JP2016128477A - ヘルペスウイルス感染を阻害するペプチド組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも1つのヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質B(HCMV-gB)配列セグメントを含むアミノ酸残基配列を有する単離ペプチド。各HCMV-gB配列セグメントは、HCMV-gBのN末端から174から200残基、233から263残基、264から291残基、297から315残基、または、前記配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違するその変種配列であるアミノ酸配列を有するペプチド。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国仮特許出願61/280,112(2009年10月30日出願)(引用によりその全体が本明細書に含まれる)について優先権を主張する。
政府の支援に関する記載
本発明は、ルイジアナ州のために地域開発局(Office of Community Development)が管理する、米国住宅および都市開発(U.S. Housing and Urban Development(HUD))の地域開発ブロックグラント(Community Development Block Grant(CDBG)(PL 109-148))に基づきコントラクト番号RCEEP-06(2007-10)により政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
HCMV gBに対する抗体はビリオンの細胞内侵入を阻止するだけでなく、細胞対細胞感染を制限することが示され、gBは、ビリオンの細胞内侵入、細胞から細胞へのウイルス伝播の他に感染細胞の融合において役割を果たすことが推量された(18,22)。最近、Isaacsonと共同研究者らは遺伝的補完を用いて、ウイルス膜と細胞膜の融合、ウイルスの進入およびHCMVの細胞から細胞への拡散にgBが必要であることを確認した(23)。
HCMVおよび他のヘルペスウイルスはヒトで生涯にわたって潜伏期を確立するので、ウイルスの進入を阻止する抗ウイルス療法が、既存の治療薬剤に代わるものとして役立つ可能性がある。我々は、HCMV感染を予防する新規なアプローチとして、HCMVと宿主細胞膜との融合を特異的に阻止してウイルス感染および/または複製を阻止するペプチドの設計および開発の特徴を報告する。
他の特徴では、本発明は、ヘルペスウイルスに曝露された対象に本発明のペプチドの治療的に有効な量を投与することによって、ヘルペスウイルス感染(HCMV、HSV-1、HSV-2、EBV、VZV、HHV-6、HHV-7またはKSHV感染などを含むがただしこれらに限定されない)を治療、予防、或いは阻止する方法を提供する。いくつかのペプチドは他のペプチドよりも特定のヘルペスウイルス感染に対してより有効であることは理解されよう。配列番号:1の残基146から315、または配列番号:1の残基146から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基146から315の配列変種の部分を含む本発明のペプチドは、HCMV感染を特に免疫不全対象において治療、予防または阻止するために有用である。同様に、配列番号:1の残基476から494、または配列番号:1の残基476から494に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基476から494の配列変種の部分を含む本発明のペプチドは、HSV-1感染の治療に特に有用である。前記ペプチドは、単独でまたは1つもしくは2つ以上の他の治療薬剤(例えば別の抗ウイルス薬剤)と併用して投与できる。前記ペプチドは、好ましくは医薬的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤(例えば生理学的pHの緩衝剤)中で投与される。
本発明はまた、ヘルペスウイルス感染(特にHCMV感染)を治療、予防または阻止するために前記ペプチドの使用を提供するとともに、ヘルペスウイルス感染阻止用医薬組成物を調製するために前記ペプチドの使用を提供する。
本発明のペプチド、医薬組成物および方法は、有益に用いてヘルペスウイルスに感染したかまたはヘルペスウイルス感染もしくはそのアウトブレークのリスクがある任意の患者を治療することができる。本発明のペプチド、医薬組成物および方法は、免疫不全患者(網膜炎患者、移植患者、異質遺伝子型幹細胞移植レシピエント)に特に有用であるとともに、妊婦でウイルス負荷を軽減させ、それによって胎盤およびその後の胎児へのヘルペスウイルスの拡散を減少させるために有用である。さらにまた、これらのペプチド、医薬組成物および方法はまた、CMV感染新生児の治療に用いて知覚神経性聴力喪失の発生リスクを軽減することができる。
本発明の方法で対象にペプチドを投与するための投薬レベルは、治療的に有用な結果(例えばヘルペスウイルスアウトブレークの抑制、ヘルペスウイルスへの暴露が判明した後の活発な感染の予防など)を提供するために十分な量であろう。本発明のペプチドの治療的に有効な量の決定はまた医業および薬業者の通常の技術レベルの範囲内である。
本発明は、ビリオンと細胞膜の融合に関与するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)糖タンパク質B(gB)の一部分と高い配列類似性を有するアミノ酸残基配列を含むペプチドを提供する。HCMV gBは配列番号:1のアミノ酸配列を有する(National Center for Biotechnology Information Database EMBL Accession No. DAA00160)。ある好ましい実施態様では、本ペプチドは、少なくとも1つのウィムリーホワイト界面疎水性規準(WWIHS)プラスのヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質B(HCMV-gB)配列セグメントを含むアミノ酸残基配列を有する。各WWIHSプラスHCMV-gB配列セグメントは、配列番号:1の残基146から315に由来するか、または配列番号:1の残基146から315に対し少なくとも70%(例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%または98%)の配列同一性を有する配列番号:1の残基146から315の変種配列に由来する、連続する少なくとも8つ(例えば少なくとも8、10または15)のかつ60を超えない(例えば60、50、45、40または35を超えない)アミノ酸残基から成る。いくつかの実施態様では、前記変種は、配列番号:1の対応する部分と1つまたは2つ以上の保存的置換のみにより相違する。好ましくは、WWIHSプラスHCMV-gB配列セグメントは、配列番号:1またはその変種の前記列挙残基の連続する少なくとも15の残基から成る。
別の実施態様では、ペプチドは、配列番号:1の残基146−200、前記に対して少なくとも70%の配列同一性を有するその配列変種の少なくとも1つの連続する部分(例えば連続する8から54の残基)を含む。
本明細書で用いられるように、“WWIHS-プラス”という用語は、正の自由エネルギー(ΔG)値(好ましくは1、2、3または4kcal/molより大きいΔG値)により算出されるWWIHSスコア(例えば本明細書記載のまたは本明細書引用の方法およびコンピュータプログラム(例えばMPExプログラム)によって決定される)を有するアミノ酸残基配列を指す。好ましくは、WWIHSプラスHCMV-gB配列セグメントは、配列番号:1またはその変種の前記列挙残基に由来する、連続する少なくとも10、または少なくとも15のアミノ酸残基(かつ好ましくは45、40、35、30または20を超えない連続するアミノ酸残基)を含む。
本発明のペプチドは、HCMV-gB配列セグメントを含む部分にフランキングする他のアミノ酸配列を(例えばHCMV-gB配列セグメントのアミノおよび/またはカルボキシル末端で)含むことができる。そのような追加の配列を配列番号:1のセグメント内の置換と同様に用い、ヘルペスウイルス感染を阻止する医薬組成物で使用するために本発明のペプチドの物理的、生理学的または化学的特徴を改変または最適化することができる。例えば追加の配列または置換は、生理学的条件下でペプチドを安定化させることができ、または好ましいデリバリービヒクルまたは担体とのペプチドの適合性強化に用いることができる。
本発明のペプチドは、ビリオン:細胞膜融合の阻止に有用であり、したがって本明細書でさらに詳細に記述するようにヘルペスウイルスによる感染の阻止または予防に有用である。
1つまたは2つ以上のリジン残基がHCMV-gBセグメント中で代用されるペプチド変種もまた本発明の範囲内に包含される。そのようなリジン代用変種は、例えば本ペプチドのウイルス阻害活性の増強に有用であり得る。
表2は、WimleyとWhiteが1996年に報告した膜界面のタンパク質のウィムリーホワイト界面疎水性規準(Wimley White Interfacial Hydrophobicity Scale)を示す。この疎水性またはハイドロパシー規準は、ペプチド残基を疎水性二重膜界面から水相へ輸送するために必要な自由エネルギー変化を基準にする。表2に示される規準では、正の残基自由エネルギー(ΔGresidue)(キロカロリー/モル)は疎水性残基を示す(すなわち疎水性の膜から疎水性残基を水に移行させるためにエネルギーが添加されねばならない)。同様に、負の自由エネルギーは親水性残基を示す。
図8、9、10、11および12は、配列番号:1の残基146から315の領域に由来する本発明のペプチドの多数の具体的な非限定例を提供する。前記には、太字で示す単離アミノ酸残基によって表示される置換(例えば保存的置換)を含むいくつかのペプチドが含まれている。さらにまた非gB誘導基を有する誘導体も含まれている。それらは、例えばN-ミリストイル(ミリスチン酸)誘導体、ヒト血清アルブミン融合タンパク質、ヒドロキシプロリン誘導体(“P*”と標識)、多様な輸送タンパク質との融合タンパク質(非gB残基は太字で示されている)、コレステロールエステル誘導体、ヘテロデティック環状ペプチド誘導体(“**”と標識)(前記は2つのシステイン残基のチオール側鎖間のジスルフィド結合によって環化される)およびポリ(エチレングリコール)エステル(PEG)誘導体である。ホモデティックな環状ペプチド誘導体(例えば図8、9、10、11および12に示す配列の最初の残基と最後の残基の間にペプチド結合を有する環状型)もまた本発明のウイルス阻害ペプチドの範囲内に包含される。
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、経口、直腸用、鼻用、局所用(頬側および舌下用を含む)、経皮、膣用または非経口(筋肉内、皮下および静脈内を含む)投与に適した形態、吸入もしくは注入による投与または羊水への注射に適した形態の投薬形を含むが、ただしこれらに限定されない。適切な場合には、本組成物は、便利にはそれぞれ分離した投薬ユニットとして提供される。本発明の医薬組成物は、製薬業界で周知の方法のいずれかによって調製できる。いくつかの好ましい投与態様には、静脈内(iv)、局所、皮下投与および羊水への注射が含まれる。
別の特徴では、本発明はまた、少なくとも1つの本発明のペプチドの治療的に有効な量をヘルペスウイルス(例えばHCMV、HSV-1、HSV-2、EBV、VZV、HHV-6、HHV-7およびKSHV感染)に曝露された対象に投与することによって、前記ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する方法を提供する。本発明の方法は、免疫不全の対象を例えばHCMV感染について治療するために特に有効であり得るが、ただし前記に限定されない。本発明の方法では、ペプチドは、好ましくは上記に記載した医薬組成物の形で投与される。本発明のペプチドは、治療的に有用および有効な投薬範囲で対象に投与されるであろう(前記は医療および医薬業界で周知の日常的な方法によって決定される)。例えば、典型的なユニット投薬は、少なくとも約1ミリグラムから約1ミリグラム、好ましくは少なくとも約10ミリグラムから約100ミリグラムの範囲のペプチド量をデリバーするであろう。本ペプチドはシングルユニットドースでまたはマルチユニットドースで投与することができ、前記は固定期間または無制限の期間の間計画にしたがって例えば1時間毎、1日毎、1週間毎、または1ヶ月毎にデリバーされる。具体的な投薬および投与プロトコルは、投薬形、個々のペプチド、感染のタイプ、感染の重症度、対象の身体状況、並びに医療および医薬業界で周知の他の因子に応じて変動するであろう。
(1)少なくとも1つのウィムリーホワイト界面疎水性規準(WWIHS)プラスのヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質B(HCMV-gB)配列セグメントを含むアミノ酸残基配列を有するペプチドであって、各WWIHSプラスHCMV-gB配列セグメントが、配列番号:1の残基146から315に由来するか、または配列番号:1の残基146から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基146から315の変種配列に由来する、連続する少なくとも8つのアミノ酸残基かつ60を超えないアミノ酸残基から成る、前記ペプチド。
(2)各WWIHSプラスHCMV-gB配列セグメントが以下から成る群から独立に選択される、(1)に記載のペプチド:
(a)配列番号:1の残基146から200に由来するか、または配列番号:1の残基146から200に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基146から200の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基;
(b)配列番号:1の残基174から200に由来するか、または配列番号:1の残基174から200に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基174から200の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基;
(c)配列番号:1の残基233から263に由来するか、または配列番号:1の残基233から263に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基233から263の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基;
(d)配列番号:1の残基264から291に由来するか、または配列番号:1の残基264から291に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基264から291の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基;および
(e)配列番号:1の残基297から315に由来するか、または配列番号:1の残基297から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基297から315の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基。
(3)ペプチドのN末端アミノ基が、アセチル基、疎水基、カルボベンゾキシル基、ダンシル基、t-ブチルオキシカルボニル基、巨大分子基および追加のペプチド配列から成る群から選択される部分と結合している、(1)に記載のペプチド。
(4)ペプチドのC末端カルボキシル基が、アミン、疎水基、巨大分子基および追加のペプチド配列から成る群から選択される部分と結合している、(1)に記載のペプチド。
(5)WWIHSプラスセグメントが追加のペプチド配列とそのC末端で結合しており、前記追加のペプチド配列が配列番号:9を含む、(1)に記載のペプチド。
(6)WWIHSプラスセグメントが追加のペプチド配列とそのN末端またはC末端で結合している、(1)に記載のペプチド。
(7)ペプチドがホモデティックな環状ペプチドまたはヘテロデティックな環状ペプチドである、(1)に記載のペプチド。
(8)ペプチドが少なくとも1つのD-アミノ酸残基を含む、(1)に記載のペプチド。
(9)少なくとも1つのヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質B(HCMV-gB)配列セグメントを含むアミノ酸残基配列を有するペプチドであって、前記ペプチドの各HCMV-gB配列セグメントが、以下から成る群からそれぞれ独立に選択されるHCMV-gBの部分の連続する少なくとも15のアミノ酸残基から成る、前記ペプチド:
(a)配列番号:1の残基146から200に由来するか、または配列番号:1の残基146から200に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基146から200の配列変種に由来する連続残基;
(b)配列番号:1の残基174から200に由来するか、または配列番号:1の残基174から200に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基174から200の配列変種に由来する連続残基;
(c)配列番号:1の残基233から263に由来するか、または配列番号:1の残基233から263に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基233から263の配列変種に由来する連続残基;
(d)配列番号:1の残基264から291に由来するか、または配列番号:1の残基264から291に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基264から291の配列変種に由来する連続残基;
(e)配列番号:1の残基297から315に由来するか、または配列番号:1の残基297から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基297から315の配列変種に由来する連続残基;および
(f)配列番号:1の残基476から494に由来するか、または配列番号:1の残基476から494に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基476から494の配列変種に由来する連続残基。
(10)ペプチドが、配列番号:1の残基174から200に由来するか、または配列番号:1の残基174から200に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基174から200の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(9)に記載のペプチド。
(11)ペプチドが、配列番号:1の残基233から263に由来するか、または配列番号:1の残基233から263に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基233から263の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(9)に記載のペプチド。
(12)ペプチドが、配列番号:1の残基264から291に由来するか、または配列番号:1の残基264から291に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基264から291の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(9)に記載のペプチド。
(13)ペプチドが、配列番号:1の残基297から315に由来するか、または配列番号:1の残基297から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基297から315の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(9)に記載のペプチド。
(14)ペプチドが、配列番号:1の残基476から494に由来するか、または配列番号:1の残基476から494に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基476から494の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(9)に記載のペプチド。
(15)ペプチドが、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7および配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6または配列番号:7に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列変種から成る群から選択されるアミノ酸残基配列を有するHCMV-gB配列セグメントを含む、(9)に記載のペプチド。
(16)配列変種が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6または配列番号:7と保存的置換のみにより相違する、(15)に記載のペプチド。
(17)ペプチドのN末端アミノ基が、アセチル基、疎水基、カルボベンゾキシル基、ダンシル基、t-ブチルオキシカルボニル基および巨大分子基から成る群から選択される部分と結合している、(9)に記載のペプチド。
(18)ペプチドのC末端カルボキシル基が、アミン、疎水基および巨大分子基から成る群から選択される部分と結合している、(9)に記載のペプチド。
(19)HCMV-gB配列セグメントが追加のペプチド配列とそのN末端またはC末端で結合している、(9)に記載のペプチド。
(20)HCMV-gB配列セグメントが追加のペプチド配列とそのC末端で結合しており、前記追加のペプチド配列が配列番号:9を含む、(9)に記載のペプチド。
(21)ペプチドがホモデティックな環状ペプチドまたはヘテロデティックな環状ペプチドである、(9)に記載のペプチド。
(22)ペプチドが少なくとも1つのD-アミノ酸残基を含む、(9)に記載のペプチド。
(23)(1)1に記載のペプチドを医薬的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤と一緒に含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する医薬組成物。
(24)(9)に記載のペプチドを医薬的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤と一緒に含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する医薬組成物。
(25)(1)に記載のペプチドの治療的に有効な量をヘルペスウイルスに曝露された対象に投与する工程を含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する方法。
(26)ヘルペスウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、(25)に記載の方法。
(27)ヘルペスウイルスがHSV-1である、(25)に記載の方法。
(28)対象が免疫不全である、(25)に記載の方法。
(29)(9)に記載のペプチドの治療的に有効な量をヘルペスウイルスに曝露された対象に投与する工程を含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する方法。
(30)ヘルペスウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、(29)に記載の方法。
(31)ヘルペスウイルスがHSV-1である、(29)に記載の方法。
(32)対象が免疫不全である、(29)に記載の方法。
(33)ペプチドが、配列番号:1の残基146から315に由来するか、または配列番号:1の残基146から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有する配列番号:1の残基146から315の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るWWIHSプラスHCMV-gB配列セグメントを含む、(1)または(9)のいずれか1項に記載のペプチド。
(34)ペプチドが、配列番号:1の残基174から200に由来するか、または配列番号:1の残基174から200に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基174から200の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(1)、(9)または(33)のいずれか1項に記載のペプチド。
(35)ペプチドが、配列番号:1の残基233から263に由来するか、または配列番号:1の残基233から263に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基233から263の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(1)、(9)、(33)または(34)のいずれか1項に記載のペプチド。
(36)ペプチドが、配列番号:1の残基264から291に由来するか、または配列番号:1の残基264から291に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基264から291の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(1)、(9)または(33)から(35)のいずれか1項に記載のペプチド。
(37)ペプチドが、配列番号:1の残基297から315に由来するか、または配列番号:1の残基297から315に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基297から315の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(1)、(9)または(32)から(36)のいずれか1項に記載のペプチド。
(38)ペプチドが、配列番号:1の残基476から494に由来するか、または配列番号:1の残基476から494に対し少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ保存的置換のみによりそれと相違する配列番号:1の残基476から494の配列変種に由来する、連続する少なくとも15の残基から成るHCMV-gB配列セグメントを含む、(1)、(9)または(32)から(37)のいずれか1項に記載のペプチド。
(39)ペプチドのN末端アミノ基が、アセチル基、疎水基、カルボベンゾキシル基、ダンシル基、t-ブチルオキシカルボニル基および巨大分子基から成る群から選択される部分と結合している、(1)、(9)または(32)から(38)のいずれか1項に記載のペプチド。
(40)ペプチドのC末端カルボキシル基が、アミン、疎水基および巨大分子基から成る群から選択される部分と結合している、(1)、(9)または(32)から(39)のいずれか1項に記載のペプチド。
(41)HCMV-gB配列セグメントが追加のペプチド配列とそのN末端またはC末端で結合している、(1)、(9)または(32)から(40)のいずれか1項に記載のペプチド。
(42)HCMV-gB配列セグメントが追加のペプチド配列とそのC末端で結合しており、さらに前記追加のペプチド配列が配列番号:9を含む、(1)、(9)または(32)から(41)のいずれか1項に記載のペプチド。
(43)ペプチドがホモデティックな環状ペプチドまたはヘテロデティックな環状ペプチドである、(1)、(9)または(32)から(42)のいずれか1項に記載のペプチド。
(44)ペプチドが少なくとも1つのD-アミノ酸残基を含む、(1)、(9)または(32)から(43)のいずれか1項に記載のペプチド。
(45)(1)、(9)または(32)から(44)のいずれか1項に記載のペプチドを医薬的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤と一緒に含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する医薬組成物。
(46)(1)、(9)または(32)から(44)のいずれか1項に記載のペプチドの治療的に有効な量をヘルペスウイルスに曝露された対象に投与する工程を含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止する方法。
(47)ヘルペスウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、(46)に記載の方法。
(48)ヘルペスウイルスがHSV-1である、(46)または(47)のいずれか1項に記載の方法。
(49)対象が免疫不全である、(46)から(48)のいずれか1項に記載の方法。
(50)(1)、(9)または(32)から(44)のいずれか1項に記載のペプチドの、対象のヘルペスウイルス感染治療における使用。
(51)ヘルペスウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、(50)に記載の使用。
(52)ヘルペスウイルスがHSV-1である、(50)または(51)のいずれか1項に記載の使用。
(53)対象が免疫不全である、(50)から(52)のいずれか1項に記載の使用。
(54)対象のヘルペスウイルス感染治療のための医薬組成物の製造における、(1)、(9)または(32)から(44)のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
(55)ヘルペスウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、(54)に記載の使用。
(56)ヘルペスウイルスがHSV-1である、(54)または(55)のいずれか1項に記載の使用。
(57)対象が免疫不全である、(54)から(56)のいずれか1項に記載の使用。
(58)相乗的組合せとして少なくとも2つのペプチドを含む、(45)に記載の医薬組成物。
(59)2つまたは3つ以上のペプチドの相乗的組合せ物が対象に投与される、(46)に記載の方法。
ウイルスおよび細胞:
緑色蛍光タンパク質(GFP)発現カセットを含むHCMVのTowne株は、Dr. Dan Streblow(Oregon Health Science University)から入手し、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)で増殖させた。ウイルス上清を収集し、遠心して細胞屑を除去し、0.45μmのフィルターに通した。HFF細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンG(100U/mL)、ストレプトマイシン(100mg/mL)およびGLUTAMAXTM L-グルタミンサプリメント(2mM)(Invitrogen)を補充したダルベッコー改変イーグル培養液(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM)で増殖させた。
上記に記載したように、ウィムリーホワイト界面疎水性規準(WWIHS)は、折り畳まれていない界面上の場所よりも二重膜貫通ヘリックス構造を好むタンパク質のセグメントを識別する。WWIHSは、アミノ酸配列が脂質膜界面と相互作用する性向を概算するために用いることができる実験的に決定されたアルゴリズムである(55)。MPExコンピュータプログラム(Interface Scale of the Membrane Protein Explorer, version 3.0(以下のurlで入手できる:blanco.biomol.uci.edu/mpex))を用いて、HCMV gBのこれら個々のセグメントを識別した。前記界面規準は、折り畳まれていないペプチド鎖内の残基の水からホスホコリン二重層への輸送自由エネルギーを基準にする。細胞膜の脂質表面と相互作用する強い性向を示すHCMV gBの9つのセグメントを、MPExプログラムを用いて識別した。続いて、長さが19から31アミノ酸残基の範囲のペプチドを設計して調製し、そのようなWWIHSプラス配列のHCMV感染性阻止能力を評価した。合成したペプチドは前記識別したgBのWWIHSプラス領域と類似するが、ただし望ましくないダイマー化を防ぐためにCys残基はAla残基によって置き換えた(例えばCys185、Cys246およびCys250はAlaによって置換した(番号は配列番号:1を基準にする))。
HCMV gB合成ペプチドは、通常の固相N-α-9-フルレニルメチルオキシカルボニル(fmoc)化学反応によって合成し(Genemed Synthesis Inc.(San Francisco, CA))、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した。配列はアミノ酸分析およびエレクトロスプレー質量分析によって確認した。ペプチドのストック溶液は、10%ジメチルスルホキシド(DMSO、質量分析等級):90%(v/v)H2O中で調製した。ペプチド濃度は、芳香族側鎖の280nmにおける吸収によって決定した(SMARTSPEC TM 3000, BioRad, Hercules, CA)。
ヒト包皮線維芽細胞を24ウェルプレートの各ウェルに約3.5 x 105細胞の濃度で感染24時間前に播種した。HFF細胞を1x DPBSで洗浄し、模擬感染を実施するかまたは室温で約90分間ウイルス感染を実施した。前記ウイルス感染には、ある濃度範囲の阻害性ペプチドの存在下で約37℃で約90分プレインキュベートしたHCMVのTowne GFP株を約0.5感染多重度(MOI)で用いた。感染後、ウイルス混合物を除去し、10%FBS完全DMEMを各ウェルに添加し、約48時間約37℃でインキュベートした。感染後約48時間でGFP陽性細胞を蛍光顕微鏡により可視化し、続いてフローサイトメトリーを用いて定量した。結果は図2A−2Dおよび3B(各図のパネルI)に示されてあり、前記ではHCMV感染細胞と比較して有意なGFP陽性細胞数の減少は、*(p<0.05)、**(p<0.01)および***(p<0.001)によって示されている(一方向ANOVAおよびTurkeyの事後検定による)。各図のパネルIIおよびIIIはまた、MacPyMOL(62)およびFreeHand(Macromedia)プログラムを用いて作成した融合後構造におけるHSV-1 gBのリボン状構造を示す。HCMV gBトリマーはパネルIIおよびIIIに示されている。HCMV gBドメインに対応する、HSV-1 gBの種々のドメインを標的とするペプチドは、各図のパネルIIおよびIIIにおいて黒色で示され、矢印で指し示されている。HFF細胞をトリプシン処理し、遠心して1%FBS-ダルベッコーリン酸緩衝食塩水(DPBS)に再懸濁させた。GFP陽性細胞はフローサイトメトリーで定量した(Cytomics FC 500 Beckman Coulter, Fullerton, CA)。
全体的構造の類似性に加えて、WWIHSプラス配列の分布の類似性もまた存在する。前記類似性には、融合ドメイン(ドメインII)内の少なくとも1つの伸長“融合ループ”、およびドメインIII内の1つまたは2つ以上のWWIHSプラススコア配列が含まれる。ACNPV gp64を例外として、クラスIIおよびクラスIII融合タンパク質は、ドメインIIに隣接する“ヒンジ”領域近くに別のWWIHSプラスのドメインII配列を含む。ヘルペスウイルスgBタンパク質は追加のWWIHSプラス配列をドメインI内に有する。
有意な正のWWIHSスコアをもつ配列と一致するペプチドを合成し、ヘルペスウイルス(例えばHCMV)によるHCMV感染を阻止するそれらの能力について試験した。1つまたは2つ以上のCys残基を含むセグメントでは、ペプチドの望ましくないダイマー化を防止するために、合成ペプチドではCys残基をAla残基で置換した。合成ペプチドは、その実体を本明細書では“ペプチドxxx−yyy”と表し、式中“xxx−yyy”はHCMV gBの対応する残基を表す(特段の記載がなければ適切な場合にはCysはAlaで置換されている)。
全ての合成ペプチドを以下の濃度で試験した:約100μM、50μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μMおよび0.078μM。例えば、ペプチド174‐200(配列番号:3)は、濃度100μMで約80%のウイルス感染阻止、さらに濃度5μMおよび2.5μMでそれぞれ51%および62%阻止を示した(図2A)。ペプチド233−263(配列番号:4)は、濃度100μMおよび50μMでそれぞれ約97%および92%阻害効果、さらに濃度2.5μMで約60%阻止を示した(図2B)。濃度100μMのペプチド233−263(配列番号:4)とともにプレインキュベートしたHCMVのTowne株をMOI約0.5で感染させたHFF細胞の代表的な蛍光像および白色光像を感染後約48時間で撮影した(図4)。図4のパネルA−Bは、ペプチド非存在下でHCMVのTowne株を感染させたHFF細胞の代表的な蛍光顕微鏡像および白色光顕微鏡像をそれぞれ示している。パネルC−Dは、濃度100μMのペプチド233−263(配列番号:4)とともにプレインキュベートしたHCMVのTowne株をMOI約0.5で感染させたHFF細胞の代表的な蛍光像および白色光像をそれぞれ示している。図4の画像は、ペプチドが細胞の感染を効果的に阻止したことを視覚的に示している。ペプチド264−291(配列番号:5)単独は約19%から約70.5%(後者は濃度5μM)の阻止を示したが(図2C)、単独で試験したペプチド297−315(配列番号:6)は濃度50μMで約40%の阻止を示した(図2D)。残りのWWIHSプラスのペプチドはいずれも、試験したいずれの濃度においてもHCMV感染の有意な阻止を示さなかった(データは示されていない)。
全ての合成ペプチドを単独で試験した後、2つのペプチドペアを組み合せて評価した。図3Aおよび3Bは、2つのペプチドの組合せについてのウイルス感染阻止データを示す。各図のパネルIIおよびIIIはHCMV gBトリマーのリボン状構造を示し、ペプチドセグメント(黒色)のおよその配置が矢印で指し示されている。各パネルIIは、細胞膜と接触するトリマーの末端から見た図を示し、各パネルIIIは、その右側で細胞膜と接触する末端をもつトリマーの側面図を示す。ペプチド174−200(配列番号:3)およびペプチド233−263(配列番号:4)は、一緒に試験したとき、各々50μMの濃度で約42%阻止を提供し(図3A)、相乗的態様では作用しなかった。この結果は、gBトリマー形成および融合事象(多段工程を含む)の首尾に要求されるビリオンの必要な構造変化を妨害できないペプチド-ペプチド相互作用によるのかもしれない。ペプチド濃度は、2つのペプチドが相乗的に作用する能力に影響を及ぼし得る1つの因子である。一方のペプチドまたは両方のペプチドの濃度が高すぎると、ペプチドは自己結合して、HCMV gBの推定的融合ループと干渉しHCMVビリオンと脂質膜との融合を阻止する能力を低下させる可能性がある。対照的に、濃度が低すぎると、感染阻止に必要なペプチドの相互作用(gBのHSPGへの結合、宿主細胞の細胞表面レセプターとの結合、細胞膜の脂質界面との結合、gBのトリマー化、または他のエンベロープ糖タンパク質と前記との結合)が達成できず、したがって感染をもたらす。
いくつかの薬剤(ガンシクロビア、その経口プロドラッグのバルガンシクロビア、フォスカーネット、シドフォビアおよびフォミビルセンを含む)がHCMV関連疾患の治療に承認された。これら薬剤のいずれも(フォミビルセンを除く)共通の標的(ウイルスDNAポリメラーゼ)を有する(27)。上記に列挙した抗HCMV薬は、薬剤特異的副作用だけでなく臨床的に関連する薬剤耐性HCMVの出現も引き起こす(28)(前記副作用には白血球減少症、血小板減少症、貧血、骨髄形成不全、下痢および腎障害性が含まれる)。本発明のペプチドはこれら承認薬に対して有用な代替物を提供する。さらにまた、本発明のペプチドはこれらの薬剤と併用して用いることができる。
本発明の阻害性ペプチドはヘルペスウイルス感染(特にHCMV感染)に対して新規な治療薬を提供する。これらの抗ウイルス薬剤を抗ウイルス治療として用いて、妊婦および新生児のウイルス負荷を軽減できる。どのようにしてウイルスが妊娠中に胎児に感染するかは明らかではないが、いくつかの研究は、HCMVによる胎盤感染が胎児へのウイルスの伝播前に発生することを明らかにし、母親から胎児へのHCMVの垂直伝播における胎盤の役割を示唆している。さらにまた、胎盤のウイルス感染は、HCMVの一次感染を示す女性の15%で生じる妊娠早期の偶発的流産にも関係があった(57, 58)。妊娠中のHCMV感染から生じる胎盤の病変はまた、早産、子宮内発育制限(IUGR)または子癇前症を引き起こし得る(57, 59, 60)。
ヒトヘルペスウイルス1 gBのアミノ酸残基168−186および346−360に広がるアミノ酸残基配列を有するペプチド(HSV-1 gB、配列番号:8)(Akkarawongsaと共同研究者らが開発(56, 73))は、HSV-1感染を阻止すると報告されている。図5に示したHSV-1とHCMVのリボン状構造によって示されるように、HCMV gBセグメント297−315はHSV-1 gBの346から360のセグメントと類似する。この類似性のために、本発明のペプチド、特に配列番号:1の残基297−315の全部もしくは部分を含むペプチドまたはその変種は、HSV-1を阻害する活性を有すると予想される。さらにまた、HCMV gBペプチド476−494(配列番号:7)(gB94(gB94の残基496から510)およびgB95(gB95の残基501−515)中のオーバーラップする阻害性ペプチドの領域と一致する)は、HSV-1による感染を阻止するであろうと予想される。その確認として、これらのペプチドはたとえWWIHSがプラスではなくとも、それらはHSV-1に対して阻害性であることが観察された。HCMV gBの残基476−494に広がるHCMV gBセグメント(配列番号:1)(伸長α-ヘリックスを含むトリマー化ドメインと一致する)は正のWWIHSスコアをもたない。このセグメントに一致するペプチド(ペプチド476−494、配列番号:7)をHCMVのTowne株-GFPに対して試験した。このペプチドは高い試験濃度では全く阻害活性を示さなかったが、しかしながらHCMV感染細胞の数は、このペプチドの濃度が低下するにつれて減少した。このペプチドはHCMV gBのトリマー化ドメインと一致するので、高濃度では、この個々のペプチドは自己凝集し、融合を阻害することができないという可能性がある。
図6では、各処置は三つ組で実施した:A=培養液、B= MOI 0.001のHSV-1、C=100μMペプチドおよびウイルス、D=50μMペプチドおよびウイルス、E=25μMペプチドおよびウイルス、F=10μMペプチドおよびウイルス、G=5μMペプチドおよびウイルス、H=2.5μMペプチドおよびウイルス。HCMV gBペプチド174−200(配列番号:3)、ペプチド233−263(配列番号:4)、およびペプチド264−291(配列番号:5)(前記はHCMV gBのドメインIIの部分に一致する)は各々HSV-1感染を阻止する。ペプチド476−494(配列番号:7)はHCMV gBのトリマー化ドメインと一致する(前記トリマー化ドメインは、HCMVビリオンと宿主細胞の脂質膜との融合時のHCMV gBホモトリマー形成で重要な伸長α-ヘリックスを含む)。HSV-1 gBタンパク質の領域496−510および501−515に広がるオーバーラップする阻害性HSV-1ペプチド(配列番号:8)は、HCMV gBペプチド476−494(配列番号:7)と類似する。予想したように、HCMVペプチド476−494(配列番号:7)は約2.5μMの濃度でもっともよく作用した。
臨床的に重要なHCMV(HCMV TRpMIA)を阻害する本発明のペプチドの能力を査定するために、ペプチド174−200(配列番号:3)、ペプチド233−263(配列番号:4)およびペプチド264−291(配列番号:5)を、上記のHCMV Towne株について実施例2で述べたアッセイ条件と同じ条件下でHFF細胞のHCMV TRpMIA感染の阻止について試験した。具体的には、HFF細胞を感染後約24時間で96ウェルプレートに約10,000細胞/ウェルの濃度でプレートした。個々の阻害性ペプチドは、約0.078μMから約100μMの範囲の種々の濃度でプレインキュベートしたHCMV TRpMIAの0.5 MOIに対して評価した。これらのアッセイから得られた結果は、ペプチド174−200、ペプチド233−263およびペプチド264−291についてそれぞれ図13、図14および図15に示されている。HCMVの感染の程度は、感染後24時間で前初期1(IE-1)またはIE-2 HCMVタンパク質を発現する細胞の数の判定によって決定した。無処置コントロールHCMV感染細胞と比較して、IE-1、IE-2またはその両方について陽性細胞の数における有意な減少をもたらす処置は、*(p<0.05)、**(p<0.01)および***(p<0.001、一方向ANOVAおよびTurkeyのポスト検定)によって示されている。ペプチド233−263(配列番号:4)の変種および誘導体もまた調製し同じアッセイで試験した。試験した変種および誘導体の配列は表4に示されている。配列番号:4に対する付加または改変は太字で示されている。
図13のデータは、ペプチド174−200は25μM(**、p<0.01信頼レベル)、50μM(*、p<0.05信頼レベル)、および100μM(***、p<0.001信頼レベル)の濃度で有意な感染阻止を示すことを表している。
図14のデータは、ペプチド233−263は5μM(*、p<0.05信頼レベル)、10μM(***、p<0.001信頼レベル)、25μM(***、p<0.001信頼レベル)、50μM(***、p<0.001信頼レベル)、および100μM(***、p<0.001信頼レベル)の濃度で有意な感染阻止を示し、ほぼ完全な阻止は50から100μMで示されることを表している。
図15のデータは、ペプチド264−291は50μM(*、p<0.05信頼レベル)、および100μM(*、p<0.05信頼レベル)の濃度で有意な感染阻止を示すことを表している。
図16のデータ(ペプチド233−263.9を用いて得られた)は、ペプチド233−263のこの改変型は、驚くべきことに25μMから100μM(***、p<0.001信頼レベル)の濃度で非常に顕著な、ほぼ完全な感染阻止を示すことを表しており、図14に示したペプチド233−263を用いて得られた結果を超えて顕著に改善されている。
ペプチド233-263.1、233-263.2、233-263.3、233-263.4、233-263.5、233-263.6、233-263.1.8は各々、ペプチド233−263と比較してHCMV TRpMIAによる感染の阻止の効果はより低かったが、各ペプチドはコントロールと比較してある程度の阻止レベルは確かに示した。
DMSO中のペプチド溶液で実施した毒性アッセイは、DMSO溶媒が24時間のプレインキュベーション中にHFF細胞の生存率にある程度の負の効果を有する可能性があることを示した。
全ての参考文献(本明細書に引用した刊行物、特許出願および特許を含む)は、各参考文献が個々におよび具体的に参照により含まれることを指示されたかのように、かつその全体が本明細書に示されたかのように同程度に参照により本明細書に含まれる。
本発明の好ましい実施態様(本発明を実施するために発明者らが知る最良の態様を含む)が本明細書に記載されている。これら好ましい実施態様の変型は、前述の記載を熟読するとき当業者には明白となろう。本発明者らはそのような変型を適切な場合に当業者が利用することを予測し、さらに本発明者らは本明細書に具体的に記載した態様とは別の態様で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、関係法が許容するように、添付の特許請求の範囲に列挙した対象項目の全ての改変および等価物を包含する。さらにまた、その可能な変型の全てにおける上記に記載の成分のいずれの組み合わせも、本明細書に特段の指示がないかぎりまたは文脈上明瞭に矛盾しないかぎり本発明に包含される。
Claims (10)
- 以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド:
(a)配列番号:1の残基174から200、または配列番号:1の残基174から200の配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列番号:1の残基174から200の配列変種;
(b)配列番号:1の残基233から263、または配列番号:1の残基233から263の配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列番号:1の残基233から263の配列変種;
(c)配列番号:1の残基264から291、または配列番号:1の残基264から291の配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列番号:1の残基264から291の配列変種;および
(d)配列番号:1の残基297から315、または配列番号:1の残基297から315の配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列番号:1の残基297から315の配列変種。 - ペプチドが、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6および配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6に対して少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列変種から成る群から選択されるアミノ酸残基配列を有する、請求項1記載のペプチド。
- 保存的置換が以下の表から選ばれる、請求項1に記載のペプチド
。 - ペプチドのN末端アミノ基が、アセチル基、疎水基、カルボベンゾキシル基、ダンシル基、t-ブチルオキシカルボニル基および巨大分子基から成る群から選択される部分と結合している、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
- ペプチドのC末端カルボキシル基が、アミン、疎水基および巨大分子基から成る群から選択される部分と結合している、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- C末端が配列番号9または配列番号10のアミノ酸配列からなる追加のペプチド配列と結合している、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- 配列番号1の残基233から263、および、N末端またはC末端または両末端に位置する配列番号1からのさらなる3〜6個の連続する残基からなるアミノ酸配列、を有するペプチドであって、配列番号143、144、145および146からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、または、前記配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列番号143、144、145または146の配列変種であるアミノ酸配列、を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- 配列番号1の残基233から263からなるアミノ酸配列、または、前記配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有し前記配列と保存的アミノ酸置換のみにより相違する配列番号1の残基233から263の配列変種であるアミノ酸配列を有し、さらにC末端が追加のPro(プロリン)残基を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- ペプチドが少なくとも1つのD-アミノ酸残基を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のペプチドを含む、ヘルペスウイルス感染を治療、予防または阻止するための医薬組成物。
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