮ末端にシステインを含む。このようなさらなる残基は、存在する場合には、好ましくは、１〜５個のアミノ酸であることが好ましい。

同様に、Ｃ末端キャッピングは、アルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインの第３のαヘリックスの安定性を改善するために利用され得る。（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるＡＢＤアミノ酸配列のＣ末端に存在するＣ末端プロリン残基は、少なくとも部分的に、キャッピング残基として機能し得る。Ｃ末端のプロリン残基の後ろのリシン残基は、リシン残基のεアミノ基とポリペプチド主鎖中のリシンの２および３残基前に位置するアミノ酸のカルボニル基、例えば、（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるＡＢＤアミノ酸配列のロイシンおよびアラニン残基のカルボニル基の間に水素結合を形成することによって、アルブミン結合ポリペプチドの第３のヘリックスのさらなる安定化に寄与し得る。したがって、一実施形態では、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＣ末端にリシン残基を含む。このようなさらなる残基は、存在する場合には、好ましくは、１〜５個のアミノ酸であることが好ましい。

上記で論じられたように、さらなるアミノ酸は、アルブミン結合ポリペプチドの製造と関連し得る。第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドが化学的ペプチド合成によって製造される場合には、特に、Ｃ末端プロリンの後ろの１個または複数のオプショナルなアミノ酸残基が利点を提供し得る。このようなさらなるアミノ酸残基は、例えば、ジケトピペラジンなどの望ましくない物質の形成を、合成のジペプチド段階で防ぎ得る。このようなアミノ酸残基の一例として、グリシンがある。したがって、一実施形態では、さらなるアミノ酸は、上記で説明されるように、プロリン残基の直後またはさらなるリシンおよび／またはグリシン残基の後ろに、ポリペプチドのＣ末端にグリシン残基を含む。あるいは、ポリペプチドの製造は、ＡＢＤアミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）のＣ末端プロリン残基のアミド化から恩恵を受け得る。この場合には、Ｃ末端プロリンは、カルボキシル炭素にさらなるアミン基を含む。

Ｃ末端にさらなるアミノ酸残基をさらに含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号４４５〜４５２、例えば、配列番号４４９〜４５０、ならびに表１および図１に示される。当業者ならば、異なる種類のペプチド合成のための予め作られたマトリックスによってＣ末端修飾を達成する方法を承知している。

別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端にシステイン残基を含む。このようなシステイン残基は、（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるようなＡＢＤアミノ酸配列の直前および／もしくは直後にあってもよく、または上記のような任意のその他のさらなるアミノ酸残基の前および／もしくは後ろであってもよい。ポリペプチド鎖のＮおよび／またはＣ末端のシステイン残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号４４９〜４５０（Ｃ末端）および配列番号４５１〜４５２（Ｎ末端）、ならびに表１および図１に示されている。ポリペプチド鎖へのシステイン残基の付加によって、アルブミン結合ポリペプチドの部位指定コンジュゲーションのためのチオール基を得ることができる。あるいは、部位特異的コンジュゲーションを促進するために、セレノシステイン残基が、システイン残基の導入についてと同様の方法でポリペプチド鎖のＣ末端に導入されてもよい（Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006）。

一実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドは、２個以下のシステイン残基を含む。別の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドは、１個以下のシステイン残基を含む。

別の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドのさらなるアミノ酸残基は、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ_６）タグ、（配列番号４９）などのポリペプチドの精製または検出のための「タグ」またはタグに対して特異的であり、および／もしくは精製において使用される抗体との相互作用のための「ｍｙｃ」（「ｃ−Ｍｙｃ」）タグもしくは「ＦＬＡＧ」タグを含む。当業者ならばその他の代替物も承知している。

例示的ＡＢＤ種として、それだけには限らないが、以下の表１および実施例において示される化合物が挙げられる。

例えば、好ましい操作されたポリペプチド実施形態では、ＡＢＤは、LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号３１３）、ならびにSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号５００）およびGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号４６３；ＰＥＰ０７９８６）を含めたそのＮ末端が伸長されたＡＢＤ配列形態を含む。位置２のセリンは、配列をキャップしており、この位置にグリシンまたはアラニンを有することと比較してＴｍをおよそ２℃上げている。アラニンはまた、AGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２０）におけるようにセリンの直前であり得る。また、上記のＡＢＤ配列の各々中に、Ｃ末端プロリン、グリシンまたは両方が存在しない対応するポリペプチドが好ましい。したがって、ＡＢＤが、親形態と比較して収率を改善し得るデス−プロリン形態：LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７０４）、ならびにSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７０２）およびGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７００）を含めたそのＮ末端が伸長されたＡＢＤ配列形態を含む配列も好ましい。また、各ＡＢＤのデス−Ｌｅｕ４５形態も好ましい。

Ｃｙｓ−コンジュゲーションが望ましい、好ましい操作されたポリペプチド実施形態では、好ましいＡＢＤは、LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG（配列番号５０１）ならびにSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG（配列番号５０２）およびGSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG（配列番号４４８；ＰＥＰ０８１８５）を含めたそのＮ末端が伸長されたＡＢＤ配列形態を含み得る。また、上記のＡＢＤ配列の各々中に、Ｃ末端プロリンまたはグリシンまたは両方が存在しないポリペプチドも好ましい。

本明細書に開示されたＡＢＤ配列のいずれかを用いる一態様では、エキセンディン−４またはエキセンディン類似体配列に対するリンカーは、本明細書に開示されたようなグリシンを含むリンカー、例えばG、GGG、GGS、GGGS（配列番号１９２）、TGGGGAS（配列番号１９３）、TGGGGGAS（配列番号１９４）、またはTGGGGSAS（配列番号１９５）である。

本明細書に記載された操作されたポリペプチドの一実施形態、特に、そのＣ末端がプロリンまたはペプチド合成の間にラセミ化することが知られているその他のアミノ酸で終わるものでは、Ｃ末端アミノ酸残基のラセミ化に関する可能性ある問題に対抗するためにＣ末端にグリシンが付加され得る。あるいは、Ｃ末端アミノ酸は、その（αアミノ基）アミド化形態にあり得る、例えば、グリシンで終わるよりもむしろ、プロリンに対してプロリンアミド。しかし、アミド化ポリペプチドは、化学合成よりも組換えによって製造されることが望ましく、次いで、Ｃ末端アミノ酸のアミド化が、当技術分野で公知のいくつかの方法、例えば、アミド化ＰＡＭ酵素の使用によって実施され得る。組換え製造によって得ることができる操作されたポリペプチドが好ましい。

本明細書においてＡＢＤは、完全に可逆的にフォールディングする、すなわち、それらは、変性され得、所望の活性三次構造に自発的に再フォールディングする。これは、２０℃でとられたスペクトル（フォールディングされた状態）および９０℃に加熱した後にとられた第２のスペクトル（加熱変性）２０℃に戻った後にとられた第３のスペクトル（再フォールディングされた状態）を比較する、例えば、ＡＢＤ配列番号４６３の円偏光二色性スペクトル分析によって評価された。この手順の間に、Ｔｍを求めることができる。

操作されたポリペプチドの別の態様は、ＡＢＤが、難溶性または低溶解性エキセンディン変異体の水溶液における溶解性の増大を提供し得るということである。この特性は、ＡＢＤ自体によってか、またはその会合が水溶液における操作されたポリペプチドの溶解度を高める、インビボもしくはインビトロで高度に可溶性のアルブミンと結合している操作されたポリペプチドの結果として生じる複合体のために付与され得る。したがって、このさらなる態様の実施形態では、本明細書に記載された融合タンパク質またはコンジュゲートとしてアルブミン結合ドメインと共有結合によってカップリングしている、それ自体、１ｍｇ／ｍｌ以下または２ｍｇ／ｍｌ以下または５ｍｇ／ｍｌ以下の水における溶解度を有するエキセンディン化合物を含む組成物が提供され、これでは、化合物およびアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、共有結合によってカップリングしており、操作されたポリペプチドの溶解度は、融合していない（またはコンジュゲートしていない）天然エキセンディン化合物のものよりも高い。

アルブミンとの結合。血清アルブミンは、哺乳類血清中に最も豊富にあるタンパク質であり（４０ｇ／Ｌ；ヒトでは、およそ０．７ｍＭ）、ここでは、それは、それだけには限らないが、脂質およびビリルビンを含めたさまざまな分子と結合する（Peters T, 1985, Advances in Protein Chemistry 37:161）。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例し、これでは、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１９日の半減期を有し、ウサギ血清アルブミンは、約５日の半減期を有するということが観察されてきた（McCurdy TR et al., J. Lab. Clin. Med. 143:115,2004）。ヒト血清アルブミンは、体中に広く、特に、腸および血液の区画において分布しており、ここでは、主に、浸透圧の維持に関与している。構造的に、アルブミンは、３つの相同なドメインを含み、合計５８４または５８５個のアミノ酸になる一本鎖タンパク質である（Dugaiczyk L et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:71）。アルブミンは、１７のジスルフィド橋および単一の反応性チオール、Ｃ３４を含有するが、Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物部分を欠く（Peters, 1985, Id.;Nicholson JP et al., 2000, Br J Anaesth 85:599）。グリコシル化がないことは、アルブミンの組換え発現を単純化する。アルブミンのこの特性は、その三次構造が知られているという事実と一緒になって（He, XM and Carter, DC, Nature 358:209 1992）、それを組換え融合タンパク質において使用するための魅力的な候補にしている。このような融合タンパク質は、一般に、単一ポリペプチド鎖において、治療用タンパク質（タンパク質それ自体の投与の際に身体から迅速に排除される）と血漿タンパク質（天然の遅いクリアランスを示す）を組み合わせる（Sheffield WP, Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol. Disord. 1:1, 2001）。このような融合タンパク質は、あまり頻繁な注射を必要としないという点およびインビボにおけるより高いレベルの治療用タンパク質において臨床的有用性を提供し得る。しかし、本明細書における操作されたポリペプチドは、アルブミンとコンジュゲートしていないが、代わりに、アルブミンとの非共有結合を可能にするモチーフを含有する。

アルブミン半減期。種々の種におけるアルブミンの半減期は、一般に、動物体重に基づいた相対成長率に忠実であると観察されている。例えば、マウス、ラット、ウサギおよびヒトにおけるアルブミン半減期は、それぞれ、１、１．９、５．６および１９日と推定されている。実際、累乗フィッティング解析（Davies & Morris, 1993, Pharm. Res. (N.Y.) 10:1093-1095）は、以下の方程式を提供する：
アルブミン半減期（日）＝３．７５＊体重（ｋｇ）^{０．３６８}。

さらなる実施形態。本明細書に開示された各ポリペプチドはまた、その天然に生じる第１のアミノ酸とインフレームでＮ末端にメチオニンを含む（例えば、付加されたＮ末端メチオニンを有するエキセンディン−４であるＭｅｔ−エキセンディン−４）よう考慮されるということは理解される。本明細書に示された操作されたポリペプチド配列中にＣ末端Ｇｌｙが現れる場合には、その残基は、その後のアミド化の間に失われ得るということがさらに理解される。いくつかの実施形態は、合成における中間体、例えば、当技術分野で公知であるように、アフィニティー精製に使用され、その後、適宜、除去されて、治療用途に適した成熟した操作されたポリペプチドをもたらし得る「Ｈｉｓタグ」を有するものなどである。

本明細書に記載された操作されたポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、エキセンディン類似体は、親エキセンディン配列に対して、少なくとも７０％、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、親エキセンディンは、エキセンディン−４であり、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４に対して少なくとも７０％、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い配列同一性を有し得る。当技術分野で公知のように、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）は、エキセンディンではなく、ＧＬＰ−１の配列は、本明細書に記載された操作されたポリペプチドに適したエキセンディン配列から具体的に排除される。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドホルモンドメインを、ＡＢＤペプチドと共有結合によって連結するリンカー、例えば、本明細書に記載されたＬ１を有する化合物が提供される。いくつかの実施形態では、第１のリンカー（Ｌ１）は、操作されたポリペプチド内のＨＤ１を共有結合によって連結する。いくつかの実施形態では、Ｌ１は結合である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドホルモンドメイン（例えば、本明細書に記載されたＨＤ１）は、ペプチドリンカーを介してＡＢＤペプチドと共有結合によって連結され得る。任意のリンカーがオプショナルである；すなわち、任意のリンカーが単に結合であり得る。存在する場合には、リンカーは主にスペーサー機能を果たすので、その化学構造は重要なものではない。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結している１〜３０個またはそれより少ないアミノ酸を含む。アミノ酸は、２０種の天然に存在する（すなわち、生理学的）アミノ酸から選択され得る。あるいは、非天然アミノ酸は、化学合成、翻訳後化学修飾によってか、または宿主細胞における組換え発現によるインビボ組込みのいずれかによって組み込まれ得る。これらのアミノ酸のうちいくつかは、グリコシル化され得る。別の実施形態では、１〜３０個またはそれより少ないアミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシン、さらにアスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される。さらなる実施形態では、リンカーは、過半数の立体障害のないアミノ酸、例えば、グリシン、アラニンおよび／またはセリンで構成されている。「立体障害のない」とは、通例の意味において、小さい側鎖、例えば、０〜２個の非水素原子を有し、その結果、大きな側鎖、例えば、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅなどを有するアミノ酸に対して立体障害(steric hinderance)が最小化されるアミノ酸を指す。ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）およびポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）と同様に、ポリグリシンは、特に有用である、例えば、（Ｇｌｙ）_３、（Ｇｌｙ）_４（配列番号１２５）、（Ｇｌｙ）_５（配列番号１２６）。荷電を有するポリグリシンは有用であり得、例えば、ポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ｇｌｕ）（配列番号１２７）、ポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ｌｙｓ）（配列番号１２８）、ポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ａｓｐ）（配列番号１２９）およびポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ａｒｇ）（配列番号１３０）モチーフ（配列中、ｎは１〜６であり得る）を含む。リンカーのその他の特定の例として、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号１３１）；（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号１３２）；（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号１３３）；およびＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１３４）がある。ＧｌｙおよびＳｅｒの組合せと同様に、ＧｌｙおよびＡｌａの組合せは、特に有用である。したがって、さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンリッチペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列［Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１３５）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１３６）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１３７）および［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１３８）（配列中、ｎは、１、２、３、４、５または６である、例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＳｅｒ］_３（配列番号７２１））からなる群から選択される。「グリシンリッチペプチド」とは、複数のグリシン残基、好ましくは、大多数のグリシン残基、より好ましくは、圧倒的多数のグリシン残基を含むポリペプチドを指す。

特定の実施形態では、荷電を有するリンカーが使用され得る。このような荷電リンカーは、相当な数の酸性残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕなど）を含有し得るか、または相当な数の塩基性残基（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）を含有し得、その結果、リンカーは、それぞれ、７より低いか、または７より大きいｐＩを有する。技術者には理解されるように、すべてのその他の事柄が等しいとして、所与のリンカー中の酸性または塩基性残基の相対量が多いほど、そのリンカーのｐＩは、それぞれ、より低く、またはより高くなる。このようなリンカーは、ペプチドｐＩ（等電点）を修飾することなどの本明細書に開示された操作されたポリペプチドに有利な特性を付与し得、これは、順に、特定のｐＨでの、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、境界を含めたｐＨ７．２からｐＨ７．６の間）での、またはこのようなポリペプチドを含む医薬組成物における、このようなポリペプチドの溶解度および／または安定性特徴を改善し得る。当技術分野で公知であるように、ペプチドの溶解度は、ペプチドのｐＩから少なくとも±１ｐＨ単位または±１ｐＨ単位より多いｐＨを有する組成物における製剤によって改善され得る。

例えば、「酸性リンカー」とは、７未満；境界も含めた６から７の間；境界も含めた５から６の間；境界も含めた４から５の間；境界も含めた３から４の間；境界も含めた２から３の間；または境界も含めた１から２の間のｐＩを有するリンカーである。同様に、「塩基性リンカー」とは、７より大きい；境界も含めた７から８の間；境界も含めた８から９の間；境界も含めた９から１０の間；境界も含めた１０から１１の間；境界も含めた１１から１２の間または境界も含めた１２から１３の間のｐＩを有するリンカーである。特定の実施形態では、酸性リンカーは、［Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１３９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１４０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１４１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１４２）、［Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１４３）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１４４）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１４５）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１４６）［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である；例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_６（配列番号７２２）］の群から選択される配列を含有する。特定の実施形態では、塩基性リンカーは、［Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１４７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１４８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１４９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１５０）、［Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１５１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１５２）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１５３）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１５４）［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である；例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_６（配列番号７２３）］の群から選択される配列を含有する。

さらに、特定の構造的モチーフまたは特徴、例えば、αヘリックスを有するリンカーが、調製され得る。例えば、このようなリンカーは、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１５５）［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である；例えば、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_３（配列番号７２４）、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_４（配列番号７２５）または［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_５（配列番号７２６）］の群から選択される配列を含有し得る。当業者ならば、任意の特定のリンカー配列のヘリックス含量を容易に決定できる。

ペプチドリンカー以外の生体適合性リンカーは、エキセンディンＣ末端を、ＡＢＤ配列のＮ末端に共有結合によって付けるために使用され得る。リンカーは、生体適合性ポリマー、好ましくは、水溶性、より好ましくは、約５０ｋＤ〜約５０００ｋＤまたは約５０ＫＤ〜５００ｋＤまたは約１００ｋＤ〜５００ｋＤであり得る。例示的生体適合性、水溶性ポリマーリンカーとして、−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−（式中、ｎは、ＰＥＧリンカーが、１００〜５０００ｋＤ、好ましくは、１００〜５００ｋＤの分子量を有し得るようなものである）などのＰＥＧリンカーがある。このようなリンカーは、−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＯ−（式中、ｎは、ＰＥＧリンカー分子量が、１００ｋＤ〜５０００ｋＤ、好ましくは、１０ｋＤ〜５００ｋＤであるようなものである）であり得る。それだけには限らないが、多糖、ポリプロピレングリコールならびにプロピレンおよびエチレングリコールのコポリマーなどを含めた、その他の生体適合性ポリマーが使用され得る。通常、このようなリンカーは、同一または異なる反応性基であり得る各末端に反応性基を含む。反応性基を有するこのようなリンカーは、公知であり、利用可能である。好ましくは、反応性基は、ペプチドのＮ末端アミノまたはＣ末端カルボキシ基のいずれかと反応性である。例えば、反応性基は、当技術分野で公知のように、ブチルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、アルデヒド、スクシンイミドまたはマレイミド部分であり得る。低級アルキル（例えば、Ｃ_１−Ｃ_６）、低級アシル、ハロゲン、ＣＮおよびＮＨ_２などの、ペプチド機能を立体障害しない任意の基によってさらに置換され得る、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｎ＝２〜２０）などのアルキルリンカーは、あまり好ましくない。

本発明に従う使用に適したリンカーは、上記および本明細書に記載の特徴およびモチーフのうちの１つまたは複数を有し得るということも理解される。例えば、リンカーは、酸性リンカーならびに構造的モチーフ、例えば、αヘリックスを含み得る。同様に、リンカーは、塩基性リンカーおよび構造的モチーフ、例えば、αヘリックスを含み得る。リンカーは、酸性リンカー、塩基性リンカーおよびαヘリックスなどの構造的モチーフを含み得る。さらに、本発明に従う操作されたポリペプチドは、２以上のリンカーを有することもあり、このような各リンカーは、本明細書に記載の特徴のうち１以上を有し得るということも理解される。

本明細書に記載されたリンカーは、例示的なものであり、本発明の範囲内のリンカーは、より長いものであり得、その他の残基を含み得る。一実施形態では、エキセンディン配列が、リンカーを伴わずにＡＢＤ配列と直接連結している操作されたポリペプチドは、明確に排除される。

いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｃ末端にＡＢＤ配列を、Ｎ末端にＨＤ１配列を含む。特定の好ましい実施形態では、Ｎ末端は、エキセンディン配列、エキセンディン断片配列またはエキセンディン類似体配列である。ＡＢＤおよびＨＤ１を含む実施形態に加えて、操作されたポリペプチドは、構造ＨＤ１−ＡＢＤを有し得る。

本明細書に示された操作されたポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の明確な指示がない場合には、操作されたポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端配向で読まれるということは理解される。例えば、ＨＤ１が、エキセンディン化合物またはその類似体の配列を有する場合には、用語ＨＤ１−ＡＢＤ、ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤ、ＨＤ１−ＡＢＤなどは、Ｎ末端および／またはＣ末端の明確な指示がない場合には、エキセンディン配列またはその類似体が操作されたポリペプチドのＮ末端にあり、ＡＢＤがＣ末端にあることを意味する。反対に、Ｎ末端および／またはＣ末端が明確に指示される場合には、操作されたポリペプチドは、末端の明確な指示に従って読まれる。例えば、用語ＨＤ１_{Ｃ−ｔｅｒｍ}−ＡＢＤ、ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤ_{Ｎ−ｔｅｒｍ}などは、ＡＢＤが操作されたポリペプチドのＮ末端にあり、ＨＤ１がＣ末端にあることを意味する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ＡＢＤポリペプチド単独、すなわち、融合されたホルモンドメインがない場合の親和性とは異なる、血清アルブミンに対する親和性を有する。効果的な会合を得るために、操作されたポリペプチドは、解離定数Ｋ_Ｄが、例えば、約１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍ、１０^−１３Ｍ、１０^−１４Ｍまたはさらに１０^−１５Ｍ未満であるような、血清アルブミンに対する結合親和性を有し得る。いくつかの実施形態では、親和性は、操作されたポリペプチドが、アルブミンから解離し、生物学的応答、例えば、受容体、例えば、ＧＬＰ−１受容体との結合を誘発し得るような過度に堅固なものではない。好ましくは、ヒト血清アルブミンに対する親和性は、制限するものではないが、アッセイおよび合成法を含め、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号に記載されるように測定され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ホルモンドメインとコンジュゲートしている、血漿半減期を延長し得る種々の部分（例えば、ＰＥＧまたはＦｃまたはアルブミン）を有する対応する化合物よりも優れている。これに関連して、用語「優れた」とは、疾患または障害の治療の評価において検討され得るさまざまな機能特性を指す。例えば、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ホルモンドメインとコンジュゲートしている種々の部分を有する対応する化合物よりも少ない、例えば、１×、２×、３×、４×、５×、またはいっそう少ない生物学的に活性な（ホルモンドメイン）成分しか必要とない場合がある。さらなる例のために、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、より高い効力、例えば、１．５×、２×、３×、４×、５×、１０×、２０×、５０×またはいっそう高い効力を有し得る。

本明細書において考慮される操作されたポリペプチド化合物として、以下の表２に示される化合物が挙げられる。好ましい化合物は、化合物５、化合物９および化合物１１である。

本明細書において具体的に考慮されるさらなる操作されたポリペプチド化合物は、具体的に示される場合、適宜、本明細書に開示されたＬ１配列のいずれかを有するＨＤ１およびＡＢＤ成分にいずれかを有し、以下の表３において開示されるものを含めた、本明細書における表および列挙の操作されたポリペプチドのいずれかの構造を有する化合物を含む：

表３．選択された例示的な操作されたポリペプチド

具体的には、Ｎ末端メチオニンが全く存在しない上記の配列の化合物が考慮される。Ｎ末端メチオニンは、細菌発現にとって好都合なものとして主に存在し得る。しかし、本発明の操作されたペプチドは、所望のホルモンまたはＡＢＤ配列の天然に存在する成熟ペプチド対応物において見られるようなＮ末端アミノ酸（すなわち、付加されたメチオニンまたは他のリーダー配列を有さない）をもたらす翻訳後Ｎ末端タンパク質分解プロセシングを有する真核細胞の宿主細胞［例えば、酵母（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））、哺乳類、バキュロウイルス］またはその他の宿主細胞において発現され得る。あるいは、発現および／または分泌（およびさらには精製）に使用されるＮ末端配列は、例えば、ＴＥＶなどのプロテアーゼの使用によってのように、翻訳後に除去され得るものであり得る。

ＩＩＩ．設計および製造方法
コンストラクトの設計。本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、アミノ酸レベルで設計され得る。次いで、これらの配列は、当技術分野で公知のさまざまなソフトウェア製品を使用して、例えば、タンパク質発現、コドン最適化、制限部位含量に基づいて、ヌクレオチド配列が、所望の発現宿主にとって最適化されるように逆翻訳され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、タンパク質発現に基づいて、および制限部位含量について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にとって最適化され得る。対象とするヌクレオチド配列に基づいて、当技術分野で公知の多段階ＰＣＲのために重複するオリゴヌクレオチドが、提供され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、対象とするタンパク質をコードするｃＤＮＡを構築するための当技術分野で周知の条件下で多重ＰＣＲ反応において使用され得る。一例については、１×Ａｍｐｌｉｔａｑバッファー、１．３ｍＭＭｇＣｌ_２、２００ｕＭｄＮＴＰ、４ＵＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ、０．２ｕＭの各プライマー（ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ、ＡＢＩ）であり、サイクリングパラメータ：（９４Ｃ：３０秒、５８Ｃ：１分、７２Ｃ：１分）、３５サイクルを用いる。

制限部位が、当技術分野で公知のベクター連結において使用されるためのＰＣＲ産物の末端に付加されてもよい。特定の部位は、ｃＤＮＡが、次いで、ｐＥＴ４５ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）において適切なリーディングフレームにあり得るように、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１を含み得る。これらの部位を使用することによって、このベクターにおいて、翻訳開始部位として除去され得る任意のＮ末端Ｈｉｓタグが、タグの下流となる。発現コンストラクトが完了されると、例えば、当技術分野で公知のＴ７プロモータープライマー、Ｔ７ターミネータープライマーおよび標準ＡＢＩＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｖ３．１プロトコールを使用して配列決定することによって、検証が実施され得る。配列情報は、例えば、ＡＢＩ３７３０ＤＮＡ分析器から得ることができ、ベクターＮＴＩｖ．１０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析され得る。発現コンストラクトは、当技術分野で公知の、リンカー配列が容易に切断除去され、変更され得るモジュラー法で設計され得る。

当技術分野で公知の、または本明細書に記載されたプロテアーゼ認識部位は、本明細書に記載された組換え操作ポリペプチドの設計、構築、操作および製造にとって有用なコンストラクト中に組み込まれ得る。

例示的コンストラクト。本明細書において考慮される操作されたポリペプチドの製造において有用なコンストラクトとして、以下の表４に示されるポリペプチドをコードするコンストラクトが挙げられる。

一般的な製造方法。本明細書に記載された操作されたポリペプチド化合物は、当技術分野で公知の、生物学的、化学的および／または組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。例示的方法は、本明細書ならびにその開示内容が参照によりその全文で、すべての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許第６，８７２，７００号；ＷＯ２００７／１３９９４１；ＷＯ２００７／１４０２８４；ＷＯ２００８／０８２２７４；ＷＯ２００９／０１１５４４；および米国公開第２００７／０２３８６６９号に記載されている。化合物を調製するためのその他の方法は本明細書に示されている。

本明細書に記載された操作されたポリペプチド化合物は、自動化または半自動化ペプチドシンセサイザーなどの標準的な固相ペプチド合成技術を使用して調製され得る。手短には、一般に、ＡＢＤおよび治療用ホルモンペプチドは、別個に製造され、次いで、一緒にコンジュゲートされ得るか、または単一ポリペプチドとして製造され得る。したがって、アルブミン結合ポリペプチド、治療用ホルモンまたは操作されたポリペプチドは、別法として、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を使用する非生物学的ペプチド合成、保護された反応性側鎖を有する第１の態様のポリペプチドを形成するためのアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の段階的カップリングを含む非生物学的ペプチド合成、ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去することおよび水溶液中でのポリペプチドのフォールディングによって製造され得る。したがって、正常なアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）および予め保護されたアミノ酸誘導体が、溶液中または有機溶媒中、固相支持体上でポリペプチド配列を逐次構築するために使用される。完全なポリペプチド配列が構築されると、保護基が除去され、ポリペプチドは、水溶液中でフォールディングすることが許される。

本開示内容に従う各ポリペプチドは、可逆的にフォールディングし、ＡＢＤドメインは、因子が付加されることなく３ヘリックスバンドルドメインに可逆的にフォールディングし、ひいては、自発的にフォールディングする。操作されたコンジュゲートは、例えば、本明細書に記載されるような任意の方法に従って、例えば、非生物学的ペプチド合成によって、アルブミン結合ポリペプチドを製造することおよび製造されたＡＢＤポリペプチドを、本明細書において定義された治療用ホルモンとコンジュゲートすることを含む方法によって製造され得る。本明細書におけるＡＢＤは、完全に可逆的にフォールディングする。これを、円二色性スペクトル分析：２０℃でとられた１つのスペクトルおよび９０℃に加熱し、続いて、２０℃に戻った後の第２のスペクトルによって評価した。この手順の間に、当技術分野において公知のＴｍを求め、変性ポリペプチドのフォールディング後に変化しないことがわかった。

典型的には、このような技術を使用して、α−Ｎ−カルバモイル保護されたアミノ酸および樹脂上で伸長中のペプチド鎖に付いているアミノ酸が、塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミンなど）の存在下、カップリング剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾールなど）の存在下、不活性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、塩化メチレンなど）中、室温でカップリングされる。α−Ｎ−カルバモイル保護基は、試薬（例えば、トリフルオロ酢酸、ピペリジンなど）を使用して、得られたペプチド樹脂から除去され、カップリング反応が、ペプチド鎖に付加されるべき次の所望のＮ保護アミノ酸を用いて反復される。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などといった適したＮ保護基が、当技術分野で周知である。ペプチドシンセサイザーにおいて使用される溶媒、アミノ酸誘導体および４−メチルベンゾヒドリル−アミン樹脂は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）から購入することができる。

一般に、固相合成は、商業的スケールへの優れた拡張性を有する直接的なアプローチであり、一般的に、比較的長い操作されたポリペプチドに適合するので、操作されたポリペプチドの化学合成には、固相ペプチド合成が使用され得る。固相ペプチド合成は、自動化ペプチドシンセサイザー（モデル４３０Ａ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用い、ＮＭＰ／ＨＯＢｔ（オプション１）システムおよびキャッピングを用いるｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学（APPLIED BIOSYSTEMS USER'S MANUAL FOR THE ABI 430A PEPTIDE SYNTHESIZER, Version 1.3B Jul. 1, 1988, section 6, pp. 49-70、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡを参照のこと）を使用して実施され得る。Ｂｏｃ−ペプチド−樹脂は、ＨＦ（−５℃〜０℃、１時間）を用いて切断され得る。ペプチドは、水および酢酸を交互に用いて樹脂から抽出され得、濾液を凍結乾燥した。Ｆｍｏｃ−ペプチド樹脂は、標準法に従って切断され得（例えば、Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12）。ペプチドはまた、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈシンセサイザー（モデルＭＰＳ３５０、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｙ．）を使用してアセンブルされ得る。

より良好な収率を提供した化学合成法を、化合物１１について以下のとおりに例示する。固相合成は、デフォルト「二重カップリング」設定を使用し、Ｆｏｍｃ−Ｐｒｏ−ＮｏｖａｓｙｎＴＧＴ樹脂（０．２ミリモル／ｇ）を使用するＰｒｅｌｕｄｅ６チャネルペプチドシンセサイザー（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）を使用して実施した。しかし、ＶＳ（アミノ酸位置５９〜６０）およびＫＴ（アミノ酸位置７１〜７２）配列については、シュードプロリン(pseudoproline)二重カップリングを使用し、アミノ酸Ｖ１９、Ｒ２０、Ｉ２３およびＰ３７については、三重カップリングを使用した。Ｈｉｓ１からＳｅｒ３９までのエキセンディン部分については、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ二重または三重カップリング（各約６０分、６×過剰の試薬）を、特に断りのない限り、２０％ピペリジン２×１５分を用いるブロッキングを用いて実施した。リンカーおよびＡＢＤ部分については、特に断りのない限り、２０％ピペリジン２×１５分を用いるブロッキングを用いてＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ二重カップリングを実施した（各約６０分、３×過剰の試薬）。ポリペプチド精製は、溶媒としてアセトニトリルを使用し、Ｃ５カラムでＲＰ−ＨＰＬＣ精製を使用して実施し、溶出されたサンプルを、溶媒としてアセトニトリルを使用するＣ１８カラムでの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣでの分析と、それに続く、第１のＲＰ−ＨＰＬＣにおいてより狭い勾配および溶媒としてアセトニトリルを使用するＣ１８カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣとによって同定した。所望の操作されたポリペプチドを含有する画分をプールし、凍結乾燥した。

本明細書に記載された化合物（エキセンディン、ＡＢＤ、リンカー、操作されたポリペプチド）はまた、Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harborなど、当技術分野で公知の方法を使用する組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。非ペプチド化合物は、当技術分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、リン酸含有アミノ酸およびこのようなアミノ酸を含有するペプチドは、Bartlett et al, 1986, Biorg. Chem., 14:356-377に記載されるものなどの当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。化合物は、当技術分野の方法を使用してか、または本明細書において記載されるようにコンジュゲートされ得る。

操作されたポリペプチドは、別法として、当技術分野で周知の組換え技術によって製造され得る。例えば、Sambrook et al., 1989（Id.）を参照のこと。組換え技術によって製造されたこれらの操作されたポリペプチドは、ポリヌクレオチドから発現され得る。当業者ならば、このような操作されたポリペプチドをコードする、ＤＮＡおよびＲＮＡを含めたポリヌクレオチドを、コドン使用の縮重を考慮して、野生型ｃＤＮＡ、例えば、エキセンディン−４から得ることができ、示された置換を組み込むよう望まれるように、さらに操作できることは理解するであろう。これらのポリヌクレオチド配列は、微生物宿主においてｍＲＮＡの転写および翻訳を促進するコドンを組み込み得る。このような製造配列は、当技術分野で周知の方法に従って容易に構築され得る。例えば、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＷＯ８３／０４０５３を参照のこと。上記のポリヌクレオチドはまた、適宜、Ｎ末端メチオニル残基をコードし得る。本発明において有用な非ペプチド化合物は、当技術分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、リン酸含有アミノ酸およびこのようなアミノ酸を含有するペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Bartlett and Landen, 1986, Bioorg. Chem. 14: 356-77を参照のこと。

操作されたポリペプチドコード配列を含有し、発現するために、さまざまな発現ベクター／宿主系が使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクトされたか、もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。組換えタンパク質製造において有用である哺乳類細胞として、それだけには限らないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞が挙げられる。タンパク質の組換え発現の例示的プロトコールは、本明細書に記載されており、および／または当技術分野で公知である。

そのようなものとして、新規の、有用なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクター、新規の有用な形質転換され、トランスフェクトされた原核生物および真核生物の宿主細胞（培養で増殖した細菌、酵母および哺乳類細胞を含む）の作製ならびに本操作されたポリペプチドを発現できるこのような宿主細胞の培養された増殖のための新規の、有用な方法において、ポリヌクレオチド配列は有用である。本明細書において、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、操作されたポリペプチドの産生不足が軽減される場合またはこのようなものの増大したレベルを必要とすることが満たされる場合において、遺伝子療法にとって有用であり得る。

本発明はまた、本操作されたポリペプチドの組換えＤＮＡ製造のプロセスを提供する。（ａ）ＤＮＡ分子の発現を促進する条件下で、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を培養することと、（ｂ）操作されたポリペプチドを得ることとを含む、操作されたポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞から、操作されたポリペプチドを製造するプロセスが提供される。

宿主細胞は、原核生物または真核生物のものであり得、細菌、哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、癌細胞またはその他の細胞）、酵母細胞および昆虫細胞などが挙げられる。

組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系もまた、当業者には周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングし、タンパク質活性を提供するのに有用となる特定の翻訳後修飾をもたらす特定の能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾として、それだけには限らないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングはまた、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能にとって重要であり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などといった種々の宿主細胞が、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするよう選択され得る。

あるいは、本発明の操作されたポリペプチドを作製するために、酵母系が使用され得る。操作されたポリペプチドＤＮＡのコーディング領域は、ＰＣＲによって増幅される。酵母プレ−プロ−αリーダー配列をコードするＤＮＡは、α接合因子遺伝子のヌクレオチド１〜２０を含有する１種のプライマーおよびこの遺伝子のヌクレオチド２５５〜２３５と相補的である別のプライマーを使用するＰＣＲ反応において、酵母ゲノムＤＮＡから増幅される（Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell, 30:933-43）。プレ−プロ−αリーダーコード配列および操作されたポリペプチドコード配列断片は、プロモーターが、成熟した操作されたポリペプチドと融合しているプレ−プロ−α因子からなる融合タンパク質の発現を指示するよう、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモーターを含有するプラスミド中にライゲーションされる。RoseおよびBroach（Rose & Broach, 1990, Meth. Enz., 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, CA）によって教示されるように、ベクターは、クローニング部位の下流のＡＤＨ２転写ターミネーター、酵母「２−ミクロン」複製起点、酵母ｌｅｕ−２ｄ遺伝子、酵母ＲＥＰ１およびＲＥＰ２遺伝子、大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子および大腸菌複製起点をさらに含む。β−ラクタマーゼおよびｌｅｕ−２ｄ遺伝子は、それぞれ、細菌および酵母における選択を提供する。ｌｅｕ−２ｄ遺伝子はまた、高レベルの発現を誘導する酵母中のプラスミドのコピー数の増大を促進する。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２遺伝子は、プラスミドコピー数の調節に関与しているタンパク質をコードする。

前述の段落において記載されたＤＮＡコンストラクトは、公知の方法、例えば、酢酸リチウム処理（Steams et al., 1990,. Meth. Enz. 185: 280-297）を使用して酵母細胞に形質転換される。ＡＤＨ２プロモーターは、増殖培地におけるグルコースの消耗の際に誘導される（Price et al., 1987, Gene 55:287）。プレ−プロ−α配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌を達成する。同時に、酵母ＫＥＸ２タンパク質が、成熟した操作されたポリペプチドからプレ−プロ配列を切断する（Bitter et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330-5334）。

本発明の操作されたポリペプチドはまた、市販の発現系、例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、酵母、例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）において組換えによって発現され得る。この系はまた、分泌を指示するプレ−プロ−α配列に頼るものであるが、挿入断片の転写は、メタノールによる誘導の際にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。分泌された操作されたポリペプチドは、例えば、細菌および哺乳類細胞上清から前記の操作されたポリペプチドを精製するために使用される方法によって酵母増殖培地から精製される。

あるいは、操作されたポリペプチドをコードするＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクター、例えば、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）中にクローニングされ得る。この操作されたポリペプチドをコードするベクターは、次いで、製造業者の指示書（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）または例えば、ｓＦ９タンパク質を含まない培地で増殖させたスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に感染させる公知の技術に従って使用され、組換えタンパク質を製造する。タンパク質は、精製され、当技術分野で公知の方法、例えば、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）およびその後の分子サイジングカラム（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して培地から濃縮され、適当な溶液、例えば、ＰＢＳ中に再懸濁される。全アミノ酸アミノ酸配列分析、例えば、Ｐｒｏｔｏｎ２０９０ペプチドシークエンサーでのエドマン分解またはそのＮ末端配列の確認ができるように、例えば、所望の操作されたポリペプチドの大きさが確認される単一バンドを示すことによってタンパク質を特性決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が使用され得る。

例えば、予測された成熟した操作されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のプロモーターおよび、適宜、リーダー配列（例えば、Better et al., 1988, Science 240:1041-1043を参照のこと）を含有するプラスミド中にクローニングされ得る。このコンストラクトの配列は、自動化配列決定によって確認され得る。次いで、プラスミドは、細菌のＣａＣｌ２インキュベーションおよび熱ショック処理を使用する標準手順を使用して大腸菌、ＭＣ１０６１株に形質転換される（Sambrook et al., Id.）。形質転換された細菌は、カルベニシリンを補給したＬＢ培地で増殖され、適した培地における増殖によって発現されたタンパク質の製造が誘導される。リーダー配列は、存在する場合には、成熟した操作されたポリペプチドの分泌に影響を及ぼし、分泌の際に切断される。分泌された組換え操作されたポリペプチドは、本明細書に記載された方法によって細菌培養培地から精製される。

あるいは、操作されたポリペプチドは、昆虫系において発現され得る。タンパク質発現のための昆虫系は、当業者に周知である。１つのこのような系では、スポドプテラ・フルギペルダ細胞において、またはトリコプルシア幼虫（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｌａｒｖａｅ）において外来遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。操作されたポリペプチドコード配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。操作されたポリペプチドの挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスを製造する。次いで、組換えウイルスを使用して、Ｓ．フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼虫に感染させ、そこで、本発明の操作されたポリペプチドが発現される（Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Engelhard et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227）。

別の例では、操作されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲによって増幅され、適当なベクター、例えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）中にクローニングされ得る。ｐＧＥＸベクターは、ベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ベクターのクローニング部位中に挿入されたＤＮＡ断片によってコードされるタンパク質とを含む融合タンパク質を製造するよう設計される。ＰＣＲのプライマーは、例えば、適当な切断部位を含むよう作製され得る。次いで、組換え融合タンパク質は、融合タンパク質のＧＳＴ部分から切断され得る。ｐＧＥＸ−３Ｘ／操作されたポリペプチドコンストラクトは、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中に形質転換され、個々の形質転換体が単離され、ＬＢ培地（カルベニシリンを補給した）中、０．４の波長６００ｎｍでの光学濃度に３７℃で増殖され、続いて、０．５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下で４時間さらにインキュベートされる。個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡが精製され、自動シークエンサーを使用して部分配列決定され、適切な配向での所望の操作されたポリペプチドをコードする遺伝子挿入断片の存在が確認される。

融合タンパク質は、細菌中で不溶性封入体として製造されると予測される場合には、上記のように、または以下のように精製され得る。細胞を、遠心分離によって収穫し、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡで洗浄し、０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）を用いて室温で１５分間処理する。溶解物を、超音波処理によって切断し、１２，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって細胞片をペレットにする。融合タンパク質を含有するペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８および１０ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％グリセロール上に層にし、６０００ｘｇで３０分間遠心分離する。ペレットを、Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含まない標準リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）に再懸濁する。変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Sambrook et al., Id.）において再懸濁されたペレットを分画することによって融合タンパク質をさらに精製する。ゲルを０．４ＭＫＣｌ中に浸漬して、タンパク質を可視化し、これを切り出し、ＳＤＳを欠くゲル−ランニングバッファー中で電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）する。ＧＳＴ／操作されたポリペプチド融合タンパク質が、細菌中で可溶性タンパク質として製造される場合には、ＧＳＴ精製モジュール（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製してもよい。

融合タンパク質は、消化に付して、成熟した操作されたポリペプチドからＧＳＴを切断しもよい。消化反応物（２０〜４０μｇ融合タンパク質、２０〜３０ユニットヒトトロンビン［０．５ｍＬＰＢＳ中、４０００Ｕ／ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）］を室温で１６〜４８時間インキュベートし、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして、反応生成物を分画する。ゲルを０．４ＭＫＣｌ中に浸漬し、タンパク質バンドを可視化する。操作されたポリペプチドの予測される分子量に対応するタンパク質バンドの同定は、自動シークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４７３Ａ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を使用する部分アミノ酸配列分析によって確認され得る。

本発明の操作されたポリペプチドの組換え発現の特に例示的な方法では、哺乳類２９３細胞が、リン酸カルシウム法によって、ｐＣＭＶベクター（５’ＣＭＶプロモーター、３’ＨＧＨポリＡ配列）中の操作されたポリペプチドｃＤＮＡおよびｐＳＶ２ｎｅｏ（ｎｅｏ耐性遺伝子を含有する）を含有するプラスミドを用いて同時トランスフェクトされ得る。一実施形態では、ベクターは、トランスフェクションに先立ってＳｃａＩを用いて直線化されなければならない。同様に、ｎｅｏ遺伝子が組み込まれた同様のｐＣＭＶベクターを使用する代替コンストラクトも使用され得る。０．５ｍｇ／ｍＬＧ４１８（ネオマイシン様抗生物質）を含有する増殖培地での１０〜１４日間の制限希釈による単細胞クローンから、安定な細胞株が選択される。細胞株は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって、操作されたポリペプチドの発現についてスクリーニングされ、高発現細胞株が、大規模増殖のために増やされる。

形質転換された細胞は、長期間の、高収率タンパク質製造のために使用されることが好ましく、そのようなものとして、安定な発現が望ましい。このような細胞が、所望の発現カセットとともに選択マーカーを含有するベクターで形質転換されると、細胞を、強化培地で１〜２日間増殖させ、その後、選択培地に交換する。選択マーカーは、選択に対する耐性を付与するよう設計され、その存在によって、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊は、細胞にとって適当な組織培養技術を使用して増殖され得る。

組換えタンパク質製造のために形質転換された細胞を回収するためには、いくつかの選択システムが使用され得る。このような選択として、それだけには限らないが、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。また、抗代謝産物耐性も、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシド、Ｇ４１８に対する耐性を付与し、また、クロルスルフロンに対する耐性を付与するｎｅｏおよびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏの選択の基準として使用され得る。有用であり得るさらなる選択可能な遺伝子として、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢまたはヒスチジンの代わりにヒスチノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）を利用するのを可能にするｈｉｓＤが挙げられる。形質転換体の同定のための可視指示を与えるマーカーとして、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質、ＧＵＳならびにルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンが挙げられる。

本発明の操作されたポリペプチドは、自動化ペプチド合成および組換え技術の両方の組み合わせを使用して製造され得る。例えば、エキセンディン化合物およびＡＢＤのいずれかまたは両方ならびに、適宜、リンカーは、合成によって、または組換えによって製造され、次いで、「天然の化学的ライゲーション」などの当技術分野で公知の方法および親化合物を連結するアミド結合が形成される公知のその変法を使用して一緒にライゲーションされ得る。例えば、参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２６，４６８号を参照のこと。あるいは、例えば、本発明の操作されたポリペプチドは、欠失、置換、挿入およびペグ化による誘導体化（またはその他の部分、例えば、ポリマー、脂肪酸アシル鎖、Ｃ末端アミド化）を含めた修飾の組合せを含有し得る。このような操作されたポリペプチドは、段階的に製造され得る。最初の段階では、欠失、置換、挿入およびそれらの任意の組合せの修飾を含有する中間体の操作されたポリペプチドは、記載されるような組換え技術によって製造され得る。次いで、本明細書に記載されるようなオプショナルな精製工程の後、中間体の操作されたポリペプチドは、適当なＰＥＧ化試薬（例えば、ＮｅＫｔａｒＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＳａｎＣａｒｌｏｓ、ＣＡ製）を用いる化学修飾によってＰＥＧ化され（またはその他の化学的誘導体化、例えば、アシル化、Ｃ末端アミド化に付され）、所望の操作されたポリペプチド誘導体が得られる。当業者ならば、上記の手順は、欠失、置換、挿入から選択される修飾、誘導体化および当技術分野で周知の修飾のその他の手段の組合せを含有し、本発明によって考慮される操作されたポリペプチドに適用するよう一般化され得るということは理解されよう。

Ｃ末端アミド化は、培養培地中に分泌されるα−因子融合タンパク質として、例えば、酵母（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））において合成されたグリシンアミノ酸によってＣ末端伸長された前駆体の使用によって達成され得る。精製後、操作されたポリペプチド前駆体のＣ末端グリシンは、酵素的アミド化、例えば、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によってアミドに変換され得る。例えば、Cooper et al., 1989, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258を参照のこと。参照によりその全文がすべての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許第６３１９６８５号も参照のこと。この開示は、α−アミド化酵素において十分に純粋であり、タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約２５ｍＵの比活性を示し、タンパク質分解不純物が十分に除かれていて、天然供給源から精製された基質または組換えＤＮＡ技術によって製造された基質とともに使用するのに適している、ラット由来のα−アミド化酵素を含む、酵素的アミド化のための方法を教示する。

ペプチドは、本明細書に記載されるものを含め、任意の数の当技術分野で公知の方法によって精製され得る。一方法では、ペプチドは、ＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａＰｒｅｐ３０００システムを使用してＲＰ−ＨＰＬＣ（分取用および分析用）によって精製される。ペプチドを単離するために、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８分取用カラム（１０ミクロン、２．２×２５ｃｍ；Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）が使用され得、純度は、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８分析用カラム（５ミクロン、０．４６×２５ｃｍ；Ｖｙｄａｃ）を使用して決定され得る。溶媒（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ_３ＣＮ）が、分析用カラムに１．０ｍｌ／分の流速でおよび分取用カラムに１５ｍｌ／分で送達され得る。アミノ酸分析は、ＷａｔｅｒｓＰｉｃｏＴａｇシステムで実施され、Ｍａｘｉｍａプログラムを使用して処理され得る。ペプチドは、気相酸加水分解（１１５℃、２０〜２４時間）によって加水分解され得る。加水分解物は、標準法によって誘導体化され、分析され得る[Cohen et al, THE PICO TAG METHOD: A MANUAL OF ADVANCED TECHNIQUES FOR AMINO ACID ANALYSIS, pp. 11-52, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989]。高速原子衝撃分析は、Ｍ−Ｓｃａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、Ｐａ．）によって実施され得る。質量較正は、ヨウ化セシウムまたはヨウ化セシウム／グリセロールを使用して実施され得る。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＢｉｏ−Ｉｏｎ２０質量分析計で、飛行時間検出を使用するプラズマ脱離法イオン化分析が実施され得る。

操作されたポリペプチド発現アッセイ。宿主細胞によるタンパク質発現のレベルをアッセイするための方法が利用可能である。宿主細胞によるタンパク質発現のレベルをアッセイするために有用な手順を以下の典型的なプロトコールにおいて例示する。約２５ｕｌのＢＬ２１大腸菌細胞を、２ｕｌのプラスミドＤＮＡ（操作されたポリヌクレオチドの発現ベクター）で形質転換する。細胞をプレーティングし、３７℃で一晩または室温で４８時間インキュベートしてもよい。単一コロニーを選択、使用して、４ｍｌの適当な抗生物質を有するＬＢ培地中で約６時間、種培養を増殖させてもよい。９００ｕｌのストックに１００ｕｌの８０％滅菌グリセロールを添加することによってグリセロールストックを調製してもよく、次いで、これを穏やかに混合し、−８０Ｃで保存してもよい。ＴＣＰ非誘導サンプルのために２５０ｕｌのサンプルを取り出してもよい。アリコート、例えば、２ｍｌの適当な抗生物質を含有するＭａｇｉｃ培地に、５ｕｌの種培養を用いて播種してもよく、次いで、これを、３７Ｃ、３００ｒｐｍで一晩（最大２４時間）インキュベートしてもよい。当技術分野で公知のように、Ｍａｇｉｃ培地は、自動誘導性である。あるいは、２５０ｍｌまたは１２５ｍｌのＴｈｏｍｐｓｏｎフラスコ中で６０ｍｌの適当な抗生物質を含有するＭａｇｉｃ培地に、６０ｕｌの種培養を用いて播種してもよく、次いで、これを、３０Ｃ、３００ｒｐｍで一晩（最大２４時間）インキュベートしてもよい。インキュベーション後、各試験管から２５０ｕｌの培養物を取り出し、細胞をペレットにしてもよい。細胞を１ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ中に再懸濁し、それに０．１容積（１００ｕｌ）のＰＯＰ培養試薬および１ｕｌのｒ−リゾチームを添加してもよい（ｒ−リゾチームバッファーでの１：７５０希釈）。混合物を十分に混合し、室温で少なくとも１０分間インキュベートしてもよい。次いで、調製物を、１４０００×Ｇで１０分間遠心分離してもよい。上清（可溶性画分）を取り出し、保持してもよく、ゲル分析のためのサンプルを調製してもよい（１５ｕｌ＋５ｕｌＬＤＳ）。残りの封入体ペレットを、超音波処理を用いて１ｍｌの１％ＳＤＳに再懸濁してもよい。ゲル分析のためのサンプルを調製してもよい（１５ｕｌ＋５ｕｌＬＤＳ）。非誘導サンプルのために、１．０容積のＰＯＰ培養試薬および１ｕｌのｒ−リゾチーム（ｒ−リゾチームバッファーでの１：７５０希釈）を添加してもよい。混合物を十分に混合し、室温で少なくとも１０分間インキュベートしてもよい。これらのサンプルは、遠心分離される必要がない場合もある。次いで、ゲル分析のためにサンプルを調製してもよい（１５ｕｌ＋５ｕｌＬＤＳ）。１×ＭＥＳバッファー中で非還元性ＮＵ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％）を実施し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅマイクロ波プロトコールを用いて染色してもよい。当技術分野で公知のように、脱染を一晩実施してもよい。ゲルイメージを保持し、分析して、タンパク質発現レベルを調べてもよい。

操作されたポリペプチドは、以下のとおりに発現および単離され得、単離された。所望の操作されたポリペプチドのタンパク質配列は、市販のソフトウェアを使用して設計され、大腸菌(E. coli)発現ベクター中にクローニングするためのＤＮＡ配列に逆翻訳された。核酸配列は、標準ＰＣＲ増幅技術を使用してオリゴヌクレオチドとして得られ、ライゲーションされたか、または標準制限酵素を使用して既存の発現コンストラクトから消化され、次いで、一緒にライゲーションされた。対象とするタンパク質を発現する配列を、誘導可能な発現のためにＴ７プロモーターを有するプラスミドｐＥＴ４５中に入れた。配列決定によってコンストラクトを確認した後、ベクターＤＮＡを精製し、発現宿主、一般に、ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。シングルコロニーを選択して、４ｍｌのＬＢ培地中で約６時間種培養を増殖させた。グリセロールストックは、９００μｌのストックに１００μｌの８０％グリセロールを添加することによって調製し、−８０℃で保存した。５００μｌの誘導されていないサンプルをゲル分析のために保持してもよい。１２５ｍｌのＴｈｏｍｐｓｏｎフラスコにおいて６０μｌの種培養を使用して、６０ｍｌの培養物（例えば、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）大腸菌発現培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ；Glenn et al., J. Biol. Chem. 2008, 283(19):12717-29）に播種し、３０℃で一晩インキュベートした。２５０μｌのサンプルを分析のために採取した。遠心分離することによって細胞をペレットとして回収し、後の処理のために凍結した。細胞抽出物の調製およびニッケル樹脂を用いる初回通過精製を、以下のとおりに実施した。大腸菌細胞ペレットを、出発培養容量に等しい容量の溶解バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に完全に再懸濁した。次いで、細胞を１００ｐｓｉのマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ＭＡ）に３回付した。細胞抽出物を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して、細片を除去した。ＥＧＴＡ（１５０ｍＭストック）を、３ｍＭＥＧＴＡの最終濃度に細胞抽出物に添加した。次いで、溶解物を、洗浄され、予め平衡化されたＮｉ−ＮＴＡスーパーフローカラムにアプライした。次いで、カラムと結合しているタンパク質を、溶解バッファーおよびＥＧＴＡ（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭＥＧＴＡ）を用いて洗浄し、その後、結合しているタンパク質を５０ｍＬの溶出バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて溶出した。Ｈｉｓ−タグの切断およびその後の精製は以下のとおりとした。溶出されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ１５遠心分離フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を用いて濃縮し、次いで、２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌを用いて希釈して、所望のタンパク質のＮ末端からＨｉｓタグを除去するプロテアーゼ消化のために調製した。タンパク質溶液に、０．１％のβ−メルカプトエタノールおよび１％のＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼ（２ｍｇ／ｍＬ、１０，０００ユニット／ｍｇ；Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎ、ＵＳＡ）を添加し、これを混合し、室温で４時間、次いで、４℃で一晩インキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、４５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を用いて予め平衡化した。ＴＥＶ消化反応物を、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いて２倍希釈した。希釈した消化反応物を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムの頂部に注意深くアプライし、フロースルーを回収した。カラムに１０ｍＬの５０ｍＭｔｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、４５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を添加して、あらゆる結合していないタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたタンパク質を、集め、組み合わせ、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨｉＬｏａｄ２６／６０カラム；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡを用いて２×）を使用して最終精製(polish)した。任意の残存する細菌性エンドトキシンを、ＥｎｄｏＴｒａｐＲｅｄ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造業者の使用説明書に従って使用して除去した。

封入体調製物。封入体画分中に見られる操作されたポリペプチドについては、以下の手順が有益であり得る。細胞ペレットを、各５０ｍｌの培養物に対して最少で１００ｍｌの溶解バッファー中に再懸濁してもよい。３０ｍｌを添加した時点で、１０ｍｌピペットを使用して再懸濁してもよく、次いで、試験管をさらなる７０ｍｌで洗浄してもよい。再懸濁された細胞溶液を、全プロセスを通じてチャンバーを氷水に維持するよう注意しながら、１００ＰＳＩ（分）のマイクロフルイダイザーを通して複数回実施してもよい、例えば、４回通過させてもよい。流動化されたスラリーを、１４０００×ｇで２０分間遠心分離してもよい（例えば、２５０ｍｌｎａｌｇｅｎｅボトルを使用して、ＪＬＡ１０．５、１０，０００ｒｐｍ）。封入体ペレットを、ピペットチップを用いて破壊した後、撹拌子および撹拌プレートを用いて氷上で冷却した溶解バッファー中に、４Ｃで１時間再懸濁してもよい。ペレットを、ピペットチップを用いて破壊した後、撹拌子および撹拌プレートを用いて、蒸留Ｈ_２Ｏに、４Ｃで１時間、２回目の再懸濁をし、それに続いて、１４０００×ｇで１５分間遠心分離してもよい。上清を取り出し、廃棄してもよい。得られたものは、−８０Ｃで保存してもよい。

タンパク質精製。本明細書に記載されるように、発現されたポリペプチドの単離のために多数の方法が知られている。分泌された操作されたポリペプチドが好ましい。しかし、以下は、封入体が形成される場合の一例である。封入体ペレットは、適当な容量の可溶化バッファー（８Ｍ尿素または８Ｍグアニジン、５０ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．７５）中で、室温で１時間可溶化され得る。可溶化されたペレットを、２７０００ｇで２０分間遠心分離してもよい。濾過された（例えば、０．４ｕｍ）上清を、室温で、適当な容量の再フォールディングバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ尿素、０．８Ｍアルギニン、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン；ｐＨ８）中に１滴ずつ移してもよい。次いで、得られたものを、穏やかに混合しながら、４℃に一晩またはそれ以上置いてもよい。ＧＥＨｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓＡＫＴＡＦＰＬＣを使用して、サンプルを濃縮し、４Ｃ環境中、１〜２ｍｌ／分でゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５２６／６０）に流してもよい。適当なタンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、プールし、第２のゲル濾過カラムを通して流してもよい。次いで、当技術分野で公知のように、プールされたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎフィルターで適当な濃度に濃縮し、例えば、ＥｎｄｏｓａｆｅＰＴＳリーダー（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）を使用してエンドトキシンレベルについてアッセイしてもよい。タンパク質サンプルがエンドトキシン判定基準を通ると、滅菌濾過し、アリコートに分配し、品質管理アッセイを通してもよい。品質管理アッセイは、およその質量を得るために分析用ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、非還元性ＳＤＳＰＡＧＥおよびＲＰＨＰＬＣ−ＭＳを含み得る。タンパク質は、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、４．３ｍＭリン酸ナトリウム、１．４ｍＭリン酸一カリウム、ｐＨ７．２）中で得、アリコートに分配し、−７０〜−８０℃で急速冷凍することができる。

ＩＶ．使用および疾患の治療方法
適応症。主に、ＧＬＰ−１受容体との相互作用による、例えば、エキセンディン−４による治療を受け入れられるものに基づいて、種々の疾患および障害が、本明細書に記載されたポリペプチド化合物および方法によって有益に治療されると考慮される。

肥満症および過体重。肥満症および過体重を含めたその関連障害は、米国および世界中で、よく見られ、極めて重篤な公衆衛生問題である。上半身肥満症は、２型真性糖尿病について知られている最強のリスク因子であり、心血管疾患の強いリスク因子である。肥満症は、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、卒中、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群などの生殖障害、乳房、前立腺および結腸の癌ならびに全身麻酔の合併症の頻度上昇の認識されているリスク因子である。例えば、Kopelman, 2000, Nature 404: 635-43を参照のこと。

肥満症は、寿命を減少させ、上記で列挙された併存症、同様に、感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、湿疹、運動不耐性、インスリン抵抗性、高血圧高コレステロール血症、胆石症、整形外科的傷害および血栓塞栓性疾患などの障害の深刻なリスクを伴う。例えば、Rissanen et al, 1990 Br. Med. J. 301: 835-7を参照のこと。肥満症はまた、インスリン抵抗性症候群または「シンドロームＸ」およびメタボリックシンドロームと呼ばれる状態の群のリスク因子である。肥満症および関連障害の世界的な医療費は、莫大である。

肥満症の病理発生は、多因子性であると考えられている。問題は、肥満の対象では、過剰の脂肪組織が存在するまで栄養素利用性とエネルギー消費が釣り合うようにならないということである。中枢神経系（ＣＮＳ）は、エネルギーバランスを制御し、動物の代謝状態に適当な、さまざまな行動、自律神経および内分泌活性を調和させる。これらの活性を制御する機序またはシステムは、前脳（例えば、視床下部）、後脳（例えば、脳幹）および脊髄中に広く分布している。最終的に、これらのシステムからの代謝（すなわち、栄養利用性）および認知（すなわち、学習された好み）情報が統合され、欲求（食物を探すこと）および完了（経口摂取）行動をとる決意がスイッチが入れられる（食事の調達および開始）か、またはスイッチが切られる（食事の終了）。視床下部は、主に、これらのシグナルを統合すること、次いで、脳幹に指令を発することに関与していると考えられている。完了運動制御システムの要素（例えば、咀嚼および嚥下に関与している筋肉）を制御する脳幹核。そのようなものとして、これらのＣＮＳ核は、文字通り、摂食行動の「最終共通路」を構成するといわれている。

神経解剖学的および薬理学的証拠は、エネルギーおよび栄養的ホメオスタシスのシグナルが前脳核において統合することおよび完了運動制御システムが脳幹核に、おそらくは、三叉神経運動核の周囲の領域中にあることを支持する。視床下部および脳幹間には大規模な相互接続がある。さまざまなＣＮＳに向けられた抗肥満症治療薬（例えば、小分子およびペプチド）は、主に、視床下部にある前脳基質に、および／または脳幹にある後脳基質に焦点をわせている。

肥満症は、不十分にしか治療可能でなく、慢性的であり、本質的に難治性の代謝障害のままである。したがって、対象における体重減少および／または体重維持において有用な新規治療の必要性が存在する。このような治療は、対象の健康に対する著しい有益な効果につながる。

糖尿病および心血管疾患。真性糖尿病は、糖尿病患者の間のすべての致死のうち６０％〜７０％が、心血管合併症の結果である複雑な慢性疾患と認識されている。糖尿病は、冠動脈心疾患リスク相当物と考えられるだけでなく、再発性心筋梗塞、鬱血性心不全および心血管インシデント後の死亡を含めた有害事象の独立した予測因子としても同定されている。より密接なグルコース管理および心血管リスク因子の積極的な治療を採ることで、冠動脈心疾患合併症のリスクが低減され、糖尿病患者の間の全体的な生存が改善されると予測される。しかし、糖尿病患者は、非糖尿病患者よりも、２〜３倍、急性心筋梗塞を経験する可能性が高く、糖尿病患者は、非糖尿病患者よりも８〜１３年少なくしか生存しない。

糖尿病性／急性心筋梗塞患者のハイリスク性を理解することで、不安定狭心症または非ＳＴ上昇型心筋梗塞（まとめて「ＡＣＳ」と呼ばれる）を有する入院患者の管理のための米国心臓病学会／米国心臓協会（ＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ／ＡｍｅｒｉｃａｎＨｅａｒｔＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（「ＡＣＣ／ＡＨＡ」）臨床実践ガイドラインは、入院している糖尿病患者は、高血糖症の積極的な管理を必要とする特別な集団であるということを最近認識した。具体的には、ガイドラインは、入院している糖尿病／ＡＣＳ患者のグルコース低下治療は、１０ｍｇ／ｄＬ未満の摂食前グルコース、１８０ｍｇ／ｄＬ未満の最大１日標的および７％未満の退院後ヘモグロビンＡ１ｃを達成することを標的としなくてはならないと述べている。

高齢のＡＣＳ患者の全国的なサンプルでは、糖尿病患者における３０日死亡率の増大は、病院に入院した時点で高グルコース値を有する患者と対応していることが実証された。“Diabetic Coronry Artery Disease & Intervention”, Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, September 20, 2002を参照のこと。入院時に一時的に上昇したグルコースではなく持続した高血糖症は、重篤有害事象と関連しているという証拠はますます増えている。患者における高血糖症および血管リスクの理想的な測定基準は、容易にはわからないが、入院期間の間の平均グルコース値は、死亡率を最も予測するものであるようである。米国中の４０を超える病院から得られたＡＣＳ患者の別個の研究では、入院時のランダムなグルコース値とは対照的に、持続性高血糖症が、院内死亡率をより予測するものであるということがわかった。Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, September 21, 2002を参照のこと。入院時のグルコース値と比較して、全入院期間にわたるグルコース管理のロジスティック回帰モデルが、死亡率を最も予測するものであった。１２０ｍｇ／ｄＬを超えるグルコースの１０ｍｇ／ｄＬの増大ごとに、入院期間の間の死亡率のリスクがほぼ２倍の増大した。継続糖尿病／ＡＣＳ患者のより小さいコホートでは、入院時にグルコースレベルの増大を伴う場合には、１年で死亡率が段階的に増加した。病院環境では、ＡＣＣ／ＡＨＡガイドラインは、入院期間の間により低い血糖を達成するための積極的なインスリン治療の開始を示唆する。

脂質調節疾患。脂質異常症は、血液中の正常な脂質成分の破壊である。インスリンレベルの長期の上昇は、脂質異常症につながり得ると考えられる。高脂血症は、血液中の脂質および／またはリポタンパク質の上昇したまたは異常なレベルの存在である。脂肪肝疾患、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、単純な脂肪肝（脂肪症）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、さらに硬変（不可逆性、肝臓の進行した瘢痕）の範囲の広いスペクトルの肝臓疾患を指す。すべての段階のＮＡＦＬＤが、共通して、肝臓細胞（肝細胞）における脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。

さらに、何らかの理論に拘束されようとは思わないが、２型糖尿病における相対的インスリン欠乏、グルコース毒性および門脈を通る腹部脂肪組織内からのデリバリーの上昇による肝臓遊離脂肪酸負荷の増大が、脂肪肝障害における可能性ある原因と関与していると考えられている。実際、摂食行動が、ＮＡＳＨを含めた多数の当然の結果を伴う肥満症のメタボリックシンドロームを駆動する重要な因子であると仮説が立てられている。したがって、２型糖尿病においてすでに実証されているように、食物摂取の減少および少ない食事の数の増大を目的とする治療は、ＮＡＳＨを有効に治療し、予防し得る。インスリン分泌および体重減少を促進し、胃内容排出を遅延する薬物はまた、糖耐性の改善に有効であり、したがって、その付随する高インスリン血症を伴う脂肪肝を改善し得る。したがって、エキセンディン、エキセンディン類似体アゴニスト、エキセンディン誘導体アゴニスト、特に、エキセンディン−４の使用は、この状態のための治療様式としてよく適したものであり得る。したがって、エキセンディンまたはその生物学的に活性な（ホルモンドメイン）ペプチド成分または断片または類似体を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、脂肪肝障害の治療において有用であり得る。

アルツハイマー病。アルツハイマー病（ＡＤ）は、当技術分野で公知のように、Ａ−βタンパク質の調節不全を含む脳中のプラークおよびもつれを伴う。ニューロンＧＬＰ−１受容体の刺激は、ニューロンの可塑性および細胞生存の調節において重要な役割を果たすと報告されている。ＧＬＰ−１受容体の刺激は、培養ニューロン細胞において、神経突起成長を誘導し、興奮毒性細胞死および酸化的傷害を保護すると報告されている。ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４は、マウス脳中のアミロイド−βペプチド（Ａ−βタンパク質）の内因性レベルを低減し、ニューロン中のβ−アミロイドタンパク前駆体（β−ＡＰＰ）のレベルを低減すると報告された。例えば、Perry et al., 2004, Curr. Drug Targets 5(6):565-571参照のこと。本明細書に開示された操作された化合物を用いる治療は、アルツハイマー病と関連している治療標的に利益を提供し得る。

パーキンソン病。パーキンソン病（ＰＤ）は、「一次性パーキンソニズム」すなわち、任意の続発性全身性原因を伴わない神経変性プロセスによる孤立性パーキンソニズムの同義語である。パーキンソニズムは、ドーパミンの喪失によって引き起こされる振戦、硬直および運動の緩徐化を特徴とする。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、エキセンディン−４は、ミクログリア不活性化因子として機能することによってドーパミンニューロンの生存因子として作用し得ると考えられ、エキセンディン−４は、ＰＤなどの神経変性性疾患の有用な治療薬であり得るということを示唆する。

メタボリックシンドロームＸ。メタボリックシンドロームＸは、インスリン抵抗性、脂質異常症、高血圧症および脂肪組織の内臓分布を特徴とし、２型糖尿病の病態生理学において中心的な役割を果たす。また、ＮＡＳＨ、繊維症および肝臓の硬変と強力に相関しているとわかった。したがって、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、メタボリックシンドロームＸの治療において有用であり得る。

ステロイド誘導性糖尿病。グルココルチコイドは、炭水化物代謝に影響を及ぼすと周知である。外因性グルココルチコイド投与に応じて、肝臓グルコース産生の増大ならびにインスリン分泌および末梢組織におけるインスリン刺激性グルコース取り込みの低減が観察される。さらに、グルココルチコイド治療は、当技術分野で公知のように、プロインスリン（Ｐ１）／免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）比を変更する。糖尿病を伴わない対象におけるグルココルチコイドによって誘発される高血糖症の通常の特徴として、空腹時血糖の最小上昇、過剰な食後高血糖、外因性インスリンに対する非感受性およびメトホルミンまたはスルホニル尿素治療に対する非反応性が挙げられる。したがって、エキセンディン生物学的に活性な（ホルモンドメイン）ペプチド成分またはその断片または類似体を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ステロイド誘発性糖尿病の治療において有用であり得る。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）治療誘発性糖尿病。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を日常的な臨床用途に導入して間もなく、ＰＴ使用を高血糖症の発生と結びつける報告が表れ始めた。ＰＩで治療されるＨＩＶ感染対象のおよそ１％〜６％が、真性糖尿病を発症するが、相当に大きな集団が、インスリン抵抗性および耐糖能異常を発症する。したがって、エキセンディン生物学的に活性な（ホルモンドメイン）ペプチド成分またはその断片または類似体を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ＨＩＶ治療によって誘発された糖尿病の治療において有用であり得る。

成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）。成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）としても知られる進行性の自己免疫性糖尿病は、２型糖尿病と診断された患者のおよそ１０％中に存在すると考えられている。ＬＡＤＡ患者は、島細胞細胞質抗原またはより頻繁には、グルタミン酸デカルボキシラーゼのいずれかに対して循環抗体を有する。これらの対象は、１型および２型糖尿病両方の臨床上の特徴を示す。インスリン分泌は、自己免疫性糖尿病の急速に進行する型においてよりも、遅い進行においてより良好に保たれるが、ＬＡＤＡ対象では、インスリン分泌は、時間とともに悪化する傾向がある。したがって、エキセンディンの生物学的に活性な（ホルモンドメイン）ペプチド成分またはその断片または類似体を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ＬＡＤＡの治療において有用であり得る。

無自覚性低血糖（ＨＵ）。低血糖症の単回のみの最近のエピソードの後でさえ、不完全なグルコース対抗制御が起こり得る。低血糖症の反復エピソードを経験する対象は、通常、低血糖症と関連する症状または切迫インスリンショック、「無自覚性低血糖」と呼ばれる状態を認識するその能力を失うことが多い。患者は自身の状態を理解しないので、血糖レベルが、昏睡および痙攣を含めた深刻な神経学的問題が結果として生じるほど低く落ちることがある。したがって、エキセンディンの生物学的に活性な（ホルモンドメイン）ペプチド成分またはその断片または類似体を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ＨＵの治療において有用であり得る。

拘束性肺疾患。ＧＬＰ１受容体は、肺に局在している。エキセンディンは、ＧＬＰ−１受容体を介する生物学的応答を誘発し得る。特に、サルコイドーシスは、肺を頻繁に巻き込む全身性の肉芽腫性疾患である。古典的に、拘束性肺疾患と考えられるが、過去何年かにおいて気道閉塞がこの疾患の認識される特徴となった。サルコイドーシスは、任意のレベルで気道に影響を及ぼし得、関与が小さい気道を含む場合には、喘息および慢性気管支炎などのより一般的な閉塞性気道疾患と似ていることもある。したがって、エキセンディンの生物学的に活性な（ホルモンドメイン）ペプチド成分またはその断片または類似体を含む操作されたポリペプチドは、このようなホルモンドメインペプチドが肺の弾性を改善するか、または強剛性を遅延させ得るので、拘束性肺疾患の治療において有用であり得る。

短腸症候群（ＳＢＳ）。エキセンディン−４は、短腸症候群の治療にとって有効であると報告されている。Kunkel et al. Neurogastroenterol. Motil. (2011)参照のこと。ＳＢＳは、下痢および栄養欠乏を特徴とする重篤な臨床障害である。回腸においてＬ−細胞によって産生されるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、近位腸通過を調節する。ＳＢＳにおいてのように広範囲の回腸切除が生じると、ＧＬＰ−１レベルが不十分となる場合がある。エクセナチドが、ＳＢＳの患者の栄養状態および腸の症状を改善した。したがって、ＳＢＳ患者は、本明細書に記載された操作されたポリペプチドを用いる治療を受け入れられる。排便の頻度および形態を改善することならびにもはや食事と関連していない排便を得ることが達成され得る。さらなる利益は、総非経口栄養が停止され得るということである。本明細書におけるこれらの化合物は、ＳＢＳ患者の排便習慣、栄養の状態および生活の質の実質的な改善を提供し、さらに非経口栄養および小腸移植の必要性を低減し得る。

したがって、一態様では、対象において疾患または障害を治療する方法が提供される。対象は、疾患または障害の治療を必要とするものである。いくつかの実施形態では、対象は、肥満症の治療を必要とする。疾患または障害は、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、脳卒中、ＳＢＳまたは高脂血症または本明細書において論じられるその他の疾患である。糖尿病は、Ｉ型、ＩＩ型、妊娠性または前糖尿病ならびにＨＩＶまたはステロイド誘発性糖尿病を含み得る。治療法は、本明細書に記載されたような操作されたポリペプチドを、疾患または障害を治療するのに有効な量で対象に投与することを含む。これらの疾患にとって特に有用なものとして、グルコース低下活性を有する（例えば、ＡＢＤと連結しているエキセンディン−４またはその断片または類似体）、体重の低減または食物摂取活性の低減、ＨｂＡ１ｃの低下、胃内容排出の遅延、血漿グルカゴンの低下および／または腸管運動性の利益を有する本明細書に記載された化合物がある。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、糖尿病、過体重または肥満症または脂質異常症または高脂血症である。操作されたポリペプチドは、ＡＢＤおよびＨＤ１ポリペプチド、ＨＤ１がエキセンディンまたはその断片または類似体である場合には、適宜、リンカーＫ１を含み得る。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造：ＨＤ１−ＡＢＤまたはＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤを有し得る。いくつかの実施形態では、エキセンディンは、好ましくは、エキセンディン−４またはＬｅｕ１４エキセンディン−４である。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、糖尿病、過体重、肥満症、脂質異常症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、ＳＢＳまたは高脂血症である。操作されたポリペプチドは、エキセンディンまたはその断片または類似体を含み得る。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造：ＨＤ１−ＡＢＤまたはＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤのうち１種を有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチド中のエキセンディンは、好ましくは、エキセンディン−４またはその類似体Ｌｅｕ１４エキセンディン−４である。いくつかの実施形態では、エキセンディン断片は、エキセンディン−４の断片である。いくつかの実施形態では、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４と、少なくとも７０％、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに高い同一性を有する。これらの疾患にとって特に有用なものとして、グルコース低下活性を有する（例えば、ＡＢＤと連結しているエキセンディン−４またはその断片または類似体）、体重の低減または食物摂取活性の低減、ＨｂＡ１ｃの低下、胃内容排出の遅延、血漿グルカゴンの低下または腸管運動性の利益を有する本明細書に記載された化合物がある。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、糖尿病、過体重、肥満症、脂質異常症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、ＳＢＳまたは高脂血症である。操作されたポリペプチドは、エキセンディンまたはその断片または類似体を含み得る。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造：ＨＤ１ＡＢＤまたはＨＤ１Ｌ１ＡＢＤのうち１種を有し得る。いくつかの実施形態では、エキセンディンは、好ましくは、エキセンディン−４またはその類似体Ｌｅｕ１４エキセンディン−４である。いくつかの実施形態では、エキセンディン断片は、エキセンディン−４の断片である。いくつかの実施形態では、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４と、少なくとも７０％、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに高い同一性を有する。これらの疾患にとって特に有用なものとして、グルコース低下活性を有する（例えば、ＡＢＤと連結しているエキセンディン−４またはその断片または類似体）、体重の低減または食物摂取活性の低減、ＨｂＡ１ｃの低下、胃内容排出の遅延、血漿グルカゴンの低下または腸管運動性の利益を有する本明細書に記載された化合物がある。

疾患または障害は、糖尿病、過体重、肥満症、脂質異常症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、ＳＢＳ、高脂血症、パーキンソン病または心血管疾患または本明細書に記載されたその他の疾患であり得る。操作されたポリペプチドは、エキセンディンまたはその断片または類似体を含み得る。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造：ＨＤ１ＡＢＤまたはＨＤ１Ｌ１ＡＢＤのうち１種を有し得る。いくつかの実施形態では、エキセンディンは、好ましくは、エキセンディン−４またはその類似体Ｌｅｕ１４エキセンディン−４である。いくつかの実施形態では、エキセンディン断片は、エキセンディン−４の断片である。いくつかの実施形態では、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４と、少なくとも７０％、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに高い同一性を有する。これらの疾患にとって特に有用なものとして、グルコース低下活性を有する（例えば、ＡＢＤと連結しているエキセンディン−４またはその断片または類似体）、体重の低減または食物摂取活性の低減、ＨｂＡ１ｃの低下、胃内容排出の遅延、血漿グルカゴンの低下または腸管運動性の利益を有する本明細書に記載された化合物がある。

本明細書に記載された化合物および方法によって治療され得るさらなる疾患および障害として、ステロイド誘発性糖尿病、ＨＩＶ治療誘発性糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、無自覚性低血糖（ＨＵ）、サルコイドーシスを含めた拘束性肺疾患およびメタボリックシンドロームＸが挙げられる。操作されたポリペプチドは、エキセンディンまたはその断片または類似体を含み得る。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造：ＨＤ１−ＡＢＤまたはＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤのうち１種を有し得る。いくつかの実施形態では、エキセンディンは、好ましくは、エキセンディン−４またはその類似体Ｌｅｕ１４エキセンディン−４である。いくつかの実施形態では、エキセンディン断片は、エキセンディン−４の断片である。いくつかの実施形態では、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４と、少なくとも７０％、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに高い同一性を有する。これらの疾患にとって特に有用なものとして、グルコース低下活性を有する（例えば、ＡＢＤと連結しているエキセンディン−４またはその断片または類似体）、体重の低減または食物摂取活性の低減、胃内容排出の遅延、ＨｂＡ１ｃの低下、血漿グルカゴンの低下または腸管運動性の利益を有する本明細書に記載された化合物がある。操作されたポリペプチドは、ホルモンドメインとして、エキセンディンまたはその類似体または断片のみを含み得る。疾患または障害は、糖尿病、過体重、肥満症、脂質異常症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、ＳＢＳ、高脂血症、パーキンソン病または心血管疾患または本明細書に記載されたその他の疾患であり得る。操作されたポリペプチドは、エキセンディンまたはその断片または類似体を含み得る。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造：ＨＤ１−ＡＢＤまたはＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤのうち１種を有し得る。ＡＢＤと連結しているエキセンディン−４またはその断片または類似体）、体重の低減または食物摂取活性の低減、胃内容排出の遅延、血漿グルカゴンの低下または腸管運動性の利益を有する。

本明細書に記載された化合物および方法によって治療され得るさらなる疾患および障害として、ステロイド誘発性糖尿病、ＨＩＶ治療誘発性糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、無自覚性低血糖（ＨＵ）、サルコイドーシスを含めた拘束性肺疾患およびメタボリックシンドロームＸが挙げられる。操作されたポリペプチドは、好ましくは、以下の構造：ＡＢＤに連結するＨＤ１−類似体またはＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤのうち１種を有する。いくつかの実施形態では、エキセンディンは、好ましくは、エキセンディン−４またはその類似体Ｌｅｕ１４エキセンディン−４である。いくつかの実施形態では、エキセンディン断片は、エキセンディン−４の断片である。いくつかの実施形態では、エキセンディン類似体は、エキセンディン−４と、少なくとも７０％、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに高い同一性を有する。

Ｖ．アッセイ
本明細書に記載された操作されたポリペプチドを製造およびアッセイする方法は、一般に、当業者に利用可能である。さらに、特定の方法は、本明細書に、ならびに参照により、このさらなる目的のために本明細書に組み込まれる、本明細書に引用された特許公報およびその他の参考文献に記載されている。

ＧＬＰ−１受容体結合および機能アッセイ：ＧＬＰ−１受容体結合活性および親和性は、任意の数の公知の方法で測定され得る。例えば、一方法では、結合活性が、受容体供給源がＲＩＮｍ５Ｆ細胞膜であり、リガンドが、［^１２５Ｉ］ＧＬＰ−１またはヨウ化エキセンディン（１−３９）またはヨウ化エキセンディン（９−３９）である結合置換アッセイを使用して測定される。ホモジナイズされたＲＩＮｍ５Ｆ細胞膜を、４０，０００ｃｐｍ［^１２５Ｉ］ＧＬＰ−１（またはエキセンディン）トレーサーおよび種々の濃度の試験化合物を有する２０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー中、２３℃で２時間、一定に混合しながらインキュベートする。反応混合物を、０．３％ＰＥＩ溶液を用いて予め浸漬させたガラスフィルターパッド通して濾過し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水を用いてすすぐ。結合しているカウントを、シンチレーションカウンターを使用して測定する。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用して結合親和性を算出する。

機能的ＧＬＰ−１受容体活性化についてのインビトロアッセイは、公知の方法および細胞および組織を使用して実施され得る。例えば、ＧＬＰ−１受容体保有細胞のエキセンディン−４刺激は、アデニレートシクラーゼ活性化、ｃＡＭＰ合成、膜脱分極増大、細胞内カルシウムの上昇およびグルコース誘導性インスリン分泌の増大を誘導し得る。例えば、Holz et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(30):17749-57参照のこと。ｒＭＴＣ６−２３（クローン６）細胞株を使用する細胞ベースのアッセイを使用して、生じたｃＡＭＰに基づいて、化合物のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を決定できる。生物検定法の一実施形態では、化合物のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性は、６−２３（クローン６）細胞を用いる細胞ベースのアッセイにおけるｃＡＭＰ産生との相関関係によって定量的に決定される。細胞ベースのアッセイは、生存６−２３（クローン６）細胞を使用する。６−２３（クローン６）細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＡＴＣＣ（登録商標）番号ＣＲＬ−１６０７（商標）として、およびＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓからＥＣＡＣＣ番号８７０４２２０６として入手可能である。別の実施形態では、細胞ベースのアッセイは、均一時間分解蛍光アッセイ（ＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓＴｉｍｅ−ＲｅｓｏｌｖｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ）（ＨＴＲＦ（登録商標））である。ＨＴＲＦ（登録商標）キットは、ＣｉｓｂｉｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ベッドフォード、マサチューセッツ）から市販されている。ＨＴＲＦ（登録商標）キットを使用する方法は、当技術分野で公知であり、キットは、一般に、例えば、サンプル、標準、較正曲線およびの調製の仕方および実験の実施の仕方に関する使用説明書マニュアルを含む。均一時間分解蛍光細胞ベースのアッセイは、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５２７，６８４号およびＣｉｓｂｉｏＨＴＲＦ（登録商標）ＰｒｏｄｕｃｔＣｅｎｔｅｒから入手可能な文書参照番号６２ＡＭ４ＰＥＢｒｅｖ０２（２００７年８月）に記載されている。開示内容が参照により本明細書に組み込まれるｗｗｗ．ｈｔｒｆ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｐｅｒ／ｃａｍｐ／を参照のこと。好ましい方法では、生物検定法は、Ｃｉｓｂｉｏからカタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＢとして入手可能なＨＴＲＦ（登録商標）ｃＡＭＰｄｙｎａｍｉｃ２１，０００アッセイキットを使用する細胞ベースのアッセイにおいてラット甲状腺癌腫６−２３（クローン６）細胞を使用する。ＨＴＲＦ（登録商標）標準および較正は、キット中の使用説明書に従って調製する。アッセイは、アルブミンの存在を伴って実施してもよく、伴わずに実施してもよい。

活性および作用持続期間および薬物動態についてのインビボアッセイは、公知の方法を使用して行われ得る。例えば、持続期間は、薬物が対象に、グルコースが経口投与される（薬物作用持続期間を測定するために；ＯＧＴＴＤＯＡ）前の所望の時点で投与され、グルコース血液レベルが測定される経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）（例えば、マウスにおいて容易に行われる）を使用して実施され得る。活性および持続期間はまた、薬物が対象に、グルコースがＩＶ投与される前の所望の時点で投与され（ＩＶＧＴＴＤＯＡ）、血糖レベルが測定される静脈内糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）（例えば、ラットにおいて容易に行われ得る）を使用して測定され得る。好ましい操作された化合物は、薬物の単回用量後の少なくとも２４時間、好ましくは、薬物の単回用量が与えられた後、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日および少なくとも１週間の期間の血糖に対して所望の効果を有する。

例えば、試験ポリペプチドを、ベースラインサンプルの直後のｔ＝０で、ＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓ雌マウスに皮下注射する。血液サンプルを、１日目の間にｔ＝２、４および８時間などの所望の時間で採取し、次いで、５日目までまたは７日目までまたはそれより長く毎日採取する。血糖を、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．、ａＪｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎＣｏｍｐａｎｙ、ミルピタス、カリフォルニア）を用いて測定する。薬物のグルコース制御活性などの活性持続期間（ＤＯＡ）測定のために、薬物投与後の所望の時点でＯＧＴＴまたはＩＶＧＴＴを実施してもよい。体重および食物摂取またはその他の薬理学的もしくは薬物動態パラメータも測定できる。例えば、雌のＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウス（８〜２０週齢）を、０６００に明かりをつける１２：１２時間明暗周期で飼育される群とする。水および標準のペレット化マウス固形飼料食は、記載されない限りは自由に利用可能とした。実験の朝に、動物を実験群にわけ、およそ０６３０時に絶食を開始する。通常の研究では、ｎ＝２ケージとし、３匹のマウス／ケージとする。時間＝０分で、血糖サンプルを採取し、直ちに、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜２５ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の量のビヒクルまたは化合物の腹膜内注射を続ける。血糖は、３０、６０、１２０、１８０および２４０分で、また単回用量後１週間以上、毎日測定され得る。実験の変法では、用量を、１４もしくは２８日などの長期間にわたって毎日かまたは毎週でさえ提供する。治療前パーセントは、測定時点、例えば、６０分または１日での血糖を、時間＝０分での血糖によって除することによって算出する。有意な治療効果は、ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）によって同定した。有意差が存在する場合には、ダネット検定（Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ｖ．４．０１、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用して試験平均を対照平均と比較する。血糖は、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．、ａＪｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎＣｏｍｐａｎｙ、ミルピタス、カリフォルニア）を用いて測定され得る。＊ビヒクル対照に対してｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、ダネット検定。その他のパラメータも測定され得る。

食物摂取阻害のインビボアッセイ：操作されたポリペプチドは、食欲抑制のその持続期間および程度について、ならびに体重減少に対する効果のその持続期間および程度について、種々の公知の方法で試験され得る。例えば、ポリペプチドは、マウス食物摂取アッセイにおいて食欲抑制について、また食事誘発性肥満症（ＤＩＯ）マウスにおいて体重増加に対するその効果について試験され得る。このようなアッセイの実験プロトコールを以下に記載する。

例えば、雌のＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウス（８〜２４週齢）が、０６００に明かりをつける１２：１２時間明暗周期で飼育される群である。水および標準のペレット化マウス固形飼料食は、記載されない限りは自由に利用可能とする。動物を、実験の１日前に、およそ１５００時に開始して絶食させる。実験の朝に、動物を実験群にわける。典型的な研究では、ｎ＝４ケージであり、３匹のマウス／ケージである。時間＝０分で、すべての動物に、典型的には、約２ｎｍｏｌ／ｋｇ〜７５ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の量で、媒体または試験化合物の腹膜内注射を施し、直ちに、予め秤量した量（１０〜１５ｇ）の標準固形飼料を与える。種々の時間、典型的には、３０、６０および１２０分またはより長い間隔、例えば毎日、食物を除去し、秤量して、消費された食物の量を調べる（Morley, Flood et al., 1994, Am. J. Physiol. 267:R178-R184）。時間＝０で最初に提供された食物の重量から、例えば、３０または６０分の時点で残っている食物の重量を差し引くことによって食物摂取を算出する。ＡＮＯＶＡによって有意な治療効果が同定される（ｐ＜０．０５）。有意差が存在する場合には、ダネット検定を使用して試験平均を対照平均と比較する（Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ｖ．２．０１、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）。体重も測定され得る。

体重、脂肪再分布および除脂肪体重アッセイ：体重および関連効果についての活性アッセイも、以下のとおりに実施され得る。スプラーグドーリーラットにおける食事誘発性肥満症（ＤＩＯ）は、肥満症およびエネルギー恒常性の調節の研究のための有用なモデルである。これらのラットは、脂肪およびエネルギーの比較的高い食事で肥満症になりやすい（Ｃｒｌ：ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）ＢＲ）ラットの系統から開発された。例えば、Levin, 1994, Am. J. Physiol. 267:R527-R535、Levin et al., 1997, Am. J. Physiol. 273:R725-R730を参照のこと。ＤＩＯ雄のラットは、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（ウィルミントン、マサチューセッツ）から入手した。ラットは、１２／１２時間明暗周期で２２℃のシューボックスケージに個別に収容する。ラットは、中程度高脂肪食（脂肪から３２％ｋｃａｌ；ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓＤ１２２６Ｂ）で自由に維持する。動物は、通常、約５００ｇの平均体重を達成する。ＬｅｖｉｎＤＩＯラットは、ケージング環境に７日間慣らされる。３晩の慣れの間に、動物にビヒクルの単回腹膜内（ＩＰ）注射を投与する。試験日に、暗期の開始にラットに化合物またはビヒクル（例えば、１０％ＤＭＳＯ）の単回ＩＰ注射を投与する。食物摂取は、自動食物摂取測定システム（ＢｉｏＤＡＱ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ）によって、研究の過程を通じて５秒間隔で測定する。体重は、毎晩記録する。

身体組成は、ＮＭＲ（ＥｃｈｏＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ、ヒューストン、テキサス）を使用して薬物治療の前後に測定され得る。身体組成測定のために、ラットを、十分に換気したプレキシガラスチューブ中に短期間（約１分）入れ、次いで、それを特殊化したげっ歯類ＮＭＲ機器中に挿入した。これによって、脂肪および乾燥除脂肪組織の実際のグラムの変化（例えば、治療後の体脂肪のグラム−ベースラインでの体脂肪のグラム＝体脂肪のグラムの変化）および脂肪および乾燥除脂肪組織の身体組成％の変化（例えば、治療後の体脂肪％−ベースラインでの体脂肪％＝体脂肪％の変化）の算出が可能となった。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして表されている。分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびポストホック検定を使用して、群差について調べる。Ｐ−値＜０．０５が有意と考えられる。統計分析およびグラフ作成は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＰＲＩＳＭ（登録商標）４（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用して実施される。グラフおよび結果は、通常、体重パーセント、体脂肪および身体タンパク質の変化においてビヒクル補正された変化として示される。

ＶＩ．医薬組成物
一態様では、本明細書に記載された化合物を、医薬上許容される賦形剤（例えば、担体）と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。本明細書において、用語「医薬上許容される担体」とは、医薬賦形剤、例えば、活性剤と有害に反応しない、腸内または非経口適用に適した医薬上、生理学上許容される有機または無機担体物質を指す。適した医薬上許容される担体として、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液など）、アルコール、オイル、ゼラチンおよびラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチセルロース（ｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）およびポリビニルピロリジンが挙げられる。このような調製物は滅菌され得、必要に応じて、本発明の化合物と有害に反応しない滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、着色料および／または芳香族物質などといった補助剤と混合され得る。

さらなる態様において、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドを、医薬上許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるような経口医薬組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、持続性医薬組成物である。医薬組成物の投与と関連して用語「持続性」とは、作用持続期間を指す。したがって、持続性医薬組成物は、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１カ月またはいっそう長い間隔で投与され得る。一実施形態では、投与は１日につき２回（すなわち「１日２回」）である。好ましい実施形態では、投与は、１日につき１回（すなわち、「１日１回」）である。より好ましい実施形態では、投与は、１週につき１回（すなわち、「週１回」）である。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、本明細書において表２および３に示される操作されたポリペプチドから選択される。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、本明細書において表２に示される操作されたポリペプチドから選択される。好ましくは、化合物は、化合物５、９または１１であるか、またはそれらと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

Ａ．製剤
本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、対象に、単独で投与され得るか、または同時投与され得る。同時投与は、化合物の、個別のまたは組合せ（２種以上の化合物）での同時の投与または逐次投与を含むものとする。例えば、肥満症は、レプチン（例えば、メトレレプチン）およびアミリン（例えば、プラムリンチド）を含む併用療法で有益に治療され得ることがわかっている。例えば、米国公開出願第２００８／０２０７５１２号を参照のこと。したがって、例えば、肥満症および過体重の治療にとって有用なＡＢＤおよびエキセンディン化合物を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、このような治療を達成するために単独で投与されてもよく、またはレプチンもしくはレプチンアゴニスト、例えば、メトレレプチンおよび／またはアミリンもしくはアミリンアゴニスト、例えば、プラムリンチドのいずれかと同時投与されてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された製剤および方法は、エキセンディン、エキセンディン類似体またはエキセンディン類似体アゴニストの操作されたポリペプチドが、抗高血糖症剤、例えば、インスリン（通常の、短期間作用性、長期間作用性および基本インスリンを含む）、アミリン、プラムリンチド、メトホルミンおよびチアゾリジンジオン（ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンを含む）などの１種または複数の抗糖尿病薬と同時投与されることをさらに提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された製剤および方法は、エキセンディン、エキセンディン類似体またはエキセンディン類似体アゴニスト操作されたポリペプチドが、１種または複数のコレステロールおよび／またはトリグリセリド低下剤と同時投与されることをさらに提供する。例示的薬剤として、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）；胆汁酸封鎖剤（ｂｉｌｅａｃｅｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔｓ）（例えば、コレセベラム、コレスチラミン、コレスチポール）；フィブラート（例えば、フェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル）、エゼチミブ、ニコチン酸、プロブコール、ロバスタチン／ナイアシン組合せ、アトルバスタチン／アムロジピン組合せ；およびシンバスタチン／エゼチミブ組合せが挙げられる。

エキセンディン化合物は、治療上活性な化合物であり、驚くべきことに、ＡＢＤと融合されている場合に活性を保持するので、本開示内容は、医薬として使用するための、すなわち、治療において使用するための組成物を提供する。液体または乾燥形態いずれかの操作されたポリペプチドと、適宜、少なくとも１種の医薬上許容される担体および／または賦形剤とを含む組成物もまた、具体的に考慮され、本明細書に例示される。

組成物は、インビボまたはインビトロで、アルブミンと結合する能力を有する。特定の場合には、生体外で組成物のアルブミンとの複合体を形成すること、すなわち、組成物に外因性アルブミンを添加することは有効であり得る。このような組成物は、凍結乾燥され得、周囲温度での保存に適している製剤を提供する。したがって、本開示内容はまた、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンをさらに含み、適宜、乾燥形態であり得る上記で定義されるような組成物を提供する。

同時投与は、エキセンディン、エキセンディンアゴニストもしくはエキセンディン類似体アゴニスト操作されたポリペプチドを、第２の薬剤と別個に投与することによってか、またはエキセンディン、エキセンディンアゴニストもしくはエキセンディン類似体アゴニスト操作されたポリペプチドおよび第２の薬剤を含む単一医薬製剤を投与することによって達成され得る。第２の薬剤の適当な投与レジメンは、一般に、当技術分野で公知である。

調製物はまた、望ましい場合には、当技術分野で公知のその他の活性物質（例えば、代謝分解を低下させるよう）またはその他の治療上活性な薬剤と同時投与され得る。本明細書に記載されたエキセンディンの操作されたポリペプチドは、レプチンまたはレプチンアゴニストおよびアミリンまたはアミリンアゴニスト化合物、例えば、ダバリンチド（ｄａｖａｌｉｎｔｉｄｅ）およびその類似体を含めたアミリンなどのその他の活性な抗糖尿病または抗肥満症剤とともに投与され得る。

アミリン。アミリンは、栄養素の摂取に応じて、インスリンと同時分泌される、膵臓β−細胞によって合成されるペプチドホルモンである。アミリンの配列は、哺乳類種中で高度に保存されており、当技術分野で公知のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、カルシトニン、インターメジンおよびアドレノメデュリンに対して構造上の類似性を有する。アミリンの血糖調節作用は、栄養素によって刺激されるグルカゴン分泌の抑制によって循環におけるグルコース出現速度を調節することおよび胃内容排出を減速することによって、インスリンの血糖調節作用を補完する。インスリンによって治療されている糖尿病患者では、プラムリンチド、ヒトアミリンの合成および等効力類似体が、不適切に上昇した食後グルカゴン分泌を抑制することおよび胃内容排出を減速することによって食後血糖変動幅を低減する。ラットアミリン、ヒトアミリンおよびプラムリンチドの配列は、それぞれ以下のとおりである：
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY（配列番号６）；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY（配列番号７）；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY（配列番号８）。

ダバリンチド（Ｄａｖａｌｉｎｔｉｄｅ）。ダバリンチドは、「ＡＣ−２３０７」としても知られ、さまざまな疾患適応症の治療において有用である強力なアミリンアゴニストである。各々、その全文が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０８３２５４およびＷＯ２００７／１１４８３８を参照のこと。ダバリンチドは、アミリンまたはカルシトニンおよびその類似体のＮ末端ループ領域、カルシトニンもしくはその類似体のα−ヘリックス領域の少なくとも一部のα−へリックス領域またはアミリンα−ヘリックス領域およびカルシトニンα−へリックス領域もしくはその類似体の一部を有するα−ヘリックス領域およびアミリンまたはカルシトニンのＣ末端テール領域を有するキメラペプチドである。ヒトカルシトニン、サケカルシトニンおよびダバリンチドの配列は以下のとおりである：
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP（配列番号９）；
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP（配列番号１０）；
KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY（配列番号１１）。

何らかの理論に拘束されようとは思わないが、アミリンおよびダバリンチドおよびその断片および類似体は、完全な生物学的応答を誘発するのにＣ末端アミド化を必要とし得ると考えられる。アミリンおよび／またはダバリンチドおよびその断片および類似体を含む本明細書に記載されたものなどのアミリン化合物は、Ｃ末端でアミド化され得るということは理解される。

「アミリンアゴニスト化合物」は、天然アミリンペプチド、アミリン類似体ペプチドおよびアミリンアゴニスト活性を有するその他の化合物（例えば、小分子）を含む。「アミリンアゴニスト化合物」は、天然供給源から誘導され得、合成であり得、または組換えＤＮＡ技術から誘導され得る。アミリンアゴニスト化合物は、アミリンアゴニスト受容体結合活性を有し、アミノ酸（例えば、天然、非天然またはそれらの組合せ）、ペプチドミメティクス、化学部分などを含み得る。当業者ならば、アミリン受容体結合アッセイを使用して、またはヒラメ筋アッセイにおけるアミリンアゴニスト活性を測定することによってアミリンアゴニスト化合物を認識されよう。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、本明細書に、その開示内容が、その全文で、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６８６，４１１号および米国公開第２００８／０１７６８０４号に記載されるものなどのアミリン受容体結合アッセイにおいて、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下または約５０ｎＭ以下のＩＣ_５０を有する。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、本明細書に、また米国特許第５，６８６，４１１号に記載されるものなどのヒラメ筋アッセイにおいて、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下または約５ｎＭ以下のＥＣ_５０を有する。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ヒト−アミリンに対して少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、アミリン（例えば、ヒトアミリン、ラットアミリンなど）およびカルシトニン（例えば、ヒトカルシトニン、サケカルシトニンなど）のペプチドキメラである。適した、例示的アミリンアゴニスト化合物はまた、その開示内容が、その全文で、すべての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２００８／０２７４９５２号に記載されている。

別の活性薬剤と同時投与される場合には、化合物は、一緒にまたは別個に製剤されて、同時にまたは逐次投与され得る。本明細書において操作された化合物は、本質的に長時間作用性であるので、それらは、１日１回、週に１回またはそれより長い投与に適している。したがって、その他の薬剤は、エキセンディン操作されたポリペプチドの投薬期間の間、必要に応じて、１回または複数回用量で、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、週に１回、例えば、週に１回投与され得る。

アミリン化合物などのその他の薬剤の単回および複数回使用製剤が報告されている。例えば、プラムリンチドは、１日１回、２回および３回の投与のために、糖尿病を治療するためにおよび肥満症を治療するために製剤されており、成功裏に投与される。

これらの医薬化合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに開示されるものなどの従来の技術に従って、医薬上許容される担体または希釈剤ならびに任意のその他の公知のアジュバントおよび賦形剤を用いて製剤され得る。Wang et al. (1988) J. of Parenteral Sci. and Tech., Technical Report No. 10, Supp. 42:2 Sも参照のこと。

一般に、操作されたポリペプチドは、患者へ投与するための、安定な、安全な医薬組成物に製剤され得る。本発明の方法において使用するために考慮される医薬製剤は、およそ０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）、特定の場合には、０．０５〜１．０％の操作されたポリペプチド、約３．０〜約７．０の最終組成物のｐＨを可能にするおよそ０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）の酢酸、リン酸、クエン酸またはグルタミン酸バッファー、およそ１．０〜１０％（ｗ／ｖ）の炭水化物または多価アルコール等張剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、適宜、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチル、エチル、プロピルおよびブチルパラベンおよびフェノールの群から選択されるおよそ０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）の保存料を含み得る。このような保存料は、一般に、製剤されたペプチドが、複数回使用製品で含まれる場合に含まれる。

特定の実施形態では、本操作されたポリペプチドの医薬製剤は、一定の範囲の濃度の化合物、例えば、約０．０１％〜約９８％ｗ／ｗの間または約１〜約９８％ｗ／ｗの間または好ましくは、８０％と９０％ｗ／ｗの間、または好ましくは、約０．０１％〜約５０％ｗ／ｗの間またはより好ましくは、これらの実施形態では、約１０％〜約２５％ｗ／ｗの間を含有し得る。十分な量の注射水を使用して、所望の濃度の溶液を得てもよい。

塩化ナトリウムなどのさらなる等張剤（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇａｇｅｎｔｓ）ならびにその他の公知の賦形剤も、必要に応じて、存在し得る。いくつかの場合には、このような賦形剤は、化合物の全体的な張力の維持において有用である。賦形剤は、目下記載されている製剤中に種々の濃度で含まれ得る。例えば、賦形剤は、約０．０２％〜約２０％ｗ／ｗ、好ましくは、約０．０２％と０．５％ｗ／ｗの間、約０．０２％〜約１０％ｗ／ｖまたは約１％〜約２０％ｗ／ｗの濃度範囲で含まれ得る。さらに、本製剤自体と同様に、賦形剤は、固体（粉末化されたものを含む）、液体、半固体またはゲルの形態で含まれ得る。

医薬製剤は、種々の形態、例えば、固体、液体、半固体または液体からなり得る。用語「固体」とは、本明細書において、例えば、散剤および凍結乾燥製剤を含めた、この用語のすべての通常の使用を包含するものとする。目下記載されている製剤は、凍結乾燥され得る。

用語バッファー、バッファー溶液および緩衝溶液は、水素イオン濃度またはｐＨに関して使用される場合には、酸またはアルカリの添加時の、または溶媒での希釈時のｐＨの変化に抵抗する、系、特に、水溶液の能力を指す。酸または塩基の添加時にｐＨの小さい変化を受ける緩衝溶液の特徴は、弱酸および弱酸の塩または弱塩基および弱塩基の塩のいずれかの存在である。前者の系の一例として、酢酸および酢酸ナトリウムがある。添加されるヒドロニウムまたはヒドロキシルイオンの量が、バッファー系のそれを中和する能力を超えない限り、ｐＨの変化はわずかである。

本明細書に記載されるように、さまざまな液体媒体、例えば、水または水性／有機溶媒混合物または懸濁液が、操作されたポリペプチドの製剤における使用に適している。

本明細書に記載される使用のために、操作されたポリペプチド製剤の安定性は、製剤のｐＨを、当技術分野で公知の方法によって決定される範囲に維持することによって増強される。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約３．５〜５．０または約３．５〜６．５、いくつかの実施形態では、約３．７〜４．３または約３．８〜４．２の範囲で維持される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０またはさらに高いものであり得る。いくつかの実施形態では、ｐＨは、生理学的範囲、ｐＨ６〜８、好ましくは、ｐＨ７〜７．６にあり得る。

特定の実施形態では、操作されたポリペプチドを有するバッファーは、酢酸バッファー（好ましくは、約１〜５から約６０ｍＭの最終製剤濃度の）、リン酸バッファー（好ましくは、約１〜５から約３０ｍＭの最終製剤濃度の）またはグルタミン酸バッファー（好ましくは、約１〜５から約６０ｍＭの最終製剤濃度の）である。いくつかの実施形態では、バッファーは、酢酸（好ましくは、約５〜約３０ｍＭの最終製剤濃度の）である。

製剤中に安定剤が含まれ得るが、必ずしも必要ではない。しかし、含まれる場合には、本発明の実施において有用な安定剤は、炭水化物または多価アルコールである。本発明の実施において有用な適した安定剤は、およそ１．０〜１０％（ｗ／ｖ）の炭水化物または多価アルコールである。多価アルコールおよび炭水化物は、その主鎖中に同一の特徴、すなわち、−−ＣＨＯＨ−−ＣＨＯＨ−−を共有し、これは、タンパク質の安定化に関与している。多価アルコールとして、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化合物が挙げられる。これらの化合物は、直鎖分子である。他方、マンノース、リボース、スクロース、フルクトース、トレハロース、マルトース、イノシトールおよびラクトースなどの炭水化物は、ケトまたはアルデヒド基を含有し得る環状分子である。これら２つのクラスの化合物は、温度上昇によって、また凍結−解凍または凍結−乾燥プロセスによって引き起こされる変性に対してタンパク質を安定化させることにおいて有効であると実証されている。適した炭水化物として、糖尿病患者に有害作用（ａｄｖｅｒｓｅａｆｆｅｃｔ）を有さない、すなわち、炭水化物が代謝されて、血液中でグルコースの許容されない高い濃度を形成することのない、ガラクトース、アラビノース、ラクトースまたは任意のその他の炭水化物が挙げられる。このような炭水化物は、糖尿病患者に適しているとして当技術分野で周知である。スクロースおよびフルクトースは、非糖尿病性適用（例えば、肥満症を治療すること）において化合物を用いる使用に適している。

特定の実施形態では、安定剤が含まれる場合には、化合物は、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、グリセロール、キシリトールおよびポリプロピレン／エチレングリコールコポリマーなどの多価アルコールならびに分子量２００、４００、１４５０、３３５０、４０００、６０００、８０００およびさらに高い種々のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて安定化される。マンニトールは、いくつかの実施形態では、好ましい多価アルコールである。本発明の凍結乾燥製剤の別の有用な特徴は、その安定性を維持するのに役立つ同一製剤成分を用いる、本明細書に記載された凍結乾燥製剤の張力の維持である。いくつかの実施形態では、マンニトールは、本目的のために使用される好ましい多価アルコールである。

米国薬局方（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）（ＵＳＰ）には、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤が、複数回用量容器中に含有される調製物に添加されなければならないと述べられている。それらは、皮下針およびシリンジを用いて、またはペン型注射器などのデリバリーのためのその他の侵襲的手段を使用して内容物の一部を引き抜く間に、調製物中に不注意に導入された微生物の増殖を防ぐための使用の時点で適切な濃度で存在しなくてはならない。抗菌剤は、処方のすべてのその他の成分との適合性を確実にするよう評価されなくてはならず、その活性は、ある製剤において有効である特定の薬剤が別のものでは有効ではないことがないことを確実にするよう、処方全体において評価されなくてはならない。特定の抗菌剤が、ある製剤において有効であるが、別の製剤では有効でないことを見出すことは珍しいことではない。

保存料は、一般的な製薬上の意味では、微生物増殖を防ぐか、または阻害し、この目的のために医薬製剤に添加され、微生物による製剤の結果として起こる腐敗を避けることができる物質である。保存料の量は多くはないが、それにもかかわらず、ペプチドの全体的な安定性に影響を及ぼすことがある。

医薬組成物において使用するための保存料は、０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得るが、いくつかの実施形態では、単独またはその他のものと組み合わせた各保存料の範囲は、ベンジルアルコール（０．１〜１．０％）またはｍ−クレゾール（０．１〜０．６％）またはフェノール（０．１〜０．８％）またはメチル（０．０５〜０．２５％）およびエチルもしくはプロピルもしくはブチル（０．００５％〜０．０３％）パラベンの組合せである。パラベンは、パラ−ヒドロキシ安息香酸の低級アルキルエステルである。各保存料の詳細な説明は、Remington's Phrmaceutical Sciences(Id．)に示されている。

操作されたポリペプチドは、液体形態の場合には、ガラス容器中のガラス上に吸着する傾向を有さないこともあり、したがって、医薬製剤をさらに安定化するために界面活性剤が必要でないこともある。しかし、液体形態の場合に、このような傾向を有する化合物に関しては、その製剤中に界面活性剤が使用されなければならない。次いで、これらの製剤は、凍結乾燥され得る。界面活性剤は、疎水性破壊および塩橋分離によっての両方のタンパク質の変性を頻繁に引き起こす。界面活性剤部分とタンパク質上の反応性部位の間の強力な相互作用のために、比較的低い濃度の界面活性剤が、強力な変性活性を発揮し得る。しかし、この相互作用の賢明な使用により、界面または表面変性に対してタンパク質を安定化できる。操作されたポリペプチドをさらに安定化できる界面活性剤は、適宜、総製剤の約０．００１〜０．３％（ｗ／ｖ）の範囲で存在し得、これとして、ポリソルベート８０（すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ＣＨＡＰＳ（登録商標）（すなわち、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］１−プロパンスルホネート）、Ｂｒｉｊ（登録商標）（例えば、（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルであるＢｒｉｊ（登録商標）３５）、ポロクサマーまたは別の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

選択された等張剤に応じて、医薬製剤の張力を調整するために塩化ナトリウムまたはその他の塩を添加することが望ましいこともある。しかし、これはオプショナルであり、選択された特定の製剤に応じて変わる。非経口製剤は、好ましくは、等張性または実質的に等張性であり得る。

非経口製剤にとって好ましい媒体として、水がある。非経口投与に適した品質の水は、蒸留によってか、または逆浸透によってのいずれかによって調製され得る。注射水は医薬製剤における使用にとって好ましい水性媒体である。

医薬製剤中にその他の構成成分が存在し得ることがあり得る。このようなさらなる構成成分として、例えば、湿潤剤、乳化剤、オイル、抗酸化物質、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、張力修飾因子、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および両性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）を挙げることができる。さらに、ポリマー溶液またはポリマーとの混合物は、ペプチドの制御放出の機会を提供する。このようなさらなる構成成分は、もちろん、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害に影響を与えてはならない。

容器はまた、注射の製剤の不可欠な部分であり、完全に不活性であるか、特に、液体が水性である場合には、含有する液体にいくつかの点で影響を及ぼさない容器がないので、一成分と考えられ得る。したがって、特定の注射のための容器の選択は、容器の組成の、ならびに溶液の考慮およびそれが付される治療に基づいたものでなくてはならない。バイアルのガラス表面へのペプチドの吸着も、必要に応じて、ホウケイ酸ガラス、例えば、ＷｈｅａｔｏｎＩ型ホウケイ酸ガラス番号３３（ＷｈｅａｔｏｎＴｙｐｅＩ−３３）またはその等価物（ＷｈｅａｔｏｎＧｌａｓｓＣｏ．）の使用によって最小化され得る。製造に許容される、同様のホウケイ酸ガラスバイアルおよびカートリッジのその他の販売会社として、ＫｉｍｂｅｌＧｌａｓｓＣｏ．、ＷｅｓｔＣｏ．、ＢｕｎｄｅｒＧｌａｓＧＭＢＨおよびＦｏｒｍａＶｉｔｒｕｍが挙げられる。化合物の生物学的および化学的特徴は、ＷｈｅａｔｏｎＴｙｐｅＩ−３３ホウケイ酸血清バイアル中での、５％マンニトールおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０の存在下での０．１ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌの化合物の終濃度への製剤および凍結乾燥によって安定化され得る。

注射によって送達される製剤については、皮下シリンジからのニードルの、複数回用量バイアル中への導入を可能にし、ニードルが引き抜かれるや否や再密封を提供するために、各バイアルの解放端は、アルミニウムバンドによって適当な位置に止められたゴムストッパー封鎖で密封されることが好ましい。

Ｗｅｓｔ４４１６／５０、４４１６／５０（テフロン表面の）および４４０６／４０、Ａｂｂｏｔｔ５１３９または任意の同等ストッパーなどのガラスバイアルのためのストッパーを、注射用医薬の封鎖として使用してもよい。ペプチド性抗肥満症剤を含む製剤については、これらのストッパーは、ペプチドならびに製剤のその他の成分と適合する。本発明者らはまた、これらのストッパーは、患者使用パターンを使用して試験される場合にストッパー完全性試験を通る、例えば、ストッパーは少なくとも約１００回の注射に持ちこたえることができることを発見した。あるいは、ペプチドは、その後の再構成のために、バイアル、シリンジまたはカートリッジ中に凍結乾燥され得る。本発明の液体製剤は、１もしくは２室カートリッジまたは１もしくは２室シリンジ中に充填され得る。

上記の医薬製剤の各成分は、当技術分野で公知であり、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるPharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Vol.1, 2nd ed., Avis et al. Ed., Mercel Dekker, New York, N.Y. 1992に記載されている。

上記の液体製剤の製造プロセスは、一般に、配合、滅菌濾過および充填工程を含む。配合手順は、指定の順序での構成成分の溶解（保存料、それに続く、安定剤／等張剤、バッファーおよびペプチド）または同時の溶解を含む。

代替製剤、例えば、非−非経口は、滅菌を必要としない場合もある。しかし、滅菌が望ましいか、または必須である場合には、本発明のペプチド医薬製剤の開発において任意の適した滅菌プロセスを使用してもよい。典型的な滅菌プロセスは、濾過、蒸気（湿式加熱）、乾式加熱、ガス（例えば、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、二酸化塩素、酸化プロピレン、β−プロピオラクトン（ｐｒｏｐｉｏｌａｃｃｔｏｎｅ）、オゾン、クロロピクリン、過酢酸メチルブロミドなど）、放射線源に対する曝露および無菌取り扱いを含む。濾過は、本発明の液体製剤の好ましい滅菌方法である。滅菌濾過は、順次、接続され得る０．４５ｕｍおよび０．２２ｕｍ（１または２）を通した濾過を含む。濾過後、溶液は、適当なバイアルまたは容器中に充填される。

特定の実施形態では、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、対象に末梢性に投与される。いくつかの実施形態では、本発明の液体医薬製剤は、非経口投与に意図される。適した投与経路として、筋肉内の、静脈内の、皮下、皮内、関節内、くも膜下腔内などが挙げられる。いくつかの実施形態では、皮下投与経路が好ましい。特定の実施形態では、粘膜デリバリーも好ましい。これらの経路として、それだけには限らないが、液体、半固体または固体形態のペプチドの投与を含み得る、経口、鼻腔、舌下、肺および頬側経路が挙げられる。操作されたポリペプチドを含む製剤については、これらの経路による投与は、非経口デリバリーと比較して、バイオアベイラビリティの低下のために、所望の生物学的効果を得るために実質的により多くの化合物を必要とし得る。

さらに、非経口制御放出デリバリーは、高分子マイクロカプセル、マトリックス、溶液、インプラントおよびデバイスを形成することならびにそれらを非経口的にか、または外科的手段によって投与することによって達成され得る。制御放出製剤の例は、参照にいより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３６８，６３０号、第６，３７９，７０４号および第５，７６６，６２７号に記載されている。これらの剤形は、ポリマーマトリックスまたはデバイス中にペプチドの一部が捕捉されるために、より低いバイオアベイラビリティを有し得る。例えば、各々、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３７９，７０４号、第６，３７９，７０３号および第６，２９６，８４２号を参照のこと。

化合物は、１用量または複数用量で有効となる操作されたポリペプチドの量を含有する投与単位形態形で提供され得る。

当業者には認識されるであろうが、操作されたポリペプチドの有効量は、対象の年齢および体重、対象の身体状態、治療される状態および当技術分野で公知のその他の因子を含めた多数の因子につれて変わる。操作されたポリペプチドの有効量はまた、投与される特定の組合せにつれて変わる。本明細書に記載されるように、組み合わせた操作されたポリペプチドの投与は、投与される操作されたポリペプチドのいずれかの低減した量が、有効量であることを可能にし得る。

投与は、経細胞性、傍細胞性または受容体媒介性経路を含めた経口形路によってであり得る。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載されるようなエキセンディンを含有する操作されたポリペプチドは、幾分かは比較的小さい大きさおよび腸酵素に対する相対的な安定性のために、経口的に利用可能である。吸収／浸透促進剤によって開けられる腸細胞間の密着結合は、２０ｎｍ未満の幅であると報告されている。例えば、Chao et al., 1998, J. Drug Targeting, 6:37-43を参照のこと。したがって、本明細書に記載されるような十分に小さい（例えば、１０ｋＤまたは１５ｋＤ未満）操作されたポリペプチドは、腸壁を通過し、門脈系においてアルブミンと結合し、それによって、循環へアクセスできる。本発明の操作されたポリペプチドの経口送達は、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、週に１回、２週に１回、３週に１回またはさらには月に１回であり得る。その他のペプチドに適した経口送達系が使用され得る。一実施形態では、経口送達系は、比較的迅速な取り込みプロフィール、例えば、１〜４時間を有し得、その場合には、操作されたポリペプチドの本質的に長い作用持続期間は、所望の延長された作用持続期間、例えば、１日１回または週に１回の投与を提供する。作用持続期間は、例えば、ＡＢＤおよびそのアルブミンに対する親和性の選択によって選択され得る。理論に拘束されようとは思わないが、アルブミンに対する親和性が高いほど、長い循環時間をもたらし、長い作用持続期間を提供すると考えられる。経口送達は、公知のインビトロおよびインビボ法を使用して試験され得る。例えば、マウスは、任意の添加された賦形剤の経口アベイラビリティーおよび効果を調べるために、浸透／吸収促進剤および／またはプロテアーゼ阻害薬とともにか、伴わずに製剤された操作されたポリペプチドを含有する溶液を用いて経口的に経管栄養され得る。薬物血漿レベル、急性または慢性グルコースおよび／またはＨｂＡ１ｃ低下、インスリン血漿レベル、食物摂取阻害、体重減少および／または脂質レベルなどの、薬力学的（治療効果）および薬物動態（薬物特性）のいずれかまたは両方が、経時的に測定され得る。

Ｂ．有効投与量
本明細書において提供される医薬組成物は、有効成分が、治療上有効な量で、すなわち、その意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。特定の適用にとって有効な実際の量は、とりわけ、治療される状態に応じて変わる。例えば、糖尿病を治療する方法において投与される場合には、このような組成物は、所望の結果（例えば、対象において空腹時血糖を低下させること）を達成するのに有効な有効成分の量を含有する。肥満症を治療するための方法において投与される場合には、このような組成物は、所望の結果（例えば、体重の減少）を達成するのに有効な有効成分の量を含有する。

投与される化合物の投与量および頻度（単回または複数回用量）は、投与経路；レシピエントの大きさ、年齢、性別、健康状態、体重、肥満度指数および食事；治療されている疾患の症状の性質および程度（例えば、本明細書に記載された化合物に応答性の疾患；空腹時血糖）；その他の疾患またはその他の健康に関連する問題の存在；同時治療の種類；および任意の疾患または治療レジメンに由来する合併症を含めたさまざまな因子に応じて変わり得る。その他の治療レジメンまたは薬剤が、本発明の方法および化合物とともに使用され得る。

ヒトにおいて使用するための治療上有効な量は、動物モデルから決定され得る。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であるとわかっている濃度を達成するよう処方され得る。ヒトにおける投与量は、上記のようにおよび当技術分野で公知のように、それだけには限らないが、血糖および体重を含めた１種または複数の生理学的パラメータをモニタリングすることおよび投与量を上方または下方に調整することによって調整され得る。

投与量は、患者の要求および使用されている化合物に応じて変わり得る。本発明に関連して、患者に投与される用量は、患者における有益な治療反応に経時的に影響を及ぼすのに十分でなくてはならない。用量の大きさはまた、任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。一般に、治療は、化合物の最適用量よりも少ないより少量の投与量で開始される。その後、投与量を、状況下で最適効果が到達されるまで小さい増分で増大させる。本発明の一実施形態では、投与量範囲は、０．００１％〜１０％ｗ／ｖである。別の実施形態では、投与量範囲は、０．１％〜５％ｗ／ｖである。

しかし、通常の用量は、本明細書における操作されたポリペプチドの延長された半減期を考慮して、１日あたり約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇから１５０μｇの下限から週あたり約５０μｇまで、１００μｇまで、１５０μｇまで、２００μｇまでまたはさらに３００μｇまでの上限までの医薬化合物を含有し得る。用量は、所望の間隔、例えば、毎日または毎週で、別個の単位用量で送達され得る。

投与量の量および間隔は、治療されている特定の臨床適応症に有効な投与される化合物のレベルを提供するよう個別に調整され得る。これによって、個々の病状の重症度にふさわしい治療レジメンが提供される。

本明細書において提供された教示を利用することで、実質的な毒性を引き起こさないが、特定の患者によって実証される臨床症状を治療するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的治療計画を立てることができる。この計画を立てることは、化合物の効力、相対バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の存在および重症度、好ましい投与様式および選択された薬剤の毒性プロフィールなどの因子を考慮することによって、活性化合物の注意深い選択を含まなければならない。

本発明の操作されたポリペプチドの驚くべき用量節約特性は、その驚くべき長い血漿半減期および薬理学的作用の持続期間とともに、優れた医薬品を提供する。また、エキセンディンを含有する操作されたポリペプチドの場合には、驚くべきは、その経口アベイラビリティーである。用量節約を含めた優れた特性は、より少ない投薬、したがって、より少ないか、または重度がより低い副作用および商品原価の改善および／または親化合物単独によって現在は達成されていない１日１回または週に１回の投与のためのより費用効率の高い、より簡単な製剤を可能にする。

Ｃ．毒性
特定の化合物の毒性および治療的効果間の比は、その治療係数であり、ＬＤ_５０（集団の５０％において致死的な化合物の量）とＥＤ_５０（集団の５０％において有効な化合物の量）の間の比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび／または動物研究から得られた治療係数データは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の処方において使用され得る。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか、または全くないＥＤ_５０を含む血漿濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。例えば Fingl et al., In: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ch.1, p.l, 1975を参照のこと。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態および化合物が使用される特定の方法を考慮して個々の医師によって選択され得る。

何らかの理論に拘束されようとは思わないが、ＡＢＤアルブミン結合ドメインの、本明細書に記載されるようなホルモンドメイとの融合は、ＡＢＤ融合を伴わないホルモンドメインと比較して、免疫応答の低減によって判断されるような免疫原性の低減を提供し得ると考えられる。例えば、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０１６０４３を参照のこと。

例示的ＨＤ１、リンカーおよびＡＢＤ配列として、以下が挙げられる：
HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂（配列番号１）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂（配列番号２）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂（配列番号３）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号４）；
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG（配列番号５）；
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY（配列番号６）；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY（配列番号７）；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY（配列番号８）；
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP（配列番号９）；
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP（配列番号１０）；
KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY（配列番号１１）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN（配列番号１２）；
HHHHHH（配列番号４９）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号１１１）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS（配列番号１１２）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS（配列番号１１３）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK（配列番号１１４）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK（配列番号１１５）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK（配列番号１１６）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１７）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１８）；
GGGG（配列番号１２５）；
GGGGG（配列番号１２６）；
［Ｇ］_ｎＥ（配列番号１２７）（配列中、ｎは１〜６である）；
［Ｇ］_ｎＫ（配列番号１２８）（配列中、ｎは１〜６である）；
［Ｇ］_ｎＤ（配列番号１２９）（配列中、ｎは１〜６である）；
［Ｇ］_ｎＲ（配列番号１３０）（配列中、ｎは１〜６である）；
GGGKGGGG（配列番号１３１）；
GGGNGSGG（配列番号１３２）；
GGGCGGGG（配列番号１３３）；
GPNGG（配列番号１３４）；
［ＧＳ］_ｎ（配列番号１３５）（配列中、ｎは１〜６である）；
［ＧＧＳ］_ｎ（配列番号１３６）（配列中、ｎは１〜６である）；
［ＧＧＧＳ］_ｎ（配列番号１３７）（配列中、ｎは１〜６である）；
［ＧＧＧＧＳ］_ｎ（配列番号１３８）（配列中、ｎは１〜６である）；
［ＧＥ］_ｎ（配列番号１３９）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＥ］_ｎ（配列番号１４０）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＥ］_ｎ（配列番号１４１）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＧＥ］_ｎ（配列番号１４２）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＤ］_ｎ（配列番号１４３）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＤ］_ｎ（配列番号１４４）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＤ］_ｎ（配列番号１４５）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＧＤ］_ｎ（配列番号１４６）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＫ］_ｎ（配列番号１４７）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＫ］_ｎ（配列番号１４８）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＫ］_ｎ（配列番号１４９）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＧＫ］_ｎ（配列番号１５０）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＲ］_ｎ（配列番号１５１）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＲ］_ｎ（配列番号１５２）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＲ］_ｎ（配列番号１５３）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＧＧＧＧＲ］_ｎ（配列番号１５４）（配列中、ｎは１〜１０である）；
［ＥＡＡＡＫ］_ｎ（配列番号１５５）（配列中、ｎは１〜１０である）；
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）、
配列中、互いに独立に、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；位置４５のロイシンは存在するかまたは存在せず；位置４６のプロリンは、存在するかまたは存在せず；
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号６７８）
配列中、互いに独立に、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；位置４５のロイシンは存在するかまたは存在せず；位置４６のプロリンは、存在するかまたは存在せず；
表１、表２、表３および図１参照のこと。

エキセンディン、エキセンディン類似体またはその活性断片を含む操作されたポリペプチド、それを使用する方法および本明細書に記載された医薬組成物の例示的実施形態として、以下が挙げられる：

実施形態１．アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）配列と、エキセンディン配列、エキセンディン類似体配列またはその活性断片配列から選択される第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）配列とを含む操作されたポリペプチド。実施形態２．前記ＨＤ１配列および前記ＡＢＤ配列を共有結合によって連結している第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む実施形態１に従う操作されたポリペプチド。３．前記の操作されたポリペプチドが、Ｃ末端部分として前記ＡＢＤ配列と、Ｎ末端部分として前記ＨＤ１配列を含む、実施形態１または２に従う操作されたポリペプチド。４．構造：ＨＤ１−ＡＢＤを含む実施形態３に従う操作されたポリペプチド。５．構造：ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤを含む実施形態３に従う操作されたポリペプチド。６．前記ＨＤ１配列が、前記エキセンディンまたはエキセンディン類似体配列である、実施形態１から５のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７．前記エキセンディン配列が、エキセンディン−４配列であり、エキセンディン類似体配列が、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４配列である、実施形態６に従う操作されたポリペプチド。８．前記エキセンディン断片配列が、エキセンディン−４（１−２８）、エキセンディン−４（１−２９）、エキセンディン−４（１−３０）、エキセンディン−４（１−３１）またはエキセンディン−４（１−３２）の配列である、実施形態６に従う操作されたポリペプチド。９．前記エキセンディンまたはエキセンディン類似体配列が、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS（配列番号３）、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号４）、
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS（配列番号２）、
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号１１１）、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS（配列番号１１２）、
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS（配列番号１１３）、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK（配列番号１１４）、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK（配列番号１１５）、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK（配列番号１１６）、HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１７）およびHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１８）
からなる配列の群から選択される、実施形態６に従う操作されたポリペプチド。１０．前記エキセンディンまたはエキセンディン類似体が、Ｈｉｓ１に対応する位置に修飾を含み、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−イミダゾアセチル、デス−アミノ−ヒスチジル（イミダゾプロピオニル）、β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジルおよびβ−カルボキシ−イミダゾプロピオニルからなる群から選択される、上記実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１１．前記類似体が、Ｈｉｓ１に対応する位置に修飾を含むエキセンディン−４を含み、（４−イミダゾアセチル）エキセンディン−４、（デス−アミノ−ヒスチジル）エキセンディン−４（または（イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４）、（β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４、（Ｎ−ジメチル−ヒスチジル）エキセンディン−４および（β−カルボキシ−イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４からなる群から選択される、上記実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１２．前記エキセンディン類似体配列が、エキセンディン−４と、実施形態９のエキセンディン類似体に対して、または実施形態８のエキセンディン断片に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１３．前記エキセンディン類似体が、エキセンディン−４と、実施形態９のエキセンディン類似体に対して、または実施形態８のエキセンディン断片に対して少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態１から１２のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１４．前記エキセンディン類似体が、エキセンディン−４と、実施形態９のエキセンディン類似体に対して、または実施形態８のエキセンディン断片に対して少なくとも９０％の同一性を有する、上記実施形態に従う操作されたポリペプチド。１５．前記エキセンディン類似体が、エキセンディン−４と、実施形態９のエキセンディン類似体に対して、または実施形態８のエキセンディン断片に対して少なくとも９５％の同一性を有する、上記実施形態に従う操作されたポリペプチド。１６．前記エキセンディン類似体配列が、挿入、欠失、付加および置換のいずれか１種またはそれらの組合せから独立に選択される１〜５のアミノ酸修飾を有する上記実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１７．前記ＡＢＤ配列が、式（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）（式中、互いに独立に、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；位置４５のロイシンは存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）；および式（ｉｉ）（ｉ）で定義される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列［ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；あるいは、アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）（配列中、互いに独立に、Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）によって定義されない］を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１８．前記ＡＢＤ配列が、式（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）（式中、互いに独立に、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され０；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１７に従う操作されたポリペプチド。１９．前記ＡＢＤ配列が、（ｉ）において定義される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する式（ｉｉ）アミノ酸配列［ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではなく；あるいは、アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）（式中、互いに独立に、Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）によって定義されない］を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１７に従う操作されたポリペプチド。２０．前記ＡＢＤ配列が、式（ｉｉｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）（配列中、互いに独立して、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）と、式（ｉｖ）（ｉｉｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；または代わりに、アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）によって定義されず、配列中、互いに独立して、Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）とを含むアミノ酸配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。２１．前記ＡＢＤ配列が、式（ｉｉｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）（配列中、互いに独立して、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２０に記載の操作されたポリペプチド。２２．前記ＡＢＤ配列が、（ｉｉｉ）において定義される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する式（ｉｖ）アミノ酸配列［ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではなく；あるいは、アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）（式中、互いに独立に、Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）によって定義されない］を含むアミノ酸配列を含む、実施形態２０に従
う操作されたポリペプチド。２３．Ｘ６が、ＡＢＤにおいて、Ｓである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。２４．Ｘ６が、ＡＢＤにおいて、Ｅである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。２５．Ｘ３が、ＡＢＤにおいて、Ｓである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。２６．Ｘ３が、ＡＢＤにおいて、Ｅである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。２７．Ｘ３が、ＡＢＤにおいて、Ｑである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。２８．Ｘ７が、ＡＢＤにおいて、Ａである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。２９．Ｘ７が、ＡＢＤにおいて、Ｓである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３０．Ｘ１０が、ＡＢＤにおいて、Ａである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３１．Ｘ１０が、ＡＢＤにおいて、Ｓである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３２．Ｘ１０が、ＡＢＤにおいて、Ｒである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３３．Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ｓである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３４．Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ｃである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３５．Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ｋである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３６．Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ａである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３７．Ｘ２６が、ＡＢＤにおいて、Ｄである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３８．Ｘ２６が、ＡＢＤにおいて、Ｅである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。３９．Ｘ３９が、ＡＢＤにおいて、Ｄである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４０．Ｘ３９が、ＡＢＤにおいて、Ｅである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４１．Ｘ４０が、ＡＢＤにおいて、Ａである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４２．Ｘ４０が、ＡＢＤにおいて、Ｅである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４３．Ｘ４３が、ＡＢＤにおいて、Ａである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４４．Ｘ４３が、ＡＢＤにおいて、Ｋである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４５．Ｘ４４が、ＡＢＤにおいて、Ａである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４６．Ｘ４４が、ＡＢＤにおいて、Ｓである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４７．Ｘ４４が、ＡＢＤにおいて、Ｅである、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４８．ＡＢＤにおいて、位置４５のロイシンが存在する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。４９．ＡＢＤにおいて、位置４５のロイシンが存在しない、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５０．ＡＢＤにおいて、位置４６のプロリンが存在する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５１．ＡＢＤにおいて、位置４６のプロリンが存在しない、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５２．相互作用のｋ_ｏｆｆ値が、最大５×１０−５ｓ−１であるよう、ＡＢＤがアルブミンと結合する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５３．相互作用のｋ_ｏｆｆ値が、最大５×１０−６ｓ−１であるよう、ＡＢＤがアルブミンと結合する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５４．ＡＢＤ配列が、本明細書に開示されたか、または表１に由来するか、または図１もしくは配列番号３０１〜４４４に由来するＡＢＤ配列のいずれか１つから選択される、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５５．ＡＢＤ配列が、配列番号３０４〜３０５、配列番号３０７〜３０８、配列番号３１０〜３１１、配列番号３１３〜３１４、配列番号３１６〜３１７、配列番号３１９〜３２０、配列番号３２２〜３２３、配列番号３２５〜３２６、配列番号３２８〜３２９、配列番号３３１〜３３２、配列番号３３４〜３３５、配列番号３３７〜３３８、配列番号３４１〜３４２および配列番号３４９〜３５０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列から選択される、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５６．ＡＢＤ配列が、表１または図１の配列のうちいずれか１種に由来するアミノ酸配列から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５７．ＡＢＤ配列が、式（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義される配列のＮおよび／またはＣ末端に位置する１種または複数のさらなるアミノ酸残基をさらに含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。５８．１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端にセリン残基を含む、前記の実施形態に従う操作されたポリペプチド。５９．１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端にグリシン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６０．１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端にグルタミン酸残基またはシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６１．１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端にアラニン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６２．１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＣ末端にグリシン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６３．１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＣ末端にシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６４．ＡＢＤが、配列番号４４５〜４５０および配列番号４６２〜４６３のいずれか１種から選択されるアミノ酸配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６５．ＡＢＤが、２個以下のシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６６．ＡＢＤ配列が、１個以下のシステイン残基を含む、前記の実施形態に従う操作されたポリペプチド。６７．エキセンディン配列またはエキセンディン類似体配列またはその断片が、ポリペプチドの位置Ｘ_１４のシステイン残基のチオール基を介してＡＢＤとコンジュゲートしている、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。６８．前記ＡＢＤが、GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号４６３）またはGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７００）である、実施形態１８に従う操作されたポリペプチド。６９．前記ＡＢＤ配列が、表１、図１または本明細書における表のいずれかに由来する配列からなる群から選択されるペプチド配列のいずれか１種を含む、実施形態１８に従う操作されたポリペプチド。７０．前記ＡＢＤ配列が、式ｉ）もしくはｉｉｉ）のＡＢＤと、または表１、図１もしくは本明細書における表のいずれかのＡＢＤのいずれか１種と、少なくとも９５％の同一性を有するＡＢＤ類似体を含む、実施形態１から６９のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７１．前記リンカーＬ１が、１〜３０個のアミノ酸または３０個未満のアミノ酸のペプチドである、実施形態１から７０のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７２．前記リンカーＬ１が、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される、実施形態１から７１のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７３．前記リンカーＬ１が、化学合成、翻訳後化学修飾によってか、または宿主細胞への組換え発現によるインビボ組み込みによって組み込まれた非天然アミノ酸を含む、実施形態１から７２のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７４．前記リンカーＬ１アミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンから選択される、実施形態１から７３のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７５．前記リンカーＬ１アミノ酸が、グリシンである、実施形態１から７４のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７６．前記リンカーＬ１が、過半数の立体障害のないアミノ酸を含む、実施形態１から７４のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７７．前記リンカーＬ１が、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）またはポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む、実施形態１から７６のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７８．前記リンカーＬ１が、(Gly)3、(Gly)4（配列番号１２５）、または(Gly)5（配列番号１２６）、(Gly)3Lys(Gly)4（配列番号１３１）；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2（配列番号１３２）；(Gly)3Cys(Gly)4（配列番号１３３）；GlyProAsnGlyGly（配列番号１３４）、GG、GGG、GGS、またはGGGS（配列番号１９２）の配列を含む、実施形態１から７７のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。７９．前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＡｌａの組合せを含む、実施形態１から７４のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８０．前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＳｅｒの組合せを含む、実施形態１から７４のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８１．前記リンカーＬ１が、グリシンリッチペプチドからなる群から選択される、実施形態１から８０のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８２．前記リンカーＬ１が、Ｎ末端ＴＧジペプチドを含む、実施形態１から８１のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８３．前記リンカーＬ１が、Ｃ末端ＡＳジペプチドを含む、実施形態１から８２のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８４．前記リンカーＬ１が、Ｎ末端ＴＧジペプチドおよびＣ末端ＡＳジペプチドを含む、実施形態１から８３のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８５．前記リンカーＬ１が、TG-(GGGS)1（配列番号８４８）、TG-(GGGS)2（配列番号８４９）、TG-(GGGS)3（配列番号８５０）、TG-(GGGS)4（配列番号８５１）、TG-(GGGS)5（配列番号８５２）、(GGGS)1-AS（配列番号８５３）、(GGGS)2-AS（配列番号８５４）、(GGGS)3-AS（配列番号８５５）、(GGGS)4-AS（配列番号８５６）、(GGGS)5-AS（配列番号８５７）、TG-(GGGS)1-AS（配列番号１９５）、TG-(GGGS)2-AS（配列番号８５８）、TG-(GGGS)3-AS（配列番号８５９）、TG-(GGGS)4-AS（配列番号８６０）、およびTG-(GGGS)5-AS（配列番号８６１）からなる群から選択される、実施形態１から８４のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８６．前記リンカーＬ１ＴＧおよび／またはＡＳが、存在しないか、Ｔ、Ａ、ＳおよびＧから選択されるアミノ酸の対によって置換されている、実施形態１から８５のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８７．約１０^−６ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する血清アルブミンに対する親和性を有する、実施形態１から８６のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。８８．約１０^−９ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する血清アルブミンに対する親和性を有する、実施形態８７に従う操作されたポリペプチド。８９．約１０^−１２ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する血清アルブミンに対する親和性を有する、実施形態８８に従う操作されたポリペプチド。９０．少なくとも１日の作用持続期間を有する、実施形態１から８９のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。９１．少なくとも３日の作用持続期間を有する、実施形態９０に従う操作されたポリペプチド。９２．少なくとも６日の作用持続期間を有する、実施形態９１に従う操作されたポリペプチド。９３．ヒト対象において少なくとも６日の作用持続期間を有する、実施形態９２に従う操
作されたポリペプチド。９４．少なくとも７日の作用持続期間を有する、実施形態９１に従う操作されたポリペプチド。９５．ヒト対象において少なくとも７日の作用持続期間を有する、実施形態９２に従う操作されたポリペプチド。９６．本明細書における表２または表３の配列のいずれか１種からなる群から選択される、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。９７．HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２７）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２８）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７２９）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３０）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３１）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３２）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３３）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３４）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３５）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７３６）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３７）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３８）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３９）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４０）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４１）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４２）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４３）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４４）；およびHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４５）からなる群から選択される、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。９８．HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２７）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２８）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７２９）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３０）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３１）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３２）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３３）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３４）；HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３５）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３７）；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３８）；およびHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３９）からなる群から選択される、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。９９．化合物５、化合物９または化合物１１を含む、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１００．前記の操作されたポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０１．前記の操作されたポリペプチドと、少なくとも９８％の配列同一性を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０２．哺乳類への投与の際に、免疫応答を誘発しないか、またはＡＢＤに付いていないか、もしくは本明細書に記載されるような低減した免疫原性のために修飾されていない、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において記載されるＡＢＤに付いているエキセンディンの、哺乳類への投与の際に誘発される免疫応答と比較して、低減した免疫応答を誘発する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０３．医薬として使用するための、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０４．１日２回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０５．１日１回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０６．週に２回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０７．週に１回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０８．少なくとも４０時間の血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１０９．少なくとも６０時間の血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１種に従う操作されたポリペプチド。１１０．少なくとも７２時間の血漿中半減期を有する、前記の実施形態のいずれか１つに従う操作されたポリペプチド。１１１．前記の実施形態のいずれか１に従う操作されたポリペプチドと、医薬上許容される賦形剤とを含む組成物。１１２．水性である、実施形態１１１に従う組成物。１１３．固体である、実施形態１１１に従う組成物。１１４．医薬として使用するための前記の実施形態のいずれか１種に従う組成物。１１５．操作されたポリペプチドが、凍結乾燥された固体である、前記の実施形態のいずれか１種に従う組成物。１１６．ヒト血清アルブミンをさらに含む、前記の実施形態のいずれか１種に従う組成物。１１７．前記の実施形態のいずれか１種に従う操作されたポリペプチドを含む医薬組成物。１１８．操作されたポリペプチドと医薬上許容される賦形剤とを含む、実施形態１１７の医薬組成物。１１９．水性である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２０．固体である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２１．医薬として使用するための、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２２．操作されたポリペプチドが、凍結乾燥した固体である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２３．ヒト血清アルブミンをさらに含む、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２４．筋肉内、静脈内、皮下、皮内、関節内、くも膜下腔内、粘膜、経口、経鼻腔、舌下、肺または頬側送達のための医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２５．皮下送達のための医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２６．注射による送達のための医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２７．経口送達のための医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１２８．経口送達のための医薬組成物であり、固体形態を含む、実施形態１２７に従う医薬組成物。１２９．経口送達のための医薬組成物であり、錠剤、顆粒剤、微粒子剤またはカプセル剤を含む、実施形態１２８に従う医薬組成物。１３０．除放性または持続性医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１３１．１日に２回投与される医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物．１３２．１日に１回投与される医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１３３．週に２回投与される医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１３４．週に１回の医薬組成物である、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１３５．このような治療を必要とする対象において疾患または障害を治療するための、前記の実施形態のいずれか１種に従う医薬組成物。１３６．疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、卒中、短腸症候群（ＳＢＳ）、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、無自覚性低血糖（ＨＵ）、サルコイドーシスを含めた拘束性肺疾患またはメタボリックシンドロームＸである、実施形態１３５の医薬組成物。１３７．前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、ＳＢＳまたはパーキンソン病である、実施形態１３６の医薬組成物。１３８．前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、妊娠性糖尿病、ＨＩＶ−治療誘発性糖尿病、ステロイド誘発性糖尿病または成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）である、実施形態１３７の医薬組成物。１３９．操作されたポリペプチドが週に１回の投与を提供する、実施形態１から１３８のいずれか１種の操作されたポリペプチドまたは医薬組成物。１４０．前記の実施形態のいずれか１種に従う操作されたポリペプチドを、それを必要とする対象に、前記疾患または障害を治療するのに有効な量で投与することを含む、対象において疾患または障害を治療する方法。１４１．前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、卒中、短腸症候群（ＳＢＳ）、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、無自覚性低血糖（ＨＵ）、サルコイドーシスを含めた拘束性肺疾患またはメタボリックシンドロームＸである、実施形態１４０に従う方法。１４２．前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、卒中、ＳＢＳ、高脂血症またはパーキンソン病である、実施形態１４０に従う方法。１４３．前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、ＳＢＳまたはパーキンソン病である、実施形態１４２に従う方法。１４４．前記疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または前糖尿病である、実施形態１４３に従う方法。１４５．前記疾患または障害が、ＩＩ型糖尿病である、実施形態１４２に従う方法。１４６．前記疾患または障害が、脂質異常症または高脂血症である、実施形態１４２に従う方法。１４７．前記の実施形態のいずれか１種に従う操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。１４８．実施形態１４７に従うポリヌクレオチドを含む発現ベクター。１４９．請求項１４８に従う発現ベクターを含む宿主細胞。１５０．操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、前記の実施形態のいずれか１種の操作されたポリペプチドを製造する方法。１５１．反応性側鎖が保護されているアミノ酸および／またはア
ミノ酸誘導体を使用する非生物学的ペプチド合成によって、前記の実施形態のいずれか１種に従う操作されたポリペプチドを製造する方法であって、非生物学的ペプチド合成が、アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を段階的にカップリングして、反応性側鎖が保護されている、前記の実施形態のいずれか１種に従うポリペプチドを形成することと、ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去することと、水溶液中での得られたポリペプチドのフォールディングとを含む、方法。１５２．エキセンディンを製造すること、ＡＢＤを製造すること、および製造されたＡＢＤを製造されたエキセンディンとコンジュゲートすることを含む、前記の実施形態のいずれか１種に従う操作されたポリペプチドを製造する方法。

実施例１〜５は、その他の事柄の中でも、本明細書に記載されたＡＢＤの優れた特性、例えば、これまでのＡＢＤと比較して低減された免疫原性特性を例示するために提供される。

実施例１
アルブミン結合ポリペプチドのクローニング、発現、精製および特性決定。
この実施例では、そのアミノ酸配列が図１に示されている８種の異なるアルブミン結合ポリペプチド、ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）をクローニングし、精製し、特性決定した。

材料および方法
Ｇ１４８−ＧＡ３の突然変異体を、適当なオリゴヌクレオチドを用い、部位特異的突然変異誘発を使用して作製し、所望のアルブミン結合ポリペプチド変異体を得た。特異的エンドヌクレアーゼ部位ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体の前のＮ末端ＭＧＳＳ配列（配列番号８４４）を付加するプライマーを用い、ＰＣＲによって、遺伝子断片を増幅した。ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて断片を切断し、精製し、同一酵素で制限された、クローニングベクター、プラスミドｐＡＹ０２５５６（ｐＢＲ３２２由来の複製起点、カナマイシン耐性遺伝子および対象とする遺伝子の発現のためのＴ７プロモーターを含有する）にライゲーションした。ライゲーションをエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。形質転換された細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補給した、ＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）血液寒天基礎培地）上に広げ、続いて、３７℃で一晩インキュベーションした。ＰＣＲを使用してコロニーをスクリーニングし、ビオチン化オリゴヌクレオチドおよび製造業者のプロトコールに従って使用されるＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して増幅した断片の配列決定を実施した。Ｍａｇｎａｔｒｉｘ８０００（ＮｏｒＤｉａｇＡＢ）を使用して、磁性ストレプトアビジンコーティングされたビーズと結合させることによって配列決定反応物を精製し、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。すべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体を、モノマーとしてサブクローニングし、発現ベクターによってコードされるコンストラクトを、ＭＧＳＳ−［ＰＰ＃＃＃］た（配列番号８４４として開示される「ＭＧＳＳ」）（ここで、ＰＰ＃＃＃は、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成する４６個のアミノ酸残基に対応する）。

さらに、Ｇ１４８−ＧＡ３の遺伝子断片、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）を、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成する４６個のアミノ酸残基の前に、特異的エンドヌクレアーゼ部位ならびにヘキサヒスチジン配列（配列番号４９）、ＴＥＶプロテアーゼ部位およびグリシン残基を付加するプライマーを用い、ＰＣＲによって増幅させた。ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（配列番号４５９）は、グリシン残基が付加された、アルブミン結合ポリペプチドＧ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）に対応する。断片をＸｂａＩおよびＮｏｔＩで切断し、精製し、同一酵素で制限された、クローニングベクターであるプラスミドｐＡＹ０２５１２（ｐＢＲ３２２由来の複製起点、カナマイシン耐性遺伝子および対象とする遺伝子の発現のためのＴ７プロモーターを含有する。クローニング部位の前には、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号４９）を含有するペプチドをコードする配列とそれに続くＴＥＶプロテアーゼの切断部位がある。）にライゲーションした。連結、形質転換および配列検証を、上記のように実施した。４種のアルブミン結合ポリペプチド変異体Ｇ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７、ＰＰ０１３およびＰＰ０３７を、モノマーとしてサブクローニングし、発現ベクターによってコードされるコンストラクトを、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧ−［ＰＰ＃＃＃］（配列中、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧは、配列番号６００であり、「ＰＰ＃＃＃」は、本明細書に記載のＡＢＤ配列を表す）とした。

タンパク質発現
アルブミン結合ポリペプチド変異体を、Ｎ末端ＭＧＳＳ伸長（配列番号８４４として開示される「ＭＧＳＳ」）またはＮ末端Ｈｉｓ６−タグ（配列番号４９）とそれに続くＴＥＶ−プロテアーゼ認識部位およびグリシン残基のいずれかを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。各アルブミン結合ポリペプチド変異体のコロニーを使用して、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度に補給した、４ｍｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地に播種した。培養物を、３７℃でおよそ５時間増殖させた。パラレルバイオリアクター（Ｇｒｅｔａｓｙｓｔｅｍ，ＢｅｌａｃｈＢｉｏｔｅｋｎｉｋＡＢ）において、各培養物から得られた３ｍｌを使用して、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度に補給した８００ｍｌのＴＳＢ＋ＹＥに播種した。培養を、８００ｍｌ／分のエアレーションおよび撹拌プロフィールを用い、３７℃で実施して、２のＯＤ６００まで３０％を上回る溶存酸素レベルを維持し、続いて、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの終濃度に添加した。培養を５時間継続し、その後、培養物を１０℃に冷却し、エアレーションを停止し、撹拌を３００ｒｐｍに低下させた。遠心分離（１５６００×ｇ、４℃、２０分）によって細胞ペレットを回収し、精製まで、−２０℃で保存した。

Ｈｉｓ６−タグ（配列番号４９）およびＴＥＶ−プロテアーゼ部位を用いるアルブミン結合ポリペプチド変異体の精製
可溶性ヘキサヒスチジンタグのついたポリペプチド（配列番号４９として開示される「ヘキサヒスチジン」）ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（配列番号４５９）を有する凍結細胞ペレットを、３５ｍｌの結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に懸濁し、１０００Ｕのベンゾナーゼ（登録商標）（１．０１６５４．００１、Ｍｅｒｃｋ）を添加し、超音波処理によって破壊した。各ポリペプチドについて、超音波処理した懸濁液を遠心分離（１時間、３７０００×ｇ、４℃）によって清澄化し、上清をＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐＴＭカラム（１１−００３３−９９、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを１０ｍｌの洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、３ｍｌの溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いてポリペプチドを溶出した。バッファーを、ＰＤ−１０脱塩カラム（１７−０８５１−０１、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して切断バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８）に交換した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって、ポリペプチド生成物の量を決定し、その後、ＤＴＴを５ｍＭの終濃度に添加した。切断バッファーに、Ｈｉｓ６タグをつけたＴＥＶプロテアーゼ（配列番号４９として開示される「Ｈｉｓ６」）をポリペプチド生成物に対して１：１０の質量比で添加した。切断を、４℃、緩徐な混合下で一晩実施した。切断混合物にイミダゾールを２０ｍＭの濃度に添加し、その後、混合物をＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐＴＭカラム（１１−００３３−９９、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、切断されたＨｉｓ６タグ（配列番号４９）、Ｈｉｓ６−タグのついたＴＥＶプロテアーゼ（配列番号４９として開示される「Ｈｉｓ６」）およびＨｉｓ６タグのついた未切断生成物（配列番号４９として開示される「Ｈｉｓ６」）を回収した。

各変異体について、アルブミン結合ポリペプチド変異体を含有するフロースルーを、以下のように逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によってさらに精製した。フロースルー画分を、ＲＰＣＡバッファー（水中、０．１％ＴＦＡ）で先に平衡化させた１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。１０カラム容積（ＣＶ）のＲＰＣＡバッファーを用いるカラム洗浄後、結合しているポリペプチドを、１０ＣＶの間、０〜５０％ＲＰＣＢバッファー（アセトニトリル中、０．１％ＴＦＡ）の直線勾配を用いて溶出した。流速を２ｍｌ／分とし、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングした。アルブミン結合ポリペプチド変異体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。

ＲＰＣ精製したアルブミン結合ポリペプチド変異体を、ＸＫ１６カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した１２０ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によってさらに精製した。ランニングバッファーは、１×ＰＢＳとし、流速は２ｍｌ／分とした。純粋なアルブミン結合ポリペプチド変異体を含有する画分をプールし、およそ１．３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最後に、製造業者の推奨に従って、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＤｅｔｏｘｉ−ゲルエンドトキシン除去ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ、ｐｒｏｄ番号２０３４４）の１ｍｌのカラムを使用することによって、微量の残存するエンドトキシンから濃縮物を精製した。

以下のとおりに、ＲＰＣ−精製工程の前に、アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９１１を、Ｍａｌ−ＤＯＴＡとコンジュゲートした。ディスポーザブルＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＩＭＡＣ−ＦＴ精製工程からのフロースルー画分のバッファーを、０．２ＭＮａＡｃ、ｐＨ５．５に交換した。マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、カタログ番号Ｂ−２７２）を５倍モル過剰で加え、連続振盪下、３０℃で６０分間インキュベートした。得られたポリペプチドをＰＥＰ０７９６８と表した。

Ｈｉｓ６−タグ（配列番号４９）を含まないアルブミン結合ポリペプチド変異体の精製
可溶性アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）を有する凍結細胞ペレットを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に懸濁し、超音波処理によって破壊した。各ポリペプチド変異体について、超音波処理された懸濁液を遠心分離（３０分、３２０００×ｇ、４℃）によって清澄化し、上清をＨＳＡ−セファロースカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。ＴＳＴ−バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２００ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）、続いて、５ｍＭＮＨ４Ａｃ、ｐＨ５．５を用いて洗浄した後、０．５ＭＨＡｃ、ｐＨ３．２を用いて結合しているアルブミン結合ポリペプチド変異体を溶出した。

アルブミン結合ポリペプチド変異体を、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって以下のとおりにさらに精製した。各変異体について、ＨＳＡ−アフィニティー精製工程から得た溶出液を、ＲＰＣＡバッファー（水中、０．１％ＴＦＡ）で先に平衡化させた１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。１０ＣＶのＲＰＣＡバッファーを用いるカラム洗浄後、結合しているポリペプチドを、１０ＣＶの間、０〜５０％ＲＰＣＢバッファー（アセトニトリル中、０．１％ＴＦＡ）の直線勾配を用いて溶出した。流速を２ｍｌ／分とし、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングした。アルブミン結合ポリペプチド変異体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。最後に、ディスポーザブルＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１×ＰＢＳ（２．６８ｍＭＫＣｌ、１３７ｍＭＮａＣｌ、１．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）にバッファーを交換した。

精製アルブミン結合ポリペプチド変異体の特性決定
濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳを用いてタンパク質をさらに分析した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、各アルブミン結合ポリペプチド変異体のおよそ１０μｇを、ＮｕＰＡＧＥＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、７０℃で１５分間インキュベートし、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。ゲルを、分子量マーカーとしてＳｈａｒｐＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＳｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、染色のためにＰｈａｓｔＧｅｌＢｌｕｅＲ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＸＣｅｌｌＩＩＳｕｒｅＬｏｃｋ電気泳動セル（Ｎｏｖｅｘ）中で、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて流した。

アルブミン結合ポリペプチド変異体の同定を検証するために、ＡＰＩ−ＥＳＩおよびシングル四重極質量分析器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ／ＭＳＤシステムを使用してＬＣ／ＭＳ分析を実施した。およそ１０μｇの各精製アルブミン結合ポリペプチド変異体を、０．５ｍｌ／分の流速のＺｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ８Ｎａｒｒｏｗ−Ｂｏｒｅカラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍ、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にロードした。０．５ｍｌ／分で１５分間の１０〜７０％溶液Ｂの直線勾配を使用してポリペプチドを溶出した。分離を、３０℃で実施した。イオンシグナルおよび２８０および２２０ｎｍでの吸光度をモニｔリングした。精製アルブミン結合ポリペプチド変異体の分子量をＭＳによって確認した。

結果
アルブミン結合ポリペプチド変異体の発現レベルは、１０〜３０ｍｇの生成物／１ｇの細胞ペレットであると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から推定された。

すべての変異体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定される純度は、９５％を超え、ＬＣ／ＭＳ分析は、正しい分子量を検証した。精製後、８種のアルブミン結合ポリペプチド変異体各々の、１から８ｍｇの間の純粋なポリペプチドが得られた。

実施例２
アルブミン結合ポリペプチドの親和性決定
この実施例では、実施例１において合成または発現および精製された、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８、（すなわち、ＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性について特性決定した。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基が付加されたＧ１４８−ＧＡ３のアミノ酸配列と対応するのに対し、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７８４４、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は、種々のＮ末端アミノ酸が付加された、ＰＰ００１（配列番号３０１）、ＰＰ０４３（配列番号３４３）、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）のアルブミン結合ポリペプチドに対応する。

材料および方法
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのバイオセンサー分析を、製造業者の推奨に従って、ＣＭ−５チップ（研究等級；Ｂｉａｃｏｒｅ）の表面のカルボキシル化デキストラン層上にアミンカップリングによって固定化されたＨＳＡ（Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）を用いて実施した。チップの表面１を活性化し、不活性化し、注入の間の参照セル（ブランク表面）として使用したのに対し、表面２は、７３１レゾナンスユニット（ＲＵ）に固定化されたＨＳＡを含み、表面４は、９５５ＲＵに固定化されたＨＳＡを含んでいた。精製アルブミン結合ポリペプチド変異体を、ランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２．５ｎＭ、１０ｎＭおよび４０ｎＭに希釈し、５０μｌ／分の一定流速で５分間注入し、続いて、ＨＢＳ−ＥＰを６０分間注入した。表面を２５μｌＨＣｌ、１０ｍＭの１回の注入で再生した。２セットで親和性測定を実施し、第１のセットでは、ＨＢＳ−ＥＰ、ＰＥＰ０６９２３、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８を注入し（チップ表面２）、第２のセットでは、ＨＢＳ−ＥＰ、ＰＥＰ０６９２３、ＰＥＰ０７８４４、ＰＥＰ０７９１２およびＰＥＰ０７９１４を注入した（チップ表面４）。対照として、各実施においてＰＥＰ０６９２３を２回注入した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結果を解析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線から差し引いた。

結果
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器には、技術的な限界があり、極めて高親和性の測定を妨げる。したがって、Ｂｉａｃｏｒｅ研究の目的は、アルブミン結合ポリペプチド変異体のＨＳＡに対する親和性の正確な動態学パラメータを調べることではない。しかし、結果は、これらのポリペプチドのアルブミンに対する相対的親和性の定量的推定を提供する。参照表面およびバッファー注入を差し引いた後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用し、質量移動について補正し、局所パラメータとしてＲＵｍａｘセットを用いて曲線を１：１（ラングミュア）結合モデルにフィッティングした。曲線は、図２に示されている。相対的Ｋ_Ｄ、ｋ_ａ（ｋ_ｏｎ）およびｋ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ）値を推定し、以下の表に示されている。

表５および６に示されるように、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡとコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）はすべて、ＨＳＡに対して、親Ｇ１４８−ＧＡ３（ＰＥＰ０７９１３；配列番号４５３）の親和性を大きく超えるおおよそ同一の親和性を有するようである。これらのポリペプチドのＨＳＡ親和性は、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）と比較して、同様の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）にもかかわらず、わずかに低い。

実施例３
アルブミン結合ポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）の決定
この実施例では、実施例１に記載のとおりに発現および精製された、アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡとコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）ならびにアルブミンポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９７５（すなわち、マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、カタログ番号Ｂ−２７２）を用いＣｙｓ１４を介してＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７８３４、配列番号４６０を、ＣＤ分析によって分析した。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基を有するＧ１４８−ＧＡ３の配列に対応し、ＰＥＰ０６９２３は、Jonsson et al、前掲によってこれまでに記載された操作された高親和性誘導体であるのに対し、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７５５４、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４、ＰＥＰ０７９６８、ＰＥＰ０７８４４およびＰＥＰ０７９７５は、本開示内容に従って種々のＮ末端アミノ酸付加を有する、ＰＰ００１（配列番号３０１）、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）、ＰＰ０３７（配列番号３３７）およびＰＰ０４３（配列番号３４３）の４６個のアミノ酸残基のアルブミン結合ポリペプチドの例である。

材料および方法
精製アルブミン結合ポリペプチド変異体を１×ＰＢＳで、０．４から０．５ｍｇ／ｍｌの間の終濃度に希釈した。円偏光二色性（ＣＤ）分析は、１ｍｍの光路長を有するセル中で、ＪａｓｃｏＪ−８１０分光偏光計で実施した。可変温度測定では、２０°〜９０℃で５℃／分の温度勾配を用い、２２１ｎｍの吸光度を測定した。

結果
ＣＤ対温度プロットにおける遷移の中間点を求めることによって、種々のアルブミン結合ポリペプチド変異体の融解温度（Ｔｍ）を算出した。結果は、以下の表７に要約されている。

¹⁾ ペプチドは、システインでマレイミド-DOTAとコンジュゲートしている
²⁾ ペプチドは、C末端でアミド化されている
³⁾ ロイシン(下線が引かれている)は、本開示内容の第1の態様において定義されるようなアルブミン結合ポリペプチドの46個のアミノ酸の配列の位置1の残基である
配列番号８４５として開示される表７中の「ＧＳＳＬ」。

ポリペプチドＰＥＰ０７９６８は、ＰＥＰ０７９１２と、前者が、位置１４にシステイン残基を有し、これがマレイミドＤＯＴＡとコンジュゲートしており、後者が、セリン残基である点を除き同一である。したがって、ＤＯＴＡ修飾は、融解温度に影響を及ぼしてはならない。また、ＰＥＰ０７９７５は、Ｃｙｓ１４を使用してＤＯＴＡとマレイミドコンジュゲートしており、Ｃ末端アミド（ペプチド合成に起因する）およびグリシンの代わりにＮ末端アラニンを有する点を除いてＰＥＰ０７９６８と同一である。さらに、ＰＥＰ０７９１２およびＰＥＰ０７５５４を比較することで、Ｎ末端セリンが、同一位置のグリシンよりも高い融解温度をもたらす（Ｔｍにおける５℃の相違）ことが示される。したがって、ＰＥＰ０７９１２およびＤＯＴＡがコンジュゲートしている変異体を除く、本開示内容に従うすべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体は、５５℃を上回るＴｍを示す。Ｎ末端部分の重要性を考慮して、すべての試験されたアルブミン結合ポリペプチドは、Jonsson et alの誘導体、例えば、ＰＥＰ０６９２３よりも優れている。

実施例４
血清反応分析
本明細書に開示されるような一連のアルブミン結合ポリペプチドと結合できる、ＩｇＧを含有するヒト血清のパーセンテージを、ＥＬＩＳＡによって分析した。１２７の個体に対応する合計１４９種の血清サンプルをスクリーニングした。

材料および方法
ＥＬＩＳＡプレート［９６ウェル、ハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９０）］を、コーティングバッファー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３０４１）で８μｇ／ｍｌに希釈した５０μｌ／ウェルのＡｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）を用いてコーティングした。プレートを、４℃で３日間オーバーナイトでコーティングした。分析の当日に、プレートを水道水で２回洗浄し、０．０５％のカゼイン（ＰＢＳＣ）を含有する１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２時間ブロッキングした。プレートを空にし、ＰＢＳＣで２μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌ／ウェルのアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）を、事前に作製したプレート配置に従って添加した。室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーション後、自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用してプレートをＰＢＳＣで４回洗浄した。１２９の個体から得た１４９種の血清サンプルを、１１７４μｌのＰＢＳＣに、２４μｌの血清を添加することによって、ＰＢＳＣで５０倍希釈した。事前に作製したプレート配置に従って、ウェルあたり、希釈した血清のうち５０μｌを添加した。各血清サンプルを一連で試験した。各プレート上に、各アルブミン結合ポリペプチドの陽性および陰性対照が含まれる。アルブミン結合抗体（５０μｌ、ＰＥＰ０６９２３を用いて免疫処理した霊長類から得た血清から社内で調製された０．５μｌ／ｍｌ免疫グロブリン溶液）を陽性対照として添加し、５０μｌのＰＢＳＣを陰性対照として使用した。プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用してＰＢＳＣで４回洗浄した。結合しているＩｇＧを、ＰＢＳＣで１００００倍希釈した５０μｌ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４０−０５）を用いて検出した。自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用してＰＢＳＣで４回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの基質を添加した（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３４０２１）。１０〜１５分後、各ウェルに５０μｌのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、その後、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して吸光度を測定した。

結果。
アルブミン結合ポリペプチドに対するＩｇＧ結合についてスクリーニングされた１４９種の血清のうち、２３種が、８種すべてのポリペプチドについて陰性であり（ＯＤ値＜０．１）、すなわち、ポリペプチドと結合しているＩｇＧを示さなかった。１種または複数のアルブミン結合ポリペプチドについて陽性であった１２６種の血清を用いて分析を実施した。平均吸光度を算出し（図３Ａ）、ＯＤ値を有する血清のパーセンテージは、＜０．１５（図３Ｂ）または＞１．０（図３Ｃ）のいずれかを評価する。ＩｇＧ結合を有する血清の最高平均ＯＤ値および最高パーセンテージが、ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）を用いて得られたのに対し、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９５４（配列番号４５６）に対して最小の反応性が見られた。

したがって、最も反応性のアルブミン結合ポリペプチドは、親のＧ１４８−ＧＡ３（ＰＥＰ０７９１３、配列番号４５３）およびＧ１４８−ＧＡ３から保持されたヘリックス１を有するこれまでに親和性が改善された誘導体（ＰＥＰ０６９２３、配列番号４５４）であった。第３のより反応性のポリペプチド（ＰＥＰ０７８４４、配列番号４６１）は、ヘリックス１中の位置１４に元のリシンを含有する。この残基はコンジュゲーションに意図され、したがって、そのようなものとして使用される場合に曝露されない。位置１４にアラニンを有する点を除いて同一であるアルブミン結合ポリペプチド変異体（ＰＥＰ０７５５４、配列番号４５６）は、最も反応性が低いものの１種である。

実施例５
アルブミン結合ポリペプチドの免疫原性試験
ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号１５９）を、５２人のヒトコーカサス人種の個体から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＣＲＩ−ＬａｂｏＭｅｄｉｓｃｈｅＡｎａｌｙｓｅ、Ｇｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手）においてＴ細胞増殖を誘導するその能力についてスクリーニングした。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基を有するＧ１４８−ＧＡ３の配列に対応するのに対し、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は、本開示内容に従って種々のＮ末端アミノ酸付加を有する、ＰＰ００７（配列番号７）、ＰＰ０１３（配列番号１３）およびＰＰ０３７（配列番号３７）の４６個のアミノ酸残基のアルブミン結合ポリペプチドの例である。

材料および方法
組織培養（ＴＣ）処理した９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、標準細胞生物学的方法に従って調製されたＰＢＭＣを３０００００個ＰＢＭＣ／ウェルの量で添加した。９００μｇ／ｍｌの（３倍モル過剰）の組換えヒトアルブミン（Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）をさらに含有するＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８、１００μｌ／ウェルの添加によって細胞を刺激した。これは、３０μｇ／ｍｌのアルブミン結合ポリペプチドの終濃度に対応していた。刺激を８連で行い、すなわち、同一量の同一アルブミン結合ポリペプチドを、同一条件下で、８つのウェルに添加した。陽性対照ウェルでは、３０μｇ／ｍｌのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または３０μｇ／ｍｌ破傷風トキソイド（ＴＴ、ＳｔａｔｅｎｓＳｅｒｕｍＩｎｓｔｉｔｕｔ）のいずれかを用いて細胞を刺激した。陰性対照ウェルでは、９００μｇ／ｍｌのアルブミンを含むか含まないＡＩＭＶ培地のみを添加した。

ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、７日の培養後に細胞増殖を評価した。６日目に１μＭ／ウェルのＥｄＵ組み込みマーカーを添加した。７日目に、細胞を洗浄し、プレートから解離させ、再度洗浄し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ試薬（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗ＣＤ４−Ａｌｅｘａ６４７試薬（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて３０分間染色した。染色後、細胞を洗浄し、固定し（ＢＤｃｅｌｌｆｉｘ、ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、透過処理し（サポニンを使用して）、製造業者のプロトコールに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ試薬を添加することによってＥｄＵについて染色した。染色が完了した後、細胞を再度洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。増殖細胞の数を評価するために、分析の前に各ウェルに固定された数のフルオスフェア（ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。すべての染色手順および洗浄は、９６ウェルプレート中で直接的に実施した。

生のＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩデータを、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して階層的にゲーティングし、ゲーティングされた細胞数ならびにＥｄＵ−ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８組み込みマーカーのその蛍光強度を記録した。増殖細胞数／８連のタンパク質処理ウェルの平均値を、陽性および陰性対照と比較し、刺激指数（ＳＩ）として記載される得られる比を算出した。ＳＩおよび複製間の変動に基づいて、刺激および阻害について閾値ＳＩ値をそれぞれ、２．０および０．５に設定した。

結果
アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８を、インビトロＰＢＭＣ増殖アッセイを使用して、標的ヒト集団における３倍過剰の組換えヒトアルブミンの存在下でのその免疫学的可能性について評価した。アルブミン対照と比較して、ＰＥＰ０７９１３は、５２ドナーのうち６において、ＰＥＰ０７９１２は、５２ドナーのうち５において、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は、５２ドナーのうち１においてＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導した（図４Ａ）。

５２ドナーすべての平均刺激指数（ＳＩ）は、組換えヒトアルブミンを含有する陰性対照と比較して、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８について大きく異ならなかった（それぞれ、ｐ＝０．７９および０．４８、図４Ｂ）。ＰＥＰ０７９１３のＳＩは、大幅に高かった（ｐ＝０．００２）のに対し、ＰＥＰ０７９１２のＳＩは高かったが有意ではなかった（ｐ＝０．０３、図４Ｂ）。

バッファーのみと比較して、反応する個体の数は、ＰＥＰ０７９１２について１０、ＰＥＰ０７９１２について７、ＰＥＰ０７９１４について２、ＰＥＰ０７９６８について１、組換えヒトアルブミンについて２であり、２つの陽性対照ＴＴおよびＫＬＨについてそれぞれ、４９および５１であった（図４Ｃ）。アルブミン結合ポリペプチドを、その免疫原性に従って以下の順序にランク付けした：ＰＥＰ０７９１３＞ＰＥＰ０７９１２＞ＰＥＰ０７９１４＞ＰＥＰ０７９６８。ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は両方とも、非免疫原性と定義された。したがって、上記の結果は、本開示内容のアルブミン結合ポリペプチドの免疫原性の可能性が、陽性対照と比較して低いことを実証する。

実施例６
エキセンディン類似体−ＡＢＤ型の操作されたポリペプチドの精製。
方法。当技術分野で公知のように、本発明の操作されたポリペプチド出発形態、例えば、同様の発現ペプチド、例えば、成熟した操作されたポリペプチドHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２７）（化合物５）をもたらすMAHHHHHHVGTGSNENLYFQHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号８３８）に適用可能である組換え合成の一例を提供する、例えば、本発明のＡＢＤではなくＡＢＤ００２３９を含有して化合物６８４をもたらす配列：MAHHHHHHVGTGSNENLYFQHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP（配列番号８４６）におけるようにＨｉｓ_６（配列番号４９）「タグ」を組み込む、Ｎ末端伸長を有する操作されたポリペプチドを製造した。

細胞抽出物の調製。細胞抽出物を調製するために、５０ｍＬの細胞培養物から得た細胞ペレットを、６０ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に完全に再懸濁した。再懸濁された細胞を、１００ＰＳＩのマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ＭＡ）に３回通した。細胞抽出物を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して、細片を除去した。ＥＧＴＡ（１５０ｍＭストック）を、細胞抽出物に、３ｍＭの最終濃度に添加した。

Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー。１５ｍＬの空のカラムに、１０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフローの５０％懸濁液を充填した。１０ｍＬの水、５０ｍＬの溶解バッファーおよび２０ｍＬの、３ｍＭＥＧＴＡ（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭＥＧＴＡ）を有する溶解バッファーを用いてカラムを洗浄した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムの頂部に細胞抽出物を注意深く添加し、フロースルーを集めた。３０ｍＬの、ＥＧＴＡ（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭＥＧＴＡ）を有する溶解バッファーを用いてカラムを洗浄した。カラムの頂部に１０ｍＬの溶出バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を添加し、溶出画分（２ｍＬ／画分）を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、フロースルーおよび各画分を調べた。Ｈｉｓタグのついた化合物を含有する画分をプールした。

ＴＥＶプロテアーゼ消化。Ｈｉｓ_６タグをつけた化合物（配列番号４９として開示される「Ｈｉｓ_６」）を、２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いて３倍希釈した。β−メルカプトエタノール（０．１％）および２％のＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼ（２ｍｇ／ｍＬ、１０，０００ユニット／ｍｇ、Ａｃｃｅｌａｇｅｎ）を添加し、その結果を混合し、室温で２時間および４℃で一晩インキュベートした。

Ｎｉ−ＮＴＡを用いる切断されたＨｉｓ−タグおよびＴｕｒｂｏＴＥＶの除去。１５ｍＬの空のカラムに、６ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフローの５０％懸濁液を充填した。カラムを２０ｍＬの水および２０ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、４５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を用いて洗浄した。ＴＥＶ消化反応物を、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いて２倍希釈した。希釈された消化反応物を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムの頂部に注意深く添加し、フロースルーを集めた。１０ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、４５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０をカラムに添加し、あらゆる結合していないタンパク質を溶出した。フロースルーを集め、組み合わせた。

第１のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。Ｎｉ−ＮＴＡフロースルーを、０．２μｍフィルターを用いて濾過した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨｉＬｏａｄ２６／６０カラムを、３９０ｍＬのＰＢＳを用いて予め平衡化した。濾過されたフロースルーを、サンプルポンプを用いてＨｉＬｏａｄ２６／６０カラムに注入した。１．５ＣＶのＰＢＳを用いてタンパク質を溶出し、モノマーピークをプールした。

第２のサイズ排除クロマトグラフ。第１のＳＥＣプールを０．２μｍフィルターを用いて濾過した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨｉＬｏａｄ２６／６０カラムを、３９０ｍＬのＰＢＳを用いて予め平衡化した。濾過されたフロースルーを、サンプルポンプを用いてカラムＨｉＬｏａｄ２６／６０に注入した。１．５ＣＶのＰＢＳを用いてタンパク質を溶出し、モノマーピークをプールした。

第３のサイズ排除クロマトグラフィー。第２のＳＥＣプールを、０．２μｍフィルターを用いて濾過した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨｉＬｏａｄ２６／６０カラムを、３９０ｍＬのＰＢＳを用いて予め平衡化した。濾過されたフロースルーを、サンプルポンプを用いてカラムＨｉＬｏａｄ２６／６０に注入した。１．５ＣＶのＰＢＳを用いてタンパク質を溶出し、モノマーピークをプールした。

ＥｎｄｏＴｒａｐＲｅｄを用いる残存するエンドトキシンの除去。第３のＳＥＣプールは、約２０ＥＵ／ｍｇのエンドトキシンを依然として含有しており、これを、ＥｎｄｏＴｒａｐＲｅｄの使用によって除去した。手短には、スラリーに１ｍＬの再生バッファーを添加し、チューブをおよそ５秒間穏やかに振盪することによって混合し、０．５ｍＬのゲルスラリーを活性化した。上清を遠心分離し、吸引した。この工程をさらに２回反復した。１ｍＬの平衡バッファーを添加し、チューブをおよそ５秒間穏やかに振盪することによって混合を実施した。上清を遠心分離し、吸引した。この工程をさらに２回反復した。樹脂にタンパク質サンプル（５．５ｍＬ）を添加し、室温で９０分間インキュベートし、インキュベートしながらチューブを穏やかに揺り動かし回転させた。結果を、１２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を清潔なチューブに移した。

結果。最終精製タンパク質は、使用された条件下でおよそ６ｋＤのタンパク質としてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動した。ＬＣ−ＭＳは、９８２７ダルトンの正確な分子量を示した。タンパク質収量は、５０ｍＬの細胞培養物から３．３ｍｇであった。

実施例７
エキセンディン−ＡＢＤ操作されたポリペプチドの活性
本発明のエキセンディン−ＡＢＤ操作されたポリペプチドは、インビトロ細胞活性化アッセイにおいて十分なエキセンディン活性を保持していた。したがって、操作されたポリペプチドは、哺乳類に単回用量として投与された場合にエキセンディン−４と比較した場合に、血糖低下および体重減少について、著しく改善された作用持続期間を提供した。驚くべきことに、作用持続期間は、げっ歯類モデルにおいて少なくとも１日に、さらに少なくとも４日、さらに少なくとも７日またはそれより長くに延長され得、これは、ヒト対象では、少なくとも１週間の作用持続期間に変換され得、したがって、１日２回、１日１回、週に３回、週に２回またはさらに週に１回の投与にも適している。

実施例８
アルブミン結合
操作されたポリペプチド化合物のアルブミンとの結合の特性決定は、本明細書に記載されたＢｉａｃｏｒｅを含めた任意の数の方法によって実施され得る。２５℃でＧＬＣセンサーチップを使用するＢｉｏＲａｄＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６システム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズカリフォルニア、ＵＳＡ；ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステムカタログ番号１７６−０１００）。アミンカップリングのために、以下に示されるように最初のストックから水で３０倍希釈したスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣの１：１混合物を使用してＧＬＣチップを５分間活性化した。各アルブミンサンプルを１０ｍＭ酢酸ＮａｐＨ５．０で２５ｕｇ／ｍｌに希釈し、別個のセンサー表面上に５分間注入した。次いで、１ＭエタノールアミンｐＨ８．５を用いて各表面をブロッキングした。各アルブミンをレゾナンスユニットにおいて２０００〜５０００の密度でカップリングした。３倍希釈シリーズにおいて最高濃度として５ｎＭを使用して、操作されたポリペプチドの結合を調べた。ランニングバッファーは、１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡおよび０．００５％ｔｗｅｅｎ−２０を含有していた。３倍希釈シリーズを使用してすべてのサンプルを調べた。各濃度シリーズを２連で試験した。最高濃度の解離相を、３時間モニタリングした。

操作されたポリペプチドの測定された相対Ｋ_Ｄが、以下の表８に示されている。結果は、アルブミン結合ポリペプチドが、アルブミンと高親和性で会合していることを示す。括弧内の数字は、最下位桁での標準偏差を表す。以下の表からわかるように、ＡＢＤ００２３９のアルブミン結合ドメインと（ポリペプチド化合物６８４または化合物０８８を作製するために）または本発明のＡＢＤと（本発明の操作されたポリペプチド、例えば、化合物５を作製するために）融合しているエキセンディンポリペプチドは、コンジュゲートしていないＡＢＤＰＥＰ０７９８６自体と比較してでさえ、種々の種から得た血清アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンに対して極めて高親和性を保持する。操作されたポリペプチドは、新規ＰＥＰ７９８６の代わりに先のＡＢＤ００２３９と融合している、同定されたエキセンディン類似体−リンカー構築物と比較してでさえ高親和性を保持する（化合物６８４を化合物５を比較する）。

実施例９
ＧＬＰ−１受容体機能アッセイにおける化合物の活性
化合物の機能活性は、ＧＬＰ−１受容体を発現する細胞株を使用して調べられ得る。例えば、アッセイ法については、参照により組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２０１１００９７７５１Ａ１を参照のこと。この実施例では、ＧＬＰ−１Ｒを内因性に発現する細胞を使用して機能活性を調べ、エキセンディン活性の尺度としてｃＡＭＰ誘導を検出する。ＨＴＲＦアッセイキットを使用した（ＣｉｓｂｉｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ベッドフォード、マサチューセッツ）。生物検定法では、カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＢとしてＣｉｓｂｉｏから入手可能なＨＴＲＦ（登録商標）ｃＡＭＰｄｙｎａｍｉｃ２１，０００アッセイキットを使用する細胞ベースのアッセイにおいて、ラット甲状腺癌腫６−２３（クローン６）細胞を使用した。ＨＴＲＦ（登録商標）標準および較正は、キット中の使用説明書に従って調製する。３８４ウェル形式のＨＴＲＦ（ＣｉｓＢｉｏ）細胞ベースのｃＡＭＰアッセイキットを使用して、化合物処理の３０分後にｃＡＭＰの蓄積を測定する。ペプチドの有効性は、１０μＭのフォルスコリン（アデニレートシクラーゼの構成的アクチベーター）を用いる細胞処理に対して調べられ、ペプチドの効力（ＥＣ５０）は、４−パラメータモデルにフィッティングさせた非線形回帰分析を使用する濃度反応曲線の分析によって調べられる。効力（ＥＣ５０）についてのＧＬＰ−１受容体機能活性（ｃＡＭＰ誘導）の結果は、以下の表９に提供されている。

血清アルブミンの存在下での操作されたポリペプチド化合物のインビトロ活性の特性決定を実証した。アッセイは、アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンの存在下および不在下で実施され得る。上記のデータは、約０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で調べた。以下の表１０は、上記のであるが、種々の種に由来し、増大した量の血清アルブミンの存在下での受容体活性化（ｃＡＭＰ誘導）アッセイの機能活性を示す。わかるように、驚くべきことに、化合物１１が血清アルブミンと、例えば、ヒト血清アルブミンと結合している場合でさえ、その立体障害の可能性およびアルブミン結合に起因する化合物の見かけのストークス半径の変化を有するＡＢＤおよび大きな血清アルブミンの存在にもかかわらず、操作されたポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を保持する。一部の種の血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンに対する、ＡＢＤおよび操作されたポリペプチドのピコモル親和性を考えると、操作されたポリペプチドは、アッセイにおいて存在するアルブミンと有効に十分に結合している（従って、循環血液中でインビボで同様に十分に結合している）と考えられる。アルブミンと結合している化合物の極めて高い親和性（上記のような）および血液中の高濃度の血清アルブミンの存在のために、化合物はインビボで本質的に結合した状態で存在するが、驚くべきことに十分なエキセンディン機能を提供する（本明細書において実証されるような）と予測される。

実施例１０
ＯＧＴＴＤＯＡ（経口糖負荷試験作用持続期間）インビボ活性。
経口胃管栄養法（１．５ｋ／ｋｇデキストロース）の前およびに胃管栄養法の３０分後に血糖を低下させる効果を、２５ｎｍｏｌ／Ｋｇで投薬された示された化合物を用いる用量の１日後に調査し、結果は以下の表に示されている。薬物を、４時間絶食させたＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウスに投与した。薬物投与の２４時間後に、ＯＧＴＴを実施して、化合物活性の持続期間を評価した。血糖は、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．、ａＪｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎＣｏｍｐａｎｙ、ミルピタス、カリフォルニア）を用いて測定した。＊ビヒクル対照に対してｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、ダネット検定。胃管栄養法の３０分後での、ビヒクルと比較した低下パーセントとしてのグルコース低下が示されている（負の値が、グルコースの低下を示す）。このＯＧＴＴＤＯＡは、薬物活性が、薬物が投与された後、少なくとも２４時間（ＯＧＴＴに先立つ期間の間）存在することを示す。結果は、表１１に示されている。エキセンディン−４（ＡＢＤとコンジュゲートしていない）、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４（ＡＢＤとコンジュゲートしていない）およびコンジュゲートしていないＡＢＤＥＰ０７９８６は、ｔ−２４時間で投薬された場合に、より高用量で提供された場合であっても、このアッセイにおいて不活性である。コンジュゲートしていないエキセンディン化合物が、ＯＧＴＴの直前に３０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与される場合には、エキセンディン−４およびＬｅｕ１４エキセンディン−４の両方とも、基礎からのグルコースの−４１％変化を提供する。比較的短いリンカー（HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP；配列番号８４７）を介してＡＢＤと融合しているＣ末端切断型エキセンディン−４（１−２８）を有する化合物１２は、ＧＬＰ−１受容体に対してインビトロで活性であったが、この持続期間アッセイにおいて２４の持続期間は示さなかった。この場合には、リンカー長を増大することは、このアッセイにおいて望ましい２４以上の持続期間をもたらすと予測される。本明細書に示されるこの作用持続期間アッセイならびにその他のインビボアッセイは、改善された操作されたポリペプチドが、ヒト血漿およびヒト細胞膜プロテアーゼに対して極めて安定であることを実証する。

実施例１１
糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスにおけるエキセンディン−アルブミン結合ドメインポリペプチドの効果
グルコース低下（例えば、ＨｂＡ１ｃ）および体重減少に対する、第１世代アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において開示されるような）と融合しているエキセンディンの慢性曝露の効果を実証するために、ｏｂ／ｏｂ／マウス（糖尿病）を、そのＣ末端で、ＡＢＤ００２３９（ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号においてこれまでに公開されたＡＢＤ、本発明のＡＢＤではない）と呼ばれるアルブミン結合ドメイン型ポリペプチドと融合しているエキセンディンを用いて処理したが、これは、本明細書に開示された新規の改善されたＡＢＤ、例えば、ＰＥＰ７９８６を使用する、本改善された操作されたポリペプチドの活性の一例を提供する。ｏｂ／ｏｂマウスにおける体重、グルコース低下およびＨｂＡ_１ｃ低下に対する試験化合物の効果の経時的推移を用量後に調査し、４週間での値が図５Ａ〜５Ｃに示されている。図５Ｃに表されるように、大幅な体重減少が、２８日間各週に２回の２５および２５０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物ＩＰを用いる処理に伴われる。図５Ａおよび５Ｂは、グルコース（処理前％）（図５Ｂ）およびＨｂＡ１ｃ（処理前％）（図５Ａ）の変化を表す。点は、平均±ｓ．ｄ．（標準偏差）を表す。試験化合物は、絶食していない雄のｏｂ／ｏｂマウスにおいて日＝０にベースラインサンプル採取の直後にｓｃ注入した。別に示さない限り、本明細書に記載された血糖測定は、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）デバイス（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｉｐｔａｓを使用した。２５ｎｍｏｌ／ｋｇｂｉｗ（週に２回）用量について観察された効果は、およそ連続注入（ＣＳＩ）によって約７．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄで投与されたエキセンディン−４について観察されたものであった。したがって、匹敵する用量で、エキセンディン−４−ＧＧＳ−ＡＢＤ００２３９化合物（化合物０８８）、最大に有効な用量のエキセンディン−４の血糖および体重減少効果に対応していた。２５０ｎｍｏｌ／ｋｇでは、化合物０８８は、最大に有効な用量のエキセンディン−４の２倍有効であった。さらに、驚くべきことに、等モル投薬では、化合物０８８は、血糖低下、ＨｂＡ１ｃ低下および体重減少について、リラグルチド［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル））−Ｌｙｓ２６，Ａｒｇ３４］−ＧＬＰ−１−（７−３７）−酸、アルブミン結合ＧＬＰ−１誘導体よりも有効であった（示されていないデータ）。

驚くべきことに、上記で観察されるようなコンジュゲートしていないエキセンディン-4と比較して、低下したインビトロ効力にもかかわらず、本明細書に開示されたアルブミン結合ポリペプチドと融合しているエキセンディンの急性(６時間以内)インビボ活性は、マウスにおける食物摂取の低減によって測定される場合など、最大有効性に関して、コンジュゲートしていないエキセンディンのものと同様であり、効力（ＥＤ５０；例えば）に関しては、わずかに小さい（数倍）だけである（示されていないデータ）。さらにより驚くべきことに、本明細書に開示されたアルブミン結合ポリペプチドと融合しているエキセンディンの慢性曝露の効果は、エキセンディン−４（連続注入された）とほぼ同程度に強力であったが、より大きな最大効果を提供できた。さらに、マウスまたはラットアルブミンの極めて高い親和性および低い解離速度(off rates)を考慮すると、インビボアッセイでは（ならびに、インビトロアッセイでは）、操作された化合物はすべて、アルブミンと有効に結合している。したがって、改善された操作されたポリペプチドは、アルブミンと結合している場合でさえＧＬＰ−１Ｒ機能活性を保持する。これは、幾分かは、アルブミン化合物、例えば、リラグルチドが、アルブミンから解離している場合のみ大幅に活性であると報告されているので、驚くべきことである。また、別の人々は、ＧＬＰ−１受容体機能を得るためにコンジュゲートしていたアルブミン結合ペプチドからタンパク質分解的にＧＬＰ−１またはエキセンディンを除去する必要性を報告している。したがって、本願を通じて記載された改善された操作されたポリペプチドのインビボ活性は、さらにより素晴らしいものである。

実施例１２
インビボでの操作されたポリペプチドの長い持続期間および作用
本明細書に記載された操作されたポリペプチドの活性の長い半減期および長い持続期間をさらに実証するために、ラットを使用して薬物動態（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）特性を調べた。正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける皮下に投薬された例示された操作されたポリペプチドの薬物動態プロフィールおよび生物活性が示されている。組換え操作された化合物である化合物１１（そのＣ末端でグリシンリンカーを介してＰＥＰ０７９８６と融合しているＬｅｕ１４エキセンディン−４を有する）および化合物９を、正常なＨＳＤラットに２５ｎｍｏｌ／ｋｇでｔ＝０で皮下に注射した。給餌したＨＳＤ雄のラットから、ｔ＝１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間で尾出血によって血液を採取した。食物および体重を毎日測定した。図６Ａ（化合物１１）および７Ａ（化合物９）は、食物摂取を低減する化合物の効果を表す。図６Ｂ（化合物１１）および７Ｂ（化合物９）は、体重を低減する化合物の効果を表す。図６Ｃ（化合物１１）および７Ｃ（化合物９）は、単回用量後の化合物のＰＫプロフィールを表す。点は、平均±ｓｄを表す。図中、ビヒクルは、中黒四角であり、化合物１１は、中白の下向き三角であり、化合物９は、中黒三角である。図６Ｃ中の血漿最大濃度は、約２５，０００ピコモルに相当する。

これらの例示的な操作されたポリペプチド化合物１１について、最大７（７）日の曝露を観察し、この投与経路によるラットにおいて、４２（４２）時間の半減期を有し、化合物９は、４６（４６）時間の半減期を有していた。相対成長率によって、またヒトアルブミンに対する操作されたポリペプチドの強力な親和性を考慮して、ヒト対象において少なくとも長い、さらにより長い身体的および生物学的活性持続期間が予測される。したがって、化合物は、特に、ヒト対象における少なくとも毎日、週に２回、さらには毎週の投与のための用途を有する。

実施例１３
インビボでの操作されたポリペプチドの長い持続期間および作用および絶対血漿中半減期
正常なＨａｒｌａｎスプラーグドーリー（ＨＳＤ）ラットにおける、静脈内に投薬された例示的な操作されたポリペプチドの薬物動態プロフィールおよび生物活性が示されており、それから、絶対血漿中半減期が算出され得る。組換え操作された化合物である化合物１１を、正常なＨＳＤラットにおいて２ｎｍｏｌ／ｋｇでｔ＝０で静脈内に注入した。コンジュゲートしていないエキセンディン−４およびエキセンディン−４類似体Ｌｅｕ１４エキセンディン−４を、２ｎｍｏｌ／ｋｇで静脈内に注入した。給餌したＨＳＤ雄のラットから、ｔ＝１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間で尾出血によって血液を採取した。食物および体重を毎日測定した。図８Ａは、食物摂取を低減する化合物１１の効果を表す。図８Ｂは、体重を低減する化合物１１の効果を表す。図８Ｃは、単回ＩＶ用量後の化合物１１のＰＫプロフィールを表す。予測されるように、コンジュゲートしていないエキセンディンの半減期は、１５分未満である。例示的な操作されたポリペプチド化合物１１の絶対半減期は、およそ少なくとも１２．３時間で推定される。点は、平均±ｓｄを表す。

この例示的な操作されたポリペプチドについて、この投与経路によるこれらの比較的低用量でさえの最大４日間の曝露を観察した。相対成長率によって、またヒトアルブミンに対する操作されたポリペプチドの強力な親和性を考慮して、ヒト対象において少なくとも長い、さらにより長い身体的および生物学的活性持続期間が予測される。したがって、化合物は、特に、ヒト対象における少なくとも１日２回（例えば、朝および夜）、少なくとも毎日、週に２回、さらには週に１回の投与のための用途を有する。

実施例１４
亜慢性投薬は、重ね合わせおよびエキセンディン様薬理学を提供する
インビボで例示的な操作されたポリペプチドの亜慢性曝露の効果を実証するために、化合物１１を１４日間、週に２回または毎日皮下投与した。食物摂取阻害、体重減少および化合物１１の血漿レベルを毎日調べた。正常な痩せたＨＳＤラットを、図９Ａ〜９Ｆに示されるように、下向き矢印によって示されるように週に２回（ＢＩＷ；中白下向き三角）か、または毎日（ＱＤ；中白四角）のいずれかで、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ化合物１１を１４日間にわたって用いて皮下処理した。累積食物摂取図９Ａ、毎日の食物摂取の変化パーセント図９Ｂおよび累積食物摂取の変化パーセント図９Ｃによって示されるように、ＢＩＷおよびＱＤ投与の両方とも、ビヒクル（中黒丸）と比較した毎日の食物摂取を阻害した。ＢＩＷおよびＱＤ投与の両方とも、ビヒクルと比較した、総体重の低減図９Ｄおよび体重の大きな負変化パーセント図９Ｅによって示されるように、体重減少をもたらした。図９Ｆは、ＢＩＷまたはＱＤで投与された化合物１１のＰＫプロフィールを表す。点は、点あたり４〜６匹の動物を用いる、平均±ｓ．ｄ（標準偏差）を表す。試験化合物は、ベースラインサンプル採取の直後に日＝０で皮下注入した。

わかるように、両投与様式とも、定常状態が得られるまで、各その後の用量の際の化合物のより高い血漿レベルにつながる重ね合わせ効果を提供する。わずか１１日の処理で、ＢＩＷ（週に２回）用量について観察された有効性が、連続注入（ＣＳＩ）によって約７．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄで投与されたＬｅｕ１４エキセンディン−４について観察されたもの−定常状態レベルで約７％低いビヒクル補正した体重に近似し始めた。ＱＤ投薬は、より円滑なプロフィールを提供するが、より大きな動物およびより長い固有のアルブミン血漿中半減期を有するものに変換されると、ラットにおいて観察されたＱＤパターンに近似する、より円滑な血漿レベルが、このおよび本明細書に記載された任意の操作されたポリペプチドのＢＩＷ、週に３回、さらには毎週の投与について予測される。この操作されたポリペプチドを用いるＱＤ用量は、短い処理期間の間にコンジュゲートしていない注入されたエキセンディンまたはエキセンディン類似体の有効性を達成または上回り、従って、本明細書に記載された操作されたポリペプチドの各々についてもそうであると予測される。

実施例１５
空砲形成の欠如
いくつかのペグ化タンパク質などのいくつかの薬物を用いると、近位尿細管の内側の上皮細胞の細胞質中に望ましくない空胞が形成することがあり、これは望ましくない毒性尺度である。本願の操作されたアルブミン結合化合物は、腎臓空胞を形成しない。Ｃ５７ＢＬ６雌のマウス（ｎ＝２ケージ、３匹のマウス／ケージ）を、消灯の３時間前に毎日秤量した。秤量の直後に、０〜６日目に試験化合物を用いてマウスに皮下注射した。７日目にマウスを屠殺し、腎臓を組織病理学に付した。腎皮質尿細管上皮細胞の細胞質空胞形成の重症度スコアは、以下のとおりとした：スコア１＝最小（８〜１５％）；２＝軽度（１６〜３５％）；３＝中程度（３６〜６０％）；４＝著しい（＞６０％）。空胞形成を引き起こすと知られている陽性対照化合物は、３とスコア化した。ＡＢＤポリペプチドＰＥＰ０７９８６自体は０とスコア化した。操作されたポリペプチド化合物５は０とスコア化した。

実施例１６
経口送達は全身分布を達成する
腸取り込みを伴う経口送達を、化合物０８８を使用して調査した。糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスに、２４０ｎｍｏｌ／ｋｇの以下の化合物、エキセンディン類似体［Ｌｅｕ１４、Ｇｌｎ２８］エキセンディン−４−（１−３２）−ｆＧＬＰ−１−（３３−３７）酸および化合物０８８を用いて経口投与した（胃管栄養法によって経口）。データは、操作されたペプチドが、送達および取り込みを増強し得るその他の特定の賦形剤が存在しない製剤ＰＢＳ／プロピレングリコール（５０：５０）においてでさえ、経口的にバイオアベイラブルであることを実証する。エキセンディン類似体と比較して、エキセンディン類似体の２倍を超える分子量での化合物０８８（両方とも、１ｍｇ／ｋｇ用量で）も、同一製剤において経口的にバイオアベイラブルである。これらの結果は、両化合物が、経口投薬された場合に活性であり、１２０分まで試験された条件下で等しく有効であったことを示す。結果は、図１０に示されている。点は平均±ｓｄを表す。ペプチドは、ベースラインサンプルの採取の直後にｔ＝０で胃管栄養法によって経口的に投薬した。マウスは２時間絶食させたｄｂ／ｄｂマウスとした。したがって、本明細書に示された改善された操作されたポリペプチド化合物は、特に、ヒト対象において、少なくとも１日２回（例えば、朝および夜）、少なくとも毎日、週に３回、種に２回、さらには週に１回の経口投与のための用途を有する。

Claims

アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）配列と、エキセンディン配列、エキセンディン類似体配列またはその活性断片配列から選択される第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチドであって、前記ＡＢＤ配列は、
式（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKT VEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）
（配列中、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）と、
式（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）によって定義されず、配列中、互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）と
を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、操作されたポリペプチド。
前記ＨＤ１配列および前記ＡＢＤ配列を共有結合によって連結している第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
前記の操作されたポリペプチドが、Ｃ末端部分としての前記ＡＢＤ配列と、Ｎ末端部分としての前記ＨＤ１配列とを含む、請求項１または２に記載の操作されたポリペプチド。
構造：ＨＤ１−ＡＢＤを含む、請求項３に記載の操作されたポリペプチド。
構造：ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤを含む、請求項３に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＨＤ１配列が、前記エキセンディンまたはエキセンディン類似体配列である、請求項１から５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン配列が、エキセンディン−４配列であり、エキセンディン類似体配列が、Ｌｅｕ１４エキセンディン−４配列（配列番号３）である、請求項６に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン断片配列が、エキセンディン−４（１−２８）（配列番号９８０）、エキセンディン−４（１−２９）（配列番号９８１）、エキセンディン−４（１−３０）（配列番号６８０）、エキセンディン−４（１−３１）（配列番号９８２）またはエキセンディン−４（１−３２）（配列番号９８３）の配列である、請求項６に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディンまたはエキセンディン類似体配列が、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS（配列番号３）、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号４）、
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS（配列番号２）、
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS（配列番号１１１）、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS（配列番号１１２）、
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS（配列番号１１３）、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK（配列番号１１４）、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK（配列番号１１５）、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK（配列番号１１６）、
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１７）および
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK（配列番号１１８）
からなる配列の群から選択される、請求項６に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディンまたはエキセンディン類似体が、Ｈｉｓ１に対応する位置に修飾を含み、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−α−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−イミダゾアセチル、デス−アミノ−ヒスチジル（イミダゾプロピオニル）、β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジルおよびβ−カルボキシ−イミダゾプロピオニルからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記類似体が、Ｈｉｓ１に対応する位置に修飾を含むエキセンディン−４を含み、（４−イミダゾアセチル）エキセンディン−４、（デス−アミノ−ヒスチジル）エキセンディン−４（または（イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４）、（β−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４、（Ｎ−ジメチル−ヒスチジル）エキセンディン−４および（β−カルボキシ−イミダゾプロピオニル）エキセンディン−４（配列番号９８４）からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン類似体配列が、エキセンディン−４と、請求項９に記載のエキセンディン類似体に対して、または請求項８に記載のエキセンディン断片に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン類似体が、エキセンディン−４と、請求項９に記載のエキセンディン類似体に対して、または請求項８に記載のエキセンディン断片に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン類似体が、エキセンディン−４と、請求項９に記載のエキセンディン類似体に対して、または請求項８に記載のエキセンディン断片に対して少なくとも９０％の同一性を有する、前記請求項に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン類似体が、エキセンディン−４と、請求項９に記載のエキセンディン類似体に対して、または請求項８に記載のエキセンディン断片に対して少なくとも９５％の同一性を有する、前記請求項に記載の操作されたポリペプチド。
前記エキセンディン類似体配列が、挿入、欠失、付加および置換のいずれか１種またはそれらの組合せから独立に選択される１〜５のアミノ酸修飾を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、式（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）
（式中、互いに独立に、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）；および
式（ｉｉ）（ｉ）で定義される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではない）
を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、式（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）（式中、互いに独立に、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）
を含むアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、式（ｉｉ）（ｉ）で定義される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列［ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではなく；あるいは、アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）（式中、互いに独立に、Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）
によって定義されない］を含むアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、
式（ｉｉｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）
（配列中、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）と、
式（ｉｖ）（ｉｉｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）によって定義されず、配列中、互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）と
を含むアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、
式（ｉｉｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）
（配列中、互いに独立して、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、式（ｉｖ）（ｉｉｉ）で定義される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列［ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではなく；あるいは、アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）（式中、互いに独立に、Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）によって定義されない］を含むアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ６が、ＡＢＤにおいて、Ｓである（配列番号９５１）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ６が、ＡＢＤにおいて、Ｅである（配列番号９５２）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ３が、ＡＢＤにおいて、Ｓである（配列番号９５３）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ３が、ＡＢＤにおいて、Ｅである（配列番号９５４）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ３が、ＡＢＤにおいて、Ｑである（配列番号９５５）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ７が、ＡＢＤにおいて、Ａである（配列番号９５６）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ７が、ＡＢＤにおいて、Ｓである（配列番号９５７）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１０が、ＡＢＤにおいて、Ａである（配列番号９５８）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１０が、ＡＢＤにおいて、Ｓである（配列番号９５９）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１０が、ＡＢＤにおいて、Ｒである（配列番号９６０）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ｓである（配列番号９６１）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ｃである（配列番号９６２）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ｋである（配列番号９６３）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ１４が、ＡＢＤにおいて、Ａである（配列番号９６４）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ２６が、ＡＢＤにおいて、Ｄである（配列番号９６５）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ２６が、ＡＢＤにおいて、Ｅである（配列番号９６６）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ３９が、ＡＢＤにおいて、Ｄである（配列番号９６７）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ３９が、ＡＢＤにおいて、Ｅである（配列番号９６８）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４０が、ＡＢＤにおいて、Ａである（配列番号９６９）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４０が、ＡＢＤにおいて、Ｅである（配列番号９７０）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４３が、ＡＢＤにおいて、Ａである（配列番号９７１）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４３が、ＡＢＤにおいて、Ｋである（配列番号９７２）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４４が、ＡＢＤにおいて、Ａである（配列番号９７３）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４４が、ＡＢＤにおいて、Ｓである（配列番号９７４）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
Ｘ４４が、ＡＢＤにおいて、Ｅである（配列番号９７５）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤにおいて、位置４５のロイシンが存在する（配列番号９７６）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤにおいて、位置４５のロイシンが存在しない（配列番号９７７）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤにおいて、位置４６のプロリンが存在する（配列番号９７８）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤにおいて、位置４６のプロリンが存在しない（配列番号９７９）、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
相互作用のｋ_ｏｆｆ値が、最大５×１０−５ｓ−１であるよう、ＡＢＤがアルブミンと結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
相互作用のｋ_ｏｆｆ値が、最大５×１０−６ｓ−１であるよう、ＡＢＤがアルブミンと結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤ配列が、本明細書に開示されたか、または表１に由来するか、または図１もしくは配列番号３０１〜４４４に由来するＡＢＤ配列のいずれか１つから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤ配列が、配列番号３０４〜３０５、配列番号３０７〜３０８、配列番号３１０〜３１１、配列番号３１３〜３１４、配列番号３１６〜３１７、配列番号３１９〜３２０、配列番号３２２〜３２３、配列番号３２５〜３２６、配列番号３２８〜３２９、配列番号３３１〜３３２、配列番号３３４〜３３５、配列番号３３７〜３３８、配列番号３４１〜３４２および配列番号３４９〜３５０のいずれか１種から選択されるアミノ酸配列から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤ配列が、表１または図１の配列のうちいずれか１種に由来するアミノ酸配列から選択される配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤ配列が、式（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義される配列のＮおよび／またはＣ末端に位置する１種または複数のさらなるアミノ酸残基をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端におけるセリン残基を含む、前記請求項に記載の操作されたポリペプチド。
１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端におけるグリシン残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端におけるグルタミン酸残基またはシステイン残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＮ末端におけるアラニン残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＣ末端におけるグリシン残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１種または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤ配列のＣ末端におけるシステイン残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤが、配列番号４４５〜４５０および配列番号４６２〜４６３のいずれか１種から選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤが、２個以下のシステイン残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
ＡＢＤ配列が、１個以下のシステイン残基を含む、前記請求項に記載の操作されたポリペプチド。
エキセンディン配列またはエキセンディン類似体配列またはその断片が、ポリペプチドの位置Ｘ_１４のシステイン残基のチオール基を介してＡＢＤとコンジュゲートしている、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤが、GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号４６３）またはGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７００）である、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、表１、図１または本明細書における表のいずれかに由来する配列からなる群から選択されるペプチド配列のいずれか１種を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
前記ＡＢＤ配列が、式ｉ）もしくはｉｉｉ）のＡＢＤと、または表１、図１もしくは本明細書における表のいずれかのＡＢＤのいずれか１種と、少なくとも９５％の同一性を有するＡＢＤ類似体を含む、請求項１から６９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、１〜３０個のアミノ酸または３０個未満のアミノ酸のペプチドである、請求項１から７０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される、請求項１から７１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、化学合成、翻訳後化学修飾によってか、または宿主細胞への組換え発現によるインビボ組み込みによって組み込まれた非天然アミノ酸を含む、請求項１から７２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１アミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンから選択される、請求項１から７３のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１アミノ酸が、グリシンである、請求項１から７４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、過半数の立体障害のないアミノ酸を含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）またはポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む、請求項１から７６のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、(Gly)3、(Gly)4（配列番号１２５）、または(Gly)5（配列番号１２６）、(Gly)3Lys(Gly)4（配列番号１３１）；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2（配列番号１３２）；(Gly)3Cys(Gly)4（配列番号１３３）；GlyProAsnGlyGly（配列番号１３４）、GG、GGG、GGS、またはGGGS（配列番号１９２）の配列を含む、請求項１から７７のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＡｌａの組合せを含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＳｅｒの組合せを含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、グリシンリッチペプチドからなる群から選択される、請求項１から８０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、Ｎ末端ＴＧジペプチドを含む、請求項１から８１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、Ｃ末端ＡＳジペプチドを含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、Ｎ末端ＴＧジペプチドおよびＣ末端ＡＳジペプチドを含む、請求項１から８３のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１が、TG-(GGGS)1（配列番号８４８）、TG-(GGGS)2（配列番号８４９）、TG-(GGGS)3（配列番号８５０）、TG-(GGGS)4（配列番号８５１）、TG-(GGGS)5（配列番号８５２）、(GGGS)1-AS（配列番号８５３）、(GGGS)2-AS（配列番号８５４）、(GGGS)3-AS（配列番号８５５）、(GGGS)4-AS（配列番号８５６）、(GGGS)5-AS（配列番号８５７）、TG-(GGGS)1-AS（配列番号１９５）、TG-(GGGS)2-AS（配列番号８５８）、TG-(GGGS)3-AS（配列番号８５９）、TG-(GGGS)4-AS（配列番号８６０）およびTG-(GGGS)5-AS（配列番号８６１）からなる群から選択される、請求項１から８４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記リンカーＬ１ＴＧおよび／またはＡＳが、存在しないか、Ｔ、Ａ、ＳおよびＧから選択されるアミノ酸の対によって置換されている、請求項１から８５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
約１０^−６ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する、血清アルブミンに対する親和性を有する、請求項１から８６のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
約１０^−９ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する、血清アルブミンに対する親和性を有する、請求項８７に記載の操作されたポリペプチド。
約１０^−１２ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する、血清アルブミンに対する親和性を有する、請求項８８に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも１日の作用持続期間を有する、請求項１から８９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも３日の作用持続期間を有する、請求項９０に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも６日の作用持続期間を有する、請求項９１に記載の操作されたポリペプチド。
ヒト対象において少なくとも６日の作用持続期間を有する、請求項９２に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも７日の作用持続期間を有する、請求項９１に記載の操作されたポリペプチド。
ヒト対象において少なくとも７日の作用持続期間を有する、請求項９２に記載の操作されたポリペプチド。
本明細書における表２または表３の配列のいずれか１種からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２７）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２８）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７２９）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３０）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３１）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３２）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３３）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３４）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３５）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７３６）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３７）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３８）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３９）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４０）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４１）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４２）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４３）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４４）；および
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA（配列番号７４５）
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２７）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７２８）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７２９）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３０）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３１）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３２）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号７３３）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３４）；
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３５）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３７）；
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３８）；および
HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL（配列番号７３９）
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
化合物５、化合物９または化合物１１を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記の操作されたポリペプチドと、少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記の操作されたポリペプチドと、少なくとも９８％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
哺乳類への投与の際に、免疫応答を誘発しないか、またはＡＢＤに付いていないか、もしくは本明細書に記載されるような低減した免疫原性のために修飾されていないＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において記載されるＡＢＤに付いているエキセンディンの、哺乳類への投与の際に誘発される免疫応答と比較して、低減した免疫応答を誘発する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
医薬として使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１日２回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
１日１回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
週に２回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
週に１回の投与に適した血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも４０時間の血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも６０時間の血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
少なくとも７２時間の血漿中半減期を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと、医薬上許容される賦形剤とを含む組成物。
水性である、請求項１１１に記載の組成物。
固体である、請求項１１１に記載の組成物。
医薬として使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
操作されたポリペプチドが、凍結乾燥された固体である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
ヒト血清アルブミンをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
前記請求項のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを含む医薬組成物。
操作されたポリペプチドと医薬上許容される賦形剤とを含む、請求項１１７に記載の医薬組成物。
水性である、請求項１１７から１１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
固体である、請求項１１７から１１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
医薬として使用するための、請求項１１７から１２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
操作されたポリペプチドが、凍結乾燥した固体である、前記請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項１１７から１２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
筋肉内、静脈内、皮下、皮内、関節内、くも膜下腔内、粘膜、経口、経鼻腔、舌下、肺または頬側送達のための医薬組成物である、請求項１１７から１２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
皮下送達のための医薬組成物である、請求項１２４に記載の医薬組成物。
注射による送達のための医薬組成物である、請求項１１７から１２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
経口送達のための医薬組成物である、請求項１２４に記載の医薬組成物。
経口送達のための医薬組成物であり、固体形態を含む、請求項１２７に記載の医薬組成物。
経口送達のための医薬組成物であり、錠剤、顆粒剤、微粒子剤またはカプセル剤を含む、請求項１２８に記載の医薬組成物。
除放性または持続性医薬組成物である、請求項１１７から１２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１日に２回投与される医薬組成物である、請求項１１７から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１日に１回投与される医薬組成物である、請求項１１７から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
週に２回投与される医薬組成物である、請求項１１７から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
週に１回の医薬組成物である、請求項１１７から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
このような治療を必要とする対象において疾患または障害を治療するための、請求項１１７から１３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、脳卒中、短腸症候群（ＳＢＳ）、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、無自覚性低血糖（ＨＵ）、サルコイドーシスを含めた拘束性肺疾患またはメタボリックシンドロームＸである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、ＳＢＳまたはパーキンソン病である、請求項１３６に記載の医薬組成物。
前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、妊娠性糖尿病、ＨＩＶ−治療誘発性糖尿病、ステロイド誘発性糖尿病または成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）である、請求項１３７に記載の医薬組成物。
操作されたポリペプチドが週に１回の投与を提供する、請求項１から１３８のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドまたは医薬組成物。
請求項１から１１０および１３９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを、それを必要とする対象に、前記疾患または障害を治療するのに有効な量で投与することを含む、対象において疾患または障害を治療する方法。
前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、脳卒中、短腸症候群（ＳＢＳ）、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、無自覚性低血糖（ＨＵ）、サルコイドーシスを含めた拘束性肺疾患またはメタボリックシンドロームＸである、請求項１４０に記載の方法。
前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、アルツハイマー病、脂肪肝疾患、脂質異常症、冠動脈疾患、脳卒中、ＳＢＳ、高脂血症またはパーキンソン病である、請求項１４０に記載の方法。
前記疾患または障害が、糖尿病、過体重、肥満症、ＳＢＳまたはパーキンソン病である、請求項１４２に記載の方法。
前記疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または前糖尿病である、請求項１４３に記載の方法。
前記疾患または障害が、ＩＩ型糖尿病である、請求項１４２に記載の方法。
前記疾患または障害が、脂質異常症または高脂血症である、請求項１４２に記載の方法。
請求項１から１１０および１３９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項１４７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項１４８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項１から１１０および１３９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを製造する方法。
反応性側鎖が保護されているアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を使用する非生物学的ペプチド合成によって、請求項１から１１０および１３９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを製造する方法であって、非生物学的ペプチド合成は、アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を段階的にカップリングして、反応性側鎖が保護されている前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドを形成することと、ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去することと、水溶液中での得られたポリペプチドのフォールディングとを含む、方法。
エキセンディンを製造すること、ＡＢＤを製造すること、および製造されたＡＢＤを製造されたエキセンディンとコンジュゲートすることを含む、請求項１から１１０および１３９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを製造する方法。